KR20210143952A - 히스톤 h3-리신 트리메틸레이션 제거에 의한 인간 체세포 핵 이식 (scnt) 효율을 증가시키는 방법 및 조성물, 및 인간 nt-esc의 유도 - Google Patents

히스톤 h3-리신 트리메틸레이션 제거에 의한 인간 체세포 핵 이식 (scnt) 효율을 증가시키는 방법 및 조성물, 및 인간 nt-esc의 유도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 세포의 체세포 핵 이식(SCNT) 및 결과적으로 인간 핵 이식 ESC(hNT-ESCs) 제조의 효율을 향상시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 공여자 체세포의 핵 유전 물질 내 재프로그래밍 저항성 영역(reprogramming resistant regions: RRRs)에서 히스톤 H3-리신 9의 트리메틸레이션(H3K9me3)이 효율적인 인간 체세포 핵 재프로그래밍 또는 SCNT를 막는다는 발견에 관한 것이다. 본 발명은 데메틸라제 KDM4 패밀리의 외인성 또는 과발현에 의해 및/또는 히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1 및/또는 SUV39h2의 억제에 의해 H3K9me3의 메틸레이션을 억제하는 것에 의해 hSCNT의 능률을 향상시키는 방법에서 H3K9me3을 감소시키는 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

히스톤 H3-리신 트리메틸레이션 제거에 의한 인간 체세포 핵 이식 (SCNT) 효율을 증가시키는 방법 및 조성물, 및 인간 NT-ESC의 유도
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 10월 9일자로 출원된 미국 임시출원 제62/239,318호 및 2015년 10월 15일자로 출원된 미국 임시출원 제62/242,050호의 35 U.S.C. § 119(e)에 따른 이익을 주장하며, 각각의 내용은 본원에 전체로서 참조에 의해 통합된다.
서열목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출되고 여기에 전체로서 참조에 의해 통합된 서열목록(Sequence Listing)을 포함한다. 2016년 10월 7일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 701039-085852-PCT_SL.txt로 명명되었고 157,721 bytes의 크기이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 체세포 핵 이식(SCNT)의 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로 데메틸라제 KDM4 패밀리의 과발현에 의해 및/또는 SUV39h1 및/또는 SUV39h2 히스톤 메틸트랜스페라제의 억제에 의해 H3K9me3의 메틸레이션을 억제하는 것에 의해 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 것 및 인간 핵 이식 ESC (hNT-ESCs)를 생산하는 것에 관한 것이다.
분화된 체세포 게놈은 체세포 핵 이식 (SCNT)를 통한 난모세포 세포질의 분자 환경에 핵이 노출될 때 배아 상태로 다시 재프로그래밍될 수 있으며(Gurdon, 1962), 그것에 의해 최종적으로 분화된 체세포로부터 다능성 배아 줄기 세포 (ESC)의 생성을 가능하게 한다(Wakayama et al., 2001). SCNT 유래 ESC (NT-ESCs)는 핵 공여자 체세포와 유전적으로 자기 유래이기 때문에, hSCNT는 질병 모델링 및 세포/조직 대체 요법을 포함하는 치료 및 재생 의학에서 큰 잠재력을 가진다(Hochedlinger and Jaenisch, 2003; Yang et al., 2007). 따라서, hSCNT는 전사 인자 기반 재프로그래밍을 통해 수행할 수 없는 미토콘드리아 유전자-관련 결함을 수정하기 위해 사용될 수 있다(Ma et al., 2015). 인간 NT-ESC의 큰 잠재력에도 불구하고, 기술적 어려움이 인간 치료법에 대한 그의 적용을 매우 어렵게 만든다 (French et al., 2008; Noggle et al., 2011; Simerly et al, 2003).
첫 번째 NT-ESC는 분화된 태아 및 영아 섬유아세포를 핵 공여자로 사용하여 Mitalipov 그룹에 의해 생성되었다(Tachibana et al, 2013). 그들의 최적화된 조건을 사용하여, 발명자 및 다른 사람들은 성인 및 고령 환자 체세포로부터 인간 NT-ESC를 유도하는데 성공하였다(Chung et al., 2014; Yamada et al., 2014). 그러나, NT-ESC의 유도는 배반포 단계로 발달하기 위한 SCNT 배아의 극도로 낮은 비율 때문에 여전히 매우 어려운 과제로 남아있다. 현재는 특정 여성 유래의 최고 품질을 갖는 난모세포만이 SCNT 배아의 배반포 단계로의 발달을 지지할 수 있어서(Chung et al., 2014; Tachibana et al, 2013), 유용한 난모세포 공여자 풀을 제한한다.
최종적으로 분화된 체세포는 체세포 핵 이식 (SCNT)의 수단에 의해 제핵 난모세포로 이식되었을 때 전능성 상태로 재프로그래밍될 수 있다(Gurdon, 1962). SCNT는 분화된 체세포의 단일 핵으로부터 전체 동물을 생성할 수 있기 때문에, 농업, 생물의학 산업 및 멸종위기에 처한 종 보존에 큰 잠재력을 가진다(Yang et al, 2007). 정말로, 1997년에 양에서 최초로 성공한 포유류 복제(Wilmut et al, 1997) 이후에 20종 이상의 포유류 종들이 SCNT를 통해 복제되었다(Rodriguez-Osorio et al., 2012). 게다가, 다능성 배아 줄기 세포는 SCNT로 생성된 배반포로부터 확립될 수 있기 때문에(Wakayama et al., 2001), SCNT는 인간 치료법에 큰 장래성을 가지고 있다(Hochedlinger and Jaenisch, 2003). 이 장래성은 고령의 성인 또는 인간 환자 세포로부터 인간 hNT-ESC의 생성뿐만 아니라(Chung et al., 2014; Yamada et al., 2014), 첫 번째 인간 핵 이식 배아 줄기 세포 (hNT-ESCs)의 유도에서의 최근 성공 이후 현실에 가까워졌다(Tachibana et al., 2013). 이러한 hNT-ESC는 재생 요법 및 세포/조직-대체 요법을 위한 세포의 원천뿐만 아니라 인 비트로(in vitro) 질병 모델링을 위한 가치 있는 세포 원천이 될 수 있다.
엄청난 잠재력에도 불구하고, 몇 가지 기술적 문제가 SCNT의 실제 사용을 막아 왔는데, 특히, 그것은 복제 동물을 생성하는데 극도로 낮은 효율을 가진다. 예를 들어, 마우스 SCNT 배아의 대략 절반은 이식 이전에 발달 정지를 나타내며, 대리모로 옮겨진 오직 1-2%의 배아만이 만삭(term)으로 발달한다(Ogura et al., 2013). 더 높은 비율의 생식 복제 효율 (5 내지 20%)을 가지는 소 종을 제외하고, 모든 다른 종에서 전반적인 생식 복제 효율은 매우 낮다(1 내지 5%) (Rodriguez-Osorio et al., 2012). 또한, hNT-ESC 확립의 성공률도 그들의 좋지 못한 이식 전 발달 때문에 낮다(배반포 단계로 10 내지 25%; Tachibana et al., 2013; Yamada et al, 2014).
SCNT의 응용 잠재력을 현실화하기 위해, SCNT 복제 효율을 향상시키기 위한 노력이 이루어져왔다. 첫째, 1-세포 SCNT 배아에 트리코스타틴 A (Tricostatin A: TSA) 또는 스크립타이드(scriptaid)와 같은 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제를 일시적으로 처리하는 것이 마우스(Kishigami et al., 2006; Van Thuan et al, 2009), 돼지(Zhao et al., 2009), 소(Akagi et al., 2011) 및 인간(Tachibana et al., 2013; Yamada et al., 2014)을 포함하는 다양한 포유동물 종의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 것으로 보고되었다. 둘째, Xist의 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)은 마우스 SCNT 배아의 이식 후 발달을 향상시키는 것으로 보고되었다(Inoue et al, 2010; Matoba et al., 2011). 그러나, 이러한 방법들 중 어느 것도 치료적 복제 또는 재생 요법을 위해 인간 SCNT가 인간 전능성 및 다능성 줄기 세포 (예를 들어 인간 NT-ESCs)의 생성에 유용하도록 충분한 인간 SCNT의 복제 효율을 향상시키지 못했다.
SCNT 배아의 발달 결함은 마우스에서 2-세포기 및 돼지, 소 및 인간에서 4- 내지 8-세포기에 발생하는 접합 유전자 활성화(zygotic gene activation: ZGA) 시점에 나타나기 시작한다(Schultz, 2002). SCNT 배아는 공여자 세포의 게놈에 기존의 정의되지 않은 후생유전학적 장벽 때문에 ZGA에 어려움이 있다. 마우스 2-세포 SCNT 배아(Inoue et al., 2006; Suzuki et al, 2006; Vassena et al, 2007) 및 후기 분열 단계 인간 SCNT 배아에서 많은 이상조절된(dysregulated) 유전자가 확인되었음에도 불구하고, "기존의 후생유전학적 장벽(pre-existing epigenetic barriers)"의 성질과 손상된 SCNT에서 ZGA와의 관계는 알려지지 않았다.
따라서, 인간 SCNT 배아가 접합 유전자 활성화(ZGA)를 통해 발달 정지 없이 효율적으로 진행하고 발달 결함 또는 생존력의 손실 없이 2-, 4- 및 8-세포기를 거쳐 배반포로 성공적으로 발달할 수 있도록 공여자 세포 핵의 게놈에서 그러한 후생유전학적 장벽을 제거하는 것에 의해 인간 SCNT 복제 효율을 향상시킬 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명은, 부분적으로, 인간 체세포에서 H3K9me3도 인간 SCNT 재프로그래밍에서 장벽으로 작용한다는 발견에 기초한다. 본 발명자들은 KDM4A 과발현 (예를 들어, 외인성 KDM4A mRNA의 주입에 의함)이 접합 유전자 활성화 (ZGA) 시점에 발달 정지를 막고 인간 SCNT 배아 발달을 유의하게 향상시켜서, 난모세포가, 제어된 실험에서, KDM4A 과발현의 도움 없이 배반포로 발달하지 못하는 공여자로부터 얻은 인간 난모세포를 사용하여 환자-특이적 인간 NT-ESC의 효율적 생산을 가능하게 한다는 것을 증명했다. 따라서, 본 발명자들은 인간 SCNT (hSCNT)를 위한 인간 난모세포 공여자의 유용성을 확장시키고, 예를 들어 KDM4 패밀리의 구성원을 과발현시킴으로써 히스톤 데메틸라제-보조 SCNT를 확립하는 방법이, 치료적 복제 및 인간 핵-이식 ESC (NT-ESC), 특히, 치료 용도 및 연구와 질병 모델링 모두를 위한 환자-유래 인간 NT-ESCS의 생산을 위해 인간 SCNT를 향상시키는 방법에서 사용될 수 있다는 것을 발견했다. 본 발명은 인간의 생식 복제를 위해 의도한 것이 아니다.
포유동물(비-인간) 난모세포는 체세포를 전능성 상태로 재프로그래밍할 수 있고, 이는 체세포 핵 이식(SCNT)을 통한 동물 생식 복제, 또는 SCNT 배아로부터 발달된 배반포로부터 ES 세포주 (NT-ESC)의 생산을 가능하게 한다. 그러나, 대다수의 SCNT 배아는 정의되지 않은 재프로그래밍 결함 때문에 배반포 또는 만삭(term)으로 발달하지 못한다. 포유동물 SCNT의 비효율성은 재생 의학 적용을 위한 환자-특이적 hESC 주의 발달에 중대한 제한이다.
인간 공여자 체세포를 사용한 인간 SCNT-유도 인간 배반포의 생산이 보고되었음에도 불구하고, 배반포 품질 및 발달 효율은 인간 배아 줄기 세포주(인간 ntESC, 또는 hNT-ESC라고도 함)의 생산을 가능하게 하기에 불충분했다(French AJ et al, Stem Cells 26, 485-493 (2008)). 고령의 성인 또는 인간 환자 세포 유래 인간 hNT-ESC의 생성뿐만 아니라(Chung et al., 2014; Yamada et al, 2014), 인간 핵 이식 배아 줄기 세포 (hNT-ESCs)가 보고되었다(Tachibana et al., 2013). 그러나, 인간 hNT-ESC 확립에 대한 성공률은 좋지 못한 이식 전 발달 때문에 매우 낮다 (오직 10 내지 25%만 배반포 단계로 발달함; Tachibana et al., 2013; Yamada et al, 2014). 그러므로 인간 SCNT 기술의 개량은 인간 SCNT 배아의 배반포 단계로의 발달을 향상시키고, SCNT를 위해 요구되는 공여자 난모세포의 수를 감소시키고, 연구 및 세포 기반 요법을 위한 인간 및 환자-특이적 동질유전자의(isogenic) 배아 줄기 세포주를 성공적으로 제조하기 위해 중요하다.
체세포 핵 이식(SCNT)을 사용한 인간 배아 줄기 세포(hNT-ESCs) 유도의 극도로 낮은 효율은 그의 잠재적 적용을 상당히 제한한다. 인간 SCNT 배아로부터 배반포 형성은 낮은 비율로 오직 일부 난모세포 공여자로만 발생한다. SCNT 배아의 좋지 못한 발달 잠재력은 인간에게만 한정된 것은 아니며, 모든 실험된 포유동물 종에서도 공통적으로 관찰된다(Rodriguez-Osorio et al., 2012).
마우스 인 비트로 수정(in vitro fertilization: IVF) 및 SCNT 배아의 비교 전사체학 및 후생유전학 분석을 통해, 본 발명자들은 공여자 체세포 게놈에서 히스톤 H3 리신 9 트리메틸레이션(histone H3 lysine 9 trimethylation: H3K9me3)이 SCNT에 의한 마우스 세포의 전사 재프로그래밍을 막는 장벽으로 기능하여, 접합 유전자 활성화(ZGA) 및 이식 전 발달의 실패를 초래한다는 것을 이전에 확인했다(Matoba et al, 2014). 본 발명자들은 또한 마우스 공여자 체세포에서 그 후생유전학적 장벽이 마우스 KDM4d, H3K9me3 데메틸라제를 이소성으로(ectopically) 과발현시킴으로써 제거될 수 있다는 것을 이전에 증명했다. H3K9me3의 제거는 ZGA를 촉진시켰고, 결과적으로 마우스 SCNT 배아의 발달을 배반포 단계에 도달하도록 향상시켰고, 이는 마우스 NT-ESC(mNT-ESC) 생산의 증가된 비율 및 효율을 초래했다(Matoba et al., 2014).
보다 구체적으로, 본 발명자들은 마우스에서, H3K9me3 데메틸라제 KDM4d의 이소성(ectopic) 발현을 통한 히스톤 H3 리신 9 트리메틸레이션(H3K9me3)의 감소가 SCNT 마우스 배아 발달을 크게 향상시킨다는 것을 이전에 증명했으며, 이것은 국제출원 WO2016/044271에 개시되어 있고, 이는 본원에 전체로서 참조에 의해 통합된다.
이전 연구와 대조적으로, 본원에서 본 발명자들은 인간 세포에서 H3K9me3 데메틸라제 KDM4A의 과발현이 인간 SCNT를 놀랍게 향상시킨다는 것과, 인간 체세포 게놈 내 H3K9me3에는 인간 SCNT 배아가 접합 유전자 활성화(ZGA)를 통해 효율적으로 진행되는 것을 막는 SCNT 재프로그래밍 장벽이 있다는 것을 증명했다. 이것은 인간 및 마우스 ES 세포가 매우 다르기 때문에 예상치 못한 것이었고, 마우스 세포에서 작용하는 것이 인간 세포에서 작용할 것이라고 예측할 수 없었다.
보다 구체적으로, 접합 유전자 활성화(ZGA)는 마우스 및 인간 세포에서 다른 시간에 발생하기 때문에, 마우스 세포에서 ZGA 장벽을 제거하는 재프로그래밍 방법이 인간 세포에서 완전히 다른 시간대에 ZGA 장벽을 제거하는 것으로도 작용할 것이라고는 예측할 수 없다. 본원에서 도 2A 및 도 2E에 나타난 바와 같이, 마우스 세포에서 SCNT의 효율을 증가시키는 절차 및/또는 방법(도 2A 참조)은 인간 세포에서 SCNT 효율을 증가시키는 절차 및/또는 방법(예를 들어, 도 2E 참조)과 상이하다. 본원에서, 본 발명자들은 전사 재프로그래밍을 촉진시키는 것에 의하여 KDM4A의 과발현이 인간 SCNT 배아에서 배반포 형성 비율을 유의하게 향상시켜서, 다른 인간 환자 집단으로부터 인간 NT-ESC의 효율적 유도를 가능하게 한다는 것을 놀랍게도 증명하였으며, 예를 들어, 본 발명자들은 성인 연령-관련 황반 변성(Age-related Macular Degeneration: AMD) 환자 체세포 핵 공여자로부터 hNT-ESC의 생성을 증명했다. 따라서 본원에서 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 방법의 발견은 재생 의학 및 치료 복제를 포함하는 다양한 맥락에서 많은 잠재적 적용을 가진다.
특히, 본 발명자들은 분화된 인간 체세포의 공여자 핵의 게놈에서 히스톤 H3 리신 9 트리메틸레이션(H3K9me3)이 SCNT에 의한 인간 세포의 효율적 재프로그래밍을 위한 주요 기존 후생유전학적 장벽이라는 것을 발견했으며, 인간 공여자 핵 또는 활성화된 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 것이 인간 SCNT의 효율을 증가시킬 수 있고, 특히, 인간 SCNT 배아의 8-세포 또는 배반포 단계로의 이식 전 발달의 효율을 증가시킬 수 있다는 것을 발견했다.
보다 구체적으로, 비교 분석을 통해 본 발명자들은 인간 SCNT 배아에서 접합 유전자 활성화(ZGA)에 저항성인 인간 공여자 핵의 게놈 도메인을 발견했다. ZGA가 돼지 및 소에서 2-세포기, 및 4- 내지 8-세포기에 발생하는 마우스와 같은 다른 포유동물에서와는 달리(Schultz, 2002), 인간에서 ZGA는 8-세포기에 발생한다(Schultz, 2002). 본원에서 발명자들은 인간 공여자 유전 물질에서 재프로그래밍 저항성 영역(reprogramming resistant regions: RRRs)이 억제성 히스톤 변형, H3K9me3에 대해 풍부해지고, 인간 공여자 체세포에서 후생유전학적 마커의 제거가 인간 SCNT의 효율을 증가시킬 수 있다는 것을 발견했다. 본원에서, 인간 SCNT의 효능을 향상시키는 두 가지 방법은 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 포함되는데, (i) H3K9me3-특이적 데메틸라제의 증가된 발현, 또는 활성화, 예를 들어, 난모세포에서 또는 활성화된 SCNT 배아에서(예를 들어, 하이브리드 난모세포가 융합되거나 활성화된 후에) 인간 KDM4 패밀리의 하나 이상의 구성원을 과발현시키는 것(예를 들어, 외인성 인간 KMD4A, KDM2B, KDM4C, KDM4D 또는 KDM4E mRNA를 발현시키는 것) 및/또는 (ii) 인간 체세포 공여자 핵에서 인간 H3K9 메틸트랜스페라제, 예를 들어, 인간 SUV39h1 또는 인간 SUV39h2 또는 둘 모두(즉, SUV39h1/2)의 발현 또는 기능을 넉다운시키거나 억제시키는 것을 포함한다. 그러한 방법은 인간 공여자 핵에서 ZGA 결함을 약화시키고 RRRs를 재활성화시킬 뿐만 아니라, 인간 SCNT의 효율을 크게 향상시킨다, 예를 들어, 2-세포, 4-세포 및 8-세포 또는 배반포 단계로 발달하는 SCNT 배아의 %를 증가시킨다.
따라서, SUV39h1/2-매개 H3K9me3은 인간 SCNT의 "후생유전학적 장벽"이고, 인간 체세포 공여자 세포의 핵, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 인간 SCNT 배아 중 어느 하나에서, H3K9me3의 트리메틸레이션의 억제 및/또는 제거 (KDM4A/JHDM3 A 또는 인간 KDM4 패밀리의 임의의 다른 구성원의 과발현, 예를 들어, 임의의 하나 이상의 인간 KDM4A, 인간 KDM4B, 인간 KDM4C, 인간 KDM4D, 인간 KDM4E 유전자의 과발현을 통함), 및/또는 인간 SUV39h1/2 단백질 또는 유전자의 억제제를 사용하는 것은, 인간 세포 재프로그래밍에서, 특히 인간 SCNT를 통한 인간 체세포 재프로그래밍에서 ZGA에서 발생하는 후생유전학적 장벽을 제거하기 위한 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에 유용하며, 인간 SCNT 복제 효율을 증가시키는 방법에 포함된다.
따라서, 본 발명은 인간 세포에서, H3K9me3이 SCNT 배아의 제조에 사용된 인간 체세포 내 RRRs에서 풍부하다는 것과, 인간 체세포 내 H3K9me3 장벽이 KDM4D 패밀리의 구성원의 과발현에 의해 제거될 수 있다는 발명자들의 발견에 기초한다.
중요하게, 본 발명자들은 hSCNT 배아(예를 들어, 5-10hpa 사이에서, 또는 2 내지 8-세포기 사이에서), 수용자 난모세포에서, 단백질의 인간 KDM4 패밀리의 하나 이상의 구성원, 예를 들어, 인간 KDM4A, 인간 KDM4B, 인간 KDM4C, 인간 KDM4D, 인간 KDM4E의 과발현에 의한(예를 들어, KDM4 패밀리 구성원을 코딩하는 외인성 mRNA, 예를 들어, KDM4A mRNA 또는 cDNA의 도입에 의한) H3K9me3의 제거가 인간 SCNT 복제의 효율의 놀랍게도 유의한 증가를 초래한다는 것을 증명했다. 특히, 본 발명자들은 배반포로 발달하는 KDM4A 주입된 hSCNT 배아의 20% 이상의 증가(즉, KDM4A 주입으로 4.2%에서 26.8%까지 증가), 및 확장된 배반포 단계로 발달하는 KDM4A 주입된 hSCNT 배아의 14%(대조군 hSCNT 배아는 하나도 없는 것과 비교함)를 놀랍게도 증명했다.
따라서, 본 발명의 양상은 인간 공여자 체세포에서 히스톤 H3-리신 9 (H3K9me3)의 트리메틸레이션이 효율적인 인간 체세포 핵 재프로그래밍 (hSCNT)을 막는다는 발견에 기초한다. 본원에서, 인간 SCNT의 효능을 향상시키는 두 가지 방법이 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 포함되며, (i) 데메틸라제 KDM4 패밀리의 구성원, 예를 들어, KDM4A (JMJD2A 또는 JHDM3A로도 알려짐)의 과발현 (즉, 외인성 발현, 또는 이소성 발현)을 사용함으로써 H3K9me3의 데메틸레이션을 촉진하는 것, 및/또는 (ii) 인간 히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39H1 및/또는 SUV39H2를 억제함으로써 H3K9me3의 메틸레이션을 억제하는 것을 포함하며, 본 발명자들이 마우스 공여자 체세포의 핵에서 SUV39h1/2의 억제가 놀랍게도 포유류 SCNT 효율의 효율을 증가시킨다는 것을 이전에 증명한 것과 같다(2015년 9월 15일 출원되고 WO2016/044271로 공개된 국제출원 PCT/US2015/050178에 개시된 바와 같으며, 이는 본원에 전체가 참조로서 통합된다). 따라서, KDM4A/JHDM3A, 또는 인간 KDM4 패밀리의 다른 구성원의 과발현 (예를 들어, 임의의 하나 이상의 인간 KDM4A, 인간 KDM4B, 인간 KDM4C, 인간 KDM4D, 인간 KDM4E 유전자의 과발현), 및/또는 인간 SUV39h1/2 단백질 또는 유전자의 억제는 인간 세포 재프로그래밍에서, 특히 인간 SCNT를 통한 인간 체세포의 재프로그래밍에서, ZGA에서 발생하는 후생유전학적 장벽을 제거하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 방법, 조성물 및 키트에서 유용하다.
따라서, 본 발명의 양상은 (i) H3K9me3을 탈메틸화시킬 수 있는 히스톤 데메틸라제, 예를 들어, 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 구성원, 예를 들어 이에 한정되지 않으나, JMJD2A/KDM4A 및/또는 JMJD2D/KDM4D 및/또는 JMJD2B/KDM4B 및/또는 JMJD2C/KDM4C 및/또는 JMJD2E/KDM4E를 발현하는 것에 의해 및/또는 (ii) H3K9me3의 메틸레이션에 관련된 인간 히스톤 메틸트랜스페라제를 억제시키는 것, 예를 들어, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1 중 임의의 하나 또는 조합의 억제에 의해 인간 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시킴으로써 인간 SCNT 효율을 증가시키는 것에 관한 방법, 조성물 및 키트와 관련된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 구성원, 예를 들어, JMJD2A/KDM4A 및/또는 JMJD2D/KDM4D 및/또는 JMJD2B/KDM4B 및/또는 JMJD2C/KDM4C 및/또는 JMJD2E/KDM4E의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제는 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 인간 SCNT 배아에 주입되거나 접촉된다.
H3K9me3의 데메틸레이션 (KDM4c/Jmjd2c에 의함)이 체세포 재프로그래밍의 효율을 증가시키기 위해 사용되는 것으로 보고되었음에도 불구하고 (예를 들어, 유도 만능 줄기(iPS) 세포의 생성 (Sridharan et al., 2013)), 최종 분화된 체세포로부터 SCNT의 효율을 증가시키기 위한 H3K9me3의 데메틸레이션은 아직까지 보고된 바 없다. Antony et al.은 다능성 ES 세포로부터 공여자 핵에서 유래된 SCNT에서 KDM4B/JMJD2B를 사용하는 것을 보고한다(Antony et al., "Transient JMJD2B-Mediated Reduction of H3K9me3 Levels Improve Reprogramming of Embryonic Stem Cells in Cloned Embryos." Mol. Cell Biol., 2013; 33(5);974). 다능성 ES 세포는 최종 분화된 체세포와 같지 않은 발생적으로 미성숙한 세포이다. 중요하게, 배아 줄기(ES) 세포 또는 유도 만능 줄기(iPS) 세포의 전반적인 후생유전학적 상태는 분화된 체세포와 비교하여 유의한 차이가 있다. 다능성 ES 세포는 후생유전학적 장벽이 더 적으므로 (예를 들어, 특히 재프로그래밍 저항성 영역(RRRs)에서 더 적은 메틸레이션), ES 세포 핵이 공여자 핵으로 사용될 때 생성되는 SCNT 배아의 효율은 최종 분화된 체세포 유래 핵이 사용될 때 생성되는 SCNT 배아의 효율과 매우 다르다(Rideout et al., 2000, Nature Genetics, 24(2), 109-10).
Antony et al.에 의한 보고와 대조적으로, 본 발명자들은 본원에서 하이브리드 난모세포, 예를 들어, 공여자 체세포 유전 물질을 포함하는 제핵 난모세포에서 활성화 전 또는 활성화 후에 H3K9me3 수준을 감소시키는 것(예를 들어, 인간 KDM4A mRNA를 과발현시키는 것에 의함)이 8-세포 후 SCNT 발달, 예를 들어, 처리된 인간 SCNT 배아의 32%가 상실배로 발달, 26.8%가 배반포로 발달 및 14.3%가 발달하여 확장된 배반포 단계를 넘는 놀라운 증가 (미처리된 인간 SCNT 배아의 0%가 확장된 배반포 단계에 도달하는 것과 비교함)를 초래한다는 것을 증명한다. 이것은 14% 증가이다. 이 결과는 Antony et al,이 논의된 바와 같이 최종 분화된 체세포와 동일한 후생유전학적 마커를 가지고 있지 않은 발달학적으로 미성숙한 세포인 ES-세포 유래 공여자 핵을 사용하는 경우에도 이식 전 발달에서 단지 약 9% 개선만을 보고한 것을 고려하면 상당히 예상치 못한 것이다.
또한, 체세포를 초기 발달 단계로 재프로그래밍하는 효율을 증가시키기 위한 H3K9me3의 데메틸레이션에 대한 많은 보고가 있었던 반면 (예를 들어, 유도 만능 줄기(iPS) 세포의 생성) (예를 들어, 본원에 전체가 참조에 의해 통합된 US 출원 2011/0136145 및 2012/0034192), iPS 세포의 생성을 위한 체세포 재프로그래밍의 메커니즘은 SCNT 배아의 생성을 위한 체세포 재프로그래밍의 메커니즘과 상당히 다르다(Pasque et al., 2011, Mechanisms of nuclear reprogramming by eggs and oocytes: a deterministic process? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 453-459; 및 Apostolou, E., and Hochedlinger, K., 2013; Chromatin dynamics during cellular reprogramming. Nature 502, 462-471에서 논의된 바와 같음). 따라서 iPS 세포의 생성에서 H3K9me3의 데메틸레이션으로부터 알게 된 것은 관련이 없거나 적용가능하지 않으며, SCNT 인간 배아의 성공적인 생성을 위한 또는 인간 SCNT 배아의 이식 전 및 후 효율을 증가시키기 위한 방법으로 이동시킬 수 없다.
특히, 인간 SCNT와 인간 iPS 재프로그래밍에 존재하는 장벽 간에 주목할만한 차이가 있으며, 뿐만 아니라 인간 SCNT 재프로그래밍과 마우스 SCNT 재프로그래밍에 주목할만한 차이가 있다. 첫째, 마우스 iPSC 재프로그래밍에서 H3K9me3-장벽은 주로 SETDB1에 의해 확립된다(Chen et al., 2013; Sridharan et al., 2013). 둘째, 성공적인 iPSC 및 SCNT 재프로그래밍에 필요한 하류 유전자 네트워크가 다르다. 예를 들어, iPSC 재프로그래밍에서, H3K9me3 장벽에 의해 억제된 Nanog 및 Sox 2와 같은 핵심적인 가장 중요한 전분화능 네트워크 유전자는 재프로그래밍의 상대적으로 늦은 단계 동안 발현된다(Chen et al., 2013; Sridharan et al, 2013). 대조적으로, SCNT 재프로그래밍에서, H3K9me3에 의해 억제된 핵심적인 유전자가 발현되고, 2-세포 배아기에서 중대한 기능을 가진다(아래에서 논의됨). 이 구분은 각 상황에서 성공적인 재프로그래밍을 위해 필요한 전사 인자 세트의 차이에서 기인할 수 있다. 정말로, iPSC 재프로그래밍을 위해 필요한 가장 중요한 전사 인자 Oct4/Pou5fl는 SCNT 재프로그래밍에 필수적인 것으로 증명되었다(Wu et al., 2013). 따라서, H3K9me3이 iPS 세포 생성 및 성공적인 SCNT 둘 모두를 위한 공통의 재프로그래밍 장벽으로 보일지라도, 그의 침적(deposition) 및 그것이 재프로그래밍 과정에 미치는 영향은 iPS 세포를 생성하기 위한 재프로그래밍 방법 및 SCNT 배아를 생성하기 위한 재프로그래밍 방법에서 상당히 다르다.
따라서, 재프로그램된 인간 체세포부터 인간 iPS 세포에서 H3K9me3 장벽의 제거가 증명되었음에도 불구하고, 서로 다른 재프로그래밍 유전자 및 재프로그래밍 메커니즘이 iPS 세포 생성에 사용되기 때문에, 그러한 방법이 인간 SCNT 배아의 생성에서 인간 체세포를 재프로그래밍하기 위해 작용할 것이라는 암시는 없다. 실제로, US 출원 2011/0136145 및 2012/0034192는 그들의 방법이 오직 체세포의 iPSC로의 재프로그래밍에만 적용되며 전능성 세포의 생성이나 인간 SCNT 배아의 제조에 적합하지 않다는 것을 구체적으로 언급한다. 따라서, 2011/0136145 및 2012/0034192 US 출원은 본 발명과 멀어지는 방향으로 개시(teach away)한다.
또한, 하기 표 1에 개요를 서술한 SCNT 배아의 생성과 비교하여 iPSC의 생성에서 체세포 재프로그래밍을 위해 사용된 상당히 다른 메커니즘뿐만 아니라, iPSC를 제조하기 위해 체세포를 재프로그래밍하는 것으로부터 제조된 줄기세포는 SCNT 배아로부터 얻은 줄기세포와 현저하게 다르다 (Ma et al., 2014, Abnormalities in human pluripotent cells due to reprogramming mechanisms. Nature, 511(7508), 177-183).
표 1: SCNT- 및 iPS-매개 재프로그래밍 간 주요 차이점의 요약
Figure pct00001
따라서, 상기 논의된 바와 같이, 인간 체세포를 인간 iPS 세포로 재프로그래밍하는 재프로그래밍 유전자 및 메커니즘이 인간 체세포를 인간 SCNT로 재프로그래밍하는 재프로그래밍 유전자 및 메커니즘과 상당히 다르기 때문에, 그리고 그 결과로 얻은 세포는 상당히 다르기 때문에, iPSC를 제조하기 위한 재프로그래밍에 대해 작용하는 방법이 인간 SCNT의 생성을 위한 재프로그래밍에 작용할 것이라고 믿을만한 지시 또는 이유가 없다. 특히, 정상적인 iPSC는 모(parent) 체세포의 전형적인 잔류 DNA 메틸레이션 패턴을 보유하고 있는 반면, NT ES 세포의 DNA 메틸레이션 및 전사체 프로파일은 IVF-유래 ES 세포에 거의 일치한다(Ma et al., Nature. 2014 Jul 10; 51 1(7508): 177-183 참조).
따라서, 본 발명의 일 양상은 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 융합 또는 활성화 이전의 공여자 유전 물질을 포함하는 인간 제핵 난모세포) 또는 인간 SCNT 배아 (즉, 공여자 핵을 제핵 난모세포와 융합한 후)를 상기 공여자 인간 세포, 수용자 인간 난모세포 또는 인간 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제와 접촉시키는 단계 포함하고, 그것에 의하여 인간 SCNT의 효율을 증가시키는, 예를 들어, 그 결과로 생긴 인간 SCNT를 비-처리된 인간 SCNT 배아와 비교하여 배반포와 그 이후로 발달시키기 위한 효율을 증가시키는, 인간 체세포 핵 이식 (hSCNT)의 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 (i) 공여자 인간 체세포 또는 수용자 인간 난모세포를 상기 공여자 인간 체세포 또는 상기 수용자 인간 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제(예를 들어, KDM4A mRNA)와 접촉시키는 단계; 여기에서 상기 수용자 인간 난모세포는 유핵 또는 제핵 난모세포이며; 상기 인간 난모세포가 유핵인 경우 수용자 인간 난모세포에서 핵을 제거하는 단계; 상기 핵을 공여자 인간 체세포에서 상기 제핵 난모세포로 이식하여 하이브리드 난모세포를 형성하는 단계; 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는 (ii) 하이브리드 난모세포를 상기 하이브리드 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 상기 하이브리드 난모세포는 인간 체세포의 유전 물질을 포함하는 제핵 인간 난모세포인 것인 단계, 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는 (iii) 활성화 후의 인간 SCNT 배아를 상기 인간 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 SCNT 배아는 제핵 인간 난모세포와 인간 체세포의 유전 물질의 융합으로부터 생성된 것인 단계; 및 상기 SCNT 배아를 배반포를 형성하기 위한 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계 중 하나 이상을 포함하는 인간 체세포 핵 이식 (hSCNT)의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 배반포로부터 하나 이상의 할구를 수집하고 배양하여 하나 이상의 인간 NT-ESC를 형성한다.
일부 구체예에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제는 하나 이상의 (i) 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 구성원의 발현 또는 활성화 또는 기능을 증가시키는 제제 및/또는 (ii) H3K9 메틸트랜스페라제 억제제이고, 그것에 의하여 RRR에서 후생유전학적 장벽을 제거하고 인간 SCNT의 효율을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 인간 체세포 핵 이식 (SCNT)의 효율을 증가시키는 것은 SCNT 배아를 (예를 들어, 인간 제핵 난모세포를 공여자 세포의 인간 유전 물질과 융합한 후) 활성화 후 5시간(5 hours post activation: 5hpa) 이상, 또는 10-12 hpa 사이에 (즉, 1-세포기에서), 또는 약 20hpa (즉, 초기 2-세포기) 또는 20-28 hpa 사이에 (즉, 2-세포기) 하나 이상의 (i) 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리 (예를 들어, KDM4A mRNA) 및/또는 (ii) H3K9 메틸트랜스페라제-억제제 (예를 들어, 인간 SUV39h1/2의 억제제)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 것은 인간 KDM4 유전자, 예를 들어, hKDM4A, hKDM4B, hKDM4C, hKDM4D 또는 hKDM4E을 인간 공여자 난모세포 (제핵 전 또는 제핵 후) 또는 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 공여자 유전 핵 물질을 포함하는 제핵 난모세포, 그러나, 활성화 전), 또는 인간 SCNT 배아 (예를 들어, 활성화 후 5시간 이상 (5hpa) 또는 1-세포기에, 또는 2-세포기에), 또는 유전 물질이 제거되기 전에 공여자 인간 체세포 중 어느 하나 또는 조합에서 과발현시키거나 외인성 발현하는 것에 의해 일어난다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4 유전자, 예를 들어, KDM4A의 외인성 발현은 인간 공여자 난모세포에서 일어난다. 일부 구체예에서, 인간 KDM4 유전자, 예를 들어, KDM4A의 외인성 발현은 제핵 인간 공여자 난모세포에서 또는 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 공여자 유전 핵 물질을 포함하나 활성화 이전의 제핵 난모세포)에서 일어난다. 일부 구체예에서, KDM4 유전자, 예를 들어, KDM4A의 외인성 발현은 SCNT 배아에서 5hpa, 10-12 hpa 사이 (즉, 1-세포기에), 약 20hpa에서 (즉, 초기 2-세포기) 또는 20-28 hpa 사이 (즉, 2-세포기) 중 어느 하나에서 일어난다. 인간 SCNT 배아가 H3K9me3을 억제시키는 제제, 그러한 제제는, 예를 들어, 인간 KDM4 유전자, 예를 들어, KDM4A의 외인성 발현을 증가시키는 제제 (예를 들어, KDM4A mRNA 또는 mod-RNA)와 접촉하는 일부 구체예에서, SCNT 배아의 각 세포 (예를 들어, 2-세포 배아의 각 세포, 또는 4-세포 배아의 각 세포)는 KDM4A 활성화 또는 과발현 제제로 주입된다(예를 들어, SCNT 배아의 각 세포는 KDM4A mRNA로 주입된다).
다른 구체예에서, 공여자 유전 물질에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키기 위한 본원에 개시된 방법은 SUV39h1 및/또는 SUV39h2, 또는 둘 모두 (SUV39h1/2)의 발현을 인간 공여자 난모세포 (제핵 전 또는 제핵 후), 또는 하이브리드 난모세포에서 (즉, 활성화 전 공여자 유전 물질을 포함하는 제핵 난모세포), 또는 SCNT 배아에서 (예를 들어, 활성화 후 5시간 이상 (5hpa) 후 또는 1-세포기에서, 또는 2-세포기에서, 또는 4-세포기에서), 또는 공여자 인간 체세포에서 중 어느 하나 또는 조합에서 억제시킴으로써 일어난다.
일부 구체예에서, SUV39h1 및/또는 SUV39h2, 또는 둘 모두 (SUV39h1/2)의 억제는 공여자 인간 체세포에서, 예를 들어, 제핵 인간 공여자 난모세포로 이식하기 위한 핵 또는 유전 물질의 제거 전에 약 24시간 이상, 또는 약 48시간 이상, 또는 약 3일 이상 또는 약 4일 이상 또는 4일을 초과하여 일어난다. 일부 구체예에서, SUV39h1 및/또는 SUV39h2, 또는 둘 모두 (SUV39h1/2)의 발현을 억제하는 것은 siRNA에 의하고, 12시간 이상, 또는 24시간 이상 동안, 핵의 제거 이전의 기간에 일어난다.
본 발명의 또 다른 양상은 인간 SCNT 배아, 인간 난모세포 또는 하이브리드 난모세포, 또는 공여자 인간 체세포를 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제(예를 들어, KDM4A mRNA)와 접촉시키는 단계를 포함하고, 그것에 의하여 SCNT의 효율을 증가시키는 인간 체세포 핵 이식 (SCNT)의 효율을 증가시키는 방법에 관련된다. 일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포는 IVF 절차를 사용하여 성공적인 수정을 위해 충분한 품질이 아닐 수 있는 좋지 못한 품질의 인간 난모세포이다. 일부 구체예에서, 인간 난모세포는 공여자 인간 핵 또는 유전 물질의 주입 이전에 접촉된다. 일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포는 제핵 인간 난모세포이다. 일부 구체예에서, SCNT 배아는 1-세포기, 또는 2-세포기 SCNT 배아이다. 일부 구체예에서, H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제 (예를 들어, KDM4A mRNA)는 최종 분화된 인간 체세포 유래 핵 또는 유전 물질을 갖는 핵 이식 이전에 수용자 인간 난모세포 또는 제핵 인간 난모세포와 접촉한다.
일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포, 인간 체세포 공여자 세포, 또는 인간 SCNT 배아와 접촉하는 제제는 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 하나 이상의 구성원, 예를 들어, 인간 KDM4A (서열번호 1), 인간 KDM4B (서열번호 2), 인간 KDM4C (서열번호 3) 또는 인간 KDM4D (서열번호 4)로 이루어진 인간 KDM4 (JMJD2) 패밀리의 하나 이상의 구성원의 발현 또는 활성을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제는 KDM4D (JMJD2D) 또는 KDM4A (JMJD2A) 또는 KDM4B 또는 KDM4C의 발현 또는 활성을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 제제는 인간 유래 KDM4의 핵산 서열, 예를 들어, KDM4A (서열번호 1), 인간 KDM4B (서열번호 2), 인간 KDM4C (서열번호 3) 또는 인간 KDM4D (서열번호 4) 또는 인간 KDM4E (서열번호 45), 또는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45의 상응하는 서열과 비교하여 인간 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 (예를 들어, 약 110% 이상, 또는 약 120% 이상, 또는 약 130% 이상, 또는 약 140% 이상, 또는 약 150% 이상, 또는 150% 초과 증가됨) 그와 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성인 그의 생물학적 활성 단편 또는 동족체(homologue)를 포함한다.
일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포 또는 인간 SCNT 배아와 접촉하는 제제는 서열번호 9의 인간 KDM4A 단백질의 발현을 증가시키거나, 및/또는 서열번호 1에 상응하는 인간 KDM4A 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 핵산 서열과 비교하여 인간 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 (예를 들어, 약 110% 이상, 또는 약 120% 이상, 또는 약 130% 이상, 또는 약 140% 이상, 또는 약 150% 이상, 또는 150% 초과 증가됨) 그의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포 또는 인간 SCNT 배아와 접촉하는 제제는 서열번호 12의 인간 KDM4D 단백질의 발현을 증가시키거나, 및/또는 서열번호 4에 상응하는 인간 KDM4D 핵산 서열 또는 그의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 KDM4D의 생물학적 활성 단편은 Antony et al. Nature, 2013에 개시된 바와 같이 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 12의 아미노산 1-424의 C-말단 또는 N-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상의 아미노산이 결여되거나, 서열번호 12의 아미노산 1-424의 C-말단 및 N-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상의 아미노산이 결여된 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다.
대안적인 구체예에서, 공여자 인간 세포, 예를 들어, 최종 분화된 세포의 공여자 핵과 접촉하는 제제는 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나 상기 논의된 바와 같은 KDM4A, KDM4B, KDM4C, KDM4D 또는 KDM4E로 이루어진 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 양상은 공여자 인간 세포, 예를 들어, 최종 분화된 체세포의 핵을 공여자 인간 체세포의 핵에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 그것에 의하여 SCNT의 효율을 증가시키는 인간 체세포 핵 이식 (SCNT)의 효율을 증가시키는 방법에 관련된다.
본 발명의 모든 양상의 일부 구체예에서, 공여자 인간 체세포와 접촉하는 제제는 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1 발현 또는 단백질 기능의 억제제이다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1의 억제제 중 하나 이상 또는 임의의 조합은 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제는 인간 SETDB1의 억제제가 아니다.
일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제는 RNAi 제제, siRNA 제제, shRNA, 올리고뉴클레오티드, CRISPR/Cas9, CRISPR/cpfl, 중화 항체 또는 항체 단편, 압타머, 소분자, 단백질, 펩티드, 소분자, 아비디미르(avidimir), 및 그의 기능성 단편 또는 유도체 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 RNAi 제제, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 구체예에서, 제제는 인간 SUV39H1 단백질 (서열번호 5 또는 서열번호 48)의 발현을 억제시키는 핵산 억제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 인간 SUV39H2 단백질 (서열번호 6)의 발현을 억제시키는 핵산 억제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39h1의 siRNA 억제제는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 또는 서열번호 23 또는 그의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 또는 서열번호 23 중 어느 하나와 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39h1의 siRNA 억제제는 서열번호 8, 서열번호 21 또는 서열번호 23 또는 그의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 8, 서열번호 21 또는 서열번호 23 중 어느 하나와 80% 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, siRNA 또는 다른 핵산 억제제는 인간 SUV39h1의 서열번호 14 또는 서열번호 47 (각각 SUV39h1 변이체 2 및 1에 상응함) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 영역 내에 위치하는 표적 서열의 전부 또는 일부에 혼성화한다.
일부 구체예에서, 인간 SUV39h2의 siRNA 억제제는 서열번호 18 또는 서열번호 19, 또는 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 또는 그의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 18 또는 서열번호 19, 또는 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27과 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상)을 갖는 핵산 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39h2의 siRNA 억제제는 서열번호 19, 서열번호 25, 서열번호 27, 또는 그의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 19, 서열번호 25, 서열번호 27과 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상)을 갖는 핵산 서열 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, siRNA 또는 다른 핵산 억제제는 인간 SUV39h2의 서열번호 15, 49, 51, 52 및 53 (hSUV39h2 변이체 1-5) 중 임의의 뉴클레오티드의 영역 내에 위치한 표적 서열의 전체 또는 일부에 혼성화한다.
일부 구체예에서, 제제는 활성화 이전에 또는 활성화 후 약 5시간에, 또는 인간 SCNT 배아가 1-세포기, 2-세포 또는 4-세포기에 있을 때 SCNT 배아와 접촉할 수 있다. 대안적인 구체예에서, 제제는 인간 SCNT 배아와 활성화 후 5시간 후에 또는 인간 SCNT 배아가 2-세포기에 있을 때 접촉할 수 있다. 일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 인간 SCNT 배아는 제제가 주입되며, 예를 들어, KDM4A mRNA를 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 인간 SCNT 배아의 핵 및/또는 세포질로 주입하는 것에 의한다. 일부 구체예에서, 제제는 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 하나 이상의 구성원의 발현 또는 활성을 증가시킨다.
일부 구체예에서, H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제 (예를 들어, KDM4A mRNA)는 공여자 인간 세포의 핵을 제핵 인간 난모세포로 주입하기 이전에 공여자 인간 세포, 예를 들어, 최종 분화된 체세포의 핵 또는 세포질과 접촉하거나 주입된다. 일부 구체예에서, 그러한 제제는 공여자 인간 체세포와 1시간 이상, 또는 2시간 이상 동안 접촉하고, 여기에서 접촉은 공여자 인간 체세포로부터 제핵 인간 난모세포로의 핵의 제거 이전에 1일 (24시간) 이상, 또는 2일 이상, 또는 3일 이상, 또는 3일 초과로 일어난다.
본 발명의 모든 양상에서, 인간 SCNT 배아는 공여자 인간 체세포 핵의 분화된 체세포 (대체로 최종 분화된 세포, 그러나 ES 세포 또는 iPSC는 아님)로부터 제핵 인간 난모세포로의 주입으로부터 제조되며, 여기에서 공여자 핵은 배아 줄기(ES) 세포 또는 유도 만능 줄기(iPS) 세포, 또는 태아세포 유래가 아니다. 본 발명의 모든 양상에서, 인간 SCNT 배아는 공여자 핵을 최종 분화된 인간 체세포로부터 제핵 인간 난모세포로 주입하는 것에 의해 생성된다. 일부 구체예에서, 공여자 인간 체세포 유전 물질은 비-인간 수용자 난모세포로 주입된다. 일부 구체예에서, 인간 SCNT 배아는 하이브리드 난모세포의 활성화 (또는 융합) 후 발달한다. 일부 구체예에서, 하이브리드 난모세포는 체세포 인간 공여자 세포 유래 유전 핵 물질, 및 또한 제3의 인간 공여자 유래 미토콘드리아 유전 물질 (예를 들어, 미토콘드리아 DNA 또는 mtDNA) (즉, 제핵 난모세포 원산이 아닌 mtDNA)을 포함하는 제핵 인간 난모세포를 포함한다.
본 발명의 모든 양상에서, 공여자 체세포, 수용자 난모세포 또는 SCNT 배아는 인간 세포이며, 예를 들어, 인간 공여자 세포, 수용자 인간 난모세포 또는 인간 SCNT 배아이다.
따라서, 본 발명의 모든 양상에서, 방법은 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제의 부재 하에 (즉, KDM4 패밀리의 구성원의 발현 또는 활성화를 증가시키는 제제의 부재 하에) 수행된 인간 SCNT와 비교하여 인간 SCNT의 효율이 약 5% 이상, 또는 약 10% 이상, 또는 약 13% 이상, 또는 약 15% 이상, 또는 30% 이상 증가, 또는 50% 이상 증가, 또는 50%-80% 증가, 또는 80% 초과로 증가를 초래한다. 달리 말하면, 본원에 개시된 방법은 SCNT 배아의 이식 전 발달의 효율을 증가시키거나, 또는 hSCNT 배아의 배반포 단계로의 발달을 증가시키거나, 또는 hSCNT 배아의 확장된 배반포 단계로의 발달을 증가시키고, 그것에 의하여 약 5%, 또는 7%, 또는 10%, 또는 12% 이상, 또는 12% 초과로 확장된 배반포 단계로 발달한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 인간 SCNT 배아의 발달의 효율을 증가시키며, 예를 들어, H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제의 부재 하에 제조된 hSCNT 배아와 비교하여 배반포 단계로의 성공적인 발달을 3배 이상, 또는 4배 이상, 또는 5배 이상, 또는 약 6배 이상, 또는 약 7배 이상, 또는 약 8배 이상 또는 8배 초과 증가시킨다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제공된 인간 SCNT 효율의 증가는 인간 SCNT 배아-유도 배아 줄기 세포 (인간 NT-ESCs)의 생성 또는 수득에서 증가를 말한다.
