JP2019509751A - 対流流体装置における核酸の表面ベースの検出方法 - Google Patents
対流流体装置における核酸の表面ベースの検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2016年3月29日出願の米国特許仮出願第62/314,909号に対する優先権を主張し、これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、科学的及び臨床的な研究並びに診断用途のための、特定の核酸配列の検出及び定量化のための新しい試薬、器具、及び方法を記載する。
ほとんどの商用核酸(NA)アッセイは、分子又はシグナル増幅のために酵素の使用を必要とする。DNAポリメラーゼなどの酵素は、高速かつ特異的であるように最適化されてきた。リソースが限られた条件での凍結乾燥酵素の再生は、コールドチェーンの必要性を低減させる。NEAR、LAMP及びNASBAなどの等温核酸増幅アッセイは、複雑な温度サイクル機器を用いることなく、DNA/RNAプロファイリングを可能にする。これら多くの進歩にもかかわらず、所望の特性(例えば、高速、高忠実度、及び化学物質/インヒビターに対して堅牢)をすべて同時に取り込む酵素を設計する/進化させることが困難であるため、既存の核酸検出技術は未だ、病原体バイオマーカーの迅速なPoC(ポイントオブケア)検出に問題を抱えている。
複数のオリゴヌクレオチド複合体を有する表面を含む装置であって、当該オリゴヌクレオチド複合体はそれぞれ、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを表面に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
第2のDNA配列は、第1のDNA配列に相補的であり、それにハイブリダイズされ、
かかる第2のDNAオリゴヌクレオチドは、蛍光部分を含まず、表面に不可逆的に連結されない、装置
が提供される。
流体反応チャンバであって、
第1の表面と、
第1の表面に接触しない第2の表面であって、かかる第1及び第2の表面が互いに対向する、第2の表面と、
第1の表面及び第2の表面と接触し、当該反応チャンバの外側境界を形成する、材料と、
第1の表面及び第2の表面と接触し、当該反応チャンバの内側境界を形成する、材料と
を含み、
第1の表面は、複数のオリゴヌクレオチド複合体を含み、当該オリゴヌクレオチド複合体はそれぞれ、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを表面に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
第2のDNA配列は、第1のDNA配列に相補的であり、それにハイブリダイズされ、
かかる第2のDNAオリゴヌクレオチドは、第1の表面に不可逆的に連結されず、任意で蛍光部分を含まない、流体反応チャンバ
が提供される。
標的核酸を増幅する方法であって、
(a)請求項16に記載の流体反応チャンバを提供する工程であって、当該流体反応チャンバは、第1及び第2の熱源と動作可能な関係にあり、かかる第1及び第2の熱源は、環状チャンバに異なる第1及び第2の熱レベルを適用することができ、かかる第1及び第2の熱レベルは同一ではない、工程と、
(b)当該流体反応チャンバ内に標的核酸配列、DNAポリメラーゼ、dNTP及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)緩衝液を含む流体を導入する工程と、
(c)第1及び第2の熱レベルを当該流体反応チャンバに適用する工程と
を含む、方法が提供される。この方法は、かかる標的核酸の増幅を検出する工程を更に含んでもよい。
第1の表面領域及び第2の表面領域を含む装置であって、
第1の表面領域は、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを第1の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチドであって、第2の配列は、第1の配列に相補的である、第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
第2の表面領域は、
第4のDNA配列と、第3のオリゴヌクレオチドを第2の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第3のオリゴヌクレオチドを含み、
第4の配列は、第2の配列、第3の配列、又は少なくとも第2の配列の6つの連続するヌクレオチドと第3の配列の6つの連続するヌクレオチドとの組み合わせに相補的である、装置、
あるいは、
第1の表面領域及び第2の表面領域を含む装置であって、
第1の表面領域は、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを第1の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチドであって、第2の配列は、第1の配列に相補的である、第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
第2の表面領域は、
第4のDNA配列と、第3のオリゴヌクレオチドを第2の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第3のオリゴヌクレオチド、及び
第5のDNA配列と第6のDNA配列とを含む第4のオリゴヌクレオチドであって、第5の配列は、第4の配列に相補的である、第4のオリゴヌクレオチド
を含み、
第2の配列は、第5の配列に相補的であるか、又は第6の配列に相補的である、装置
が提供される。
流体反応チャンバであって、
第1の表面と、
第1の表面に接触しない第2の表面であって、かかる第1及び第2の表面が互いに対向する、第2の表面と、
第1の表面及び第2の表面と接触し、当該反応チャンバの外側境界を形成する、材料と、
第1の表面及び第2の表面と接触し、当該反応チャンバの内側境界を形成する、材料と
を含み、
(a)第1の表面は、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを第1の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチドであって、第2の配列は、第1の配列に相補的である、第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
第2の表面領域は、
第4のDNA配列と、第3のオリゴヌクレオチドを第2の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第3のオリゴヌクレオチドを含み、
