BRPI0715904A2 - mÉtodo e sistema para monitorar um processo enzimÁtico em uma molÉcula biolàgica - Google Patents

Abstract

"MÉTODO E SISTEMA PARA MONITORAR UM PROCESSO ENZIMÁTICO EM UMA MOLÉCULA BIOLàGICA". A presente invenção fornece um método e um dispositivo para monitorar um processo enzimático de uma molécula biológica, em particular uma atividade de polimerização em uma amplificação de ácidos nucléicos, por exemplo, PCR, por, pelo menos uma vez, durante o processo enzimático que determina uma quantidade de partículas magnéticas ligadas a uma superfície de sensor. O método e o dispositivo de acordo com as formas de realização da presente invenção podem ser usados para monitorar um processo enzimático como uma função de tempo.

Description

"MÉTODO E SISTEMA PARA MONITORAR UM PROCESSO ENZIMÁTICO EM UMA MOLÉCULA BIOLÓGICA" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a processos enzimáticos e mais particularmente a um método e sistema para monitorar um processo enzimático em uma molécula biológica usando-se objetos magnetizáveis ou magnéticos como rótulos. O método e o dispositivo de acordo com a presente invenção podem ser usados para monitorar um processo enzimático como uma função de tempo. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os ácidos nucléicos (RNA, DNA) podem ser muito sensível e especificamente medidos usando-se um processo bioquímico de amplificação. A amplificação de ácido nucléico a detecção subseqüente são processos complicados que, no geral, requerem diversas etapas de processo. Para a detecção de material biológico (por exemplo, micro-organismos) estas etapas incluem tipicamente enriquecimento (seletivo), isolamento/purificação e identificação. Existem esforços grandes para a amplificação dos processos e melhora do desempenho analítico (por exemplo, sensibilidade, especificidade, velocidade). Por exemplo, foi mostrado que é praticável detectar sensível e especificamente os produtos de amplificação de RNA/DNA por meio de proteínas de ligando através de uma combinação de técnicas biológicas moleculares e imuno-detecção. Para o desenvolvimento de sinal outros ensaios usam a fluorescência, quimioluminescência ou uma ampla variedade de detectores de (imuno)sensor em vez de colorimetria. Entretanto, a maioria dos ensaios desenvolvidos são relativamente complexos, caros e/ou requerem instrumentação (sofisticada).

Um método de extração e amplificação simplificado combinado com um método de detecção de imunoensaio de fluxo lateral (LFIA) foi desenvolvido, sendo diversas ordens de magnitude mais sensíveis do que a eletroforese em gel e os resultados são revelados dentro de 5 a 15 minutos. Em princípio, o LFIA é adaptado para a detecção de multi-analito, isto é, a avaliação para até 6 seqüências de RNA/DNA específicas em um dispositivo de ensaio. Um método com base em partículas coloidais negras e ligandos específicos imobilizados em membranas de nitrocelulase permite a detecção de 5 a 30 parâmetros diferentes em um ajuste de mini-série. Os resultados podem ser digitalizados pela varredura em leito plano e análise de imagem.

O aspecto quantitativo e a faixa dinâmica da medição é um problema importante na amplificação bioquímica. Isto é, particularmente, o caso dos métodos de amplificação exponencial, tais como o PCR, que tem uma transição abrupta entre as concentrações de amplicon no nível de sub- detecção, por um lado e saturação do processo de amplificação bioquímico por outro lado. Freqüentemente, o resultado é uma resposta sim ou não em vez de um valor parecido para a concentração alvo.

Um método melhorado é o PCR em tempo real, em que a concentração de amplicons é dinamicamente medida (por exemplo, com orientações moleculares) durante o processo de amplificação bioquímico exponencial. Em PCR em tempo real quantitativo, os dados quantitativos são derivados usando-se projeto de sonda dedicado, controle de processo e monitoramento de processo. A concentração alvo original é deduzida do tempo requerido para desenvolver um certo sinal. As desvantagens da PCR em tempo real quantitativo são (i) o procedimento de ensaio complicado, (ii) nível de custo alto por teste e (iii) a dificuldade de realizar a multiplexação de ensaio.

Em suas formas mais comumente usadas, os métodos acima (ELISA, LFIA, PCR em tempo real), todos envolvem a detecção óptica. A detecção óptica pode ter diversas desvantagens, tais como

- Sinais básicos altos (por exemplo, autofluorescência do substrato ou do material de dispositivo, do material da amostra ou dos materiais biológicos no dispositivo de teste) particularmente quando as amostras biológicas complexas são usadas.

- As propriedades de rótulo podem depender do ambiente bioquímico (por exemplo, eficiência de fluorescência), que complica a quantificação da medição.

- Interconexões propensas a erro entre cartucho e leitor.

- Varredura por luz do dispositivo e da amostra fluida.

- A absorção de luz incidente e emitida/refletida depende das propriedades ópticas do fluido.

- Algumas vezes, equipamento de leitura caro é necessário.

Métodos de detecção alternativos para a detecção com base em

luz existem. Por exemplo, sensores magnéticos que detectam nanopartículas magnéticas estão sendo investigados para os propósitos biodiagnósticos devido às seguintes vantagens esperadas: desempenho analítico alto (sensibilidade (materiais biológicos tem uma base magnética muito baixa e sensores muito sensíveis estão disponíveis)), velocidade (devido à atuação magnética), especificidade (devido à discriminação de força), etapas de ensaio combinadas (por exemplo, extração e detecção alvo, com partículas magnéticas) e facilidade de uso (interconexão elétrica simples e confiável, o sensor e o leitor são compactos e de custo baixo).

As tentativas preliminares foram feitas para combinar a amplificação de ácido nucléico com detecção magnética. O WO 00/61803 divulga uma combinação de amplificação de ácido nucléico seguido pela detecção em um chip de sensor magnético. O processo inclui a aplicação de estringência pelas forças magnéticas. Solução é particularmente focalizada no método de Amplificação de Substituição de Filamento (SDA). O EP0781346 divulga um método em que a amplificação PCR é alternada com um método de detecção magnética. A detecção magnética é fundamentada na diferença na migração entre os iniciadores magneticamente rotulados e DNA amplificado. Em vista das desvantagens dos sistemas prévios, existe uma necessidade de processos de detecção de ácido nucléico em tempo real de faixa dinâmica, quantitativos, sensíveis e rápidos com base em métodos de detecção alternativos e/ou rótulos alternativos e/ou sensores alternativos. Ais métodos devem conter tão poucas etapas quanto possível, isto é . ter integração máxima de processo bioquímicos e detecção. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um método e um sistema para monitorar um processo enzimático. O método compreende:

- permitir que um processo enzimático aconteça em uma câmara de reação, a câmara de reação sendo fornecida com objetos magnetizáveis ou magnéticos, tais como partículas, fornecer um dispositivo de sensor tendo uma superfície de sensor,

- durante o processo enzimático, subseqüentemente atrair e retirar os objetos magnetizáveis ou magnéticos para e da superfície do sensor e

- pelo menos uma vez durante o processo enzimático, após atrair os objetos magnetizáveis ou magnéticos para a superfície do sensor, medir a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor.

De acordo com as formas de realização da presente invenção, a medição da quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor pode ser realizada antes dos objetos magnetizáveis ou magnéticos serem retirados da superfície do sensor ou após os objetos magnetizáveis ou magnéticos serem retirados da superfície do sensor.

A medição ou detecção de objetos magnéticos ou magnetizáveis ligados à superfície do sensor podem ser realizadas com ou sem a varredura do elemento de sensor com respeito à superfície de biossensor. De acordo com as formas de realização preferidas, a medição da quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor pode ser realizada mais do que uma vez e o método ainda pode compreender:

- monitorar a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados como uma função de tempo.

Os objetos magnetizáveis ou magnéticos podem ser revestido com uma primeira porção de captura e a superfície do sensor pode ser revestida com uma segunda porção de captura, a primeira e a segunda porções de captura sendo diferentes uma da outra.

A primeira porção de captura pode ser, mais preferivelmente compatível com uma primeira parte da molécula biológica e a segunda porção de captura pode ser, mais preferivelmente compatível com uma segunda parte da molécula biológica, a primeira parte sendo diferente da segunda parte.

A medição da quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados para a superfície do sensor pode ser realizada por qualquer método de detecção adequado, por exemplo, detecção magnética, detecção óptica, detecção sônica ou detecção elétrica. Preferivelmente, os objetos magnetizáveis ou magnéticos usados como rótulos podem ser detectados ou, em outras palavras, a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor pode ser medida oticamente, por exemplo, usando-se formação de imagem óptica ou varredura óptica, preferivelmente com uma técnica óptica que é sensível na superfície, por exemplo, com uma unidade captadora óptica de varredura confocal que detecta os rótulos através de um substrato oticamente transparente (similar às técnicas de armazenagem de dados por exemplo) ou com uma técnica de detecção de campo imperceptível.