본 발명의 또 다른 양상은 인간 SCNT 배아, 수용자 인간 난모세포, 또는 하이브리드 난모세포 또는 인간 배반포 중 하나 이상 및 (i) 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리 (Jmjd2)의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제 또는 (ii) H3K9 메틸트랜스페라제를 억제시키는 제제 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관련된다.
일부 구체예에서, 조성물은 최종 분화된 체세포로부터 얻은 공여자 핵을 주입하기 이전의 제핵 인간 난모세포 또는 인간 난모세포인 수용자 인간 난모세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 활성화 이전의 공여자 핵 유전 물질을 포함하는 인간 제핵 난모세포)를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 SCNT 배아는 1-세포기, 또는 2-세포, 또는 4-세포기 인간 SCNT 배아이다. 일부 구체예에서, 조성물은 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 구성원을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키거나, 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 하나 이상의 구성원, 예를 들어, KDM4A, KDM4B, KDM4C, KDM4D 또는 KDM4E의 활성을 증가시키는 제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 KDM4D (JMJD2D) 또는 KDM4A (JMJD2A)의 발현 또는 활성을 증가시키거나, 또는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45의 상응하는 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 SCNT의 효율을 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편 또는 동족체이다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열번호 1에 상응하는 인간 KDM4A 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 핵산 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 SCNT의 효율을 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1의 억제제인 제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1의 억제제 중 하나 이상 또는 임의의 조합이 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 방법에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 siRNA, shRNA, 중화 항체 또는 항체 단편, 압타머, 소분자, 단백질, 펩티드, 소분자 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제를 포함한다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 인간 SUV39h1 또는 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1를 억제시키는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간 SUV39h1의 서열번호 14 또는 서열번호 47 (각각 SUV39h1 변이체 2 및 1에 상응함), 또는 인간 SUV39h2의 서열번호 15, 49, 51, 52 및 53 (hSUV39h2 변이체 1-5) 중 임의의 뉴클레오티드의 영역 내에 위치한 표적 서열의 전체 또는 일부에 혼성화하는 핵산 억제제를 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 서열번호 7의 표적 서열 또는 그의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 7과 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열에 전체 또는 일부에 결합하는 인간 SUV39h1의 siRNA 억제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열번호 8 또는 그의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 8과 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함하는 인간 SUV39h1의 siRNA 억제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간 SUV39h1의 서열번호 14 또는 서열번호 47 (각각 SUV39h1 변이체 2 및 1에 상응함) 중 어느 하나의 뉴클레오티드의 영역 내이 위치한 표적 서열에 전체 또는 일부에 혼성화하는 siRNA 또는 다른 핵산 억제제를 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 인간 SUV39h2의 서열번호 15, 49, 51, 52 및 53 (hSUV39h2 변이체 1-5) 중 임의의 뉴클레오티드의 영역 내에 위치한 표적 서열에 전체 또는 일부에 혼성화하는 siRNA 또는 다른 핵산 억제제를 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 1-세포 또는 2-세포 또는 4-세포기에 있는 인간 SCNT 배아를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제핵 인간 난모세포 또는 하이브리드 난모세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간 SCNT 배아, 수용자 인간 난모세포, 인간 하이브리드 난모세포 또는 인간 배반포를 포함한다.
또 다른 구체예는 (i) 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는, 예를 들어, 인간 KDM4 패밀리의 구성원의 mRNA를 포함하는 제제 및/또는 (ii) H3K9 메틸트랜스페라제를 억제시키는 제제를 포함하는 키트에 관련된다.
본원에 개시된 바람직한 구체예에서의 개시는 인간을 복제하는 방법, 인간의 생식계 유전적 동일성을 변형하는 방법, 또는 산업적 또는 상업적 목적의 인간 SCNT 배아의 사용 또는 사람에게 어떠한 실질적인 의학적 이익 없이 고통을 초래할 수 있는 인간의 유전적 동일성을 변형하는 방법, 또는 그러한 방법으로부터 초래된 인간에 관한 것이 아니다.
도 1A-1F는 체세포에서 인간 재프로그래밍 저항성 영역 (RRRs)이 H3K9me3에 대해 풍부화된 것을 나타낸다. 도 1A는 실험 절차의 개략도이다. RNA-seq를 위해 사용된 시료는 대시 기호로 이루어진 직사각형으로 표시되었다. 도 1B는 IVF 인간 이식 전 배아의 전사체의 열지도(heatmap) 도면이다. 각 타일은 슬라이딩-윈도우 분석에 의해 얻어진 영역 내의 피크의 평균을 나타낸다. IVF 배아에서 4-세포기에서 8-세포기로 활성화된 707개 영역이 표시된다. RNA-seq 데이터 세트는 이전 공개문헌으로부터 얻었다(Xue et al., 2013). 도 1C는 공여자 체세포, 8-세포기에서 IVF 및 SCNT 배아를 비교하는 전사체의 열지도 도면이다. (도 1A)에서 확인된 707개 영역이 표시된다. 이러한 영역은 SCNT- 및 IVF 8-세포 배아 간의 전사 수준의 배수-변화 (fold-change: FC)에 기초하여 세 그룹으로 분류되었다. FRRs, PRRs, 및 RRRs는 각각 완전히 재프로그래밍된 영역 (FC <= 2), 부분적으로 재프로그래밍된 영역 (2 < FC <= 5) 및 재프로그래밍 저항성 영역 (FC > 5)을 지시한다. 도 1D는 인간 섬유아세포 (human fibroblast cells: Nhlf)에서 H3K9me3 및 H3K4me3의 평균 ChIP-seq 강도가 200 kb 측방(flanking) 영역과 비교하여 FRR, PRR, 및 RRR 내에 나타난다는 것을 보여준다. 히스톤 변형 ChIP-seq 데이터 세트는 ENCODE 프로젝트로부터 얻었다(Bernstein et al., 2012; The Encode Consortium Project, 2011). 도 1E 및 도 1F는 서로 다른 체세포 유형에서 FRR, PRR 및 RRR 내의 H3K9me3-ChIP-seq (도 IE) 및 DNaseI-seq (도 IF)의 평균 강도를 비교하는 상자 그림이다. ChIP-seq 및 DNaseI-seq 데이터 세트는 ENCODE 프로젝트로부터 얻었다(ENCODE Project Consortium, 2011). 색깔 공간의 중간 선은 중앙값을 지시하고, 모서리는 25/75 백분위수를 지시하며, 위스커(whiskers)는 2.5/97.5 백분위수를 지시한다. *** p <0.001, ** p < 0.01. 또한 도 5, 표 5 및 6을 참조하라. (약어: RRR = 재프로그래밍 저항성 영역(reprogramming resistant regions), PRR = 부분적으로 재프로그래밍된 영역(partially reprogrammed regions); FRR = 완전히 재프로그래밍된 영역(fully-reprogrammed regions)),
도 2A-2H는 인간 KDM4A mRNA의 주입이 마우스 및 인간 SCNT 배아의 발달을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 도 2A는 마우스 SCNT 절차의 개략도이다. 도 2B는 mRNA 주입 후 수 시간에 항-H3K9me3 및 DAPI5로 염색된 1-세포기 SCNT 배아의 대표적 핵 이미지를 나타낸다. 도 2C는 KDM4A mRNA 주입이 마우스 SCNT 배아의 이식 전 발달을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 지시된 단계에 도달한 배아의 백분율이 표시된다. 에러 바는 s.d.를 지시한다. 도 2D는 인 비트로(in vitro) 배양 120 시간 후 SCNT 배아의 대표 이미지를 나타낸다. 축척 막대(scale bar), 100 Jim. 도 2E는 인간 SCNT 절차의 개략도이다. 도 2F는 7일의 인 비트로(in vitro) 배양 동안 4개의 서로 다른 공여자 유래 난모세포를 사용하여 얻은 인간 SCNT 배아의 평균 발달 효율을 나타내는 막대 그래프이다. 효율은 2-세포기에 도달한 배아의 수를 사용하여 계산하였다. Blast: 배반포(blastocyst), ExBlast: 확장된 배반포(expanded blastocyst). 발달률은 피셔의 정확성 검정(Fisher's exact test)에 의해 통계적으로 분석하였다. 도 2G는 인 비트로(in vitro) 배양 7일 후 SCNT 배아의 대표 이미지를 나타낸다. 도 2H는 각 난모세포-공여자 여성으로부터 유도된 인간 SCNT 배아의 발달률의 막대 그래프를 나타낸다. 또한 표 3 및 4를 참조하라.
도 3A-3J는 ADM 환자로부터 NTK-ESC의 확립 및 특징화를 나타낸다. 도 3A는 KDM4A-보조 SCNT를 통해 핵 공여자로서 AMD 환자 섬유아세포를 사용하여 확립된 NT-ESC 라인의 개요 표이다. 도 3B는 NTK-ESC의 대표적인 위상 대비 및 면역 염색 이미지를 나타낸다. 축적 막대(Scale bar), 100 Jim. 도 3C는 RNA-seq 데이터에 기초한 다능성-특이적 및 섬유아세포-특이적 유전자의 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 도 3D는 대조군 ESC 라인 (ESC 15)과 대표적인 NTK-ESC, NTK6 간의 유전자 발현 수준을 비교하는 산점도이다. 다르게 발현된 유전자 (FC > 3.0)는 검정색 점으로 표시되었다. 도 3E는 RNA-seq 데이터 세트에 기초한 NTK-ESC, 대조군 ESC 및 공여자 피부 섬유아세포의 계층적 클러스터링을 나타낸다. 도 3F는 2주 동안 인 비트로(in vitro)에서 자발적으로 분화된 면역염색 배양체 (embryoid bodies: EBs)의 대표 이미지이다. 축척 막대(Scale bar), 100 Jim. 도 3G는 이식 후 12주에 NTK6으로부터 유도된 기형종의 대표적인 조직학적 이미지를 나타낸다. 축척 막대(Scale bar), 100 μm. 도 3H는 NTK6의 세포유전학적 G-밴딩 분석의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 3I는 16 STR 마커를 사용한 핵 DNA 유전자형을 나타낸다. 도 3J는 대표적인 단일 뉴클레오티드 다형성 (single nucleotide polymorphism: SNP) 부위의 미토콘드리아 DNA 유전자형을 나타낸다. 또한 도 6 및 7을 참조하라. 도 3J는 나타난 순서대로 각각 서열번호 58, 58 및 59로서 rs2853826 (m. 10398 A>G) 서열, 및 나타난 순서대로 각각 서열번호 58, 58 및 59로서 rs2853826 (m. 10400 C>T)을 개시한다.
도 4A-4C는 SCNT 8-세포 배아에서 KDM4A mRNA 주입 시 전사의 부분 회복을 나타낸다. 도 4A는 후기 8-세포기에서 318개 RRR의 전사 수준을 비교하는 열지도를 나타낸다. 318개 RRR 중 158개의 발현 수준은 KDM4A mRNA 주입에 반응하여 현저하게 (FC > 2) 증가한다. 도 4B는 206개 KDM4A-반응성 유전자 (FC > 2)의 유전자 온톨로지 분석을 나타낸다. 도 4C는 IVF, 또는 SCNT (KDM4A mRNA 주입 유 또는 무) 8-세포 배아에서 두 개의 대표적인 KDM4A-반응성 유전자, UBTFL1 및 THOC5의 전사 수준의 막대 그래프 및 게놈 브라우저 그림을 나타낸다. 또한 표 7을 참조하라.
도 5A-5E는 도 1과 관련되며 인간 체세포에서 RRR (재프로그래밍 저항성 영역)이 이종염색질 특징을 보유하는 것을 나타낸다. 도 5A는 인간 섬유아세포 (Nhlf)에서 FRR, PRR, 및 RRR에서 6개 히스톤 변형의 평균 ChIP-seq 신호를 비교하는 상자 그림을 나타낸다. 도 5B 및 5C는 서로 다른 체세포 유형에서 FRR, PRR 및 RRR 내의 H3K9me3-ChIP-seq (도 5B) 및 DNaseI-seq (도 5C)의 평균 강도를 비교하는 상자 그림을 나타낸다. ChIP-seq 및 DNaseI-seq 데이터 세트는 ENCODE 프로젝트로부터 얻었다(ENCODE Project Consortium, 2011). H3K9me3 강도는 FRR 및 PRR과 비교하여 RRR에서 상당히 풍부하며, DnaseI-seq 강도는 FRR 및 PRR과 비교하여 RRR에서 상당히 감소한다는 것을 주목하라. *** p <0.001, ** p <0.01, * p < 0.05. 도 5D는 인간 게놈에서 FRR, PRR 및 RRR에서 단백질 코딩 유전자의 밀도를 나타내는 엑손 서열의 평균 백분율을 비교하는 상자 그림을 나타낸다. *** p <0.001, * p < 0.05. 도 5E는 FRR, PRR 및 RRR 내의 반복 서열의 평균 백분율을 비교하는 상자 그림을 나타낸다. *** p <0.001, * p < 0.05, ns, 유의하지 않음(not significant).
도 6A-6F는 도 1과 관련되며 인간 NTK-ESC가 정상의 다능성을 나타냄을 보여준다. 도 6A는 NTK-ESC와 IVF-유도된 대조군 ESC의 대표적인 면역염색 이미지를 나타낸다. ESC 콜로니는 항-SOX2, 항-SSEA4 항체 및 DAPI로 공동-염색(co-stained)되었다. 축척 막대(Scale bar), lOOμm. 도 6B는 대조군 ESC 및 NTK-ESC의 상이한 생물학적 복제물의 RNA-seq의 재현성에 대한 산점도 평가이다. 도 6C는 대조군 ESC와 NTK-ESC 간의 전체적인 유전자 발현 패턴을 비교하는 산점도를 나타낸다. 다르게 발현된 유전자 (FC > 3.0)는 검정색 점으로 표시되었다. 각 쌍(pair-wise) 비교의 상관관계는 극도로 높다는 것을 주목하라 (r = 0.95-0.99). 도 6D는 2주 동안 인 비트로(in vitro)에서 자발적으로 분화된 면역염색 배양체 (EBs)의 대표적인 이미지를 나타낸다. EB는 항-TUJI, 항-BRACHYURY 또는 항-AFP 항체로 DAPI와 함께 염색되었다. 축척 막대(Scale bar), 100 μm. 도 6E는 이식 후 12주에 NTK-ESC#6으로부터 유도된 기형종의 대표적인 조직학적 이미지를 나타낸다. 축척 막대(Scale bar), 100 μm. 도 6F는 이식 후 12주에 NTK7 및 NTK8로부터 유도된 기형종의 대표적인 조직학적 이미지를 나타낸다.
도 7A-7C는 도 3에 관련되며 인간 NTK-ESC가 핵-공여자 유래 게놈 및 난모세포-공여자 유래 미토콘드리아를 함유하는 것을 나타낸다. 도 7A는 NTK-ESC 라인 NTK7 및 NTK8에서 예상된 성 염색체 조성을 갖는 정상 핵형을 나타내는 세포유전학적 G-밴딩 분석의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 7B는 16 STR 마커를 사용하여 핵 DNA 유전자형을 나타낸다. NTK-ESC NTK7 및 NTK8의 모든 STR 마커는 원래의 핵 공여자 섬유아세포 DFB-6 및 DFB-8의 그것과 각각 완전히 일치한다는 것을 주목하라. 도 7C는 대표적인 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 부위의 미토콘드리아 DNA 유전자형을 나타낸다. NTK-ESC의 미토콘드리아는 공여자 난모세포에서만 유래된다. 도 7C는 나타난 순서대로 각각 서열번호 60-65로서 rs1116907 (m. 8468 C>T) 서열, 및 나타난 순서대로 각각 서열번호 66-69 및 69-70으로서 rs1116904 (m. 8027 G>A) 서열을 개시한다.
기초 과학 및 치료 용도로 막대한 잠재력이 있음에도 불구하고, 체세포 핵 이식(SCNT)에 의한 인간 체세포의 복제 효율은 매우 낮아서 배반포로의 발달이 좋지 못하고 확장 배반포(expanded blastocyst)에서 세포 수가 적다. 이러한 결함은 또한 복제된 인간 SCNT 배아에서 드물게 성공적인 인간 ES 세포주 확립의 원인이 된다. 복제된 인간 배아의 무능력은 주로 공여자 인간 핵에서 불완전한 핵 프로그래밍 및/또는 후생유전학적 장벽(epigenetic barriers)으로 인한 것이다.
본 발명은 히스톤 H3-리신 9의 트리메틸레이션(H3K9me3)이 인간 공여자 세포의 핵 내 재프로그래밍 저항성 영역(RRR)에서 발생하며, SCNT에 의한 효율적인 인간 체세포 핵 재프로그래밍을 막는 후생유전학적 장벽이라는 발견에 기초한다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 두 가지 방법을 증명했는데, 첫째로 KDM4 데메틸라제 패밀리의 구성원, 예를 들어, KDM4A 또는 KDM4D의 외인성 또는 증가된 발현 (예를 들어, 과발현)을 사용하여 공여자 핵 유전 물질의 H3K9me3의 데메틸레이션을 촉진하는 것에 의하거나, 및/또는 히스톤 메틸트랜스페라제, 예를 들어, SUV39h1 및/또는 SUV39h2를 억제하여 H3K9me3의 메틸레이션을 억제하는 것에 의한 것이다. 일부 구체예에서, 하이브리드 인간 난모세포 (예를 들어, 활성화 이전의 인간 공여자 체세포 유래 핵 유전 물질을 포함하는 제핵 인간 난모세포) 및/또는 인간 SCNT 배아는 KDM4A 및/또는 KDM4D의 발현을 증가시키는 제제 (예를 들어, 인간 KDM4A 단백질 또는 KDM4A 단백질의 기능성 단편을 코딩하는 mRNA 및/또는 인간 KDM4D 단백질 또는 KDM4D 단백질의 기능성 단편을 코딩하는 mRNA)가 주입된다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 KDM4A 또는 KDM4D 단백질, 또는 이의 동족체(homologue), 또는 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 패밀리의 다른 구성원을 코딩하는 mRNA이다.
일부 구체예에서, 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 융합 또는 활성화 이전의 공여자 유전 물질을 포함하는 인간 제핵 난모세포) 또는 인간 SCNT 배아 (즉, 공여자 핵을 제핵 난모세포와 융합한 후)는 KDM4 패밀리의 구성원을 코딩하는 mRNA, 또는 mRNA 또는 핵산 또는 핵산 유사체(analogue) (변형된 mRNA (mod-RNA로도 알려짐)를 포함함)가 주입된다. 일부 구체예에서, 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포, 또는 인간 SCNT는 인간 KDM4A 단백질 또는 KDM4A 단백질의 기능성 단편을 코딩하는 mRNA 및/또는 인간 KDM4D 단백질 또는 KDM4D 단백질의 기능성 단편을 코딩하는 mRNA가 주입된다. hSCNT가 주입되는 일부 구체예에서, 그것은 활성화 후 임의의 단계, 예를 들어, hSCNT 배아의 5hpa, 또는 10-12hpa, 또는 20-28hpa, 1-세포기, 2-세포기 또는 4-세포기에 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 인간 핵 유전 물질에서 (예를 들어, 인간 공여자 게놈에서) 후생유전학적 장벽을 제거하는 것에 의하여 hSCNT 배아의 배반포기 및 그 이후로의 발달을 포함하는 성공적인 인간 SCNT의 효율을 증가시키기 위한, H3K9me3 히스톤 데메틸라제 활성제, 예를 들어, 인간 KDM4/JMJD2 패밀리의 활성제 및/또는 H3K9me3 메틸트랜스페라제 억제제, 예를 들어, 인간 SUV39h1 또는 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1의 억제제를 포함하는 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 양상은 (i) H3K9me3을 탈메틸화시킬 수 있는 히스톤 데메틸라제, 예를 들어, 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 구성원, 비제한적인 예를 들면, JMJD2A/KDM4A 또는 JMJD2B/KDM4B, 또는 JMJD2C/KDM4C 또는 JMJD2D/KDM4D 또는 JMJD2E/KDM4E를 발현시키는 단계 및/또는 (ii) H3K9me3의 메틸레이션에 관련된 히스톤 메틸트랜스페라제를 억제, 예를 들어, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1 중 어느 하나 또는 조합을 억제시킴으로써 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 단계에 의해 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 것에 관한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제는 KDM4E(JMJD2E), KDM4D (JMJD2D), KDM4C (JMJD2C), KDM4B (JMJD2B) 또는 KDM4A (JMJD2A)의 발현 또는 활성을 증가시킨다.
또 다른 양상은 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 제조된 인간 SCNT-배아를 사용하여, 제거되거나 생검되거나 및/또는 인간 ES 세포 (즉, 인간 NT-ESCs)를 생성하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 할구로 발달하는 것에 관한 것이다. 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된 NT-hESCs는 다양한 목적, 예를 들어, 재생 및/또는 세포-기반 요법, 분석법, 및 질병 모델링에서의 사용 (예를 들어, 여기에서 hNT-ESCs가 환자 특이적 hNT-ESC이고, 여기에서 hSCNT 배아는 특정 돌연변이 또는 SNP을 가지거나 및/또는 특정 질병에 걸릴 경향을 가지는 인간 공여자 개체 유래 유전 핵 공여자를 사용하여 생성됨)을 위해 사용될 수 있다. hNT-ESC는 또한 분석법, 예를 들어, 비제한적인 예로 맞춤형 약물 스크리닝 및/또는 질병 특이적 약물 스크린을 포함하는 약물 스크리닝 분석법에서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 생성된 hNT-ESCs는 냉동보존될 수 있을뿐만 아니라 인간 NT-ESC 은행에 보관될 수 있다.
정의
편의상, 전체 명세서 (발명의 설명, 실시예, 및 첨부된 청구항을 포함함)에서 사용된 특정 용어를 여기에 모았다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다.
구절 "체세포 핵 이식(Somatic Cell Nuclear Transfer)" 또는 "SCNT"는 일반적으로 치료 또는 재생 클로닝이라고도 하며, 체세포가 제핵 난모세포와 융합되는 과정이다. 체세포의 핵은 유전 정보를 제공하는 반면, 난모세포는 배아의 발달에 필요한 영양소 및 다른 에너지 생성 물질을 제공한다. 일단 융합이 일어나면, 세포는 전능성이며, 결국 배반포로 발달하고, 그 지점에서 내부 세포 덩어리가 분리된다.
본원에서 사용된 용어 "핵 이식(nuclear transfer)"은 제핵 난모세포를 체세포의 세포 핵 유전 물질 또는 핵과 인공적으로 결합시킴으로써 획득한 동일한 특징 및 특성을 가능하게 하는 유전자 조작 기술을 말한다. 일부 구체예에서, 핵 이식 절차는 공여자 체세포 유래 핵 또는 핵 유전 물질을 제핵 난자 또는 난모세포(핵/전핵이 제거된 난자 또는 난모세포)로 옮기는 것이다. 공여자 핵은 체세포로부터 올 수 있다.
용어 "핵 유전 물질"은 개인에 대한 정보를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)를 포함하는 핵에서 발견되는 구조 및/또는 분자를 말한다. 핵 유전 물질은 염색체 및 염색질을 포함한다. 상기 용어는 또한 모 세포에서 딸 세포로의 분열과 같은 세포 분열에 의해 생성된 핵 유전 물질 (예를 들어, 염색체)을 말한다. 핵 유전 물질에는 미토콘드리아 DNA가 포함되어 있지 않다.
용어 "SCNT 배아"는 체세포의 핵 또는 핵 유전 물질과 융합된 제핵 난모세포의 세포, 또는 이의 전능성 후대를 말한다. SCNT 배아는 배반포로 발달할 수 있고 살아있는 자손으로 이식 후 발달할 수 있다. SCNT 배아는 1-세포 배아, 2-세포 배아, 4-세포 배아, 또는 배반포로 되기 이전의 임의의 단계의 배아일 수 있다.
용어 "모 배아(parental embryo) "는 단일 할구가 제거되거나 생검되는 SCNT 배아를 지칭하기 위해 사용되었다. 생검 후, 남아있는 모 배아 (생검된 할구를 제외한 모 배아)는 할구와 함께 배양되어 할구의 증식을 촉진시킬 수 있다. 남아있는 생존 가능한 모 SCNT 배아는 이후에 장기간 또는 영구적 저장을 위해 또는 미래의 사용을 위해 동결될 수 있다. 대안적으로, 생존 가능한 모 배아는 임신을 창출하는 데 사용될 수 있다.
용어 "공여자 인간 세포" 또는 "공여자 인간 체세포"는 핵 수용체(acceptor) 또는 수용자인 수용자 난모세포로 이식되는 인간 세포의 체세포 또는 핵을 말한다.
용어 "체세포"는 생식 세포 또는 생식 세포 전구체가 아닌 식물 또는 동물 세포를 말한다. 일부 구체예에서, 분화된 세포는 생식 세포가 아니다. 체세포는 다능성 또는 전능성 세포와 관련되지 않는다. 일부 구체예에서 체세포는 "비-배아 체세포"이며, 이는 배아에 존재하지 않거나 배아로부터 수득되지 않으며 인 비트로(in vitro)에서 그러한 세포의 증식으로부터 유래하지 않는 체세포를 의미한다. 일부 구체예에서 체세포는 "성체 체세포(adult somatic cell) "이며, 이는 배아 또는 태아 이외의 유기체에 존재하거나 유기체로부터 수득되거나 인 비트로(in vitro)에서 그러한 세포의 증식으로부터 유래된 세포를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "분화된 세포"는 체세포 계통으로 분화되거나 최종 분화된 과정 중의 임의의 세포를 말한다. 예를 들어, 배아 세포는 내장을 감싸는 상피 세포로 분화할 수 있다. 분화된 세포는 예를 들어 태아 또는 살아있는 태어난 동물에서 분리될 수 있다.
세포 개체 발생의 맥락에서, 형용사 "분화된" 또는 "분화하는"은 상대적인 용어로서 "분화된 세포"는 그것이 비교되는 세포보다 발달 경로를 따라 더 진행된 세포인 것을 의미한다. 따라서, 줄기 세포는 계통-제한된 전구 세포(예를 들어 중배엽 줄기 세포)로 분화할 수 있으며, 차례로 경로를 따라 다른 유형의 전구 세포로 분화할 수 있고(예를 들어 심근세포 전구체), 그 다음에 마지막-단계 분화된 세포까지 분화할 수 있는데, 이것은 특정 조직 유형에서 특징적 역할을 하고, 더 증식할 수 있는 능력을 보유하거나 보유하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "난모세포(oocyte)"는 감수분열의 중기 II에 도달한 성숙한 난모세포를 말한다. 난모세포는 또한 생식에 관여하는 여성 배우자(gamete) 또는 생식 세포를 설명하기 위해 사용되며, 일반적으로 난자라고도 불린다. 성숙한 난자는 모계 염색체 (인간 영장류에서 23, X) 한 세트를 가지며 중기 II에서 중단된다.
"하이브리드 난모세포(hybrid oocyte)"는 제1 인간 난모세포 ("수용자"로 지칭) 유래 세포질을 가지지만 수용자 난모세포의 핵 유전 물질은 가지지 않는 제핵 난모세포를 말하며; 그것은 "공여자"로 지칭된 또 다른 인간 세포 유래 핵 유전 물질을 가진다. 일부 구체예에서, 하이브리드 난모세포는 또한 수용자 난모세포 유래가 아니라 공여자 세포(이는 핵 유전 물질과 동일한 공여자 세포이거나 다른 공여자 유래, 예를 들어, 공여자 난모세포 유래일 수 있음) 유래인 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "제핵 난모세포(enucleated oocyte)"는 핵이 제거된 인간 난모세포를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "제핵(enucleation)"은 세포의 핵 물질이 제거되고 세포질만 남는 과정을 말한다. 난자에 적용될 때, 제핵은 핵막에 의해 둘러싸여 있지 않은 모계 염색체의 제거를 말한다. 용어 “제핵 난모세포”는 핵 물질 또는 핵이 제거된 난모세포를 말한다.
본원에서 사용된 "수용자 인간 난모세포"는 그의 원래 핵이 제거된 후에 인간 핵 공여자 세포로부터 핵을 받는 인간 난모세포를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "융합"은 핵 공여자 세포와 수용자 난모세포의 지질막의 조합을 말한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 원형질막 또는 핵막일 수 있다. 융합은 핵 공여자 세포와 수용자 난모세포 간에 그들이 서로 인접하게 위치하거나 핵 공여자 세포가 수용자 난모세포의 난황주위공간에 위치할 때 전기적 자극의 적용 시에 발생할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "활성화"는 핵 이식 전, 도중 도는 후에 세포를 분열시키기 위한 자극을 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서, 그것은 핵 이식 후에 세포를 분열시키기 위한 자극을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "살아있는 자손"은 자궁 외(ex utero)에서 생존할 수 있는 동물을 의미한다. 바람직하게는, 그것은 1초, 1분, 1일, 1주일, 1개월, 6개월 또는 1년 이상 생존할 수 있는 동물이다. 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 요구하지 않을 수 있다.
용어 "태아기의(prenatal)"는 출생 전에 존재하거나 발생하는 것을 말한다. 유사하게, 용어 "생후의(postnatal)"는 출생 후에 존재하거나 발생하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 "배반포(blastocyst)"는 약 30-150개 세포의 태반 포유 동물 내 이식 전 배아 (마우스에서 수정 후 약 3일, 인간에서 수정 후 약 5일)를 말한다. 배반포 단계는 상실기를 뒤따르며, 그 독특한 형태로 구별될 수 있다. 배반포는 세포층 (영양외배엽), 체액 충진 공동 (포배강 또는 배반포 공동) 및 내부 세포 집단 (내부 세포 덩어리 또는 ICM)으로 구성된 구로 이루어진다. 미분화 세포로 이루어진 ICM은 배반포가 자궁 내에 이식되면 태아가 될 수 있는 것을 발생시킨다. 이러한 동일한 ICM 세포는, 배양물에서 성장되면, 배아 줄기 세포주를 만들 수 있다. 이식 시 마우스 배반포는 약 70개의 영양막 세포와 30개의 ICM 세포로 구성된다.
본원에서 사용된 용어 "포배(blastula)"는 포배강으로 불리는 체액 충진 공동을 둘러싸는 세포의 중공으로 이루어진 배아의 발달 초기 단계를 말한다. 용어 포배는 때로는 배반포와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "할구(blastomere)"는 이식 전 배아로부터 수득된 하나 이상의 할구 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 등)를 지칭하기 위해 전체에 걸쳐 사용된다. 용어 "둘 이상의 할구의 클러스터"는 "할구 유래 파생물"과 상호교환적으로 사용되며, 할구의 인 비트로(in vitro) 배양 동안에 생성된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 할구가 SCNT 배아로부터 수득되고 처음 배양된 후, 그것은 일반적으로 둘 이상의 할구의 클러스터(할구 유래 파생물이라고도 알려짐)를 생산하기 위해 적어도 한 번 이상 분열한다. 클러스터는 배아 세포 또는 태아 세포와 더 배양될 수 있다. 궁극적으로, 할구-유래 파생물은 계속해서 분열할 수 있다. 이러한 구조로부터, ES 세포, 전능성 줄기 (totipotent stem: TS) 세포 및 부분적으로 분화된 세포 유형들이 배양 방법의 과정에서 발달될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "핵체(karyoplast)"는 제핵에 의해 세포로부터 수득되고, 세포질 및 원형질막의 좁은 가장자리에 의해 둘러싸인 세포 핵을 말한다.
본원에서 사용된 용어 "세포 커플렛(cell couplet) "은 융합 및/또는 활성화 이전의 제핵 난모세포 및 체세포 또는 태아 핵체를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "절단 패턴(cleavage pattern) "은 매우 초기의 배아에서 세포가 분열하는 패턴을 말한다; 유기체의 각각의 종은 현미경으로 관찰할 수 있는 특징적인 절단 패턴을 나타낸다. 특징적인 패턴을 벗어난 것은 대개 배아가 비정상임을 가리키므로, 절단 패턴은 배아의 이식 전 스크리닝을 위한 기준으로 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "클론(clone)"은 DNA 분자, 세포, 조직, 기관, 또는 전체 식물 또는 동물, 또는 또 다른 유기체와 동일한 핵 게놈을 갖는 유기체의 정확한 유전 복제(replica)를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "복제된 (또는 복제) "은 또 다른 개별 단위와 동일한 유전자 세트를 갖기 위하여 새로운 개별 단위를 준비하기 위한 유전자 조작 기술을 말한다. 본 발명에서, 본원에서 사용된 용어 "복제된"은 핵 또 다른 세포, 배아 세포, 태아 세포, 분화된 세포 및/또는 동물 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 유사 또는 동일한 DNA 서열을 갖는 세포, 배아 세포, 태아 세포, 및/또는 동물 세포를 말한다. 용어 "실질적으로 유사한" 및 "동일한"은 본원에서 설명된다. 복제된 SCNT 배아는 하나의 핵 이식에서 발생할 수 있으며, 또는 대안적으로, 복제된 SCNT 배아는 하나 이상의 재-복제 단계를 포함하는 복제 과정에서 발생할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "형질전환 유기체"는 또 다른 유기체 유래 유전 물질이 실험적으로 전달되어 그 숙주가 그의 염색체 조성물에서 전달된 유전자의 유전적 특징을 획득하는 유기체를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "배아 분할(embryo splitting)"은 초기-단계 배아를 동일한 유전 구성을 갖는 둘 이상의 배아로 분리하여 본질적으로 일란성 쌍둥이 또는 그 이상의 배수 (세쌍둥이, 네쌍둥이 등)를 생성하는 것을 말한다.
본원에서 사용된 용어 "상실배(morula)"는 12-32개 세포로 구성된 고체 덩어리 (할구)일 때 수정 후 3-4일의 이식 전 배아를 말한다. 8-세포기 후에, 이식 전 배아의 세포는 서로 더 단단히 달라붙기 시작하여 "조밀하게(compacted)" 된다. 그 결과물인 배아는 오디(mulberry)와 닮아서 모룰라(morula)로 불린다 (라틴어: morus=mulberry).
용어 "배아 줄기 세포(embryonic stem cells)" (ES cells)는 세포주로 연속적으로 계대된(passaged) 배반포 또는 상실배의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 다능성 세포를 말한다. ES 세포는 난자 세포를 정자 또는 DNA와 수정, 핵 이식, 예를 들어, SCNT, 단위 생식(parthenogenesis) 등으로부터 유래될 수 있다. 용어 "인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cells)" (hES cells)는 인간 ES 세포를 말한다. 용어 "ntESC"는 SCNT 배아로부터 생산된 배반포 또는 상실배의 내부 세포 덩어리로부터 수득된 배아 줄기 세포를 말한다. "hNT-ESC"는 인간 SCNT 배아로부터 생산된 배반포 또는 상실배의 내부 세포 덩어리로부터 수득된 배아 줄기 세포를 말한다. ESC의 생성은 미국 특허 번호 제5,843,780호; 제6,200,806호에 개시되어 있고, 체세포 핵 이식으로부터 유래된 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 수득된 ESC는 미국 특허 번호 제5,945,577호; 제5,994,619호; 제6,235,970호에 설명되어 있으며, 이는 본원에 전체로서 참조로 통합된다. 배아 줄기 세포의 구별되는 특징은 배아 줄기 세포 표현형을 정의한다. 따라서, 세포가 배아 줄기 세포의 하나 이상의 독특한 특징을 보유하고 있다면 세포는 배아 줄기 세포의 표현형을 가지며, 그에 의해 세포가 다른 세포와 구별될 수 있다. 예시적인 구별되는 배아 줄기 세포 특징은, 이에 한정되지 않으나, 유전자 발현 프로파일, 증식 능력, 분화 능력, 핵형, 특정 배양 조건에의 민감성 등을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "다능성(pluripotent)"은 상이한 조건에서 하나 초과의 분화 세포 유형으로 분화할 수 있는, 바람직하게는 세 개의 모든 생식 세포 층의 특징인 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 말한다. 다능성 세포는 주로, 예를 들어 누드마우스 기형종 형성 분석법을 사용하여, 하나 초과의 세포 유형, 바람직하게는 세 가지 모든 생식세포 층으로 분화하는 능력에 의해 특징 지어진다. 그러한 세포는 hES 세포, 인간 배아-유래 세포 (hEDCs), 인간 SCNT-배아 유래 줄기 세포 및 성체-유래 줄기 세포를 포함한다. 다능성 줄기 세포는 유전적으로 변형되거나 유전적으로 변형되지 않을 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 그들의 확인에 이용할 수 있는 형광 단백질과 같은 마커를 포함할 수 있다. 다능성은 또한 배아 줄기 (ES) 세포 마커의 발현에 의해 증명되나, 다능성에 대한 바람직한 시험은 세 가지 생식세포 층의 각각의 세포로 분화하는 능력의 증명이다. 그러한 세포를 단순히 배양하는 것만으로는 그것을 다능성으로 만들 수 없다는 점이 주목되어야 한다. 재프로그래밍된 다능성 세포 (예를 들어, 본원에서 정의된 바와 같은 iPS 세포)는 또한, 일반적으로 배양물에서 오직 한정된 수의 분열 능력을 갖는 일차 세포 부모에 비해, 성장 잠재력의 손실 없이 확장된 계대(passaging)의 능력의 특징을 가진다.
SCNT 배아와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "전능성(totipotent)"은 살아있는 태어난 동물로 발달할 수 있는 SCNT 배아를 말한다.
본원에서 사용된, 용어 "iPS 세포" 및 "유도 다능성 줄기 세포"는 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 강화된 발현을 유도하는 것에 의해, 비-다능성 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터 인공적으로 유래된 (예를 들어, 유도되거나 완전한 역전(reversal)에 의함) 다능성 줄기 세포를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "재프로그래밍(reprogramming)"은 체세포의 분화 상태를 변화 또는 역전시켜 핵의 발달 시계가 리셋되는 과정을 말한다; 예를 들어, 성체 분화 세포 핵의 발달 상태를 초기 배아 세포 핵의 유전 프로그램을 수행할 수 있도록 재설정하여, 배아 발달에 필요한 모든 단백질을 만든다. 일부 구체예에서, 공여자 인간 세포는 SCNT에 의한 재프로그래밍 이전에 최종적으로 분화된다. 본원에 개시된 재프로그래밍은 체세포의 분화 상태의 다능성 또는 전능성 세포로의 완전한 역전을 포함한다. 재프로그래밍은 일반적으로 접합체(zygote)가 성체로 발달함에 따라 세포 분화 동안 발생하는 핵산 변형 (예를 들어, 메틸레이션), 염색질 응축, 후성적 변화, 유전체 각인(genomic imprinting) 등의 적어도 일부의 유전적 패턴의 변화, 예를 들어, 역전을 수반한다. 체세포 핵 이식 (SCNT)에서, 수용자 난모세포 세포질의 구성성분은 배아 핵의 기능을 수행하기 위하여 체세포 핵을 재프로그래밍하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
SCNT 배아와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "배양"은 배양 배지에 배아를 위치시키는 것을 수반하는 실험실 절차를 말한다. SCNT 배아는 SCNT 배아를 정지되어도 배지에서 기능을 유지하게 하거나 SCNT 배아가 배지에서 성장할 수 있도록 배양 배지 내에 적절한 양의 시간 동안 위치시킬 수 있다. 배아를 배양하는 데 적절한 배양 배지는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 모든 도면, 표 및 그림을 포함하는 전체가 참조에 의해 본원에 통합된 미국 특허 번호 제5,213,979호, "In vitro Culture of Bovine Embryos", First et al., 1993년 5월 25일 발행, 및 미국 특허 번호 제5,096,822호, "Bovine Embryo Medium", Rosenkrans, Jr. et al., 1992년 3월 17일 발행을 참조하라.
용어 "배양 배지"는 "적절한 배지"와 상효교환적으로 사용되며, 세포 증식을 가능하게 하는 임의의 배지를 말한다. 적절한 배지는 최대 증식을 촉진할 필요는 없고, 단지 측정 가능한 세포 증식만을 촉진시킬 필요가 있다. 일부 구체예에서, 배양 배지는 다능성 또는 전능성 상태로 세포를 유지시킨다.
본원에 개시된 SCNT 배아와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "이식하는(implanting)"은 본원에서 설명된 SCNT 배아를 대리 여성 동물에 주입하는 것을 말한다. 이 기술은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Seidel and Elsden, 1997, Embryo Transfer in Dairy Cattle, W. D. Hoard & Sons, Co., Hoards Dairyman를 참조하라. 배아는 자궁 내에서 발달되도록 할 수 있고, 또는 대안적으로, 분만 전에 태아가 자궁 환경에서 제거될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "제제(agent)"는 임의의 화합물 또는 물질(substance)을 의미하며, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나, 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 펩티드, 약물, 이온 등이다. "제제"는 임의의 화학물질, 엔티티(entity) 또는 모이어티일 수 있으며, 이에 한정되지 않으나 합성 및 자연 발생 단백질성 및 비-단백질성 엔티티를 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 핵산, 핵산 유사체(analogues), 단백질, 항체, 펩티드, 압타머, 핵산의 올리고머, 아미노산, 또는 탄수화물이고, 이에 한정되지 않으나 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNAzymes, 당단백질, siRNAs, 리포단백질, 압타머, 및 이의 변형 및 조합 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 제제는 화학적 모이어티를 가지는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 마크로리드(macrolides), 렙토마이신(leptomycins) 및 관련된 천연 산물 또는 이의 유사체(analogues)를 포함하는 비치환된 또는 치환된 알킬, 방향족, 또는 헤테로시클릴 모이어티를 포함한다. 화합물은 원하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 알려져 있거나, 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "접촉시키는(contacting)" (즉, 인간 공여자 세포, 인간 수용자 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 인간 SCNT 배아를 제제와 접촉시키는 단계)은 제제 및 인간 세포, 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNT-배아를 인 비트로(in vitro)에서 함께 배양하는 단계 (예를 들어, 제제를 배양물 내 또는 용기 내 공여자 인간 세포, 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNT-배아에 첨가하는 단계)를 포함하는 것으로 의도되었다. 일부 구체예에서, 용어 "접촉시키는"은 개체에서 자연적으로 발생할 수 있는 세포의 본원에 개시된 제제에 대한 인 비보(in vivo) 노출 (즉, 자연 생리학적 과정의 결과로 발생할 수 있는 노출)을 포함하는 것으로 의도되지 않았다. 인간 체세포, 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNT-배아를 본원에 개시된 제제와 접촉시키는 단계는 임의의 적절한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 인간 체세포, 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNT-배아는 접착성 배양물 내 또는 현탁 배양물 내에서 처리될 수 있다. 인간 체세포, 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNt-배아가 본원에 개시된 제제와 접촉될 수 있고, 또한 동시에 또는 이후에 성장 인자 또는 다른 분화 제제와 같은 또 다른 제제, 또는 세포를 안정화시키거나 세포를 더 분화시키는 환경과 접촉될 수 있다고 생각되고 있다. 유사하게, 인간 체세포, 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNt-배아는 본원에 개시된 제제 (예를 들어, KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제 또는 mRNA)와 접촉되고 나서 본원에 개시된 제2 제제 (예를 들어, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제)와 접촉되거나, 또는 그 반대로도 접촉될 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 체세포, 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNt-배아는 본원에 개시된 제제 및 본원에 개시된 제2 제제와 접촉되며, 접촉은 일시적으로 분리된다. 일부 구체예에서, 인간 체세포, 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNt-배아는 본원에 개시된 하나 이상의 제제와 실질적으로 동시에 접촉된다 (예를 들어, KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제 (예를 들어, KDM4D mRNA) 및 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제와 실질적으로 동시에 접촉됨).
용어 "외인성(exogenous)"은 그의 타고난 근원 또는 수준과 다르게 세포 또는 유기체 내에 존재하는 물질을 말한다. 예를 들어, 용어 "외인성 핵산" 또는 "외인성 단백질"은 인간의 손을 수반하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템으로 도입된 핵산 또는 단백질을 말하며, 상기 세포 또는 유기체에서 그것은 보통 때는 발견되지 않거나 도입된 핵산 또는 단백질이 보통 때는 더 적은 양으로 발견된다. 물질이 세포 또는 그 물질을 물려받는 세포의 조상으로 도입된다면, 물질은 외인성으로 간주될 것이다. 대조적으로, 용어 "내인성(endogenous)"은 그 당시에 생물학적 시스템 또는 세포에 타고난 물질을 말한다. 예를 들어, "외인성 KDM4A"는 그 당시에 세포 또는 유기체 내로 도입되는 곳에서 보통 때는 그 수준으로 발견 또는 발현되지 않는 KDM4A mRNA 또는 cDNA의 도입을 말한다.
용어 "발현"은 전사, 번역, 접힘, 변형 및 가공과 같이 적용 가능한 RNA 및 단백질의 생산과 관련된 세포 과정을 말한다. "발현 산물"은 유전자로부터 전사된 RNA 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득한 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "미토콘드리아 DNA"는 "mtDNA"와 상호교환적으로 사용되며 (모든 다른 염색체가 위치하는) 핵 내보다는 세포의 세포질 내에 위치하는 구조인 미토콘드리아의 DNA를 말한다. 생체 내에서, 모든 mtDNA는 어머니로부터 유전된다. 각 미토콘드리아에는 2 내지 10개 복제본(copy)의 mtDNA 게놈이 있다. mtDNA는 이중-가닥의 원형 분자이다. 그것은 핵 내 염색체에 비해 매우 작으며 미토콘드리아 호흡-연쇄 복합체 내의 오직 한정된 수의 유전자, 예를 들어 많은 서브유닛을 코딩하는 유전자 및 일부 리보솜 RNAs 및 전달 RNAs에 대한 유전자를 포함한다. 세포는 지속적인 세포질적 복제에 기반한 미토콘드리아에서 유래된 mtDNA를 포함하는데, 방추(spindle) 전달의 경우 수용자 세포질에 기반을 둔다.
용어 "미토콘드리아 질병"은 미토콘드리아의 기능에 영향을 미치거나 및/또는 미토콘드리아 DNA에 기인한 질병 및 장애를 말한다. mtDNA는 오로지 모계로만 유전된다. 일반적으로 이러한 질병들은 산화적 인산화의 장애에 기인한다. 미토콘드리아 질병은 종종 미토콘드리아 유전자 내 병원성 돌연변이에 의해 유발된다. 돌연변이는 보통 이형적(heteroplasmic)이므로 정상과 돌연변이 DNA의 혼합이 있고, 그것의 수준은 조직간에 다를 수 있다. 그러나, 일부 돌연변이는 동형적(homoplasmic)이므로, 그들은 mtDNA에 100%로 존재한다. 자손에서 점 돌연변이의 이형성(heteroplasmy) 백분율은 어머니에서 돌연변이 백분율과 관련이 있다. 난모세포 발달 동안 발생하는 유전적 병목현상이 있다.
"유전적으로 변형된" 또는 "조작된" 세포는 인간의 손을 수반하는 과정에 의해 외인성 핵산이 도입된 세포 (또는 핵산의 적어도 일부를 물려받은 그러한 세포의 후손)를 말한다. 핵산은 예를 들어 세포에 대해 외인성인 서열을 함유할 수 있고, 그것은 천연 서열 (즉, 세포 내에서 자연적으로 발견되는 서열)이나 자연적으로 발생하지 않는 배열 (예를 들어, 다른 유전자 유래 프로모터와 연결된 코딩 영역), 또는 천연 서열의 변형된 버전 등을 함유할 수 있다. 핵을 세포로 전달하는 과정은 임의의 적절한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적절한 기술은 인산 칼슘 또는 지질-매개 형질감염, 전기천공법, 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 구체예에서 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부는 세포의 게놈에 통합된다. 핵산은 그 후에 게놈으로부터 제거되거나 삭제될 수 있는데, 그러한 제거 또는 삭제가 비변형된 것 외에는 동등한 세포에 비해 세포에서 검출가능한 변형을 초래할 수 있다.
용어 "동일성"은 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 서열이 동일한 정도를 말한다. 평가의 창에 대한, 예를 들어 관심 서열의 길이에 대한 관심 서열과 제2 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열을 정렬시키고, 동일성을 최대화하기 위해 갭의 도입을 허용하는 동일한 잔기의 반대편인 평가의 창 내 잔기 (뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 결정하고, 창 내에 있는 관심 서열 또는 제2 서열 (둘 중 큰 것)의 잔기의 총 수로 나누고, 그리고 100을 곱하는 것에 의해 계산할 수 있다. 특정한 퍼센트 동일성을 달성하기 위해 필요한 동일한 잔기의 수를 계산할 때, 분수는 가장 가까운 정수로 반올림된다. 퍼센트 동일성은 이 기술 분야에 알려진 다양한 컴퓨터 프로그램의 사용으로 계산할 수 있다. 예를 들어, BLAST2, BLASTN, BLASTP, Gapped BLAST 등과 같은 컴퓨터 프로그램은 정렬을 생성하고 관심 서열 간의 퍼센트 동일성을 제공한다. Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993에서와 같이 변형된 Karlin 및 Altschul (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:22264-2268, 1990)의 알고리즘은 Altschul et al. (Altschul, et al, J. Mol. Biol. 215 :403-410, 1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, Altschul et al. (Altschul, et al. Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402, 1997)에서 설명된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 매개 변수가 사용될 수 있다. PAM250 또는 BLOSUM62 매트릭스가 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information: NCBI)를 통해 공중이 이용가능하다. 이러한 프로그램에 대한 URL주소 www.ncbi.nlm.nih.gov를 가지는 웹 사이트를 참조하라. 특정 구체예에서, 퍼센트 동일성은 NCBI에 의해 제공된 매개 변수와 함께 BLAST2를 사용하여 계산된다. 일부 구체예에서, 핵산 또는 아미노산 서열은 그 핵산 또는 아미노산 서열과 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 서열 상동성을 가진다.
