JPWO2009098998A1 - 核酸検出方法及び核酸検出用キット - Google Patents
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Abstract
Description
(1)1以上の検出対象塩基を含む標的塩基配列を有する核酸が、核酸試料中に含有されているか否かを検出する方法であって、
(a)該核酸試料;前記標的塩基配列中の前記検出対象塩基を含む部分領域と相同的又は相補的な塩基配列の、前記検出対象塩基に対応する塩基よりも5’末端側に、1以上の塩基による挿入部位又は欠損部位を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドである、検出対象塩基識別用プライマー;及びポリメラーゼを用いた核酸伸張反応を行う工程;及び
(b)前記工程(a)において伸長された産物を検出する工程;
を有する核酸検出方法。
(2)前記検出対象塩基識別用プライマーの前記挿入部位又は前記欠損部位が、該プライマーの3’末端から3塩基目よりも5’末端側にあることを特徴とする、前記(1)記載の核酸検出方法。
(3)前記検出対象塩基識別用プライマーの前記挿入部位又は欠損部位が、該プライマーの3’末端から20塩基目よりも3’末端側にあることを特徴とする、前記(2)記載の核酸検出方法。
(4)前記工程(a)の前に、
(c)前記核酸試料中の核酸;及び
前記検出対象塩基識別用プライマーと相補的な配列を5’末端に有し、前記検出対象塩基を含む部分領域以外の前記標的塩基配列の部分領域と相同的又は相補的な塩基配列を3’末端に有するポリヌクレオチドである増幅用プライマー;
を用いて、当該核酸の伸長反応を行い、標的塩基配列の3’末端に検出対象塩基識別用プライマーと相同的な塩基配列を有する核酸を得る工程;
を有し、
前記工程(a)において、前記工程(c)において得られた核酸の標的塩基配列部分を鋳型とし、前記工程(c)において得られた核酸の3’末端部分を検出対象塩基識別用プライマーとすることを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれか一つに記載の核酸検出方法。
(5)前記挿入部位が、1〜3塩基の挿入による部位であることを特徴とする銭(1)〜(4)のいずれか一つに記載の核酸検出方法。
(6)前記欠損部位が、1〜3塩基の欠損による部位であることを特徴とする前記(1)〜(4)のいずれか一つに記載の核酸検出方法。
(7)前記核酸伸張反応が、熱変性工程と、アニーリング工程と、伸張工程とを繰り返し行う反応であることを特徴とする、前記(1)〜(6)のいずれか一つに記載の核酸検出方法。
(8)前記アニーリング工程におけるアニーリング温度と、前記伸張工程における伸張反応温度とが同一であることを特徴とする前記(7)記載の核酸検出方法。
(9)前記検出対象塩基識別用プライマーが、30塩基長以上のポリヌクレオチドであることを特徴とする、前記(1)〜(8)のいずれか一つに記載の核酸検出方法。
(10)前記検出対象塩基識別用プライマーと、前記標的塩基配列を有する核酸とのアニーリング温度が68℃以上であることを特徴とする、(1)〜(9)のいずれか一つに記載の核酸検出方法。
(11)前記アニーリング工程におけるアニーリング時間と伸長反応時間の和が3分間以上であることを特徴とする、前記(7)〜(10)のいずれか一つに記載の核酸検出方法。
(12)前記アニーリング工程におけるアニーリング時間を、サイクルごとに延長することを特徴とする、(7)〜(10)のいずれか一つに記載の核酸検出方法。
(13)最終サイクルにおけるアニーリング時間が3分間以上であることを特徴とする前記(12)記載の核酸検出方法。
(14)前記ポリメラーゼが鎖交換活性を有する酵素であり、前記核酸伸張反応が、一定温度条件下で、アニーリング工程と伸張工程とを繰り返し行う反応であることを特徴とする、前記(1)〜(6)のいずれか一つに記載の核酸検出方法。
(15)前記(1)〜(14)のいずれか一つに記載の核酸検出方法に用いるキットであって、検出対象塩基識別用プライマーを有することを特徴とする核酸検出用キット。
(16)さらに、ポリメラーゼ及び反応用緩衝液を有することを特徴とする、前記(15)記載の核酸検出用キット。