Subseqüentemente atrair e retirar os objetos magnetizáveis ou magnéticos para e da superfície do sensor pode ser realizada por meio de forças magnéticas. As forças magnéticas podem ser geradas on-chip ou off- chip.

De acordo com as formas de realização preferidas da invenção, o processo enzimático pode ser um processo de amplificação de ácido nucléico de RNA ou DNA.

As formas de realização da invenção dizem respeito a métodos e ferramentas para amplificar ácidos nucléicos isto é, RNA ou DNA e determinando a quantidade de RNA ou DNA amplificado ou de um reagente envolvido no processo de amplificação. Neste método, a etapa de determinar a quantidade do ácido nucléico amplificado ou de um reagente envolvido no processo de amplificação pode ser realizada via detecção magnética, detecção óptica, detecção sônica ou detecção elétrica, e pode ser realizada pelo menos um período durante o processo de amplificação do dito RNA ou DNA. No método da presente invenção, a etapa de determinar a quantidade do RNA ou DNA amplificado ou de um reagente envolvido no processo de amplificação pode ser realizada via um método em que o ácido nucléico amplificado ou o reagente são ligados a uma superfície de sensor via uma ou mais moléculas biológicas ou moléculas de captura. As formas de realização particulares da presente invenção

dizem respeito a métodos e ferramentas para realizar tais métodos como descrito acima em que a uma ou mais moléculas biológicas que é/são usadas para ligar o ácido nucléico amplificado é DNA, Ácido Nucléico de Peptídeo (PNA) ou RNA que liga especificamente o ácido nucléico amplificado ou amplicon. Alternativamente, a molécula biológica pode ser uma proteína, uma vitamina, lipídeo ou carboidrato ou pode ser uma combinação tanto de um ácido nucléico quanto de uma proteína que garante a ligação do amplicon à superfície do sensor.

As formas de realização particulares da presente invenção dizem respeito a métodos e ferramentas para realizar tais métodos em que o ácido nucléico que é amplificado por um método isotérmico ou por um método de termociclização.

As formas de realização adicionais particulares da presente invenção dizem respeito a métodos e ferramentas para realizar tais métodos em que os iniciadores que são usados para a amplificação (amplímero) são rotulados com uma partícula magnética. As formas de realização alternativas da invenção dizem respeito a métodos e ferramentas para realizar tais métodos em que o amplicon é detectado por meio de uma sonda de hibridização específica, que é rotulada (nesta forma de realização, os amplímeros não são rotulados com uma partícula magnética).

A presente invenção ainda fornece um sistema para monitorar um processo enzimático em uma molécula biológica. O sistema compreende:

- uma câmara de reação para permitir que um processo enzimático aconteça, a câmara de reação sendo para o uso com ou fornecido com objetos magnetizáveis ou magnéticos,

- um dispositivo de sensor tendo uma superfície de sensor,

meios para, durante o processo enzimático, subseqüentemente atrair e retirar os objetos magnetizáveis ou magnéticos para e da superfície do sensor e

- meios para, pelo menos uma vez, após atrair os objetos magnetizáveis ou magnéticos para a superfície do sensor, medir a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor.

Os meios para medir a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície pode ser tal que a medição da quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor pode ser realizada antes dos objetos magnetizáveis ou magnéticos serem retirados da superfície do sensor ou após os objetos magnetizáveis ou magnéticos serem retirados da superfície do sensor Os meios para medir a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície pode ser tal que a medição ou detecção de objetos magnéticos ou magnetizáveis ligados à superfície do sensor podem ser realizadas com ou sem a varredura do elemento de sensor com respeito à superfície de biossensor.

De acordo com as formas de realização da invenção, o sistema ainda pode compreender meios para monitorar a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados para a superfície do sensor como uma função de tempo.

O métodos e ferramentas da presente invenção permitem, por

exemplo, determinação de polinucleotídeo com desempenho analítico melhorado, tal como velocidade, sensibilidade e especificidade melhoradas. Os métodos e ferramentas da presente invenção permitem a determinação da concentração de polinucleotídeo com facilidade melhorada de uso, tal como uma robustez maior, uma taxa de erro menor, interconxões mais simples e custo mais baixo.

Em um aspecto da presente invenção e a fim de medir a concentração de, por exemplo, ácidos nucléicos em uma amostra, o ciclo de partícula magnética é combinado com a amplificação de ácido nucléico, levando em conta a vantagem da integração e da sincronização do ciclo magnético e dos processo de ciclo de amplificação de ácido nucléico (por exemplo, ciclo de temperatura ou ciclo de reagente).

O métodos de acordo com as formas de realização da presente invenção podem incluir as seguintes etapas: uma etapa de extração de ácido nucléico opcional, uma etapa de pré-amplificação magnética opcional para determinar a quantidade de ácido nucléico de partida, uma etapa de amplificação de ácido nucléico e uma etapa de detecção em que uma biomolécula (por exemplo, DNA ou RNA) é usado para ligar o ácido nucléico amplificado, por exemplo, a uma superfície do sensor ou a um outro corpo. O métodos da invenção envolvem a detecção dos ácidos nucléicos amplificados ou de reagentes envolvidos no processo de amplificação pela ligação a uma biomolécula que é ligada por si só a um sensor. A ligação da biomolécula à superfície do sensor pode ser covalente.

De acordo com uma forma de realização, este processo pode

compreender as seguintes etapas.

- Amplificação de ácidos nucléicos em uma solução volumosa com iniciadores covalentemente ligados a partículas magnéticas e/ou uma superfície sensor-chip.

- Medição de nanopartículas na vicinidade de um sensor de

rótulo magnético (por exemplo, ligado por intermédio de uma biomolécula à superfície do sensor) como uma função de tempo e

- Aplicação de ciclo de partícula magnética para permitir que o primeiro processo de amplificação volumoso e o segundo processo de

detecção de superfície aconteça com eficiência alta.

Mais especificamente, quando usa-se o método de PCR, o método da invenção é caracterizado pela aplicação do ciclo de temperatura e atuação de força magnética para permitir a detecção do progresso de amplificação no modo próximo ao tempo real.

No geral, a presente invenção fornece métodos que combine a

amplificação de ácidos nucléicos com detecção de objeto magnetizável ou magnético sensível. O sistema é vantajoso em termos de detecção em tempo real, velocidade, controle do processo, monitoração do processo, multiplexação, densidade, facilidade de uso e baixo custo.

O método e o sistema de acordo com as formas de realização

da invenção são adaptados para a multiplexação do sensor (isto é, o uso paralelo de sensores diferentes superfícies do sensor), multiplexação do rótulo (isto é, o uso paralelo de tipos diferentes de rótulos) a multiplexação de câmara (isto é, o uso paralelo de câmaras de reação diferentes). O método e o sistema de acordo com as formas de realização da presente invenção podem ser usados como biossensores de ponto de cuidado rápidos, robustos e fáceis de usar para volumes de amostra pequenos. A câmara de reação pode ser um item descartável a ser usado com um leitor compacto e pode conter um ou mais meios geradores de campo magnético e um ou mais meios de detecção. Também, o método e o sistema de acordo com as formas de realização da presente invenção podem ser usados em teste de produtividade alta automatizado. Neste caso, a câmara de reação é, por exemplo, uma placa de reservatórios ou cadinho, que adapta-se em um instrumento automatizado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 mostra configurações alternativas de sensores de partícula magnética para a detecção de seqüências de ácido nucléico amplificadas para a detecção próxima do tempo real de acordo com as formas de realização da presente invenção.

A Fig. 2 mostra um exemplo de um sensor magnético para a detecção de seqüências de ácido nucléico amplificadas em uma configuração de duas etapas com módulos para amplificação e purificação de iniciador livre seguido pela detecção de chip de sensor magnético de acordo com as formas de realização da presente invenção. Após a detecção, o ácido nucléico amplificado é re-introduzido no módulo de amplificação.

A Fig. 3 mostra um exemplo de um sensor de partícula magnética para a detecção de seqüências de ácido nucléico amplificadas em uma configuração de tempo real com um módulo de três câmaras simples para a amplificação, purificação e detecção (após a detecção, o ácido nucléico amplificado re-introduzido no módulo de amplificação.) (A), ou com um módulo de uma câmara simples para a amplificação e detecção (B) de acordo com as formas de realização da presente invenção.

A Fig. 4 mostra uma ilustração de um dispositivo com uma câmara de reação e nanopartículas magnéticas (a entrada e a saída não são mostradas) de acordo com as formas de realização da presente invenção, as partículas são atuadas para passarem através de um processo de ciclo de partícula magnética, sincronizado com o processo de amplificação bioquímico.