본원에서 사용된 용어 "분리된" 또는 "부분적으로 정제된"은, 핵산 또는 폴리펩티드의 경우에, 그 천연 자원에서 발견되는 핵산 또는 폴리펩티드와 함께 존재하거나 및/또는 세포에 의해 발현되거나 분비 폴리펩티드의 경우 분비될 때 핵산 또는 폴리펩티드와 함께 존재할 수 있는 하나 이상의 다른 성분 (예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)으로부터 분리된 핵산 또는 폴리펩티드를 말한다. 화학적으로 합성된 핵산 또는 폴리펩티드 또는 인 비트로(in vitro) 전사/번역을 사용하여 합성된 핵산 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것으로 간주된다. "분리된 세포"는 원래 발견된 유기체로부터 제거된 세포 또는 그러한 세포의 후손이다. 선택적으로 세포는 인 비트로(in vitro)에서, 예를 들어, 다른 세포의 존재 하에 배양되었다. 선택적으로 세포는 나중에 제2 유기체로 도입되거나 또는 그것이 분리된 유기체 (또는 그것이 유래한 세포)로 재도입된다.
본원에서 사용된 세포의 분리된 집단에 관한 용어 "분리된 집단"은 세포의 혼합되거나 이종의 집단으로부터 제거되고 분리된 세포의 집단을 말한다. 일부 구체예에서, 분리된 집단은 세포가 분리되거나 농축된 이종 집단과 비교하여 세포의 실질적으로 순수한 집단이다.
특정 세포 집단에 관한 용어 "실질적으로 순수한"은 전체 세포 집단을 구성하는 세포에 관하여 약 75% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상 순수한 세포의 집단을 말한다. 재구성하면, 최종 내배엽 세포의 집단에 관한 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "본질적으로 정제된"은 본원에서 상기 용어에 의해 정의된 바와 같은 불확정(indefinite) 내배엽 세포 또는 그의 자손이 아닌 세포의 약 20% 이하, 보다 바람직하게는 약 15%, 10%, 8%, 7% 이하, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 1% 미만을 함유하는 세포의 집단을 말한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 불확정 내배엽 세포의 집단을 확장시키는 방법을 포함하며, 여기에서 불확정 내배엽 세포의 확장된 집단은 불확정 내배엽 세포의 실질적으로 순수한 집단이다. 유사하게, SCNT-유도된 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포의 "실질적으로 순수한" 또는 "본질적으로 정제된" 집단에 관하여, 본원에서 상기 용어에 의해 정의된 바와 같은 줄기 세포 또는 그의 자손이 아닌 세포의 약 20% 이하, 보다 바람직하게는 약 15%, 10%, 8%, 7% 이하, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 1% 미만을 함유하는 세포의 집단을 말한다.
용어 "풍부(enriching)" 또는 "풍부한(enriched)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 한 가지 유형의 세포의 수율 (분율)이 출발 배양 또는 제조에서 그 유형의 세포의 분율 보다 10% 이상 증가된 것을 의미한다.
용어 "재생(renewal)" 또는 "자기 재생(self-renewal)" 또는 "증식(proliferation)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 장기간 및/또는 수 개월 내지 수 년에 걸쳐 동일한 비-전문화된 세포 유형으로 분열하는 것에 의해 줄기 세포가 스스로 재개하는 능력을 지칭하는 데 사용된다. 일부 예에서, 증식은 단일 세포의 두 개의 동일한 딸 세포로의 반복 분열에 의한 세포의 확장을 말한다.
본원에서 사용된 용어 "계통(lineages)"은 세포를 공통의 조상을 갖는 세포 또는 공통의 발생운명을 갖는 세포를 설명한다. 내배엽 기원 또는 "내배엽 계통"인 세포의 맥락에서 이는 세포가 내배엽 세포에서 유래되고 내배엽 계통 제한 경로, 예를 들어 차례로 간 세포, 흉선, 췌장, 폐 및 장으로 분화할 수 있는 최종 내배엽 세포가 생기게 하는 하나 이상의 발달 계통 경로를 따라 분화할 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용된, 용어 "이종(xenogeneic)"은 상이한 종으로부터 유래된 세포를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "마커"는 세포의 특징 및/또는 표현형을 설명하기 위해 사용된다. 마커는 관심있는 특징을 포함하는 세포의 선택에 사용될 수 있다. 마커는 구체적 세포에 따라 다를 것이다. 마커는 특정 세포 유형의 세포의 형태학적, 기능적 또는 생화학적 (효소적) 특징인지 또는 세포 유형에 의해 표시되는 분자인지의 특징이다. 바람직하게는, 그러한 마커는 단백질이고, 보다 바람직하게는, 이 기술분야에 사용 가능한 항체 또는 다른 결합 분자에 대한 에피토프를 보유한다. 그러나, 마커는 세포에서 발견된 임의의 분자로 구성될 수 있고, 이에 한정되지 않으나, 단백질(펩티드 및 폴리펩티드), 지질, 다당류, 핵산 및 스테로이드를 포함한다. 형태학적 특징 또는 형질의 예는, 이에 한정되지 않으나, 모양, 크기 및 핵 대 세포질 비율을 포함한다. 기능적 특징 또는 형질의 예는, 이에 한정되지 않으나, 특정 기질에 부착하는 능력, 특정 염료를 포함하거나 배제하는 능력, 특정 조건 하에 이동하는 능력, 및 특정 계통을 따라 분화하는 능력을 포함한다. 마커는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 사용 가능한 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 마커는 또한 형태학적 특징이 없거나 단백질, 지질 등이 없을 수 있다. 마커는 폴리펩티드의 존재 및 부재의 독특한 특징 및 다른 형태학적 특징의 패널의 조합이 될 수 있다.
용어 "조절하다(modulate)"는 이 기술분야에서 그의 용도와 일관하여 사용되는데, 즉, 관심 있는 방법, 경로 또는 현상에서 질적 또는 양적 변화, 변경 또는 변형을 유발하거나 가능하게 하는 것을 의미한다. 제한 없이, 그러한 변화는 방법, 경로 또는 현상의 상이한 성분 또는 가지의 상대적 강도 또는 활성의 증가, 감소 또는 변화일 수 있다. "조절제(modulator)"는 관심 있는 방법, 경로 또는 현상에서 질적 또는 양적 변화, 변경 또는 변형을 유발하거나 가능하게 하는 제제이다.
용어 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 이중-가닥 RNA (dsRNA)가 dsRNA의 가닥에 상보성을 갖는 상응하는 mRNA의 서열-특이적 분해 또는 번역 저해를 유발하는 현상을 말하는 것으로 이 기술분야의 의미와 일관되게 본원에서 사용된다. dsRNA 및 mRNA의 가닥 간의 상보성은 100%일 필요는 없지만 유전자 발현의 억제 ("침묵(silencing)" 또는 "넉다운(knockdown) "이라고도 함)를 매개하는데 충분할 필요만 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 상보성의 정도는 가닥이 (i) RNA 유도 침묵 복합체 (RNA-induced silencing complex: RISC)에서 mRNA의 절단을 안내하거나; 또는 (ii) mRNA의 번역 저해를 유발할 수 있다. 특정 구체예에서 RNA의 이중-가닥 부분은 길이가 약 30개 뉴클레오티드 미만, 예를 들어, 길이가 17개에서 29개 사이인 뉴클레오티드이다. 포유류 세포에서, RNAi는 적절한 이중-가닥 핵산을 세포 내로 도입하거나 핵산을 세포에서 발현시킴으로써 세포 내에서 dsRNA를 수득할 수 있도록 가공하여 달성할 수 있다. RNAi를 매개할 수 있는 핵산은 본원에서 "RNAi 제제"로 지칭한다. RNAi를 매개할 수 있는 예시적인 핵산은 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA: shRNA), 짧은 간섭 RNA (short interfering RNA: siRNA) 및 마이크로RNA 전구체이다. 이러한 용어는 잘 알려져 있고 본원에서 이 기술분야에서의 의미와 일관된다. siRNA는 전형적으로 서로 혼성화되어 이중 복합체를 형성하는 두 개의 분리된 핵산 가닥을 포함한다. 이들은, 예를 들어, 표준 핵산 합성 기술을 사용하여 인 비트로(in vitro)에서 합성될 수 있다. 이들은 다양한 변형된 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있고, 화학적으로 또는 생물학적으로 변형된 염기, 변형된 백본 등을 포함할 수 있다. RNAi에 유용한 것으로 이 기술분야에서 인식된 임의의 변형이 사용될 수 있다. 일부 변형은 증가된 안정성, 세포 흡수, 효능 등을 초래한다. 특정 구체예에서, siRNA는 길이가 약 19개 뉴클레오티드인 이중복합체 및 길이가 1-5개 뉴클레오티드인 하나 또는 두 개의 3' 오버행을 포함하고, 이것은 데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. shRNA는 주로 비-자기 상보성 영역에 의해 분리된 두 개의 상보적인 부분을 함유하는 단일 핵산 가닥을 포함한다. 상보성 부분은 혼성화하여 이중복합체 구조를 형성하고 비-자기 상보성 영역은 이중복합체의 하나의 가닥의 3' 말단과 다른 가닥의 5' 말단을 연결하는 루프를 형성한다. shRNA는 세포 내 가공을 겪어 siRNA를 생성한다.
용어 "선택 가능한 마커"는 발현될 때 세포에 선택 가능한 표현형, 예를 들어 세포독성 또는 세포정지 제제에 저항성 (예를 들어, 항생제 저항성), 영양적 자가영양성 또는 단백질을 발현하는 세포를 그렇지 않은 세포와 구별하기 위한 기초로 사용될 수 있는 특정 단백질의 발현을 부여하는 유전자, RNA 또는 단백질을 말한다. 형광 또는 발광 단백질 또는 유색, 형광 또는 발광 물질을 생성하기 위한 기질에 작용하는 효소와 같이 발현이 쉽게 검출될 수 있는 단백질 ("검출 가능한 마커")은 선택 가능한 마커의 서브세트를 구성한다. 다능성 세포에서 선택적으로 또는 배타적으로 정상적으로 발현된 유전자 본래의 발현 조절 요소에 연결된 선택 가능한 마커의 존재는 다능성 상태로 재프로그래밍된 체세포를 확인하고 선택하는 것을 가능하게 한다. 다양한 선택 가능한 마커 유전자, 예를 들어 네오마이신 저항성 유전자 (neo), 푸로마이신 저항성 유전자 (puro), 구아닌 포스포리보실 트랜스페라제 (guanine phosphoribosyl transferase: gpt), 디히드로폴레이트 리덕타제 (dihydrofolate reductase: DHFR), 아데노신 데아미나제 (adenosine deaminase: ada), 푸로마이신-N-아세틸트랜스페라제 (puromycin-N-acetyltransferase: PAC), 하이그로마이신 저항성 유전자 (hygromycin resistance gene: hyg), 다약물 내성 유전자 (multidrug resistance gene: mdr), 티미딘 키나제 (thymidine kinase: TK), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라제 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase : HPRT), 및 hisD 유전자가 사용될 수 있다. 검출 가능한 마커는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP) 블루, 사파이어, 옐로우, 레드, 오렌지 및 청록색 형광 단백질 및 이들의 임의의 변이체를 포함한다. 루시페라제 (예를 들어, 파이어플라이(firefly) 또는 레닐라(Renilla) 루시페라제)와 같은 발광 단백질도 사용된다. 이 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본원에서 사용된 용어 "선택 가능한 마커"는 유전자 또는 유전자의 발현 산물, 예를 들어, 암호화된 단백질을 지칭할 수 있다.
용어 "소분자"는 다중 탄소-탄소 결합 및 1500 달톤 미만의 분자량을 가지는 유기 화합물을 말한다. 전형적으로 그러한 화합물은 하나 이상의 단백질과 구조적 상호작용, 예를 들어, 수소 결합을 매개하는 작용기를 포함하고, 전형적으로 적어도 아민기, 카보닐기, 하이드록실기 또는 카르복실기를 포함하고, 일부 구체예에서 적어도 두 개의 기능적 화학 그룹을 포함한다. 소분자 제제는 하나 이상의 화학 작용기 및/또는 헤테로 원자로 치환된 시클릭 카본 또는 헤테로시클릭 구조 및/또는 방향족 또는 다중방향족 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 말한다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 펩티드는 상대적으로 짧은 폴리펩티드이고, 전형적으로 길이가 약 2 내지 60개 아미노산이다. 본원에서 사용된 폴리펩티드는 전형적으로 단백질에서 가장 흔하게 발견되는 20 L-아미노산과 같은 아미노산을 함유한다. 그러나, 이 기술분야에 알려진 다른 아미노산 및/또는 아미노산 유사체가 사용될 수 있다. 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산은, 예를 들어, 탄수화물기, 인산기, 지방산기, 접합, 기능화 등을 위한 링커와 같은 화학적 엔티티(entity)의 첨가에 의해, 변형될 수 있다. 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 비-폴리펩티드 모이어티를 가지는 폴리펩티드는 여전히 "폴리펩티드"로 간주된다. 예시적인 변형은 글리코실레이션 및 팔미토일레이션을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 자원으로부터 정제되고, 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조되고, 통상적인 고상 펩티드 합성 등과 같은 화학적 수단을 통해 합성될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드 서열" 또는 "아미노산 서열"은 폴리펩티드 물질 그 자체 및/또는 폴리펩티드를 생화학적으로 특징화하는 서열 정보 (즉, 아미노산 명칭에 대해 약어로 사용되는 문자 또는 3문자코드의 연속)를 지칭할 수 있다. 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열은 다르게 지시되지 않는다면 N-말단에서 C-말단 방향으로 나타낸다.
폴리펩티드 또는 핵산 서열을 언급할 때 용어 "변이체"는, 예를 들어, 전장 폴리펩티드 또는 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 핵산 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체는 전장 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체는 자연적으로 발생하는 스플라이스(splice) 변이체일 수 있다. 예를 들어, Suv39h1(Gene ID: 6839)은 두 개의 대안적인 스플라이스 변이체를 가지며, 변이체 1은 Suv39h1 아이소폼 1 단백질 (긴 전사물 및 보다 긴 아이소폼을 암호화 함)을 생성하고, mRNA NM_001282166.1와 단백질 NP_001269095.1에 상응하는 반면, 변이체 2는 Suv39h1 아이소폼 2를 생성하며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' UTR에 차이가 있고, 5' 코딩 영역의 일부가 결여되고, 다른 시작 코돈에서 번역이 개시된다. 암호화된 Suv39h1 아이소폼 (2) 단백질은 아이소폼 1과 비교하여 더 짧고, 구별되는 N-말단을 가진다. Suv39h1 아이소폼 2에 대한 mRNA는 NM_003173.3이고, 이는 NP_003164.1에 상응하는 아이소폼 2 단백질을 암호화한다. 변이체는 전장 폴리펩티드 또는 전장 핵산 서열의 50% 이상의 길이의 단편에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 또는 핵산 서열일 수 있고, 여기에서 단편은 관심 있는 활성을 가지는 전장 야생형 폴리펩티드 또는 핵산 서열 길이의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 예를 들어, KDM4d 폴리펩티드 또는 KDM4d 핵산 서열과 비교하여 동등 또는 유사한 정도까지 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 갖는 KDM4d의 변이체.
용어 "기능성 단편" 또는 "생물학적 활성 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 그 단편인 폴리펩티드 보다 크기가 작은 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 말하며, 여기에서 기능성 단편 폴리펩티드는 그 단편인 폴리펩티드와 약 50% 이상, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 동일한 생물학적 작용을 가진다. 기능성 단편 폴리펩티드는 감소된 항원성, 증가된 DNA 결합 (전사 인자에서와 같이), 또는 변경된 RNA 결합 (RNA 안정성 또는 분해 조절에서와 같이)을 포함할 수 있는 추가적인 기능을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 활성 단편은 그 단편인 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이다. 이론에 국한되지 않고, KDM4A의 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제의 기능성 단편의 예시적인 예는 동일한 방법을 사용하고 동일한 조건 하에 있는 서열번호 9의 아미노산을 포함하는 KDM4A 폴리펩티드와 비교하여 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 약 50% 이상, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과로 가지는 서열번호 9의 단편 (예를 들어, 여기에서 단편은 서열번호 9의 길이와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다)을 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 9의 생물학적 활성 단편은 서열번호 9의 C-말단 또는 N-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상 아미노산이 결핍된다. 일부 구체예에서, 서열번호 9의 생물학적 활성 단편은 서열번호 9의 C-말단 및 N-말단 모두에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상 아미노산이 결핍된다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 KDM4D의 생물학적 활성 단편, 예를 들어, Antony et al., Nature, 2013에 개시된 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함하는 서열번호 12의 생물학적 단편이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다 (예를 들어, 서열번호 13에 상응하는 단편). 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 12의 아미노산 1-424의 C-말단 또는 N-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상 아미노산이 결핍된다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 12의 아미노산 1-424의 C-말단 및 N-말단 모두에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상 아미노산이 결핍된 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다.
핵산 서열에 관하여 본원에서 사용된 용어 "기능성 단편" 또는 "생물학적 활성 단편"은 그 단편인 핵산 서열 보다 크기가 작은 핵산 서열을 말하며, 여기에서 핵산 서열은 그 단편인 생물학적 활성 단편과 동일한 생물학적 작용을 약 50% 이상, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과로 가진다. 이론에 국한되지 않고, KDM4A의 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제의 핵산 서열의 기능성 단편의 예시적인 예는 동일한 방법을 사용하고 동일한 조건 하에 있는 서열번호 1의 KDM4A 핵산 서열과 비교하여 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 약 50% 이상, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과로 가지는 서열번호 1의 단편 (예를 들어, 여기에서 단편은 서열번호 1의 길이의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다)을 포함한다.
분리된 세포에 적용된 용어 "처리하다, 치료하다(treat)", "처리하는, 치료하는(treating)", "처리, 치료(treatment)" 등은 세포에 임의의 종류의 방법 또는 조건을 적용하는 것, 또는 세포에 임의의 종류의 조작 또는 절차를 수행하는 것을 포함한다. 개체에 적용될 때, 상기 용어는 개인에게 의학적 또는 수술적 주의, 케어 또는 관리를 제공하는 것을 말한다. 개인은 일반적으로 병에 걸리거나 (질병 또는 의학적/수술적 주의를 요구하는 다른 질환으로 고통받음) 또는 부상을 입거나, 또는 집단의 평균 구성원에 비해 병에 걸릴 위험이 증가되어 있고, 그러한 주의, 케어 또는 관리가 필요하다. "개인"은 본원에서 "개체"와 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 임의의 구체예에서, "개인"은 인간, 예를 들어, 세포 요법이 사용되는 질환을 앓고 있거나 그 위험이 있는 인간 ("지시된(indicated) ")일 수 있다.
발정 주기와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "동기화된(synchronized) " 또는 "동기(synchronous) "는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 보조 생식 기술을 말한다. 이러한 기술은 이전 단락에 인용된 참조문헌에 충분히 설명된다. 전형적으로, 에스트로겐 및 프로게스테론 호르몬은 여성 동물의 발정 주기를 배아의 발달 주기와 동기화하는 데 이용된다. 본원에서 사용된 용어 "발달 주기"는 본 발명의 배아 및 배아 내의 각 세포 분열 사이에 존재하는 기간을 말한다. 이 기간은 배아에서 예측 가능하고, 수용자 동물의 발정 주기와 동기화될 수 있다.
핵 DNA 서열과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 유사한"은 거의 동일한 두 개의 핵 DNA 서열을 말한다. 두 개의 서열은 핵 DNA의 복제 동안 일반적으로 발생하는 복제 오류 차이에 따라 다를 수 있다. 실질적으로 유사한 DNA 서열은 바람직하게는 97% 이상 동일, 보다 바람직하게는 98% 이상 동일, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일하다. 동일성은 두 서열에서 동일한 잔기의 수를 총 잔기의 수로 나눈 값에 100을 곱하여 측정된다. 따라서, 정확히 동일한 서열의 2개의 복제본은 100% 동일성을 갖는 반면, 덜 고도로 보존되고 결실, 첨가 또는 치환을 갖는 서열은 보다 낮은 정도의 동일성을 갖는다. 이 기술분야의 통상의 기술자는 몇몇 컴퓨터 프로그램이 서열 비교를 수행하고 서열 동일성을 결정하기 위해 이용 가능하다는 것을 인식할 것이다.
용어 "보다 낮은", "감소된", "감소" 또는 "감소시키다" 또는 "억제하다"는 모두 본원에서 통계적으로 유의한 양의 감소를 의미하는 것으로 일반적으로 사용되었다. 그러나, 의심의 여지를 피하기 위해, "보다 낮은", "감소된", "감소" 또는 "감소시키다" 또는 "억제시키다"는 기준 수준과 비교하여 적어도 10% 감소, 예를 들어 기준 수준과 비교하여 적어도 약 20% 감소, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 100% 감소를 포함하고 (즉, 기준 시료와 비교하여 부재 수준) 또는 10-100% 사이의 임의의 감소를 의미한다.
용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "강화시키다" 또는 "활성화시키다"는 모두 본원에서 통계적으로 유의한 양의 증가를 일반적으로 의미하는 것으로 사용되며, 의심의 여지를 피하기 위해, 용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "강화시키다" 또는 "활성화시키다"는 기준 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 기준 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 100% 증가를 포함하고, 또는 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 기준 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배에서 10배 이상 사이의 임의의 증가를 의미한다.
용어 "통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"는 통계적 유의성을 말하며, 마커의 농도가 정상 아래 또는 보다 낮은 두 표준편차 (2SD)를 일반적으로 의미한다. 상기 용어는 차이가 있다는 통계적 증거를 말한다. 그것은 귀무가설이 실제로 사실일 때 귀무가설을 기각하기로 결정할 확률로 정의된다. 그 결정은 주로 p-값을 사용하여 이루어진다.
본원에서 사용된 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 본 발명에 필수적인 조성물, 방법 및 그의 각각의 구성요소(들)와 관련하여 사용되나, 필수적이든 아니든 불특정 요소의 포함에 개방되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "본질적으로 이루어지는"은 주어진 구체예에 요구되는 요소를 말한다. 상기 용어는 본 발명의 구체예의 기본적이고 신규한 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가적인 요소의 존재를 허용한다.
용어 "이루어지는"은 본원에서 설명된 조성물, 방법 및 그의 각각의 구성요소를 말하며, 이는 구체예의 설명에 열거되지 않은 임의의 요소를 배제한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법(the method)"에 대한 언급은 하나 이상의 방법, 및/또는 본원에서 설명된 유형의 단계 및/또는 이 개시를 읽을 때 이 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 것 등을 포함한다.
전술한 상세한 설명 및 하기의 실시예는 단지 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아닌 것으로 이해된다. 이 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것인 개시된 구체예에 대한 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 또한, 확인된 모든 특허, 특허출원 및 간행물은, 예를 들어, 본 발명과 관련되어 사용될 수 있는 그러한 간행물에 설명된 방법론을 설명하고 개시할 목적으로 본원에 참조로 명확히 통합된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 공개를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여 발명자가 선행 발명이나 임의의 다른 이유로 그러한 개시에 앞서 있을 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 관한 모든 진술은 출원인이 사용할 수 있는 정보에 기초한 것이며 이 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.
KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제
일 양상에서, 본 발명은 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 융합 또는 활성화 이전에 공여자 유전 물질을 포함하는 인간 제핵 난모세포) 또는 인간 SCNT 배아 (즉, 공여자 핵의 제핵 난모세포와의 융합 후)의 핵 또는 세포질을 히스톤 메틸레이션을 억제하는, 특히, H3K9 메틸레이션을 억제하는, 특히, H3H9me3 트리메틸레이션을 억제하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제이다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 유용한 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 패밀리, 예를 들어, 인간 KDM4A, 인간 KDM4B, 인간 KDM4C 또는 인간 KDM4D의 활성을 증가시키는 제제이다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 KDM4D (JMJD2D) 또는 KDM4A (JMJD2A)의 발현 또는 활성을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 유용한 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 KDM4A 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 제제, 또는 KDM4A 폴리펩티드, 또는 그의 변이체 또는 생물학적 활성 단편이다. 본원에서 사용된, 인간 KDM4A 뉴클레오티드 서열은 Genbank Accession No. NM_014663.2에 상응하며, 서열번호 1로 지칭한다. KDM4A는 리신(K)-특이적 데메틸라제 4A, JMJD2, JMJD2A, "jumonji domain containing 2", 또는 "jumonji domain containing 2A"로도 알려져 있다. 인간 KDM4A 단백질은 Genebank Accession no. NP_055478.2 (서열번호 9)에 상응한다. 따라서, KDM4A의 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00002
일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 KDM4A의 핵산 서열 (서열번호 1을 포함하거나, 또는 서열번호 1에 상응하는 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 그에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)의 그의 생물학적 활성 단편 또는 동족체 또는 변이체이다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열번호 1에 상응하는 인간 KDM4A 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 핵산 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 임의의 인간 KDM4A 폴리펩티드를 코딩하거나 인간 KDM4A 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편을 코딩하는 핵산 제제로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 인간 KDM4A 폴리펩티드, 또는 그러한 인간 KDM4A 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편으로부터 선택된다. 이 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 인간 KDM4A 폴리펩티드의 적절한 인간 동족체 및 그러한 인간 동족체를 코딩하는 핵산을 확인할 수 있다는 점이 본 발명에 내포되어 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 유용한 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 KDM4B 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 제제, 또는 KDM4B 폴리펩티드, 또는 그의 변이체 또는 생물학적 활성 단편이다. 본원에서 사용된, 인간 KDM4B 핵산은 Genbank Accession No. NM_015015.2에 상응하고, 본원에 개시된 서열번호 2로 지칭된다. KDM4B는 리신 (K)-특이적 데메틸라제 4B, JMJD2B 또는 "jumonji domain containing 2B", KIAA0876, TDRD 14B, 또는 "tudor domain containing 14B로도 알려져 있다. 인간 KDM4B 단백질은 Genebank Accession no. NP 055830.1 (서열번호 10)에 상응한다. 따라서, KDM4B의 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00003
일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 KDM4B의 핵산 서열 (서열번호 2을 포함하거나, 또는 서열번호 2에 상응하는 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 그에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)의 그의 생물학적 활성 단편 또는 동족체 또는 변이체이다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열번호 2에 상응하는 인간 KDM4B 핵산 서열, 또는 서열번호 2의 핵산 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 임의의 인간 KDM4B 폴리펩티드를 코딩하거나 인간 KDM4B 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편을 코딩하는 핵산 제제로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 임의의 인간 KDM4B 폴리펩티드, 또는 그러한 인간 KDM4B 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편으로부터 선택된다. 이 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 인간 KDM4B 폴리펩티드의 적절한 인간 동족체 및 그러한 인간 동족체를 코딩하는 핵산을 확인할 수 있다는 점이 본 발명에 내포되어 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 유용한 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 KDM4C 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 제제, 또는 KDM4C 폴리펩티드, 또는 그의 변이체 또는 생물학적 활성 단편이다. 본원에서 사용된, 인간 KDM4C 핵산 서열은 본원에 개시된 Genbank Accession No. NM_015061.3 (서열번호 3)에 상응한다. KDM4C는 리신 (K)-특이적 데메틸라제 C, JMJD2C 또는 "jumonji domain containing 2C" GASC1, KIAA0780, TDRD14C 또는 "tudor domain containing 14C로도 알려져 있다. 인간 KDM4C 단백질은 Genebank Accession no. NP_055876.2 (서열번호 11)에 상응한다. 따라서, KDM4C의 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00004
일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 KDM4C의 핵산 서열 (서열번호 3)을 포함하거나, 또는 서열번호 3에 상응하는 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 그에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)의 그의 생물학적 활성 단편 또는 동족체 또는 변이체이다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열번호 3에 상응하는 인간 KDM4C 핵산 서열, 또는 서열번호 3의 핵산 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 임의의 인간 KDM4C 폴리펩티드를 코딩하거나 인간 KDM4C 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편을 코딩하는 핵산 제제로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 임의의 인간 KDM4C 폴리펩티드, 또는 그러한 인간 KDM4C 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편으로부터 선택된다. 이 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 인간 KDM4C 폴리펩티드의 적절한 인간 동족체 및 그러한 인간 동족체를 코딩하는 핵산을 확인할 수 있다는 점이 본 발명에 내포되어 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 유용한 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 KDM4D 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 제제, 또는 KDM4D 폴리펩티드, 또는 그의 변이체 또는 생물학적 활성 단편이다. 본원에서 사용된, 인간 KDM4D 핵산 서열은 Genbank Accession No. NM_018039.2에 상응하며, 본원에 개시된 서열번호 4로 지칭된다. KDM4D 는 리신 (K)- 특이적 데메틸라제 4D, FLJ10251, JMJD2D 또는 "jumonji domain containing 2D"로도 알려져 있다. 인간 KDM4D 단백질은 Genebank Accession no. NP_060509.2" (서열번호 12)에 상응한다. 따라서, KDM4D의 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00005
일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 KDM4D의 핵산 서열 (서열번호 4를 포함하거나, 또는 서열번호 4의 상응하는 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 SCNT의 효율을 증가시키는 그에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)의 그의 생물학적 활성 단편 또는 동족체 또는 변이체이다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열번호 4에 상응하는 인간 KDM4D 핵산 서열, 또는 서열번호 4의 핵산 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 융합 또는 활성화 이전에 공여자 유전 물질을 포함하는 인간 제핵 난모세포) 또는 인간 SCNT 배아 (즉, 공여자 핵의 제핵 난모세포와의 융합 후)와 접촉하는 제제는 서열번호 9의 인간 KDM4A 단백질, 또는 서열번호 10의 인간 KDM4B 단백질, 또는 서열번호 11의 인간 KDM2C 단백질, 또는 서열번호 12의 인간 KDM4D 단백질의 발현을 증가시키거나, 및/또는 서열번호 1에 상응하는 인간 KDM4A 핵산 서열, 서열번호 2에 상응하는 인간 KDM4B 핵산 서열, 서열번호 3에 상응하는 인간 KDM4C 핵산 서열, 서열번호 4에 상응하는 인간 KDM4D 핵산 서열, 서열번호 45에 상응하는 인간 KDM4E 핵산 서열, 또는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45의 핵산 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 (예를 들어, 약 110% 이상, 또는 약 120% 이상, 또는 약 130% 이상, 또는 약 140% 이상, 또는 약 150% 이상, 또는 150% 초과 증가됨) 서열번호 1-4 또는 서열번호 45의 생물학적 활성 단편 중 어느 하나 또는 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 Antony et al., Nature, 2013에 개시된 바와 같이 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 12의 아미노산 1-424의 C-말단 또는 N-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상 아미노산이 결핍된 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 12의 아미노산 1-424의 C-말단 및 N-말단 모두에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상 아미노산이 결핍된 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 서열번호 64를 포함하며, 여기에서 서열번호 13의 단백질 서열은 다음을 포함한다:
Figure pct00006
일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 13의 C-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상 아미노산이 결핍된 서열번호 13의 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 13의 N-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상 아미노산이 결핍된 서열번호 13의 아미노산을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 임의의 인간 KDM4D 폴리펩티드를 암호화하거나 인간 KDM4D 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편을 암호화하는 핵산 제제로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 임의의 인간 KDM4D 폴리펩티드, 또는 그러한 인간 KDM4D 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편으로부터 선택된다. 이 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 인간 KDM4D 폴리펩티드의 적절한 인간 동족체 및 그러한 인간 동족체를 코딩하는 핵산을 확인할 수 있다는 점이 본 발명에 내포되어 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 유용한 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 KDM4E 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 제제, 또는 KDM4E 폴리펩티드, 또는 그의 변이체 또는 생물학적 활성 단편이다. 본원에서 사용된, 인간 KDM4E 핵산은 Genbank Accession No. NM_001161630.1에 상응하며, 본원에 개시된 서열번호 45로 지칭된다. KDM4E는 리신 (K)-특이적 데메틸라제 4E, JMJD2E 또는 "jumonji domain containing 2E", KDM4DL, 또는 "lysine (K)-specific demethylase 4D-like"로도 알려져 있다. 인간 KDM4B 단백질은 Genebank Accession no. NP 001155102.1(서열번호 46)에 상응한다. 따라서, 인간 KDM4E의 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00007
일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 KDM4E의 핵산 서열 (서열번호 45을 포함하거나, 또는 서열번호 45의 상응하는 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 그에 대해 80% 이상 서열 상동성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 상동성)의 그의 생물학적 활성 단편 또는 동족체 또는 변이체이다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열번호 45에 상응하는 인간 KDM4E 핵산 서열, 또는 서열번호 45의 핵산 서열과 비교하여 유사 이상의 정도로 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 임의의 인간 KDM4E 폴리펩티드를 코딩하거나 인간 KDM4E 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편을 코딩하는 핵산 제제로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 임의의 인간 KDM4E 폴리펩티드, 또는 그러한 인간 KDM4E 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편으로부터 선택된다. 이 기술분야의 통상의 기술자가 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 인간 KDM4E 폴리펩티드의 적절한 인간 동족체 및 그러한 인간 동족체를 코딩하는 핵산을 확인할 수 있다는 점이 본 발명에 내포되어 있다.
일부 구체예에서 사용된 바와 같이, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 히스톤 데메틸라제 활성제는 AOF (LSD1), AOF1 (LSD2), FBXL11 (JHDM1A), Fbxl1O (JHDM1B), FBXL19 (JHDM1C), KIAA1718 (JHDM1D), PHF2 (JHDM1E), PHF8 (JHDM1F), JMJD1A (JHDM2A), JMJD1B (JHDM2B), JMJD1C (JHDM2C), KDM4A(JMJD2A; JHDM3A), KDM4B (JMJD2B; JHDM3B), KDM4C (JMJD2C; JHDM3 C), KDM4D(JMJD2D; JHDM3D), KDM4E (JMJD2E), RBP2 (JARID1A), PLU1 (JARID1B), SMCX (JARID1C), SMCY (JARID1D), Jumonji (JARID2), UTX (UTX), UTY (UTY), JMJD3 (JMJD3), JMJD4 (JMJD4), JMJD5 (JMJD5), JMJD6 (JMJD6), JMJD7 (JMJD7), JMJD8 (JMJD8)로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택된다. 그러한 히스톤 데메틸라제 활성제는 US 출원 2011/0139145에 개시되고, 이는 본원에 전체가 참조로서 통합된다.
일부 구체예에서, KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 서열번호 9-12 또는 서열번호 46 (인간 KDM4A-KDM4E)이거나 서열번호 1-4 또는 서열번호 45에 상응하는 핵산 서열 중 어느 하나에 의해 코딩되는 임의의 인간 KDM4 폴리펩티드의 폴리펩티드 변이체, 또는 전장 폴리펩티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 변이체, 또는 폴리펩티드의 단편이다.
일부 구체예에서, KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 서열번호 9-12 또는 서열번호 46 (인간 KDM4A-KDM4E)의 KDM4 폴리펩티드의 폴리펩티드 변이체, 또는 전장 폴리펩티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 핵산 서열, 또는 폴리펩티드의 단편이다. 일부 구체예에서, KDM4 히스톤 데메틸라제는 서열번호 9-12 또는 서열번호 46 (인간 KDM4A-KDM4E)의 20개 이상 연속적인 아미노산의 단편, 서열번호 9-12 또는 서열번호 46 (인간 KDM4A-KDM4E) 각각의 단백질의 효율과 비교하여 SCNT의 효율을 증가시키는 능력이 80% 이상인 것과 같은 관심 있는 활성을 가지고 전장 야생형 폴리펩티드에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 길이인 인간 KDM4A, KDM4B, KDM4C, KDM4D 또는 KDM4E의 단편 또는 그의 도메인이다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4A의 생물학적 활성 단편은 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 9의 아미노산을 포함하는 KDM4A 폴리펩티드와 비교하여 적어도 약 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는 서열번호 9의 단편 (예를 들어, 여기에서 단편은 서열번호 9에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 길이이다)을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4B의 생물학적 활성 단편은 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 10의 아미노산을 포함하는 KDM4B 폴리펩티드와 비교하여 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는 서열번호 10의 단편 (예를 들어, 여기에서 단편은 서열번호 10에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 길이이다)을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4C의 생물학적 활성 단편은 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 11의 아미노산을 포함하는 KDM4C 폴리펩티드와 비교하여 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는 서열번호 11의 단편 (예를 들어, 여기에서 단편은 서열번호 11에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 길이이다)을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4D의 생물학적 활성 단편은 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 12의 아미노산을 포함하는 KDM4D 폴리펩티드와 비교하여 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는 서열번호 12의 단편 (예를 들어, 여기에서 단편은 서열번호 12에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 길이이다)을 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 Antony et al., Nature, 2013에 개시된 바와 같이 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 12의 아미노산 1-424의 C-말단 또는 N-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상 아미노산이 결핍된 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 12의 아미노산 1-424의 C-말단 및 N-말단 모두에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상, 또는 50-100개 이상 아미노산이 결핍된 서열번호 12의 아미노산 1-424를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 서열번호 13을 포함하며, 여기에서 서열번호 13의 단백질 서열은 다음을 포함한다:
Figure pct00008
일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 13의 C-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상 아미노산이 결핍된 서열번호 13의 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 서열번호 12의 생물학적 활성 단편은 또한 서열번호 13의 N-말단에서 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 2-10개 이상, 또는 10-20개 이상, 또는 20-50개 이상 아미노산이 결핍된 서열번호 13의 아미노산을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4E의 생물학적 활성 단편은 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 46의 아미노산을 포함하는 KDM4E 폴리펩티드와 비교하여 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는 서열번호 46의 단편 (예를 들어, 여기에서 단편은 서열번호 46에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 길이이다)을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4A의 생물학적 활성 변이체는 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 9의 아미노산을 포함하는 KDM4A 폴리펩티드와 비교하여 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는, 서열번호 9에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 서열번호 9의 변이체 (예를 들어, 여기에서 변이체는 서열번호 9와 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일함)를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4B의 생물학적 활성 변이체는 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 10의 아미노산을 포함하는 KDM4B 폴리펩티드와 비교하여 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는, 서열번호 10에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 서열번호 10의 변이체 (예를 들어, 여기에서 변이체는 서열번호 10과 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일함)를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4C의 생물학적 활성 변이체는 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 11의 아미노산을 포함하는 KDM4C 폴리펩티드와 비교하여 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는, 서열번호 11에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 서열번호 11의 변이체 (예를 들어, 여기에서 변이체는 서열번호 11과 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일함)를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4D의 생물학적 활성 변이체는 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 12의 아미노산을 포함하는 KDM4D 폴리펩티드와 비교하여 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는, 서열번호 12에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 서열번호 12의 변이체 (예를 들어, 여기에서 변이체는 서열번호 12와 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일함)를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 KDM4E의 생물학적 활성 변이체는 동일 방법을 사용하고 동일 조건 하에 있을 때 서열번호 46의 아미노산을 포함하는 KDM4E 폴리펩티드와 비교하여 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 능력을 가지는, 서열번호 46에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 서열번호 46의 변이체 (예를 들어, 여기에서 변이체는 서열번호 46과 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일함)를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물 및 키트에서 유용한 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45 서열에 상응하거나 서열번호 9-12 또는 서열번호 46에 상응하는 단백질을 코딩하는 미국 특허출원 US2012/03228640에 개시된 RNA 또는 변형된 RNA (modRNA)와 같은 핵산 제제, 또는 그의 기능성 단편, 또는 생물학적 활성 변이체 또는 단편이다. 일부 구체예에서, KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45, 또는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45와 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 핵산 변이체 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 제제를 포함한다. 일부 구체예에서, KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45 중 어느 하나의 20개 이상의 연속적인 아미노산의 단편, 예를 들어, 서열번호 1-4 또는 서열번호 45의 20개 이상 또는 30개 이상 또는 40개 이상 또는 50개 이상 핵산의 단편인 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법 및 조성물 및 키트에서 유용한 핵산 제제인 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터로부터 발현된다.
대안적인 구체예에서, 본원에서 사용하기 위하여 포함된 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45 서열에 상응하거나, 서열번호 9-12 또는 서열번호 46에 상응하는 단백질 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 합성 변형된 RNA (modRNA)이다. 합성 변형된 RNA (modRNA)는 미국 출원 US2012/03228640; US2009/0286852 및 US2013/0111615 및 미국 특허 제8,278,036호; 제8,691,966호; 제8,748,089호; 제8,835,108호에서 설명되며, 이는 본원에 전체가 참조로서 통합된다. 일부 구체예에서, 합성, 변형된 RNA 분자는 벡터에서 발현되지 않으며, 합성, 변형된 RNA 분자는 나출된(naked) 합성, 변형된 RNA 분자일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 지질 복합체에 존재하는 하나 이상의 합성, 변형된 RNA 분자를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 합성, 변형된 RNA 분자는 두 개 이상의 변형된 뉴클레오시드(nucleoside)를 포함하며, 예를 들어, 두 개 이상의 변형된 뉴클레오시드는 5-메틸시티딘 (5-methylcytidine: 5mC), N6-메틸아데노신 (N6-methyladenosine: m6A), 3,2'-0-디메틸우리딘 (3,2'-0-dimethyluridine: m4U), 2-티오우리딘 (2-thiouridine: s2U), 2' 플루오로우리딘 (2' fluorouridine), 슈도우리딘 (pseudouridine), 2'-0-메틸우리딘 (2'-0-methyluridine: Um), 2'데옥시 우리딘 (2'deoxy uridine: 2' dU), 4-티오우리딘 (4-thiouridine: s4U), 5-메틸우리딘 (5-methyluridine: m5U), 2'-0-메틸아데노신 (2'-0-methyladenosine: m6A), N6,2'-0-디메틸아데노신 (N6,2'-0-dimethyladenosine: m6Am), N6,N6,2'-0-트리메틸아데노신 (N6,N6,2'-0-trimethyladenosine: m62Am), 2'-0-메틸시티딘 (2'-0-methylcytidine: Cm), 7-메틸구아노신 (7-methylguanosine: m7G), 2'-0-메틸구아노신 (2'-0-methylguanosine: Gm), N2,7-디메틸구아노신 (N2,7-dimethylguanosine: m2,7G), N2, N2, 7-트리메틸구아노신 (N2, N2, 7-trimethylguanosine: m2,2,7G), 및 이노신 (inosine: I)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 합성, 변형된 RNA 분자는 5' 캡, 예를 들어, 5' 캡 유사체, 예를 들어, 5' 디구아노신 캡을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 합성, 변형된 RNA 분자는 5' 트리포스페이트를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 합성, 변형된 RNA 분자는 폴리(A) 테일, Kozak 서열, 3' 비번역 영역, 5' 비번역 영역, 또는 이의 임의의 조합을 더 포함하고, 일부 구체예에서, 합성, 변형된 RNA 분자는 알칼리성 인산가수분해효소로 선택적으로 처리될 수 있다.
H3K9 메틸트랜스페라제 억제제.
일 측면에서, 본 발명은 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 융합 또는 활성화 이전에 공여자 유전 물질을 포함하는 인간 제핵 난모세포) 또는 인간 SCNT 배아 (즉, 공여자 핵의 제핵 난모세포와의 융합 후)의 핵 또는 세포질을 히스톤 메틸레이션을 억제하는, 특히, H3K9 메틸레이션을 억제하는, 특히, 인간 핵 유전 물질에서 H3H9me3 트리메틸레이션을 억제하는 제제와 접촉하는 단계를 포함하는 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 구체예에서 상기 제제는 히스톤 메틸트랜스페라제 활성을 억제한다. 본 발명의 특정 구체예에서 상기 제제는 인간 히스톤 메틸트랜스페라제의 발현을 억제한다. 본 발명의 특정 구체예에서 억제제는 인간 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제이다. 본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 H3K9 메틸트랜스페라제 단백질의 억제가 인간 SCNT의 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 발견했다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 단백질 억제제이며, 일부 구체예에서, 억제제는 H3K9 메틸트랜스페라제 단백질의 기능 또는 그의 유전자로부터 H3K9 메틸트랜스페라제의 발현을 억제하는 임의의 제제이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제제는 인간 히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1 단백질의 발현 또는 기능을 억제시킨다. SUV39h1은 두 개의 대안적인 스플라이스 변이체 (변이체 1 및 2)를 가지며, 이는 SUV39h1 아이소폼 1 및 SUV39h1 아이소폼 2 단백질을 생성한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 키트 및 조성물에서 사용하기 위한 제제는 SUV39h1의 변이체 1 (서열번호 47) 또는 변이체 2 (서열번호 14)의 mRNA의 번역을 억제한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 키트 및 조성물에서 사용하기 위한 제제는 SUV39h1 단백질의 아이소폼 1 (서열번호 48) 또는 아이소폼 2 (서열번호 5)의 기능을 억제한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제제는 인간 히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h2 단백질을 억제한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제제는 인간 히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h2 단백질의 발현 또는 기능을 억제한다. SUV39h2는 5개의 대안적인 스플라이스 변이체 (변이체 1-5)를 가지며, 이는 SUV39h2의 4개의 아이소폼을 생성한다 (변이체 2 및 3은 모두 아이소폼 2를 코딩한다). 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 키트 및 조성물에서 사용하기 위한 제제는 서열번호 15, 49, 51, 52 및 53 (hSUV39h2 변이체 1-5) 중 어느 하나 이상의 mRNA의 번역을 억제한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 키트 및 조성물에서 사용하기 위한 제제는 서열번호 6 및 서열번호 54-57에 상응하는 hSuv39h2 아이소폼 1-4의 기능을 억제한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제제는 인간 히스톤 메틸트랜스페라제 EHMT1의 억제제이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제제는 인간 히스톤 메틸트랜스페라제 SETDB1을 억제한다. 특정 구체예에서 둘 이상의 H3K9 메틸트랜스페라제 (예를 들어, 2개, 3개, 4개 등)가 억제된다. 본 발명의 특정 구체예에서, SUV39h1 및 SUV39h2는 모두 동일한 제제 (예를 들어, SUV39h1/2 억제제)에 의해 또는 2개 이상의 분리된 제제에 의해 억제된다. 본 발명의 특정 구체예에서 상기 제제는 RNAi 제제, 예를 들어 H3K9 메틸트랜스페라제; 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 또는 인간 SETDB1 중 어느 하나 이상의 발현을 억제하는 siRNA 또는 shRNA이다.
본원에서 사용된 용어 "SUV39h1" 또는 "H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1"은 이 기술분야의 일반적인 의미를 가지며, 히스톤 H3의 Lys-9를 메틸화하는 히스톤 메틸트랜스페라제 “변화 3-9 동족체 1의 억제제(suppressor of variegation 3-9 homolog 1)(초파리)”를 말한다(Aagaard L, Laible G, Selenko P, Schmid M, Dorn R, Schotta G, Kuhfittig S, Wolf A, Lebersorger A, Singh P B, Reuter G, Jenuwein T (June 1999). "Functional mammalian homologues of the Drosophila PEV-modifier Su(var)3-9 encode centromere-associated proteins which complex with the heterochromatin component M31 ". EMBO J 18 (7): 1923-38.). 상기 히스톤 메틸트랜스페라제는 MG44, KMT1A, SUV39H, 히스톤-리신 N-메틸트랜스페라제 SUV39H1, H3-K9-HMTase 1, OTTHUMP00000024298, Su(var)3-9 동족체 1, 리신 N-메틸트랜스페라제 1A, 히스톤 H3-K9 메틸트랜스페라제 1, 위치-효과 변화 3-9 동족체(position-effect variegation 3-9 homolog), 히스톤-리신 N-메틸트랜스페라제, 또는 H3 리신-9 특이적 1로도 알려져 있다. 상기 용어는 SU(VAR)3-9와 같은 SUV39h1의 모든 오르소로그(ortholog)를 포함하며, SUV39h1 아이소폼 1 및 SUV39h1 아이소폼 2를 코딩하는 변이체 1 및 변이체 2를 포함한다. 표 8에 요약된 바와 같이, 이론에 국한되지 않고, Suv39hl(Gene ID: 6839)는 두 개의 대안적인 스플라이스 변이체를 가지며, 변이체 1은 Suv39hl 아이소폼 1 단백질 (긴 전사물 및 보다 긴 아이소폼을 코딩한다)을 생성하고 mRNA NM_001282166.1 (서열번호 47) 및 단백질 NP_001269095.1 (서열번호 48)에 상응한다. Suv39hl의 변이체 2는 아이소폼 2를 코딩하고, 변이체 1과 비교하여 5' UTR에 차이가 있고 5' 코딩 영역의 일부가 결여되며, 다른 시작 코돈에서 번역을 개시한다. 코딩된 Suv39h1 아이소폼 2 단백질은 아이소폼 1 단백질과 비교하여 더 짧고, 구별되는 N-말단을 가진다. Suv39h1 아이소폼 2에 대한 mRNA는 NM_003173.3 (서열번호 14)이고, 이는 NP_003164.1 (서열번호 5)에 상응하는 아이소폼 2 단백질을 코딩한다.