(a)該核酸試料;前記標的塩基配列中の前記検出対象塩基を含む部分領域と相同的又は相補的な塩基配列の、前記検出対象塩基に対応する塩基よりも5’末端側に、1以上の塩基による挿入部位又は欠損部位を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドである、検出対象塩基識別用プライマー;及びポリメラーゼ;を用いた核酸伸張反応を行う工程;及び
(b)前記工程(a)において伸長された産物を検出する工程;
を有する核酸検出方法である。
本発明において検出対象塩基とは、ある特定の塩基配列(標的塩基配列)中の検出対象となる塩基を意味する。該検出対象塩基は、1個の塩基であってもよく、2以上の複数個の塩基であってもよい。また、複数個の塩基が検出対象塩基である場合には、検出対象塩基は互いに隣接する塩基である必要はない。また、該検出対象識別用プライマーの設計においては、該検出対象塩基識別用プライマーに加えた挿入又は欠損部位よりも3’側に該検出対象塩基を配置させることも必要である。
本発明の核酸検出方法における検出対象核酸としては、例えば、遺伝子多型や、疾患のマーカー遺伝子中の特徴的な塩基等を挙げることができる。なお、マーカー遺伝子中の特徴的な塩基とは、該マーカー遺伝子の塩基配列と他の遺伝子の塩基配列とを識別し得る塩基を意味する。
挿入部位として検出対象塩基認識配列に挿入される塩基の種類は、挿入された塩基が標的核酸とハイブリダイズされない塩基であれば、特に限定されるものではない。また、2以上の塩基を挿入する場合は、同じ種類の塩基のみを複数個挿入してもよく、異なる種類の塩基を組み合わせて挿入してもよい。挿入される塩基は、グアニンやシトシンよりも、アデニンやチミンであることが好ましい。
なお、検出対象塩基認識配列中の挿入部位又は欠損部位の数は、1であってもよく、2以上あってもよい。2以上の挿入部位又は欠損部位を有する場合には、検出対象塩基の位置は、最も3’末端側の挿入部位又は欠損部位よりも3’末端側とする。
<プライマーの設計>
予めヒトの5番染色体の131,686,608〜131,687,270塩基目の領域を増幅し得ると確認されているフォワードプライマー(Fw)とリバースプライマー(Re)のプライマーセットのうち、Fwの3’末端から1〜8塩基目に1〜3塩基を挿入したプライマーを設計した。設計した各プライマーの配列を表1に示す。なお、塩基の挿入に際しては、挿入された塩基により、標的核酸とハイブリダイズする領域がシフトしないように、挿入する塩基種を決定した。なお、表2は、連続する2塩基(5’側塩基と3’側塩基)の種類と、その間に挿入される塩基の種類の関係を示したものである。
フォワードプライマーとして表1のように設計した各プライマーをそれぞれ用いてPCRを行い、PCR産物を検出した。リバースプライマーは全てReを用いた。また、鋳型として、ヒトゲノムGenome Mix(NovaGene社製)を用いた。
具体的には、5μLの2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix(QIAGEN社製)に対して、5ngのGenome Mixと、フォワードプライマーとリバースプライマーを最終濃度が100nMとなるようにそれぞれ添加し、10μLの反応溶液を調製した。該反応溶液を、95℃で15秒間処理した後、95℃で30秒間、68℃で6分間の熱サイクルを30サイクル行うことにより、PCRを行った。その後、得られた反応溶液からそれぞれ1μLを回収して、電気泳動法により、PCR産物を検出した。検出結果を表3に示す。表中、「挿入位置」は、PCRに用いたフォワードプライマーの塩基が挿入されている位置(Fwの3’末端から数えて何塩基目の5’側に塩基を挿入したか)を、「挿入塩基数」は、PCRに用いたフォワードプライマーの挿入されている塩基数を、それぞれ表している。また、「○」はPCR産物が検出されたことを、「△」はPCR産物は検出されたが非常に量が少ないことを、「×」はPCR産物が検出されなかったことを、それぞれ表している。
<プライマーの設計>
まず、Fw_I01_P04とFw_I02_P06の各塩基挿入位置の3’側の塩基を一塩基ずつ置換したプライマーを設計した。設計した各プライマーの配列を表4に示す。