A Fig. 5 mostra um gráfico de sinal de sensor como uma função de tempo.

A Fig. 6 mostra um método esquemático de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A amplificação por PCR é realizada na câmara de incubação acima do chip do sensor. Cada ciclo, uma combinação particular de temperatura e atuação de campo magnético é aplicada para a medição do estado do tempo próximo ao real do processo de amplificação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA FORMA DE REALIZAÇÃO Os amplímeros referem-se a uma nucleotídeo, tal como um

oligonucleotídeo de DNA ou RNA usado como iniciador para um DNA ou RNA polimerase. Os amplímeros em uma reação de PCR são, no geral, denominados iniciadores avançados e reversos. Um amplímero rotulado refere-se a um amplímero que é covalentemente ligado a uma micropartícula magnética ou nanopartícula e/ou uma molécula biológica, das quais os exemplos não limitantes são biotina e fluoresceína.

O amplicon refere-se a um ácido nucléico obtido como um resultado de um processo de amplificação.

A sonda de hibridização ou iniciadores de hibridização referem-se a um nucleotídeo, tal como um oligonucleotídeo de DNA ou RNA, que é usado para detectar o DNA ou RNA amplificados (isto é, amplicon). Em certas formas de realização da presente invenção a sonda de hibridização pode ser covalentemente ligada a uma micropartícula ou nanopartículas magnéticas e/ou uma molécula biológica. A sonda do sensor ou o iniciador do sensor refere-se a um nucleotídeo, tal como um oligonucleotídeo de DNA ou RNA, que é direta ou indiretamente ligado à superfície do sensor (isto é, a parte do dispositivo que está na proximidade de ou no local de ou na região de detecção de um sistema de detecção de uma partícula magnética) e é capaz de ligar o amplicon. Nas técnicas de amplificação em que o amplicon compreende RNA, uma sonda de sensor de RNA pode ser usada para ligar o RNA amplificado. A ligação da sonda do sensor à superfície do sensor pode ser covalente. Alternativamente, a sonda do sensor pode ser ligada à superfície do sensor através de uma ou mais biomoléculas (ligandos, anticorpos) covalentemente ligados a uma molécula biológica. Deve ser observado que a sonda do sensor pode ser qualquer sonda que pode formar uma ligação biológica específica com uma biomolécula na solução, por exemplo, anticorpo, carboidrato,....

A presente invenção será descrita com respeito às formas de realização particulares e com referência a certos desenhos, mas a invenção não é limitada a este mas apenas pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser construídas como limitante do escopo. Os desenhos descritos são apenas esquemáticos e não são limitantes. Nos desenhos, o tamanho de alguns dos elementos pode ser exagerado e não desenhados em escala para os propósitos ilustrativos. Quando o termo "que compreende" é usado no presente relatório descritivo e reivindicações, este não exclui outros elementos ou etapas. Quando um artigo indefinido ou definido são usados quando refere-se a um nome singular, por exemplo, "um" ou "uma", "o", este inclui um plural daquele nome a não ser que, algumas vezes, este seja especificamente estabelecido.

Além disso, o primeiro, segundo terceiro termo e outros no relatório descritivo e nas reivindicações, são usados para a distinção entre os elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem seqüencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assim usados são intercambeáveis sob as circunstâncias apropriadas e que as formas de realização da invenção descritas neste são capazes de operação em outras seqüência que não descritas ou ilustradas neste.

Além disso, os termos parte superior, parte inferior em, sob e outros no relatório descritivo e nas reivindicações são usados para os propósitos descritivos e não necessariamente para descrever as posições relativas. Será entendido que os termos usados desta maneira são intercambeáveis sob as circunstâncias apropriadas e que as formas de realização da invenção descritas neste são capazes de operação em outras orientações que não as descritas e ilustradas neste.

A presente invenção fornece um método para monitorar um processo enzimático de uma molécula biológica, tal como, por exemplo, um processo de amplificação de ácido nucléico ou um outro processo de conversão, com objeto magnetizável ou magnético, por exemplo, partículas magnéticas, como rótulos, enquanto detecta-se a ligação/não ligação os rótulos com respeito a uma superfície do sensor. Isto pode ser realizado por qualquer técnica adequada para detectar a presença de partículas magnetizáveis ou magnéticas em ou próximo da superfície do sensor, com base em qualquer propriedade dos objetos magnetizáveis ou magnéticos, por exemplo, partículas magnéticas. O método de acordo com as formas de realização da invenção é adaptado para a multiplexação de sensor (isto é, o uso paralelo de sensores diferentes superfícies do sensor), multiplexação de rótulo (isto é, o uso paralelo de tipos diferentes de rótulos) e multiplexação de câmara (isto é, o uso paralelo de câmaras de reação diferentes). Além disso, o método de acordo com as formas de realização da presente invenção pode ser usado como biossensores de ponto de cuidado rápidos, robustos e fáceis de usar para volumes de amostra pequenos. A câmara de reação pode ser um item descartável a ser usado com um leitor compacto e pode conter um ou mais meios de gerar campo magnético e um ou mais meios de detecção. Também, o método e o sistema de acordo com as formas de realização da presente invenção podem ser usados em teste de produtividade alta automatizado. Neste caso, a câmara de reação é, por exemplo, uma placa de reservatório ou cadinho, que adapta-se em um instrumento automatizado.

Qualquer reação química ou séries de reações catalisadas por

pelo menos uma enzima é descrita como uma processo enzímico ou enzimático. As enzimas compreendem um grupo grande de proteínas que aumenta as taxas de reação de processo bioquímicos e são produzidos por todas as células viventes e atua tanto dentro quanto fora das células. Existem muitas enzimas diferentes. A maior parte das enzimas

de ocorrência natural são altamente específicas, significando que cada enzima usualmente catalisa apenas uma reação bioquímica definida. Em, por exemplo, biologia molecular, certas enzimas são ferramentas para clivar e reunir DNA, o carregador de informação genética. "Enzimas de restrição" reconhece as seqüências definidas de nucleotídeos para cortar o DNA precisamente naquele local. Outras enzimas (Iigases) pode ligar filamentos separados de DNA em um pedaço contínuo. A presente invenção não é limitada a enzimas de ocorrência natural mas também inclui, dentro de seu escopo, o uso de enzimas semi-sintéticas ou sintéticas. As enzimas semi- sintéticas podem carregar grupos funcionais não naturais que inclui a substituição dos cofatores naturais quimicamente ligados a grupos funcionais que fornecem novas propriedades. Tais enzimas tem grupos sintéticos ou artificiais colocados em posições específicas na vicinidade próxima do local de cofator. Entretanto, as enzimas sintéticas não necessitam imitar as enzimas naturais de maneira alguma. As enzimas sintéticas são divulgadas, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos U 5.110.833.

Um processo enzimático bioquímico pode envolver diversas transformações moleculares ou, em outras palavras, pode ser realizado em qualquer molécula biológica. Um tipo de um processo enzimático pode, por exemplo, ser um processo de amplificação de ácido nucléico.

O método de acordo com a presente invenção compreende:

- permitir que um processo enzimático aconteça em uma câmara de reação, a câmara de reação sendo fornecida com objetos magnetizáveis ou magnéticos,

- fornecer um dispositivo de sensor tendo uma superfície de

sensor,

- durante o processo enzimático, subseqüentemente atrair e retirar os objetos magnetizáveis ou magnéticos para e da superfície do sensor e

- pelo menos uma vez durante o processo enzimático, após atrair os objetos magnetizáveis ou magnéticos para a superfície do sensor, medir a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor.

A medição ou detecção da quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor pode ser realizada antes dos objetos magnetizáveis ou magnéticos serem retirados da superfície do sensor ou após os objetos magnetizáveis ou magnéticos serem retirados da superfície do sensor.

A Medição ou detecção de objetos magnéticos ou magnetizáveis ligados à superfície do sensor podem ser realizadas com ou sem a varredura do elemento de sensor com respeito à superfície de biossensor.

A presente invenção ainda será descrita por meio de um dispositivo de sensor com base em sistemas magnetoresistivos. Entretanto, este não é limitante da invenção de maneira alguma. A presente invenção pode ser aplicada ao dispositivo de sensores que compreendem qualquer elemento de sensor adequado para detectar os objetos magnetizáveis ou magnéticos, por exemplo, partículas magnéticas em ou próximo da superfície do sensor com base em qualquer propriedade das partículas. Por exemplo, a detecção dos objetos magnetizáveis ou magnéticos, por exemplo, partículas magnéticas, pode ser realizado por meio de métodos magnéticos (por exemplo, elementos de sensor magnetoresistivo, sensores de entrada, espirais), métodos ópticos (por exemplo, fluorescência formadora de imagem, quimioluminescência, absorção, dispersão, ressonância de plasmon de superfície, Raman, ...), detecção sônica (por exemplo, onda acústica de superfície, onda acústica volumosa, cantiléver, cristal de quartzo, ...), detecção elétrica (por exemplo, condução, impedância, ciclo de redox amperométrico),....