본원에서 사용된 용어 "SUV39h2" 또는 "H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h2"는 이 기술분야의 일반적인 의미를 가지며, 히스톤 H3의 Lys-9를 메틸화하는 히스톤 메틸트랜스페라제 "변화 3-9 동족체 2의 억제제(suppressor of variegation 3-9 homolog 2) (초파리)"를 말한다. 상기 히스톤 메틸트랜스페라제는 KMT1B, FLJ23414, H3-K9-HMTase 2, 히스톤 H3-K9 메틸트랜스페라제 2, 리신 N-메틸트랜스페라제 IB, su(var)3-9 동족체 2로도 알려져 있다. 상기 용어는 모든 동족체 (Suv39h2 유전자는 침팬지, 붉은털 원숭이, 개, 소, 마우스, 래트, 닭 및 개구리에서 보존된다) 뿐만 아니라 표 8에 개시된 SUV39h2의 대안적인 스플라이스 변이체를 포함한다. 이론에 국한되지 않고, 표 8은 5개의 대안적인 스플라이스 인간 Suv39h2 (Gene ID: 79723) 변이체를 나열하며, 이는 다음과 같다: 변이체 1은 Suv39h2 아이소폼 1 단백질 (긴 전사물 및 보다 긴 아이소폼을 코딩한다)을 코딩하고; 변이체 2 및 변이체 3은 모두 Suv39h2 아이소폼 2를 코딩하고; 변이체 4는 Suv39h2 아이소폼 3을 코딩하고, 그리고 변이체 5는 Sub39h2 아이소폼 4를 코딩한다. Suv39h2 변이체에 대한 mRNA의 서열 식별자 및 그들의 상응하는 단백질을 표 8에 나타내었다.
표 8: hSUVh1 및 hSUVh2 변이체에 대한 서열의 개요
Figure pct00009
본 발명에 따르면, 인간 SUV39h1의 억제제는 H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1 단백질 기능의 억제제 또는 H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1 유전자 발현의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1의 억제제"는 H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1에 의한 히스톤 H3의 Lys-9의 메틸레이션을 억제하는 능력을 가지는 임의의 화합물 (자연적이거나 아님)을 말한다. 용어 "H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h2의 억제제"는 H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h2에 의한 히스톤 H3의 Lys-9의 메틸레이션을 억제하는 능력을 가지는 임의의 화합물 (자연적이거나 그렇지 않음)을 말한다.
화합물의 억제 활성은 Greiner D. Et al. Nat Chem Biol. 2005 August; 1(3): 143-5 또는 Eskeland, R. et al. Biochemistry 43, 3740-3749 (2004)에 설명된 바와 같이 다양한 방법을 사용하여 결정될 수 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로서 통합된다.
일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 억제는 제제에 의한 것이다. 임의의 제제, 예를 들어 이에 한정되지 않으나, 핵산, 핵산 유사체, 펩티드, 파지, 파지미드, 폴리펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetics), 리보솜, 압타머, 항체, 작은(small) 또는 큰(large) 유기 또는 무기 분자, 또는 이의 임의의 조합을 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제는 RNAi 제제, siRNA 제제, shRNA, 올리고뉴클레오티드, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1 중화 항체 또는 항체 단편, 압타머, 소분자, 단백질, 펩티드, 소분자, 아비디미르(avidimir), 아비미르(avimir), 및 그의 기능성 단편 또는 유도체 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. CRISPR/Cas9s 또는 CRISPR/Cpf1 시스템을 통한 넉아웃 SUV39h1 및/또는 SUV39h2에 대한 상업적으로 이용 가능한 서열은 Origene (제품 번호 KN202428 및 KN317005) 및 Santa Cruz Biotechnology (제품 번호: sc-401717)로부터 입수 가능하며, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 포함된다.
본원에 개시된 방법에서 유용한 제제는 또한 유전자 발현을 억제할 수 있다 (즉, 유전자의 발현을 억제하거나 및/또는 억누른다). 그러한 제제는 이 기술분야에서 "유전자 사일런서(gene silencers)"라고 지칭되며 이 기술분야의 통상의 기술자에게 흔히 알려져 있다. 예들은, 이에 한정되지 않으나 RNA, DNA 또는 핵산 유사체에 대한 핵산 서열을 포함하며, 단일 또는 이중 가닥일 수 있고, 관심 있는 단백질을 코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 핵산 유사체, 예를 들어 이에 한정되지 않으나 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid: PNA), 슈도-상보적 PNA (pseudo-complementary PNA: pc-PNA), 잠긴 핵산 (locked nucleic acids: LNA) 및 그 유도체 등을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 헥산 제제는 또한, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나 전사 억제자, 안티센스 분자, 리보자임, 작은 억제 핵산 서열, 예를 들어 이에 한정되지 않으나 RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로 RNAi (miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등으로 작용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 모든 양상의 일부 구체예에서, 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 융합 또는 활성화 이전에 공여자 유전 물질을 포함하는 인간 제핵 난모세포) 또는 인간 SCNT 배아 (즉, 공여자 핵의 제핵 난모세포와의 융합 후)와 접촉하는 제제는 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1 중 어느 하나의 억제제이다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1의 억제제 중 하나 이상 또는 임의의 조합은 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, SUV39h1, SUV39h2 또는 SETDB1의 억제제는 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1 핵산 서열 (예를 들어, 서열번호 14-16, 또는 서열번호 47 또는 서열번호 49, 51-53)의 발현, 또는 인간 SUV39h1 단백질 (서열번호 5 또는 서열번호 48), 인간 SUV39h2 (서열번호 6 또는 서열번호 54-57) 또는 인간 SETDB1 단백질 (서열번호 17)의 활성을 억제한다.
본 발명의 맥락에서, H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1/2의 억제제는 바람직하게는 다른 분자와 비교하여 H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1/2에 대해 선택적이다. "선택적(selective)"은 억제제의 친화성이 다른 히스톤 메틸트랜스페라제에 대한 친화성 보다 적어도 10배, 바람직하게는 25배, 보다 바람직하게는 100배, 더욱 바람직하게는 500배 높음을 의미한다.
전형적으로, H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1 및/또는 SUV39h2의 억제제는 작은 유기 분자이다. 용어 “작은 유기 분자”란 의약에서 일반적으로 사용된 유기 분자에 필적하는 크기의 분자를 말한다. 상기 용어는 생물학적 거대분자 (예를 들어, 단백질, 핵산 등)를 배제한다. 바람직한 작은 유기 분자는 크기가 약 5000 Da 이하, 보다 바람직하게는 2000 Da 이하, 가장 바람직하게는 약 1000 Da 이하이다.
특정 구체예에서, H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1의 억제제는 Greiner D, Bonaldi T, Eskeland R, Roemer E, Imhof A. Identification of a specific inhibitor of the histone methyltransferase SU(VAR)3-9. Nat Chem Biol. 2005 August; 1(3): 143-5. Epub 2005 Jul. 17.; Weber, H. P., et al., The molecular structure and absolute configuration of chaetocin. Acta Cryst, B28, 2945-2951 (1972); Udagawa, S., et al., The production of chaetoglobosins, sterigmatocystin, O-methylsterigmatocystin, and chaetocin by Chaetomium spp. and related fungi. Can. J. microbiol., 25, 170-177 (1979).; Gardiner, D. M., et al., The epipolythiodioxopiperazine (ETP) class of fungal toxins: distribution, mode of action, functions and biosynthesis. Microbiol., 151, 1021-1032 (2005)에 의해 설명된 케토신(chaetocin) (CAS 28097-03-2)이다. 예를 들어, 케토신은 Sigma Aldrich에서 상업적으로 입수 가능하다.
또 다른 구체예에서, H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1의 억제제는 압타머이다. 압타머는 분자 인식의 관점에서 항체에 대한 대안을 나타내는 분자의 분류(class)이다. 압타머는 높은 친화성 및 특이성을 갖는 임의의 분류의 표적 분자를 거의 인식할 수 있는 능력을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고펩티드 서열이다. 그러한 리간드는 Tuerk C. 및 Gold L., 1990에서 설명된 바와 같이, 무작위 서열 라이브러리의 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)를 통해 분리될 수 있다. 무작위 서열 라이브러리는 DNA의 조합 화학 합성에 의해 얻을 수 있다. 그 라이브러리에서, 각 구성원은 결국 화학적으로 변형된 고유한 서열의 선형 올리고머이다. 분자의 그 분류의 가능한 변형, 사용 및 이점은 Jayasena S. D., 1999에서 검토되었다. 펩티드 압타머는 2개의 하이브리드 방법에 의해 조합 라이브러리로부터 선택된 대장균 티오레독신 A(Thioredoxin A)와 같은 플랫폼 단백질에 의해 디스플레이되는 구조적으로 제약된 항체 가변 영역으로 이루어진다(Colas et al., 1996).
본 발명에 사용하기 위한 발현의 억제제는 안티-센스 올리고뉴클레오티드 구조물(construct)에 기초할 수 있다. 안티-센스 RNA 분자 및 안티-센스 DNA 분자를 포함하는 안티-센스 올리고뉴클레오티드는 H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1 또는 HP1α mRNA의 번역을 그들에 결합하는 것에 의해 직접적으로 차단하기 위해 작용할 것이고, 그러므로 단백질 번역을 막거나 mRNA 분해를 증가시켜서, H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1 또는 HP1α의 수준과 세포에서 활성을 감소시킨다. 예를 들어, H3K9-히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1을 코딩하는 mRNA 전사물 서열의 고유 영역에 상보적이고 약 15개 염기 이상인 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 통상적인 포스포디에스테르 기술에 의해 합성될 수 있고, 예를 들어, 정맥 주입 또는 투입에 의해 투여될 수 있다. 서열이 알려진 유전자의 유전자 발현을 특이적으로 억제하기 위한 안티센스 기술을 사용하는 방법은 이 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 제6,566,135호; 제6,566,131호; 제6,365,354호; 제6,410,323호; 제6,107,091호; 제6,046,321호; 및 제5,981,732호를 참조). SUV39h1의 억제제는 US 특허출원 제2015/0038496호에 개시되어 있고, 이는 본원에 전제가 참조로서 통합된다. US 출원 제2014/0161785호에 개시된 바와 같이, 소분자, 베티실린(Veticillin)은 인간 SUV39h1 및 인간 SUV39h2에 대한 선택적 억제제(즉, SUV39h1/2를 억제한다)로 확인되었으며, 이는 본원에 전체가 참조로서 통합되며, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기 위해 포함된다.
SUV39h2의 억제제 및 그 확인 방법은 미국 특허출원 US2014/0094387에 개시되며, 이는 본원에 전체가 참조로서 통합된다.
H3K9 메틸트랜스페라제의 RNAi 억제제. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 RNAi 제제, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA 분자이다. 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1, 및 인간 PRDM2의 RNAi 제제는 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 일부 구체예에서 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제는 RNAi 제제이다. 일부 구체예에서, RNAi 제제는 본원에 개시된 인간 SUV39h1 핵산 서열 (서열번호 14 또는 서열번호 47), 인간 SUV39h2 단백질 (서열번호 15, 49, 51, 52, 53) 또는 인간 SETDB1 단백질 (서열번호 16) 중 어느 하나의 뉴클레오티드의 영역 내에 위치한 표적 서열에 전체 또는 일부에서 혼성화한다.
일부 구체예에서, RNAi 제제는 본원에 개시된 인간 SUV39h1 단백질 (서열번호 5 또는 서열번호 48), 인간 SUV39h2 단백질 (서열번호 6 또는 서열번호 54-57) 또는 인간 SETDB1 단백질 (서열번호 17) 중 어느 하나의 발현을 억제한다.
H3K9 메틸트랜스페라제의 억제는 통상의 기술자에게 흔히 알려진 방법에 따른 유전자 침묵 RNAi 분자에 의한 것일 수 있다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 RNAi 제제이거나 표 2로부터 선택된 siRNA 제제 중 어느 하나 또는 조합이다.
예를 들어, 유전자 침묵 siRNA 올리고뉴클레오티드 이중가닥(duplex)들은 변이체 2에 상응하는 NM_003173.3 (서열번호 14), 또는 변이체 1에 상응하는 NM_001282166.1 (서열번호 47)에 상응하는 인간 SUV39h1 내에 위치하는 영역을 표적으로 하여, 인간 SUV39h1 발현을 넉다운시키기 위해 용이하게 사용될 수 있다. SUV39h1 mRNA는 siRNA를 사용하여 성공적으로 표적화할 수 있고; 다른 siRNA 분자는 표적 mRNA의 알려진 서열을 기초로 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 의심을 피하기 위해, 인간 SUV39h1의 서열은, 예를 들어, GenBank Accession Nos. NM_003173.3 (서열번호 14) (아이소폼 1을 코딩하는 변이체 2) 또는 NM_001282166.1 (서열번호 47) (아이소폼 1을 코딩하는 변이체 1)로 제공된다. 통상의 기술자는 인간 SUV39h1 단백질 (서열번호 5 또는 서열번호 48)을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하거나 또는 임의의 다른 포유류 SUV39h1 단백질의 발현을 억제하도록 사용될 RNAi 제제를 선택할 수 있다.
의심을 피하기 위해, 인간 SUV39h1 cDNA의 서열은, 예를 들어, 변이체 2에 상응하는 GenBank Accession Nos.: NM_003173.3 (서열번호 14), 또는 변이체에 상응하는 NM_001282166.1 (서열번호 47)로 제공되며, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 H3K9 메틸트랜스퍼 억제제로 사용하기 위한 인간 SUV39h1 mRNA 발현을 억제하는 유전자 침묵 RNAi 조절제를 설계하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39h1의 억제제는 siRNA 제제, 예를 들어, GAAACGAGUCCGUAUUGAAtt (서열번호 7) 또는 UUCAAUACGGACUCGUUUCtt (서열번호 8) 및 그의 80% 서열 동일성을 갖는 단편 또는 유도체 중 하나 이상 또는 둘을 포함하는 siRNA 제제이다.
본원에서 사용된, 용어 "SUV39h1 단백질"은 본원에 개시된 서열번호 5 (아이소폼 2) 또는 서열번호 48 (아이소폼 1)의 아미노산 서열, 또는 기능의 구조에 부정적인 영향을 미치지 않는 보존적 치환, 첨가, 결실을 포함하는 그의 동족체를 말한다. 일부 구체예에서, SUV39h1 단백질은 다음과 같은 인간 SUV39h1 전사물 변이체 2 (Suv39hl 아이소폼 2 단백질을 코딩함)에 대한 핵산 서열 (서열번호 14)에 의해 코딩된다:
Figure pct00010
일부 구체예에서, SUV39h1 단백질은 다음과 같은 인간 SUV39h1 전사물 변이체 1 (Suv39h1 아이소폼 1 단백질을 코딩함)에 대한 핵산 서열 (서열번호 47)에 의해 코딩된다:
Figure pct00011
일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 SUV39h1 mRNA (서열번호 14 또는 서열번호 47)의 발현을 50% 이상 억제 또는 감소시키는 핵산 억제제를 포함한다 (SUV39h1 억제제의 부재 시와 비교함).
일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 SUV39h1 단백질 (서열번호 5 (아이소폼 2) 또는 서열번호 48 (아이소폼 1)의 수준 또는 기능을 억제하거나 감소시키는 핵산 억제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 SUV39h2 단백질 (즉, 서열번호 6, 54-57 중 어느 하나)의 수준 또는 기능을 억제 또는 감소시키는 핵산 억제제를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 SUV39h1의 siRNA 억제제는 서열번호 8 또는 그의 10개 이상 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 8에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열이다. 일부 구체예에서, siRNA 또는 다른 핵산 억제제는 서열번호 7의 표적 서열에 전체 또는 일부에서 혼성화한다.
일부 구체예에서, 마우스 SUV39h2의 siRNA 억제제는 서열번호 19 또는 그의 10개 이상 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 19에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열이다. 일부 구체예에서, siRNA 또는 다른 핵산 억제제는 서열번호 18의 표적 서열에 전체 또는 일부에서 혼성화한다.
일부 구체예에서, 인간 SUV39h1의 siRNA 억제제는 서열번호 21 또는 그의 10개 이상 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 21에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열이다. 일부 구체예에서, siRNA 또는 다른 핵산 억제제는 서열번호 20의 표적 서열에 전체 또는 일부에서 혼성화한다.
일부 구체예에서, siRNA 또는 다른 핵산 억제제는 인간 SUV39h2의 서열번호 15, 49, 51, 52 및 53 (hSUV39h2 변이체 1-5) 중 어느 하나의 뉴클레오티드의 영역 내에 위치한 표적 서열에 전체 또는 일부에서 혼성화한다.
H3K9 메틸트랜스페라제의 억제는 통상의 기술자에게 흔히 알려진 방법에 따른 유전자 침묵 RNAi 분자에 의한 것일 수 있다. 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1, 및 인간 PRDM2의 억제는 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 RNAi 제제이거나 표 2로부터 선택된 siRNA 제제 중 어느 하나 또는 조합이다.
일부 구체예에서, SUV39H1은 hsa-mir-98-5p (MIRT027407), hsa-mir-615-3p (MIRT040438), hsa-mir-331-3p (MIRT043442) 또는 그들에 대해 85% 이상 서열 동일성인 miR 변이체에 의해 표적화되고 억제될 수 있다. 인간 세포에서 SUV39h1 및/또는 SUV39h2를 억제하는 상업적으로 이용 가능한 siRNA, RNAi 및 shRNA 제품은 Origene, Qiagen 및 Santa Cruz Biotechnology로부터 입수 가능하며, 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다.
예를 들어, 인간 SUV39H2 변이체 1-5 (서열번호 15, 49, 51, 52 및 53) 중 어느 하나에 위치한 핵산 서열에 결합하고 일부 또는 전체에서 혼성화하는 유전자 침묵 siRNA 올리고뉴클레오티드는 SUV39h2 발현을 넉다운시키기 위해 용이하게 사용될 수 있다. SUV39h2 mRNA는 siRNA를 사용하여 성공적으로 표적화될 수 있고; 다른 siRNA 분자는 표적 mRNA의 알려진 서열에 기초하여 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 의심을 피하기 위해, 인간 SUV39h2 변이체의 서열은 표 8에 나타내었다. 의심을 피하기 위해, 인간 SUV39h2 변이체 cDNA의 서열은, 예를 들어, GenBank Accession Nos.: NM_024670.3 (서열번호 15), NM_001193425.1 (서열번호 51), NM_001193426.1 (서열번호 52), NM_OOl193427.1 (서열번호 53)에 제공되었고, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 H3K9 메틸트랜스퍼 억제제로 사용하기 위한 인간 SUV39h2 mRNA 발현을 억제하는 유전자 침묵 RNAi 조절제를 설계하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, SUV39h2의 억제제는 siRNA 제제이고, 예를 들어, siRNA는 하기 서열 중 하나 이상 또는 둘을 포함할 수 있다: GCUCACAUGUAAAUCGAUUtt (서열번호 18) 또는 AAUCGAUUUACAUGUGAGCtt (서열번호 19) 및 그의 80% 이상 서열 동일성의 단편 또는 유도체. 일부 구체예에서, SUV39h2의 억제제는 GCUCACAUGUAAAUCGAUUtt (서열번호 18)의 적어도 표적 서열에 결합하는 siRNA 제제이다. 일부 구체예에서, SUV39h2의 억제제는 AAUCGAUUUACAUGUGAGCtt (서열번호 19)의 일부의 5개 이상 연속적인 뉴클레오티드 또는 그의 80% 이상 서열 동일성의 단편 또는 유도체를 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "SUV39H2 단백질"은 본원에 개시된 서열번호 54 (아이소폼 1), 서열번호 6 또는 서열번호 53 (아이소폼 2), 서열번호 56 (아이소폼 3) 또는 서열번호 57 (아이소폼 4) 중 어느 하나의 아미노산, 및 기능의 구조에 부정적 영향을 미치지 않는 보존적 치환, 첨가, 결실을 포함하는 그의 동족체를 말한다. hSUV39h2 변이체 핵산 서열 및 그에 상응하는 단백질에 대한 Accession number는 표 8에 나타내었다. 예를 들어, SUV39h2 아이소폼 2 단백질은 인간 SUV39H2 변이체 3 전사물에 대한 핵산 서열 (서열번호 15)에 의해 코딩되며, 이는 다음과 같다:
Figure pct00012
일부 구체예에서, 제제는 본원에 개시된 인간 SUV39h2 (hSUV39h2 변이체 1-5)의 서열번호 15, 49, 51, 52 및 53 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제한다. 일부 구체예에서, 통상의 기술자는 서열번호 6, 54-57 중 어느 하나 이상의 인간 SUV39h2 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 데 사용될 RNAi 제제를 선택할 수 있다.
인간 SUV39H1 및 SUV39H2를 억제하는 다른 예시적인 siRNA 서열은 본원에 전체가 참조로서 통합된 US 출원 제2012/0034192호에 개시된다.
표 2 - H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하기 위한 예시적인 siRNA 서열:
Figure pct00013
의심을 피하기 위해, 인간 SETDB1 cDNA의 서열은, 예를 들어, GenBank Accession Nos.: NM_001145415.1 (서열번호 16)로 제공되며, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 H3K9 메틸트랜스퍼 억제제로 사용하기 위한 인간 SETDB1 mRNA 발현을 억제하는 유전자 침묵 RNAi 조절제를 설계하기 위해 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다.
의심을 피하기 위해, 인간 EHMT1 cDNA의 서열은, 예를 들어, GenBank Accession Nos. : NM_024757.4 (서열번호 42)로 제공되며, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 H3K9 메틸트랜스퍼 억제제로 사용하기 위한 인간 EHMT1 mRNA 발현을 억제하는 유전자 침묵 RNAi 조절제를 설계하기 위해 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다.
의심을 피하기 위해, 인간 PRDM2 cDNA의 서열은, 예를 들어, GenBank Accession Nos. : NM_012231.4 (서열번호 43)로 제공되며, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 H3K9 메틸트랜스퍼 억제제로 사용하기 위한 인간 PRDM2 mRNA 발현을 억제하는 유전자 침묵 RNAi 조절제를 설계하기 위해 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제는 RNAi 제제, siRNA 제제, shRNA, 올리고뉴클레오티드, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1 중화 항체 또는 항체 단편, 압타머, 소분자, 단백질, 펩티드, 소분자, 아비디미르(avidimir), 및 그의 기능성 단편 또는 유도체 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 RNAi 제제, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 인간 SUV39H1 단백질 (서열번호 5 또는 서열번호 48) 또는 SUV29h1 mRNA (서열번호 14 또는 서열번호 47) 또는 인간 SUV39H2 단백질 (서열번호 6 또는 서열번호 54-57) 또는 SUV39h2 mRNA (서열번호 15 또는 서열번호 49, 51, 52, 53)의 단백질 발현을 감소시키는 핵산 억제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39h1의 siRNA 억제제는 서열번호 8 또는 그의 10개 이상 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 8에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85%이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열이다. 일부 구체예에서, siRNA 또는 다른 핵산 억제제는 SUV39H1의 서열번호 7의 표적 서열에 전체 또는 일부에서 혼성화한다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39H2의 siRNA 억제제는 서열번호 19 또는 그의 10개 이상 연속적인 뉴클레오티드의 단편, 또는 서열번호 19에 대해 80% 이상 서열 동일성 (또는 약 85%이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 서열 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, siRNA 또는 다른 핵산 억제제는 SUV39h2의 서열번호 18 또는 서열번호 15의 표적 서열에 전체 또는 일부에서 혼성화한다.
상기 양상의 다른 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 히스톤 메틸트랜스페라제 중 어느 하나를 억제한다: SUV39H1, SUV39H2, G9A (EHMT2), EHMT1, ESET (SETDB 1), SETDB2, MLL, MLL2, MLL3, SETD2, NSD1, SMYD2, DOT1L, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, EZH2, SETD7, PRDM2, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT4, PRMT5, PRMT6, PRMT7, PRMT8, PRMT9, PRMT10, PRMT11, CARM1.
일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는, 예를 들어, 인간 SUV39H1, 인간 SUV39H2 또는 인간 SETDB1을 억제하는 제제는 핵산이다. H3K9 메틸트랜스페라제, 예를 들어, SUV39H1, SUV39H2 또는 SETDB1의 핵산 억제제는, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나, RNA 간섭-유도 (RNA interference-inducing: RNAi) 분자, 예를 들어 이에 한정되지 않으나 siRNA, dsRNA, stRNA, shRNA 및 그의 변형된 버전을 포함하고, 여기에서 RNA 간섭 (RNAi) 분자는 인간 SUV39H1, 인간 SUV39H2 및/또는 인간 SETDB1 유전자 중 어느 하나로부터의 유전자 발현을 침묵시킨다.
따라서, 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제, 예를 들어, 인간 SUV39H1, 인간 SUV39H2 또는 인간 SETDB1의 억제제는 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 알려진 임의의 “유전자 침묵” 방법에 의해 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 핵산 억제제, 예를 들어, 예를 들어, 인간 SUV39H1, 인간 SUV39H2 또는 인간 SETDB1의 억제제는 안티-센스 올리고핵산, 또는 핵산 유사체, 예를 들어 이에 한정되지 않으나 DNA, RNA, 펩티드-핵산 (PNA), 슈도-상보적 PNA (pc-PNA), 또는 잠긴 핵산 (LNA) 등이다. 대안적인 구체예에서, 핵산은 DNA 또는 RNA, 및 핵산 유사체, 예를 들어 PNA, pcPNA 및 LNA이다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있고, 관심 있는 단백질을 코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, PNA 등을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 그러한 핵산 서열은, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나, 전사 억제제, 안티센스 분자, 리보자임, 작은 억제 핵산 서열, 예를 들어 이에 한정되지 않으나 RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로 RNAi (mRNAi), 안티센스 올리고뉴클레오티드로 작용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서 진핵 세포에서 내인성으로 발견되는 단일-가닥 RNA (single-stranded RNA: ssRNA), RNA의 형태는 RNAi 분자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 세포 ssRNA 분자는 메신저 RNA (및 전구 전-메신저 RNA(progenitor pre-messenger RNA)), 작은 핵 RNA, 작은 핵인 RNA (small nucleolar RNA), 운반 RNA 및 리보솜 RNA를 포함한다. 이중-가닥 RNA (double-stranded RNA: dsRNA)는 크기-의존적 면역 반응 유도하여 30bp 보다 큰 dsRNA가 인터페론 반응을 활성화시키게 하는 반면, 짧은 dsRNA는 다이서(Dicer) 효소의 세포의 내인성 RNA 간섭 조직 하류(machinery downstream)로 유입된다.
RNA 간섭 (RNAi)은 선택된 표적 폴리펩티드의 발현을 억제하는 강력한 접근법을 제공한다. RNAi는 선택적 분해를 위해 표적 폴리펩티드를 코딩하는 메신저 RNA를 표적하는 작은 간섭 RNA (siRNA) 이중가닥을 사용한다. 유전자 발현의 siRNA-의존적 전사 후 침묵은 siRNA에 의해 가이드 된 부위에서 표적 메신저 RNA 분자를 절단하는 것을 수반한다.
RNA 간섭 (RNAi)는 진화적으로 보존된 과정으로, 표적 유전자와 동일 또는 매우 유사한 서열의 RNA를 발현시키거나 또는 도입함으로써 표적화된 유전자로부터 전사된 메신저 RNA (mRNA)의 서열 특이적 분해 또는 특이적 전사 후 유전자 침묵 (post-transcriptional gene silencing: PTGS)을 초래하여(Coburn, G. and Cullen, B. (2002) J. of Virology 76(18):9225를 참조), 그것에 의하여 표적 유전자의 발현을 억제한다. 일 구체예에서, RNA는 이중 가닥 RNA (dsRNA)이다. 이 과정은 식물, 무척추동물, 및 포유류 세포에서 설명되었다. 사실상, RNAi는 dsRNA-특이적 엔도뉴클레아제 다이서(Dicer)에 의해 개시되며, 이는 긴 dsRNA를 siRNA라 불리는 이중-가닥 단편으로 전진적인 절단을 하는 것을 촉진한다. siRNA는 표적 RNA를 인식하고 절단하는 단백질 복합체 (RNA 유도된 침묵 복합체," 또는 "RISC"로 불림)로 통합된다. RNAi는 또한 핵산 분자, 예를 들어, 합성 siRNA 또는 RNA 간섭 제제를 도입하는 것에 의해 개시되어 표적 유전자의 발현을 억제 또는 침묵시킬 수 있다. 본원에서 사용된, "표적 유전자 발현의 억제"는 RNA 간섭이 유도되지 않은 상황과 비교하여 표적 유전자에 의해 코딩되는 표적 유전자 또는 단백질의 발현 또는 단백질 활성 또는 수준에서 임의의 감소를 포함한다. 상기 감소는 RNA 간섭 제제에 의해 표적화되지 않은 표적 유전자의 발현 또는 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 이상일 수 있다.
"짧은 간섭 RNA(short interfering RNA)" (siRNA)는 본원에서 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA)"로도 지칭되며, 예를 들어, RNAi에 의해, 표적 유전자의 발현을 억제하는 기능을 하는 제제로 정의된다. siRNA는 화학적으로 합성될 수 있고, 인 비트로(in vitro) 전사에 의해 생산될 수 있고, 또는 숙주 세포 내에서 생산될 수 있다. 일 구체예에서, siRNA는 길이가 약 15개 내지 약 40개 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15개 내지 약 28개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 길이가 약 19개 내지 약 25개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 길이가 약 19, 20, 21, 22, 또는 23의 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자이며, 약 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 각 가닥에 3' 및/또는 5' 오버행을 함유할 수 있다. 오버행의 길이는 2개의 가닥 간 독립적인데, 즉, 한 가닥의 오버행의 길이는 제2 가닥의 오버행의 길이에 의존하지 않는다. 바람직하게는 siRNA는 표적 메신저 RNA (mRNA)의 분해 또는 특이적 전사 후 유전자 침묵 (PTGS)을 통해 RNA 간섭을 촉진시킬 수 있다.
siRNA는 또한 작은 헤어핀 (줄기 루프라고도 함) RNA (shRNA)를 포함한다. 일 구체예에서, 이들 shRNA는 약 5개 내지 약 9개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 루프가 뒤따르는 짧은 (예를 들어, 약 19개 내지 약 25개 뉴클레오티드) 안티센스 가닥, 및 유사한 센스 가닥으로 구성된다. 대안적으로, 센스 가닥은 뉴클레오티드 루프 구조에 선행할 수 있고, 안티센스 가닥이 뒤따를 수 있다. 이들 shRNA는 플라스미드, 레트로바이러스 및 렌티바이러스에 함유될 수 있고, 예를 들어, pol III U6 프로모터, 또는 또 다른 프로모터로부터 발현될 수 있다 (예를 들어, 본원에 전체가 참조에 의해 통합된 Stewart, et al. (2003) RNA Apr;9(4):493-501 참조).
RNA 간섭 제제의 표적 유전자 또는 서열은 세포 유전자 또는 게놈 서열, 예를 들어 SUV39h1, SUV39h2 또는 SETDB1 유전자 서열의 H3K9 메틸트랜스페라제 유전자 서열일 수 있다. siRNA는 표적 유전자 또는 게놈 유전자, 또는 그의 단편과 실질적으로 상동일 수 있다. 이 맥락에서 사용된, 용어 "상동의(homologous)"는 표적의 RNA 간섭을 가져오는 표적 RNA 또는 그의 단편에 실질적으로 동일하거나, 충분히 상보적이거나, 또는 유사한 것으로 정의된다. 본래의 RNA 분자에 더하여, 표적 서열의 발현을 억제 또는 간섭하기 위해 적합한 RNA는 RNA 유도체 및 유사체를 포함한다. 바람직하게는, siRNA는 그의 표적 서열과 동일하다.
siRNA는 바람직하게는 오직 하나의 서열을 표적한다. 각각의 RNA 간섭 제제, 예를 들어 siRNA는, 예를 들어, 발현 프로파일링에 의해 잠재적인 오프-타겟 효과에 대해 스크리닝될 수 있다. 그러한 방법은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어, Jackson et al, Nature Biotechnology 6:635-637, 2003에서 설명된다. 발현 프로파일링에 더하여, 또한 서열 데이터베이스에서 유사한 서열에 대한 잠재적 표적 서열을 스크리닝하여 오프-타겟 효과를 가질 수 있는 잠재적 서열을 확인할 수 있다. 예를 들어, Jackson et al. (Id.)에 따르면 서열 동일성의 15개 또는 아마도 11개만큼 적은 연속적인 뉴클레오티드가 비-표적화된 전사물을 침묵하도록 지시하는 데 충분하다. 그러므로, BLAST와 같은 임의의 알려진 서열 비교 방법에 의한 서열 동일성 분석을 사용하여 잠재적 오프-타겟 침묵을 피하기 위해 제안된 siRNA를 초기에 스크리닝할 수 있다.
siRNA 분자는 RNA만을 함유하는 분자에 한정할 필요는 없으나, 예를 들어, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드를 더 포함하고, 또한 리보오스 당 분자가 또 다른 당 분자 또는 유사한 기능을 수행하는 분자로 치환된 분자를 포함한다. 또한, 포스포로티오에이트 결합과 같은, 뉴클레오티드 잔기 간 비-자연 결합이 사용될 수 있다. 예를 들어, RNA에서 발견되는 자연적으로-발생하는 D-리보뉴클레오시드 대신에 D-아라비노푸라노실 구조를 함유하는 siRNA가 본 발명에 따른 RNAi 분자에 사용될 수 있다(미국 특허 번호 제5,177,196호). 다른 예들은 당과 뉴클레오시드의 헤테로시클릭 염기 사이에 o-결합을 함유하는 RNA 분자를 포함하며, 이는 2'-0-메틸 리보오스, 아라비노오스 및 특히 D-아라비노오스를 함유하는 올리고뉴클레오티드와 유사한 올리고뉴클레오티드 분자에 뉴클레아제 내성 및 긴밀한 상보적 가닥 결합을 부여한다(미국 특허 번호 제5,177,196호).
RNA 가닥은 형광단과 같은 리포터 기의 반응성 작용기로 유도체화될 수 있다. 특히 유용한 유도체들은 RNA 가닥의 말단 또는 말단들, 전형적으로 센스 가닥의 3' 말단에서 변형된다. 예를 들어, 3' 말단에서 2'-히드록시기는 다양한 그룹으로 용이하고 선택적으로 유도체화될 수 있다.
다른 유용한 RNA 유도체들은 변형된 탄수화물 모이어티, 예를 들어 2'O-알킬화된 잔기 또는 2'-0-메틸 리보실 유도체 및 2'-0-플루오로 리보실 유도체를 가지는 뉴클레오티드를 포함한다. RNA 염기들은 또한 변형될 수 있다. 표적 서열의 발현을 억제하거나 또는 간섭하는 데 유용한 임의의 변형된 염기가 사용될 수 있다. 예를 들어, 할로겐화된 염기, 예를 들어 5-브로모우라실 및 5-아이오도우라실이 포함될 수 있다. 염기들은 또한 알킬화될 수 있고, 예를 들어, 7-메틸구아노신이 구아노신 잔기 대신에 포함될 수 있다. 성공적인 억제를 산출하는 비-자연 염기들도 포함될 수 있다.
가장 바람직한 siRNA 변형들은 2'-데옥시-2'-플루오로우리딘 또는 잠긴 핵산 (LNA) 뉴클레오티드 및 포스포디에스테르나 다양한 수의 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 RNA 이중가닥(duplexes)을 포함한다. 그러한 변형은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있고, 예를 들어, Braasch et al., Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003에 설명된다. siRNA 분자들에 대해 유용한 변형들의 대부분은 안티센스 올리고뉴클레오티드 기술에 대해 확립된 화학적 성질들을 사용하여 도입될 수 있다. 바람직하게는, 변형들은 최소한의 2'-0-메틸 변형을 수반하며, 바람직하게는 그러한 변형을 배제한다. 변형들은 또한 바람직하게는 siRNA의 유리 5'-히드록시기의 변형을 배제한다.
3'- 또는 5'-말단에, 또는 둘 모두에 공유결합으로 부착된 다양한 "테일(tailes)"을 가지는 siRNA 및 miRNA 분자도 이 기술분야에 알려져 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 전달된 siRNA 및 miRNA 분자를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 말하면, RNA 분자의 3' 또는 5' 말단에 부착된 삽입기(intercalating groups), 다양한 종류의 리포터기 및 친유성기는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 본 발명의 방법에 따라 유용하다. 본 발명에 따라 유용한 변형된 RNA 분자의 제조에 적용 가능한 3'-콜레스테롤 또는 3'-아크리딘 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성에 대한 설명은, 예를 들어, 다음 문헌들에서 찾을 수 있다: Gamper, H. B., Reed, M. W., Cox, T., Virosco, J. S., Adams, A. D., Gall, A., Scholler, J. K., and Meyer, R. B. (1993) Facile Preparation and Exonuclease Stability of 3'-Modified Oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 21 145-150; 및 Reed, M. W., Adams, A. D., Nelson, J. S., and Meyer, R. B.,Jr. (1991) Acridine and Cholesterol-Derivatized Solid Supports for Improved Synthesis of 3'-Modified Oligonucleotides. Bioconjugate Chem. 2 217-225 (1993).
H3K9 메틸트랜스페라제, 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 또는 SETDB1 유전자를 표적하는 데 유용한 다른 siRNA는 쉽게 설계되고 검증될 수 있다. 따라서, 본원에서 설명된 방법에 유용한 siRNA는 길이가 약 15개 내지 약 40개 또는 약 15개 내지 약 28개 뉴클레오티드의 siRNA 분자를 포함하고, 이는 특정 H3K9 메틸트랜스페라제 유전자, 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 또는 SETDB1 유전자에 상동이다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 표적 제제, 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 또는 SETDB1 표적 siRNA 분자는 약 25개 내지 약 29개 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 표적 siRNA, 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 또는 SETDB1 표적 siRNA 분자는 약 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 표적 RNAi, 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 또는 SETDB1 표적 siRNA 분자는 또한 3' 하이드록시기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 표적 siRNA, 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 또는 SETDB1 표적 siRNA 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고; 그러한 분자는 블런트(blunt) 말단이거나 오버행 말단(예를 들어, 5', 3')를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, RNA 분자는 이종 가닥일 수 있고, 블런트 말단이거나 오버행 말단을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제, 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 또는 SETDB1 표적 RNA 분자의 하나 이상의 가닥은 길이가 약 0개 내지 약 6개 뉴클레오티드 (예를 들어, 피리미딘 뉴클레오티드, 퓨린 뉴클레오티드)인 3' 오버행을 가진다. 다른 구체예에서, 3' 오버행은 길이가 약 1개 내지 약 5개 뉴클레오티드, 약 1개 내지 약 3개 뉴클레오티드 및 약 2개 내지 약 4개 뉴클레오티드이다. 일 구체예에서 인간 SUV39h1/2, SETDB1, EHMT1 또는 PRDM2 표적 RNA 분자는 이중 가닥이고 - 한 가닥은 3' 오버행을 가지고 다른 가닥은 블런트-말단이거나 오버행을 가질 수 있다. H3K9 메틸트랜스페라제, 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 SETDB1, EHMT1 또는 PRDM2 RNAi 제제가 이중 가닥이고 두 가닥 모두 오버행을 포함하는 구체예에서, 오버행의 길이는 각 가닥에서 같거나 다를 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 RNA는 쌍을 이루거나 RNA의 두 3' 말단 모두에 약 1개 내지 약 3개, 특히 약 2개, 뉴클레오티드의 오버행을 가지는 약 19, 20, 21, 또는 22개 뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 3' 오버행은 분해에 대해 안정화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, RNA는 퓨린 뉴클레오티드, 예를 들어 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드를 포함하는 것에 의해 안정화된다. 대안적으로, 변형된 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오티드의 치환, 예를 들어, 2'-데옥시티미딘에 의한 우리딘 2 뉴클레오티드 3' 오버행의 치환이 허용되며, RNAi의 효율에 영향을 미치지 않는다. 2' 히드록시기의 부재는 조직 배양 배지에서 오버행의 뉴클레아제 내성을 유의적으로 향상시킨다.
본원에 개시된, H3K9 메틸트랜스페라제 SUV39h1, SUV39h2 및 SETDB1에 대한 siRNA는 마우스 SCNT의 효율을 증가시키기 위해 성공적으로 사용되어왔다. H3K9 메틸트랜스페라제의 유전자 침묵 RNAi, 예를 들어, 발현/유전자 침묵 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2를 억제하는 RNAi 제제가 상업적으로 입수 가능하지 않은 일부 구체예에서, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2 또는 PRDM2의 억제를 표적하는 유전자 침묵 RNAi 제제는 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 본원에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2 mRNA 및/또는 단백질의 발현 및/또는 넉다운의 평가는 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 알려진 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 결정될 수 있다. 다른 것들은 표적 mRNA의 알려진 서열에 기초하여 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제는 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2 mRNA 수준의 어느 하나 이상을 하향조절하거나 감소시키는 유전자 침묵 RNAi 제제이고, 25-nt 헤어핀 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 유전자 침묵 RNAi, 예를 들어, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2 중 어느 하나 이상의 shRNA 서열이다.
일 구체예에서, 본원에 설명된 방법에서 사용된 RNA 간섭 제제는 벡터를 사용하지 않고 정맥 주입, 예를 들어, 유체역학 주입 후 인 비보(in vivo)에서 세포에 의해 능동적으로 흡수되어, RNA 간섭 제제, 예를 들어, 본원의 방법에서 사용된 siRNA의 효율적인 인 비보(in vivo) 전달을 보여준다.
RNA 간섭 제제, 예를 들어, 본 발명의 방법에서 사용된 siRNA 또는 shRNA의 전달을 위한 다른 전략들이 또한 사용될 수 있는데, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, 플리스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터에 의한 전달이다. 그러한 벡터들은, 예를 들어, Xiao-Feng Qin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 183-188에서 설명된 바와 같이 사용될 수 있다. 다른 전달 방법은 RNA 간섭 제제, 예를 들어, 본 발명의 siRNA 또는 shRNA의 전달, RNA 간섭 제제를 염기성 펩티드, 예를 들어 TAT 펩티드의 단편과 컨쥬게이트시키거나 혼합하는 것에 의한 염기성 펩티드를 사용하는 것, 양이온 지질과 혼합하는 것 또는 입자로 제형화하는 것을 포함한다.
상기 한 바와 같이, dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA는 유도성 벡터, 예를 들어 테트라사이클린 유도성 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, pTet-On 벡터 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하는 Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5103-5106에 설명된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 또는 삽입 및 외래 서열에 대해 및 진핵세포로의 도입에 대해 적합한 임의의 다른 적합한 비히클일 수 있다. 벡터는 아고니스트 또는 안타고니스트 핵산 분자의 DNA 서열의 RNA로의 전사를 지시할 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 바이러스 발현 벡터는, 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 엡스테인 바 바이러스- (Epstein Barr virus-), 소유두종바이러스, 아데노바이러스- 및 아데노-연관-기반 벡터 또는 상기 중 임의의 것의 하이브리드 바이러스를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 벡터는 에피솜성(episomal)이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 높은 카피수의 추가 염색체 DNA에서 개체 내 안타고니스트 핵산 분자를 유지시켜 염색체 통합의 잠재적 효과를 제거하는 수단을 제공한다.
본원에 개시된 방법에서 유용한 RNA 간섭 분자 및 핵산 억제제는 임의의 알려진 기술, 예를 들어 파지 DNA 폴리머라제, RNA-의존적 RNA 폴리머라제 및 DNA 기반 벡터를 사용하여, S2 세포로부터 유래된 인 비트로(in vitro) 시스템을 통해, 다이서(Dicer) 단백질 또는 초파리(Drosophila) 배아 용해물에 노출에 의한 긴 이중 가닥 RNA의 가공을 통해, 직접 화학 합성을 사용하여 제조될 수 있다. 세포 용해물 또는 인 비트로 가공의 사용은 짧은, 예를 들어, 약 21-23개 뉴클레오티드, siRNA의 용해물로부터의 후속 분리 등을 더 수반할 수 있다. 화학적 합성은 일반적으로 두 개의 단일 가닥 RNA-올리고머를 만들고, 두 개의 단일 가닥 올리고머를 이중 가닥 RNA로 어닐링하는 것에 의해 진행된다. 다른 예들은 siRNA의 화학적 및 효소적 합성을 교시하는 WO 99/32619 및 WO 01/68836에 개시된 방법들을 포함한다. 또한, 수많은 상업적 서비스가 특정 siRNA를 설계하고 제조하기 위해 이용 가능하다 (예를 들어, QIAGEN Inc., Valencia, CA and AMBION Inc., Austin, TX 참조).
용어 "안티미르(antimir)" "마이크로RNA 억제제" 또는 "miR 억제제"는 동의어이며, 특정 miRNA의 활성을 방해하는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 억제제는 단일 가닥, 이중 가닥 (RNA/RNA 또는 RNA/DNA 이중가닥) 및 헤어핀 디자인을 포함하는 다양한 구성을 채택할 수 있으며, 일반적으로, 마이크로RNA 억제제는 표적화될 miRNA의 성숙 가닥 (또는 가닥들)에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 서열의 하나 이상의 서열 또는 일부를 포함하고, 게다가, miRNA 억제제는 또한 성숙 miRNA의 역 보체(reverse complement)인 서열에 대해 5' 및 3'에 위치한 추가적 서열을 포함한다. 상기 추가적 서열은 성숙 miRNA가 유래된 pri-miRNA에서 성숙 miRNA에 인접한 서열의 역 보체일 수 있고, 또는 추가적 서열은 임의의 서열 (A, G, C, U, 또는 dT의 혼합물을 가짐)일 수 있다. 일부 구체예에서, 추가적 서열의 하나 또는 둘은 헤어핀을 형성할 수 있는 임의의 서열이다. 따라서, 일부 구체예에서, miRNA의 역 보체인 서열은 헤어핀 구조에 의해 5' 쪽과 3' 쪽에 측면에 있다. 마이크로RNA 억제제는, 이중 가닥일 때, 반대 가닥의 뉴클레오티드 사이의 불일치를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제제는 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2 중 어느 하나 또는 조합의 발현을 억제하는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 RNAi 제제이다. 그러한 구체예에서 세포는 변형되어 (예를 들어, 상동 재조합에 의해) 그러한 제제의 증가된 발현을 제공할 수 있으며, 예를 들어, 전체 또는 일부에서, 자연적으로 발생하는 프로모터를 이종 프로모터의 전부 또는 일부로 대체하는 것에 의해, 세포가 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2의 억제제, 예를 들어 단백질 또는 RNAi 제제 (예를 들어 유전자 침묵-RNAi 제제)를 발현하도록 한다. 전형적으로, 이종 프로모터는 상기 제제를 코딩하는 목적하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 방식으로 삽입된다. 예를 들어, Transkaryotic Therapies, Inc.에 의한 PCT 국제공개번호 WO 94/12650, Cell Genesys, Inc.에 의한 PCT 국제공개번호 WO 92/20808, 및 Applied Research Systems에 의한 PCT 국제공개번호 WO 91/09955를 참조하라. 세포는 또한 유도성 조절 요소의 조절 하에 억제제를 포함하는 내인성 유전자를 발현하도록 조작될 수 있으며, 이 경우 내인성 유전자의 조절 서열은 상동 재조합에 의해 대체될 수 있다. 유전자 활성화 기술은 Chappel의 미국 특허번호 제5,272,071호; Sherwin et al.의 미국 특허번호 제5,578,461호; Selden et al.에 의한 PCT/US92/09627 (W093/09222); 및 Skoultchi et al에 의한 PCT/US90/06436 (W091/06667)에 설명된다. 상기 제제는 miRNA를 발현하기 위해 적합한 배양 조건 하에 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 그 결과로 발현된 제제는 그 후 알려진 정제 과정, 예를 들어 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 그러한 배양물로부터 (즉, 배양 배지 또는 세포 추출물로부터) 정제될 수 있다. 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2의 펩티드 또는 핵산 제제 억제제의 정제는 또한 단백질에 결합할 것인 제제를 함유하는 친화성 컬럼; 콘카나발린 A-아가로오스, HEPARIN- TOYOPEARL™ 또는 시바크롬 블루 3GA 세파로오스(Cibacrom blue 3GA Sepharose)와 같은 그러한 친화성 레진을 통한 하나 이상의 컬럼 단계; 페닐 에테르, 부틸 에테르, 또는 프로필 에테르와 같은 그러한 레진을 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수반하는 하나 이상의 단계; 면역친화성 크로마토그래피, 또는 상보적인 cDNA 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2의 핵산 억제제, 예를 들어 (유전자 침묵 RNAi 제제)는 합성적으로 얻을 수 있고, 예를 들어, 통상의 기술자에게 알려진 임의의 합성 방법에 의해 핵산을 화학적으로 합성하는 것에 의할 수 있다. 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2와 같은 H3K9 메틸트랜스페라제의 합성된 핵산 억제제는 그 후 이 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다. 핵산의 화학적 합성 방법은, 이에 한정되지 않으나, 포스포트리에스테르, 포스페이트 또는 포스포르아미디트 화학 및 고체상 기술을 사용하여 또는 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간체를 통한 인 비트로(in vitro) 화학적 합성을 포함한다(Bhongle의 미국 특허번호 제5,705,629호 참조).
