JP2015522267A - 増幅されたヌクレオチド配列の迅速な検出のための方法および装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、連続流動のＰＣＲ増幅と、試験片における毛管現象によるオリゴクロマトグラフの検出とを組み合わせた、試料内に存在する可能性があるターゲットヌクレオチド配列の増幅および高速検出のための方法および装置に関する。

Description

本発明の目的

本発明は、生体試料内に存在する固有かつ特定の遺伝子配列の（遺伝子）（酵素）増幅による遺伝子配列（アンプリコン）の迅速な検出のための方法および装置に関する。

方法は、好ましくは、異なる複数の遺伝子ターゲット配列（オリゴヌクレオチド）を含む試料に関する診断的適用のために設計され、（ｉ）試料内の特定の核酸配列の高速かつ効率的検出ならびに、検出結果と、試験された試料が由来する個人のさまざまな病状および病気、とりわけ、抗生物質などの治療薬に耐性のある形態のものを包含する、感染病、菌血症、感染性の呼吸器または腸の疾患との相関関係のための、（ｉｉ）食品の汚染を特定するための、または（ｉｉｉ）予後試験、特に、試料内に存在する可能性があるガンマーカーの試験のためのものである。

現在の技術水準

（遺伝子）増幅法の中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学において、生体試料内に存在する可能性がある固有かつ特定のヌクレオチド配列の一つまたはいくつかの複製の特定の増幅を得るために最もよく使用されている手法である。この手法では、一連の（遺伝子）増幅サイクルによって、数百万、さらには数十億もの固有かつ特定の配列の複製の生成が可能である。ＰＣＲ増幅法は、いくつか（二つまたは三つ）の特定の温度に加熱および冷却するための繰り返しの熱サイクルを包含し、このサイクルによりヌクレオチド配列を変性し、プライマーをハイブリダイゼーションし、そしてハイブリダイゼーションされたプライマーの初期のヌクレオチド配列を酵素伸長する。

この方法は、一連の熱サイクル、とりわけ、繰り返されかつ連続した温度の上昇および下降によって増幅される試料のターゲット遺伝子配列を収容する静止反応チャンバーを加熱および冷却するプログラム可能な機器を用いて実現される。

増幅速度は、機器の加熱ブロックの加熱および冷却速度によって制限される。

（複数の）ＰＣＲ増幅のための合計時間を減少させるために、いくつかの手法が提案されてきた。それらの一つは、連続動的流動の下でＰＣＲ増幅を実現することからなる。

この手法では、各々が一定温度を有する二つまたは三つの異なる空間区域を通過する（マイクロ）チャネルを通る一定流量で試料を進ませることができる。

そのような装置は、Koppらの論文（1998,Science 280,1046-1048）に特に記述されている。この装置は、変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のための異なる温度を有する三つの区域を数回通って進むチャネルを包含する。試料は、チャネルの一方の端部に導入され、増幅された試料が分析のために回収されるチャネルの他方の端部に向かって送られる。

小型化された形式および連続（一定）した動的流動による（遺伝子）増幅では、増幅されたヌクレオチド配列の検出も必要となる。

Koppらの論文では、増幅された試料は、増幅装置の外部においてエチジウムブロマイドで染色されたゲルを用いた電気泳動によって分析される。

ＰＣＲは、極めて敏感な増幅手法であり、したがって試料を汚染しうる非常に少量の（特に先行する増幅からの）ヌクレオチド配列が増幅され、偽陽性結果が生成されることがある。この欠点を抑制することを考慮した最も効率的な手法は、（ＰＣＲ）増幅工程と増幅された生産物を検出する工程とを、同一の、閉鎖され、使い捨て可能の装置に統合することからなる（一度限り使用）。

そのような統合装置は、例として、微小のチェッカー盤を用いたキャピラリー電気泳動またはハイブリダイゼーションによる検出用に存在する。しかしながら、測定および分析のためのそのような方法および装置は、一般的に複雑かつ費用が高い。さらに、これらの装置における検出は、準備的な（遺伝子）増幅工程期間に生成されたマイクロバブルの放出によって乱されることがある。

したがって、その使用および効率を単純にし、その費用を減少し、そしてその使用の迅速さを増大するために、これらの方法および装置を単純化する要求がある。

本発明の目的

本発明は、単純かつ安価であり、現在の技術水準の欠点を有さない検出方法と装置とを組み合わせた、好ましくは、連続動的流動におけるＰＣＲによる（遺伝子）増幅のための方法および装置を提供することを目的とする。

本発明の特有の目的は、試料内の特定の核酸配列の存在の分析結果を得るための、迅速のみならず効率的な検出を可能とし、好ましくは、試料の迅速かつ歪曲されていない診断を提供し、場合により、この検出と、試料を採取された個人の種々の病状および病気、とりわけ、治療剤（とりわけ抗生物質）への耐性がある形態のものを包含する、菌血症、呼吸器または腸の感染病などの感染症との相関関係を知るための方法および装置を提供することである。

発明の概要

本発明の第一の態様は、好ましくはＰＣＲによる、増幅法、および生体試料内に存在する可能性があるターゲットヌクレオチド配列の少なくとも一つおよび／または最大数十の（多重検出）の検出方法に関するものであり、この生体試料は、好ましくは、（ｉ）動物または哺乳類などの個体、特に人間から抽出した試料、または（ｉｉ）食品成分の汚染物質であり、方法は、以下の連続的な工程を含む。

方法は、
ａ）装置を提供する工程を含み、装置が、
およそ０．０１ｍｍからおよそ１０ｍｍの断面を有するチャネルと、
チャネルと流体連通する試験片と
を含み、試験片が、
増幅されたターゲットヌクレオチド配列の少なくとも一つの第一の配列部分と相補的な第一の（一以上の）かつ特定のプローブ、または
一対の相補的かつ異なる分子の第一の分子からなり、その一対（異なりかつ相補的な分子の）の第二の（異なる）分子に結合することが可能な捕捉試薬（capture reagent）のいずれかを含み、この第二の分子は、（好ましくはＰＣＲによって、増幅期間中にアンプリコンを組み入れるプライマーを介して直接に、または相補的プローブを介して間接的に）増幅されたターゲットヌクレオチド配列の第一の配列部分に結合し、好ましくは、
それぞれ好ましくは異なる一定温度の少なくとも四つの（三つの）区域を生成する手段を含み、この区域の三つ（少なくとも二つ）は、チャネルにおける異なる場所に位置し、第四の（第三の）区域は、試験片に位置する。