第4の配列は、第2の配列、第3の配列、又は少なくとも第2の配列の6つの連続するヌクレオチド及び第3の配列の6つの連続するヌクレオチドの組み合わせに相補的であるか、あるいは、
(b)第1の表面領域は、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを第1の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチドであって、第2の配列は、第1の配列に相補的である、第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
第2の表面領域は、
第4のDNA配列と、第3のオリゴヌクレオチドを第2の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第3のオリゴヌクレオチド、及び
第5のDNA配列と第6のDNA配列とを含む第4のオリゴヌクレオチドであって、第5の配列は、第4の配列に相補的である、第4のオリゴヌクレオチド
を含み、
第2の配列は、第5の配列に相補的であるか、又は第6の配列に相補的である、流体反応チャンバが提供される。
標的核酸を増幅する方法であって、
(a)請求項71に記載の流体反応チャンバを提供する工程であって、当該流体反応チャンバは、第1及び第2の熱源と動作可能な関係にあり、かかる第1及び第2の熱源は、環状チャンバに異なる第1及び第2の熱レベルを適用することができ、かかる第1及び第2の熱レベルは同一ではない、工程と、
(b)当該流体反応チャンバ内に標的核酸配列を含む流体を導入する工程と、
(c)第1及び第2の熱レベルを当該流体反応チャンバに適用する工程と
を含む、方法を含む。
反応チャンバであって、
(a)第1の領域及び第2の領域であって、第1のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドは、第1の表面領域に官能化され、第2のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドは、第2の表面領域に官能化され、第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は同一でない、第1の領域及び第2の領域と、
(b)非均一温度でDNAハイブリダイゼーションに適応できる緩衝液であって、第1の表面領域及び第2の表面領域に接触する、緩衝液と、
(c)第3のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドであって、第1のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、第3のオリゴヌクレオチドと、
(d)第1の温度帯及び第2の温度帯であって、第1の温度帯は、第2の温度帯の温度より少なくとも10℃高い温度を有する、第1の温度帯及び第2の温度帯と
を含む、反応チャンバを含む、システムを含む。
(a)サンプルを反応チャンバ内の組成物と接触させる工程であって、組成物は、
DNAハイブリダイゼーションに適応可能な緩衝液と、
第1の表面領域及び第2の表面領域であって、緩衝液は、第1の表面領域及び第2の表面領域に接触する、第1の表面領域及び第2の表面領域と、
第1のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドであって、第1の表面領域に官能化される、第1のオリゴヌクレオチドと、
第2のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドであって、第2の表面領域に官能化される、第2のオリゴヌクレオチドと、
第3のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドであって、第1のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、第3のオリゴヌクレオチドと
を含み、
第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は同一ではなく、第3のヌクレオチドは、第1のヌクレオチド配列に相補的ではない第1のヌクレオチド領域を含む、工程と、
(b)反応チャンバの一部を別個に加熱する工程であって、チャンバの領域の最高温度は、チャンバの最低温度より少なくとも10℃高い、工程と、
(c)電位増幅を検出する工程と
を含む、方法。
酵素依存の増幅及び核酸標的の検出の方法であって、
(a)サンプルを反応チャンバ内の組成物に接触させる工程であって、組成物は、
DNAハイブリダイゼーションに適応可能な緩衝液と、
表面領域であって、緩衝液は表面領域に接触する、表面領域と、
第1のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドであって、第1のオリゴヌクレオチドは、表面領域に官能化される、第1のオリゴヌクレオチドと、
第2のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドと、温度指向の方法で核酸を修飾する酵素とを含み、第2のヌクレオチド配列は、第1のヌクレオチド配列に相補的でないヌクレオチド領域を含む、工程と、
(b)反応チャンバの一部を別個に加熱する工程であって、チャンバの領域の最高温度は、チャンバの最低温度より少なくとも10℃高い、工程と、
(c)電位増幅を検出する工程と
を含む、方法が提供される。
(図1) 異なる温度でヒーターに垂直に装着された流体チップの一実施形態の概略図を示す。流体チップは、DNAオリゴヌクレオチドを官能化するための表面を有する反応チャンバを含む。いくつかの実施形態では、このチップは、核酸の多重PCRに基づく検出を行うために使用される。
(図2) 流体チップが異なる温度でヒーターに垂直に装着されるシステムの一実施形態を示す。水平に装着された光源は、チップに官能化されたDNA上の蛍光部分を励起し、蛍光シグナルは、示されている検出器を介して定量化される。
(図3) 流体チップ(左)、ヒーターに装着されたチップ(中間)、及びヒーターに装着された矩形のチャンバ付きチップ(右)のカメラ写真を示す。
(図4) 検出プローブの一部を形成するためのDNAオリゴヌクレオチドを用いたガラススライドの官能化の化学的アプローチの一例を示す。プロセスは、アジド−PEG−アミン(11−アジド−3,6,9−トリオキサウンデカン−1−アミン)によるPDITC(p−フェニレン−ジイソシアネート)活性化ガラスと、それに続く、親水性PEGリンカーを介したオリゴヌクレオチドの付着をもたらす、銅触媒を用いるアルキンとアジドとの環化付加によるアルキン官能化オリゴヌクレオチドとの共役と、の2段階反応である。官能化表面の親水性は、標的DNA、プライマー及び酵素などの反応成分の非特異的吸着を防止する。歪みシクロアルキンによって修飾されたオリゴヌクレオチドを有するアジド官能化表面の銅フリー反応はまた、表面へのオリゴヌクレオチドの安定した非常に特異的な共有結合をもたらす。