表4記載のフォワードプライマーを用いた以外は全て実施例1と同様にして反応溶液を調製した。該反応溶液を、95℃で15秒間処理した後、95℃で30秒間、68℃で6分間の熱サイクルを30サイクル行うことにより、PCRを行った。その後、得られた反応溶液からそれぞれ1μLを回収して、アガロースゲル電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドで染色してバンドパターンを得た。図2は反応溶液を電気泳動した結果得られたバンドパターンを示したものである。左端のレーンは塩基対長マーカーを泳動したものである。レーン上の番号は、表4に記載の番号が付されたフォワードプライマーを用いて得られたPCR産物を流したことを示している。
<プライマーの設計>
各種方法に基づき、Aアレルを識別するプライマーAと、Gアレルを識別するプライマーGをそれぞれ設計した。設計した各プライマーの配列を表5に示す。具体的には、SSP−PCR法により設計されたSSP PrimerA/Gは、3’末端にSNPに対応する塩基を配置したものである。ASP−PCR法により設計されたASP PrimerA/Gは、3’末端から2塩基目にSNPに対応する塩基を配置したものである。また、特許文献2に記載の方法(ASP−PCR法に変異をいれたもの)により設計されたASP+MM PrimerA/Gは、3’末端から2塩基目にSNPに対応する塩基を配置し、3塩基目の塩基を置換したものである。本発明の核酸検出方法により設計されたINS−SP PrimerA/Gは、3’末端から3塩基目にSNPに対応する塩基を配置し、5塩基目の5’側に2塩基を挿入したものである。さらに、本発明の核酸検出方法の対照として、塩基を挿入せず、3’末端から3塩基目にSNPに対応する塩基を配置したINS−SPC PrimerA/Gも設計した。
表5のように設計した各プライマーをそれぞれ用いてPCRを行い、PCR産物を検出した。リバースプライマーは全てrs4994 Rv Primerを用いた。また、鋳型として、rs4994のSNPがヘテロ体であることが予めわかっているゲノムサンプル(AG)、Aアレルのホモ体であることが予めわかっているゲノムサンプル(AA)、Gアレルのホモ体であることが予めわかっているゲノムサンプル(GG)をそれぞれ用いた。
具体的には、5μLの2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix(QIAGEN社製)に対して、5ngの各ゲノムサンプルと、フォワードプライマーとリバースプライマーを最終濃度が500nMとなるようにそれぞれ添加し、10μLの反応溶液を調製した。該反応溶液を、95℃で15秒間処理した後、95℃で30秒間、68℃で6分間の熱サイクルを40サイクル行うことにより、PCRを行った。その後、得られた反応溶液中のPCR産物量を、2100BIOANALYZER(Agilnet社製)で確認したバンドパターンを画像解析し数値化した。算出されたPCR産物量の結果を図3A〜図3Eに示す。
<プライマーの設計>
実施例3において用いたINS−SPC PrimerA/Gの3’末端から6塩基目と7塩基目を欠損させたDEL−SP PrimerA/Gを設計した。設計した各プライマーの配列を表6に示す。
フォワードプライマーとして、表6のように設計したDEL−SP PrimerA/Gと、を用いた以外は、実施例3と同様にして、PCRを行い、得られた反応溶液中のPCR産物量を測定した。算出されたPCR産物量の結果を図4に示す。図中、GGはゲノムサンプル(GG)を、AGはゲノムサンプル(AG)を、AAはゲノムサンプル(AA)を、それぞれ用いた場合の結果を示している。この結果、DEL−SP PrimerA/Gを用いた場合には、アレルのタイプとPCR産物量は相関していた。これらの結果から、挿入又は欠損部位として、塩基を欠損させた場合にも、挿入させた場合と同様に、塩基の識別能が高いプライマーを得られることが明らかである。
Claims (16)
- 1以上の検出対象塩基を含む標的塩基配列を有する核酸が、核酸試料中に含有されているか否かを検出する方法であって、