それぞれ好ましくは異なる一定温度の三つ（少なくとも二つ）の区域を生成するためのこれらの手段は、（遺伝子）増幅工程を起こすことが可能なチャネルにおける異なる場所に位置し、一方で、試験片に位置する第四の（第三の）区域は、キャピラリー流動（キャピラリークロマトグラフィー）の際の膜（試験片）における効率的なハイブリダイゼーション処理のために、他の三つ（少なくとも二つ）の区域より低い一定値の温度に維持される。

先に記述した本発明の方法では、試料ならびに（遺伝子）増幅のための試薬（化合物および場合により添加剤）を含む溶液は、その後（「工程ｂ）」により）装置のチャネル内に導入され、とりわけ本発明の装置では、ターゲットヌクレオチド配列の、好ましくは、ＰＣＲ、場合により、ＲＴ−ＰＣＲまたはＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅、Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification）を用いる。（「工程ｃ）」により）ターゲットヌクレオチド配列のうち、増幅され、場合によりマークされた配列が、このように、増幅された配列を（「工程ｄ）」により）試験片に接触させる前に、（流体における）動的流動、好ましくはチャネル内の一定の（または連続した）流れにより溶液を循環させることによって生成され、こうして、（「工程ｅ）」により）第一のプローブと増幅された配列（および、場合により、第二のマークされたプローブ、またはＤＮＡに挿入されたマーカー）との間のハイブリダイゼーションによって、測定可能な検出シグナルを形成する錯体が生成される。

本発明の方法では、工程ｂ）〜ｅ）は、閉鎖された仕方に設計された工程ａ）の装置において発生し、したがって、他の遺伝子配列によって汚染されることがない（または、非常に少ししか汚染されない）。

本発明の方法により、増幅された配列は、好ましくはＰＣＲにより、複数の（遺伝子）増幅サイクルのために構成された、異なる一定温度の二つ（または、三つ）の区域を通過する複数のループを含むチャネル内で生成される。

したがって、チャネル内において、複数のループは、好ましくはＰＣＲによる、複数の（遺伝子）増幅サイクルのために構成された、少なくとも二つ（好ましくは、二つまたは三つ）の異なる一定温度の区域を通過する。

好ましくは、本発明の方法では、溶液は、一定の動的流動によってチャネル内での試料の置換を可能にするシリンジポンプを用いてチャネル内に導入される（押し進められる）。溶液は、吸引装置を用いてもチャネル内での一定の動的流動により導入し、置き換えられることができる。閉回路内の一定の動的流動には、ポンプ、例えば、蠕動ポンプ（または、ローラーポンプ）も応用することができる。

本発明の方法では、検出を容易にするため、好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅のための試薬として、選択的にマークできる（遺伝子）増幅プライマーの一対を特に用いる。この方法の一つの選択肢では、マークされたＤＮＡの挿入剤（例として、蛍光マーキング）によっても、増幅された配列（アンプリコン）のマーキングを実現できる。

好ましくは、各一対のプライマーの少なくとも一つにラベルが付される。

好ましくは、プライマーまたは増幅された配列（アンプリコン）のラベルは、金属粒子、とりわけ、金粒子、コロイド粒子、ポリスチレン粒子、カラー粒子、（常）磁性粒子、または蛍光要素によって形成された群より選択される。

本発明の方法の好ましい態様によれば、ラベルは、蛍光ラベル、例えば、シアニン（Ｃｙ５）、または同様の蛍光特性を有するラベルである。

本発明の方法では有利にも、検出シグナルは、ラベルによって形成された一つまたはいくつかの線、またはラベルによって形成された一つまたはいくつかのドットからなり、好ましくは、シグナルは、４、６、８、９、１０、１２、１４または１６ドット、さらには３２ドット以上（のネットワーク）からなり、これはラベルによって形成され、したがって試験片の表面に存在する。試験片の表面におけるラベルによって形成されるドットの数の選択は、検出分解能、ならびにドット全体の写真（画像）および種々のドット間の区別を得るための容易さに従い選択される。

本発明の方法は、増幅されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションされていない配列の部分を、サンドイッチタイプの検出を促進するように、ラベルされた一つまたはいくつかの第二のプローブとともに、第一のプローブに接触させることもできる。

本発明の方法は、それが単一鎖、二本鎖もしくは部分的な二本鎖、またはＲＮＡ配列から逆転写されたｃＤＮＡ配列か否かにかかわらず、任意のタイプのターゲットヌクレオチド配列の増幅および検出を可能にする。

本発明の好ましい態様によれば、方法は、ＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅）工程またはＲＴ−ＰＣＲ工程を包含する。

本発明の方法では、シグナルの読み出しは、好ましくは、一以上の可能性がある病原体、例えば、遺伝子的に改変された植物、バクテリアまたはウイルスによる一つまたはいくつかの感染症または食品成分の汚染の特定、および／または一つまたはいくつかの病原性が疑われる主体の一つまたはいくつかの治療処理に対する耐性、とりわけ、病原性が疑われる主体がバクテリアであるときの一つまたはいくつかの抗生物質の作用に対する耐性の特定にも相関する。

本発明の方法の効果は、９０分以内、好ましくは６０分以内、さらには、好ましい状況下では３０分以内に迅速に実施できるので、その迅速さにある。

本発明の方法は、ターゲットヌクレオチド配列が複数かつ異なっており、同じ試料内に同時に存在する場合（多重状況）のターゲットヌクレオチド配列の増幅および検出も可能にする。これらのヌクレオチド配列の数は、（異なるターゲットヌクレオチド配列の）５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００またはそれ以上となる可能性がある。