(図5) 官能化されたプローブ構造の一例を示す。表面に官能化されたオリゴヌクレオチドは、蛍光色素分子で標識化され、表面官能化プローブにハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、消光剤で標識化される。検出標的が、消光剤で標識化されたオリゴヌクレオチドを表面から移動させると、表面の蛍光強度が増加する。下部パネルは、標的導入の前後の蛍光顕微鏡画像を示しており、ここでスポット径は1mmである。オリゴヌクレオチドは、以下のとおりであった。
(図6) 対流が適用されたときの、流体チップ内のゲノムDNA(gDNA)テンプレートのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅の概略図を示し、配列(10)はフォワードプライマー、配列(11)はリバースプライマーを示す。フォワード鎖中のドメイン10−15−16−17と、リバース鎖中のドメイン11−12−13−14とを含む、二本鎖アンプリコンは、95℃の高温帯で変性され、次いで対流によって60℃帯に搬送され、そこで消光剤で標識化されたオリゴヌクレオチドを変位させて、対応するスポット内に増強蛍光を発生させることができる。
(図7) 対流チップ内でのPCR増幅の結果を示す。左パネルは、増幅産物のアガロースゲル電気泳動を示す。レーン1は、対流チップにおいて30分増幅された10ngのNA18562 gDNAテンプレートの増幅産物を示す。プライマー濃度は、フォワードプライマーの場合は600nM、リバースプライマーの場合は200nMである。レーン2は、プライマー、ポリメラーゼ、dNTP、及びプローブスポットによる、ただしgDNAインプットのない、陰性対照を示す。ラダーは、50bpラダー(New England Biolabs)を基準とする。右パネルは、増幅反応を介したスポット強度の蛍光時間経過を示す。この実験のプローブ及びプライマーは、標的rs7517833(図20を参照のこと)用に設計された。
(図8) 流体チップ内の対流を示す。左上パネルは、チップにわたって温度勾配のない(いずれのヒーターも60℃)、蛍光追跡ビーズの蛍光画像を示す。右上パネルは、温度勾配が適用されたときの(左ヒーター95℃、右ヒーター60℃)、蛍光追跡ビーズのタイムラプス(2秒)蛍光画像を示す。下部パネルは、チャンバ厚に基づいて観測された平均対流流速を要約する。
(図9) 流体チップ内の複数のアンプリコンのアレイに基づいた読み出しの概略図を示す。右パネルは、24個のプリントスポットを有するチップの蛍光画像を示す。Mのマークが付いたスポットは、消光剤で標識化されたオリゴヌクレオチドが欠如している陽性対照スポットである。他のスポットはそれぞれ、特定のアンプリコン配列に特異的である。
(図10) 対流PCRの前後における流体チップのプローブアレイ領域の蛍光画像を示す。スポット2、3、及び4のプローブに対応するアンプリコンを生成するプライマーは、10ngのgDNAテンプレートと共に導入された(それぞれのフォワードプライマーは600nM、それぞれのリバースプライマーは200nM)。スポット14の高い蛍光性は、意図的ではなく、不完全に官能化又はハイブリダイズされたDNAプローブ分子に起因するものであり得る。
(図11) 対流流体チップにおける9重PCR増幅の時間経過蛍光を示す。それぞれのスポットの蛍光強度は、背景蛍光及びマーカースポットMの蛍光強度に基づいて個別に定量化され、正規化された。それぞれのフォワードプライマー濃度は200nMであり、それぞれのリバースプライマー濃度は100nMであり、gDNAのインプットは10ngである。
(図12−1) ヒト、マウス、及びラットDNAのプライマーに対応する対流流体チップにおける3重PCR増幅を示す。ここで、一列内のすべてのスポットは、同一のアンプリコンについての同一の配列同一性及びレポートを有する。上部の列は、陽性対照プローブである。反応チャンバでは、それぞれのフォワードプライマーは600nM、それぞれのリバースプライマーは200nM、gDNAテンプレートは10ngであった。実験に使用された配列は、以下のとおりである。
プライマー
アーム
消光剤
アンカー
(図12−2) ヒト、マウス、及びラットDNAのプライマーに対応する対流流体チップにおける3重PCR増幅を示す。ここで、一列内のすべてのスポットは、同一のアンプリコンについての同一の配列同一性及びレポートを有する。上部の列は、陽性対照プローブである。反応チャンバでは、それぞれのフォワードプライマーは600nM、それぞれのリバースプライマーは200nM、gDNAテンプレートは10ngであった。実験に使用された配列は、以下のとおりである。
プライマー
アーム
消光剤
アンカー
(図13A) 2つの表面領域を有する反応チャンバの概略図を示し、それぞれ異なるDNAオリゴヌクレオチド試薬で官能化されている。図1とは異なり、オリゴヌクレオチド試薬は、配列非依存ではなく、むしろ酵素フリー増幅用に合理的に設計されている。
(図13B) 2つの表面領域の2つの可能な実施形態を示しており、2つの表面領域は異なる表面上にあるか、又は同一表面上であるが直接相互作用を防止するために遠位に位置しているかのいずれかである。
(図14A−1) 第6の配列(6)及び第7の配列(7)を担持する標的核酸配列の線形増幅の機構を示す。標的核酸配列は、第2の配列(2)及び第3の配列(3)を担持する複数のオリゴヌクレオチドを表面領域1から表面領域2へ触媒的に移送する。高温帯内の二本鎖DNA分子(23:67)の自発性解離は、迅速な代謝回転を可能にするために重要である。
(図14A−2) 第6の配列(6)及び第7の配列(7)を担持する標的核酸配列の線形増幅の機構を示す。標的核酸配列は、第2の配列(2)及び第3の配列(3)を担持する複数のオリゴヌクレオチドを表面領域1から表面領域2へ触媒的に移送する。高温帯内の二本鎖DNA分子(23:67)の自発性解離は、迅速な代謝回転を可能にするために重要である。
(図14B) 図14Aに記載のプロセスの正味の反応、並びにリアルタイム読み出しを可能にする蛍光標識化戦略を示す。
(図14C) 反転した5’/3’配向による代替の実施例を示す(文献内の慣例として、半分の矢印頭部は3’の端部を示す)。
(図15−1) 標的核酸配列が表面結合オリゴヌクレオチドの化学量論的再配列を誘導する、対照実験の機構を示す。
(図15−2) 標的核酸配列が表面結合オリゴヌクレオチドの化学量論的再配列を誘導する、対照実験の機構を示す。
(図16) 標的核酸の様々な濃度が導入されたときの、表面領域1の時間経過蛍光を示す。線形増幅チップ内の蛍光は、化学量論的な変換チップ内よりも迅速に減少し、酵素フリーのDNA増幅の機構を支持する。
(図17−1) 標的核酸配列の指数関数的増幅の機構を示す。
(図17−2) 標的核酸配列の指数関数的増幅の機構を示す。
