CN104508146A - 用于快速检测扩增的核苷酸序列的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于扩增和快速检测可能存在于样品中的靶核苷酸序列的方法和设备，其将连续流动PCR扩增与通过毛细管作用在测试条带上的寡色谱检测组合。

Description

用于快速检测扩增的核苷酸序列的方法和设备
技术领域
本发明涉及用于快速检测来自存在于生物样品中的原始和特定基因序列的(基因)(酶促)扩增的基因序列(扩增子)的方法和设备。
该方法优选设计用于包含不同的多个基因靶序列(寡核苷酸)的样品的诊断应用，(i)用于快速且有效地检测样品中的特定核酸序列，以及该检测与该测试样品所来自的个体的不同病理和疾病，具体地感染性疾病、菌血症、呼吸道或肠道传染病的相关性，包括对于治疗性试剂如抗生素的抗性形式，(ii)用于识别食品的污染物，或(iii)用于预后测试，尤其是检测可能存在于样品中的癌症标记物。
背景技术
在(基因)扩增方法中，聚合酶链式反应(PCR)是在分子生物学中最常用的用于获得可能存在于生物样品中的一个或多个拷贝的原始和特定核苷酸序列的特异性扩增的技术。通过连续的(基因)扩增循环，该技术允许产生百万甚至千百万的原始和特定序列的拷贝。该PCR扩增方法包括在若干(2个或3个)特定的温度加热和冷却的重复热循环，用于变性该核苷酸序列、用于引物的杂交以及杂交引物的初始核苷酸序列的酶促延长。
该方法通过程序化仪器的实现，通过连续的热循环，具体地重复的和连续的温度升高和降低的循环，该程序化仪器加热和冷却包含将要扩增的样品的靶基因序列的固定反应室。
通过仪器的加热块(block)的加热和冷却速率限制扩增速率。
为了降低用于(多个)PCR扩增的总时间，已提出了多种方法。它们中的一种由连续动态流动下实现PCR扩增组成。
用这种技术，可以使得样品在稳定流下通过(微)通道，通过2个或3个不同的空间区域，每个具有恒定的温度。
Kopp等的文章(1998,Science 280,1046-1048)特别描述了这类设备。该设备包括多次通过具有不同的变性、杂交和延长温度的3个区域的通道。在通道的一端引入样品并且朝着通道的另一端的方向泵入，在该通道的另一端回收该扩增的样品以便于分析。
以小型化形式和以连续(恒定)动态流动的(基因)扩增也要求检测扩增的核苷酸序列。
在Kopp等的文章中，通过在扩增设备外用溴化乙锭着色的凝胶上的电泳分析该扩增的样品。
因为PCR是极其灵敏的扩增技术，因而可以扩增能够污染样品的非常小量的核苷酸序列(特别是来自之前的扩增)，产生假阳性结果。考虑到抑制该缺点，最有效的方法由将该(PCR)扩增步骤以及用于检测该扩增产物的步骤集成至同一闭合且一次性的设备中(一次使用(one-use))组成。
存在用于检测的这类集成设备，例如，通过毛细管电泳或通过在微网格板(checkerboard)上杂交。然而，用于测量和分析的这类方法和设备通常是复杂并且是昂贵的。进一步，产生于初步(基因)扩增步骤期间的微泡发射可以干扰这些设备上的检测。
因此，存在对于简化这些方法和设备的需要以简化其使用和效率，降低其成本并且增加其使用的速度。
发明目的
本发明的目的是提供用于优选通过PCR以连续动态流动的(基因)扩增的方法和设备，结合简单且廉价的、并且不具有现有技术的缺点的检测方法和设备。
本发明的具体目的是提供这类方法和设备，其允许快速检测，以及有效率的检测，以获得样品中特定核酸序列存在的分析结果，优选样品的快速和未失真诊断，以及可选地该检测与该样品所收集自的个体的不同病理和疾病，具体地感染性疾病，如菌血症、呼吸道和胃肠道感染性疾病的相关性，包括对治疗性试剂、具体地抗生素的抗性的形式。
发明内容
本发明的第一个方面涉及优选通过PCR的扩增方法，并且涉及可能存在于生物样品优选(i)从动物或个体如哺乳动物、更具体地人提取的样品，或者(ii)食物组合物的污染物中的至少一种和/或至多达数十种(多重检测)靶核苷酸序列的检测方法，所述方法包括以下连续步骤：
a)提供包括以下各项的设备：
-具有包含在约0.01mm至约10mm之间的区段的通道，
-与所述通道流体连通的测试条带，所述测试条带包括：
-与所述扩增的靶核苷酸序列的至少一个第一序列部分互补的第一(一个或多个)和特异性探针，或
-由互补且不同的分子的对中的第一分子组成，并且能够特异性地结合至(不同且互补的分子的)所述对中的第二(不同)分子的捕捉试剂(捕获试剂，夺获试剂，capture reagent)，该第二分子结合(直接通过引物，所述引物在优选PCR的扩增期间并入扩增子，或间接通过互补探针)至所述扩增的靶核苷酸序列的所述第一序列部分，以及优选地