本発明は、少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列の増幅および（迅速な）検出のための装置にも関わるものであり、本発明の方法を利用するための手段、ならびに、およそ０．０１ｍｍ〜１０ｍｍからなる断面の少なくとも一つのチャネル、およびチャネルと流体連通する試験片を含み、試験片は、増幅されたターゲットヌクレオチド配列の（検出される）第一の配列部分の第一の相補的かつ特定のプローブ、または一対の異なりかつ相補的な分子（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、またはポリストレプトアビジン／ビオチン）のうち少なくとも一つの第一の分子からなる捕捉試薬を含み、そして前記の一対のうちの第二の分子を結合可能であり、この第二の分子は、（好ましくはＰＣＲにより、増幅期間中にアンプリコンに組み入れられるプライマーを介して直接に、または相補的プローブを介して間接的に）増幅されたターゲットヌクレオチド配列の第一の配列部分に結合し、好ましくは、チャネルおよび試験片は、二つの異なるチャンバー内に存在する。

有利には、装置は、異なる一定温度の少なくとも四つの（三つの）区域を生成するための手段も含むことができ、三つ（少なくとも二つ）の区域はチャネルの異なる場所に位置し、第四の（第三の）区域は試験片に位置し、チャネルは、異なる一定温度の三つ（二つ）の区域を通過し、好ましくはＰＣＲによる、複数の（遺伝子）増幅サイクルのために構成された、複数のループを包含できる。装置は、また、チャネルの端部に、チャネル内への試料の導入および好ましくは一定の（または連続した）動的流動を保証するシリンジポンプを含むことができ、または、吸引または特に蠕動ポンプ（ローラーポンプ）によってチャネル内の試料の好ましくは一定の（連続した）動的流動を保証するための他の手段、ならびにＭＬＰＡもしくはＲＴ−ＰＣＲによる試料の事前処理または試料のその他の事前処理のための手段も含むことができる。

本発明の装置では、試験片は、試験片の表面に、増幅されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションの後に線またはドットの形態の検出シグナルを生成することが可能な第一のプローブ（場合により、（場合によりラベルされた）第二のプローブ）を包含する。この検出シグナルは、４、６、８、９、１０、１２、１４または１６ドット、さらには３２ドット以上（のネットワーク）からなり得る。

本発明の別の態様は、好ましくはＰＣＲによる増幅および検出キットに関するものであり、前述の本発明の装置の手段、ならびに、好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅のための培地（試薬）および試験片におけるクロマトグラフの検出を含む。これらの手段は、好ましくはプローブ、好ましくはラベルされたプローブ、および／または、場合により、試料を希釈するための手段、とりわけ、バッファー溶液、および、好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅のために通例使用される要素、とりわけ、各一対のうち少なくとも一つのプライマーが場合によりラベルされた複数対の（単一目的または汎用の）プライマー、ならびに、増幅の効率性のための（陰性結果が真の陰性結果か否かの確認のための）一つまたはいくつかの内部コントロール手順である。

好ましくは、ラベルは、金属粒子、とりわけ金粒子、コロイド粒子、カラー粒子、ポリスチレン粒子、常（磁性）粒子、または蛍光要素からなる群より選択されるため、好ましくは本発明のキットでは、ラベルは、蛍光要素、特にシアニン（Ｃｙ５）または同様の蛍光特性を有するラベルである。

本発明を、添付の図面を参照して本発明の好ましい態様においてより詳細に記述する。

図１は、第一の実施態様による本発明の装置の特徴を図式的に示す。装置は、一定の動的流動における核酸の配列の（遺伝子）増幅が意図された手段を含む第一の部分、そしてそれと組み合わされた、オリゴクロマトグラフィーの手法によって、膜（試験片）において増幅された配列の検出を可能にする手段を含む第二の部分を含む。両方の部分は、増幅された配列を移送するための手段、例えば、流体連通するパイプ（管）を通して接続される。 図２は、第一の実施態様による本発明の装置の特徴を図式的に示す。装置は、一定の動的流動における核酸の配列の（遺伝子）増幅が意図された手段を含む第一の部分、そしてそれと組み合わされた、オリゴクロマトグラフィーの手法によって、膜（試験片）において増幅された配列の検出を可能にする手段を含む第二の部分を含む。両方の部分は、増幅された配列を移送するための手段、例えば、流体連通するパイプ（管）を通して接続される。 図３は、第二の実施態様による本発明の装置の特徴を図式的に示し、両方の部分が、装置の構造に統合されたチャネルを通り接続される。 図４は、測定可能な検出シグナルを形成する錯体を（「工程ｅ）」により）ハイブリダイゼーションによって生成するための、試験片に検出手段を異なる方法で設置するやり方を図式的に示す。

発明を実施するための形態

図１に図示する装置は、（核酸の）配列の迅速なかつ特定の（遺伝子）増幅、とりわけ、一定の（または連続した）動的流動におけるＰＣＲタイプの増幅を可能にする試料のマイクロ流体処理のための手段、そしてそれと組み合わされた、これらの増幅されたヌクレオチド配列（アンプリコン）を検出するための手段を含む。

図１に図示するように、本発明の装置は、このような（遺伝子）増幅を実行するための種々の適当な手段を含む、ＰＣＲによる第一の（遺伝子）増幅区域またはチャンバー１、およびチャンバー１からの増幅された遺伝子配列のこのような検出を実行するための種々の適当な手段を含む第二の区域または検出チャンバー２を含む。

チャンバー１として記述された装置は、既に技術水準から知られるものであり、マイクロ流体において、好ましくは一定の動的流動の下での、好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅のためのさまざまな手段を包含できる。