(図18) SybrGreen又はEvaGreenなどの介在色素の使用による酵素フリー増幅の報告の視覚的表現を示す。表面領域1の蛍光強度は、反応の過程で減少し、表面領域2の蛍光強度は増加する。
(図19) 蛍光色素分子官能化オリゴヌクレオチドの使用による酵素フリー増幅の報告の視覚的表現を示す。表面領域1の蛍光強度は、反応の過程で増加し、表面領域2の蛍光強度は、反応の過程を通して暗いままとなる。
(図20−1) PCR増幅/検出に使用されるプライマー及びプローブ(アンカー+アーム+消光剤)のリストを示す。
(図20−2) PCR増幅/検出に使用されるプライマー及びプローブ(アンカー+アーム+消光剤)のリストを示す。
(図20−3) PCR増幅/検出に使用されるプライマー及びプローブ(アンカー+アーム+消光剤)のリストを示す。
ここで、本発明者らは、DNA増幅アッセイのための装置、システム、及び方法を提示する。本開示は、偽陽性に起因する意図しない分子事象を防止するために、試薬の固相分離を採用し、二本鎖アンプリコンの自発性解離を可能にするために対流循環を使用する。本発明と比較した3つの関連する従来技術及びそれらの制限事項を以下に記載する。
液体は、非均一な温度に保持され、ある体積に閉じ込められると、レイリー・ベナール(Rayleigh−Benard)対流[1]として知られるプロセスを介して循環する。レイリー・ベナール対流は、PCRに必要な温度サイクル(対流PCR、cf−PCR)を提供する低コスト装置を生成するための分子診断に使用されてきた[2、米国特許第6,586,233(B2)号、米国特許第8,735,103(B2)号、米国特許第8,187,813(B2)号]。cf−PCRは、高いエネルギー消費の熱サイクル器具を必要とせず、およそ95℃の高温及びおよそ60℃の低温(アニーリング/伸張温度)で維持される静的温度勾配のみを必要とする。
マイクロアレイ技術は、生体サンプルの多重スクリーニングの主要テクニックの1つである。複数のプローブ配列は、表面に官能化され、特定のスポットの蛍光シグナルは、対応する配列の定量的読み出しとなる。この技術は、DNA、RNA、タンパク質、炭水化物及び細胞などの様々なタイプの生体分析物の検出の実証に成功してきた[8〜12]。マイクロアレイ技術の適用は、核酸実験の分野において最も広範な使用法を見出した。マイクロアレイ技術は、全ゲノムハイブリダイゼーション、新しい配列決定、再配列決定、比較ゲノミクス、トランスクリプトームハイブリダイゼーション又は一塩基変異の識別[13〜15]のためのNAマイクロアレイの適用を示してきた。上記NAの適用例はいずれも、ハイブリダイゼーション用に大量のNA標的を必要とし、その結果、マイクロアレイは典型的に、PCR増幅産物に対する最終読み出しとして使用される。マイクロアレイの読み出しは典型的に遅く、夜通しのハイブリダイゼーションを必要とし、また、開管プロセスによるアンプリコン汚染の危険を伴う。
トーホールド媒介性の鎖置換反応[19〜21]は、酵素が存在しないときに生じる競合ハイブリダイゼーションのプロセスであり、本開示に関連する。トーホールド媒介性の鎖置換を使用して、均質な溶液中のDNA及びRNA分析物配列の酵素フリー増幅が実証されてきた[22〜27](米国特許第8,043810(B2)号、米国特許第8,110,353(B2)号)。本開示の酵素フリー増幅の実施形態は、熱対流を使用して、二本鎖アンプリコンを自発的に解離させ、表面の官能化を使用して、反応試薬を互いに隔離して偽陽性を低減させる点で異なる。トーホールド媒介性の鎖置換は、標的分析物配列の他の配列への化学量論的変換のために、表面官能化DNAオリゴヌクレオチド(米国特許第8,630,809(B2)号)に適用されてきた。本開示は、検出標的の増幅を提供する点で異なる。
本開示は、特定の核酸標的配列の増幅及び検出のための試薬及び装置を記載する。本開示は、偽陽性に起因する意図しない分子事象を防止するためのオリゴヌクレオチド試薬の固相官能化及び隔離と、標的再生のためのレイリー・ベナール熱対流の適用と、DNA表面ハイブリダイゼーション速度則(反応混合物のより効率液な混合)の促進とを利用する。レイリー・ベナール対流レジメンは、反応チャンバを置くことによって実現され得、反応チャンバは、定義された角度で傾斜する2つの別個に制御された熱板(図1〜3)の間を、厚さ250μmのスペーサとして両面粘着テープで分けられている2つの1mm厚の白色ガラス顕微鏡スライドからなる。スペーサの形状は、反応チャンバの形状を決定し、対流流速及び軌道を変更するように修正され得る。ガラスは、チャンバにわたって均一な温度勾配の維持を容易にし、合成オリゴヌクレオチドによる表面の官能化を可能にするため、チップ材料としてガラスが選択される。
本開示は、標的核酸の酵素フリー増幅を表し、アンプリコン濃度は経時的に直線状に増加する(図14A)。2つの表面領域は、2つのDNAオリゴヌクレオチド、ドナーD(ドメイン1を含む)及び受容体A(ドメイン4〜5を含む)で不可逆的に官能化される。表面領域1に官能化されたドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ドメイン2が溶液に暴露されトーホールド配列の役割を果たすような方法で、ドメイン4〜5に相補的である、ドメイン2〜3を含む、一本鎖Sと最初にハイブリダイズされる。受容体鎖は、表面領域2に不可逆的に官能化され、最初は一本鎖オリゴヌクレオチドである。表面領域1及び2は、35℃に保持された温度帯(35℃帯)に局在化され、ここでD−S二重鎖は、検出アッセイの時間スケールにわたって高く安定するように設計される。標的分子T(ドメイン6〜7を含む)は、反応溶液中に導入され、対流によって反応チャンバの35℃帯に移送される。標的Tは、ドメイン7(「トーホールド」ドメイン)を介してシグナルSに結合し、トーホールド媒介性の鎖置換機構によってドメイン3を表面から溶液へ移動させる。次いで、レイリー・ベナール対流が二重鎖をチャンバの高温帯(85℃に保持)に搬送し、そこで二重鎖が解離する。2つの一本鎖分子、標的鎖T及びシグナル鎖Sは次いで、チャンバの35℃帯に戻され、鎖Sは、表面領域2に官能化された受容体オリゴヌクレオチドAに結合する。同時に、一本鎖標的Tを許容することで、別のシグナルS分子を表面領域1から触媒によって移動させ、触媒サイクルを完了させる。このトリガは、シグナル分子Sが表面領域1から表面領域2に完全に移送されるまで連続的に進行するべきである。