-用于产生至少4个(3个)优选的不同且恒定温度的区域的装置，所述区域的3个(至少2个)定位在通道的不同位置，而第4(第3)区域定位在测试条带处。
这些用于产生优选地不同且恒定温度的3个(至少2个)区域的装置定位在能够产生(基因)扩增步骤的通道的不同位置，而定位在测试条带处的第4(第3)区域在低于其他3个(至少2个)其他区域的值维持恒定，用于有效处理毛细管流(毛细管色谱)的膜(测试条带)上的杂交。
在本发明的上述方法中，随后(根据步骤b))将用于(基因)扩增的包括样品以及试剂(化合物和可选的添加剂)的溶液引入该设备、具体地本发明的设备的通道中，优选用靶核苷酸序列的PCR，以及可选的RT-PCR或MLPA(多重连接依赖式探针扩增)。在将所述扩增的序列(根据步骤d))与测试条带接触前，通过根据动态流动(在流体中)，优选在所述通道中的恒定(或连续)流动使溶液环流(流通，circulate)从而(根据步骤c))产生扩增的和可选地标记的靶核苷酸序列，并且通过在第一探针和所述扩增的序列(以及可选地第二标记探针或标记物插入的DNA)之间的杂交，从而(根据步骤e))产生形成可测量的检测信号的复合物。
在本发明的方法中，在以闭合的方式设计的步骤a)的设备中产生步骤b)至e)，由此其不能(或仅非常少地)被其他基因序列污染。
根据本发明的方法，该扩增的序列产生于通道中，该通道包括通过2个(或3个)不同的、恒定的温度的区域并且配置用于优选通过PCR的多个(基因)扩增循环的多个环(环路，loop)。
因此，在该通道中，该多个环通过至少2个(优选2个或3个)不同的、恒定的温度的区域，并且配置用于优选通过PCR的多个(基因)扩增循环。
优选地，在本发明的方法中，将溶液引入(和推送)至具有注射泵(注射器泵)的通道中，并允许样品根据恒定动态流动在通道中移动。也可以引入溶液并使其以恒定动态流动(恒定动态流，constant dynamic flow)在具有抽吸装置的所述通道中移动。也可以通过泵，如蠕动泵(或滚子泵)的方法施加在闭合回路中的恒定动态流动。
在本发明的方法中，为了促进检测，用于优选通过PCR的(基因)扩增的试剂具体地是(基因)扩增引物的对，其可以可选地被标记。根据该方法的替换形式，也可以获得用标记DNA的插入试剂(例如荧光标记)标记的扩增序列(扩增子)。
优选地，标记各对引物中的至少一个。
优选地，该引物或扩增序列(扩增子)的标记选自由金属颗粒特别是金颗粒、胶体颗粒、聚苯乙烯颗粒、着色颗粒、(顺)磁性颗粒或荧光成分(元素，要素，element)形成的组。
根据本发明的方法的优选实施方式，该标记是荧光标记，如花青素(Cy5)或具有类似的荧光特性的标记。
有利地，在本发明的方法中，该检测信号由通过标记形成的一条或多条线，或通过标记形成的一个或多个点组成，优选该信号由通过标记形成的4、6、8、9、10、12、14或16个点，或甚至32个点或更多点(的网络)组成，从而存在于测试条带的表面上。根据检测分辨率以及根据用于获得全部点的照片(图像)的设备以及不同的点之间的识别力(discrimination)，选择测试条带的表面上由标记形成的点的数量。
本发明的方法还可以使扩增的核苷酸序列的未杂交序列的部分与第一探针接触，以及标记一个或多个第二探针以有助于夹心型的检测。
本发明的方法允许任何类型的靶核苷酸序列的扩增和检测，不论它是单链、双链或部分双链，或从RNA序列逆转录的cDNA序列。
根据本发明的优选实施方式，该方法包括MLPA(多重连接依赖式探针扩增)步骤或RT-PCR步骤。
在本发明的方法中，信号的读出(读取，readout)也优选与通过一种或多种可能的病原体，如基因改变的植物、细菌或病毒的一种或多种感染，或者食品组合物的污染物的识别相关，和/或与一种或多种可能的病原体对一种或多种治疗性处理的抗性，特别是当可能地病原体是细菌时，对一种或多种抗生素的作用的抗性的识别相关。
本发明的方法的优点是它的速度，由于它可以以小于90分钟，优选地以小于60分钟或者甚至在以小于30分钟的优选条件下快速进行。
本发明的方法还允许靶核苷酸序列的扩增和检测，该序列可以是多个并且是不同的，并且同时存在于相同的样品中(多重条件)。这些核苷酸序列的数量可以是5、10、15、20、25、50、100、200、400、600、800、1,000或更多(不同的靶核苷酸序列)。
本发明还涉及用于扩增和(快速)检测至少一个靶核苷酸序列的设备，包括用于应用本发明方法的设置，并且包括具有包括在约0.01mm至10mm之间的区段的至少一个通道，与所述通道液体连通的测试条带，所述测试条带包括(待检测的)扩增的靶核苷酸序列的第一序列部分的第一互补和特异性探针，或者由来自不同且互补的分子的对中的至少一个第一分子(链霉素/生物素，抗生物素蛋白/生物素或聚链霉素/生物素)组成并且能够结合至所述对中的第二分子的捕捉试剂，所述第二分子结合(在优选PCR的扩增期间直接通过引物并入至扩增子，或间接通过互补探针)至扩增靶核苷酸序列的第一序列部分，优选所述通道和所述测试条带存在于2个不同的室中。