これらの手段は、ガラス、石英もしくはプラスチック、とりわけ、ポリカーボネート（Bayer Material Science）、またはシクロオレフィンの共重合体で作られ、そして射出成形によって作られたチャネル３を含む。このチャネルの微細構造的特徴は、好ましくは、従来のフォトリソグラフィー処理によって作られる。

場合により、チャネル３のアパーチャは、場合により希釈される試験される試料の導入および準備的な処理を容易にするために、装置の第一の部分において、場合により適合させられる。このような試料、好ましくは試料を含む溶液は、当業者に公知の種々の手段、特にマイクロシリンジによってチャネル３内に取み込まれることができる。

チャネル３は、好ましくは、コイル構成を有し、その外形寸法は変動し得るが、（遺伝子）増幅のために必要な種々の工程を実行することが可能な所定数のループを含み、これらのループの区域を正確に加熱するための手段と接触させられる。これらの手段は、ペルティエ素子または加熱エレメント、またはアルミニウムの加熱ブロック、および適当なセンサであることができる。

チャネル３は、好ましくはおよそ１５００ｍｍ〜およそ２０００ｍｍ、さらにはより長く最大３０００ｍｍ以上、一般的には１８５０ｍｍ程度の全長、およそ１００μmの深さ、およびおよそ２００μmの幅（直径）を有する。所定数の、好ましくは１５、２０、２５または３０、さらには５０（遺伝子）増幅サイクルより多く、好ましくは３５（遺伝子）増幅サイクルより多く、とりわけ４０（遺伝子）増幅サイクルより多く、好ましくは本例における４１（遺伝子）増幅サイクルより多い（遺伝子）増幅サイクルを行うことが可能なように、複数のループを持つコイルパターンが提供される。

これらの（遺伝子）増幅サイクルは、事前変性工程が先行し、その後に最終伸長（伸長後）工程が続くこともでき、本発明の装置は、分析される試料、および本発明の方法の工程に有効なバッファー、例として、増幅された配列の検出サポートへの非特異性の結合（ハイブリダイゼーション）の除去を意図するオリゴクロマトグラフィーのまたは洗浄のバッファー、を収容する可能性を与える、一つまたはいくつかの容器１１および１２も包含できる。これらの容器は、好ましくは、≪Ｌｕｅｒ≫タイプのアパーチャを通り充填され、栓で閉鎖される。有利には、装置は、パイプ１３、好ましくはループを形成し、ポンプヘッド、すなわち、蠕動ポンプ（ローラーポンプ）の要素（ローラー）と接触することが可能なフレキシブルパイプも包含する。このパイプ１３は、≪ｏｌｉｖｅ≫タイプのコネクタを介して、試料を収容することが意図された容器１１と、試料およびバッファーの流動的な置換（一定の動的流動）を、前記ポンプを利用して保証するためのバッファーを収容する容器１２に、本発明の装置を通して接続する。別の接続手段（パイプ）１４が、第二の区域またはチャンバー２（試験片４）内に存在する検出手段と容器１２との接続も可能にする。図３に図示するようなこのクローズドシステムは、したがって、汚染することがない（または、非常に少ししか汚染しない）、または汚染物質とはならない。

好ましくは、マイクロ流体装置は、一体的に作られ、チャネル３は、（第二の区域またはチャンバー２に向かう、増幅された配列の移送を可能にする流動的な連通１０を介して）本発明の装置の第二の区域またはチャンバー２内に存在する検出手段に連絡する。好ましくは、（遺伝子）増幅が意図されたチャネル３の端部は、オリゴクロマトグラフィーとして設計された方法によって増幅された遺伝子配列の検出を可能にする試験片４につながれる（連絡する）。

好ましくは、オリゴクロマトグラフィーによる検出が意図された（試験片に存在する）手段は、チャネル３を含むチャンバー１から分離した第二の区域またはチャンバー２内に位置する。増幅された生産物（増幅された配列を含有する溶液）が、クローズドシステム内での検出のため、直接、チャンバー２に移送され、好ましくは汚染すること、または汚染物質となることがないよう、両方のチャンバーは流体連通される。

この第二のチャンバー２は、三つの区域または領域が組み入れられた試験片４を含む。これらの三つの区域は、流体またはその構成成分（すなわち、増幅された配列を含む溶液）の毛管現象による近位部５から遠位部６への移動を可能にする多孔質膜からなる。これらの三つの区域または領域は、適用領域７、検出領域８および吸収領域９である。

好ましくは、適用区域７の膜は、ガラス繊維または別の適当な材料（ポリエステル）からなり、検出区域８の膜は、ニトロセルロースからなり、吸収領域９の膜は、好ましくはセルロースからなる。当業者は、試験片４内の毛管現象による移動特質を改善、またはそれらのサポートにおける検出が意図された要素の統合を改善するための他のタイプの構造および材料を考慮できる。当業者は、例として、適用区域７が検出区域８と同じ膜に存在する、または区域もしくは吸収領域９が全くない試験片４の構造を提供できる。試験片４がニトロセルロースで全体的に覆われ、吸収区域が全くないことも構想できる。

異なる区域または領域は、試験片４に接触させられた異なる増幅された遺伝子配列の検出を容易にすることが可能な異なる試薬を包含できる。

好ましくは、（遺伝子）増幅チャネル３を連絡させるための手段が、適用区域７に作られ、これは増幅された遺伝子配列（図４）のための特定のハイブリダイゼーション手段を含む。有利かつ意外には、（流動的な連通１０を介する）この適用、および試験片４における毛管現象による置換は、追加の溶媒または特定のハイブリダイゼーション塩を追加する必要なく、増幅された配列を含む溶液の流れによって直接に達成できる。好ましくは、チャネルによって運ばれ、試験片に堆積する溶液の容積は、およそ１０μl〜およそ５０μl、好ましくはおよそ３０μl〜およそ１０μl、好ましくはおおよそ２０μlである。

検出の表示は、検出区域８の膜に存在する一つまたはいくつかの検出線または一つまたはいくつかの検出ドット（または、任意の他の模様、文字、線、ドットもしくは模様）とすることができ、検出線またはドットは、（遺伝子）増幅チャネル３内で実行された増幅からの一つまたはいくつかの増幅されたヌクレオチド配列の適用に特定的である。