Preferivelmente, os objetos magnetizáveis ou magnéticos usados como rótulos podem ser detectados ou, em outras palavras, a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor podem ser medidos, oticamente, por exemplo, usando-se formação de imagem óptica ou varredura óptica, por exemplo, com uma unidade captadora óptica de varredura confocal que detecta os rótulos através de um substrato oticamente transparente (similar ao DVD por exemplo).

Além disso, a presente invenção será descrita por meio dos objetos magnetizáveis ou magnéticos usados como rótulos sendo partículas magnéticas. Novamente, isto é apenas para facilitar a explicação e não limitar a invenção de maneira alguma. A presente invenção também aplica-se para um objeto magnetizável ou magnético sendo um bastão magnético, uma série de partículas magnéticas ou uma partícula de compósito, por exemplo, uma partícula contendo material magnético, bem como material oticamente ativo ou material magnético dentro de uma matriz não magnética.

A presente invenção ainda será descrita por meio do processo enzimático sendo um processo de amplificação de ácido nucléico de RNA ou DNA. Deve ser entendido que este é apenas um exemplo e não é pretendido limitar a invenção de maneira alguma. O método de acordo com a presente invenção também pode ser aplicado a outros processos enzimáticos.

Em conseqüência, em uma primeira etapa, o método de acordo com a presente invenção compreende deixar o processo de amplificação de ácido nucléico de RNA ou DNA acontecer em uma câmara de reação. A câmara de reação compreende a amostra com os ácidos nucléicos de RNA ou DNA e além disso, compreende partículas magnéticas como rótulos. As partículas magnéticas podem ser revestidas com uma primeira porção de captura. A primeira porção de captura pode ser qualquer porção de captura adequada conhecida por uma pessoa habilitada na técnica. Preferivelmente, a primeira porção de captura pode ser compatível com uma primeira parte do RNA ou DNA de ácidos nucléicos amplificados ou amplicon, de modo que as partículas magnéticas revestidas podem ligar-se ao ácido nucléico de RNA ou DNA através da primeira porção de captura. Por exemplo, no exemplo dado para a amplificação de ácido nucléico de RNA ou DNA, a primeira porção de captura pode ser um primeiro oligonucleotídeo.

A seguir, um dispositivo de sensor tendo uma superfície de sensor pode ser fornecido. A superfície do sensor pode ser revestida com uma segunda porção de captura que é mais preferivelmente diferente da primeira porção. A segunda porção de captura pode ser preferivelmente compatível com uma segunda parte do RNA ou DNA de ácido nucléico amplificados ou amplicon diferente da primeira parte, de modo que o ácido nucléico de RNA ou DNA pode ligar-se à superfície do sensor. Por exemplo, no exemplo dado para o processo de amplificação de ácido nucléico de RNA ou DNA, a segunda porção de captura pode ser um segundo oligonucleotídeo, preferivelmente diferente do primeiro oligonucleotídeo. A quantidade de partículas magnéticas que é ligada à superfície do sensor é uma medição de ácidos nucléicos de RNA ou DNA amplificados ou amplicons.

Durante o processo de amplificação, os ácidos nucléicos de RNA ou DNA ligados às partículas magnéticas serão subseqüentemente atraídos a e retirados da superfície do sensor. Isto pode ser feito por meio de forças magnéticas. De acordo com as formas de realização da invenção, as forças magnéticas podem ser geradas on-chip, por exemplo, por meio de um meio gerador de campo magnético, por exemplo, fio elétrico de corrente, integrado no dispositivo de sensor. De acordo com outras formas de realização da invenção, as forças magnéticas também podem ser geradas off- chip ou externamente, por exemplo, por meio de um magneto externo. Durante o processo de amplifícação, cada vez mais amplicons ou ácidos nucléicos de RNA ou DNA amplificados, serão gerados durante o tempo. Em conseqüência, assim como o processo de amplifícação procede ou, em outras palavras, assim como mais ciclos de amplifícação são realizados, cada vez mais amplicons ligar-se-ão às partículas magnéticas. Em outras palavras, durante o processo de amplifícação, cada vez mais amplicons, durante a etapa de atração, serão ligados à superfície do sensor durante o tempo. De acordo com o método das formas de realização da presente

invenção, a quantidade de partículas magnéticas ligadas à superfície do sensor pode ser medida pelo menos uma vez. A medição pode ser realizada após atrair as partículas magnéticas para a superfície do sensor. Preferivelmente, a quantidade de partículas magnéticas ligadas à superfície do sensor pode ser medida mais do que uma vez durante o processo de amplifícação. Neste caso é possível monitorar a quantidade de partículas magnéticas ligadas à superfície do sensor como uma função de tempo.

A seguir, algumas formas de realização serão descritas para a implementação possível do processo de amplifícação e a detecção, isto é, determinação qualitativa e quantitativa, dos ácidos nucléicos amplificados.

Em um aspecto, a invenção diz respeito a métodos em que a amplifícação de ácido nucléico é alternada com a determinação qualitativa e quantitativa do DNA amplificado usando-se detecção magnética e ferramentas para realizar tais métodos. Os métodos da presente invenção incluem as seguintes etapas:

- um processo de amplificação de ácido nucléico (por etapas

ou contínuo),

- uma ou mais etapas de detecção durante e/ou após o processo de amplificação em que uma sonda de sensor de DNA ou RNA é usada para ligar o ácido nucléico amplificado, por exemplo, a uma superfície do sensor ou a um outro corpo. A ligação da sonda de sensor para a superfície do sensor pode ser covalente.

Opcionalmente, os métodos da invenção compreendem ainda, antes da amplificação:

- uma etapa de extração de ácido nucléico e/ou

- uma etapa de pré-amplifícação magnética para determinar a quantidade de ácido nucléico de partida.

De acordo com uma forma de realização, a detecção do ácido nucléico amplificado ou amplicon é garantido pela incorporação do rótulo no amplicon. De acordo com sua forma de realização, o método da invenção compreende as seguintes etapas:

- amplificar os ácidos nucléicos em uma solução volumosa com iniciadores ligados às nanopartículas ou micropartículas magnéticas

- contactar o ácido nucléico amplificado com uma sonda de sensor ligada à superfície do sensor. A ligação dos iniciadores a uma superfície do sensor pode ser covalente.

- Detecção ou medição das nanopartículas ou micropartículas magnéticas pelo menos uma vez durante e/ou após o processo de amplificação.

Opcionalmente, o ciclo de partícula magnética é aplicado para permitir que o (primeiro) processo de amplificação volumoso e (segundo) processo de detecção de superfícies aconteça com eficiência alta.

Em uma forma de realização específica da invenção, o ciclo de temperatura e a atuação de força magnética são aplicados para permitir a detecção do progresso de amplificação em modo de tempo próximo ao real.

Como indicado acima, os métodos da presente invenção incluem uma etapa de amplificação de ácido nucléico, por exemplo, em líquido volumoso. Os métodos de amplificação diferentes que são conhecidos na técnica podem ser integrados nos métodos da presente invenção. Os protocolos de amplificação são comumente divididos em alvo e tipos de sonda de amplificação (Hill, C.S. (1996) Journal of Clinicai Ligand Assay 19, 43-52.).

A amplificação do "alvo" produz cópias da seqüência alvo desejadas pela síntese dos nucleotídeos individuais usando a molécula de ácido nucléico alvo como modelo. Os exemplos são reação em cadeia de polimerase (PCR), amplificação mediada por transcrição (TMA), amplifícação da seqüência com base em ácido nucléico (NASBA) e amplificação de deslocamento padrão (SDA) (Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491; Compton, J. (1991) Nature 350, 91-92; Walker et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20, 16914696; McDonough et al. (1997) em: Nucleic acid amplification technologies, Eds. Lee, H., Morse, S, e Olsvik, O., Natick, MA: Biotechniques Books, 113-123.). As formas de realização específicas da invenção envolve a amplificação de um DNA ou RNA específico usando PCR.Por outro lado 'tipos de sondas' de amplifícação produzem versões modificadas das sondas originais colocando na reação. Um exemplo deste método é a reação de cadeia ligase (LCR) (Laffler et al. (1993) Annales de Biologie Clinique 50, 821-826).