有利地，该设备也可以包括用于产生具有不同且恒定温度的至少4个(3个)区域的装置，3个(至少2个)区域位于通道的不同位置，而第4(第3)区域位于测试条带处；所述通道可以包括通过具有不同的恒定温度且配置用于优选通过PCR的多个(基因)扩增循环的3个(2个)区域的多个环。在该通道的端部，该设备也可以包括注射泵，确保通道内样品的引入以及优选恒定(或连续)动态流动，或包括其他装置用于确保通过抽吸或特别是蠕动泵(滚子泵)在通道内样品的优选恒定(连续)动态流动，以及通过MLPA或RT-PCR或样品的其他前处理用于样品的前处理的装置。
在本发明的设备中，测试条带包括在扩增的核苷酸序列的杂交之后在测试条带的表面上能够产生以线或点的形式的检测信号的第一探针(以及可选地第二探针(可选地被标记))。该检测信号可以由4、6、8、9、10、12、14或16个点或甚至32个或更多点(的网络)组成。
本发明的另一方面涉及优选PCR扩增和检测试剂盒，包括本发明的前述设备的装置，以及用于优选通过PCR的(基因)扩增和在测试条带上的色谱检测的介质(试剂)。这些装置优选是探针，优选被标记，和/或可选地用于稀释样品的组件(介质，means)，具体地缓冲溶液，以及通常用于优选通过PCR的(基因)扩增的成分，具体地引物(单一或通用)的对，可选地标记各对中的至少一个引物，以及用于扩增效率的一个或多个内部对照序列(以便检查阴性结果是否是真实阴性结果)。
优选地，因为标记选自由金属颗粒具体是金颗粒、胶体颗粒、着色颗粒、聚苯乙烯颗粒、顺(磁性)颗粒或荧光成分组成的组，优选在本发明的试剂盒中，该标记是荧光成分，更具体地是花青素(Cy5)或具有类似的荧光特性的标记。
参考附图在本发明的优选实施方式中将更详细地描述本发明。
附图说明
图1和图2示意性地示出了根据第一个实施方式的本发明的设备的特征。该设备包括含有旨在用于以恒定动态流动(基因)扩增核酸序列的装置的第一部分，结合包括允许通过寡色谱(oligochromatography)技术在膜(测试条带)上检测扩增序列的装置的第二部分。两个部分通过用于转移扩增序列的装置连接，如流体连通管道(管)。
图3示意性地示出了根据第二个实施方式的本发明的设备的特征，其中，两个部分通过集成至该设备的结构中的通道连接。
图4示意性地示出了如何将检测装置不同地置于测试条带上以通过杂交(根据步骤e)产生形成可测量的检测信号的复合物。
具体实施方式
如图1描述的设备包括用于样品的微流体处理的装置，允许(核酸)序列的快速和特异性(基因)扩增，具体以恒定(或连续)动态流动的PCR类型的扩增，结合用于检测这些扩增核苷酸序列(扩增子)的装置。
如图1所示出的，本发明的设备包括通过PCR的包括用于进行这类(基因)扩增的不同的适当装置的第一(基因)扩增区域或室1，以及包括用于进行来自室1的扩增基因序列的这类检测的不同的适当装置的第二区域或检测室2。
如在室1中描述的设备是现有技术已知的，并且可以包括用于在微流体中和优选在恒定动态流动下(基因)扩增的不同装置，优选通过PCR。
这些装置包括由玻璃、石英或塑料，特别是聚碳酸酯(Bayer MaterialScience)或环烯烃的共聚物通过注射成型制造而制成的通道3。该通道的微结构特征优选通过常规的光刻处理制造。
可选地调节在该设备的第一部分中的通道3的孔，以促进待测试以及可选地待稀释的样品的引入和初步处理。通过本领域技术人员已知的不同装置，特别是通过微注射器，这类样品、优选包含该样品的溶液可以合并至通道3。
通道3优选具有卷绕结构(螺旋结构，coil configuration)，其尺寸可以变化，但其包含能够进行(基因)扩增所要求的不同步骤的一定数量的环(线圈，loop)，并且与装置接触用于精确加热这些环的区域。这些装置可以存在于帕尔贴(Peltier)设备或铝制加热电阻器或加热块以及合适的传感器。
该通道3优选具有包括在约1,500mm至约2,000mm之间的长度，或甚至高达3,000mm或更多的长度，通常是1,850mm的量级的长度，约100μm的厚度以及约200μm的宽度(直径)。在本实施例中提供了具有多个环的卷绕图形以便能够进行一定数量的(基因)扩增循环，优选大于15、20、25或30甚至50个(基因)扩增循环，优选大于35个(基因)扩增循环，更具体大于40个(基因)扩增循环，优选41个(基因)扩增循环。