有利には、検出器によって容易に読み出される適当な模様を生成するために、検出剤がネットワークに従って試験片のサポートに置かれ、このネットワークは、好ましくは、４、６、８、９、１０、１２、１４または１６ドット、さらには３２ドット以上であり、検出をコントロールするための少なくとも一つまたは二つのドット（増幅（内部コントロールとして使用される特定の配列の特定のハイブリダイゼーション）のコントロール、および移動のコントロール（増幅工程期間に使用されない（場合によりラベルされた）プライマー配列の過剰分の検出）のための少なくとも一つのドット、ならびに試験片の位置を決めるためのドット）を包含することが可能である。

膜、とりわけ、検出区域８に存在する検出手段は、特定の状況下で一以上の増幅されたヌクレオチド配列の特定の配列の部分（図４）にハイブリダイゼーション（捕捉）される第一の捕捉プローブからなる。

好ましくは、この第一の捕捉プローブは、核酸または同様の分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡなど）からなるヌクレオチド配列からなる。担体試薬は、結合要素、例えば、ハプテン、ペプチドまたは前記担体試薬に特定的に結合できる任意の他の分子を通じて第一の捕捉プローブに結合できる。

好ましくは、第一の捕捉プローブは、一対の（結合した）異なる、または相補的な分子の第一の分子（第一の要素）、例えばビオチンに結合し、それ自体は、アビジン、ストレプトアビジン、ポリストレプトアビジン、または、ビオチンを結合する任意の他のタンパク質などの、一対の分子の相補的な要素を介してニトロセルロースに結合し、捕捉試薬として用いられる。

検出において、後者は、好ましくは、試験片４の表面における線もしくはドットの形態、または別の幾何学的形態（模様、図形）の一つまたはいくつかの検出可能な蛍光シグナル（の放出）を引き起こすことができる蛍光ラベルの励起（放出）によって生成される。後者は、蛍光検出器の使用によって見ることができる。使用されるラベルのタイプに依存して他の手段（例として、金でラベルされたプローブの反射率を測定するための手段）が選択される。

第一の実施態様では、検出は、二つの工程に分けて達成され、つまり、ターゲット配列と、ラベルされた特定のプローブとの間に錯体を形成させるために、増幅されたターゲット（特定の）ヌクレオチド配列が、試験片４を適用するための区域７に存在する相補的なかつラベルされた特定のプローブとハイブリダイゼーションされ、この錯体は、検出区域８に向かって膜を移動し、検出区域に結合された第一の捕捉プローブと反応することで、サンドイッチタイプの錯体を形成する。この錯体では、増幅されたターゲットヌクレオチド配列の第一の部分は、試験片４の特定の場所におけるターゲット配列の固定化を可能にする第一の捕捉プローブにハイブリダイゼーションされ、そして増幅されたターゲットヌクレオチド配列の第二の部分は、試験片４に形成され、固定化された錯体の検出を可能にする第二のラベルされたプローブにハイブリダイゼーションされる（図４Ａ）。この瞬間に、錯体は、ラベルの蓄積によって見えるようになり、検出可能となる。

第二の実施態様では、検出は、一つの工程において達成され、つまり、（例として、好ましくはＰＣＲにより、増幅の間にアンプリコンに組み入れられたラベルされたプライマーによって）増幅されかつラベルされたターゲットヌクレオチド配列が、試験片４の膜において検出区域８に向かって移動し、そこで、ラベルされたターゲット配列が検出区域における第一の結合捕捉プローブと反応し、それによって錯体を形成する。この錯体では、増幅されたターゲットヌクレオチド配列の第一の部分は第一の捕捉プローブにハイブリダイゼーションされ、増幅されたターゲットヌクレオチド配列の、試験片４の特定の位置における固定化を可能にする（図４Ｂ）。増幅されたターゲット配列におけるラベルの存在によって、試験片４に形成され、固定化された錯体の検出が可能になる。

増幅されかつラベルされたターゲットヌクレオチド配列を検出区域８に向かって移動させた後、場合により、検出シグナルの測定を妨げる可能性があり得る、（増幅された配列に組み入れられていない）ラベルされたプライマーの過剰分を除去する目的で、バッファーされた溶液を移動させることができる。場合により、試料を前記チャネル３内に導入された後数秒間後に、バッファーされた溶液を（前記チャネル３に接続された容器から）同じチャネル内に導入することができ、そして方法の増幅および検出工程の下での液体の流れを追跡できる。

有利には、本発明の装置の検出手段は、キャピラリー電気泳動によるまたは微小のチェッカー盤における検出において事例となり得るような、熱変化の後のチャネルの連続動的流動へのバブルの導入またはその形成によっては決して阻害されない。

本発明の好ましい態様によれば、第一の捕捉プローブは、ターゲットヌクレオチド配列を検出するための試験（図４）を実施する前に、試験片４の特定の場所に固定化される。例として、捕捉試薬（一対の異なる、かつ相補的な分子のうちの第一の分子）、例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはポリストレプトアビジンは、検出区域８全体において膜に結合でき、一対の異なる、かつ相補的な分子のうちの第二の分子、例えば、ビオチンを包含する第一の捕捉プローブは、その後、膜の特定の場所に堆積する。

結合は、好ましくは、捕捉試薬および第一の捕捉プローブを適当なバッファーで希釈し、膜、好ましくはニトロセルロース膜に線またはドットを堆積させることによって実現される。あるいは、プローブは、堆積する前に、担体分子（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、抗ビオチン抗体、およびビオチンタイプ、．．．の一対の相補的な分子（要素））、もしくは非生体サポート、例えば、（検出システムでは見えない）白ミクロスフェアのいずれかに予め結合され、またはニトロセルロースの膜に直接に（化学的に）結合する。