No caso da PCR e LCR um termociclo é usado por intermediários duplos filamentados desnaturados. Outros protocolos (por exemplo TMA, NASBA e SDA) são isotérmicos e requeridos geralmente apenas em um dispositivo de aquecimento em temperatura constante (por exemplo banho de água ou termobloco). Os métodos de transcrição tal como TMA tem diversas diferenças comparados à PCR/LCR. O TMA pode usar RNA ou DNA filamentado simples diretamente como um alvo. Teoricamente, estes métodos são mais rápidos do que a PCR/LCR em que estes podem produzir um amplificação de bilhões de vezes em tão pouco quanto 15 minutos, enquanto a PCR/LCR pode levar 3 a 4 horas para produzir uma quantidade similar. Por outro lado o TMA é potencialmente menor do que a PCR específica, porque o processo é realizado em uma temperatura inferior. As sondas específicas são usadas para compensar esta diferença.

Uma técnica recente (EXPAR) usa uma combinação de uma enzima de corte estável por calor e uma polimerase (Van Ness et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. 100, 4504-4509). Esta é uma reação de cadeia molecular isotérmica em que os oligonucleotídeos curtos são gerados. O método é altamente sensível e pode atingir amplificações de > IO6-vezes. A força, velocidade, e sensibilidade da reação exponencial é útil rapidamente em detectar a presença de pequenas quantidades de uma seqüência de DNA específica na amostra.

As técnicas de amplificação diferentes acima são geralmente referidas como processo de amplificação, isto é um processo de início da amplificação de uma amostra até a quantidade desejada da amplificação ser obtida, ou até as amplificações serem esgotadas e/ou as enzimas envolvidas na amplificação terem perda na sua atividade.

No caso do processo de amplificação de termociclo, este processo compreende tal como diversas das etapas de amplificação discretas. No caso dos processos isotérmicos, a amplificação é um processo contínuo. Pelo ciclo magnético com partículas rotuladas por sonda e uma outra sonda imobilizada em uma superfície do sensor o material amplificado (por exemplo um oligonucleotídeo de RNA filamentado simples no caso do NASBA) pode ser ligado à superfície pela detecção capaz de dados quantitativos ou qualitativos próximo ao tempo real. Preferivelmente, as sondas hibridizam à seqüência do material amplificado diferente das seqüências amplificadas.

Alternativamente, este processo pode ser entretanto dividido em etapas de amplificação pela manipulação da temperatura ou pela separação fisicamente do modelo das amplificações. Quando referidos ao método da presente invenção como um método da segunda etapa, um método pelo qual a amplificação (e opcionalmente a purificação) e detecção são realizadas em unidades diferentes, módulos ou câmaras do dispositivo usado. Tipicamente, o método de duas etapas da invenção será realizado em um dispositivo que compreende um módulo de amplificação, em que a amplificação é realizada e uma câmara de incubação que compreende a superfície do sensor (chip) (Figura 2). Opcionalmente, o dispositivo compreende um terceiro módulo em que os iniciadores livres são purificados.

De acordo com uma forma de realização particular da invenção uma amostra é pré-tratada, antes da amplificação (primeira), como uma etapa de extração de DNA e/ou RNA. Os protocolos adequados são descritos em manuais de referência em clonagem molecular (por exemplo Sambrook et al. 1989). Diversos tipos de kits de extração de DNA ou RNA são comercialmente disponíveis (Pharmacia, Dynal, Waters). Estes métodos de extração (tipicamente fabricam o uso de partículas magnéticas) removem os compostos incômodos tal como polissacarídeos e polifenóis.

Também os métodos simples de extração podem ser usados em que o rRNA é extraído que está presente em milhares de cópias em uma célula simples (Kohne et al. 1984) em Thomsberry et al. (Ed): Legionella: Proceedings of the 2o International Symposium, Washington D.C., American Society for Microbiology, 107-108). O uso de um certo pré-tratamento dependendo dos parâmetros tal como da complexidade e concentração da amostra.

Ainda em uma etapa opcional, o ácido nucléico, que é inicialmente extraído usando partículas magnéticas, pode ser diretamente usado para a detecção por um chip de sensor magnético, a fim de determinar a quantidade do material de partida em uma etapa de pré-amplificação.

De acordo com as formas de realização da invenção, os métodos da presente invenção podem compreender uma etapa de detecção usando sensores magnéticos. De acordo com uma forma de realização específica do método da invenção, uma biomolécula é usada para a ligação do ácido nucléico amplificado por uma superfície de sensor. A etapa de detecção é realizada pelo menos uma vez durante o processo de amplificação, e também opcionalmente no final do processo de amplificação. No processo contínuo de amplificação a detecção pode ser realizada em certos períodos de tempo durante o processo de amplificação. Gradualmente no processo de amplificação tal como PCR a etapa de detecção é tipicamente realizada após a etapa de extensão. A etapa de detecção pode ser realizada após cada ciclo de amplificação do processo de amplificação. Em certas formas de realização em que a determinação quantitativa é desejada, a etapa de detecção apresentada no estágio de fase exponencial de uma reação de PCR, tipicamente entre o ciclo de cerca de 15 ao ciclo de cerca de 25.

A porção de captura da primeira ou biomolécula, usada para a ligação da amplificação pelo sensor ou por uma molécula permitindo a detecção pelo dito sensor podendo ser uma proteína, um ácido nucléico mas também outros compostos biológicos tal como carboidratos ou vitaminas (por exemplo biotina).

De acordo com uma forma de realização particular da invenção a amplificação é ligada diretamente ou indiretamente para a superfície do sensor por meio de uma sonda de sensor ou porção da segunda captura que é um oligonucleotídeo específico para a amplificação. Opcionalmente, esta sonda de sensor é covalentemente ligada à superfície do sensor. Todos os tipos de sondas definidos neste, incluindo a sonda de sensor ou sonda de hibridização, também pode ser ligada a outras moléculas tal como proteínas, ou moléculas orgânicas, diretamente ao oligonucleotídeo, ou por intermédio da ligação a uma partícula magnética, que é ligada ao oligonucleotídeo. Por certos ligadores clivados da aplicação são considerados (por exemplo ligadores químicos cliváveis por um agente de redução, ou proteínas ou fragmentos de DNA que podem ser enzimaticamente clivados). As interações biológicas que garantem a ligação entre as moléculas biológicas consideradas na presente invenção são por exemplo ligação de DNA/DNA, ligação de DNA/RNA, ligação de anticorpo de antígeno, ligação de receptor do ligando, ligação do substrato da enzima, ligação inibidora de enzima, ligação de afinidade (por exemplo biotina-(estrept)avidina, Zinc-His-Tag, ligação de proteína GST-GST, etc.)

De acordo com uma forma de realização, as moléculas biológicas atuam como moléculas de capturas e são imobilizadas na superfície do sensor tal como por exemplo anticorpos, uma superfície de polímero ou proteína atrativa especial, etc. Estas moléculas de captura especialmente ligam-se as amplificações, por exemplo através de um rótulo ligado a um iniciador (sonda de sensor). A Figura 1, mostra no item 1 vários esquemas de captura que podem ser usados com a presente invenção. Por exemplo uma molécula de captura 16 tal como um anticorpo pode ser ligado à superfície do sensor 10 que compreende 12 geradores de campo magnético, por exemplo fios elétricos de corrente elétrica embebidos em um substrato 14. A molécula de captura 16 pode ser convalentemente ligada à superfície do sensor. As moléculas de captura 16 são ligadas à superfície do sensor pelo menos na vinicidade dos 12 geradores de campo magnético.

O substrato 14 pode ser um substrato orgânico ou inorgânico, por exemplo um polímero, substrato semi-condutor ou de vidro, por exemplo de um "biochip". O anticorpo 16 liga-se especialmente a uma aplicação 18 gerada pela etapa de amplificação diretamente ou através de um rótulo ligado a uma sonda específica para a amplificação. Uma partícula magnética ou magnetizável 20 é ligada à amplificação 18 através de uma proteína do ligando 22 ou por um outro meio, por exemplo diretamente (amplificação durante a incorporação) ou através de uma sonda de hibridização.

Em uma forma de realização alternativa da presente invenção, as sondas de sensor são ligadas diretamente à superfície do sensor, este é o ligando imobilizado pelo sensor que é em fato seqüências de oligonucleotídeos específicos 24 que hibridizam no final da amplificação 18 que não é ligada à partícula magnética 20 como mostrado na Figura 1, item 2. Uma partícula magnética ou magnetizável 20 é ligada à amplificação 18 através de uma proteína do ligando 22 ou por um outro meio, por exemplo diretamente (amplificação durante a incorporação) ou através de um sonda de hibridização.