这些(基因)扩增循环也可以通过预变性步骤以及随后的最终延长(后-延长)步骤进行，并且本发明的设备也可以包括一个或多个容器(储蓄器，reservoir)11和12，提供包含待分析样品和可用于本发明方法的步骤的缓冲液的可能性，如寡色谱(oligochromatographic)或旨在除去检测支持物上的扩增序列的非特异性连接(杂交)的清洗缓冲液。这些容器优选通过鲁尔(Luer)型的孔填充，用塞子封闭。有利地，该装置还包括管道13，优选柔性管并且形成回路以及能够与泵压头接触，即与蠕动泵(滚子泵)的元件(辊子)接触。通过本发明的设备，应用所述泵该通道13通过olive型连接器连接旨在包括样品的容器11以及包括缓冲液的容器12用于确保样品和缓冲液的流体移动(恒定动态流动)。另一连接装置(管)14也允许存在于第二区域或室2(测试条带4)中的检测装置连接至容器12。因此，如图3示出的，该闭合系统不能(或仅仅非常少地)污染或成为污染物。
优选地，该微流体设备制成一个整体并且使通道3(通过流体连通10，使得扩增序列朝着第二区域或室2转移)与存在于本发明的设备的第二区域或室2中的检测装置接触。优选地，通过称为寡色谱的方法，旨在用于(基因)扩增的通道3的端部与测试条带4连接，允许扩增的基因序列的检测。
优选地，旨在通过寡色谱用于检测的装置(存在于测试条带上)定位于与包含通道3的室1分隔的第二区域或室2。两个室都处于流体连通使得扩增的产物(包含扩增序列的溶液)可以直接转移至室2用于在闭合系统中的检测并且优选其不污染或成为污染物。
该第2室包括并入3个区域或区的测试条带4。这3个区域由多孔膜组成，允许液体及其组分(即包含扩增序列的溶液)通过毛细管作用从近端部分5迁移至远端部分6。这3个区域或区是施加区7、检测区8和吸收区9。
优选地，施加区7的膜由玻璃纤维或另一种适当的材料(聚酯)组成，检测区8的膜由硝化纤维组成，以及吸收区9的膜优选由纤维素组成。本领域技术人员可以考虑其他类型的结构和材料用于改善通过测试条带4内的毛细管作用的迁移特性或用于改善旨在用于它们的支持物上的检测的元件的集成。本领域技术人员可以，例如提供测试条带4的结构，其中，施加区7与检测区8存在于相同的膜上或者不具有任何区域或吸收区9。可以预想到完全用硝化纤维覆盖测试条带4并且可能地不具有任何吸收区。
不同的区域或区可以包括能够促进与测试条带4接触的不同扩增基因序列的检测的不同试剂。
优选地，用于使(基因)扩增通道3接触的装置在施加区7制造，其包括用于扩增的基因序列(图4)的特异性杂交装置。有利地和出乎意料地，该施加(通过流体连通10)和通过测试条带4上的毛细管作用的移动可以直接通过包含扩增序列的溶液的流动完成，而不需要添加任何另外的溶剂或特定的杂交盐。优选地，由通道带走并且沉积在测试条带上的溶液体积包含在约10μl至约50μl，优选约30μl至约10μl之间，优选20μl的量级。
检测的表示可以存在于检测区8的膜上的一个或多个检测线或一个或多个检测点(或任何其他图形、字母、线、点或图)，检测线或点对来自于在(基因)扩增通道3中进行的扩增的一个或多个扩增核苷酸序列的施加具有特异性。
有利地，检测试剂根据网络(网格，network)置于测试条带的支持物上以产生容易被检测者阅读的合适图形，优选具有4、6、8、9、10、12、14或16个点，甚至32个点或更多点的网络，能够包括至少一个或两个点用于对照检测(至少一个点用于对照扩增(用作内部对照的特定序列的特异性杂交)以及迁移对照(过量的引物序列(可选地标记)的检测，在扩增步骤期间没有使用)以及测试条带的定位点)。
该检测装置存在于膜上，具体在检测区8中，由第一捕捉探针组成，在特定条件下，该第一捕捉探针杂合至(捕捉)一个或多个扩增核苷酸序列的特定序列的部分(图4)。
优选地，该第一捕捉探针由以下核苷酸序列组成：由核酸或类似的分子(DNA、RNA、PNA、LNA、ANA、HNA等)组成。载体试剂(carrierreagent)可以通过连接元件如半抗原、肽或可以特异性地结合于所述载体试剂的任何其他分子连接至第一捕捉探针。
优选地，该第一捕捉探针与不同的或互补的分子对(配对)的第一分子(第一元件)如生物素偶联，通过该分子对的互补元件，如用作捕捉试剂的抗生物素蛋白、链霉素(抗生蛋白链菌素，streptavidin)、聚链霉素(polystreptavidin)或任何其他结合生物素的蛋白质，它自身连接至硝化纤维。
在检测时，优选后者通过荧光标记的激发(发射)产生，该荧光标记可以在测试条带4的表面上引起线或点形式或另一种几何形式(图形、图画)的一个或多个可检测荧光信号(的发射)。后者可以通过使用荧光检测器观察。取决于使用的标记的类型，将选择其他方法(例如，用于测量用金标记的探针的反射率的装置)。