酵素フリー増幅法が複数の代謝回転を呈することを実証するため、発明者らは、対流装置(図15)を使用して対応する化学量論的検出システムを構築した。化学量論的システムはまた、ドナーで官能化された2つの表面領域、ドメイン11〜12を含むDs鎖と、ドメイン16を含むAs鎖とを含む。Ds鎖は、ドメイン14〜15を含むブリッジオリゴヌクレオチドBs及びドメイン13を含むシグナルオリゴヌクレオチドSsからなるシグナル複合体とハイブリダイズされる。Bs鎖及びAs鎖のドメイン14は、同一の配列を有する。反応に導入されるドメイン17〜18を含む標的分子Tは、ドナーDsのトーホールドドメイン11に結合し、次いでシグナル複合体を溶液中に移動させる。このプロセス中、標的Tは、ドナーDsと結合し、表面領域1からの別のシグナル複合体の遊離をトリガするため、チャンバの高温帯での再生が不可能となる。移動したシグナル複合体は、対流によって85℃帯に移送され、そこで解離する。解離後、シグナル分子Ssは、35℃帯に戻され、表面領域2に官能化された受容体オリゴヌクレオチドAsによって捕捉される。このように、捕捉されたシグナル鎖Ssの量は、システムに導入された標的Tの量と等しくなる。
図17は、試薬が消費されるまで(図17)、検出標的が、時間と共に濃度が指数関数的に増加するアンプリコン産物の遊離をトリガする、本発明の一実施形態を示す。このシステムでは、2つの表面領域が部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド複合体で官能化される。ドメイン3が一本鎖に留まりトーホールド配列の役割を果たすような方法で、表面に不可逆的に付着し、ドメイン3−2を含むオリゴヌクレオチドS1とハイブリダイズしている、単一ドメインのオリゴヌクレオチドからなる複合体を、表面領域1は有する。表面領域2は、表面領域1をミラーリングし、表面に官能化されたオリゴヌクレオチド試薬の類似のアーキテクチャを有する。ドメイン4を含むオリゴヌクレオチドは、表面に不可逆的に官能化され、ドメイン6〜5を含むオリゴヌクレオチドS2とハイブリダイズし、ドメイン6は、一本鎖のトーホールドを表す。ドメイン7及び8(配列においてそれぞれドメイン6及び5と同一)を含む標的鎖Tの反応混合物への注入により、オリゴヌクレオチドS1が二本鎖アンプリコンの形状で表面領域1から遊離する。
図14Bは、反応の進行をアッセイするための1つの可能な検出機構を提示する。蛍光顕微鏡法を使用する代替の読み出しアプローチも可能である。SybrGreen及びSyto色素などの配列非特異的な挿入核酸染色色素を使用して、蓄積した二本鎖産物の合計量を示すことができる(図18)。表面領域2に固定化された受容体鎖A(ドメイン4〜5)は、反応の開始時は一本鎖状であるため、挿入色素は、鎖Aに対して低い親和性を有することになる。反応の過程において、更に多くの鎖S(ドメイン2〜3)は、表面官能化鎖A(ドメイン4〜5)とハイブリダイズする。新たに形成された複合体A−Sはここで、表面領域2の蛍光の増加を引き起こす色素によって効率的に染色される。反対の状況が、表面領域1で潜在的に観察され得る。
本開示に記載の組成物の別の用途として、この組成物は、溶液中で進行する酵素核酸増幅プロセスの表面ベースのリアルタイムモニタリングのための効率的な手段として使用され得る。表面官能化プローブを使用した対流ベースのPCRのリアルタイムモニタリングについて報告された例は存在しない。
本開示の提案される組成物及び方法は、複数の核酸標的配列の増幅(酵素フリー又は酵素ベースのいずれか)を同時にモニタリングすることを可能にする。異なる表面領域での異なるオリゴヌクレオチドプローブの空間パターンは、アレイベース又はカメラベースの読み出しが、それぞれの標的増幅反応のアンプリコン濃度の独立した情報を提供することを可能にする。
以下のオリゴヌクレオチド配列が、例として提供されるが、限定するものではない。
Claims (110)
- 複数のオリゴヌクレオチド複合体を有する表面を含む装置であって、前記オリゴヌクレオチド複合体はそれぞれ、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを前記表面に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第2のDNA配列は、前記第1のDNA配列に相補的であり、それにハイブリダイズされ、
前記第2のDNAオリゴヌクレオチドは、蛍光部分を含まず、前記表面に不可逆的に連結されない、装置。 - 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一である、請求項1に記載の装置。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一ではない、請求項1に記載の装置。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項2に記載の装置。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項3に記載の装置。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光部分を含む、請求項1〜5に記載の装置。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光消光剤を含む、請求項6に記載の装置。
- 前記空間的に離散した領域のそれぞれが、第4のDNA配列と第5のDNA配列とを含む第3のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記第4のDNA配列は、前記第3のDNA配列に相補的である、請求項4〜5に記載の装置。
- 前記第3のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、蛍光消光剤部分を含む、請求項8に記載の装置。
- 前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項1に記載の装置。
- 前記第1のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項1〜10に記載の装置。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項1〜10に記載の装置。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項12に記載の装置。
- 前記第5のDNA配列のそれぞれが、約5〜約20ヌクレオチドの長さを有する、請求項8に記載の装置。
- 前記第4のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項8に記載の装置。
- 流体反応チャンバであって、
第1の表面と、
前記第1の表面に接触しない第2の表面であって、前記第1及び第2の表面が互いに対向する、第2の表面と、
前記第1の表面及び前記第2の表面に接触し、前記反応チャンバの外側境界を形成する、材料と、
前記第1の表面及び前記第2の表面に接触し、前記反応チャンバの内側境界を形成する、材料と
を含み、