As partículas magnéticas ou magnetizáveis 20, usadas na presente invenção são tipicamente na faixa de 10 nm por 5 micrômetro, isto é nanopartículas ou micropartículas magnéticas ou magnetizáveis. O tamanho das partículas magnéticas ou magnetizáveis 20 não devem ser tão pequeno, para facilitar a detecção e serem capazes de estimular as partículas com campos magnéticos aplicados. O tamanho também não deve ser tão grande, porque esta pode levar a ligação não específica, e sedimentação. Preferivelmente, o tamanho da partícula é na faixa entre 30 nm e 3 micrômetro, mais preferido entre 60 nm e 1 micrômetro. A estrutura da partícula e forma podem ser qualquer uma adequada, por exemplo núcleo magnético simples, núcleo multimagnético, esférico, em forma de bastão, etc. As partículas magnéticas ou magnetizáveis 20 ainda podem ser revestidas com (bio)polímeros para intensificar a estabilidade e para fornecer grupos funcionais para a ligação da molécula biológica como mencionado acima. Também, os componentes podem ser adicionados para facilitar a detecção da partícula magnética, por exemplo material luminescente no caso do detecção óptica.

Um sensor 10 a ser usado de acordo com a presente invenção detecta ou mede a presença de micro-partículas ou nanopartículas magnéticas 20 na vinicidade, por exemplo dentro de 100 μιη, mais preferido dentro de ΙΟμπι. De acordo com uma forma de realização particular, o sensor 10 será dez vezes mais sensível às nanopartículas dentro de 1 μπι da superfície do sensor do que por nanopartículas em uma distância de 10 μπι da superfície do sensor. O sensor 10 pode ser qualquer sensor adequado que pode detectar a presença das partículas magnéticas (ver no início). Preferivelmente o sensor é um sensor com base óptica ou um com base magnética que é sensível aos rótulos magnéticos ligados à superfície do sensor. O sensor opcionalmente pode ser integrado em um chip.

Na superfície do sensor ou na proximidade da superfície do sensor preferivelmente muitas funções como possíveis são integradas, tal como percepção de temperatura, aquecimento, e detecção da partícula magnética. Os elementos de congelamento (por exemplo elemento Peltier) podem ser integrados no cartucho ou podem ser parte do instrumento de leitura. Quando o aquecimento e congelamento rápido é desejável (por exemplo PCR) a área de contato da amostra líquida ao elemento de calor ou frio ser preferivelmente tão grande quanto possível.

A força do campo e gradiente do campo requerido para transferir as partículas magnéticas através de uma solução dependendo de diversos parâmetros, por exemplo a susceptibilidade magnética e o momento magnético das partículas, a homogeneidade e concentração das partículas, a ocorrência das interações de partícula-partícula tal como formação ou agrupamento de cadeia, e a resistência de fluxo no meio. Os campos podem ser gerados pela combinação dos meios para gerar o campo (fios elétricos correntes e material magnético) na leitura, no cartucho, e no chip. Neste sistema estes parâmetros serão selecionados em uma tal maneira para dar o transporte repetitivo das partículas na câmara biológica durante o período do ensaio.

As ligações biológicas entre uma partícula magnética e um outro elemento (por exemplo a superfície do sensor) podem ser sondados ou rompidos pela geração da força ou torque entre as partículas e o outro elemento (ver por exemplo WO 2005010527).

As biomoléculas rotuladas magneticamente são introduzidas (por exemplo iniciadores e sondas rotuladas) e geradas (por exemplo a amplificação rotulada) na mistura de reação e são então manipuladas. Em particular formas de realização, as biomoléculas rotuladas magneticamente são distribuídas e/ou misturadas dentro desta mistura pela aplicação dos campos magnéticos. Por exemplo, ciclo do volume/superfície da partícula magnética nos ensaios bioquímicos são usados como foram recentemente descritos em um imunoensaio com detecção de partícula por um espiral plana (Luxton et al. (2004) Anal. Chem. 76, 1715.).

A presente invenção inclui métodos adicionais para o ciclo das partículas magnéticas em sensores resistentes ao magneto e métodos para fazer o volume bem como os processos da superfície mais eficiente, por exemplo usando agentes adicionais ou métodos de atuação dedicados como descritos no WO 2005010527.

As interações biológicas com micropartículas ou nanopartículas pode dar um forte aumento da inclinação de uma curva de fusão e especificidade intensificada da detecção, possivelmente devido aos efeitos co-operativos.

Os dispositivos e substratos diferentes são adequados para a realização dos métodos da presente invenção. O dispositivo pode ter um projeto em fluxo ou um através do fluxo. De acordo com as formas de realização da invenção, o substrato pode ser um substrato plano, um substrato com a estrutura da superfície ou um substrato poroso. Uma embalagem através do fluxo é por exemplo descrita em DE040286 EPP (depositado em Novembro de 2004). Cuidado é tomado para evitar ângulos mortos ou re- circulação indesejada, por exemplo tendo transições uniformes e para evitar as extremidades de fluxo com ângulos abruptos. No caso de uma etapa de lavagem é usada com uma solução de lavagem, o projeto da câmara preferivelmente garante uma taxa ampla renovada na superfície do sensor, por exemplo pela limitação da profundidade de fluxo na localização do sensor. O cartucho é preferivelmente feito de materiais que tem baixa ligação não específica de biomateriais, a fim de evitar a perda do material alvo e/ou reagentes pelas paredes do cartucho.

A Figura 2 ilustra uma forma de realização da invenção usando uma combinação de unidades de série de amplifícação 30, purificação 32 e detecção 34. O processo de amplifícação é separado a partir da etapa de detecção do sensor. As interações indesejadas entre os iniciadores livres e os ligandos específicos em uma superfície do sensor são evitadas e se necessário, os iniciadores livres e outros contaminantes de reação permanecerão após o processo de amplifícação e são removidos no módulo de purificação 32, que consiste de, por exemplo, material de sílica. De acordo com certas formas de realização o fluido na câmara de amplifícação é re-circulado, pelo qual o módulo de purificação é projetado para deixar a amplifícação passar e manter todos os outros materiais (por exemplo os iniciadores livres) na câmara de amplifícação.

A Figura 3A ilustra uma forma de realização da invenção pelo qual um dispositivo simples é usado com três câmaras 30, 32, 34, e cada transição separada por um sistema de válvula controlável para permitir a passagem controlada e adequada da solução na próxima câmara. As três câmaras 30 a 34 e o chip do sensor 10 cumpre os papéis similares como os módulos 30 a 34 e o chip do sensor 10 na construção como descrito na Figura 2, mas aqui os fluidos podem ser transferidos para frente e para trás entre as câmaras 30 a 34.

Ainda em uma forma de realização preferida um dispositivo do processo e detecção é como mostrado na Figura 3B, isto é, a amplifícação e detecção ou medição são realizadas em um dispositivo simples 36, preferivelmente em uma câmara simples na vinicidade do chip do sensor 10, que permite a detecção direta da amplificações formadas. Mais particularmente o dispositivo compreende uma superfície do sensor estável ao calor, preferivelmente com ligandos imobilizados ligados a este e tendo a capacidade de realizar um protocolo de amplifícação em temperaturas de variação (por exemplo PCR), ou em uma temperatura constante (por exemplo NASBA) como requerido pelo método de amplifícação usado. Adicionalmente, o dispositivo é adaptado para permitir uma remoção dos iniciadores livres competitivos se presente, para evitar a ocorrência de interações não específicas tal como em complexos de iniciador-iniciador e para levar em conta as características específicas das partículas magnéticas usadas.

Como mostrado esquematicamente na Fig. 4, a presente invenção inclui os métodos adicionais para o ciclo das partículas magnéticas em sensores de partículas magnéticas e métodos para fazer o volume bem como os processos da superfície mais eficientes, por exemplo usando agentes adicionais ou métodos de atuação dedicados como descritos no WO 2005010527.

As modificações do dispositivo do processo e detecção são incluídos dentro do escopo da presente invenção. Em particular, outros dispositivos geométricos possíveis incluem o uso de área de alta superfície ou materiais porosos para uma superfície do sensor. Ainda um fluxo lateral ou arquitetura através do fluxo podem ser usados.

A presente invenção é aplicável em uma variedade de aplicações. Uma lista não limitante de aplicações são por exemplo, uma detecção de micro-organismos (desperdício ou envenenamento dos alimentos, das toxinas que codificam os genes no campo agro-alimentício-ambiental; a avaliação dos genes ativos (mRNA em estudos 'genômicos') em lavouras e frutos (indicadores de qualidade); a detecção de GMO's (segurança e identificação do alimento) avaliação da adulteração/fraude (determinação do DNA estranho); a detecção dos produtos alergênicos/contaminações; a detecção de micro-organismos com conseqüências ambientais, por exemplo MRSA, legionella, listeria; a identificação de micro-organismos em culturas celulares. As aplicações em diagnósticos clínicos são por exemplo: a detecção de micro-organismos com respeito a sepse, meningite, doenças respiratórias, tuberculose, hepatite, AIDS, etc.; a identificação de micro-organismos em culturas celulares, por exemplo relatados pelas doenças acima.