線の堆積の場合、捕捉試薬の分布速度は、毎秒およそ５０ｍｍ〜およそ１０ｍｍにおいて変動し得るが、好ましくは毎秒およそ３０ｍｍの値に設定される。

分布される材料の容積は、０．５μｌ／ｃｍ〜およそ３μｌ／ｃｍにおいて変動し得るが、好ましくは、おおよそ、およそ１μｌ／ｃｍである。

ドットの堆積の場合、分布される材料の容積は、１００ｎｌ〜１ｎｌにおいて変動し得るが、好ましくは、およそ１０ｎｌの値に設定される。

捕捉試薬の濃度は、およそ０．０１ｍｇ／ｍｌ（または、より低い濃度）またはおよそ０．１ｍｇ／ｍｌ〜およそ５ｍｇ／ｍｌにおいて変動し得るが、好ましくは、おおよそ１．５ｍｇ／ｍｌである。

第一の捕捉プローブの濃度は、およそ５０μＭ〜およそ１μＭもしくはおよそ１ｎＭまたはより低い濃度において変動し得るが、好ましくは、およそ３０μＭ〜およそ５μＭ、より詳細にはおおよそ１０μＭである。

本発明の好ましい態様によれば、結合に使用されるバッファーは、およそ７．２のｐＨのリン酸塩でバッファーされた食塩溶液（ＮａＣｌ）からなる。

サポートがニトロセルロース膜からなる場合には、試験片４は、その後、およそ５０℃の温度またはおよそ６０℃以上の温度において、数秒または数分（二分以上）間、最大およそ７２時間乾燥される。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の装置に使用されるオリゴクロマトグラフの試験片４は、およそ５７ｍｍの全長に対しておよそ５ｍｍのサイズの幅を有するが、他の形状および形式の試験片を使用できる。

本発明の装置および方法では、検出できる増幅された配列は、ＤＮＡ配列、とりわけ、単一鎖、二本鎖または一部分が二本鎖のＤＮＡ配列、およびＲＮＡ配列の逆転写によって得られたｃＤＮＡ配列でもあり得る。

逆転写工程は、場合により、本発明の装置の別ユニット、例として、好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅が起きるチャネル３に（場合により、バルブまたはポンプを通して）接続されたチャンバーまたは（マイクロ）チャネルの中で、本発明の方法に統合することができる。

本発明の方法および装置は、同じ試料内に存在する複数のかつ異なるヌクレオチド配列（多重状況）の増幅および検出に完全に適応する。

本発明の装置で検出できる異なるヌクレオチド配列の数は、適用に必要な要求に従い適応できる。本発明の方法および装置は、検出されるターゲットヌクレオチド配列の数に従いモデュレーションされ、試験片に存在するプローブの数を適応できる。

（特定のおよび／または汎用の）プライマーの対の数は、増幅されるターゲットヌクレオチド配列の数に適応させなければならない。

好ましい態様では、およそ２〜およそ５０のターゲットヌクレオチド配列、好ましくは、およそ５〜およそ２０のターゲットヌクレオチド配列が、同じ試料において増幅および検出される。

同じ増幅溶液内に存在する特定のプライマーの対が所定数を上回ると、（ＰＣＲ）増幅の効率が低下する。

同じ試料内で検出できるターゲットヌクレオチド配列の数を増大するために、ＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅）手法を使用できる。ＭＬＰＡは、多重ＰＣＲの代替手段であり、一対の汎用のプライマーを用いた複数のターゲットヌクレオチド配列の増幅を可能にする。ライゲーション工程は、好ましくはＰＣＲによる、増幅に先行する。ターゲッティングされたヌクレオチド配列に隣接する二つの部位（一部または部分）を認識することにより、増幅される各ヌクレオチド配列は、一対のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションがなされる。一対のうちの各オリゴヌクレオチドは、プライマーの一つと相補的な汎用の配列をさらに包含する。したがって、一対のオリゴヌクレオチドがそれらのターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションされると、それらはリガーゼにより連結できる。ライゲーションされたオリゴヌクレオチドは、その後、一対の汎用のプライマーによって増幅される。

ライゲーション工程は、場合により、本発明の装置の別ユニット、例として、好ましくはＰＣＲによる、一対の汎用のプライマーを用いた（遺伝子）増幅が起きるチャネル３に接続されたチャンバーまたは（マイクロ）チャネルの中で、本発明の方法に統合し、実行できる。

ＭＬＰＡを使用する実施態様では、２０〜１０００のターゲットヌクレオチド配列が、同じ試料において増幅および検出される。

試料は、好ましくは、精製されたＤＮＡおよび一定の動的流動に基づき増幅装置に使用できる他の構成成分を含有する水溶液である。

これらの種々の化合物は、好ましくは試料と同時に、場合により、チャネル３と連絡する他の（マイクロ）チャネルまたは容器を通じて、チャネル３内に導入される。

これらの他の構成成分は、この（遺伝子）増幅、好ましくはＰＣＲによる（遺伝子）増幅を実行することが可能な試薬であり、特に、適当なバッファー内においてＤＮＡの重合を得ることが可能なＤＮＡポリメラーゼであり、これは場合により、他の化合物（試薬）、例えば、塩化マグネシウム、プライマー、とりわけ、（遺伝子）増幅のための一対の適当な（特定のまたは汎用のいずれかの）プライマー、好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅に必要なタイプに従い選択された、および検出される遺伝子配列のタイプに従い選択されたｄＮＴＰの追加により補われる。

他の構成成分、例えば、表面ブロッキング（飽和）剤、好ましくは、ブロッキング剤として血清アルブミン（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または安定剤、ならびに反応エンハンサも反応溶液に追加できる。

好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅のための（特定のまたは汎用のいずれかの）プライマーとして使用されるヌクレオチド配列の選択は、増幅および検出されるヌクレオチド配列のタイプに従ってなされる。これらのプライマーの選択は、当業者の知る範囲内かつ、金属粒子、好ましくは、金粒子、コロイドまたは蛍光要素などの要素による任意のラベリングによる。