在第一个实施方式中，该检测可以通过两个步骤进行：用互补的和标记的特异性探针杂交扩增的靶(特异性)核苷酸序列，该探针存在于区域7用于施加测试条带4，以形成靶序列及其标记的特异性探针之间的复合物，将在膜上朝着检测区8迁移的复合物，在检测区8将与结合于检测区的第一捕捉探针相互作用，从而形成夹心型的复合物。在该复合物中，扩增的靶核苷酸序列的第一部分与第一捕捉探针杂交，允许在测试条带4的特定位置的靶序列固定以及扩增的靶核苷酸序列的第二部分与第二标记探针杂交允许形成的复合物的检测并且固定在测试条带4上(图4A)。此时，该复合物是可见的并且通过标记的累积是可检测的。
在第二个实施方式中，该检测将在一步完成：扩增的和标记的靶核苷酸序列(例如通过标记的引物，其在优选通过PCR的扩增期间，并入至扩增子)将在测试条带4的膜上朝着检测区8迁移，其中，该标记的靶序列将与检测区中的第一结合捕捉探针反应，从而形成复合物。在该复合物中，扩增的靶核苷酸序列的第一部分与第一捕捉探针杂交使得扩增的靶核苷酸序列固定在测试条带4的特定位置(图4B)。在扩增的靶序列上标记的存在允许检测形成并固定在测试条带4上的复合物。
在扩增的以及标记的靶核苷酸序列朝着检测区8迁移后，可选地可以具有缓冲溶液的迁移，目的是除去过量的标记引物(其未并入至扩增的序列)，并且其可以干扰检测信号的测定。在将样品引入相同的通道数秒后，该缓冲溶液可以可选地(从连接至所述通道3的容器中)引入至所述通道3，并且可以示踪进行该方法的扩增和检测步骤的液体的流动。
有利地，本发明的设备的检测装置绝不会受通道的连续动态流动中气泡的引入或形成，随后导致的热变化的干扰，因为这可以是通过毛细管电泳或在微网格板在检测中的情况。
根据本发明优选的实施方式，在进行用于检测靶核苷酸序列的测试前，第一捕捉探针固定在测试条带4的特定位置。例如，捕捉试剂(不同且互补的分子对的第一分子)如抗生物素蛋白、链霉素、或聚链霉素，可以结合至整个检测区8的膜上，并且第一捕捉探针，包括该不同且互补的分子对的第二分子如生物素，则沉积在膜的特定位置。
结合优选通过稀释在适当的缓冲液中的捕捉试剂以及第一捕捉探针并且通过在膜上优选在硝化纤维上沉积线或点获得。可替换地，该探针预先结合在载体分子上(如生物素-抗生物素蛋白、生物素-链霉素、抗-生物素抗体和生物素类型的互补分子(元件)对)，或者在沉积前结合在非生物支持物上，如白色微球(用检测系统是不可见的)，或者直接(化学)结合在硝化纤维膜上。
在线的沉积的情况下，捕捉试剂的分布率可以在约50mm至约10mm每秒之间变化，并且优选设置为约30mm每秒的值。
分布材料的体积可以在0.5μl/cm至约3μl/cm之间变化，但优选是在约1μl/cm的量级。
在点的沉积的情况下，分布材料的体积可以在约100nl至1nl之间变化，但是优选设置为约10nl的值。
捕捉试剂的浓度可以在约0.01mg/ml(或更低的浓度)或约0.1mg/ml至约5mg/ml之间变化，优选1.5mg/ml量级。
第一捕捉探针的浓度可以在约50μM至约1μM或约1nM或更低的浓度之间变化，优选在约30μM至约5μM之间变化，更具体地10μM的量级。
根据本发明优选的实施方式，用于结合的缓冲液由用pH为约7.2的磷酸盐缓冲的盐溶液(NaCl)组成。
当支持物由硝化纤维膜组成时，随后干燥测试条带4数秒或数分钟(2分钟或更多)直至约50℃的温度或在约60℃或更高温度下72小时。
根据本发明优选的实施方式，在本发明的设备中使用的寡色谱测试条带4具有约5mm的宽度、约57mm的长度的尺寸，但也可以使用其他形状和形式的测试条带。
在本发明的设备和方法中，可以检测的扩增序列可以是DNA序列，特别是单链或双链或部分双链的DNA序列以及获得自RNA序列逆转录的cDNA序列。
该逆转录步骤可以可选地合并至本发明设备的分离单元内的本发明的方法中，例如，在与通道3连接的室或(微)通道中(可选地通过阀或泵)，其中，发生优选通过PCR的(基因)扩增。
精确地调整本发明的方法和设备用于存在于相同样品(多种条件下)中的多个和不同的核苷酸序列的扩增和检测。
可以根据应用所需的需求调整可以在本发明的设备中检测的不同的核苷酸序列的数量。可以调节本发明的方法和设备，并且根据待检测的靶核苷酸序列的数量允许调整存在于的测试条带上的探针的数量。
(特异性和/或通用)引物对的数量将必须适应待扩增的靶核苷酸序列的数量。
在优选的实施方式中，在同一样品中扩增并检测约2个序列至约50个靶核苷酸序列，优选约5个序列至约20个靶核苷酸序列。
超出一定数量的存在于相同的扩增溶液中的特异性引物对，(PCR)扩增的效率降低。