A invenção agora é ilustrada com os seguintes exemplos.

Exemplo 1: Amplificação de PCR usando amplificações dentro do rótulo magnético.

Após uma etapa de extração de ácido nucléico opcional, a amplificação dos ácidos nucléicos é realizado em qualquer dos dispositivos do processo e detecção mencionados acima de acordo com o protocolo de PCR com duas amplificações específicas na solução. O processo de amplificação resulta em 18 amplificações pelo qual um dos filamentos hibridizam com a sonda de hibridização que é covalentemente ligada à superfície de nano ou micropartículas magnéticas 20. Uma outra parte deste filamento de 18 amplificações hibridizam com uma outra sonda complementar, isto é a sonda de sensor, ligada pelo chip da superfície do sensor. A ligação pode ser covalente. A interferência mínima é obtida quando a hibridização e a sonda de sensor hibridizam com uma seqüência de ácido nucléico dentro do filamento estendido que não é complementar às amplificações usadas no processo de amplificação. Neste exemplo, a concentração de micropartículas ou nanopartículas que tornam-se ligadas pelo sensor é intermitentemente medida, em um ponto particular na seqüência de repetição (ciclo).

As três etapas seguintes descrevem um ciclo de PCR

convencional:

Modelo de DNA de filamento duplo é aquecido para dissociar os filamentos individuais, tipicamente entre 90 e 99° C (desnaturação).

A temperatura é diminuída para permitir os iniciadores fortalecerem aos filamentos livres, tipicamente entre 45 a 65 dependendo do comprimento e seqüência do iniciador de amplificação (fortalecimento).

A temperatura é aumentada, tipicamente a 72° C. Os iniciadores são estendidos junto aos filamentos modelos (extensão).

A fim de detectar e medir o ácido nucléico amplificado, por exemplo DNA, RNA das seguintes etapas são realizados:

Após a completa amplificação do DNA, a temperatura é aumentada para dissociar ao DNA de filamento duplo.

As sondas de hibridização com micro ou nanopartículas magnéticas são atraídas a partir do volume da solução em direção a superfície do sensor usando uma força magnética, por exemplo devido aos gradientes de campo magnético gerados pelos 12 geradores integrados do campo magnético e/ou pelos geradores externos do campo magnético ao substrato. O filamento de DNA complementar para a hibridização e as sondas de detecção, são colocados (por intermédio da hibridização) entre estas sondas. Como uma conseqüência do filamento de DNA é imobilizado para a superfície do sensor e rotulado com uma partícula magnética.

As sondas de hibridização não ligadas são subseqüentemente repelidas da superfície do sensor pela aplicação de uma força magnética, por exemplo por um campo magnético e/ou gradiente de campo magnético com a inclinação correta, entretanto a força máxima sendo tal que esta não rompe o DNA-DNA que hibridiza no complexo de sonda de sensor da sonda de hibridização padrão. Os valores típicos são na faixa de pN, as forças na faixa de nN romperão as ligações específicas (como descrito no WO 2005010527).

A força do campo magnético das partículas magnéticas ligadas à sonda de hibridização é medida, este valor sendo relatado a uma quantidade da amplificação formada na amplificação de PCR. Este método permite uma detecção de PCR próximo ao tempo real. Nesta forma mais comum usada, a PCR de tempo real detecta um volume do processo de amplificação do ácido nucléico usando os repórteres moleculares (por exemplo orientações moleculares) que são dissolvidos no volume do fluido. O estado dos repórteres ópticos moleculares é detectado usando um sistema óptico de detecção que sondam ou formam imagem do volume do fluido. Uma desvantagem das técnicas de detecção com base no volume é que um limite de detecção é preferivelmente mais alto. Como uma conseqüência, o processo de amplificação de ácido nucléico necessita voltar mais ciclos a fim de criar um sinal detectável. As técnicas com base na superfície podem a princípio atingir limites menores de detecção do que as técnicas com base no volume, mas estes requerem que os materiais moleculares específicos são concentrados a partir do volume em direção a superfície, que é o período de consumo devido ao lento processo de difusão. Portanto, este é vantajoso para uso na rotulação magnética do material molecular, tal que o material específico pode ser atraído em direção a superfície sensível.

Após a etapa de medição, a temperatura pode ser opcionalmente aumentada mais uma vez para dissociar as interações de filamento da sonda de aplicação. As nanopartículas são re-distribuídas na solução do volume para inverter o gradiente do campo magnético onde este participa novamente nas reações bioquímicas pela atuação da força magnética aplicada. Neste ponto a amostra é desnaturada e rapidamente entra no próximo ciclo de amplificação.

A Figura 5 mostra um gráfico do sinal do sensor como uma função de tempo.

Para aqueles habilitados na técnica é evidente que as modificações das etapas particulares no processo acima são possíveis. Por exemplo, a etapa de detecção é realizada após cada etapa de amplificação, alternativamente a etapa de detecção é realizada com uma freqüência inferior ou é apenas realizada após um número inicial de ciclos de PCR e foram realizados sem a etapa de detecção. Também, após cada medida da etapa de detecção pode ser colocado para remover todas as partículas magnéticas ligadas; alternativamente, as partículas magnéticas ligadas podem permanecer na superfície e as partículas não ligadas podem ser re-distribuídas no volume da solução para participar novamente das reações bioquímicas.

No processo acima é denominado 'ciclo de temperatura e partícula magnética' como ambas as partículas magnéticas são submetidas ao ciclo bem como a temperatura. Este permite as micro ou nanopartículas participar eficientemente no volume do processo bem como no processo de superfície. Nesta forma de realização a geração e formação da amplificação apresentada no volume da solução e detecção de partícula na superfície do sensor. Esta é uma forma da detecção intermitente, o período entre as medições individuais sendo iguais ao período do ciclo do procedimento de PCR. Pela diminuição do período do ciclo de PCR, a situação próximo ao tempo real do processo de amplificação tornar-se mais exata. Presentemente, o estado da técnica, a amplificação miniaturizada requer 15 a 30 segundos por ciclo.

Pela adição de um padrão interno ao processo, isto é a quantidade conhecida do modelo de referência e iniciadores dedicados para o propósito da comparação, este é possível fazer desta amplificação próxima ao tempo real também quantitativa. Preferivelmente, um local ou locais separados (escolhidos a esmo estatisticamente) na superfície do sensor é ou são feitos específicos por este padrão interno. Registrando-se a eficiência da amplificação (por exemplo quantidade por intervalo de tempo) um cálculo da quantidade inicial do modelo de DNA não conhecido seja possível.

Em uma apresentação mais preferida a detecção é realizada em um regime onde a quantidade de iniciadores de hibridização às micro ou nanopartículas tem uma cobertura menor de amplificação, isto é em média menos do que uma amplificação por nanopartícula. Esta garante que a probabilidade de ter mais do que uma amplificação por micro ou nanopartículas é menor e que diversas micro ou nanopartículas no sensor podem ser quantitativamente e corretamente traduzidas em uma concentração alvo na amostra original.

De acordo com a presente invenção a multiplexação também pode ser realizada por ter um arranjo de 10 sensores com moléculas de captura diferentes. Em alguns casos os mesmos iniciadores podem ser usados, em outros casos iniciadores diferentes serão necessários. Além de multiplexação do sensor, também a multiplexação do

rótulo pode ser importante, por exemplo para os ensaios comparativos, para a adição de controles e para a paralelização adicional. A multiplexação de rótulo refere-se ao fato de tipos diferentes de rótulos podem ser distinguidos no ensaio. Uma vantagem do uso dos rótulos com base em partículas é que a multiplexação do rótulo é facilmente incorporada, porque os rótulos podem ser fornecidos com propriedades diferentes. Uma vantagem do uso de rótulos de nano ou micropartículas diz respeito aos rótulos moleculares que são componentes que podem ser adicionados ou incorporados nos rótulos, que dão muitas possibilidades para a multiplexação de rótulo. Por exemplo, no caso da multiplexação de rótulo da detecção óptica pode ser atingida pelo uso de rótulos magnéticos com diferentes propriedades ópticas. Os rótulos magnéticos fornecidos com diferentes propriedades podem ser feitos por diversas maneiras conhecidas na técnica, por exemplo pela adição de tingimento com características espectrais diferentes, tal como propriedades luminescentes, propriedades refrativas, propriedades de absorção, propriedades de Raman, propriedades de dispersão, propriedades de fosforescência, etc., para os rótulos magnéticos.