예를 들어, 핵산 억제제의 증가된 뉴클레아제 안정성이 요구되는 일부 상황에서, 핵산 유사체 및/또는 변형된 인터뉴클레오시드 결합을 가지는 핵산이 사용될 수 있다. 변형된 인터뉴클레오시드 결합을 함유하는 핵산은 또한 이 기술분야에 잘 알려진 시약 및 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 포스포네이트(phosphonate) 포스포로티오에이트(phosphorodithioate), 포스포르아미데이트 메톡시에틸 포스포르아미데이트(phosphoramidate methoxyethyl phosphoramidate), 포름아세탈(formacetal), 티오포름아세탈(thioformacetal), 디이소프로필실릴(diisopropylsilyl), 아세트아미데이트(acetamidate), 카바메이트(carbamate), 디메틸렌-설파이드 (-CH2-S-CH2), 디이네틸렌-설폭사이드 (-CH2-SO-CH2), 디메틸렌-설폰 (-CH2-S02-CH2), 2'-0-알킬, 및 2'-데옥시-2'-플루오로' 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 (2'-deoxy-2'-fluoro ' phosphorothioate internucleoside) 결합을 함유하는 핵산을 합성하는 방법은 이 기술분야에 잘 알려져 있다 (Uhlmann et al, 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31:335 및 본원에 인용된 참조문헌들 참조). Cook, et al.의 미국 특허번호 제5,614,617호 및 제5,223,618호, Acevedo, et al의 제5,714,606호, Cook, et al.의 제5,378,825호, Buhr, et al.의 제5,672,697호 및 제5,466,786호, Cook, et al.의 제5,777,092호, De Mesmacker, et al.의 제5,602,240호, Cook, et al 의 제5,610,289호 및 Wang 의 제5,858,988호, 또한 향상된 뉴클레아제 안정성 및 세포 흡수를 위한 핵산 유사체를 설명한다.
shRNA 분자를 포함하는 합성 siRNA 분자는 또한 이 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 많은 기술을 사용하여 쉽게 얻을 수 있다. 예를 들어, siRNA 분자는 이 기술분야에 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 적절히 보호된 리보뉴클레오시드 포르포르아미디트 및 통상적인 DNA/RNA 합성제를 사용하여 화학적으로 합성되거나, 재조합적으로 제조될 수 있다(예를 들어, Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411 :494-498; Elbashir, S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15: 188-200; Harborth, J. et al. (2001) J. Cell Science 114:4557-4565; Masters, J.R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017; 및 Tuschl, T. et al. (1999) Genes & Development 13:3191-3197 참조). 대안적으로, 몇몇의 상업적 RNA 합성 공급자가 이용 가능하며, 이에 한정되지 않으나, Proligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL , USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes (Ashland, MA, USA), 및 Cruachem (Glasgow, UK)를 포함한다. 이와 같이, siRNA 분자는 합성하기가 지나치게 어렵지 않으며, RNAi에 적합한 품질로 쉽게 제공된다. 또한, dsRNA는 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 및 렌티바이러스에 의해 코딩되는 줄기 루프 구조로 표현될 수 있다(Paddison, P.J. et al. (2002) Genes Dev. 16:948-958; McManus, M.T. et al. (2002) RNA 8:842-850; Paul, CP. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508; Miyagishi, M. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500; Sui, G. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520; Brummelkamp, T. et al. (2002) Cancer Cell 2:243; Lee, N.S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505; Yu, J.Y., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:6047-6052; Zeng, Y., et al. (2002) Mol. Cell 9: 1327-1333; Rubinson, D.A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406; Stewart, S.A., et al. (2003) RNA 9:493-501). 이들 벡터는 일반적으로 dsRNA의 polIII 프로모터 상류를 가지며, 센스 및 안티센스 RNA 가닥을 개별적으로 및/또는 헤어핀 구조를 발현할 수 있다. 세포 내에서, 다이서(Dicer)는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 효과적인 siRNA로 가공한다.
일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제는, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2 유전자 중 어느 하나를 표적하는 유전자 침묵 siRNA 분자이며, 특정 구체예에서, 개시 코돈의 약 25 내지 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 75개 뉴클레오티드, 또는 약 75 내지 100 뉴클레오티드 하류에서 시작하여 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2의 코딩 mRNA 서열을 표적으로 한다. 본 발명의 siRNA 분자를 설계하는 하나의 방법은 29개 뉴클레오티드 서열 모티프 AA(N29)TT (여기에서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음) (서열번호 50)를 확인하고, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% G/C 함량으로 히트(hit)를 선택하는 것을 수반한다. 서열의 "TT" 부분은 선택사항이다. 대안적으로, 그러한 서열이 발견되지 않는다면, 검색은 모티프 NA(N21)를 사용하여 확장될 수 있고, 여기에서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 이 상황에서, 센스 siRNA의 3' 말단은 TT로 전환되어 센스 및 안티센스 3' 오버행의 서열 조성에 대해 대칭 이중가닥을 생성할 수 있다. 안티센스 siRNA 분자가 그 후 23개 뉴클레오티드 서열 모티프의 뉴클레오티드 1 내지 21 위치의 보체로서 합성될 수 있다. 대칭 3' TT 오버행의 사용은 작은 간섭 리보뉴클레오단백질 입자 (small interfering ribonucleoprotein particles: siRNPs)가 대략 동등한 비율의 센스 및 안티센스 표적 RNA-절단 siRNP로 형성되도록하는 데 유리할 수 있다(Elbashir et al. (2001) supra 및 Elbashir et al. 2001 supra). 이에 한정되지 않으나 NCBI, BLAST, Derwent 및 GenSeq 뿐만 아니라 OLIGOENGINE®과 같은 상업적으로 이용 가능한 올리고합성 소프트웨어를 포함하는, 서열 데이터베이스의 분석은 또한 오직 하나의 유전자를 표적하기 위해 EST 라이브러리에 대한 siRNA 서열을 선택하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 설명된 방법에 유용한 siRNA는 길이가 약 15 내지 약 40개 또는 약 15 내지 약 28개 뉴클레오티드의 siRNA 분자를 포함하며, 이는 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2와 같은 H3K9 메틸트랜스페라제 중 어느 하나와 상동이다. 바람직하게는, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 또는 인간 PRDM2에 대한 표적 siRNA 분자는 약 19 내지 약 25개 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 보다 바람직하게는, 표적 siRNA 분자는 약 19, 20, 21, 또는 22 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 표적 siRNA 분자는 또한 3' 히드록시기를 포함할 수 있다. 표적 siRNA 분자는 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있고; 그러한 분자는 블런트 말단이거나 오버행 말단 (예를 들어, 5', 3')을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, RNA 분자는 이중 가닥이고 블런트 말단이거나 또는 오버행 말단을 포함한다.
일 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 RNAi 표적 RNA 분자의 하나 이상의 가닥은 길이가 약 0 내지 약 6개 뉴클레오티드 (예를 들어, 피리미딘 뉴클레오티드, 퓨린 뉴클레오티드)인 3' 오버행을 가진다. 다른 구체예에서, 3' 오버행은 길이가 약 1 내지 약 5개 뉴클레오티드, 약 1 내지 약 3개 뉴클레오티드 및 약 2 내지 약 4개 뉴클레오티드이다. 일 구체예에서 표적 RNA 분자는 이중 가닥이며 - 한 가닥은 3' 오버행을 가지고 다른 가닥은 블런트-말단이거나 오버행을 가질 수 있다. 표적 RNA 분자가 이중 가닥이고 두 가닥 모두 오버행을 포함하는 구체예에서, 오버행의 길이는 각 가닥에서 같거나 다를 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 RNA는 쌍을 이루거나 RNA의 두 3' 말단 모두에 약 1 내지 약 3개, 특히 약 2개, 뉴클레오티드의 오버행을 가지는 약 19, 20, 21, 또는 22개 뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 3' 오버행은 분해에 대해 안정화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, RNA는 퓨린 뉴클레오티드, 예를 들어 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드를 포함하는 것에 의해 안정화된다. 대안적으로, 변형 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오티드의 치환, 예를 들어, 2'-데옥시티미딘에 의한 우리딘 2 뉴클레오티드 3' 오버행의 치환이 허용되며, RNAi의 효율에 영향을 미치지 않는다. 2' 히드록시기의 부재는 조직 배양 배지에서 오버행의 뉴클레아제 내성을 유의적으로 향상시킨다.
올리고뉴클레오티드 변형
미변형된 올리고뉴클레오티드는 일부 적용에서 최적 이하일 수 있으며, 예를 들어, 미변형된 뉴클레오티드는 예를 들어 세포성 뉴클레아제에 의해 분해를 일으킬 수 있다. 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 그러나, 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 서브유닛에 대한 화학적 변형은 개선된 성질을 부여할 수 있고, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제에 더 안정하게 만들 수 있다.
변형된 핵산 및 뉴클레오티드 대용물은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 비-결합 포스페이트 산소의 하나 또는 둘의, 및/또는 포스포디에스테르 백본 결합에서 결합 포스페이트 산소의 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체, (ii) 리보오스 당의 구성성분의, 예를 들어, 리보오스 당에 2' 히드록시기의 변경, 예를 들어, 대체; (iii) 포스페이트 모이어티의 "데포스포(dephospho)" 링커와의 대량 대체; (iv) 자연적으로 발생한 염기의 비-자연 염기와의 변형 또는 대체; (v) 리보오스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형; (vi) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 말단 인산기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 대한 모이어티, 예를 들어, 형광으로 표지된 모이어티의 접합(conjugation); 및 (vii) 당의 변형 (예를 들어, 6원자 고리).
이 맥락에서 사용된 용어 대체, 변형, 변경 등은 임의의 과정 한정을 암시하지 않으며, 예를 들어, 변형은 참조 또는 자연적으로 발생한 리보핵산으로 시작하여 변형된 리보핵산을 생산하도록 그것을 변형해야 한다는 것을 의미하는 것이 아니라, 자연적으로 발생한 분자와 단순히 차이를 나타내도록 변형되는 것을 의미한다.
올리고뉴클레오티드는 서브유닛 또는 모노머의 중합체이기 때문에, 본원에 설명된 많은 변형들은 올리고뉴클레오티드 내에 반복되는 위치에서 발생할 수 있으며, 예를 들어, 핵염기, 당, 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-브리징(non-bridging) 산소의 변형. 주어진 올리고뉴클레오티드 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 하나 이상의 전술한 변형이 단일 올리고뉴클레오티드 내에 또는 심지어 올리고뉴클레오티드 내의 단일 뉴클레오시드에서 포함될 수 있다.
일부 경우에는 변형은 올리고뉴클레오티드의 모든 대상 위치에서 일어날 수 있으나, 대부분의 경우 사실상 그렇지 않을 것이다. 한 예로서, 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 일어날 수 있고, 내부 영역에서만 일어날 수 있고, 말단 영역 내에서만, 예를 들어 말단 뉴클레오티드의 위치에서 또는 올리고뉴클레오티드의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오티드에서 일어날 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역에서, 단일 가닥 영역에서, 또는 둘 모두에서 일어날 수 있다. 변형은 올리고뉴클레오티드의 이중 가닥 영역에서만 일어나거나 올리고뉴클레오티드의 단일 가닥 영역에서만 일어날 수 있다. 예를 들어, 비-브리징 산소 위치에서 포스포로티오에이트 변형은 하나 또는 둘 모두의 말단에서만 일어날 수 있고, 말단 영역 내에서만, 예를 들어, 말단 뉴클레오티드의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오티드 내에서 일어날 수 있고, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 영역 내, 특히 말단에서 일어날 수 있다. 5' 말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
본원에서 설명된 변형은 유일한 변형이거나, 또는 다수 뉴클레오티드에 포함된 유일한 종류의 변형일 수 있고, 또는 변형은 본원에 설명된 하나 이상의 다른 변형과 조합될 수 있다. 본원에 설명된 변형은 또한 올리고뉴클레오티드 상에 결합될 수 있고, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 서로 다른 뉴클레오티드가 본원에 설명된 서로 다른 변형을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 예를 들어, 안정성을 향상시키는 것, 오버행에 특정 핵염기를 포함시키는 것, 또는 단일 가닥 오버행에, 예를 들어, 5' 또는 3' 오버행에, 또는 둘 모두에 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 대용물을 포함시키는 것이 특히 바람직하며, 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오티드를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서 3' 또는 5' 오버행 내 염기의 모두 또는 일부는, 예를 들어, 본원에 개시된 변형에 의해, 변형될 것이다. 변형은, 예를 들어, 리보오스 당의 2' OH 기에서 변형의 사용, 예를 들어, 리보뉴클레오티드 대신에, 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어, 데옥시티미딘의 사용, 및 인산기의 변형, 예를 들어, 포스포티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동일 필요가 없다.
올리고뉴클레오티드에 특이적 변형
인산기
인산기는 음으로 하전된 종이다. 전하는 두 개의 비-브리징 산소 원자에 균등하게 분배된다. 그러나, 인산기는 산소 중 하나를 다른 치환물로 대체하는 것에 의해 변형될 수 있다. RNA 포스페이트 백본에 대한 이 변형의 결과는 올리고리보뉴클레오티드의 핵산 분해(breakdown)에 대한 증가된 저항성일 수 있다. 따라서, 이론에 구속되기를 바라지는 않으나, 일부 구체예에서 미하전(uncharged) 링커 또는 비대칭적 전하 분포를 갖는 하전된 링커를 초래하는 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
변형된 인산기의 예들은 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트(borano phosphates), 보라노 포스페이트 에스테르(borano phosphate esters), 히드로겐 포스포네이트(hydrogen phosphonates), 포스포로아미데이트(phosphoroamidates), 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 특정 구체예에서, 포스페이트 백본 모이어티에서 비-브리징 포스페이트 산소 원자 중 하나는 하기 중 어느 하나에 의해 대체될 수 있다: S, Se, BR3 (R은 수소, 알킬, 아릴), C (즉 알킬기, 아릴기, 등... ), H, NR2 (R은 수소, 알킬, 아릴), 또는 OR (R은 알킬 또는 아릴). 미변형된 인산기 내의 인 원자는 아키랄(achiral)이다. 그러나, 비-브리징 산소 중 하나를 상기 원자 중 하나 또는 원자의 그룹과 치환하는 것은 인 원자를 키랄성(chiral)으로 만든다; 다시 말하면 이 방식으로 변형된 인산기 내 인 원자는 입체 중심이다. 입체성 인 원자는 "R" 배열 (본원에서 Rp) 또는 "S" 배열 (본원에서 Sp)을 가질 수 있다.
포스포로디티오에이트(Phosphorodithioate)는 두 개의 모든 비-브리징 산소가 황으로 대체되어 있다. 포스포로디티오에이트의 인 중심은 올리고리보뉴클레오티드 부분입체이성질체의 형성을 방해하는 아키랄(achiral)이다. 따라서, 이론에 구속되기를 바라지는 않으나, 키랄 중심을 제거하는 두 개의 모든 비-브리징 산소에 대한 변형, 예를 들어 포스포디티오에이트 형성은 부분입체이성질체 혼합물을 생성할 수 없다는 점에서 바람직할 수 있다. 따라서, 비-브리징 산소는 독립적으로 S, Se, B, C, H, N, 또는 OR (R은 알킬 또는 아릴) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트 링커는 또한 브리징 산소 (즉 포스페이트를 뉴클레오시드에 연결하는 산소)를 질소 (브리지된 포스포로아미데이트(bridged phosphoroamidates)), 황 (브리지된 포스포로티오에이트(bridged phosphorothioates)) 및 탄소 (브리지된 메틸렌포스포네이트(bridged methylenephosphonates))로 대체하는 것에 의해 변형될 수 있다. 대체는 각각의 결합 산소에서 또는 결합 산소 둘 모두에서 일어날 수 있다. 브리징 산소가 뉴클레오시드의 3'-산소일 때, 탄소로 대체가 바람직하다. 브리징 산소가 뉴클레오시드의 5'-산소일 때, 질소로 대체가 바람직하다.
인산기의 대체
인산기는 인을 함유하지 않은 연결기(connector)에 의해 대체될 수 있다. 이론에 구속되기를 바라지는 않으나, 하전된 포스포디에스테르기는 핵산 분해에서 반응 중심이기 때문에, 중성 구조 모방체로의 그의 대체는 향상된 뉴클레아제 안정성을 부여해야 한다고 믿어진다. 또한, 이론에 구속되기를 바라지는 않으나, 일부 구체예에서, 하전된 인산기가 중성 모이어티에 의해 대체되는 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
인산기를 대체할 수 있는 모이어티의 예들은 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate), 히드록실아미노(hydroxylamino), 실록산(siloxane), 카보네이트(carbonate), 카복시메틸(carboxymethyl), 카바메이트(carbamate), 아미드(amide), 티오에테르(thioether), 에틸렌 옥시드 링커(ethylene oxide linker), 설포네이트(sulfonate), 설폰아미드(sulfonamide), 티오포름아세탈(thioformacetal), 포름아세탈(formacetal), 옥심(oxime), 메틸렌이미노(methyleneimino), 메틸렌메틸이미노(methylenemethylimino), 메틸렌히드라조(methylenehydrazo), 메틸렌디메틸히드라조(methylenedimethylhydrazo) 및 메틸렌옥시메틸이미노(methyleneoxymethylimino)를 포함한다. 바람직한 대체물은 메틸렌카보닐아미노(methylenecarbonylamino) 및 메틸렌메틸이미노(methylenemethylimino) 기(group)를 포함한다.
포스페이트에 연결된 하나 이상의 산소가 대체되었거나 인산기가 비-인산성 그룹에 의해 대체된 변형된 포스페이트 결합은 또한 "비-포스포디에스테르 백본 결합"으로 지칭된다.
리보포스페이트 백본의 대체
올리고뉴클레오티드-모방 스캐폴드(oligonucleotide-mimicking scaffold)는 또한 포스페이트 링커 및 리보오스 당이 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대용물에 의해 대체되는 것으로 구성될 수 있다. 이론에 구속되기를 바라지는 않으나, 반복적으로 하전된 백본의 부재가 폴리음이온을 인식하는 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제)에 결합하는 것을 줄이는 것으로 믿어진다. 또한, 이론에 구속되기를 바라지는 않으나, 일부 구체예에서, 염기가 중성 대용물 백본에 의해 연결된 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 예들은 몰포리노, 시클로부틸, 피롤리딘 및 펩티드 핵산 (PNA) 뉴클레오시드 대용물을 포함한다. 바람직한 대용물은 PNA 대용물이다.
당 변형
올리고뉴클레오티드는 핵산의 당 그룹의 전부 또는 일부의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 히드록시기 (OH)는 많은 서로 다른 "옥시" 또는 "데옥시" 치환물로 변형되거나 대체될 수 있다. 이론에 구속되지는 않으나, 히드록시기가 더 이상 탈양자화되어 2'-알콕시드 이온을 형성할 수 없기 때문에 향상된 안정성이 예상된다. 2'-알콕시드는 링커 인 원자에 대한 분자 내 친핵성 공격에 의한 분해를 촉매할 수 있다. 또한, 이론에 구속되기를 바라지는 않으나, 일부 구체예에 대해 2' 위치에서 알콕시드 형성이 가능하지 않은 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
"옥시"-2' 히드록시기 변형의 예들은 알콕시 또는 아릴옥시 (OR, 예를 들어, R = H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 0(CH2CH20)nCH2CH20R; 2' 히드록시기가, 예를 들어, 메틸렌 브리지에 의해, 동일한 리보오스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠긴" 핵산 (LNA); O-AMINE (AMINE = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노) 및 아미노알콕시, 0(CH2)nAMINE, (예를 들어, AMINE = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노)를 포함한다. 메톡시에틸기 (MOE), (OCH2CH20CH3, PEG 유도체)만을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 견고한 포스포로티오에이트 변형으로 변형된 것들에 필적하는 뉴클레아제 안정성을 나타낸다는 것이 주목할 만하다.
"데옥시" 변형은 수소 (즉 부분적으로 dsRNA의 오버행 부분에 특히 관련된 데옥시리보오스 당); 할로 (예를 들어, 플루오로); 아미노 (예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE (AMINE = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노), -NHC(0)R (R = 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당), 시아노; 멀캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 티오알킬; 및 선택적으로, 예를 들어, 아미노 기능성으로 치환될 수 있는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함한다.
당 그룹은 또한 리보오스 내의 상응하는 탄소의 그것과 반대의 입체화학 배열을 소유하는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 당으로서, 예를 들어 아라비노오스를 함유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 모노머는 당의 1' 위치에 알파 결합, 예를 들어, 알파-뉴클레오시드를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 C-1'에 핵염기가 결여된 "무염기(abasic)" 당을 포함할 수 있다. 이들 무염기 당은 또한 하나 이상의 구성 당 원자에 변형을 더 함유하고 있는 것일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 L 형태의 하나 이상의 당, 예를 들어 L-뉴클레오시드를 함유할 수 있다.
바람직한 치환물은 2'-0-Me (2'-0-메틸), 2'-0-MOE (2'-0-메톡시에틸), 2'-F, 2'-0-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-0-NMA), 2'-S-메틸, 2'-0-CH2-(4'-C) (LNA), 2'-0-CH2CH2-(4'-C) (ENA), 2'-0-아미노프로필 (2'-0-AP), 2'-0-디메틸아미노에틸 (2'-0-DMAOE), 2'-0-디메틸아미노프로필 (2'-0-DMAP) 및 2'-0-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-0-DMAEOE)이다.
말단 변형
올리고뉴클레오티드의 3-프라임 (3') 및 5-프라임 (5') 말단은 변형될 수 있다. 그러한 변형은 분자의 3' 말단, 5' 말단 또는 두 말단 모두에서일 수 있다. 그들은 전체 말단 포스페이트의, 또는 인산기의 하나 이상의 원자의 변형 또는 대체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 말단은 표지 모이어티, 예를 들어, 형광단 (예를 들어, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 또는 Cy5 염료) 또는 보호기(예를 들어, 황, 실리콘, 보론 또는 에스테르에 기초함)와 같은 다른 기능성 분자 엔티티에 접합될 수 있다. 기능성 분자 엔티티는 인산기 및/또는 링커를 통해 당에 부착될 수 있다. 링커의 말단 원자는 인산기의 결합 원자 또는 당의 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C 그룹에 연결하거나 대체할 수 있다. 대안적으로, 링커는 뉴클레오티드 대용물 (예를 들어, PNA)의 말단 원자에 연결하거나 대체할 수 있다.
링커/포스페이트-기능성 분자 엔티티-링커/포스페이트 배열이 dsRNA의 두 가닥 사이에 삽입될 때, 이 배열은 헤어핀-유형 RNA 제제에서 헤어핀 RNA 루프를 치환할 수 있다.
조절 활성에 유용한 말단 변형은 포스페이트 또는 포스페이트 유사체로 5' 말단의 변형을 포함한다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서 dsRNA의 안티센스 가닥은 5' 인산화되거나 또는 5' 프라임 말단에 인산 유사체를 포함한다. 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개된 유전자 침묵과 호환되는 것을 포함한다. 5'-말단 말단(5'-terminal end)에서 변형은 또한 개체의 면역 시스템을 자극하거나 억제하는 데 유용할 수 있다. 적합한 변형은: 5'-모노포스페이트 ((HO)2(0)P-0-5'); 5'-디포스페이트 ((HO)2(0)P-0-P(HO)(0)-0-5'); 5'-트리포스페이트 ((HO)2(0)P-0-(HO)(0)P-0-P(HO)(0)-0-5'); 5'-구아노신 캡 (7-메틸화된 또는 비-메틸화된) (7m-G-0-5'-(HO)(0)P-0-(HO)(0)P-0-P(HO)(0)-0-5'); 5'-아데노신 캡 (Appp), 및 임의의 변형된 또는 미변형된 뉴클레오티드 캡 구조 (N-0-5'-(HO)(0)P-0-(HO)(0)P-0-P(HO)(0)-0-5'); 5'-모노티오포스페이트 (포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-0-5'); 5'-모노디티오포스페이트 (포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-0-5'), 5'-포스포로티오레이트 ((HO)2(0)P-S-5'); 산소/황 대체된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트 중 임의의 추가적인 조합 (예를 들어 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-베타-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트 등), 5'-포스포르아미데이트 ((HO)2(0)P-NH-5', (HO)(NH2)(0)P-0-5'), 5'-알킬포스포네이트 (R=알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등, 예를 들어 RP(OH)(0)-0-5'-, (OH)2(0)P-5'-CH2-), 5'-알킬에테르포스포네이트 (R=알킬에테르=메톡시메틸 (MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어 RP(OH)(0)-0-5'-)를 포함한다. 다른 구체예들은 산소/황의 BH3, BH3- 및/또는 Se로의 대체를 포함한다.
말단 변형은 또한 분포를 모니터링하는 데 유용할 수 있으며, 이러한 경우에 첨가될 바람직한 그룹은 형광단, 예를 들어, 플루오르세인 또는 ALEXA® 염료, 예를 들어 ALEXA® 488을 포함한다. 말단 변형은 또한 흡수를 향상시키는 데 유용할 수 있으며, 이에 대한 유용한 변형은 콜레스테롤을 포함한다. 말단 변형은 또한 RNA 제제를 또 다른 모이어티와 가교시키는 데 유용할 수 있으며; 이것에 대해 유용한 변형은 미토마이신 C (mitomycin C)를 포함한다.
핵염기
아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실은 RNA에서 발견되는 가장 흔한 염기이다. 이들 염기들은 개선된 특성을 가지는 RNA를 제공하기 위해 변형되거나 대체될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 내성 올리고리보뉴클레오티드는 그들 염기로 또는 합성 및 자연 핵염기로 (예를 들어, 이노신, 티민, 잔틴, 하이포잔틴, 누불라린, 이소구아니신 또는 투베르시딘) 및 상기 변형의 어느 하나로 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 염기들 및 "보편적 염기들(universal bases)" 중 어느 하나의 치환된 또는 변형된 유사체가 이용될 수 있다. 예들은 2-(할로)아데닌, 2- (알킬)아데닌, 2-(프로필)아데닌, 2 (아미노)아데닌, 2-(아미노알킬)아데닌, 2 (아미노프로필)아데닌, 2 (메틸티오) N6 (이소펜텐일)아데닌, 6 (알킬)아데닌, 6 (메틸)아데닌, 7 (데아자)아데닌, 8 (알케닐)아데닌, 8-(알킬)아데닌, 8 (알키닐)아데닌, 8 (아미노)아데닌, 8-(할로)아데닌, 8- (히드록실)아데닌, 8 (티오알킬)아데닌, 8-(티올)아데닌, N6-(이소펜틸)아데닌, N6 (메틸)아데닌, N6, N6 (디메틸)아데닌, 2-(알킬)구아닌, 2 (프로필)구아닌, 6-(알킬)구아닌, 6 (메틸)구아닌, 7 (알킬)구아닌, 7 (메틸)구아닌, 7 (데아자)구아닌, 8 (알킬)구아닌, 8-(알케닐)구아닌, 8 (알키닐)구아닌, 8-(아미노)구아닌, 8 (할로)구아닌, 8-(히드록실)구아닌, 8 (티오알킬)구아닌, 8-(티올)구아닌, N (메틸)구아닌, 2-(티오)시토신, 3 (데아자) 5 (아자)시토신, 3-(알킬)시토신, 3 (메틸)시토신, 5-(알킬)시토신, 5-(알키닐)시토신, 5 (할로)시토신, 5 (메틸)시토신, 5 (프로필)시토신, 5 (프로피닐)시토신, 5 (트리플루오로메틸)시토신, 6-(아조)시토신, N4 (아세틸)시토신, 3 (3 아미노-3 카복시프로필)우라실, 2-(티오)우라실,5 (메틸) 2 (티오)우라실, 5 (메틸아미노메틸)-2 (티오)우라실, 4-(티오)우라실, 5 (메틸) 4 (티오)우라실, 5 (메틸아미노메틸)-4 (티오)우라실, 5 (메틸) 2,4 (디티오)우라실, 5 (메틸아미노메틸)-2,4 (디티오)우라실, 5 (2-아미노프로필)우라실, 5-(알킬)우라실, 5-(알키닐)우라실, 5-(알릴아미노)우라실, 5 (아미노알릴)우라실, 5 (아미노알킬)우라실, 5 (구아니디늄알킬)우라실, 5 (l,3-디아졸-l-알킬)우라실, 5-(시아노알킬)우라실, 5-(디알킬아미노알킬)우라실, 5 (디메틸아미노알킬)우라실, 5-(할로)우라실, 5-(메톡시)우라실, 우라실-5 옥시아세트산, 5 (메톡시카보닐메틸)-2-(티오)우라실, 5 (메톡시카보닐-메틸)우라실, 5 (프로피닐)우라실, 5 (프로피닐)우라실, 5 (트리플루오로메틸)우라실, 6 (아조)우라실, 디히드로우라실, N3 (메틸)우라실, 5-우라실 (즉, 슈도우라실(pseudouracil)), 2 (티오)슈도우라실, 4 (티오)슈도우라실, 2,4-(디티오)슈도우라실, 5-(알킬)슈도우라실, 5-(메틸)슈도우라실, 5-(알킬)-2-(티오)슈도우라실, 5- (메틸)-2-(티오)슈도우라실, 5-(알킬)-4 (티오)슈도우라실, 5-(메틸)-4 (티오)슈도우라실, 5-(알킬)-2,4 (디티오)슈도우라실, 5-(메틸)-2,4 (디티오)슈도우라실, 1 치환된 슈도우라실, 1 치환된 2(티오)-슈도우라실, 1 치환된 4 (티오)슈도우라실, 1 치환된 2,4-(디티오)슈도우라실, 1 (아미노카보닐에틸렌일)-슈도우라실, 1 (아미노카보닐에틸렌일)-2(티오)- 슈도우라실, 1 (아미노카보닐에틸렌일)-4 (티오)슈도우라실, 1 (아미노카보닐에틸렌일)-2,4- (디티오)슈도우라실, 1 (아미노알킬아미노카보닐에틸렌일)-슈도우라실, 1 (아미노알킬아미노카보닐에틸렌일)-2(티오)-슈도우라실, 1 (아미노알킬아미노카보닐에틸렌일)-4 (티오)슈도우라실, 1 (아미노알킬아미노카보닐에틸렌일)-2,4-(디티오)슈도우라실, 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-l-일, l,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-l-일, l-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-l-일, 7-치환된 l,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-l-일, 7-치환된 l-(아자)-2-(티오)-3- (아자)-페녹사진-l-일, 7-치환된 l,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-l-일, 7-치환된 l-(아자)-2- (티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-(아미노알킬히드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-(아미노알킬히드록시)-l-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-l-일, 7-(아미노알킬히드록시)-l,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-l-일, 7-(아미노알킬히드록시)-l-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-l-일, 7-(구아니디늄알킬히드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-(구아니디늄알킬히드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-l-일, 7-(구아니디늄알킬히드록시)-l,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-(구아니디늄알킬히드록시)-l-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-l-일, l,3,5-(트리아자)-2,6-(디옥사)-나프탈렌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 누불라린, 투베르시딘, 이소구아니신, 이노시닐, 2-아자-이노시닐, 7-데아자-아노시닐, 니트로이미다졸릴, 니트로피라졸릴, 니트로벤지미다졸릴, 니트로인다졸릴, 아미노인돌릴, 피롤로피리미디닐, 3-(메틸)이소카르보스티리릴, 5-(메틸) 이소카르보스티리릴, 3-(메틸)-7-(프로피닐)이소카르보스티리릴, 7-(아자)인돌릴, 6-(메틸)-7-(아자)인돌릴, 이미디조피리디닐, 9-(메틸)-이미디조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이소카르보스티리릴, 7-(프로피닐)이소카르보스티리릴, 프로피닐-7-(아자)인돌릴, 2,4,5-(트리메틸)페닐, 4-(메틸)인돌릴, 4,6-(디메틸)인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸베닐, 테트라세닐, 펜타세닐, 디플루오로톨릴, 4-(플루오로)-6-(메틸)벤즈이미다졸, 4-(메틸)벤즈이미다졸, 6-(아조)티민, 2-피리디논, 5 니트로인돌, 3 니트로피롤, 6-(아자)피리미딘, 2 (아미노)퓨린, 2,6-(디아미노)퓨린, 5 치환된 피리미딘, N2-치환된 퓨린, N6-치환된 퓨린, 06-치환된 퓨린, 치환된 1,2,4-트리아졸, 또는 그의 임의의 O-알킬화된 또는 N-알킬화된 유도체를 포함한다;
추가의 퓨린 및 피리미딘은 미국 특허번호 제3,687,808호에 개시된 것, 이로써 참조에 의해 통합된, Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 개시된 것, 및 Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에 개시된 것을 포함한다.
양이온기
올리고뉴클레오티드에 대한 변형은 또한 하나 이상의 양이온기를 포스페이트의 당, 염기, 및/또는 인 원자 또는 변형된 포스페이트 백본 모이어티에 부착하는 것을 포함할 수 있다. 양이온기는 자연, 비정상 또는 보편적 염기에 치환할 수 있는 임의의 원자에 부착될 수 있다. 바람직한 위치는 혼성화로 방해받지 않는 것, 즉, 염기 쌍형성에 필요한 수소결합 상호작용으로 방해받지 않는 것이다. 양이온기는, 예를 들어 당의 C2' 위치, 또는 고리형 또는 비고리형 당 대용물 내 유사 위치를 통해, 부착될 수 있다. 양이온기는, 예를 들어, O-AMINE (AMINE = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노)로부터 유래된, 양성자화된 아미노기; 아미노알콕시, 예를 들어, 0(CH2)nAMINE, (예를 들어, AMINE = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노); 아미노 (예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); 또는 NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE (AMINE = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노)를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 내에서 대체
일부 변형은 바람직하게는 특정 위치에서, 예를 들어, 가닥의 내부 위치에서 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단상에서 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 상에 변형의 바람직한 위치는, 제제에 바람직한 특성을 부여한다. 예를 들어, 특정 변형의 바람직한 위치는 최적 유전자 침묵 특성, 또는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 활성에 대한 증가된 내성을 부여할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 2'-5' 결합을 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 역 결합, 예를 들어 3'-3', 5'-5', 2'-2' 또는 2'-3' 결합을 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 5'-피리미딘-퓨린-3' (5'-PyPu-3') 디뉴클레오티드를 포함할 수 있고 여기에서 피리미딘은 2'-0-Me (2'-0-메틸), 2'-0-MOE (2'-0-메톡시에틸), 2'-F, 2'-0-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-0-NMA), 2'-S-메틸, 2'-0-CH2-(4'-C) (LNA) 및 2'-0-CH2CH2-(4'-C) (ENA)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 변형으로 변형된다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드에서 서열 모티프 5'-피리미딘-퓨린-3' (5'-PyPu-3') 디뉴클레오티드가 모두 발생하는 5'-대부분의 피리미딘은 2'-0-Me (2'-0-메틸), 2'-0-MOE (2'-0-메톡시에틸), 2'-F, 2'-0- [2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-0-NMA), 2'-S-메틸, 2'-0-CH2-(4'-C) (LNA) 및 2'-0-CH2CH2-(4'-C) (ENA)로 이루어진 군으로부터 선택된 변형으로 변형된다.
이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 우리딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 5'-우리딘-아데닌-3' (5'-UA-3') 디뉴클레오티드, 또는 5'-우리딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 5'-우리딘-구아닌-3' (5'-UG-3') 디뉴클레오티드, 또는 5'-시티딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 말단 5'-시티딘-아데닌-3' (5'-CA-3') 디뉴클레오티드, 또는 5'-우리딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 말단 5'-우리딘- 우리딘-3' (5'-UU-3') 디뉴클레오티드, 또는 5'-시티딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 말단 5'- 시티딘-시티딘-3' (5'-CC-3') 디뉴클레오티드, 또는 5'-시티딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 말단 5'-시티딘-우리딘-3' (5'-CU-3') 디뉴클레오티드, 또는 5'-우리딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 말단 5'-우리딘-시티딘-3' (5'-UC-3') 디뉴클레오티드의 하나 이상을 포함할 수 있다. 이들 변형을 포함하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제 활성에 대해 특히 안정화된다.
일반 참조문헌
이 발명에 따라 사용된 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고리보뉴클레오시드는 고체상 합성으로 합성될 수 있으며, 예를 들어 "Oligonucleotide synthesis, a practical approach", Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984; "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991 (특히 Chapter 1, Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis, Chapter 2, Oligoribonucleotide synthesis, Chapter 3, 2'-0--Methyloligoribonucleotide- s: synthesis and applications, Chapter 4, Phosphorothioate oligonucleotides, Chapter 5, Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates, Chapter 6, Synthesis of oligo-2'-deoxyribonucleoside methylphosphonates, 및. Chapter 7, Oligodeoxynucleotides containing modified bases를 참조하라. 다른 특히 유용한 합성 절차, 시약, 차단기(blocking groups) 및 반응 조건은 Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311 및 Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123- 6194 또는 그들에서 언급된 참조문헌에서 설명된다. WO 00/44895, WO01/75164, 또는 WO02/44321에서 설명된 변형이 본원에서 사용될 수 있다. 본원에 내열된 모든 간행물, 특허, 및 공개된 특허출원의 개시는 여기에 참조에 의해 통합된다.
인산기(phosphate) 참조문헌
포스피네이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 미국 특허번호 제5,508,270호에서 설명된다. 알킬 포스페이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 미국 특허번호 제4,469,863호에 설명된다. 포스포르아미디트 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 미국 특허번호 제5,256,775호 또는 미국 특허번호 제5,366,878에 설명된다. 포스포트리에스테르 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 미국 특허번호 제5,023,243호에 설명된다. 보라노 포스페이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 미국 특허번호 제5,130,302호 및 제5,177,198호에 설명된다. 3'-데옥시-3'-아미노 포스포르아미데이트 올리고리보뉴클레오티드는 미국 특허번호 제5,476,925호에 설명된다. 3'-데옥시-3'-메틸렌포스포네이트 올리고리보뉴클레오티드는 An, H, et al. J. Org. Chem. 2001, 66, 2789-2801에 설명된다. 황 가교된 뉴클레오티드의 제조는 Sproat et al. Nucleosides Nucleotides 1988, 7,651 및 Crosstick et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4693에 설명된다.
당 그룹 참조문헌
2' 변형에 대한 변형은 Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134 및 그들 내의 모든 참조문헌들에서 찾을 수 있다. 리보오스에 대한 특정 변형은 하기 참조문헌들에서 찾을 수 있다: 2'-플루오로 (Kawasaki et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841), 2'-MOE (Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938), "UNA" (Wengel, J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301-310).
인산기의 대체 참조문헌
메틸렌메틸이미노 연결된 올리고리보뉴클레오시드, 본원에서 MMI 연결된 올리고리보뉴클레오시드로도 식별됨, 메틸렌디메틸히드라조 연결된 올리고리보뉴클레오시드, 본원에서 MDH 연결된 올리고리보뉴클레오시드로도 식별됨, 및 메틸렌카르보닐아미노 연결된 올리고뉴클레오시드, 본원에서 아미드-3 연결된 올리고리보뉴클레오시드로도 식별됨, 및 메틸렌아미노카르보닐 연결된 올리고뉴클레오시드, 본원에서 아미드-4 연결된 올리고리보뉴클레오시드로도 식별됨 뿐만 아니라, 예를 들어서, 대체 MMI 및 PO 또는 PS 결합을 가지는 혼합된 백본 화합물은 미국 특허번호 제5,378,825호, 제5,386,023호, 제5,489,677호에서 및 공개된 PCT 출원 PCT/US92/04294 및 PCT/US92/04305 (WO 92/20822 WO 92/20823으로 각각 공개됨)에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 포름아세탈 및 티오포름아세탈 연결된 올리고리보뉴클레오시드는 미국 특허번호 제5,264,562호 및 제5,264,564호에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 에틸렌 옥시드 연결된 올리고리보뉴클레오시드는 미국 특허번호 제5,223,618호에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 실록산 대체물은 Cormier,J.F. et al. Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4583에 설명된다. 카보네이트 대체물은 Tittensor, J.R. J. Chem. Soc. C 1971, 1933에 설명된다. 카복시메틸 대체물은 Edge, M.D. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1991에 설명된다. 카바메이트 대체물은 Stirchak, E.P. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 6129에 설명된다.
포스페이트-리보오스 백본의 대체 참조문헌
시클로부틸 당 대용물 화합물은 미국 특허번호 제5,359,044호에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 피롤리딘 당 대용물은 미국 특허번호 제5,519,134호에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 몰포리노 당 대용물은 미국 특허번호 제5,142,047호 및 제5,235,033호, 및 다른 관련된 특허 개시에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 펩티드 핵산 (PNAs)은 그 자체로 알려져 있고, Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23에 언급된 임의의 다양한 절차에 따라 제조될 수 있다. 그들은 또한 본원에 전체가 참조에 의해 통합된 미국 특허번호 제5,539,083호에 따라 제조될 수 있다.
말단 변형 참조문헌.
말단 변형은 Manoharan, M. et al. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12, 103-128 (2002) 및 그 안에 참조문헌들에 설명된다.
핵염기 참조문헌
N-2 치환된 퓨린 뉴클레오시드 아미디트는 미국 특허번호 제ㄹ,459,255호에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 3-데아자 퓨린 뉴클레오시드 아미디트는 미국 특허번호 제5,457,191호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 5,6-치환된 피리미딘 뉴클레오시드 아미디트는 미국 특허번호 제5,614,617호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 5-프로피닐 피리미딘 뉴클레오시드 아미디트는 미국 특허번호 제5,484,908호에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 추가적인 참조문헌들은 염기 변형에 대한 상기 항목에서 설명된다.
올리고뉴클레오티드 생산
본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물은 용액-상 또는 고체-상 유기 합성을 사용하여 제조될 수 있다. 유기 합성은 비-자연 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 가닥이 쉽게 제조될 수 있는 이점을 제공한다. 이 기술분야에 알려진 그러한 합성에 대한 임의의 다른 수단은 추가적으로 또는 대안적으로 이용될 수 있다. 다른 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하기 위하여 유사한 기술을 사용하는 것도 알려져 있다. 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 화합물은 두-단계 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 먼저, 이중-가닥 분자의 개개의 가닥이 개별적으로 제조된다. 그 후, 구성성분 가닥들이 어닐링된다.
합성 방법에 관계없이, 올리고뉴클레오티드는 제형화에 적합한 용액 (예를 들어, 수성 및/또는 유기 용액)에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 제제를 침전시키고, 순수한 이중-증류수에 재용해시키고, 동결건조시킬 수 있다. 건조된 올리고뉴클레오티드는 그 후 의도된 제형화 공정에 적합한 용액에서 재현탁시킬 수 있다.
특정의 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성에 관한 교시는 하기 미국 특허 또는 계류 중인 특허출원에서 찾을 수 있다: 미국 특허번호 제5,138,045호 및 제5,218,105호, 폴리아민 접합된 올리고뉴클레오티드에 관함; 미국 특허번호 제5,212,295호, 키랄 인산성 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드의 제조를 위한 모노머에 관함; 미국 특허번호 제5,378,825호 및 제5,541,307호, 변형된 백본을 가지는 올리고뉴클레오티드에 관함; 미국 특허번호 제5,386,023호, 백본-변형된 올리고뉴클레오티드 및 환원성 커플링을 통한 그의 제조에 관함; 미국 특허번호 제5,457,191호, 3-데아자퓨린 고리 시스템에 기초한 변형된 핵염기 및 그의 합성 방법에 관함; 미국 특허번호 제5,459,255호, N-2 치환된 퓨린에 기초한 변형된 핵염기에 관함; 미국 특허번호 제5,521,302호, 키랄 인산성 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 방법에 관함; 미국 특허번호 제5,539,082호, 펩티드 핵산에 관함; 미국 특허번호 제5,554,746호, β-락탐 백본을 가지는 올리고뉴클레오티드에 관함; 미국 특허번호 제5,571,902호, 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 방법 및 물질에 관함; 미국 특허번호 제5,578,718호, 알킬티오 그룹을 가지는 뉴클레오시드, 여기에서 그러한 그룹은 뉴클레오시드의 임의의 다양한 위치에 부착된 다른 모이어티에 대한 링커로서 사용될 수 있는 것에 관함; 미국 특허번호 제5,587,361호 및 제5,599,797호, 높은 키랄 순도의 포스포로티오에이트 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드에 관함; 미국 특허번호 제5,506,351호, 2'-0-알킬 구아노신 및 2,6-디아미노퓨린 화합물을 포함하는 관련된 화합물의 제조를 위한 방법에 관함; 미국 특허번호 제5,587,469호, N-2 치환된 퓨린을 가지는 올리고뉴클레오티드에 관함; 미국 특허번호 제5,587,470호, 3-데아자퓨린을 가지는 올리고뉴클레오티드에 관함; 미국 특허번호 제5,223,168호, 및 미국 특허번호 제5,608,046호, 둘 모두 접합된 4'-데스메틸 뉴클레오시드 유사체에 관함; 미국 특허번호 제5,602,240호, 및 제5,610,289호, 백본-변형된 올리고뉴클레오티드 유사체에 관함; 및 미국 특허번호 제6,262,241호, 및 제5,459,255호, 그 중에서도, 2'-플루오로-올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 관함.
RNA 간섭 제제의 전달:
RNAi 제제, 예를 들어, siRNA, 또는 RNAi 제제를 함유하는 벡터를 표적 세포 (예를 들어, 기저 세포 또는 폐 및/또는 호흡기 시스템의 세포 또는 다른 원하는 표적 세포)로 전달하는 방법은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제인 RNAi 제제 (예를 들어, 유전자 침묵-RNAi 제제), 예를 들어 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2 중 어느 하나를 억제하는 RNAi 제제는 에어로졸 수단을 통해, 예를 들어 분무기 등을 사용하여, 개체에 투여될 수 있다. 대안적인 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제인 RNAi 제제 (예를 들어 유전자 침묵-RNAi 제제), 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 SETDB1, EHMT1 및/또는 PRDM2 중 어느 하나의 억제제의 투여는, 예를 들어 (i) RNA 간섭 제제, 예를 들어, siRNA를 함유하는 조성물의 주입, 또는 (ii) 세포 (예를 들어, 공여자 인간 세포, 수용자 난모세포, 또는 SCNT 배아)를 RNAi 제제, 예를 들어, siRNA를 포함하는 조성물과 직접 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포, 난모세포 또는 배아의 투여는 단일 주입에 의해 또는 2회 이상의 주입에 의한 것일 수 있다. 일부 구체예에서, RNAi 제제는 약학적으로 허용 가능한 담체로 전달된다. 하나 이상의 RNAi 제제는 동시에 사용될 수 있으며, 예를 들어 SUV39h1, SUV39h2 SETDB1, EHMT1 및/또는 PRDM2와 같은 하나 이상의 H3K9 메틸트랜스페라제의 유전자 침묵 RNAi 제제 억제제가 함께 투여될 수 있다. RNA 간섭 제제, 예를 들어, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2 중 어느 하나를 억제하기 위한 siRNA는 단독으로, 또는 다른 RNA 간섭 제제, 예를 들어, siRNA, 예를 들어, 다른 세포 유전자에 대한 siRNA와 조합하여 전달될 수 있다.
일부 구체예에서, 특정 세포는 RNA 간섭으로 표적화되어, RNA 간섭의 비-특이적 표적화에 의해 야기되는 RNA 간섭의 잠재적인 부작용을 제한한다. 상기 방법은, 예를 들어, RNAi를 세포로 효과적으로 전달하기 위해 사용된 세포 표적 모이어티 및 RNA 간섭 결합 모이어티를 포함하는 복합체 또는 융합 분자를 사용할 수 있다. 예를 들어, siRNA와 혼합되었을 때 항체-프로타민 융합 단백질은 siRNA에 결합하고 siRNA를 항체에 의해 인식된 항원을 발현하는 세포로 선택적으로 전달하여, 항체에 의해 확인된 항원을 발현하는 그들 세포 내에서만 유전자 발현을 침묵시킨다.
일부 구체예에서, siRNA 또는 RNAi 결합 모이어티는 단백질 또는 단백질의 핵산 결합 도메인 또는 단편이고, 결합 모이어티는 표적 모이어티의 일부에 융합된다. 표적 모이어티의 위치는 구조물의 카르복실-말단 또는 아미노-말단 엔드 내 또는 융합 단백질의 중간 내일 수 있다.
일부 구체예에서, 바이러스-매개 전달 메커니즘은 또한 siRNA, 예를 들어 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2의 siRNA (예를 들어 유전자 침묵 RNAi 제제) 억제제를 Xia, H. et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10): 1006)에 설명된 바와 같이 세포로 인 비트로(in vitro) 전달하기 위해 사용될 수 있다. shRNA의 플라스미드- 또는 바이러스-매개된 전달 메커니즘은 또한 shRNA를 Rubinson, D.A., et al. ((2003) Nat. Genet. 33 :401-406) 및 Stewart, S.A., et al. ((2003) RNA 9:493-501)에 설명된 바와 같이 세포로 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 전달하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 구체예에서, RNAi 제제, 예를 들어, SUV39h1, SUV39h2 SETDB1, EHMT1 및/또는 PRDM2와 같은 H3K9 메틸트랜스페라제의 유전자 침묵-RNAi 제제 억제제는 세포, 난모세포 또는 SCNT 배아를 상기 RNAi 제제 억제제 단독 또는 RNAi 제제를 발현하는 바이러스 벡터와 함께 배양하는 것을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
일반적으로, 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법은 RNAi 간섭 분자에 사용을 위해 조정할 수 있다 (예를 들어, Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5): 139-144; WO94/02595 참조, 이들은 본원에 전체가 참조에 의해 통합됨).
RNA 간섭 분자는 콜레스테롤과 같은 친유성기에 화학적 접합에 의해 변형되어 세포 흡수를 향상시키고 분해를 막을 수 있다. 대안적인 구체예에서, RNAi 분자는 약물 전달 시스템, 예를 들어, 나노입자, 덴드리머, 폴리머, 리포좀 또는 양이온성 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 양으로 하전된 양이온성 전달 시스템은 RNA 간섭 분자 (음으로 하전됨)의 결합을 용이하게 하며, 또한 음으로 하전된 세포막에서 상호작용을 강화시켜 세포에 의한 siRNA의 효율적 흡수를 허용한다. 양이온성 지질, 덴드리머 또는 폴리머는 RNA 간섭 분자에 결합되거나, RNAi 분자를 감싸는 베지클 또는 미셀을 형성 (예를 들어, Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2): 107-1 16 참조)하기 위해 유도된다. 베지클 또는 미셀의 형성은 또한 전신으로 투여되었을 때 RNAi 분자의 분해를 막는다. 양이온성-RNAi 복합체를 제조하고 투여하는 방법은 이 기술분야의 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다 (예를 들어, Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9: 1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25: 197-205 참조, 이는 본원에 전체가 참조에 의해 통합됨).