前記第1の表面は、複数のオリゴヌクレオチド複合体を含み、前記オリゴヌクレオチド複合体はそれぞれ、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを前記表面に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第2のDNA配列は、前記第1のDNA配列に相補的であり、それにハイブリダイズされ、
前記第2のDNAオリゴヌクレオチドは、前記第1の表面に不可逆的に連結されず、任意で蛍光部分を含まない、流体反応チャンバ。 - 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一である、請求項16に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一ではない、請求項16に記載の流体反応チャンバ。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項17に記載の流体反応チャンバ。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項18に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光部分を含む、請求項16〜20に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光消光剤部分を含む、請求項21に記載の流体反応チャンバ。
- 前記空間的に離散した領域のそれぞれが、第4のDNA配列と第5のDNA配列とを含む第3のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記第4のDNA配列は、前記第3のDNA配列に相補的である、請求項20〜21に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第3のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、蛍光消光剤部分を含む、請求項23に記載の流体反応チャンバ。
- 前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項16に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第1のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項16〜25に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項16〜25に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項27に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第5のDNA配列のそれぞれが、約5〜約20ヌクレオチドの長さを有する、請求項23に記載の流体反応チャンバ。
- 前記チャンバの前記内側及び外側の境界を形成する第1及び第2の表面に接触する前記材料が、40マイクロメートル(40μm)〜2ミリメートル(2mm)の厚さを有する、請求項16〜29に記載の流体反応チャンバ。
- 円形、楕円形、正方形、矩形、三角形、六角形、八角形、菱形又は台形である、請求項16〜30に記載の流体反応チャンバ。
- 前記流体反応チャンバが均一な温度ではなく、前記反応チャンバの最高温度領域が前記反応チャンバの最低温度領域より少なくとも10℃高い、請求項16〜31に記載の流体反応チャンバ。
- 前記反応チャンバの前記最低温度領域が、約50℃〜約75℃である、請求項16〜32に記載の流体反応チャンバ。
- 前記反応チャンバの前記最高温度領域が、約80℃〜約100℃である、請求項16〜33に記載の流体反応チャンバ。
- 前記流体反応チャンバ内に配置された流体を更に含み、前記流体溶液は、DNAポリメラーゼ、dNTP及びPCR緩衝液を含む、請求項16〜34に記載の流体反応チャンバ。
- 標的核酸を増幅する方法であって、
(a)請求項16に記載の流体反応チャンバを提供する工程であって、前記流体反応チャンバは、第1及び第2の熱源と動作可能な関係にあり、前記第1及び第2の熱源は、環状チャンバに異なる第1及び第2の熱レベルを適用することができ、前記第1及び第2の熱レベルは同一ではない、工程と、
(b)前記流体反応チャンバ内に標的核酸配列、DNAポリメラーゼ、dNTP及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)緩衝液を含む流体を導入する工程と、
(c)第1及び第2の熱レベルを前記流体反応チャンバに適用する工程と
を含む、方法。 - 前記標的核酸の増幅を検出する工程を更に含む、請求項36に記載の方法。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一である、請求項36に記載の方法。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一ではない、請求項36に記載の方法。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項38に記載の方法。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項37に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光部分を含む、請求項36〜40に記載の方法。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光消光剤部分を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記空間的に離散した領域のそれぞれが、第4のDNA配列と第5のDNA配列とを含む第3のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記第4のDNA配列は、前記第3のDNA配列に相補的である、請求項42〜43に記載の方法。
- 前記第3のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、蛍光消光剤部分を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記第1のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項36〜45に記載の方法。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項36〜45に記載の方法。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項48に記載の方法。
- 前記第5のDNA配列のそれぞれが、約5〜約20ヌクレオチドの長さを有する、請求項44に記載の方法。
