JP2011200193A - 核酸増幅方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも1回のPCRサイクルを行うことができる蛇行流路を備えた核酸増幅装置にPCR試料液を供給してPCR反応を行う核酸増幅方法において、前記核酸増幅装置は、片側のループ部に対応する1つの変性温度帯とアニーリングおよび/または伸
長を行う1つまたは2つの温度帯を有し、かつ、PCR試料液は気体によりPCRの1サイクル分或いはそれ以上隔てられた状態で前記蛇行流路内に供給されることを特徴とする、核酸増幅方法。
【選択図】図1
Description
で、コピー数を倍にすることが可能である。実際には、サーマルサイクルが続くと、必要な反応試薬の濃度が減少するので、増幅されたDNA産物の集積が、最終的に止まる。PCRの一般的詳細については、「Clinical Applications of PCR」、Dennis Lo(編集)、Humana Press(ニュージャージー州トトワ所在)(1998年)、および「PCR Protocols A Guide
to Methods and Applications」、M.A.Innisら(編集)、Academic Press Inc.社(カリフォルニア州サンディエゴ所在)(1990年)を参照のこと。
lといった極微量のPCRチャンバー内でテンプレートDNAを増幅し、検出できることを実証している。これらの参考文献では、試料量の低減により熱容量を小さくし、サーマルサイクルの高速化を目指しているが、チャンバーやヒーター自身の熱容量の低減に限界があるため、十分な増幅反応を行うには、少なくとも1サイクル当たり30秒程度必要であった。
リイミドコーティング溶融シリカキャピラリーを使用する連続流PCRデバイスを説明している。この形状では、一般的な連続流PCRに用いられる平板状のマイクロ流体デバイスと異なり、キャピラリーとヒーターが一体的となるため、ディスポーサブルな用途には不適ではあるが、95℃から約60℃の間に72℃の温度領域が入らないため、理想的なサーマルサイクルが可能な点で注目に値する。
項1. 少なくとも1回のPCRサイクルを行うことができる蛇行流路を備えた核酸増幅装置にPCR試料液を供給してPCR反応を行う核酸増幅方法において、前記核酸増幅装置は、片側のループ部に対応する1つの変性温度帯とアニーリングおよび/または伸長を
行う1つまたは2つの温度帯を有し、かつ、PCR試料液は気体によりPCRの1サイクル分或いはそれ以上隔てられた状態で前記蛇行流路内に供給されることを特徴とする、核酸増幅方法。
項2. 前記蛇行流路は、両側のループ部とその間の直線部を有し、片側のループ部に対応する1つの変性温度帯と、他方のループ部に対応するアニーリング温度帯と、直線部分に対応する伸長温度帯の3つの温度帯から構成される、項1に記載の核酸増幅方法。
項3. 前記蛇行流路は、両側のループ部とその間の直線部を有し、片側のループ部に対
応する1つの変性温度帯と、他方のループ部及び直線部に対応しアニーリング温度から変性温度の途中の温度で、伸長過程を実施する温度帯の2つの温度帯から構成される、項1に記載の核酸増幅方法。
項4. PCR試料液がセグメントフロー方式でポンプにより蛇行流路内に送液される、項1〜3のいずれかに記載の核酸増幅方法。
項5. より低温のアニーリング領域からより高温の変性領域へ向かうPCR試料液の移動速度は変性領域の蒸気圧により減少され、変性領域からアニーリング領域へのPCR試料液の移動速度は高温の変性領域の蒸気圧により増加される、項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法。
できる温度帯(伸長過程はアニール温度から変性温度の途中の温度で実施する)の2つの温度設定のサーマルサイクルでPCRを行う場合には、表1の推奨比率に対応するように実施すればよい。
その上に作製した連続流PCR用マイクロ流体デバイスと接触させることで、3ヶ所の接触領域について個別かつ局所的に温度を制御した。各ヒーターは、アルミブロック表面を均一に、120℃以上まで加熱可能な性能を有しており、また、底面側にペルチェ素子を接合させることで、5℃以下まで冷却する機能を持たせた。
示しているが、サーマルサイクルを1回実行できるように蛇行流路を設計してもよく、温度帯を2つになるように設計してもよい。
る。これにより、55℃から95℃へ向かう伸長反応の過程では、上流側の気液界面での蒸気圧は、下流側より高まるために流れ方向に逆らう力が発生し、図4に示すように、試料プラグは低速で移動する(図6(B)参照)。それに対し、95℃から55℃へ向かう微小流路内では、下流側の気液界面側の蒸気圧が高くなり流れを加速するように働くため、試料プラグは2〜3倍の速度で移動する。
定されるものではなく、RT-PCRを含むPCR法を利用した核酸増幅技術に利用可能
である。
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文献(5):Martin U.K. et al. Chemical amplification continuous-flow PCR on a chip. Science 1998; 280: 1046-1048.
2 蛇行流路
3 リザーバー
4 連続流PCR用微小流体デバイス
5 アニーリング用アルミブロック
6 伸長反応用アルミブロック
7 DNA変性用アルミブロック
8 試料プラグ(sample)
Claims (5)
- 少なくとも1回のPCRサイクルを行うことができる蛇行流路を備えた核酸増幅装置にPCR試料液を供給してPCR反応を行う核酸増幅方法において、前記核酸増幅装置は、片側のループ部に対応する1つの変性温度帯とアニーリングおよび/または伸長を行う1つ
または2つの温度帯を有し、かつ、PCR試料液は気体によりPCRの1サイクル分或いはそれ以上隔てられた状態で前記蛇行流路内に供給されることを特徴とする、核酸増幅方法。 - 前記蛇行流路は、両側のループ部とその間の直線部を有し、片側のループ部に対応する1つの変性温度帯と、他方のループ部に対応するアニーリング温度帯と、直線部分に対応する伸長温度帯の3つの温度帯から構成される、請求項1に記載の核酸増幅方法。
- 前記蛇行流路は、両側のループ部とその間の直線部を有し、片側のループ部に対応する1つの変性温度帯と、他方のループ部及び直線部に対応しアニーリング温度から変性温度の途中の温度で、伸長過程を実施する温度帯の2つの温度帯から構成される、請求項1に記載の核酸増幅方法。
- PCR試料液がセグメントフロー方式でポンプにより蛇行流路内に送液される、請求項1〜3のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- より低温のアニーリング領域からより高温の変性領域へ向かうPCR試料液の移動速度は変性領域の蒸気圧により減少され、変性領域からアニーリング領域へのPCR試料液の移動速度は高温の変性領域の蒸気圧により増加される、請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法。
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