Exemplo 2: Amplificação de PCR usando a amplificação com rótulo magnético.

Após uma etapa de extração de ácido nucléico opcional, a amplificação dos ácidos nucléicos é realizada de acordo com o protocolo de PCR com as amplificações de que pelo menos um é ligado covalentemente a uma partícula magnética e o outro não é magneticamente rotulado. Este exemplo é ilustrado esquematicamente na Figura 6. O processo de amplificação resulta em um dos filamentos estendidos sendo rotulados por micro ou nanopartículas magnéticas por intermédio do iniciador ligado.

Neste exemplo, a concentração de micro ou nanopartículas ligadas pelo sensor 10 é intermitentemente medida, em um ponto particular na seqüência de repetição (ciclo).

As etapas descrevem o projeto e procedimento preferido e as opções adicionais indicadas de acordo com esta forma de realização e são essencialmente as mesmas como descrito para o procedimento no Exemplo 1, apesar da separação a partir das amplificações, apenas uma sonda adicional (sonda de sensor) ser necessária, ligada covalentemente pelo chip da superfície do sensor. Esta sonda de sensor pode compreender a mesma seqüência como um oligonucleotídeo de amplificação ou pode sobrepor com a seqüência de um oligonucleotídeo de amplificação, como descrito na Figura 6. Alternativamente, a sonda de sensor hibridiza à seqüência do DNA amplificado diferente das seqüências pelo qual uma amplificação liga-se.

Como uma alternativa acima: a concentração de partículas magnéticas ligadas pelo sensor durante uma etapa de detecção, tem uma conexão com a concentração alvo original. Em outra palavras, por um período de ensaio dado e período do processo de detecção, a concentração das partículas no sensor pela ligação por um filamento de amplificação formado indica a concentração alvo original. Uma outra maneira de medir a quantidade de amplificação formada é uma detecção da quantidade de amplificações permanecentes no período de ensaio particular. Se a amplificação ligada à partícula é alvejada por este método, a concentração de partículas ligadas diminuiria na concentração aumentada da amplificação formada durante o processo de amplificação. Aqui um exemplo de um tal ensaio é dado:

Um tipo de amplificação é ligada covalentemente a uma partícula magnética. No sensor, as sondas são imobilizadas pelo qual foram selecionadas para ligar-se a esta amplificação. De modo inicial as partículas com esta amplificação ligada covalentemente pode ligar-se pelo sensor com uma alta taxa de ligação. Como o processo de amplificação procede, mais amplificações ligadas às partículas serão estendidas às amplificações totais. Como uma conseqüência, a probabilidade que uma partícula ligar-se pelo sensor diminuído, conduzido pelo número inferior de amplificações acessíveis na partícula e/ou devido ao impedimento estérico pelas amplificações ligadas à partícula.

Exemplo 3: Aplicações de microarranjos da invenção Os procedimentos descritos nos prévios exemplos capazes da detecção do material genético amplificado pelo ciclo do campo magnético e em alguns casos pelo ciclo de temperatura. Qualquer destes métodos é excelentemente adequado a ser aplicado em aplicações de microarranjos. A força de interação entre as sondas imobilizadas em uma superfície do sensor no arranjo e amplificações a partir da solução da amostra (neste caso ligado às nanopartículas magnéticas) é maior ou menor proporcional à extensão da complementaridade entre as sondas e amplificações. Pela força diferente de aplicação cruzando o arranjo (por exemplo forças magnéticas diferentes que dependem da posição do arranjo) ou pela variação das forças como uma função de tempo, vários tipos de arranjo de sub-locais de arranjo são identificados, por exemplo a partir da liberação dos locais das amplificações ligadas e nanopartículas magnéticas em forças inferiores (por exemplo hibridização não específica ou altamente degenerativa) até os locais com uma ligação mais poderosa entre a sonda e a amplificação (por exemplo alta complementaridade). Neste último caso o sinal magnético ainda é registrado como uma conseqüência das partículas magnéticas imobilizadas nestes locais particulares.

No microarranjo apresenta, que as sondas específicas são imobilizadas em partes muito menores e discretas da superfície do sensor, a oportunidade de colisões entre a sonda particular e uma partícula rotulada magnética tendo o ligando da amplificação complementar específico ligado ou ligada, muito menor. O ciclo da força magnética com os componentes da velocidade perpendicular para a superfície do sensor aumentarão a concentração dos pares de ligação específica (isto é, sonda de superfície e partícula rotulada do ligando de amplificação) em um volume menor acima da superfície do sensor. Entretanto, o movimento das partículas paralelas à superfície do sensor é registrada (também como um resultado do campo magnético). Consequentemente, a interação dos pares de ligação específica em relação ao processo de amplificação necessário para dar os resultados mensuráveis é um processo ineficiente no microarranjo apresentado.

Para superar esta redução uma outra forma de realização do formato de microarranjo é apresentado em que as forças magnéticas e a velocidade são aplicados com os componentes paralelos à superfície do sensor, intermitentemente ou em uma maneira coordenada com os componentes perpendiculares, para mover as partículas horizontalmente e fechar na proximidade da superfície do sensor ainda para aumentar os contatos colisionais.

Em adição para ajustar a temperatura por influência da atuação do campo magnético da eficiência da ligação podem ser usados para dar valores adicionados para as interações sub-dividirem em uma temperatura particular. Estas são capazes da detecção de SNPs ou outras mudanças da seqüência de ácido nucléico, de modo que as diferenças dos genes podem ser detectadas sem a análise da seqüência (note que uma análise de seqüência pode ser usada como um teste de confirmação). Este também pode ser capaz de uma descrição mais sensível e mais exata dos genes super e sub-regulados, isto é, um número inferior de genes chaves com respeito ao parâmetro fisiológico particular estudado no experimento do microarranjo. Este também pode ser capaz de uma identificação mais precisa dos micro-organismos, patogênios, ou outros materiais biológicos.

Claims (14)

1. Método para monitorar um processo enzimático em uma molécula biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: - permitir que um processo enzimático aconteça em uma câmara de reação, a câmara de reação sendo fornecida com objetos magnetizáveis ou magnéticos, - fornecer um dispositivo de sensor tendo uma superfície, - durante o processo enzimático, subseqüentemente atrair e retirar os objetos magnetizáveis ou magnéticos para e da superfície do sensor e pelo menos uma vez durante o processo enzimático e após atrair os objetos magnetizáveis ou magnéticos para a superfície do sensor, medir a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a medição da quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos é realizado mais do que uma vez e em que o método compreende ainda: -monitorar a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor como uma função de tempo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os objetos magnetizáveis ou magnéticos são revestidos com uma primeira porção de captura e a superfície do sensor é revestida com uma segunda porção de captura, a primeira e a segunda porções de captura sendo diferentes uma da outra.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a primeira porção de captura é compatível com uma primeira parte da molécula biológica e a segunda porção de captura é compatível com uma segunda parte da molécula biológica, a primeira parte sendo diferente da segunda parte.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a medição da quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados é realizada por detecção magnética, detecção óptica, detecção sônica ou detecção elétrica.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, subseqüentemente, atrair e retirar os objetos magnetizáveis ou magnéticos para e da superfície do sensor é realizada por meio de forças magnéticas.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo enzimático é um processo de amplificação de ácido nucléico de RNA ou DNA.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o processo de amplificação compreende amplificar ácido nucléico de RNA ou DNA usando-se um ou mais amplímeros e determinando a quantidade do dito RNA ou DNA de ácido nucléico amplificados ou de um reagente envolvido no processo de amplificação.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o RNA ou DNA é amplificado por um método isotérmico.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o RNA ou DNA amplificado por intermédio de um método de termociclização.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito RNA ou DNA amplificado é detectado usando-se uma sonda de hibridização magneticamente rotulada.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda ciclo de força magnética com componentes de velocidade perpendiculares à superfície do sensor.

13. Sistema para monitorar um processo enzimático em uma molécula biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: -uma câmara de reação para permitir que um processo enzimático aconteça, a câmara de reação sendo para o uso com objetos magnetizáveis ou magnéticos, - um dispositivo de sensor tendo uma superfície, - meios para, durante o processo enzimático e quando os objetos magnetizáveis ou magnéticos estão presentes, subseqüentemente atrair e retirar os objetos magnetizáveis ou magnéticos para e da superfície do sensor, e - meios para, pelo menos uma vez, após atrair os objetos magnetizáveis ou magnéticos para a superfície do sensor, medir a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados à superfície do sensor usando-se o elemento sensor.

14. Sistema de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: - meios para monitorar a quantidade de objetos magnetizáveis ou magnéticos ligados para a superfície do sensor como uma função de tempo.