为了增加可在相同的样品内检测的靶核苷酸序列的数量，可以使用MLPA(多重连接依赖式探针扩增(Multiplex Ligation-dependent ProbeAmplification))技术。MLPA是多重PCR的替代，并允许用通用引物对扩增多个靶核苷酸序列。优选通过PCR的扩增之前是连接步骤。每个待扩增的核苷酸序列与识别(局部或部分)靶核苷酸序列相邻的两个位点的寡核苷酸对杂交。该对的每个寡核苷酸进一步包括与引物中的一个互补的通用序列。因此，一旦寡核苷酸对与它们的靶核苷酸序列杂交，它们可以通过连接酶连接在一起。随后通过通用引物对，该连接的寡核苷酸扩增。
该连接步骤可选地合并至本发明的方法，并在与本发明的设备分隔的单元中进行，例如在与通道3相连的室或(微)通道中，其中，利用通用引物对，优选通过PCR的(基因)扩增发生。
在使用MLPA的实施方式中，在相同的样品中扩增并检测20个序列至1000个靶核苷酸序列。
该样品优选是包含纯化DNA，以及可以在恒定动态流动的扩增设备中使用的其他组分的水性溶液。
这些不同的化合物优选在与样品的相同时间引入到通道3或可选地通过其它(微)通道或容器与通道3接触。
这些其它的组分是能够进行该(基因)扩增，优选通过PCR的(基因)扩增的试剂，特别是DNA聚合酶，能够在适当的缓冲液中获得DNA的聚合，根据所需的(基因)扩增的类型，优选通过PCR以及根据待检测(基因)序列的类型，可选地，利用添加其它化合物(试剂)补充，如氯化镁、引物，特别是用于(基因)扩增的适当引物对(无论是特异的还是通用的)，选择的dNTP。
其它组分，如表面阻断(饱和)剂，优选血清白蛋白(牛血清白蛋白，BSA)和聚乙二醇(PEG)作为阻断剂，或稳定剂，以及反应促进剂，也可以加入该反应溶液中。
根据待扩增和待检测的核苷酸序列的类型，进行选择核苷酸序列作为引物(特异的或通用的)，用于优选通过PCR的(基因)扩增。这些引物的选择在本领域技术人员能力范围内的，并且用成分，如金属颗粒，优选金颗粒、胶体或荧光成分作为它们的可选标记。
优选地，该标记是荧光标记，优选由花青素(Cy5的)或具有类似的荧光性的标记组成。
通过使未标记的扩增序列与第二标记的探针接触，该标记也可以是间接的，其中该第二标记的探针互补于与第一捕获探针(夹心检测)未杂交的扩增序列部分(或局部)。
也可以使用具有不同着色类型的标记用于标记不同的引物序列，以获得多重形式的扩增的DNA序列，以便促进它们在测试条4上同时或连续的检测。
每种颜色是对于扩增的基因序列的序列或组是特异的，并且最初存在于测试样品中，它们的比色检测可以通过本领域技术人员已知的方式获得。
本发明的设备还包括能够检测信号，特别是由测试条带4上的标记(荧光)形成的一个或多个点或线组成的荧光信号的元件，特别是信号检测器，特别是荧光信号检测器。
优选地，光源产生光束以激发标记的荧光。必须调整检测以便在包含全部待分析的点或线的测试条带4的表面上获得相同的检测效率。在本文中使用的检测器是能够拍摄全部点或线(任何其他图形、图画、字母或数字)的CCD照相机。
除了检测单元，本发明的设备包括能够有助于该(基因)扩增，优选通过PCR以及该检测的其他元件，特别是微流体设备的下表面的加热单元(例如加热电阻器或铝块)，设计该加热装置以获得优选通过PCR的(基因)扩增反应，并且通过所述微流体设备的合适部分的热处理来检测。
例如，本发明的设备的室1和室2置于4个(至少3个)加热块上，独立地控制各自的温度。使用3个(至少2个)块用于调节优选通过PCR的(基因)扩增的温度，并且定位于通道3的不同区域的室1的下方，以及第4(第3)块位于测试条带4的室2的下方。
为了使进行的优选通过PCR的(基因)扩增具有高产率，很好地限定从一个温度区域到另一个区域的过渡是重要的。为了该目的，通过间隔约1mm到约2mm将加热块彼此分开。
该加热单元也可以包括盖或任何其他设备以限制热损失。
该通道3包括带入不同的温度(在该温度处理)的不同部分以促进优选通过PCR的(基因)扩增，而检测室2保持在单一的适当温度。
优选地，在扩增区或室1，温度可以在约100℃至约90℃(优选约98℃)，以及约50℃至约80℃(优选约57℃)之间变化，而检测区或室2保持在包括约40℃至约60℃(优选约41℃)之间的温度。
检测单元和加热单元可以集成到相同的设备，或者相反，根据用户的需要分离。假如优选通过PCR的(基因)扩增需要比信号的测量更长的时间，可以有利地分开两个单元。
不同的室或区1和区2通过必要的元件连接，特别是标准的管道系统(管)，优选以聚乙烯或硅酮，或通过优选包括诸如泵、注射器、阀等装置的泵系统。可以使用，例如注射泵用来确保样品的泵送(以恒定和控制的温度)以便也允许通过通道3的稳定流。
这种注射泵系统将优选包括在约6mm至约30mm之间的内径，约0.012mm至约6mm每秒之间的泵送速率，用于每分钟0.3μl量级的最小泵送体积。