- 前記流体が、非特異的な核酸染色色素を更に含む、請求項36〜120に記載の方法。
- 前記流体反応チャンバが、円形、楕円形、正方形、三角形、矩形、六角形、八角形、菱形又は台形である、請求項36〜51に記載の方法。
- 前記流体反応チャンバが、均一な温度ではなく、前記反応チャンバの最高温度領域が前記反応チャンバの最低温度領域より少なくとも10℃高い、請求項36〜52に記載の方法。
- 前記反応チャンバの前記最低温度領域が、約50℃〜約75℃である、請求項36〜53に記載の方法。
- 前記反応チャンバの前記最高温度領域が、約80℃〜約100℃である、請求項36〜54に記載の方法。
- 第1の表面領域及び第2の表面領域を含む装置であって、
前記第1の表面領域は、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを前記第1の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第2の配列は、前記第1の配列に相補的である、第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第2の表面領域は、
第4のDNA配列と、第3のオリゴヌクレオチドを前記第2の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第3のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第4の配列は、前記第2の配列、前記第3の配列、又は少なくとも前記第2の配列の6つの連続するヌクレオチドと前記第3の配列の6つの連続するヌクレオチドとの組み合わせに相補的である、装置。 - 第1の表面領域及び第2の表面領域を含む装置であって、
前記第1の表面領域は、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを前記第1の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第2の配列は、前記第1の配列に相補的である、第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第2の表面領域は、
第4のDNA配列と、第3のオリゴヌクレオチドを前記第2の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第3のオリゴヌクレオチド、及び
第5のDNA配列と第6のDNA配列とを含む第4のオリゴヌクレオチドであって、前記第5の配列は、前記第4の配列に相補的である、第4のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第2の配列は、前記第5の配列に相補的であるか、又は前記第6の配列に相補的である、装置。 - 前記第1又は第2のオリゴヌクレオチドが、蛍光部分を含む、請求項56〜57に記載の装置。
- 前記第1又は第2のオリゴヌクレオチドが、蛍光消光剤を含む、請求項56〜57に記載の装置。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一である、請求項56〜59に記載の装置。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一ではない、請求項56〜59に記載の装置。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項60に記載の装置。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項61に記載の装置。
- 前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項56〜57に記載の装置。
- 前記第1のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項56〜64に記載の装置。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項56〜65に記載の装置。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項66に記載の装置。
- 前記第5のDNA配列のそれぞれが、約5〜約20ヌクレオチドの長さを有する、請求項56〜67に記載の装置。
- 前記第4のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項56〜67に記載の装置。
- 前記第6のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項56〜67に記載の装置。
- 流体反応チャンバであって、
第1の表面と、
前記第1の表面に接触しない第2の表面であって、前記第1及び第2の表面が互いに対向する、第2の表面と、
前記第1の表面及び前記第2の表面に接触し、前記反応チャンバの外側境界を形成する、材料と、
前記第1の表面及び前記第2の表面に接触し、前記反応チャンバの内側境界を形成する、材料と
を含み、
(a)前記第1の表面は、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを第1の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第2の配列は、前記第1の配列に相補的である、第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第2の表面領域は、
第4のDNA配列と、第3のオリゴヌクレオチドを前記第2の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第3のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第4の配列は、前記第2の配列、前記第3の配列、又は少なくとも前記第2の配列の6つの連続するヌクレオチドと前記第3の配列の6つの連続するヌクレオチドとの組み合わせに相補的であるか、あるいは、
(b)前記第1の表面領域は、
第1のDNA配列と、第1のオリゴヌクレオチドを前記第1の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のDNA配列と第3のDNA配列とを含む第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第2の配列は、前記第1の配列に相補的である、第2のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第2の表面領域は、
第4のDNA配列と、第3のオリゴヌクレオチドを前記第2の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第3のオリゴヌクレオチド、及び