(a)該核酸試料;前記標的塩基配列中の前記検出対象塩基を含む部分領域と相同的又は相補的な塩基配列の、前記検出対象塩基に対応する塩基よりも5’末端側に、1以上の塩基による挿入又は欠損部位を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドである、検出対象塩基識別用プライマー;及びポリメラーゼを用いた核酸伸張反応を行う工程;及び
(b)前記工程(a)において伸長された産物を検出する工程;
を有する核酸検出方法。 - 前記検出対象塩基識別用プライマーの前記挿入部位又は前記欠損部位が、該プライマーの3’末端から3塩基目よりも5’末端側にあることを特徴とする、請求項1記載の核酸検出方法。
- 前記検出対象塩基識別用プライマーの前記挿入部位又は欠損部位が、該プライマーの3’末端から20塩基目よりも3’末端側にあることを特徴とする、請求項2記載の核酸検出方法。
- 前記工程(a)の前に、
(c)前記核酸試料中の核酸;及び
前記検出対象塩基識別用プライマーと相補的な配列を5’末端に有し、前記検出対象塩基を含む部分領域以外の前記標的塩基配列の部分領域と相同的又は相補的な塩基配列を3’末端に有するポリヌクレオチドである増幅用プライマー;
を用いて、当該核酸の伸長反応を行い、標的塩基配列の3’末端に検出対象塩基識別用プライマーと相同的な塩基配列を有する核酸を得る工程;
を有し、
前記工程(a)において、前記工程(c)において得られた核酸の標的塩基配列部分を鋳型とし、前記工程(c)において得られた核酸の3’末端部分を検出対象塩基識別用プライマーとすることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸検出方法。 - 前記挿入部位が、1〜3塩基の挿入による部位であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項記載の核酸検出方法。
- 前記欠損部位が、1〜3塩基の欠損による部位であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
- 前記核酸伸張反応が、熱変性工程と、アニーリング工程と、伸張工程とを繰り返し行う反応であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
- 前記アニーリング工程におけるアニーリング温度と、前記伸張工程における伸張反応温度とが同一であることを特徴とする請求項7記載の核酸検出方法。
- 前記検出対象塩基識別用プライマーが、30塩基長以上のポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
- 前記検出対象塩基識別用プライマーと、前記標的塩基配列を有する核酸とのアニーリング温度が68℃以上であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
- 前記アニーリング工程におけるアニーリング時間と伸長反応時間の和が3分間以上であることを特徴とする、請求項7〜10のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
- 前記アニーリング工程におけるアニーリング時間を、サイクルごとに延長することを特徴とする、請求項7〜10のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
- 最終サイクルにおけるアニーリング時間が3分間以上であることを特徴とする請求項12記載の核酸検出方法。
- 前記ポリメラーゼが鎖交換活性を有する酵素であり、前記核酸伸張反応が、一定温度条件下で、アニーリング工程と伸張工程とを繰り返し行う反応であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の核酸検出方法に用いるキットであって、検出対象塩基識別用プライマーを有することを特徴とする核酸検出用キット。
- さらに、ポリメラーゼ及び反応用緩衝液を有することを特徴とする、請求項15記載の核酸検出用キット。
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