특정 RNAi 제제의 투여량은 RNA 간섭, 예를 들어, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2의 유전자 침묵에 영향을 미치기에 필요한 양 내에 있을 것이며, 그것에 의하여 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2의 유전자 발현 수준의 감소 및 그 후의 각각의 단백질 발현 수준의 감소를 초래할 것이다.
RNAi 분자가 그들의 표적 서열에 완벽하게 일치할 필요가 없다는 것은 또한 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 그러나, siRNA의 안티센스 (가이드) 가닥의 5' 및 중간 부분은 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2 유전자 중 어느 하나의 표적 핵산 서열과 완벽히 상보적이다.
따라서, 본원에 개시된 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2의 유전자 침묵-RNAi 제제 억제제로 기능하는 RNAi 분자는 예를 들어, 이에 한정되지 않으나, 짧은-시간 RNA (stRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 짧은-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA)를 포함하는 미번형된 및 변형된 이중 가닥 (ds) RNA 분자이다 (예를 들어, Baulcombe, Science 297:2002-2003, 2002 참조). dsRNA 분자, 예를 들어 siRNA는 또한 3' 오버행, 바람직하게는 3'UU 또는 3'TT 오버행을 함유할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 약 30-40개 염기, 약 40-50개 염기, 약 50개 이상의 염기보다 큰 ssRNA를 포함하는 RNA 분자를 포함하지 않는다. 일 구체예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 그들 길이의 약 25% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상에 대해 이중 가닥이다.
일부 구체예에서, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2의 유전자 침묵 RNAi 핵산 억제제는 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2에 결합하고 발현을 억제하는 임의의 제제이며, 여기에서 각각의 메틸트랜스페라제 유전자의 발현이 억제된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2의 억제제는 촉매성 핵산 구조물, 예를 들어, RNA 전사물을 절단할 수 있고 그것에 의하여 야생형 단백질의 생산을 막을 수 있는 리보자임일 수 있다. 리보자임은 리보자임 촉매 부위에 인접한 표적에 상보적인 서열의 2개 영역에 의해 특정 서열에 표적화되거나 어닐링된다. 결합 후, 리보자임은 부위 특이적 방식으로 표적을 절단한다. 본원에 설명된 유전자 산물의 서열을 특이적으로 인식하고 절단하는, 예를 들어, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2과 같은 H3K9 메틸트랜스페라제의 절단을 위한 리보자임의 설계 및 검증은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술에 의한다 (예를 들어 Lleber and Strauss, (1995) Mol Cell Biol 15:540.551, 이것의 개시는 본원에 참조에 의해 통합됨).
H3K9 메틸트랜스페라제의 단백질 및 펩티드 억제제
일부 구체예에서, H3K9 매틸트랜스페라제 억제제는 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2와 같은 H3K9 메틸트랜스페라제 중 어느 하나의 단백질 및/또는 펩티드 억제제이며, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나 변이 단백질; 치료 단백질 및 재조합 단백질 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2뿐만 아니라 우성 음성 억제제 (예를 들어, H3K9 메틸트랜스페라제의 비-기능성 단백질, 또는 경쟁적으로 H3K9 메틸트랜스페라제에 결합하는 H3K9 메틸트랜스페라제의 비-기능성 리간드)이다. 단백질 및 펩티드 억제제는 또한 예를 들어 변이 단백질, 유전적으로 변형된 단백질, 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 인간화된 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 변형된 단백질 및 그의 단편을 포함할 수 있다.
본원에 설명된, 방법에서 H3K9 메틸트랜스페라제, 예를 들어, 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2 유전자 발현의 억제제 및/또는 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2 단백질 기능의 억제로 유용한 제제는, 임의의 유형의 엔티티, 예를 들어 이에 한정되지 않으나 화학약품, 핵산 서열, 핵산 유사체, 단백질, 펩티드 또는 그의 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 제제는, 비제한적으로 합성 및 자연 발생 비-단백질성 엔티티를 포함하는, 임의의 화학적, 엔티티 또는 모이어티이다. 특정 구체예에서 상기 제제는 화학적 모이어티를 가지는 소분자이다.
대안적인 구체예에서, 본원에 개시된 방법에서 유용한 제제는 H3K9 메틸트랜스페라제, 예를 들어 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2의 유전자 발현 또는 기능을 억제하는 단백질 및/또는 펩티드 또는 그의 단편이다. 그러한 제제는, 예를 들어 이에 한정되지 않으나 단백질 변이체, 변이 단백질, 치료 단백질, 절단 단백질 및 단백질 단편을 포함한다. 단백질 제제는 또한 변이 단백질, 유전적으로 조작된 단백질, 펩티드 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 미디바디(midibodies), 미니바디(minibodies), 트리아바디(triabodies), 인간화된 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 변형 단백질 및 그의 단편들을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 억제제 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2로 본원에 개시된 방법에서 유용한 제제는, 비제한적으로 합성 및 자연발생 비-단백질성 엔티티를 포함하는, 화학약품, 소분자, 대형 분자 또는 엔티티 또는 모이어티일 수 있다. 특정 구체예에서 상기 제제는 본원에 개시된 화학 모이어티를 가지는 소분자이다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 H3K9메틸트랜스페라제의 우성 음성 변이체이고, 예를 들어 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2의 비-기능성 변이체는 서열번호 5, 6, 48 및 54-57의 아미노산 중 어느 하나의 연속적인 아미노산의 단편, 예를 들어, 서열번호 5, 6, 48 및 54-57의 약 50개 이상, 또는 약 60개 이상, 또는 약 70개 이상, 또는 약 80개 이상, 또는 약 90개 이상 또는 90개 초과 아미노산의 단편을 포함하는 절단된 또는 우성 음성 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, H3K9 메틸트랜스페라제 단백질, 예를 들어 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2, 인간 SETDB1, 인간 EHMT1 및/또는 인간 PRDM2 단백질의 우성 음성 억제제는 H3K9 메틸트랜스페라제 단백질의 가용성 세포외 도메인이다.
DBC 1 (Deleted Breast Cancer 1) 유전자의 유전자 산물 또는 단백질과 같은 단백질 억제제는 SUV39H1 효소적 도메인에 결합하고 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)에서 히스톤 H3을 메틸화하는 그의 능력을 억제하며 (Lu et al., Inhibition of SUV39H1 Methyltransferase Activity by DBC l, JBC, 2009, 284; 10361-10366), 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 포함된다.
항체
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에서 유용한 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는, 예를 들어, 단클론, 키메라 인간화된, 및 재조합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 중화 항체가 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제로 사용될 수 있다. 항체는 래빗 또는 마우스와 같은 동물에서 항원으로 면역화하는 것에 의해 쉽게 높아진다. 면역화된 마우스는 하이브리도마의 제조를 위해 B 세포의 공급원을 제공하는 데 특히 유용하며, 하이브리도마는 차례로 대량의 단클론 항체를 생산하기 위해 배양된다. 인간 SUV39h1 및/또는 SUV39h2의 상업적으로 입수 가능한 항체 억제제는 본원에서 사용하기 위해 포함되며, 예를 들어, Santa Cruz biotechnology 등으로부터 입수 가능하다.
본 발명의 일 구체예에서, 본원에서 확인된 유전자 산물에 대한 억제제는 항체 분자 또는 항체 분자의 에피토프-결합 모이어티 등일 수 있다. 항체는 넓은 표적 항원 및 합텐(haptens)에 높은 결합 활성 및 고유한 특이성을 제공한다. 본원의 실시에 유용한 단클론 항체는 전체 항체 및 그의 단편을 포함하며, 하이브리도마 합성, 재조합 DNA 기술 및 단백질 합성과 같은 통상적인 기술에 따라 생성된다.
유용한 단클론 항체 및 단편은 임의의 종 (인간을 포함함)으로부터 유래될 수 있고, 하나 이상의 종으로부터의 서열을 이용하는 키메라 단백질로 형성될 수 있다. 인간 단클론 항체 또는 "인간화된" 쥐(murine) 항체 또한 본 발명에 따라 사용된다. 예를 들어, 쥐 단클론 항체는 쥐 Fv 영역 (즉, 항원 결합 부위를 함유함) 또는 그의 상보적 결정 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 불변 도메인 영역 및 Fc 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 유전적으로 재조합하는 것에 의해 "인간화"될 수 있다. 인간화된 표적 모이어티는 숙주 수용자에서 항체 또는 폴리펩티드의 면역반응성을 감소시켜 유럽 특허출원 번호 제0,411,893호 A2에 개시된 것과 유사한 방식으로 반감기의 증가 및 아마 부정적인 면역 반응의 감소를 허용하는 것으로 인식된다. 쥐 단클론 항체는 바람직하게는 인간화된 형태에서 이용되어야 한다. 항원 결합 활성은 항체의 가변 부분 (Fv)의 경쇄 및 중쇄에 (3개씩) 위치한 6개 상보적 결정 영역 (complementarily determining regions: CDRs)의 아미노산의 서열 및 구조에 의해 결정된다. 25-kDa 단일-사슬 Fv (scFv) 분자는, 짧은 펩티드 스페이서 서열을 통해 연결된 경쇄의 가변 영역 (VL) 및 중쇄의 가변 영역 (VH)으로 구성되며, 지금까지 발달된 가장 작은 항체 단편이다. scFv를 위한 유전자를 함유하는 사상파지의 표면에 scFv 분자를 표시하기 위해 기술들이 개발되어 왔다. 넓은 범위의 항원-특이성을 갖는 scFv 분자는 단일 대형 풀의 scFv-파지 라이브러리에 존재할 수 있다. 본 발명의 방법에서 유용한, 높은 친화도 단클론 항체 및 그의 키메라 유도체의 일부 예들은 유럽 특허출원 EP 제186,833호; PCT 특허출원 WO 92/16553; 및 미국 특허번호 제6,090,923호에 설명된다.
키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개 이상의 조각 또는 일부를 특징으로 하는 면역글로불린 분자이다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 영역은 비-인간 포유류 항체, 예를 들어 쥐 단클론 항체로부터 유래되며, 면역글로불린 불변 영역은 인간 면역글로불린 분자로부터 유래된다. 바람직하게는, 두 영역 및 조합은 일상적으로 결정된 낮은 면역원성을 가진다.
scFv 분자의 한 가지 한계는 표적 항원과의 1가 상호작용이다. scFv의 그 표적 항원에 대한 결합을 개선시키는 가장 쉬운 방법 중 하나는 멀티머의 생성을 통한 기능성 친화도를 증가시키는 것이다. 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies)를 형성하기 위한 동일한 scFv 분자의 결합(association)은 다수의 동일한 Fv 모듈을 포함할 수 있다. 이들 시약은 그러므로 다가이나, 단일특이적이다. 각각 서로 다른 부모 Ig로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 포함하는 두 개의 상이한 scFv 분자의 결합은 완전한 기능적 이중특이적 디아바디(diabody)를 형성한다. 이중특이적 scFv의 독특한 적용은 두 개의 (인접한) 표면 에피토프를 통해 동일한 표적 분자에 동시에 두 부위에 결합하는 것이다. 이들 시약은 단일 scFv 또는 Fab 단편에 비해 상당한 결합활성 이점을 얻는다. 다수의 다가 scFv-기반 구조가 조작되어 왔으며, 예를 들어, 미니항체, 이합 미니항체, 미니바디, (scFv)2, 디아바디 및 트리아바디를 포함한다. 이들 분자는 원자가의 범위 (2 내지 4개의 결합 부위), 크기 (50 내지 120 kDa), 유연성 및 생산 용이성을 포괄한다. 단일 사슬 Fv 항체 단편 (scFv)은 VH 및 VL 도메인이 12개 이상의 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 때 우위적으로 단량체이다. 모노머 scFv는 모든 조건 하에서 12 및 25개 아미노산 길이의 링커로 열역학적으로 안정하다. 비공유 디아바디 및 트리아바디 분자는 조작이 쉽고, 단일 scFv 분자의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 연결하는 펩티드 링커를 단축시킴으로써 생산된다. scFv 이합체는 높은 정도의 유연성을 제공하는 양친매성 나선에 의해 연결되며, 미니항체 구조는 이중 나선을 통해 연결된 두 개의 미니항체 (4개 scFv 분자)를 함유하는 이합성 이중특이성 (DiBi) 미니항체를 생성하기 위해 변형될 수 있다. 유전자-융합된 또는 이황화 결합된 scFv 이합체는 중간 정도의 유연성을 제공하며, C-말단 Gly4Cys (서열번호 44) 서열을 추가하는 직접적인 클로닝 기술에 의해 생성된다. scFv-CH3 미니바디는 IgG CH3 도메인에 직접적으로 (LD 미니바디) 또는 매우 유연한 힌지 영역을 통해 (Flex 미니바디) 연결된 두 개의 scFv 분자로 구성된다. 대략 80 kDa의 분자량을 가진, 이들 2가 구조물은 항원과 유의한 결합이 가능하다. Flex 미니바디는 마우스에서 인상적인 종양 위치화를 나타낸다. 이중- 및 삼중-특이적 멀티머는 서로 다른 scFv 분자의 결합(association)에 의해 형성될 수 있다. 기능성 친화도의 증가는 Fab 또는 단일 사슬 Fv 항체 단편 (scFv) 단편이 이합체, 삼중체 또는 더 큰 집합체로 복합화될 때 도달될 수 있다. 1가 scFv 및 Fab 단편에 대한 다가 scFv의 가장 중요한 이점은 표적 항원에 대한 기능성 결합 친화도 (결합활성)의 획득이다. 높은 결합활성은 scFv 멀티머가 별도의 표적 항원에 동시에 결합할 수 있는 것을 요구한다. scFv 단량체와 비교하여 scFv 디아바디에 대한 기능성 친화도의 획득은 중요하며, 두 개 이상 표적 항원에 다중 결합 및 하나의 Fv가 해리될 때 재결합됨으로써 감소된 오프-레이트(off-rates)에서 주로 보인다. 그러한 scFv 분자가 멀티머로 결합할 때, 그들은 단일 표적 항원에 대한 높은 결합활성을 가지거나 또는 서로 다른 표적 항원에 대한 다중 특이성을 가지도록 설계될 수 있다. 항원에 대한 다중 결합은 Fv 모듈에서 올바른 정렬 및 방향에 달려있다. 다가 scFv 표적에서 완전한 결합활성을 위해, 항원 결합 부위는 같은 방향을 향해야 한다. 다중 결합이 입체적으로 가능하지 않은 경우, 기능적 친화도에서 명백한 획득은 확산 속도 및 항원 농도에 의존하는 증가된 재결합의 영향 때문일 수 있다. 그들의 특성을 개선시키는 모이어티와 접합된 항체 또한 본 발명을 위해 고려된다. 예를 들어, 인 비보(in vivo) 반감기를 증가시키는 PEG와의 항체 접합체는 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 면역 라이브러리는 순수 또는 면역화된 동물 또는 환자 유래 가변 항체 단편을 코딩하는 유전자를 PCR 증폭함으로써 제조될 수 있다. 면역글로불린 유전자에 또는 면역글로불린 유전자 패밀리에 특이적인 올리고뉴클레오티드의 조합이 사용된다. 면역글로불린 배아 계통 유전자는 변성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되는 가변 단편의 상보적-결정 영역과 함께 반합성 항체 목록을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이들 단일-플롯 라이브러리는 많은 수의 항원에 대한 항체 단편이 하나의 단일 라이브러리로부터 분리될 수 있다는 이점을 가진다. 파지-디스플레이 기술은, 무작위, 코돈-기반 또는 부위-유도된 돌연변이유발에 의해, 개개의 도메인의 사슬을 순수한 목록 유래 단편의 그것과 셔플링에 의해, 또는 박테리아 돌연변이유전자 균주를 사용하는 것에 의해, 이미 존재하는 항체 단편으로부터 제조된 새로운 라이브러리와 함께, 항체 단편의 친화도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
대안적으로, SCID-hu 마우스, 예를 들어 Genpharm에 의해 발달된 모델이 항체 또는 그의 단편을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 펩타바디(peptabody)라고 하며, 다가 상호작용의 효과를 활용하는 것에 의해 생성되는, 새로운 유형의 높은 결합활성 결합 분자가 고려된다. 짧은 펩티드 리간드는 반경식(semirigid) 힌지 영역을 통해 연골 올리고머 매트릭스 단백질의 꼬인-코일 어셈블리 도메인과 융합되어, 5량체의 다가 결합 분자를 만들었다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 리간드 및/또는 키메라 억제제는, 예를 들어 항-리간드 항체 (Ab) 및 특이적 표적을 향하여 유도된 Ab의 화학적 결합에 의해 제조된 이중특이적 항체를 사용하는 것에 의해 조직- 또는 종양-특이적 표적을 표적화할 수 있다. 화학적 접합체의 한계를 피하기 위해, 항체의 분자 접합체가 세포 표면 분자에서 리간드 및/또는 키메라 억제제를 유도하는 재조합 이중특이성 단일-사슬 Ab의 제조를 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 표적 모이어티에 부착된 2개 이상의 활성 제제 및 또는 억제제가 투여될 수 있고, 여기에서 각 접합체는 표적 모이어티, 예를 들어, 서로 다른 항체를 포함한다. 각 항체는 서로 다른 표적 부위 에피토프 (동일한 또는 상이한 표적 부위 항원에 연관됨)에 반응성이다. 부착된 제제와 함께 서로 다른 항체는 원하는 표적 부위에서 부가적으로 축적된다. 항체-기반 또는 비-항체-기반 표적 모이어티는 표적 부위에 리간드 또는 억제제를 전달하기 위해 이용될 수 있다. 바람직하게는, 조절되지 않은 또는 질병 연관 항원에 대한 천연 결합 제제가 이 목적을 위해 사용된다.
소분자
상기 단락에서 설명된 모든 적용은 본원에 참조에 의해 통합된다. 일부 구체예에서, 이 기술분야의 통상의 기술자는 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제로서 다른 제제를 사용할 수 있으며, 예를 들어 항체, 데코이(decoy) 항체 또는 RNAi가 본원에 개시된 SCNT의 효율을 증가시키는 방법, 화합물 및 키트에서 효과적이다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에 유용한 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제는 본원에 전체가 참조에 의해 통합된 Takahashi et al, 2012, J. Antibiotics 65, 263-265 또는 Shaabam et al, Chemistry & Biology, Volume 14, Issue 3, March 2007, Pages 242-244에 개시된 글리오톡신(gliotoxin) 또는 관련된 에피폴리티오디옥소피페라진(epipolythiodioxopiperazines), 또는 BIS-01294 (디아제핀-퀴나졸린-아민 유도체이다. BIX-01294는 하기 화학 구조를 가진다:
Figure pct00014
UNC0638로도 알려진 퀴나졸린은 또한 G9a를 억제하며, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 포함된다. UNC0638은 하기 구조를 가진다:
Figure pct00015
SUV39h1의 소분자 억제제는 본원에 전체가 참조에 의해 통합된 미국 특허출원 제2015/0038496호에 개시된다. 소분자인 베르티실린 A (verticillin A)는 본원에 전체가 참조에 의해 통합된 미국 출원 제2014/0161785에 개시된 바와 같이 SUV39h1 및 SUV39h2 둘 모두에 대한 선택적 억제제 (즉, SUV39h1/2를 억제함)로 확인되며, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기 위해 포함된다.
SUV39h1의 다른 소분자 억제제는 캐토신 (Chaetocin, 화학명: (3S,3'S,5aR,5aR,10bR,10'bR,11aS,11'aS)-2,2',3,3',5a,5'a,6,6'-옥타히드로-3,3'-비스(히드록시메틸)-2,2'-디메틸-[10b,10'b(11H,11'H)-비3,11a-에피디티오-11aH-피라지노[1',2':1,5]피롤로[2,3-b]인돌]-1,1',4,4'-테트론) (Bernhard et al., FEBS Letts, 2011, 585 (22); 3549-3554 참조)을 포함하며, 이는 하기 화학 구조를 가지고, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 포함된다.
Figure pct00016
화합물 A-366 (CHEMBL3109630로도 지칭함) (PubChem CID: 76285486)은, 21개의 다른 메틸트랜스페라제에 대해 1000배 이상의 선택성을 가지며 IC50이 3.3nM인 G9a로도 알려진 EHMT2 (Euchromatic histone methyltransferase 2)의 강한 억제제인 것으로 발견되었으며(참조: Sweis et al.,. Discovery and development of potent and selective inhibitors of histone methyltransferase G9a. ACS medical Chem Letts, 2014; 5(2); 205-209), 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 포함된다. 소분자 A-366은 하기 구조를 가진다;
Figure pct00017
3-데아자네플라노신 A (3-Deazaneplanocin A: DZNep) (CAS No: 102052-95-9)는 SETDB1 H3K9me3 HMTase의 감소를 야기하고, H3K27me3 및 H3K9me3 모두의 감소된 수준에서 감소를 야기하며 (Lee et al, Biochem Biophys Res Comm, 2013, 438(4); 647-652), 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 포함된다. DZNp는 하기의 화학식을 가진다:
Figure pct00018
HMTase 억제제 IV인 UNC0638 (Calbiochem으로부터 입수 가능함)은 SUV39h2를 미량으로 억제하며 (IC50 >10μΜ) (참조: Vedadi, M., et al. 2011. Nat. Chem. Biol. 7, 566; and Liu, F., et al. 2011. J. Med. Chem. 54, 6139), 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 포함된다. HMTase 억제제 IV는 또한 동의어: 2-시클로헥실-N-(l-이소프로필피페리딘-4-일)-6-메톡시-7-(3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)퀴나졸린-4-아민, DNA 메틸트랜스페라제 억제제 III, DNA MTase 억제제 III, EHMT1/GLP 억제제 II, EHMT2/G9a 억제제 IV로도 알려져 있으며, 하기 화학식을 가진다:
Figure pct00019
SCNT
본 발명의 목적 중 하나는 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 수단 및 인간 SCNT 배아로부터 인간 NT-ESC들의 제조를 제공하는 것이다. 이 개시의 방법은 포유동물을 복제하기 위해서, 전능성 또는 다능성 세포를 얻기 위해서, 또는 인간 세포를 재프로그래밍 하기 위해서 사용될 수 있다.
수용자 인간 난모세포:
특정 구체예에서, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물에서 사용하기 위한 수용자 인간 난모세포는 건강한 인간 공여자 유래일 수 있다. 일부 구체예에서, 냉동보존된 난모세포가 수용자 난모세포로 사용된다. 특정 구체예에서, 수용자 난모세포는 인간이다. 난모세포의 극저온 보존 및 해동은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다 (Tucker et at, Curr Opin Obstet Gynecol. 1995 June; 7(3): 188-92 참조). 일부 구체예에서, 인간 수용자 난모세포는 자발적인 인간 여성 공여자, 예를 들어 난자 공여자, 예를 들어 IVF 클리닉에 대한 난자 공여자로부터 얻는다. 일부 구체예에서, 난모세포는 난소 자극 또는 난소의 과잉자극 (즉 배란 유도 또는 조절된 난소 과자극)을 겪었던 여성 인간 개체로부터 얻는다. 조절된 난소 과자극의 방법은, 예를 들어, 전체가 참조에 의해 본원에 통합된 US 특허 제8,173,592호 및 국제 특허 공개 WO2000/059542에 개시된 바와 같이 이 기술분야에 잘 알려져 있다.
일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포는 제핵 난모세포이다. 공여자 난모세포의 제핵은 본원에 참조에 의해 통합된 미국 특허번호 제4,994,384호에 설명된 바와 같이 알려진 방법에 의해 효과가 있을 수 있다. 예를 들어, 중기 II (MII) 난모세포는, 즉시 제핵을 위해, 선택적으로 7.5 밀리그램 퍼 밀리리터 시토칼라신 B(cytochalaisin B)를 함유하는, HECM에 위치하거나, 또는 적합한 배지, 예를 들어 CR1aa + 10% 발정기 소 혈청에 위치했다가 그 후에 핵을 제거할 수 있다. 제핵은 또한 극체 및 인접한 세포질을 제거하기 위해 미세피펫을 사용하여 미세외과적으로 성취할 수 있다. 세포는 그 다음 성공적으로 제핵된 그것을 확인하기 위해 선별될 수 있다. 이 선별은 HECM에서 1 밀리그램 퍼 밀리리터 33342 Hoechst 염료로 세포를 염색한 다음, 10초 이하 동안 자외선 조사 하에 세포를 시각화하는 것에 의해 효과가 있을 수 있다. 성공적으로 제핵된 세포는 적합한 배양 배지에 둘 수 있다.
일부 구체예에서, 난모세포 재핵을 위한 비-침습적 접근법은, 예를 들어, 자외선으로 조사가 일상적 절차로 사용되는 양서류로부터 난모세포를 제핵하기 위한 절차와 유사하게 사용될 수 있다 (Gurdon Q. J. Microsc. Soc. 101 299-31 1 (I960)). 일부 구체예에서, 인간 난모세포의 난모세포 재핵은 DNA-특이적 형광색소를 사용하여 수행할 수 있으며, 마우스 난모세포의 자외선에의 30초 이상 동안 노출은 세포의 발달 잠재력을 감소시킨다 (Tsunoda ei a/., J. Reprod. Fertil. 82 173 (1988)).
일부 구체예에서, 제핵 인간 난모세포는 감수분열 방추제(spiidle)의 미세소관의 불안정화 (예를 들어, 해중합)를 통하여 감수분열 방추제 장치를 파괴하는 것에 의한 난모세포의 제핵을 지칭하는 "유도된 제핵"을 겪었다 (본원에 전체가 참조에 의해 통합된 미국 특허 출원번호 제2006/0015950호 참조). 미세소관의 불안정화는 염색분체가 분리되는 것을 막으며(예를 들어 성공적 핵분열을 막음), 난모세포 게놈 (예를 들어, 핵 염색질)이 감수분열 성숙 동안 불균일하게 분리되도록 (예를 들어, 비스듬히 움직임) 유도하여, 본질적으로 난모세포의 모든 내인성 염색질을 제2 극체에서 수집한다.
일부 구체예에서, 난모세포 기증은 건강 여성, 예를 들어, 건강한 인간 여성 난모세포 기증자에서 유래한 것이다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기 위한 인간 난모세포는 IVF 절차에서 더 이상 필요하지 않은 인공 수정 병원으로부터 얻은 과잉 난모세포이다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기 위한 인간 난모세포는, 그들의 좋지 못한 품질 때문에, 인 비트로(in vitro) 정자에 의해 성공적으로 수정될 가능성이 낮다는 점에서 좋지 못한 또는 준-최적 품질이다 (예를 들어, 인간 난모세포는 IVF 절차에서 실패할 수 있는 좋지 못한 품질일 수 있다). 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기 위해 선택된 인간 난모세포는 그의 품질에 기초하여 선택되고, 일부 구체예에서, 인 비트로(in vitro) 정자에 의해 (예를 들어, IVF 절차에서) 성공적으로 수정되지 않을 것으로 예상되는 낮은 품질 난모세포가 선택된다. 일부 구체예에서, 높은 내지 중간 품질 난모세포는 인 비트로(in vitro) 정자에 의해 (예를 들어, IVF 절차에서) 성공적으로 수정될 것으로 보이는 것에서 선택된다. 일부 구체예에서, 인 비트로(in vitro)에서 성공적으로 수정되지 않을 것으로 예측되는 폐경 후 인간 여성으로부터 기증된 인간 난모세포가 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기 위해 선택되고 포함된다.
일부 구체예에서, 인간 난모세포 공여자에 대한 필요성을 우회하기 위해, 비-인간 난모세포가 인간 공여자 체세포의 핵 재프로그래밍에 대해 보고된 경우 종간 SCNT가 탐구되었다 (Chung et al, Cloning and Stem Cells 11, 1-11 (2009)). 따라서, 일부 구체예에서, 공여자 난모세포는 비-인간 영장류, 또는 소 난모세포, 또는 사람 공여자 체세포로부터 얻은 핵 또는 핵 유전 물질을 위한 수용자 난모세포가 될 수 있는 임의의 다른 비-인간 포유류 종에서 유래한 것이다.
일부 구체예에서, 인간이 자극되어 난모세포를 생산하고 (예컨대 호르몬적으로) 그들 난모세포가 수확되면, 수집된 난모세포는 상이한 단계에 있을 수 있다. 일부 인간 난모세포는 중기 I (MI)에 있는 반면, 다른 난모세포는 중기 II (MII)에 있다. 그러한 경우에서, 중기 I (MI)에 있는 인간 난모세포는 그들이 중기 II에 도달할 때까지 배양되고 나서 수용자 난모세포의 역할을 하기 위한 제핵을 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 중기 II에 도달하도록 배양된 인간 난모세포는 잠재적인 숙주 세포의 풀을 위해 수확될 때 이미 중기 II에 있는 난모세포와 조합된다. 다른 경우에서, 수확물에서 중기 II에 있는 인간 난모세포만이 제핵을 위해 사용된다. 임의의 이들 인간 난모세포는 추가적인 사용을 위해 냉동될 수 있다. 따라서, 공여자 및/또는 수용자 난모세포는 사용 이전에 냉동보존될 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포는 공여자 인간 체세포가 얻어지는 서로 다른 개체 또는 개인으로부터 얻어진다. 일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포는 hSCNT 배아로부터 유도된 hNT-ESC가 이식될 동일 개체로부터 얻어진다. 예를 들어, 환자-특이적 hNT-ESC들은 hSCNT 배아로부터 얻어질 수 있고, 여기에서 환자-공여자 인간 체세포 유래 핵 유전 물질이 수용자 인간 난모세포로 주입된다.
일부 구체예에서, 난모세포는 미토콘드리아 질병을 가지지 않는 여성 개체로부터 얻어진다. 일부 구체예에서, 난모세포는 미토콘드리아 질병을 가지는 여성 개체로부터 얻어진다. 미토콘드리아 질병은 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 결합에 의해 유전되며, 이는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
일 구체예에서, 수용자 인간 난모세포는 미토콘드리아 DNA 돌연변이, 예를 들어 호모플라즈마성(homoplasmic) 또는 헤테로플라즈마성(heteroplasmic) 미토콘드리아 질병을 가지지 않은 개체로부터의 것일 수 있다. 이것은, 예를 들어, 미토콘드리아 DNA를 평가하는 것에 의한 것과 같은 유전자 분석에 의해 결정될 수 있고, 또는 임상적 평가에 의해 결정될 수 있다. 염색체와 같은 핵 유전 물질은, 미토콘드리아 DNA 질병, 예를 들어 호모플라즈마성 또는 헤테로플라즈마성 미토콘드리아 질병을 가지는 개체, 예를 들어 인간 개체, 유래 공여자 난모세포로부터 분리될 수 있다.
일부 구체예에서, 미토콘드리아 질병은 불임과 연관될 수 있다. 불임과 연관된 미토콘드리아 질병의 예들은 레베르시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy), 근간대성 간질(myoclonic epilepsy), 또는 컨스-세르 증후군(Kearns-Sayre Syndrome)을 포함한다. 그러므로, 일부 예에서, 수용자 영장류 난모세포는 레베르시신경병증, 근간대성 간질, 또는 컨스-세르 증후군을 가지지 않는 개체로부터의 것이다.
다른 예에서, 염색체를 포함하는 핵 유전 물질은 레베르시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy), 근간대성 간질(myoclonic epilepsy), 신경병증, 운동실조 및 색소분비 망막증 증후군(Neuropathy, ataxia and pigmentary retinopathy syndrome), MILS (Maternally inherited Leigh's syndrome), MERRF (Myoclonic epilepsy syndrome with red-ripped fibers), MELAS (Mitochondrial encephalo- myopathy syndrome with lactic acidosis and cerebro-vascular accident episodes), 난청 동반 모계 유전 당뇨(Maternally inherited diabetes with deafness), 미토콘드리아성 뇌근육병증(mitochondrial encephalomyopathy), 만성 진행성 외안근 마비(chronic progressive external opthalmoplegia), 퍼슨 골수-췌장 증후군(Pearson's bone marrow-pancreas syndrome), DIDMOAD (diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy and deafness), 만성 진행성 외안근 마비(chronic progressive external opthalmoplegia) 또는 컨스-세르 증후군(Kearns-Sayre Syndrome)를 가지는 영장류 개체 유래 공여자 인간 난모세포로부터의 것이다. 따라서, 수용자 인간 난모세포는 미토콘드리아 질병, 예를 들어 레베르시신경병증, 근간대성 간질, 신경병증, 운동실조 및 색소분비 망막증 증후군, MILS, MERRF, MELAS, 난청 동반 모계 유전 당뇨, 미토콘드리아성 뇌근육병증, 만성 진행성 외안근 마비, 퍼슨 골수-췌장 증후군, DIDMOAD, 만성 진행성 외안근 마비 및 컨스-세르 증후군을 가지지 않는 개체로부터 분리된다.
레베르시신경병증 (LHON) 또는 레베르 시신경위축은 중심 시력의 급성 또는 아급성 상실을 초래하는 망막 신경절 세포(retinal ganglion cells: RGCs) 및 그 축의 미토콘드리아성 유전 (모계에서 모든 자손) 변성이며; 이는 대개 젊은 성인 남성에 영향을 미친다. 그러나, LHON은 주로 미토콘드리아 (핵이 아님) 게놈의 돌연변이로 인해 어머니를 통해서만 이전되며, 오직 난자만 배아에 미토콘드리아를 기증한다. LHON은 일반적으로 세 가지 병원성 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 점 돌연변이 중 하나에 기인한다. 이들 돌연변이는 미토콘드리아의 산화적 인산화 사슬의 복합체 I의 ND4, ND1 및 ND6 서브유닛 유전자에서 각각 뉴클레오티드 위치 11778 G가 A로, 3460 G가 A로 14484 T가 C로 존재한다. 임상적으로, 처음에는 한 눈에서, 그 후 몇 주 내지 몇 달 후 다른 눈에서 시력 상실이 급성 시작된다. 이것은 전형적으로 매우 심각한 시신경위축과 영구적인 시력 감소로 진행된다.
아급성 뇌사 뇌척수병증(Subacute Necrotizing Encephalomyelopathy: SNEM)으로도 알려진 리 질병(Leigh's disease)은, 중추 신경계에 영향을 미치는 희귀한 신경대사 장애이다. 그것은 일반적으로 3개월 내지 2년 사이의 영아에게 영향을 미치는 유전 장애이나, 드물게는 10대와 성인들도 있다. 이 질병의 경우, 미토콘드리아 DNA (mtDNA)에서 또는 핵 DNA (유전자 SURF 및 일부 COX 어셈블리 인자)에서 돌연변이가 운동 능력의 저하 및 결국 죽음의 원인이 된다. 이 질병은 자신의 움직임을 통제하는 자신의 능력이 저하되는 것으로 가장 주목된다. 그것은 빠르게 진행되기 때문에, 가장 빠른 징후는 좋지 못한 빠는 능력 및 머리 통제 및 운동 능력의 상실일 수 있다. 다른 증상으로는 식욕 상실, 구토, 과민성, 계속적인 울음 (영아에서) 및 발작을 포함한다. 나중 징후는 또한, 호흡기와 신장 기능의 손상을 초래할 수 있는 젖산산증의 사건(episode)일 수 있다. 일부 어린이들은 발달 능력의 상실 또는 발달상 퇴보를 가지는 것이 나타날 수 있고, 종종 잘 자라는 것에 실패한 조사를 가진다. 성인에서 질병이 진행됨에 따라, 전반적인 약화, 신부전 및 심장 질환을 일으킬 수 있다. 며칠간의 급성의 격한 아픔과 장기 생존이 보고되었을지라도 기대 수명은 증상의 시작 약 1년 내이다.
신경병증, 운동실조 및 색소분비 망막증 증후군 (Neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa: NARP)은 주로 신경계에 영향을 미치는 다양한 징후 및 증상을 유발하는 질환이다. 유아 또는 초기 성이기부터 시작하여, NARP를 앓고 있는 대부분의 사람들은 무감각, 따끔거림, 또는 팔 및 다리의 통증 (감각 신경병증); 근육 약화; 및 균형 및 조정의 문제 (운동실조)를 경험한다. 많은 영향을 받은 개인들은 또한 눈 뒤쪽 (망막)을 따라 늘어선 빛-민감성 조직 내 변화에 의해 야기된 시력 상실을 가진다. 일부 경우에서, 시력 손상은 망막염이라고 불리는 상태에서 비롯된다. 이 안구 질병은 망막의 빛-감지 세포가 점차적으로 악화되도록 한다. 신경병증, 운동실조 및 색소분비 망막증 증후군은 미토콘드리아 DNA 내, 특히 MT-ATP6 유전자 내의 돌연변이에 관련된 질환이다.
근신경증 위장 뇌병증(Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy) 또는 MNGIE는 전형적으로 20대 내지 50대 사이에서 나타나는 또 다른 미토콘드리아 질병이다. MNGIE는 안검하수증, 진행성 외안근 마비, 위장 운동장애 (종종 거짓폐쇄), 확산성 백질뇌증, 마른 몸 체형, 말초 신경병증 및 근병증을 유발하는 다중시스템 장애이다.
일부 구체예에서, 여성 개체가 미트콘드리아 DNA (mtDNA) 결함, 또는 mtDNA 내 돌연변이를 갖는다면, 미토콘드리아 전달이 발생할 수 있어서 건강한 미토콘드리아 및 야생형 mtRNA를 갖는 난모세포질이 난모세포질 전달이라고도 불리는 세포질 전달을 통해 수용자 난모세포로 도입되어 헤테로플라즈미 난모세포를 야기할 수 있다 (참조: Sterneckert et al, Nat Reviews Genetics, Genetics 15, 625-639 (2014) and Ma ei al., 2015; Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease, Nature 524, 234-238). 세포질 전달 방법은, 예를 들어, 본원에 전체가 참조에 의해 통합된 미국 특허출원 제2004/0268422호에 설명된 바와 같이, 잘 알려져 있다. 그러한 헤테로플라즈미 난모세포는 그 후 제핵되어 공여자 체세포 유래 핵 유전 물질의 주입을 위한 수용자 난모세포로 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 그 결과로 얻은 SCNT 배아는 3개의 분리된 개인으로부터 유래될 수 있다; 즉, 공여자 체세포 유래 핵 유전 물질, 수용자 난모세포 유래 세포질 및 제3 개인 또는 공여자 개체 유래 야생형 또는 변이 mtDNA를 함유한다).
공여자 인간 세포
본원에 개시된 방법, 키트 및 조성물은 공여자 인간 세포를 포함하며, 그로부터 핵이 수집되고 (수확되고) 제핵 인간 난모세포로 주입되어 인간 SCNT 배아를 생성한다. 일부 구체예에서, 공여자 인간 세포는 최종적으로 분화된 체세포이다. 일부 구체예에서, 공여자 인간 세포는 배아 줄기 세포 또는 성체 줄기 세포 또는 iPS 세포가 아니다. 일부 구체예에서, 공여자 체세포는 남성 인간 개체, 예를 들어, XY 개체로부터 수득된다. 대안적인 구체예에서, 체세포의 공여자는 여성 인간 개체, 예를 들어, XX 개체로부터 수득된다. 일부 구체예에서, 인간 체세포의 공여자는 XXY 인간 개체로부터 수득된다.
본 발명에서 유용한 인간 공여자 체세포는, 예로서, 상피세포, 신경세포, 표피세포, 각질형성세포, 조혈세포, 멜라노사이트, 연골세포, 림프구 (B 및 T 림프구), 다른 면역 세포, 적혈구, 대식세포, 멜라노사이트, 단핵구, 단핵세포, 섬유아세포, 심근세포, 난구세포 및 다른 근육 세포 등을 포함한다. 핵 이식을 위해 사용된 인간 체세포는 다른 기관, 예를 들어, 피부, 폐, 췌장, 간, 위, 장, 심장, 생식 기관, 방광, 신장, 요도 및 다른 비뇨기관 등으로부터 수득될 수 있다. 이들은 단지 적합한 인간 공여자 세포의 일부 예일 뿐이다. 적합한 공여자 세포, 즉, 본 발명에 유용한 세포는, 임의의 세포 또는 몸체의 기관으로부터 수득될 수 있다. 이것은 모든 체세포, 및 일부 구체예에서, 생식 세포, 예를 들어, 원시 생식 세포, 정자 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 공여자 세포 또는 인간 공여자 세포 유래 핵 (즉, 핵 유전 물질)은 활발히 분열, 즉, 비-정지 세포인데, 이는 복제 효능을 향상시키는 것으로 보고되었기 때문이다. 그러한 공여자 체세포는 G1, G2, S 또는 M 세포기에서의 그것을 포함한다. 대안적으로, 정지 세포가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 그러한 인간 공여자 세포는 G1 세포 주기에 있을 것이다. 특정 구체예에서, 적용의 인간 공여자 및/또는 수용자 세포는 2-세포 블록(block)을 겪지 않는다.
일부 구체예에서, 인간 공여자 체세포의 핵 유전 물질 (즉, 핵)은 난구세포, 세르톨리 세포로부터 또는 배아 섬유아세포 또는 성체 섬유아세포로부터 수득된다.
일부 구체예에서, 핵 유전 물질은 유전적으로 변형되어, 예를 들어, 유전 돌연변이 또는 비정상성을 교정하거나, 또는, 예를 들어, 질병 모델에서, 예를 들어, 인간 SCNT 배아로부터 얻은 NT-ESC에서, 유전적 변형의 효과를 연구하기 위해 유전자 변형을 도입한다. 그러한 구체예에서, NT-ESC는 환자-특이적 NT-ESC이고, 이는 치료적 복제를 위해, 및/또는 특정 질병을 연구하기 위해 사용될 수 있고, 여기에서 환자는 특정 질병을 가지거나, 특정 질병으로 발달하는 성향을 가진다. 일부 구체예에서, 인간 공여자 세포의 핵 유전 물질은 유전적으로 변형되어, 예를 들어, 원하는 특징을 공여자 체세포로 도입한다. 체세포를 유전적으로 변형하기 위한 방법은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 포함된다.
일부 구체예에서, 인간 공여자 체세포는 본원에 전체가 참조에 의해 통합된 미국 특허출원 US2004/0025193에 개시된 방법에 따라 선택되며, 이는 원하는 이식유전자를 인간 공여자 체세포로 도입하는 것 및 수용자 난모세포로의 주입을 위한 핵을 얻기 이전에 이식유전자를 가지는 인간 체세포를 선택하는 것을 개시한다.
특정 구체예에서, 인간 공여자 핵 (예를 들어, 공여자 체세포 유래 핵 유전 물질)은 표지될 수 있다. 세포는 녹색 형광 단백질 (Yang, M., et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 1206-1211)과 같은 쉽게 시각화된 단백질을 코딩하는 이식유전자, 또는 그의 유도체 중 하나로 유전적으로 변형될 수 있고, 또는 반디(Photinus pyralis) 루시페라제 유전자 (Flue) (Sweeney, T. J., et al. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 12044-12049)로부터 구성된 이식유전자로 변형될 수 있고, 또는 바다 팬지 (Renilla reniformis) 루시페라제 유전자 (Rluc) (Bhaumik, S., and Ghambhir, S. S., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:377- 382)로부터 구성된 이식유전자로 변형될 수 있다.
공여자 체세포의 핵 유전 물질로 도입된 하나 이상의 이식유전자는 "하우스-키핑 유전자" 프로모터를 사용하여 구성적으로 발현될 수 있어서, 이식유전자(들)이 많은 또는 모든 세포에서 높은 수준으로 발현되거나, 또는 이식유전자(들)이 조직 특이적 및/또는 특이적 발달 단계 특이적 유전자 프로모터를 사용하여 발현될 수 있어서, 오직 특이적 세포 계통 또는 특정 적합한 환경(niche)으로 위치하고 특정 조직 또는 세포 유형으로 발달된 세포만이 이식유전자(들)을 발현하고 시각화된다 (이식유전자가 리포터 유전자인 경우). 추가적인 리포터 이식유전자 또는 표지 시약은, 이에 한정되지 않으나, 형광 단백질 유사체 및 바이오센서를 포함하는 발광 표지된 거대분자, 녹색 형광 단백질 및 그의 돌연변이로 형성된 것을 포함하는 발광 거대분자 키메라, 생리학적 반응, 발광 염색, 염료, 및 기타 소분자와 관련된 세포 항원과 반응하는 발광 표지된 일차 또는 이차 항체를 포함한다. 모자이크 배반포 유래 표지된 세포는 예를 들어 유동세포분석법에 의해 선별되어 복제된 집단을 분리할 수 있다.
일부 구체예에서, 인간 공여자 체세포는 건강한 인간 공여자, 예를 들어, 건강한 인간, 또는 이전부터 존재하던 의학적 질환을 갖는 공여자 (예를 들어, 파킨슨 병 (PD), ALS, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 류마티스 관절염 (RA), 연령 관련 황반변성 (AMD), 당뇨병, 비만, 심장병, 낭포성 섬유증, 자가면역 질병 (예를 들어, MS, Lupus), 신경퇴행성 질병, 유전적 또는 후천성 질병을 갖는 임의의 개체) 또는 존재하는, 기존에 존재하던 또는 진행 중인 상태 또는 질병을 치료하기 위해 재생 치료법 및/또는 줄기 세포 이식이 필요한 임의의 개체로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 공여자 인간 체세포는 미래에 SCNT-유도 인간 ES 세포 (NT-ESC)의 줄기 세포 이식의 수용자가 될 개체로부터 수득되며, 그것에 의하여 환자-특이적 hES 세포의 자가 이식을 가능하게 한다. 따라서, 일부 구체예에서, 방법 및 조성물은 환자-특이적 동종동계 배야 줄기 세포주 (즉, 동종동계 hNT-ESC 계통)의 생산을 가능하게 한다.
따라서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트는 인간 난모세포주를 기능적으로 핵을 제거하고 인간 환자 공여자로부터 수집한 체세포로부터 얻은 핵 유전 물질과 융합함으로써 환자-특이적 인간 줄기 세포주를 얻는 것을 가능하게 하고, 그것에 의하여 환자-특이적 NT-ESC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 hSCNT를 생성한다. 일부 구체예에서, 환자-특이적 hNT-ESC들을 환자에게 투여하는 것에 의한 치료의 방법이 본원에 포함되며, 여기에서, 일부 구체예에서, 환자는 인간 체세포의 공여자이고, 여기에서 핵 유전 물질이 SCNT 절차를 위해 수확된다.
일부 구체예에서, 인간 공여자 체세포 또는 핵 (즉, 핵 유전 물질)은 본원에 개시된 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제로, 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따른 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 또는 인간 SETDB1의 억제제 중 어느 하나로 처리된다. 특정 구체예에서, 공여자 인간 세포 또는 핵은 핵 이식 전에 예비 처리되지 않으며, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNT 배아는 본원에 개시된 방법에 따른 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리된다. 특정 구체예에서, 공여자 세포 또는 핵은 핵 이식 또는 제핵 수용자 난모세포로의 주입을 위한 유전 물질 (또는 핵)의 수집 전 스페르민(spermine), 프로타민(protamine), 또는 푸트레신(putrescine)으로 예비 처리되지 않는다.
공여자 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 인간 SCNT를 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제와 접촉하는 단계.
일부 구체예에서, 인간 공여자 체세포는 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리되거나, 또는 접촉된다. 일부 구체예에서, 공여자 인간 세포의 핵 (또는 핵 유전 물질)은, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리되거나, 또는 접촉된다. 일부 구체예에서, 공여자 인간 세포의 세포질 및/또는 핵은, 본원에 개시된 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제, 예를 들어 인간 SUV39h1, 인간 SUV39h2 및/또는 인간 SETDB1 중 어느 하나 또는 조합의 억제제로 처리되거나, 또는 접촉된다. 일부 구체예에서, 상기 접촉은 공여자 인간 체세포의 세포질 및/또는 핵으로 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제의 미세주입이다.
일부 구체예에서, 공여자 체세포는 인간 SUV39h1 및/또는 인간 SUV39h2, 또는 둘 모두 (SUV39h1/2)의 억제제로, 제핵 인간 공여자 난모세포로 이식을 위한 핵의 제거 전에, 약 24시간 이상, 또는 약 48시간 이상, 또는 약 3일 이상 또는 약 4일 이상 또는 4일 초과로 접촉된다. 일부 구체예에서, SUV39h1 및/또는 SUV39h2, 또는 둘 모두 (SUV39h1/2)의 억제제는 siRNA에 의하며, SUV39h1 및/또는 SUV39h2, 또는 둘 모두 (SUV39h1/2)의 발현의 억제는 수용자 난모세포로의 주입을 위한 핵의 제거 이전에 12시간 이상, 또는 24시간 이상 또는 그 이상의 기간 동안 일어난다. 일부 구체예에서, SUV39h1 및/또는 SUV39h2, 또는 둘 모두 (SUV39h1/2)의 억제는, 공여자 체세포에서, 예를 들어, 제핵 인간 공여자 난모세포로 이식을 위한 핵의 제거 전에 약 24시간 이상, 또는 약 48시간 이상, 또는 약 3일 이상 또는 약 4일 이상 또는 4일 초과로 일어난다. 일부 구체예에서, SUV39h1 및/또는 SUV39h2, 또는 둘 모두 (SUV39h1/2)의 발현을 억제하는 것은 siRNA에 의하며, 핵의 제거 이전 기간에 12시간 이상, 또는 24시간 이상 또는 그 이상 동안 일어난다.