也可以通过在闭合回路中的蠕动泵(滚子泵)确保设备内部的恒定流量，但闭合回路的速率可以是可变的。
本发明的方法以非常快的方式，以小于90分钟，优选小于60分钟甚至小于30分钟进行。优选通过PCR的(基因)扩增是在小于60分钟，优选小于30分钟内进行，并且在测试条上的检测小于15分钟，优选小于5分钟(包括检测和发展)。

Claims (36)

1.一种用于PCR扩增和用于检测可能存在于生物样品、优选从个体提取的样品中的至少一种靶核苷酸序列的方法，所述方法包括以下连续步骤：
a)提供包括以下各项的设备：
-具有包括在0.01mm至10mm之间的区段的通道(3)，
-与所述通道(3)流体连通的测试条带(4)，所述测试条带(4)包括针对所述扩增的靶核苷酸序列中的至少一个第一序列部分的一种或多种第一互补和特异性探针，或者不同且互补的分子的对中的至少一个第一分子，能够结合来自所述对的第二分子，所述第二分子结合(直接或间接)至所述扩增的靶核苷酸序列的所述第一序列部分；
-用于产生至少4个不同且恒定温度的区域的装置，至少2个(或甚至3个)区域位于所述通道(3)的不同位置，而第4区域位于所述测试条带(4)处，
b)将包括所述样品以及用于所述靶核苷酸序列的扩增试剂的溶液引入所述通道(3)中，
c)通过使所述溶液在所述通道(3)中根据恒定动态流动环流，产生所述靶核苷酸序列的扩增的和可选地标记的序列，
d)使所述扩增的序列与所述测试条带(4)接触，以及
e)通过第一探针和所述扩增的序列之间的杂交产生形成可测量的检测信号的复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在以闭合方式设计的步骤a)的所述设备中产生步骤b)至e)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述扩增的序列产生于所述通道(3)中，所述通道(3)包括通过不同的、恒定的温度的2个区域并且配置用于多个扩增循环的多个环。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述扩增的序列产生于所述通道(3)中，所述通道(3)包括通过不同的、恒定的温度的3个区域并且配置用于多个扩增循环的多个环。
5.根据前述权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，用注射泵将所述溶液引入所述通道(3)中，允许所述样品在所述通道(3)中根据恒定动态流动移动。
6.根据前述权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，通过抽吸装置引入所述溶液并使所述溶液在所述通道(3)中以恒定动态流动移动。
7.根据前述权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述溶液通过蠕动泵(滚子泵)以恒定动态流动移动。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增试剂包括一对或多对引物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，标记各对的所述引物中的至少一个。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述引物的标记选自由以下形成的组：金属颗粒、特别是金颗粒，胶体颗粒，着色的或(顺)磁性颗粒，聚苯乙烯颗粒或荧光成分。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述标记是荧光标记。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述荧光标记是花青素(Cy5)或具有类似的荧光特性的标记。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测信号由通过所述标记形成的一条或多条线组成。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测信号由通过所述标记形成的一个或多个点组成。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述信号由通过所述标记形成的4、6、8、9、10、12、14、16或32个点(的网络)组成。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使所述扩增的核苷酸序列的序列未杂交的部分与所述第一探针、与一种或多种第二标记探针接触。