好ましくは、ラベルは、蛍光ラベルであり、好ましくは、シアニン（Ｃｙ５）または同様の蛍光特性を有するラベルからなる。

ラベリングは、第一の捕捉プローブとハイブリダイゼーションされていない増幅された配列の一部（または、部分）と相補的である第二のラベルされたプローブと、ラベルされていない増幅された配列との接触を介して、間接的に行うこともできる（サンドイッチ検出）。

多重形態におけるＤＮＡ配列の増幅を得るように、かつ試験片４におけるそれらの同時のまたは連続的な検出を容易にするように、種々のタイプの着色を有するラベルも、種々のプライマー配列をラベリングするために使用できる。

各色は、配列または増幅された遺伝子配列の群に特定的であり、試験された試料に初めから存在し、それらの比色検出は、当業者に公知の手段によって得ることができる。

本発明の装置は、シグナル、とりわけ、試験片４における、（蛍光の）ラベルによって形成された一つまたはいくつかのドットまたは線からなる蛍光シグナルを測定する能力がある要素、特にシグナル検出器、とりわけ蛍光シグナル検出器も包含する。

好ましくは、光源が、ラベルの蛍光を励起するための光ビームを生成する。検出は、分析されるドットまたは線全体を含む試験片４の表面において、同じ検出効率を得るように調節しなければならない。これに関連して使用される検出器は、ドットまたは線全体（または、任意の他の模様、図形、文字もしくは数値の模様）の写真を取る能力があるＣＣＤカメラである。

本発明の装置は、検出ユニットに加えて、好ましくはＰＣＲによる、この（遺伝子）増幅およびこの検出を容易にすることが可能な他の要素、特に、マイクロ流体装置のより低い表面における加熱ユニット（例として、加熱レジスタまたはアルミニウムブロック）を包含し、この加熱装置は、好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅反応、およびマイクロ流体装置の適当な部分の加熱処理による検出を得るように設計される。

例として、本発明の装置のチャンバー１および２は、温度が互いに独立してコントロールされる四つ（少なくとも三つ）の加熱ブロックの上に載っている。三つ（少なくとも二つ）のブロックが、好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅の温度を調整するために使用され、チャンバー１の下方のチャネル３の異なる区域に位置し、そして第四の（第三の）ブロックはチャンバー２の下方の試験片４に位置する。

好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅を高収率で実行するために、一つの温度区域から別の温度区域への転移を十分に明確にすることが重要である。この目的のために、加熱ブロックは、およそ１ｍｍからおよそ２ｍｍの間隔をあけて互いから分離される。

加熱ユニットは、加熱損失を制限するために、蓋または任意の他の装置も包含できる。

チャネル３は、好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅を容易にするよう、異なる温度に導かれた（において処理が行われる）異なる部分を包含し、一方で、検出チャンバー２は単一の適当な温度に維持される。

好ましくは、増幅区域またはチャンバー１内の温度は、およそ１００℃〜およそ９０℃（好ましくはおよそ９８℃）、およびおよそ５０℃〜およそ８０℃において変動でき（好ましくはおよそ５７℃）、一方で、検出区域またはチャンバー２は、およそ４０℃〜およそ６０℃（好ましくはおよそ４１℃）の温度に維持される。

検出ユニットと加熱ユニットとは、同じ装置に統合することができ、それとは逆に、ユーザの要求に従い分離することもできる。好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅にシグナルの測定よりも長い時間がもし必要であるならば、両方のユニットを分離することが有利となり得る。

種々のチャンバーまたは区域１および２は、適当な要素、特に、好ましくはポリエチレンもしくはシリコンの標準的な配管システム（チュービング）を用いて、または、ポンプ、シリンジ、バルブなどの手段を好ましくは包含するポンピングシステムを介して接続される。シリンジポンプは、例として、チャネル３を通る一定流動も可能にするような、（一定およびコントロールされた温度における）試料のポンピングを保証するために使用できる。

このシリンジポンプシステムは、好ましくは、毎分おおよそ０．３μlの最小ポンピング容積のため、およそ６ｍｍ〜およそ３０ｍｍの内部直径、毎秒およそ０．０１２ｍｍ〜およそ６ｍｍのポンプ流量を包含する。

装置の内側での一定流動は、閉回路内の蠕動ポンプ（ローラーポンプ）によっても保証できるが、速度が可変とすることができる。

本発明の方法は、９０分未満、好ましくは６０分未満、さらには３０分未満で、非常に迅速に実行される。好ましくはＰＣＲによる、（遺伝子）増幅は、６０分未満、好ましくは３０分未満で実行され、試験片における（検出および現像を包含する）検出は、１５分未満、好ましくは５分未満で実行される。

Claims (36)