第5のDNA配列と第6のDNA配列とを含む第4のオリゴヌクレオチドであって、前記第5の配列は、前記第4の配列に相補的である、第4のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第2の配列は、前記第5の配列に相補的であるか、又は前記第6の配列に相補的である、流体反応チャンバ。 - 前記第1又は第2のオリゴヌクレオチドが、蛍光部分を含む、請求項71に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第1又は第2のオリゴヌクレオチドが、蛍光消光剤を含む、請求項71に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一である、請求項71〜73に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一ではない、請求項71〜73に記載の流体反応チャンバ。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項74に記載の流体反応チャンバ。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項75に記載の流体反応チャンバ。
- 前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項71に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第1のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項71〜78に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項71〜79に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項80に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第5のDNA配列のそれぞれが、約5〜約20ヌクレオチドの長さを有する、請求項71に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第4のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項80に記載の流体反応チャンバ。
- 前記第6のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項71に記載の流体反応チャンバ。
- 円形、楕円形、正方形、三角形、矩形、六角形、八角形、菱形又は台形である、請求項71〜84に記載の流体反応チャンバ。
- 前記流体反応チャンバが均一な温度ではなく、前記反応チャンバの最高温度領域が前記反応チャンバの最低温度領域より少なくとも10℃高い、請求項71〜85に記載の流体反応チャンバ。
- 前記反応チャンバの前記最低温度領域が、約10℃〜約50℃である、請求項71〜86に記載の流体反応チャンバ。
- 前記反応チャンバの前記最高温度領域が、約51℃〜約100℃である、請求項71〜87に記載の流体反応チャンバ。
- 前記流体反応チャンバ内に配置された流体を更に含み、前記流体は、1つ以上のオリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーション緩衝液を含む、請求項71〜88に記載の流体反応チャンバ。
- 前記流体が、非特異的な核酸染色色素を更に含む、請求項89に記載の流体反応チャンバ。
- 標的核酸を増幅する方法であって、
(a)請求項71に記載の流体反応チャンバを提供する工程であって、前記流体反応チャンバは、第1及び第2の熱源と動作可能な関係にあり、前記第1及び第2の熱源は、環状チャンバに異なる第1及び第2の熱レベルを適用することができ、前記第1及び第2の熱レベルは同一ではない、工程と、
(b)前記流体反応チャンバ内に、標的核酸配列を含む流体を導入する工程と、
(c)第1及び第2の熱レベルを前記流体反応チャンバに適用する工程と
を含む、方法。 - 前記標的核酸の増幅を検出する、請求項91に記載の方法。
- 前記第1又は第2のオリゴヌクレオチドが、蛍光部分を含む、請求項91〜92に記載の方法。
- 前記第1又は第2のオリゴヌクレオチドが、蛍光消光剤を含む、請求項91〜92に記載の方法。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一である、請求項91〜94に記載の方法。
- 前記第2のDNA配列のそれぞれが同一ではない、請求項91〜94に記載の方法。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項94に記載の方法。
- 前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項95に記載の方法。
- 前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項91に記載の方法。
- 前記第1のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項91〜99に記載の方法。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項91〜100に記載の方法。
- 前記第3のDNA配列のそれぞれが、約15〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項101に記載の方法。
- 前記第5のDNA配列のそれぞれが、約5〜約20ヌクレオチドの長さを有する、請求項91に記載の方法。
- 前記第4のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項101に記載の方法。
- 前記第6のDNA配列のそれぞれが、約5〜約80ヌクレオチドの長さを有する、請求項91に記載の方法。
- 前記流体反応チャンバが、円形、楕円形、正方形、矩形、三角形、六角形、八角形、菱形又は台形である、請求項91〜105に記載の方法。
- 前記流体反応チャンバが、均一な温度ではなく、前記反応チャンバの最高温度領域が前記反応チャンバの最低温度領域より少なくとも10℃高い、請求項91〜106に記載の方法。
- 前記反応チャンバの前記最低温度領域が、約10℃〜約50℃である、請求項91〜107に記載の方法。
- 前記反応チャンバの前記最高温度領域が、約51℃〜約100℃である、請求項91〜108に記載の方法。
- 前記流体が、非特異的な核酸染色色素を更に含む、請求項91〜109に記載の方法。
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