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶核苷酸序列是单链、双链、部分双链序列或来自RNA序列的逆转录的cDNA序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤b)之前并且包括步骤b)，它包括MLPA(多重连接依赖式探针扩增)反应。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述信号的读出与被一种或多种病原体的一种或多种感染的识别相关，和/或与一种或多种病原体对一种或多种治疗性处理具有抗性的识别相关。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述病原体是细菌并且所述抗性是对一种或多种抗生素的抗性。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述信号的所述读出与食品的污染物的识别相关。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，它以小于90分钟，并且优选以小于30分钟进行。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于扩增和检测存在于同一样品中的多个且不同的核苷酸序列(多重条件)。
24.根据前述权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述不同且互补的分子的对选自由链霉素/生物素、抗生物素蛋白/生物素、链霉素/生物素或抗生物素/生物素抗体组成的组。
25.一种用于快速扩增和检测至少一种靶核苷酸序列的设备，包括用于应用根据前述权利要求中任一项所述的方法的装置，并且包括：
-具有包括在0.01mm至10mm之间的区段的通道(3)，
-与所述通道(3)流体连通的测试条带(4)，所述测试条带(4)包括(待检测的)扩增的所述靶核苷酸序列的第一序列部分的第一互补和特异性探针，或者不同且互补的分子的对中的至少一个第一分子，并且能够结合所述对的第二分子，所述第二分子结合(直接或间接)至扩增的所述靶核苷酸序列的所述第一序列部分，
并且其中，所述通道(3)包括通过3个(至少2个)不同的、恒定的温度的区域并且配置用于多个通过PCR(基因)扩增循环的多个环。
26.根据权利要求25所述的设备，包括用于产生至少4个不同且恒定温度的区域的装置，3个区域位于所述通道(3)的不同位置，而第四个位于所述测试条带(4)处。
27.根据权利要求25或26中任一项所述的设备，包括在所述通道(3)的端部的注射泵，确保所述通道(3)内的样品的引入以及恒定动态流动。
28.根据前述权利要求25至27中任一项所述的设备，进一步包括通过MLPA(多重连接依赖式探针扩增)的样品初步处理装置。
29.根据前述权利要求25至28中任一项所述的装置，其特征在于，所述测试条带(4)包括第一探针以及可选的第二探针，在扩增的所述核苷酸序列杂交后，所述第二探针能够在所述测试条带(4)的表面上以线或点的形式产生检测信号。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述信号由4、6、8、9、10、12、14、16或32个点(的网络)组成。
31.一种用于至少一种靶核苷酸序列的PCR扩增和检测试剂盒，包括根据前述权利要求25至30中任一项所述的设备，以及用于通过PCR(基因)扩增和在测试条带(4)上进行寡色谱检测的介质和试剂。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，包括可选地标记的引物，可选地标记的探针和/或可选地用于稀释所述样品的组件，具体地缓冲溶液。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，所述标记选自由金属颗粒、聚苯乙烯颗粒、着色的或(顺)磁性颗粒、胶体颗粒或荧光成分组成的组。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中，所述标记是荧光成分。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中，所述荧光成分是花青素(Cy5)或具有类似荧光特性的标记。
36.根据前述权利要求25至35中任一项所述的试剂盒，其中，所述不同且互补的分子的对选自由链霉素/生物素、抗生物素蛋白/生物素、聚链霉素/生物素或抗生物素/生物素抗体组成的组。
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