1. 生体試料内に存在する可能性がある少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅および検出するための方法であって、好ましくは試料が個人から抽出され、以下の連続的な工程を含む方法であり、方法が、
   ａ）装置を提供する工程であって、装置が、
   ０．０１ｍｍ〜１０ｍｍの断面を有するチャネル（３）、
   チャネル（３）と流体連通する試験片（４）であって、試験片（４）が、増幅されたターゲットヌクレオチド配列の少なくとも一つの第一の配列部分に対して、一以上の第一の相補的かつ特定のプローブ、またはその一対のうちの第二の分子に結合することが可能な、一対の異なるかつ相補的な分子のうちの少なくとも一つの第一の分子のいずれかを含み、第二の分子が、増幅されたターゲットヌクレオチド配列の第一の配列部分に（直接または間接的のいずれかで）結合する、試験片（４）、および
   異なる一定温度の少なくとも四つの区域を生成するための手段であって、少なくとも二つ（さらには三つ）の区域がチャネル（３）の異なる場所に位置し、第四の区域が試験片（４）に位置する、手段、
   を含む、装置を提供する工程と、
   ｂ）試料及びターゲットヌクレオチド配列のための増幅試薬を含む溶液をチャネル（３）内に導入する工程と、
   ｃ）溶液をチャネル（３）内で一定の動的流動によって循環させることによって、ターゲットヌクレオチド配列の、増幅され、場合によりラベルされた配列を生成する工程と、
   ｄ）増幅された配列を試験片（４）に接触させる工程と、
   ｅ）第一のプローブと前記増幅された配列との間のハイブリダイゼーションによって、測定可能な検出シグナルを形成する錯体を生成する工程と、
   を含む、方法。
2. 工程ｂ）〜ｅ）が、閉鎖された仕方に設計された工程ａ）の装置において発生する、請求項１に記載の方法。
3. 増幅された配列が、複数の増幅サイクルのために構成された、異なる一定温度の二つの区域を通過する複数のループを含むチャネル（３）内で生成されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 増幅された配列が、複数の増幅サイクルのために構成された、異なる一定温度の三つの区域を通過する複数のループを含むチャネル（３）内で生成されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
5. 一定の動的流動によってチャネル（３）内の試料の置換を可能にするシリンジポンプを用いて溶液をチャネル（３）内に導入する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 吸引装置により、チャネル（３）内に一定の動的流動において溶液を導入、置き換えることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
7. 蠕動ポンプ（ローラーポンプ）により、一定の動的流動において溶液を置き換えることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
8. 増幅試薬が一以上の一対のプライマーを包含することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 各一対のプライマーの少なくとも一つがラベルされることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. プライマーのラベルが、金属粒子、とりわけ金粒子、コロイド粒子、カラーもしくは常磁性粒子、ポリスチレン粒子、または蛍光要素によって形成される群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. ラベルが蛍光ラベルであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 蛍光ラベルがシアニン（Ｃｙ５）または同様の蛍光特性を有するラベルであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 検出シグナルが、ラベルによって形成された一以上の線からなることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 検出シグナルが、ラベルによって形成された一以上のドットからなることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. シグナル、がラベルによって形成された４、６、８、９、１０、１２、１４、１６または３２ドット（のネットワーク）からなることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. ハイブリダイゼーションされていない、増幅されたヌクレオチド配列の部分を、一以上の第二のラベルされたプローブとともに、第一のプローブに接触させることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. ターゲットヌクレオチド配列が、単一鎖、二本鎖、部分的に二本鎖配列、またはＲＮＡ配列から逆転写されたｃＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかの方法。
18. 工程ｂ）およびそれ以前の工程において、ＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅）反応を包含することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
19. シグナルの読み出しが、一以上の病原体による一以上の感染症の特定、および／または一以上の治療処理に対する一以上の病原体の耐性の特定に相関する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 病原体がバクテリアであり、耐性が一以上の抗生物質に対する耐性である、請求項１９に記載の方法。
21. シグナルの読み出しが食品の汚染の特定に相関する、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
22. ９０分以内、好ましくは３０分以内に実行されることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 同じ試料内に存在する複数のかつ異なるヌクレオチド配列（多重状況）の増幅および検出のための、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
24. 一対の異なるかつ相補的な分子が、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、または抗ビオチン／ビオチン抗体からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
25. 請求項１〜２４のいずれかに記載の方法を適用するための手段を含む、少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列の迅速な増幅および検出のための装置であって、
    ０．０１ｍｍ〜１０ｍｍの断面を有するチャネル（３）と、
    チャネル（３）と流体連通する試験片（４）であって、試験片（４）が、（検出される）増幅されたターゲットヌクレオチド配列の第一の配列部分の第一の相補的かつ特定のプローブ、またはその一対の第二の分子に結合することが可能な、一対の異なるかつ相補的な分子のうちの少なくとも一つの第一の分子のいずれかを含み、第二の分子が、増幅されたターゲットヌクレオチド配列の第一の配列部分に（直接または間接的のいずれかで）結合する、試験片（４）と、を含み、
    チャネル（３）が、ＰＣＲによる複数の（遺伝子）増幅サイクルのために構成された三つ（少なくとも二つ）の異なる一定温度の区域を通過する複数のループを含む、装置。
26. 異なる一定温度の少なくとも四つの区域を生成するための手段を含み、三つの区域がチャネル（３）の異なる場所に位置し、第四の区域が試験片（４）に位置する、請求項２５に記載の装置。
27. チャネル（３）の端部において、試料のチャネル（３）内への導入および一定の動的流動を保証するシリンジポンプを含む、請求項２５または２６に記載の装置。
28. ＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅）による試料の準備的な処理手段をさらに含む、請求項２５〜２７のいずれかに記載の装置。
29. 試験片（４）が、試験片（４）の表面に、増幅されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションの後に線またはドットの形態の検出シグナルを生成することが可能な、第一のプローブ、および、場合により第二のプローブを包含することを特徴とする、請求項２５〜２８のいずれかに記載の装置。
30. シグナルが、４、６、８、９、１０、１２、１４、１６または３２ドット（のネットワーク）からなることを特徴とする、請求項２９に記載の装置。
31. 請求項２５〜３０のいずれかに記載の装置、ならびに試験片（４）における、ＰＣＲによる（遺伝子）増幅およびオリゴクロマトグラフの検出のための培地および試薬を含む、少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列のためのＰＣＲ増幅および検出キット。
32. 場合によりラベルされたプライマー、場合によりラベルされたプローブ、および／または場合により、試料を希釈するための手段、とりわけ、バッファーされた溶液を含む、請求項３１に記載のキット。
33. ラベルが、金属粒子、ポリスチレン粒子、カラーもしくは（常）磁性粒子、コロイド粒子または蛍光要素からなる群より選択される、請求項３２に記載のキット。
34. ラベルが蛍光要素である、請求項３３に記載のキット。
35. 蛍光要素が、シアニン（Ｃｙ５）または同様の蛍光特性を有するラベルである、請求項３４に記載のキット。
36. 一対の異なるかつ相補的な分子が、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、ポリストレプトアビジン／ビオチン、または抗ビオチン／ビオチン抗体からなる群より選択される、請求項２５〜３５のいずれかに記載のキット。

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