일부 구체예에서, 일부 구체예에서, 인간 난모세포는 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리되거나 또는 접촉된다. 일부 구체예에서, 인간 난모세포는, 예를 들어, 제핵 난모세포의 세포질로의 직접 주입에 의해, H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리되거나, 또는 접촉된 제핵 난모세포이다. 일부 구체예에서, 인간 난모세포 또는 제핵 인간 난모세포는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제, 예를 들어, 이에 한정되지 않으나, 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 구성원, 예를 들어 인간 KDM4A, 인간 KDM4B, 인간 KDM4C, 인간 KDM4D 또는 인간 KDM4E 중 어느 하나 또는 조합을 활성화시키는 제제로 처리되거나 또는 접촉된다. 일부 구체예에서, 제핵 난모세포는 공여자 핵 유전 물질로 주입되지 않았거나, 또는 받지 않았다.
대안적인 구체예에서, 수용자 인간 난모세포는 핵 이식 이전에 (즉, 공여자 핵 유전 물질로 주입되기 이전에) 약 40시간의 기간 내에서 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리될 것이다. 그러한 접촉은 핵 이식 전 약 40시간, 또는 그 이상 바람직하게는 핵 이식 전 약 12 또는 24시간의 기간 내에, 가장 바람직하게는 핵 이식 전 약 4 내지 9시간의 기간 내에서부터 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 수용자 인간 난모세포는 수용자 난모세포가 하이브리드 난모세포일 때 (즉, 공여자 체세포 유래 핵 유전 물질을 포함하나, 아직 활성화되지 않음) H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제와 접촉된다. 그러한 접촉은 핵 이식 후 약 40시간, 또는 그 이상 바람직하게는 핵 이식 후 약 1-4, 또는 4-12의 기간 내에 또는 24시간 내 임의의 시간, 가장 바람직하게는 핵 이식 후 약 1-4 또는 4 내지 9시간의 기간 내에서부터이나 융합 또는 활성화 전에 일어날 수 있다.
수용자 인간 난모세포는 인간 공여자 체세포로부터 얻은 핵 유전 물질의 핵 이식 전, 동시에 또는 후에 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리될 수 있다. 일반적으로, 수용자 인간 난모세포는 핵 이식의 5시간 내에 또는 활성화 또는 융합의 5시간 내에 (예를 들어, 5hpa; 활성화 후 5시간) 처리될 것이다. 일부 구체예에서, 활성화 (또는 융합)를 공여자 체세포 유래 유전 물질을 제핵 난모세포로 주입한 후 1-2 또는 2-4시간 내에 일어나며, 그 경우에, SCNT 배아는 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제와 접촉된다.
일 구체예에서, 인간 SCNT 배아는 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리된다. 인간 SCNT 배아는 공여자 체세포 유래 핵 (예를 들어, 핵 유전 물질)을 제핵 수용자 난모세포로 주입하는 것으로부터 생성되어 "하이브리드 난모세포"를 형성하며, 이는 활성화되어 (또는 융합되어) SCNT 배아를 생성한다. 일부 구체예에서, 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 활성화 이전에 공여자 핵 유전 물질을 포함하는 제핵 난모세포)는 본원에 개시된 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리된다.
SCNT 배아는 공여자 핵 유전 물질을 수용자 난모세포의 세포질과 활성화 (융합으로도 알려짐) 한 후에 생성된다. 일부 구체예에서, 인간 공여자 세포 및/또는 제핵 난모세포 유래 세포질 또는 핵의 각각 또는 모두는 본원에 개시된 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리되었거나 접촉되었다. 일부 구체예에서, 공여자 세포 및/또는 제핵 난모세포 어느 것도 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제 및/또는 KDM4 히스톤 데메틸라제 활성제로 처리되지 않았으며, 이는 하이브리드 난모세포가 처리되거나 및/또는 hSCNT 배아가 처리되었기 때문이다.
일부 구체예에서, 인간 체세포 핵 이식 (hSCNT)의 효율을 증가시키는 것은 인간 SCNT 배아를, 예를 들어, 5hpa 이상, 또는 10-12 hpa 사이에 (즉 1-세포기에), 또는 약 20hpa에 (즉, 초기 2-세포기) 또는 20-28 hpa 사이에 (즉, 2-세포기), (i) 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리 및/또는 (ii) H3K9 메틸트랜스페라제-억제 제제 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, KDM4 유전자, 예를 들어, KDM4A의 외인성 발현은 SCNT 배아에서 5hpa, 10-12 hpa 사이 (즉, 1-세포기에), 약 20hpa에 (즉, 초기 2-세포기) 또는 20-28 hpa 사이 (즉, 2-세포기) 중 어느 하나에서 일어난다. hSCNT 배아가 H3K9me3을 억제하는 제제, 그러한 제제는, 예를 들어, KDM4 유전자, 예를 들어, KDM4A의 외인성 발현을 증가시키는 제제 (예를 들어, KDM4A mRNA 또는 mod-RNA)와 접촉되는 일부 구체예에서, SCNT 배아의 각 세포 (예를 들어, 2-세포 배아 또는 4-세포 배아의 각 세포)가 KDM4A 활성화 또는 과발현 제제로 주입된다. 일부 구체예에서, KDM4 유전자, 예를 들어, KDM4A의 외인성 발현은 인간 SCNT 배아에서 5hpa, 10-12 hpa 사이 (즉, 1-세포기에), 약 20hpa에서 (즉, 초기 2-세포기) 또는 20-28 hpa 사이 (즉, 2-세포기) 또는 그 후(예를 들어, 4-세포기에) 중 어느 하나에서 일어난다. 일부 구체예에서, 인간 SCNT 배아가 H3K9me3을 억제하는 제제, 그러한 제제는, 예를 들어, KDM4 유전자, 예를 들어, KDM4A의 외인성 발현을 증가시키는 제제 (예를 들어, KDM4A mRNA 또는 mod-RNA)와 접촉되는 일부 구체예에서, SCNT 배아의 각 세포 (예를 들어, 2-세포 배아 또는 4-세포 배아의 각 세포)는 KDM4d 활성화 또는 과발현 제제로 주입된다.
핵 이식의 방법
본 발명의 일 목적은 인간 체세포를 보다 효율적으로 복제하는 수단을 제공하는 것이다. 개시의 방법 및 조성물은 인간의 치료적 복제를 위해, 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cells: PSCs) 및 인간 전능성 세포 (human totipotent cells: TSCs)를 수득하기 위해, 및 인간 체세포를 재프로그래밍 하기 위해 사용될 수 있다.
핵 치환 기술 또는 핵 이식 기술은 문헌에 공지된다. 특히, 본원에 전체가 참조에 의해 통합된 Campbell et al, Theriogenology, 43: 181 (1995); Collas et al, Mol. Report Dev., 38:264-267 (1994); Keefer et al, Biol. Reprod., 50:935-939 (1994); Sims et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274, 및 WO 90/03432를 참조하라. 또한, 미국 특허번호 제4,944,384호 및 제5,057,420호는 소 핵 이식을 위한 절차를 설명한다. 또한 Cibelli et al, Science, Vol. 280: 1256-1258 (1998)를 참조하라.
공여자 핵을 수용자 수정된 배아로 이식하는 것은 미세주입 장치로 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 최소의 세포질이 핵으로 이식된다. 최소의 세포질의 이식은 세포 융합 접근법에 의한 이식과 대조적으로 미세주입을 사용하여 핵이 이식될 때 달성할 수 있다. 일 구체예에서, 미세주입 장치는 피에조 단위(piezo unit)를 포함한다. 전형적으로 피에조 단위는 바늘에 진동을 부여하기 위해 바늘에 작동 가능하게 부착된다. 그러나, 바늘에 진동을 부여할 수 있는 피에조 유닛의 임의의 배열이 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 특정 예에서, 피에조 유닛은 바늘을 대상물질로 통과시키는 것을 보조할 수 있다. 특정 구체예에서, 피에조 유닛은 최소의 세포질을 핵으로 이식하기 위해 사용될 수 있다. 상기 목적에 적합한 임의의 피에조 유닛이 사용될 수 있다. 특정 구체예에서 피에조 유닛은 피에조 마이크로조작기 제어기 PMM150 (PrimeTech, Japan)이다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 공여자 핵을 제핵 난모세포와 융합하는 단계를 포함한다. 세포질체의 핵과의 융합은 폴리에틸렌 글리콜 (Pontecorvo "Polyethylene Glycol (PEG) in the Production of Mammalian Somatic Cell Hybrids" Cytogenet Cell Genet. 16(1-5):399-400 (1976) 참조, 핵의 직접 주입, 센다이(Sendai) 바이러스-매개 융합 (미국 특허번호 제4,664,097호 및 Graham Wistar Inst. Symp. Monogr. 9 19 (1969) 참조), 또는 전기세포융합과 같은 이 기술분야에 알려진 기타 기술을 포함하는 이 기술분야에 알려진 많은 기술을 사용하여 수행된다. 세포의 전기세포융합은 세포를 함께 매우 근접하게 가져오고 그들을 교류 전기장에 노출시키는 것을 수반한다. 적절한 조건 하에, 세포가 함께 밀려나고 세포막이 융합된 다음 융합 세포(fusate cells) 또는 하이브리드 세포가 형성된다. 세포의 전기세포융합 및 이를 수행하기 위한 장치가, 예를 들어, 미국 특허번호 제4,441,972호, 제4,578,168호 및 제5,283,194호, 국제특허출원번호 PCT/AU92/00473 [WO 1993/05166로 공개됨], Pohl, "Dielectrophoresis", Cambridge University Press, 1978 and Zimmerman et al., Biochimica et Bioplzysica Acta 641: 160- 165, 1981에 설명된다.
SCNT의 방법, 및 공여자 핵 유전 물질을 수용자 난모세포의 세포질과의 활성화 (즉 융합)는 본원에 전체로서 참조에 의해 통합된 미국 출원 제2004/0148648호에 개시된다.
난모세포 수집.
난모세포 기증자는 이전에 설명된 바와 같이 동기화되고 과잉 배란될 수 있고 (Gavin W.G., 1996), 48시간 간격으로 정관수술 받은 남성과 교배된다. 수집 후, 난모세포를 2 mM L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (10,000 I.U. each/ml)으로 보충된 10% FBS로 평형화된 M199에서 배양되었다. 핵 이식은 또한 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro)에서 성숙되었을 수 있는 난모세포를 이용할 수 있다. 인 비보(in vivo)에서 성숙된 난모세포는 상기 설명된 바와 같이 유도되고, 인 비트로(in vitro)에서 성숙된 난모세포는 핵 이식에 사용하기 위해 수확되기 전에 특정 세포기로 인 비트로(in vitro)에서 발달되도록 한다.
세포질체 준비 및 제핵.
부착된 난구세포를 갖는 난모세포는 전형적으로 폐기된다. 난구-프리 난모세포는 두 개의 그룹으로 나누었다: 정지된 중기-II (한 개의 극체) 및 말기-II 프로토콜 (극체가 분명히 보이지 않거나 부분적으로 돌출된 제2 극체가 있음). 정지된 중기-II 프로토콜에서 난모세포는 먼저 핵이 제거된다. 활성화된 말기-II 프로토콜에 할당된 난모세포는 M199/10% FBS에서 2 내지 4시간 동안 배양함으로써 준비되었다. 이 기간 후에, 모든 활성화된 난모세포는 (부분적으로 돌출된 제2 극체의 존재) 배양-유도된, 칼슘-활성화된 말기-II 난모세포 (말기-II-Ca) 및 제핵된 것으로 분류되었다. 배양 기간 동안 활성화되지 않은 난모세포는 그 후 활성화를 유도하기 위해 7% 에탄올을 함유하는 M199, 10% FBS에서 5분 인큐베이션된 다음, 말기-II에 도달하기 위해 추가적인 3시간 동안 10% FBS와 함께 M199에서 배양하였다 (말기-II-EtOH 프로토콜). 모든 난모세포는 제핵 15 내지 30분 이전에 시토칼라신-B (cytochalasin-B)로 처리된다. 중기-II 단계 난모세포는 중기판을 제거하기 위해 제1 극체 및 극체를 둘러싸는 인접 세포질(세포질의 -30%)을 흡입함으로써 유리 피펫으로 핵을 제거하였다. 말기-II-Ca 및 말기-II-EtOH 난모세포는 제1 극체 및 부분적으로 돌출된 제2 극체를 함유하는 둘러싸는 세포질 (세포질의 10 내지 30%)을 제거함으로써 핵이 제거된다. 제핵 후, 모든 난모세포는 즉시 재구성되었다.
핵 이식 및 재구성
공여자 세포 주입은 난모세포 제핵을 위해 사용된 동일한 배지에서 수행되었다. 하나의 공여자 세포를 유리 피펫을 사용하여 투명대와 난모세포질막 사이에 위치시켰다. 세포-난모세포 커플렛(couplets)을 전기융합 및 활성화 절차 전 30 내지 60분 동안 M199에서 인큐베이션 하였다. 재구성된 난모세포는 융합 버퍼 (300 mM 만니톨, 0.05 mM CaCl2, 0.1 mM MgSO4, 1 mM K2HPO4, 0.1 mM 글루타티온, 0.1 mg/ml BSA)에서 2분 동안 평형화하였다. 전기세포융합 및 활성화는 실온에서, 융합 배지로 채워진 "융합 슬라이드" (500 μm 간격; BTX-Genetronics, San Diego, Calif.)을 만든 2개의 스테인리스 강철 전극을 갖는 융합 챔버에서 수행하였다.
융합 (예를 들어, 활성화)은 융합 슬라이드를 사용하여 수행된다. 융합 슬라이드를 융합 디쉬에 넣고, 디쉬는 융합 슬라이드의 전극을 덮기에 충분한 양의 융합 버퍼로 잠기도록 하였다. 커플렛은 배양 인큐베이터로부터 제거하였고, 융합 버퍼를 통해 세척하였다. 입체현미경을 사용하여, 커플렛을 두 전극 사이에 등거리로 배치하고, 핵체/세포질체 접합부를 전극에 평행하게 두었다. 활성화 및 융합을 촉진하기 위해 커플렛에 적용된 전압 범위는 1.0 kV/cm 내지 10.0 kV/cm일 수 있음에 유의해야 한다. 바람직하게는 그러나, 초기 단일 동시 융합 및 활성화 전기 펄스는 2.0 내지 3.0 kV/cm의 전압 범위, 가장 바람직하게는 2.5 kV/cm에서, 바람직하게는 20 μsec 이상 동안 지속한다. 이것은 BTX ECM 2001 Electrocell Manipulator를 사용하여 세포 커플렛에 적용된다. 미세펄스의 지속은 10 내지 80 μsec에서 다양할 수 있다. 그 과정 이후, 처리된 커플렛은 전형적으로 신선한 융합 버퍼 한 방울로 이식된다. 융합 처리된 커플렛은 평형화된 SOF/FBS를 통해 세척한 다음, 시토칼라신-B (cytochalasin-B)가 있거나 없는 평형화된 SOF/FBS로 이식되었다. 시토칼라신-B가 사용되는 경우 그 농도는 1 내지 15 μg/ml에서 다양할 수 있고, 가장 바람직하게는 5 μg/ml일 수 있다. 커플렛은 37-39℃에서 공기에 대략 5% CO2를 함유하는 습한 가스 챔버에서 인큐베이션 되었다. 만니톨은 현재 개시에서 제공된 임의의 프로토콜 전체에 걸쳐 시토칼라신-B 대신에 사용될 수 있음을 유의해야 한다 (Ca+2 및 BSA를 갖는 HEPES-완충된 만니톨 (0.3 mm) 기초 배지). 융합 후 10 내지 90분 사이에, 가장 바람직하게는 융합 후 30분에 시작하여, 실제 핵체/세포질체 융합의 존재가, 추후 이식 또는 핵 이식의 추가 라운드에서의 사용을 위한 형질유전 배아의 발달을 위해, 결정된다.
시클로헥시미드 처리 후, 커플렛은 0.1% 소 혈청 알부민, 바람직하게는 0.7% 이상, 바람직하게는 0.8% 이상, 및 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 평형화된 SOF 배지로 광범위하게 세척된다 (SOF/BSA). 커플렛은 평형화된 SOF/BSA로 이식되었고, 24-48시간 동안 37-39℃에서 대략 6% O2, 5% CO2 잔여 질소를 함유하는 습윤 모듈식 인큐베이션 챔버에서 방해되지 않은 상태로 배양하였다. 나이가 적절한 발달 (24 내지 48시간에서 1-세포부터 8-세포까지)을 갖는 핵 이식 배아는 대리의 동기화된 수용자에게 전달되었다.
핵 이식 배아 배양 및 수용자로 이식
SCNT 배아의 배양
hSCNT에 의해 유도된 배아는 배아가 일반적으로 배양되는 것 (적어도 인 비보(in vivo)) 이외의 인 비보(in vivo)에서 배양 조건으로부터 이익을 얻거나, 심지어 요구할 수 있다는 점이 시사되었다. 소 배아의 일상적인 증식에서, 재구성된 배아들 (그들 중 많은 것들을 한꺼번에)은 양 난관에서 5 내지 6일 동안 배양되었다 (Willadsen, In Mammalian Egg Transfer (Adams, E. E., ed.) 185 CRC Press, Boca Raton, Fla. (1982)에 의해 설명된 바와 같음). 특정 구체예에서, SCNT 배아는 이식 전에 한천과 같은 보호 배지에 박아 넣어진 다음 일시적인 수용자로부터 회수 후 한천으로부터 절개될 수 있다. 보호 한천 또는 다른 배지의 기능은 두 가지이다: 첫째, 그것은 투명대를 함께 유지함으로써 SCNT 배아의 구조적 원조 역할을 하며; 둘째로 그것은 수용자 동물의 면역 시스템의 세포에 장벽 역할을 한다. 이 접근법은 배반포를 형성하는 배아의 비율을 증가시키지만, 많은 배아가 손실될 수 있다는 단점이 있다. 일부 구체예에서, hSCNT 배아는 피더 세포, 예를 들어, 1차 염소 난관 상피 세포의 단층 상에 50 μl 작은 방울로 공동-배양될 수 있다. 배아 배양은 5% CO2를 갖는 가습된 39℃ 인큐베이터에서 hSCNT 배아의 이식이 hNT-ESC의 생성을 위한 할구의 수집을 위해 사용되기 전 48시간 동안 유지될 수 있다.
적용
전능성 세포 (TPC)의 수득.
SCMT 실험은 성체 분화된 체세포 유래 핵이 전능성 상태로 재프로그래밍될 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 본원에 설명된 방법을 사용하여 생성된 hSCNT 배아는 전능성 도는 배아 줄기 세포 또는 줄기-유사 세포 및 세포 콜로니의 생성을 위한 적합한 인 비트로(in vitro) 배양 배지에서 배양될 수 있다. 배아의 배양 및 성숙에 적합한 배양 배지는 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 소 배아 배양 및 유지를 위해 사용될 수 있는 알려진 배지의 예들은, Ham's F-10+10% 태아 송아지 혈청(fetal calf serum: FCS), 조직 배양 배지(Tissue Culture Medium-199: TCM-199)+10% 태아 송아지 혈청, 티로드-알부민-락테이트-피루베이트 (Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate: TALP), 둘베코 인산염완충식염수 (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline: PBS), 이글 및 휘튼 배지(Eagle's and Whitten's media)를 포함한다. 난모세포의 수집 및 성숙에 사용된 가장 흔한 배지 중 하나는 TCM-199, 및 태아 송아지 혈청, 신생 혈청(newborn serum), 발정기 소 혈청(estrual cow serum), 어린 양 혈청 또는 수송아지 혈청을 포함하는 1 내지 20% 혈청 보충물이다. 바람직한 유지 배지는 얼 염(Earl salts), 10% 태아 송아지 혈청, 0.2 Ma 피루베이트 및 50 ug/ml 겐타마이신 설페이트를 함유한 TCM-199를 포함한다. 상기 중 임의의 것은 또한 과립막 세포, 난관세포, BRL 세포 및 자궁세포 및 STO 세포와 같은 다양한 세포 유형과 공동-배양을 수반할 수 있다.
특히, 자궁 내막의 인간 상피 세포는 이식 전 및 이식 기간 동안 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor: LIF)를 분비한다. 그러므로, 일 구체예에서, LIF의 배양 배지에 첨가는 hSCNT-유도 배아의 인 비트로(in vitro) 발달을 향상시키기는 것에 포함된다. 배아 또는 줄기-유사 세포 배양을 위한 LIF의 사용은 본원에 참조에 의해 통합된 미국 특허번호 제5,712,156호에 설명되어있다.
또 다른 유지 배지는 본원에 참조에 의해 통합된 Rosenkrans, Jr. et al.의 미국 특허번호 제5,096,822호에 설명된다. CR1로 명명된 이 배아 배지는 배아를 지지하기 위해 필요한 영양 물질을 함유한다. CR1은 헤미칼슘 L-락테이트를 1.0 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 1.0 mM 내지 5.0 mM의 범위의 양으로 함유한다. 헤미칼슘 L-락테이트는 헤미칼슘염이 포함된 L-락테이트이다. 또한, Thomson et al., Science, 282: 1145-1147 (1998) 및 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7844-7848 (1995)에서 논의된 바와 같은 배양에서 인간 배아 줄기 세포를 유지하기 위한 적절한 배양 배지.
일부 구체예에서, 피더 세포는 마우스 배아 섬유아세포를 포함할 것이다. 적합한 섬유아세포 피더 층의 제조를 위한 수단은 하기 실시예에 설명되고, 통상의 기술자의 기술 범위 내에 있다.
배반포-단계 인간 SCNT 배아들 (또는 그의 균등물)로부터 인간 ES 세포들 (예를 들어, 인간 NT-ESC들 또는 hNT-ESC들)을 유도하는 방법은 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 그러한 기술은 인간 SCNT 배아들로부터 인간 ES 세포들 (예를 들어, hNT-ESC들)을 유도하기 위해 사용될 수 있고, 여기에서 hNT-ESC들을 생성하기 위해 사용된 hSCNT 배아들은, KDM4 데메틸라제 패밀리의 구성원 및/또는 히스톤 메틸트랜스페라제 SUV39h1/SUV39h2의 억제제로 처리되지 않은 hSCNT들과 비교하여, 인간 공여자 체세포로부터 기증된 핵 유전 물질에서 H3K9me3의 감소된 수준을 가진다. 추가적으로 또는 대안적으로, hNT-ESC들은 발달의 더 이른 단계 동안 복제된 인간 SCNT 배아들로부터 유도될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트를 사용하여 생성된 인간 SCNT 배아로부터 생성된 할구는 유리 피펫을 사용하여 해리되어 전능성 세포를 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, 해리는 0.25% 트립신의 존재에서 일어날 수 있다(Collas and Robl, 43 BIOL. REPROD. 877-84, 1992; Stice and Robl, 39 BIOL. REPROD. 657-664, 1988; Kanka et al., 43 MOL. REPROD. DEV. 135-44, 1996).
특정 구체예에서, hSCNT 배아로부터 결과로 얻은 할구 또는 할구-유사 클러스터는 배아 줄기 세포주, 예를 들어, 핵 이식 ESC (nuclear transfer ESC: ntESC) 세포주를 얻기 위해 사용될 수 있다. 그러한 계통은, 예를 들어, 본원에 그 전체가 참조에 의해 통합된 Thomson et al., Science, 282: 1 145-1 147 (1998) 및 Thomson et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7544-7848 (1995)에 의해 보고된 배양 방법에 따라 수득될 수 있다.
다능성 배아 줄기 세포는 또한 출생으로의 배아의 정상적 발달을 방해하지 않고 hSCNT 배아로부터 제거된 단일 할구로부터 생성될 수 있다. 미국 출원번호 제60/624,827호, 2004년 11월 4일 출원됨; 제60/662,489호, 2005년 3월 14일 출원됨; 제60/687, 158호, 2005년 6월 3일 출원됨; 제60/723,066호, 2005년 10월 3일 출원됨; 제60/726,775호, 2005년 10월 14일 출원됨; 제11/267,555호, 2005년 11월 4일 출원됨; PCT 출원번호 PCT/US05/39776, 2005년 11월 4일 출원됨을 참조하며, 이들의 개시는 전체가 참조에 의해 통합된다; 또한 Chung et al., Nature, Oct. 16, 2005 (출판에 앞서 전자적으로 공개됨) 및 Chung et al., Nature V. 439, pp. 216-219 (2006)를 참조하며, 이들 각각의 전체 개시는 전체로서 참조에 의해 통합된다). 그러한 경우에, hSCNT 배아는 다능성 줄기 세포의 생성을 위해 파괴되지 않는다.
본 발명의 일 양상에서, 방법은 연구 및 치료법에서 hSCNT 배아로부터 유도된 세포의 이용을 포함한다. 그러한 인간 다능성 줄기 세포들 (PSC들) 또는 전능성 줄기 세포들 (TSC)은, 비제한적으로, 피부, 연골, 뼈, 골격근, 심장근, 신장, 간, 혈액 및 혈액생성, 혈관 전구체 및 혈관 내피, 췌장베타, 뉴런, 교질, 망막, 내이 모낭, 장, 폐, 세포들을 포함하는 체내의 임의의 세포로 분화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, hSCNT 배아, 또는 배반포, 또는 hSCNT 배아로부터 얻은 전능성 또는 다능성 세포 (예를 들어, NT-ESC)는, 하나 이상의 분화 유도제에 노출시켜 망막 색소 상피, 조혈세포 전구체 및 혈광모세포 선구체와 같은 다른 치료적으로-유용한 세포뿐만 아니라 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 다른 유용한 세포 유형을 수득할 수 있다. 그러한 유도제들은 이에 한정되지 않으나 다음을 포함한다: 사이토카인, 예를 들어 인터류킨-알파 A, 인터페론-알파 A/D, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 인터페론-감마-유도성 단백질-10, 인터류킨-1-17, 케라티노사이트 성장 인자, 렙틴, 백혈병 억제 인자, 대식세포 콜로니-자극 인자, 및 대식세포 염증 단백질-1 알파, 1-베타, 2, 3 알파, 3 베타, 및 단핵구 화학주성 단백질 1-3, 6킨, 엑티빈 A, 암피레귤린(amphiregulin), 안지오제닌, B-내피 세포 성장 인자, 베타 셀룰린(beta cellulin), 뇌-유도 신경자극 인자, C10, 카디오트로핀-1(cardiotrophin-1), 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor), 사이토킨-유도 호중구 화학주성인자-1, 에오탁신, 표피 성장 인자, 상피 호중구 활성 펩티드-78, 에리트로포이에틴, 에스트로겐 수용체-알파, 에스트로겐 수용체-베타, 섬유아세포 성장 인자 (산성 및 염기성), 헤파린, FLT-3/FLK-2 리간드, 신경아교 세포계-유도 신경영양 인자, Gly-His-Lys, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구대식세포 콜로니 자극 인자, GRO-알파/MGSA, GRO-베타, GRO-감마, HCC-1, 헤파린-결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 헤레귤린-알파(heregulin-alpha), 인슐린, 인슐린 성장 인자 결합 단백질-1, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-1, 인슐린-유사 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 II, 신경 성장 인자, 뉴로토핀-3,4(neurotophin-3,4), 온코스타틴 M(oncostatin M), 태반 성장 인자(placenta growth factor), 플레이오트로핀(pleiotrophin), 란테스(rantes), 줄기 세포 인자, 간질 세포-유도 인자 IB, 트로모포이에틴(thromopoietin), 형질전환 성장 인자--(알파, 베타 1,2,3,4,5), 종양 괴사 인자 (알파 및 베타), 혈관 내피 성장 인자, 및 골형성 단백질, 호르몬 및 호르몬 길항제의 발현을 바꾸는 효소, 예를 들어 17B-에스트라디올, 부신피질자극호르몬, 아드레노메둘린, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬, 융모성 고나도트로핀, 코르티코스테로이드-결합 글로불린, 코르티코스테론, 덱사메타손, 에스트리올, 여포 자극 호르몬, 가스트린 1, 글루카곤, 고나도트로핀, L-3,3',5'-트리요오드티로닌, 류틴화 호르몬, L-티록신, 멜라토닌, MZ-4, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, PEC-60, 뇌하수체 성장 호르몬, 프로게스테론, 프로락틴, 세크레틴, 성 호르몬 결합 글로불린, 갑상샘 자극 호르몬, 갑상샘자극호르몬 방출 인자, 티록신-결합 글로불린, 및 바소프레신, 세포외기질 성분, 예를 들어 피브로넥틴, 피브로넥틴의 단백질가수분해 단편, 라미닌, 테나신, 트롬보스폰딘, 및 프로테오글리칸, 예를 들어 아그레칸, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 콘트로이틴 설페이트 프로테오글리칸, 및 신데칸. 다른 유도체들은 본 발명의 재프로그래밍된 세포로부터 유도된 분화하는 세포에 유도성 신호를 제공하기 위해 사용된 정의된 조직으로부터 유래된 세포 또는 구성성분을 포함한다. 그러한 유도체 세포는 무특이 병원(specific pathogen-free: SPF) 배아 또는 성체 세포와 같이 인간, 비-인간 포유동물, 또는 조류로부터 유도될 수 있다.
할구 배양. 일 구체예에서, hSCNT 배아는 할구를 생성하고 이식 전 유전 진단 (pre-implantation genetic diagnosis: PGD)에 현재 사용되는 것과 관련된 인 비트로(in vitro) 기술을 이용하기 위해 사용되어 hSCNT 배아를 파괴시키지 않고 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 hSCNT 배아로부터 단일 할구를 분리할 수 있고, 그렇지 않으면 생존력을 상당히 변화시킨다. 본원에서 증명된 바와 같이, 다능성 인간 배아 줄기 (hES) 세포 및 세포주는 출생으로의 배아의 정상 발달을 방해받지 않고 본원에 개시된 hSCNT 배아로부터 제거된 단일 할구로부터 생성될 수 있다.
치료적 복제
"돌리(Dolly)"의 양 복제에서 Wilmut et al. (Wilmut, et al, Nature 385, 810 (1997)의 발견은, hESC의 유도에서 Thomson et al. (Thomson et al, Science 282, 1145 (1998))의 발견과 함께, 환자 자신의 핵으로부터 생성된 hSCNT-배아 또는 hSCNT-조작된 세포 덩어리로부터 유도된 환자-특이적 hESC의 확립에 기초한 재생 세포 이식에 대한 상당한 열광을 발생시켰다. 자가 이식을 통한 면역 반응을 피하기 위한 목적인 이 전략은 아마도 hSCNT에 대한 가장 강한 임상적 근거이다. 같은 이유로, 복합 질병-특이적 SCNT-hESC의 유도는 질병 메커니즘의 발견을 가속화할 수 있다. 세포 이식을 위해, 개별 마우스 자신의 SCNT-유도 mESC로 쥐 SCID 및 PD 모델의 혁신적 치료가 유망하다(Rideout et al, Cell 109, 17 (2002); Barberi, Nat. Biotechnol. 21, 1200 (2003)). 궁극적으로, 넓은 조직 적합성을 가진 SCNT-유래 줄기 세포 더미를 만드는 능력은 새로운 난모세포의 지속적인 공급에 대한 필요성을 감소시킬 것이다.
본 발명의 특정 구체예에서, hSCNT 배아로부터 얻은 다능성 또는 전능성 세포 (예를 들어, hNT-ESC)는 선택적으로 분화될 수 있고, 치료적 유용성을 나타내기 위하여 그들이 정상적으로 거주하는 조직 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, hSCNT 배아로부터 얻은 다능성 또는 전능성 세포는 조직 내로 도입될 수 있다. 특정 다른 구체예에서, hSCNT 배아로부터 얻은 다능성 또는 전능성 세포는 전신적으로 또는 치료적 유용성이 요구되는 사이트로부터 거리를 두고 도입될 수 있다. 그러한 구체예에서, hSCNT 배아로부터 얻은 다능성 또는 전능성 세포는 거리를 두고 작용할 수 있고, 또는 원하는 사이트로 연마할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, hSCNT 배아로부터 얻은 복제된 세포, 다능성 또는 전능성 세포는 다른 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 데 이용될 수 있다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하면서 인 비트로(in vitro) 증식할 수 있는 세포의 단일 세포-유래 집단의 생성은 다른 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 데 유용하다. 세포-세포 유도는 초기 배아에서 분화를 지시하기 위한 흔한 수단이다. 많은 잠재적 의학적으로-유용한 세포 유형은 척수 뉴런, 심장 세포, 췌장 베타 세포 및 최종 조혈 세포를 포함하는 정상 배아 발달 동안 유도 신호에 의해 영향을 받는다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하면서 인 비트로(in vitro) 증식할 수 있는 세포의 단일 세포-유래 집단은 다른 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하여 원하는 세포 또는 조직 유형이 될 수 있는 다양한 인 비트로(in vitro), 인 오보(in ovo) 또는 인 비보(in vivo) 배양 조건에서 배양될 수 있다.
hSCNT 배아로부터 얻은 다능성 또는 전능성 세포 (예를 들어, ntESC)는 임의의 원하는 분화된 세포 유형을 얻기 위해 사용될 수 있다. 그러한 분화된 인간 세포의 치료적 용도는 독보적이다. 예를 들어, 인간 조혈 줄기 세포는 골수 이식을 요구하는 의학적 치료에서 사용될 수 있다. 그러한 절차는 많은 질병, 예를 들어, 난소암 및 백혈병과 같은 말기 암뿐만 아니라 AIDS와 같은 면역계를 손상시키는 질병을 치료하기 위해 사용된다. 조혈 줄기 세포는, 예를 들어, 인간 암 또는 AIDS 환자로부터 얻은 공여자 성체 최종 분화된 체세포, 예를 들어, 상피세포 또는 림프구를 수용자 제핵 인간 난모세포와 융합시키는 것에 의해 얻을 수 있고, 그것에 의하여 본원에 개시된 방법에 따라 hSCNT 배아를 얻고, 이것은 그 이후에 상기 설명된 환자-특이적 다능성 또는 전능성 세포 또는 줄기-유사 세포를 얻기 위해 사용될 수 있고, 조혈 줄기 세포를 얻을 때까지 분화를 돕는 조건 하에서 그러한 세포를 배양하는 데 사용될 수 있다. 그러한 조혈 세포는 암 및 AIDS를 포함하는 질병의 치료에 사용될 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 인간 성체 공여자 세포, 또는 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 hSCNT 배아는 본원에 개시된 방법에 따라 KDM4 히스톤 디메틸라제 활성제 및/또는 H3K9 메틸트랜스페라제 억제제로 처리될 수 있다.
대안적으로, 공여자 인간 세포는 신경계 장애를 갖는 인간 환자 유래 성인 체세포일 수 있고, 생성된 hSCNT 배아는 분화 조건 하에 배양되어 신경 세포주를 생산할 수 있는 환자-특이적, 또는 질병-특이적 다능성 또는 전능성 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 NT-ESC는 신경계 장애를 치료하기 위한 치료용 복제에서, 또는 신경계 및 신경퇴행성 장애의 질병 모델링에서 사용될 수 있다. 그러한 hNT-ESC는 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 알려진 방법에 의해 신경계 계통을 따라 방향성 있게 분화될 수 있다. 세포-기반 치료요법 및 그러한 인간 신경 세포의 이식에 의해 치료 가능한 특정 질병은, 예로서, 그 중에서도 파킨슨병, 알츠하이머병, ALS, MS 및 뇌성마비를 포함한다. 파킨슨병 (PD)의 특정 경우에서, 이식된 태아 두뇌 신경 세포가 주변 세포와의 적절한 연결을 만들고 도파민을 생산한다는 것이 입증되었다. 이것은 파킨슨병 증상의 장기간 역전을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 신경계 계통을 따라 분화된 환자-특이적 NT-ESC는 PD 환자를 치료하기 위한 방법에 사용될 수 있고, 여기에서 NT-ESC는 hSCNT 배아로부터 수득되고, 여기에서 hSCNT 배아는 PD를 갖는 개체로부터 얻은 체세포 유래 핵 유전 물질을 인간 제핵 난모세포와 융합하는 것으로부터 만들어졌고, 이것은 KDM4 아고니스트 또는 mRNA 및/또는 SUV39h1 및/또는 SUV39h2의 억제제로 처리되었던 것이다.
일부 구체예에서, hSCNT 배아로부터 얻은 다능성 또는 전능성 세포 (예를 들어, NT-ESC)는 고도로 탄성적이거나 흉터 형성을 일으키지 않고 재생할 수 있는 유전자 발현의 피부과학적 산전 패턴을 갖는 세포로 분화될 수 있다. 특히 관절을 둘러싼 영역에서와 같이 외피가 높은 수준의 탄력성의 이익을 받는 영역에 해당하는 포유동물의 태아 피부의 피부 섬유아세포는 회전(turnover) 없이 다년간 기능하는 탄력 섬유의 구조(architecture)를 데노보(de novo) 합성하는 것에 책임이 있다. 또한, 초기 배아 피부는 흉터 형성 없이 재생할 수 있다. SCNT 배아로부터 얻은 다능성 또는 전능성 세포로부터 배아 발달에서 이 지점으로부터의 세포는 정상 엘라스틴 구조를 형성하는 것을 포함하는 피부의 흉터 없는 재생을 촉진하는 데 유용하다. 이것은 특히 정상적인 사람 노화 과정의 증상을 치료하는 데, 또는 피부의 깊은 탄성조직분해가 일어나 피부의 늘어짐 및 주름짐을 포함하는 노화된 모습을 나타낼 수 있는 광화학선 피부 손상에서 유용하다.
서로 다른 계통을 따라 분화된 후 NT-ESC의 분화된 세포의 특이적 선별을 가능하기 하기 위해서, 일부 구체예에서, 공여자 인간 체세포는 유도성 프로모터를 통해 발현된 선택 가능한 마커로 형질감염될 수 있고, 그것에 의하여 분화가 유도될 때 특정 세포 계통의 선별 또는 농축을 허용할 수 있다. 예를 들어, CD34-neo는 조혈 세포의 선별을 위해, Pwl-neo는 근세포를 위해, Mash-1-neo는 교감신경세포를 위해, Mal-neo는 대뇌 피질의 회색질의 인간 CNS 뉴런을 위해 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 큰 이점은, hSCNT의 효율을 증가시킴으로써, 특히 유도된 다능성 줄기 세포가 아닌 (예를 들어, iPS가 아님) 다능성의 동질성 또는 동족성의 인간 ES 세포를 본질적으로 무한한 공급을 제공한다는 것이다. 그러한 NT-ESC는 iPSC 보다 이점을 가지며, 부분적으로 다능성이 아니기 때문에 이식에 적합하고, 바이러스 전이유전자 또는 재프로그래밍을 지시하는 재프로그래밍 인자의 강제 발현을 가지지 않는다.
일부 구체예에서, hSCNT로부터 생성된 hNT-ESC는, 공여자 인간 세포를 다능성 줄기 세포 또는 그의 분화된 후손으로 치료될 개체로부터 얻은 hSCNT 배아로부터 얻은 환자-특이적 다능성이다. 그러므로, 현재 이식 방법에 연관된 상당한 문제, 즉, 숙주 대 이식편 또는 이식편 대 숙주 거부 때문에 일어날 수 있는 이식된 조직의 거부를 제거할 것이다. 통상적으로, 거부는 시클로스포린과 같은 항-거부 약물의 투여에 의해 예방되거나 감소된다. 그러나, 그러한 약물들은, 예를 들어, 면역억제, 발암 성질과 같은 상당한 부작용을 가질 뿐만 아니라 매우 고가이다. 본 발명은 시클로스포린, 이물란, FK-506, 글루코코르티코이드 및 라파마이신, 및 그의 유도체와 같은 항-거부 약물에 대한 필요성을 제거하거나, 적어도 크게 감소시켜야 한다.
동종 동계의 세포 치료요법에 의해 치료 가능한 다른 질병 및 질환은, 예로서, 이에 한정되지 않으나, 척수손상, 다발성 경화증(multiple sclerosis: MS), 근이영양증(muscular dystrophy), 당뇨병, 간 질병, 즉, 과콜레스테롤혈증, 심장병, 연골 대체(cartilage replacement), 당뇨병, 화상, 족부 궤양, 소화기계 질병, 혈관 질병, 신장 질병, 요로 질병, 및 연령 관련 황반 변성 및 유사 질환(Age-related macular degeneration: AMD)과 같은 연령 관련 질병을 포함한다.
인간 NT-ESC들, 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포들 (PSC) 및 인간 전능성 줄기 세포들 (TSC들)에 대한 용도
hSCNT의 효율을 증가시키기 위한 본원에 개시된 방법들 및 조성물은 줄기 세포 연구 및 발달 생물학의 분야를 증진시킬 많은 중요한 용도를 가진다. 예를 들어, hSCNT 배아는 hES 세포, hES 세포주, 인간 전능성 줄기(TS) 세포 및 세포주를 생성하기 위해 사용될 수 있고, 그들로부터 분화된 세포는 기초 발달 생물학뿐만 아니라 특정 질병을 연구하기 위해 사용될 수 있으며 많은 질병 및 질환의 치료에 치료적으로 사용될 수 있다. 추가적으로, 그들 hNT-ESC는 그들 세포의 성장, 분화, 생존 또는 이동을 조절하기 위해 사용될 수 있는 인자 및 조건을 확인하기 위해 스크리닝 분석에 사용될 수 있다. 확인된 제제는 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 세포 거동을 조절하기 위해 사용될 수 있고, 세포 또는 무세포 치료요법의 기초를 형성할 수 있다.
포유동물에서 다능성 인간 배아 줄기 세포의 분리 및 SCNT에서 돌파구는, 조직 복구 및 이식 의학에서 잠재적 적용을 갖는, 연구에서 사용하기 위한 미분화된 세포의 잠재적으로 무한한 자원을 생성하는 인간 SCNT를 수행하는 가능성을 올렸다.
때로는 "치료적 복제"로 불리는 이 개념은 체세포의 핵을 제핵 공여자 난모세포로 이식하는 것을 말한다 (Lanza, et al, Nature Med. 5,975 (1999)). 이론적으로, 난모세포의 세포질은 모든 체세포 유전자를 침묵시키고 배아의 것은 활성화시킴으로써 이식된 핵을 재프로그래밍할 것이다. ES 세포 (즉, ntESC)는 복제된 이식 전 단계 배아의 내부 세포 덩어리 (inner cell mass: ICM)으로부터 분리된다. 치료적 환경에서 적용될 때, 그들 세포는 환자의 핵 게놈을 운반할 것이다; 그러므로, 직접 세포 분화 후에, 그 세포들은 (그 중에서도) 당뇨병, 골관절염 및 파킨슨 질병과 같은 퇴행성 장애를 치료하기 위해 면역 거부 없이 이식될 수 있다는 점이 제안된다. 이전 보고들은 소 ES-유사 세포의 생성 (Cibelli et al, Nature Biotechnol. 16, 642 (1998)), 복제된 배반포의 ICM으로부터의 마우스 ES 세포 (Munsie et al., Curro Biol 10, 989 (2000); Kawase, et al., Genesis 28, 156 (2000); Wakayama et al., Science 292, 740 (2001)) 및 복제된 인간 배아의 8- 내지 10-세포기 및 배반포로의 발달 (Cibelli et al., Regen. Med. 26, 25 (2001); Shu, et al., Fertil. Steril. 78, S286 (2002))을 설명했다. 여기에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 SCNT-조작된 세포 덩어리로부터 인간, 환자-특이적 ES 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. SCNT로부터 생성된 그러한 ES 세포는 본원에서 "ntESC"로 지칭되며, 환자-특이적 동종동계 배아 줄기 세포주를 포함할 수 있다.
hESC의 인간 계통을 제조하기 위한 본 기술은 과잉 IVF 클리닉 배아를 이용하며, 환자-특이적 ES 세포를 수득하지 않는다. 환자-특이적, 면역-일치성 hESC는 질병 및 발달의 연구를 위해 생물의학적으로 매우 중요할 것이고 치료적 줄기 세포 이식의 방법을 증진시킬 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명은 인간 공여자 피부 세포, 인간 공여자 난구 세포, 또는 기증된 제핵 난모세포로 그의 핵이 삽입되는 통지된 공여자 유래 다른 인간 공여자 체세포로부터 생성된 hSCNT로부터 hESC 계통을 확립하기 위해 사용될 수 있다. 이들 hSCNT-유래 hESC 계열은 동물성 단백질이 없는 배양 배지에서 성장될 것이다.
각 SCNT-유도된 hESC들 (즉, hNT-ESC들)의 주요 조직적합성 복합체 동일성은 환자 자신의 것과 비교되어 면역학적 적합성을 나타낼 수 있고, 이는 궁극적인 이식에 중요하다. 이들 SCNT-유도된 hESC (즉, hNT-ESC)의 생성에 대해, 유전적 및 후생유전학적 안정성의 평가가 이루어질 것이다.
많은 인간 상처 및 질병은 단일 세포 유형의 결함으로 인해 발생한다. 결함 세포가 적절한 줄기 세포, 선조 세포 또는 인 비트로(in vitro)에서 분화된 세포로 대체될 수 있다면, 그리고 이식된 세포의 면역 거부를 피할 수 있다면, 클리닉에서 세포 수준에서 질병 및 상처를 치료하는 것이 가능할 수 있다 (Thomson et al, Science 282, 1145 (1998)). 체세포 핵이 개별 환자에서 유래한 - 핵이 (미토콘드리아 DNA (mtDNA) 게놈이 아닐지라도 공여자의 것과 동일한 상황 - 인간 SCNT 배아 또는 SCNT-조작된 세포 덩어리로부터 hESC를 생성하는 것에 의해, 이들 세포가 인간 치료에 사용될 것이었다면 면역 거부의 가능성이 제거될 수 있다 (Jaenisch, N. Engl. Med. 351, 2787 (2004); Drukker, Benvenisty, Trends Biotechnol. 22, 136 (2004)). 최근에, 중증 복합형 면역부전증 (severe combined immunodeficiency: SCID) 및 파킨슨병(PD)의 마우스 모델 (Barberi et al., Nat. Biotechnol. 21, 1200 (2003)이 치료적 복제라고도 불리는 과정인 NT 배반포로부터 유도된 자가 분화된 마우스 배아 줄기 세포 (mESC)의 이식을 통해 성공적으로 치료되었다.
본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된 인간 SCNT 배아 또는 SCNT-조작된 세포 덩어리로부터의 hESC의 생성은, 알칼리 포스파타제 (alkaline phosphatase: AP), 단계-특이적 배아 항원 4 (stage-specific embryonic antigen 4: SSEA-4), SSEA-3, 종양 거부 항원 I-81 (tumor rejection antigen I-81: Tra-I-81), Tra-I-60, 및 옥타머-4 (octamer-4: Oct-4)를 포함하는 hESC 다능성 마커의 발현에 대해 평가될 수 있다. 인간 짧은 직렬-반복 프로브로 DNA 핑거프린팅이 또한 사용되어, 유도된 모든 NT-hESC 계통이 체세포 인간 세포의 각각의 공여자로부터 기원했다는 점 및 그들 계통이 제핵 실패 및 그 이후 단위생식 활성화의 결과가 아니었다는 점을 높은 확실성으로 보여줄 수 있다. 줄기 세포는 자기-재생뿐만 아니라 모든 세 가지 배아 배엽층: 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로부터 체세포로 분화하는 능력에 의해 정의된다. 적절한 동물 모델로의 IM 주입에 의해 증명된 바와 같이 기형종 형성 및 배아체 (EB) 형성과 관련하여 분화가 분석될 것이다.
요약하면, hSCNT의 효율을 증가시키는 본 방법은 ES 세포를 유도하는 현재 방법에 대한 대안을 제공한다. 그러나, 현재 접근법과 달리, hSCNT는 공여자 조직과 조직적합성이 있는 ES 세포주를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 hSCNT 배아는 치료가 필요한 특정 환자와 조직적합성이 있는 세포 치료요법을 개발할 기회를 미래에 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 시스템, 키트 및 장치는 서비스 제공자에 의해 수행될 수 있는데, 예를 들어, 연구자가 서비스 제공자에 의해 작동되는 실험실에서 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된 hSCNT 배아, 또는 hSCNT 배아로부터 유도된 다능성 줄기 세포, 또는 전능성 줄기 세포를 제공하도록 서비스 제공자에게 요청할 수 있다. 그러한 구체예에서, 공여자 인간 체세포를 얻은 후, 서비스 제공자는 본원에 개시된 방법을 수행하여 hSCNT 배아 또는 그러한 hSCNT-배아로부터 유도된 배반포를 생성하거나, 또는 그러한 hSCNT 배아로부터 hNT-ESC를 생성할 수 있고, 그 다음에 서비스 제공자는 연구자에게 hSCNT 배아, 또는 그러한 SCNT-배아로부터 유도된 배반포 또는 그러한 hSCNT 배아로부터의 hNT-ESC를 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 연구자는 공여자 인간 체세포 샘플을 임의의 수단을 통해, 예를 들어, 우편, 속달우편 등을 통해, 서비스 제공자에게 보낼 수 있고, 또는 대안적으로, 서비스 제공자는 연구자로부터 공여자 인간 체세포 샘플을 수집하고 그들을 서비스 제공자의 실험실로 전달하기 위한 서비스를 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 연구자는 서비스 제공자 실험실의 위치에 hSCNT 방법에서 사용될 공여자 인간 체세포 샘플을 맡길 수 있다. 대안적인 구체예에서, 서비스 제공자는 서비스 제공자가 연구자의 실험실에 인원을 보내는 스톱-바이 서비스를 제공하고, 또한 연구자 실험실에서 연구자가 원하는/선호하는 공여자 인간 체세포 (예를 들어, 환자-특이적 체세포)의 본원에 개시된 방법의 hSCNT 방법 및 시스템을 수행하기 위한 키트, 장치 및 시약을 제공한다. 그러한 서비스는 치료적 복제를 위해, 예를 들어, hNT-ESC 및/또는 hSCNT-배아 유래 배반포 유래 다능성 줄기 세포를 얻기 위해, 예를 들어, 재생 세포- 또는 조직 치료요법이 필요한 개체에 이식을 위한 환자-특이적 다능성 줄기 세포를 위해 유용하다.
또한, 인간에 투여하기에 적합한 제형의 NT-ESC로부터 유도된 (제조된) 이식가능한 세포로 구성된 치료 조성물을 본원에서 제공된다. 일 구체예에서, 이식을 위한 수용자는 공여자 체세포의 공급원인 공여자 인간이다. 일부 구체예에서, 치료 조성물은 다능성 세포, 계통-특이적 줄기 세포, 뿐만 아니라 본원에서 제공된 hNT-ESC로부터 유도된 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 포함한다.
hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC 세포의 제제는 이를 필요로 하는 개인에게 이식가능한 세포의 하나 이상의 제제의 유효한 양을 투여함으로써 이를 필요로 하는 개인에게 세포를 제공하는 방법을 가능하게 한다. 세포는 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex: MHC)의 하나 이상의 좌위에서 일치될 것이다. 일 구체예에서, 모든 MHC 좌위에서 완전한 일치가 있다. 일 구체예에서 hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC 세포는 관심 있는 개인의 체세포 유래 핵을 제2 개인 유래 제핵 숙주 세포 (예를 들어, 난모세포)로 이식하는 것에 의해 만들어진다. hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC 세포는 그 이후 상기 설명된 바와 같이 배양되어 다능성 줄기 세포 및 다분화성 줄기 세포 (multipotent stem cells: MPSC)를 생산할 수 있다. 다분화성 세포의 치료적으로 유효한 양이 그 이후 관심 있는 개체에서 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 치료된 개인에 대해 하나 이상의 MHC 좌위에서 일치된 세포는 본원에서 제공된 기술을 사용하여, 예를 들어 SCNT에 의해, 생성되고 배양된다. 바람직한 구체예에서, 세포는 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 세포는 이종 세포 (예를 들어, 마우스 배아 섬유아세포와 같은 비-인간 섬유아세포)와 함께 배양되지 않는다.
손상된 또는 퇴행성 체세포를 특징으로 하는 질병을 앓고 있는 인간에서 hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC 세포를 이식하는 단계를 포함하는 질병을 치료하는 방법이 제공된다.
본원에 설명된 hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC는 원하는 세포 유형의 세포의 생성에 유용하다. 일부 구체예에서, hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC는 중간엽 줄기세포, 신경 줄기세포, 및/또는 조혈 줄기 세포를 유도하기 위해 사용된다. 다른 구체예에서, hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC는, 이에 한정되지 않으나, 췌장, 간, 뼈, 상피, 내피, 힘줄, 연골 및 근육 세포, 및 이들의 선조 세포를 포함하는 세포를 생성하기 위해 사용된다. 따라서, hSCNT로부터 유도된 이식가능한 hNT-ESC 세포는 질병, 장애 또는 질환을 치료하기 위해 하나 이상의 세포 유형을 필요로 하는 개인에게 투여될 수 있다. 치료 또는 예방될 수 있는 질병, 장애 또는 질환의 예들은 신경계, 내분비선계, 구조계, 골격계, 혈관계, 비뇨기계, 소화계, 외피, 혈액, 면역, 자가-면역, 염증성, 신장, 방광, 심혈관, 암, 순환기, 조혈, 대사, 생식 및 근육 질병, 장애 및 질환을 포함한다. 일부 구체예에서, hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC로부터 유래된 조혈 줄기 세포는 암을 치료하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 그들 세포는 재건 적용에, 예를 들어 조직 또는 기관을 수선하거나 대체하는 데 사용된다.
본원에 설명된 hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC는 다분화성 줄기 세포 또는 이식가능한 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일례에서, 이식가능한 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 중간엽 줄기 세포는 매우 많은 수의 구별되는 조직을 생성한다 (Caplan, J. Orth. Res 641-650, 1991). 뼈, 근육, 힘줄, 지방 조직, 간질 세포 및 연골로 분화할 수 있는 중간엽 줄기 세포는 또한 골수로부터 분리된다 (Caplan, J. Orth. Res. 641-650, 1991). 미국 특허번호 제5,226,914호는 골수로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하는 예시적인 방법을 설명한다. 일례에서, 상피 선조 세포 또는 케라티노사이트는 피부의 상태 및 내장의 내벽을 치료하는 데 사용하기 위해 생성될 수 있다 (Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229, 1980). 세포는 또한 간 전구 세포 (PCT 공개번호 WO 94/08598 참조) 또는 신장 전구 세포 (Karp et al., Dev. Biol. 91 :5286-5290, 1994 참조)를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 또한 내이 전구 세포 (Li et al., TRENDS Mol. Med. 10: 309, 2004 참조)를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC로부터 유래된 이식가능한 세포는 또한 신경 세포일 수 있다. 대상에게 투여되는 신경 세포 현탁액과 같은 세포 현탁액의 부피는 이식 부위, 치료 목표 및 용액 중의 세포의 양에 따라 달라질 것이다. 전형적으로 개체에게 투여될 세포의 양은 치료적으로 유효한 양일 것이다. 예를 들어, 치료가 파킨슨병에 대한 것인 경우, 세포의 치료적으로 유효한 양의 이식은 전형적으로 장애, 예를 들어, 경직, 운동불능 및 보행 장애와 연관된 증상의 양 및/또는 중증도에서 감소를 생산할 것이다. 일례에서, 심각한 파킨슨병 환자는 이식으로부터 실질적인 유익한 효과를 가지기 위해 이식 부위 당 약 100,000개 이상의 생존 도파민 세포가 필요하다. 일반적으로 뇌 조직 이식에서 세포 생존이 낮음에 따라 (5-10%) 1백만 세포 이상이 투여되며, 예를 들어 약 1백만 내지 약 4백만개의 도파민성 뉴런이 이식된다. 일 구체예에서, 세포는 개체의 뇌에 투여된다. 세포는 뇌의 실질 내에, 지주막 공간 또는 뇌실과 같은 뇌척수액을 함유하는 공간 내, 또는 신경외부적으로(extaneurally) 이식 될 수 있다. 그러므로, 일례에서, 세포는 복강 신경절 또는 좌골 신경과 같은 중추 신경계 또는 말초 신경계 내에 있지 않은 개체의 영역에 이식된다. 또 다른 구체예에서, 세포는 경뇌막 내의 모든 구조를 포함하는 중추 신경계로 이식된다. 신경 세포의 주입은 일반적으로 18-21 게이지 바늘을 가지는 멸균된 주사기로 이루어질 수 있다. 정확한 크기의 바늘은 치료할 종에 따라 다를 것일지라도, 바늘은 어떤 종에서도 직경이 1 mm 보다 크지 않아야 한다. 이 기술분야의 통상의 기술자는 개체의 뇌에 세포를 투여하는 기술에 익숙하다.
일반적으로 hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC의 치료적으로 유효한 양이 개인에게 투여된다. 세포는 약학적 담체로 투여될 수 있다. 유용한 약학적으로 허용가능한 담체는 통상적이다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15th Edition (1975)는, 본원에 개시된 세포의 약학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 설명한다. 일반적으로, 담체의 종류는 이용되는 투여의 특정 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 비경구 제형은 보통 물, 생리식염수, 평형 염 용액, 수성 덱스트로오스, 글리세롤 등과 같은 약학적으로 및 생리학적으로 허용가능한 유체를 비히클로서 포함하는 주입가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물 (예를 들어, 분말, 알약, 정제 또는 캡슐 형태)을 위해, 통상적인 비-독성 고체 담체는, 예를 들어, 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적으로-중성인 담체 이외에, 투여될 약학 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 방부제 및 pH 완충제 등, 예를 들어 소듐 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
개인은 관심 있는 임의의 개체일 수 있다. 적합한 개체는 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 유래된 세포의 증식으로부터 이익을 받을 것인 개체를 포함한다. 일 구체예에서, 개인은 신경 전구 세포 및/또는 신경교 전구 세포의 증식을 필요로 한다. 예를 들어, 개인은 신경퇴행성 장애를 가지거나 뇌졸중과 같은 허혈성 사건을 가졌었을 수 있다. 신경퇴행성 장애의 특이적, 비-제한적인 예들은 알츠하이머병, 판토텐네이트 키나아제 결합 신경퇴화(Pantothenate kinase associated neurodegeneration), 파킨슨병, 헌팅턴병 (Dexter et al., Brain 114: 1953-1975, 1991), HIV 뇌병증 (Miszkziel et al., Magnetic Res. Imag. 15 : 1113-1119, 1997), 및 근위축성 측삭 경화증이다. 적합한 개인은 또한 노화된 개체, 예를 들어 약 65세이상, 약 70세 이상, 약 75세 이상, 약 80세 이상 또는 약 85세 이상의 나이인 개인을 포함한다. 추가적인 예에서, 개인은 척수 손상, 배튼병(Batten's disease) 또는 이분척추를 가질 수 있다. 추가의 예에서, 개인은 청각 장애인인 개체와 같은 청력 손실을 가질 수 있고, 또는 청력 손실을 예방하기 위해 내이로부터 줄기 세포의 증식을 필요로 할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 제조된 hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC는 생식세포계에 기여할 수 있다. 따라서, 관심 있는 개체 유래 체세포는 추후에 난모세포 또는 정자로 분화될 수 있는 ES 세포를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이들 난모세포 또는 정자는 그 후 수정을 위해 사용되어 불임 개체가 그 개체에 유전적으로 관련된 아동을 생산할 수 있게 할 수 있다. 그러한 방법은 미토콘드리아 질병을 가지는 여성 개체에 유용하며, 여기에서 그러한 질병을 가진 여성은 방법에 대한 인간 공여자 체세포에 공급원이 되어 hSCNT로부터 NT-ESC의 생산을 가능하게 하고, 이는 난모세포로 분화될 수 있고, 이는 그 여성에 의해 mtDNA에 결함이 없는 아동을 생산하는 데 사용될 수 있다. 또한, ES 세포-유래 난자는 연구에 사용된다. 예를 들어, 이들 난자는 결국 인간 SCNT-유도 ES 세포를 만들기 위해 사용될 수 있다. 이들 난모세포의 이러한 유용성은 연구를 위해 기증된 인간 난자의 사용을 감소시킬 수 있다.
hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC는 또한 세포 배양에 사용되는, 영양외배엽과 같은, 추가 배아 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 피더 세포로서 자가 세포 (예를 들어, 영양외배엽)의 사용은 결국 분화된 기관-특이적 세포로 분화하는 능력을 가지는 줄기 세포를 생성하는 데 도움이 될 수 있다. 다른 구체예에서, 그러한 피더 층 성분의 생성을 가능하게 하기 위해 그러한 방식에서 만능성 줄기 세포를 배양하는 것을 사용함으로써 얻은 동종이계 피더 세포의 사용은, 이종-오염을 피하기 위해 유용하며, 따라서, 치료 목적으로 배양된 분화된 세포의 쉬운 FDA 승인을 가능하게 한다.
hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC와 같이, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 세포는 또한 제제가 분화 또는 세포 증식에 영향을 주는지 결정하기 위해서와 같이 관심 있는 제제를 시험하는 데 사용된다. 예를 들어, hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC는 제제와 접촉되고, 분화 또는 증식하는 세포의 능력이 제제의 존재 및 부재에서 평가된다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC는 또한 신경 세포에 영향을 주는 제제와 같은 특정 인간 세포 유형에 영향을 주는 제제를 선택하기 위해 약학 제제를 스크리닝 하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC는 또한 분화에 영향을 주는 것을 선택하기 위해 제제를 스크리닝 하기 위해 사용될 수 있다. 시험 화합물은 화학적 화합물, 소분자, 폴리펩티드 또는 기타 생물학적 제제 (예를 들어 항체 또는 사이토카인)를 포함하는 관심 있는 임의의 화합물일 수 있다. 몇 가지 예들에서, 사이토카인 또는 성장 인자의 패널을 스크리닝하는 것과 같은, 잠재적 제제의 패널을 스크리닝한다.
원하는 활성에 대해 시험될 수 있는 분자의 조합 라이브러리를 제조하는 방법은 이 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 펩티드의 파지 디스플레이 라이브러리를 만드는 방법을 포함하는데, 이는 제약된 펩티드 (예를 들어, 미국 특허번호 제5,622,699호; 미국 특허번호 제5,206,347호; Scott and Smith, Science 249:386-390, 1992; Markland et al., Gene 109: 13-19, 1991 참조), 펩티드 라이브러리 (미국 특허번호 제5,264,563호); 펩티드모방성(peptidomimetic) 라이브러리 (Blondelle et al., Trends Anal Chem. 14:83-92, 1995); 핵산 라이브러리 (O'Connell et al., Proc. Natl Acad. Set., USA 93:5883-5887, 1996; Tuerk and Gold, Science 249:505-510, 1990; Gold et al., Ann. Rev. Biochem. 64:763-797, 1995); 올리고사카라이드 라이브러리 (York et al., Carb. Res. 285:99-128, 1996; Liang et al., Science 274: 1520- 1522, 1996; Ding et al., Adv. Expt. Med. Biol. 376:261-269, 1995); 리포단백질 라이브러리 (de Kruif et al., FEBSLett. 3 99:23 2-23 6, 1996); 글리코단백질 또는 글리코지질 라이브러리 (Karaoglu et al., J. Cell Biol. 130.567-577, 1995); 또는, 예를 들어, 약물 또는 다른 약학 제제를 함유하는 화학 라이브러리 (Gordon et al., J. Med. Chem. 37.1385-1401, 1994; Ecker and Crooke, BioTechnology 13:351- 360, 1995)일 수 있다. 세포 폴리펩티드를 포함하는 세포 표적에 대한 결합 특이성을 가지는 핵산 분자가 자연적으로 존재하기 때문에, 그리고 그러한 특이성을 가지는 합성 분자는 쉽게 제조되고 확인될 수 있기 때문에 폴리뉴클레오티드는 기능 다능성 또는 전능성 세포를 바꿀 수 있는 제제로서 특히 유용할 수 있다 (예를 들면, 미국 특허번호 제5,750,342호 참조).
일 구체예에서, 고 처리량 포맷을 위해, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 hSCNT로부터 유래된 hNT-ESC 또는 MPSC는 멀티웰 플레이트 또는 유리 슬라이드 또는 마이크로칩의 웰로 도입될 수 있고, 시험 제제와 접촉될 수 있다. 일반적으로, 세포는 어레이, 특히 다룰 수 있는 어레이로 조직되어 로봇 공학이 편리하게 세포 및 용액을 조작하기 위해, 및 특히 검사되는 기능과 관련하여 세포를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 고 처리량 포맷을 사용하는 것의 이점은 많은 시험 제제를 동시에 검사할 수 있고, 원하는 경우, 시험 조건과 동일한 조건 하에 대조군 반응을 실행할 수 있다는 것이다. 이에 따라, 본원에 개시된 방법은 hSCNT로부터 유도된 hNT-ESC의 기능을 바꿀 수 있는 제제를 확인하기 위하여 하나, 몇 가지, 또는 많은 수의 시험 제제, 예를 들어, hNT-ESC가 원하는 세포 유형으로 분화하도록 유도하는, 또는, 예를 들어, 조절 분자의 발현의 높은 수준을 유지함으로써 자발적인 분화를 막는 제제를 스크리닝하는 수단을 제공한다.
hNT-ESC는 화합물이 세포와 상호작용 하기에 충분한 시험 화합물과 접촉된다. 화합물이 별개 수용체와 결합할 때, 세포는 그의 수용체와 결합하기에 충분한 시간 동안 제제에 대해 접촉된다. 일부 구체예에서, 세포는 기질의 인산화에 영향을 미치기에 충분한 양의 시간 동안 시험 화합물과 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, hNT-ESC는 인 비트로(in vitro)에서 37℃에서 5% CO2 가습된 대기에서 시험 화합물로 처리된다. 시험 화합물로 처리된 후, 세포는 Ca2+ 및 Mg2+ 프리(free) PBS로 세척하고, 총 단백질은 설명된 바와 같이 추출한다 (Haldar et al., Cell Death Diff 1: 109-115, 1994; Haldar et al, Nature 342: 195- 198, 1989; Haldar et al., Cancer Res. 54:2095-2097, 1994). 추가적인 구체예에서, 시험 화합물의 연속 희석이 사용된다.
조성물 및 키트.
본 발명의 또 다른 양상은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 SCNT로부터 얻은 hNT-ESC들의 집단에 관련된다. 일부 구체예에서, hNT-ESC들은 인간 ntESC들, 예를 들어 환자-특이적 hNT-ESC들, 및/또는 환자-특이적 동질 동계의 hNT-ESC들이다. 일부 구체예에서, hNT-ESC들은 배양 배지, 예를 들어 전능성 또는 다능성 상태에서 hNT-ESC들을 유지하는 배양 배지에 존재한다. 일부 구체예에서, 배양 배지는 냉동보존에 적합한 배지이다. 일부 구체예에서, hNT-ESC들의 집단은 냉동보존된다. 극저온 보존은, 예를 들어, 미래의 사용을 위해, 예를 들어, 치료적 사용을 위해, 또는 다른 사용, 예를 들어, 연구 사용을 위해 hNT-ESC들을 저장하기 위해 유용하다. hNT-ESC들은 증폭될 수 있고, 증폭된 hNT-ESC들의 일부가 사용될 수 있고, 또 다른 일부는 극저온으로 보존될 수 있다. hNT-ESC들을 증폭하고 보존하는 능력은 상당한 유연성, 예를 들어, 다수의 환자-특이적 인간 hNT-ESC들의 생산뿐만 아니라 SCNT 절차에 사용하기 위한 공여자 체세포의 선택을 가능하게 한다. 예를 들어, 조직적합성 공여자로부터의 세포는 증폭되고 하나 이상의 수용자에서 사용될 수 있다. hNT-ESC들의 극저온 보존은 조직 은행에 의해 제공될 수 있다. hNT-ESC들은 조직절합성 데이터에 따라 냉동보존될 수 있다. 본원에 개시된 방법을 사용하여 제조된 hNT-ESC들은 일상적인 절차에 따라 냉동보존될 수 있다. 예를 들어, 냉동보존은 적합한 증식 배지, 10% BSA 및 7.5% 디메틸설폭시드를 포함할 수 있는 "동결" 배지에서 약 1백만 내지 1천만 개의 세포에 대해 수행될 수 있다. hNT-ESC들은 원심분리된다. 성장 배지는 흡인되고 동결 배양 배지로 대체된다. hNT-ESC들은 구체(spheres)로 재현탁된다. 세포들은, 예를 들어, -80℃에 용기에 두는 것에 의해, 천천히 냉동된다. 냉동된 hNT-ESC들은 37℃ 배스(bath)에서 스월링(swirling) 하는 것에 의해 해동되고, 신선한 줄기 세포 배지에 재현탁되어, 상기 설명된 바와 같이 성장된다.
일부 구체예에서, hNT-ESC들은 공여자 체세포 유래 핵 유전 물질을 수용자 난모세포의 세포질로 주입하는 것으로부터 생성된 SCNT 배아로부터 생성되며, 여기에서 수용자 난모세포는 제3 공여자 개체 유래 mtDNA를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 hSCNT 배아에 관한 것이다. 일 구체예에서, hSCNT 배아는 인간 배아이다. 일부 구체예에서, 인간 SCNT 배아는 유전적으로 변형되며, 예를 들어, SCNT 절차 이전에 (즉, 공여자 핵을 수집하고 수용자 난모세포의 세포질과 융합하기 이전에) 공여자 핵의 유전 물질 내 하나 이상의 이식유전자가 변형된다 (예를 들어, 도입되거나, 또는 삭제되거나, 또는 변경된다). 일부 구체예에서, hSCNT 배아는 인간 공여자 체세포 유래 핵 DNA, 인간 수용자 난모세포 유래 세포질 및 제3 인간 공여자 개체 유래 mtDNA를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간 SCNT 배아 또는 그의 배반포, 또는 수용자 인간 난모세포 (유핵 또는 제핵) 중 하나 이상, 및 (i) 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제; 또는 (ii) H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제 중 어느 하나를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 (i) 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제 및/또는 H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제, 및 (ii) 인간 난모세포를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 선택적으로 수용자 난모세포 및/또는 SCNT 배아를 위한 배양 배지, 뿐만 아니라 공여자 핵 유전 물질을 수용자 난모세포의 세포질과의 활성화 (예를 들어, 융합)을 위한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 난모세포는 제핵 난모세포이다. 일부 구체예에서, 인간 난모세포는 핵이 제거되지 않은 것이다. 일부 구체예에서, 인간 난모세포는 동결되거나 및/또는 냉동보존 동결 배지에 존재한다. 일부 구체예에서, 인간 난모세포는 미토콘드리아 질병을 가지거나 mtDNA에 돌연변이 또는 기형을 가지는 공여자 여성 개체로부터 수득된다. 일부 구체예에서, 난모세포는 미토콘드리아 질병을 가지지 않거나 또는 mtDNA에 돌연변이를 가지지 않는 공여자 여성 개체로부터 수득된다. 일부 구체예에서, 난모세포는 제3 개체 유래 mtDNA를 포함한다.
키트는 또한 선택적으로 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제 및/또는 H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제의 빛 또는 다른 부정적 조건에 의한 분해를 막기 위하여 적절한 시스템 (예를 들어 불투명 용기) 또는 안정화제 (예를 들어 항산화제)를 포함할 수 있다.
키트는 선택적으로 hSCNT 절차를 수행하기 위한 (예를 들어, 난모세포의 핵을 제거하기 위한, 및/또는 공여자 체세포의 핵 유전 물질을 수용자 난모세포로 주입하기 위한 및/또는 융합/활성화를 위한, 및/또는 hSCNT 배아를 배양하기 위한) 지시 (즉, 프로토콜), 뿐만 아니라 공여자 체세포 및/또는 수용자 난모세포, 및/또는 hSCNT 배아 중 하나 이상을 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제 및/또는 H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제 중 하나 이상과 접촉시키는 것의 설명을 함유하는 지시 물질을 포함할 수 있다.
본원에 설명된 발명이 완전히 이해될 수 있도록, 하기 상세한 설명이 개시된다.
본 발명은 하기 번호의 단락들 중 임의의 것으로 더 정의될 수 있다:
1. 하이브리드 난모세포를 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 구성원의 발현을 증가시키는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 하이브리드 난모세포는 인간 체세포의 유전 물질을 포함하는 제핵(enucleated) 인간 난모세포인 것인, 인간 체세포 핵 이식(hSCNT)의 효율을 증가시키는 방법.
2. 단락 1에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 하이브리드 난모세포의 활성화 또는 융합 후에 일어나지만, 인간 접합 유전자 활성화(zygotic genome activation: ZGA)가 시작되기 전에 일어나는 것인 방법.
3. (i) 공여자 인간 체세포 또는 수용자 인간 난모세포를 상기 공여자 인간 체세포 또는 상기 수용자 인간 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 수용자 인간 난모세포는 유핵 또는 제핵 난모세포인 단계; 상기 인간 난모세포가 유핵인 경우 수용자 인간 난모세포에서 핵을 제거하는 단계; 상기 핵을 상기 공여자 인간 체세포에서 상기 제핵 난모세포로 이식하여 하이브리드 난모세포를 형성하는 단계; 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는
(ii) 하이브리드 난모세포를 상기 하이브리드 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 상기 하이브리드 난모세포는 인간 체세포의 유전 물질을 포함하는 제핵 인간 난모세포인 것인 단계, 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는
(iii) 활성화 후의 인간 SCNT 배아를 상기 인간 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 SCNT 배아는 제핵 인간 난모세포와 인간 체세포의 유전 물질의 융합으로부터 생성된 것인 단계; 중 하나 이상을 포함하고,
상기 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 상기 인간 SCNT 배아 중 어느 하나에서 H3K9me3 메틸레이션의 감소는 SCNT의 효율을 증가시키는 것인, 인간 체세포 핵 이식(SCNT)의 효율을 증가시키는 방법.
4. a. (i) 공여자 인간 체세포 또는 수용자 인간 난모세포를 상기 공여자 인간 체세포 또는 상기 수용자 인간 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계; 여기에서 상기 수용자 인간 난모세포는 유핵 또는 제핵 난모세포이고; 상기 인간 난모세포가 유핵인 경우 상기 수용자 인간 난모세포에서 핵을 제거하는 단계; 상기 핵을 상기 공여자 인간 체세포에서 상기 제핵 난모세포로 이식하여 하이브리드 난모세포를 형성하는 단계; 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는
(ii) 하이브리드 난모세포를 상기 하이브리드 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 상기 하이브리드 난모세포는 인간 체세포의 유전 물질을 포함하는 제핵 인간 난모세포인 것인 단계, 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는
(iii) 활성화 후의 인간 SCNT 배아를 상기 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 SCNT 배아는 제핵 인간 난모세포와 인간 체세포의 유전 물질의 융합으로부터 생성된 것인 단계; 중 하나 이상,
b. 상기 SCNT 배아를 배반포를 형성하기 위한 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 상기 배반포로부터 하나 이상의 할구를 수집하는 단계 및 상기 하나 이상의 할구를 배양하여 하나 이상의 인간 NT-ESC를 형성하는 단계를 포함하는,
인간 핵 이식 배아줄기세포(human nuclear transfer embryonic stem cell: hNT-ESC)를 제조하는 방법.
5. 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포 또는 인간 체세포 핵 이식(SCNT) 배아 중 하나 이상을 상기 공여자 인간 체세포, 상기 수용자 인간 난모세포 또는 상기 인간 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 수용자 인간 난모세포는 유핵 또는 제핵 난모세포인 것인 단계;
상기 인간 난모세포가 유핵인 경우 상기 수용자 인간 난모세포에서 핵을 제거하는 단계;
상기 핵을 상기 공여자 인간 체세포에서 상기 제핵 난모세포로 이식하여 하이브리드 난모세포를 형성시키는 단계; 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시키는 단계 및
상기 하이브리드 난모세포를 상기 인간 SCNT 배아를 형성하기 위해 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 인간 체세포 핵 이식(SCNT) 배아를 제조하는 방법.
6. 단락 2 내지 5 중 어느 하나에 있어서, H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제는 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 패밀리의 구성원의 발현을 증가시키는 제제인 것인 방법.
7. 단락 6에 있어서, 상기 제제는 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 (JMJD2) 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 방법.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 KDM4A (JMJD2A), KDM4B (JMJD2B), KDM4C (JMJD2C), KDM4D (JMJD4D) 또는 KDM4E (JMJD2E) 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 방법.
9. 단락 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 KDM4A (JMJD2A)의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 방법.
10. 단락 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45에 상응하는 핵산 서열, 또는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45의 상응하는 서열과 비교하여 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것인 방법.
11. 단락 6에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1에 상응하는 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 핵산 서열과 비교하여 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것인 방법.
12. 단락 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제인 것인 방법.
13. 단락 12에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제는 SUV39h1 또는 SUV39h2인 것인 방법.
14. 단락 12에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제는 SETDB1인 것인 방법.
15. 단락 12에 있어서, SUV39h1, SUV39h2 및 SETDB 1 중 둘 이상이 억제된 것인 방법.
16. 단락 12에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제는 RNAi 제제, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpfl 올리고뉴클레오티드, 중화 항체 또는 항체 단편, 압타머, 소분자, 펩티드 억제제, 단백질 억제제, 아비디미르(avidimir), 및 그의 기능성 단편 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
17. 단락 16에 있어서, 상기 RNAi 제제는 siRNA 또는 shRNA 분자인 것인 방법.
18. 단락 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 서열번호 14-16, 47, 49, 51, 52 또는 53 중 어느 하나의 발현을 억제하는기 위한 핵산 억제제를 포함하는 것인 방법.
19. 단락 17에 있어서, 상기 RNAi 제제는 서열번호 14-16, 47, 49, 51, 52 또는 53의 적어도 일부에 혼성화하는 것인 방법.
20. 단락 17에 있어서, 상기 RNAi 제제는 서열번호 7, 8, 또는 서열번호 18 또는 19의 핵산 또는 그의 10개 이상의 연속적인 핵산의 단편, 또는 서열번호 7, 8 또는 서열번호 18 또는 19와 80% 이상 동일한 서열을 가지는 동족체(homologue) 중 어느 하나 또는 조합을 포함하는 것인 방법.
21. 단락 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 수용자 인간 난모세포는 제핵 인간 난모세포인 것인 방법.
22. 단락 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 1-세포기 SCNT 배아, 활성화 후 5시간(5 hours post activation: 5hpa) SCNT 배아, 활성화 후 10-12시간(10-12 hours post activation: 10-12hpa) SCNT 배아, 활성화 후 20-28시간(20-28 hours post activation: 20-28hpa) SCNT 배아, 2-세포기 SCNT 배아 중 임의의 것으로부터 선택되는 것인 방법.
23. 단락 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 핵 이식 이전에 수용자 인간 난모세포 또는 제핵 인간 난모세포와 접촉하는 것인 방법.
24. 단락 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 활성화 후 약 5시간 이전에, 또는 활성화 후 약 5시간에, 또는 SCNT 배아가 1-세포기에 있을 때 인간 SCNT 배아와 접촉하는 것인 방법.
25. 단락 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 활성화 후 5시간(5hpa) 후, 또는 활성화 후 12시간(hpa) 후, 또는 활성화 후 20시간(20hpa) 후, 또는 SCNT 배아가 2-세포기에 있을 때, 또는 5hpa와 28hpa 사이의 임의의 시간에 인간 SCNT 배아와 접촉하는 것인 방법.
26. 단락 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 수용자 인간 난모세포 또는 하이브리드 난모세포, 또는 인간 SCNT 배아를 제제와 접촉시키는 단계는 상기 제제를 상기 수용자 인간 난모세포 또는 하이브리드 난모세포, 또는 인간 SCNT 배아의 핵 또는 세포질에 주입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
27. 단락 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 방법.
28. 단락 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 제핵 인간 난모세포로 주입하기 위한 핵의 제거 이전에 공여자 인간 체세포의 세포질 또는 핵과 접촉하는 것인 방법.
29. 단락 28에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 상기 공여자 인간 체세포의 핵을 제핵 인간 난모세포로 주입하기 이전에 24시간 이상, 또는 1일 이상 동안 접촉되는 것인 방법.
30. 단락 28에 있어서, 상기 제제는 상기 공여자 인간 체세포의 핵을 제핵 인간 난모세포로 주입하기 이전에 24시간 이상, 또는 48시간 이상, 또는 3일 이상 동안 상기 공여자 인간 체세포와 접촉하는 것인 방법.
31. 단락 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 것인 방법.
32. 단락 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제는 SUV39h1 또는 SUV39h2, 또는 SUV39h1 및 SUV39h2 (SUV39h1/2)인 것인 방법.
33. 단락 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 최종 분화 체세포인 것인 방법.
34. 단락 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 배아줄기세포, 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPS cell), 또는 태아세포(fetal cell), 또는 배아세포(embryonic cell)가 아닌 것인 방법.
35. 단락 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질형성세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, 적혈구, 대식세포, 단핵구, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아줄기세포, 배아생식세포, 태아세포, 태반세포, 및 성체세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
36. 단락 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 섬유아세포 또는 난구세포인 것인 방법.
37. 단락 1 또는 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 제핵 수용자 인간 난모세포로 주입하기 위한 핵이 공여자 인간 체세포로부터 제거될 때까지 공여자 인간 체세포의 핵과 접촉하는 것인 방법.
38. 단락 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제의 부존재 하에 수행된 hSCNT와 비교하여 hSCNT의 배반포 단계까지 효율의 10% 이상 증가를 야기하는 것인 방법.
39. 단락 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제의 부존재 하에 수행된 hSCNT와 비교하여 hSCNT의 효율의 10-20% 증가를 야기하는 것인 방법.
40. 단락 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제의 부존재 하에 수행된 hSCNT와 비교하여 hSCNT의 효율의 20% 이상 증가를 야기하는 것인 방법.
41. 단락 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, SCNT 효율의 증가는 인간 SCNT 배아의 배반포 단계로의 발달의 증가인 것인 방법.
42. 단락 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, SCNT 효율의 증가는 인간 SCNT 배아 유도 배아줄기세포(human SCNT embryo-derived embryonic stem cells: hNT-ESC)들의 유도의 증가인 것인 방법.
43. 단락 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 유전적으로 변형된 공여자 인간 세포인 것인 방법.
44. 단락 5에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아를 인 비트로(in vitro) 배양하여 인간 배반포를 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
45. 단락 44에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 하나 이상의 4-세포 인간 SCNT 배아인 것인 방법.
46. 단락 44에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 하나 이상의 4-세포 SCNT 배아인 것인 방법.
47. 단락 44에 있어서, 인간 배반포에서 내부 세포 덩어리로부터 세포를 분리하는 단계; 및 미분화된 상태의 상기 내부 세포 덩어리 유래 세포를 배양하여 인간 배아줄기(embryonic stem: ES) 세포를 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
48. 단락 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포 또는 인간 SCNT 배아 중 어느 하나 이상은 동결 및 해동된 것인 방법.
49. 단락 1 내지 48 중 어느 하나의 방법으로부터 제조된 인간 SCNT 배아 유도 배아줄기세포(hNT-ESC)들의 집단.
50. 단락 49에 있어서, 상기 hNT-ESC들은 유전적으로 변형된 hNT-ESC들인 것인 hNT-ESC들의 집단.
51. 단락 49에 있어서, 상기 hNT-ESC들은 다능성줄기세포 또는 전능성줄기세포인 것인 hNT-ESC들의 집단.
52. 단락 49에 있어서, 상기 hNT-ESC들은 배양 배지에 존재하는 것인 hNT-ESC들의 집단.
53. 단락 52에 있어서, 상기 배양 배지는 상기 hNT-ESC들을 다능성 또는 전능성 상태로 유지하는 것인 hNT-ESC들의 집단.
54. 단락 52에 있어서, 상기 배양 배지는 상기 hNT-ESC들의 동결 또는 냉동보존에 적합한 배지인 것인 hNT-ESC들의 집단.
55. 단락 54에 있어서, 상기 hNT-ESC의 집단은 동결 또는 냉동보존된 것인 hNT-ESC들의 집단.
56. 단락 1 내지 55의 방법에 의해 제조된 인간 SCNT 배아.
57. 단락 56에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 유전적으로 변형된 것인 인간 SCNT 배아.
58. 단락 56에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 수용자 인간 난모세포 유래가 아닌 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA: mtDNA)를 포함하는 것인 인간 SCNT 배아.
59. 단락 56에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 배양 배지에 존재하는 것인 인간 SCNT 배아.
60. 단락 59에 있어서, 상기 배양 배지는 인간 SCNT의 동결 또는 냉동보존에 적합한 배지인 것인 인간 SCNT 배아.
61. 단락 60에 있어서, 상기 인간 배아는 동결 또는 냉동보존된 것인 인간 SCNT 배아.
62. 인간 SCNT 배아, 수용자 인간 난모세포, 인간 하이브리드 난모세포 또는 배반포 중 하나 이상 및
a. 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제; 또는
b. H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
63. 단락 62에 있어서, 상기 히스톤 데메틸라제의 KDM4 (JMJD2) 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제는 KDM4A (JMJD2A), KDM4B (JMJD2B), KDM4C (JMJD2C), KDM4D (JMJD2D) 또는 KDM4E (JMJD2E) 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 조성물.
64. 단락 63에 있어서, 상기 제제는 KDM4D (JMJD2D) 또는 KDM4A (JMJD2A)의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 조성물.
65. 단락 64에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45에 상응하는 핵산, 또는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45의 상응하는 서열과 비교하여 인간 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것인 조성물.
66. 단락 64에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1에 상응하는 핵산, 또는 서열번호 1의 핵산 서열과 비교하여 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것인 조성물.
67. 단락 62에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제는 SUV39h1, SUV39h2, 또는 SETDB 1 중 하나 이상 또는 임의의 조합을 억제하는 것인 조성물.
68. 단락 62에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 1-세포기, 2-세포기, 또는 4-세포기 인간 SCNT 배아인 것인 조성물.
69. 단락 62에 있어서, 상기 수용자 인간 난모세포는 제핵 수용자 인간 난모세포인 것인 조성물.
70. 단락 62에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 최종 분화 인간 체세포의 핵의 주입으로부터 제조된 것이거나, 또는 상기 배반포는 최종 분화 인간 체세포의 핵을 제핵 인간 난모세포로 주입하는 것으로부터 제조된 인간 SCNT 배아로부터 발달된 것인 조성물.
71. (i) 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제 및/또는 H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제 및 (ii) 인간 난모세포를 포함하는 키트.
72. 단락 92에 있어서, 상기 인간 난모세포는 제핵 난모세포인 것인 키트.
73. 단락 92에 있어서, 상기 인간 난모세포는 비-인간 난모세포인 것인 키트.
다른 식으로 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 설명된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명 또는 본 발명의 시험에서 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 재료는 하기에 설명된다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하려는 것은 아니다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 공개 및 출원 및 다른 문서들은 그 전체가 참조에 의해 통합된다.
상기 요약한 바와 같이, 본 발명은 배아를 반드시 파괴하지 않고 초기 단계 배아의 단일 할구들로부터 ES 세포, ES세포주, 및 분화된 세포 유형을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 및 하기에 상술된 발명의 다양한 양상 및 구체예의 모든 조합이 고려된다.
실시예
본원에 나타낸 실시예들은 (i) 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 패밀리의 구성원, 예를 들어, KDM4A의 발현 또는 활성을 증가시키는 것 및/또는 (ii) 인간 SCNT 배아에서 및/또는 인간 체세포의 인간 공여자 핵에서 인간 메틸트랜스페라제 hSUV39h1 또는 hSUV39h2 중 어느 하나를 억제하는 것에 의해 H3K9me을 감소시키거나 또는 제거함으로써 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 방법 및 조성물에 관련된다. 본 출원 전체에 걸쳐, 다양한 간행물들이 참조된다. 모든 간행물들 및 그들 간행물 내에 인용된 참조문헌들의 개시는 본 발명이 속하는 기술 수준을 더욱 완전하게 설명하기 위해 전체가 참조에 의해 본 출원에 통합된다. 하기 실시예들은 본 발명의 청구항의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 특정 구체예의 예시를 위한 것이다. 통상의 기술자에게 일어나는 예시적인 방법에서 임의의 변형은 본 발명의 범위 내에 속한다.
실험 절차
인간 SCNT 절차 및 KDM4A mRNA 주입
구별되는 제1 극체를 갖는 모든 MII 단계 인간 난모세포를 폴로스코프(Poloscope) (Oosight®, Cambridge Research & Instrumentation)가 장착된 도립현미경 하에서 핵을 제거하였다. 제핵 및 핵 공여자 세포 융합은 카페인 (1.25 mM)의 존재에서 수행하였다. 제핵을 위해, 난모세포는 0.5 μg/ml 시토칼라신 B(cytochalasin B) 및 카페인 (1.25 mM)을 함유하는 Hepes를 갖는 Global HTF 배지 (Life Global)에서 5분 동안 전-인큐베이션 하였다. 그 후, 스핀들 복합체를 PIEZO 작동기 (Primetech, Japan)를 사용하여 제거하였다. HVJ-E 추출물 (Cosmo Bio, USA)을 함유하는 드롭(drop)에 재현탁한 피부 섬유아세포를 제핵 난모세포의 난황주위공간으로 삽입하였다. 재구성된 난모세포를 세포 융합이 확인될 때까지 카페인 (1.25mM)을 함유하는 조작 배지에서 유지시킨 다음, 재조합된 난모세포를 Global 배지 10% SPS로 옮기고, 활성화 전 1-1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 활성화는 이전에 설명된 바에 따라 0.25M d-소르비톨 버퍼 및 6-DMAP (2 mM, 4시간)에서 전기펄스 (2X 50μs DC 펄스, 2.7 kV/cm)를 적용함으로써 수행하였다 (Tachibana et al., 2013). 활성화된 배아는 12시간 동안 트리코스타틴 A (Trichostatin A: TSA, 10nM, Sigma)로 보충된 Global 10% SPS 배지로 옮긴 다음, 배아는 TSA가 없는 Global 10% FBS로 옮기고, 인큐베이터에서 7일까지 동안 6% C02 / 5% 02/ 89% N2의 대기와 함께 37℃에서 배양되었다. 배양 배지는 3일째에 교체하였다.
mRNA 주입을 위해, 활성화된 SCNT 배아는 세척하고 KDM4A mRNA 주입 전에 Global 10% SPS에서 1시간 동안 배양하였다. KDM4A mRNA의 대략 10 pl은 이전에 설명된 바와 같이 활성화 후 5시간에 PIEZO 작동기를 사용하여 Hepes-HTF 10% SPS 배지에서 SCNT 배아에 주입되었다(Matoba et al., 2014). 공여자 세포 준비, mRNA 제조, RNA-seq 및 다른 절차들에 대한 보다 상세한 사항은 보충 실험 절차에서 찾을 수 있다.
인간 재프로그래밍 저항성 영역의 확인
슬라이딩 윈도우 (크기 20 kb, 단계 크기 10 kb)를 사용하여 4-세포 및 8-세포 인간 배아의 게놈 전체 발현 수준을 평가하였다. 각 윈도우에 대해, 정규화된 RPM (고유하게 맵핑된 리드의 백만 당 리드(reads per millions of uniquely mapped reads))로 발현 수준을 정량화하였다. 4-세포 IVF 배아에 비해 8-세포에서 유의적으로 활성화된 영역을 엄격한 기준으로 확인하였으며(8-세포 IVF 배아에서 FC > 5, RPM > 5), 중첩되는 영역은 병합하였다. 이들 활성화된 영역은 인간 SCNT 및 IVF 8-세포 배아에서 그들의 발현 차이에 기초하여 3가지 그룹으로 분류하였다.
마우스들
B6D2F1/J (BDF1) 마우스들은 C57BL/6J 암컷과 DBA/2J 수컷을 교배시킴으로써 제조하였고, SCNT에 대한 난모세포 및 체세포 핵 공여자 모두의 수집에 사용하였다. 모든 동물 실험은 하버드 의대의 동물 실험 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Harvard Medical School)의 승인을 받았다.
인간 KDM4A mRNA의 인 비트로(in vitro) 전사
인 비트로(in vitro) 전사는 이전에 설명된 바에 따라 수행하였다(Matoba et al., 2014). 간략하게, 전장 인간 KDM4A/JHDM3A cDNA를 클로닝 부위의 3' 엔드에 폴리(A)83을 함유하는 pcDNA3.1 플라스미드에 클로닝하였다. KDM4A (H188A)의 촉매 프라임 STAR 돌연변이유발 키트(TAKARA # R045A)를 사용하여 결함 돌연변이 형태를 생성하였다. mMESSAGE mMACHINE T7 울트라 키트(Life technologies # AM1345)를 사용하여 mRNA를 합성하였다. 합성된 mRNA는 뉴클레아제가 없는 물에 용해시켰다. mRNA의 농도는 NanoDrop ND-1000 분광광도계 (NanoDrop Technologies)에 의해 측정하였다. 사용하기 전까지 -80℃에서 mRNA의 부분 표본을 보관하였다.
마우스 SCNT 및 KDM4A mRNA 주입
마우스 체세포 핵 이식은 이전에 설명된 바에 따라 수행하였다(Matoba et al., 2014). 간략하게, 7.5 IU의 임신말 혈청성 성선자극호르몬(pregnant mare serum gonadotropin: PMSG; Millipore # 367222) 및 7.5 IU의 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin: hCG; Millipore # 230734)을 주입함으로써 과배란을 통해 성체 BDF1 암컷 마우스로부터 수용자 MII 난모세포 및 공여자 난구세포를 수집하였다. hCG 주입 후 15 내지 17시간에, 난관에서 난구-난모세포 복합체 (cumulus-oocyte complexes: COCs)를 수집하고, 300 U/ml 소 고환 히알루로니다제 (Calbiochem # 385931)를 함유하는 Hepes-완충된 칼륨 심플렉스-최적화된 배지 (potassium simplex-optimized medium: KSOM)를 짧게 처리하여 해리된 MII 난모세포 및 난구세포를 얻었다. 분리된 MII 난모세포는 7.5 jig/ml의 시토칼라신 B (Calbiochem # 250233)를 함유하는 Hepes-완충된 KSOM 배지에서 Piezo로 작동되는 현미조작장치 (Primetech # PMM-150FU)를 사용하여 핵을 제거하였다. 공여자 난구세포의 핵은 제핵 난모세포로 주입하였다. KSOM에서 1시간 인큐베이션 후, 재구성된 SCNT 난모세포를 2.5 mM SrCl2 및 5 jig/ml 시토칼라신 B를 함유하는 Ca-프리 KSOM에서 1시간 동안 인큐베이션하는 것에 의해 활성화하였고, 그리고 시토칼라신 B를 갖는 KSOM에서 4시간 동안 더 배양하였다. 활성화된 SCNT 배아를 SrC12 처리의 시작 후 5시간 (활성화 후 시간, hpa)에 세척하였고, 5% CO2의 습한 대기에서 37.8℃로 KSOM에서 배양하였다. SCNT 배아는 Piezo로 작동되는 현미조작장치를 사용함으로써 5-6 hpa에서 ~10 pl의 물 (대조군), 1500 mg/μl의 야생형 또는 변이체 (H188A) 인간 KDM4A mRNA를 주입하였다. 이식 전 발달률은 스튜던트 T-검정에 의해 분석하였다.
인간 난모세포의 준비
인간 난모세포 실험을 위한 프로토콜 (CHA001)은 차 재생의학 연구소 (CHA Regenerative Medicine Institute: CHARMI) 줄기세포 연구 감독 (Stem Cell Research Oversight: SCRO) 위원회와 펄 생명윤리위원회 (Pearl Institutional Review Board : PIRB) 모두에 의해 승인되었다. 초기 난자 기증자 모집은 이전에 설명된 바와 같이 웹-기반 광고를 통해 수행하였다(Chung et al., 2014). 모든 기증자들은 미국 생식 의학 협회 (American Society for Reproductive Medicine: ASRM)의 지침에 따라 생식, 의학 및 심리 건강을 기준으로 선별된 자발적인 참가자였다. 난모세포 기증자들은 ASRM에 의해 확립된 지침에 따라 그들의 시간, 노력, 임금 손실, 여행 관련 비용, 불편, 및 기부금 처리와 관련된 기타 관련 비용에 대해 재정적으로 상환되었다.
난소 자극은 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다(Chung et al, 2014). 간략하게, 인간 재조합 난포-자극 호르몬(rFSH, 225-300IU, Merck) 및 인간 폐경기 성선자극호르몬 (Menopur 75IU, Ferring)의 조합을 사용하여 GnRH 안타고니스트 (Ganirelix acetate, Merck) 억제로 9-11일 동안 난소를 자극하였다. 루프론(Lupron) 4mg을 사용하여 1 또는 2개의 난포가 직경 18 mm에 도달했을 때 LH 서지(surge)를 모방하였다. 모든 약물은 피하 주사를 통해 투여되었다. 루프론 주입 후 대략 36시간에 질경유 난모세포 회수를 수행하였다. 수집된 COC들은 회수 후 1-2 시간 내에 5080 IU/ml 히알루로니다제 (Sigma-Aldrich)로 노출시켰다(denuded). 그 후, 그들은 사용할 때까지 10% 혈청 단백질 보충제 (serum protein supplement: SPS; Cooper Surgical) (IVF Online)로 보충된 Global 배지에서 보관했다.
기증된 인간 IVF 배아
이 연구에 사용된 IVF 배아는 표준 IVF 절차 후 원하는 수의 유아를 가진 환자로부터 얻었고, 나머지 배아는 수년 동안 (2-6년) 저장고에서 냉동보존되었다. 모든 기증자들은 안내된 동의서에 서명함으로써 연구를 위해 그들의 배아 (다세포 분열 단계)를 자발적으로 기증했다. 연구를 위한 배아 기증 프로그램은 차(CHA) 강남 의학센터의 IRB에 의해 승인되었다.
인간 공여자 체세포 준비 및 특징화
사람 핵 공여자 체세포를 준비하기 위해, 국소 마취 하에 복부 피부의 작은 부분 (0.5 cm x 0.3 cm)을 생검하고, 항생제/항균제 용액 (anti-anti IX, Invitrogen)으로 보충된 PBS에서 3회 세척하여 가능한 모든 오염물질을 제거하였다. 이 연구에서 사용된 모든 체세포 기증자는 AMD 환자이다 (AMD subtype: Central Areolar Choroidal Dystrophy). DFB-6은 52세 여성으로부터 유래되었다. DFB-7은 42세 여성으로부터 유래되었다. DFB-8은 59세 여성으로부터 유래되었다.
체세포 핵 공여자 세포 준비 절차는 이전에 설명된 바와 본질적으로 동일하다(Chung et al., 2014). 간략하게, 피부 외피를 기계적으로 다듬고, 10 μg/ml 페니시린-스트렙토마이신 용액으로 보충된 DMEM에서 콜라게나제 (type I, 200 unit/ml, Worthington-biochem)으로 처리하여 피부 조직을 해리시켰다. 밤새 인큐베이션 후, 해리된 세포를 수집하고, 2회 세척하고, DMEM (Invitrogen, 10% FBS, 1% 비-필수 아미노산 및 10μg/mL 페니실린-스트렙토마이신 포함) 용액을 함유하는 60-mm 배양 디쉬에 심었다. 세포가 80% 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 초기 성장의 1/2는 냉동보존되었고, 나머지 세포들은 각 패시지(passage)의 세포가 냉동보존되도록 여러 번 계대 유지되었다. 이어서 냉동 세포를 SCNT 이전에 해동시키고, 그들이 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 4-세포 디시 (Nunc)에서 배양하였다. 그 다음 그것을 2-3일 동안 혈청-결핍된 DMEM (0.5% FBS)에서 배양하여 사용 전 세포 주기를 동기화시켰다.
KDM4A-보조된 SCNT 배반포로부터 인간 NTK-ESC들의 유도
모든 확장된 배반포들을 산 티로드(Tyrode) 용액으로 처리하여 투명대를 제거한 다음, 전체 배반포는 (영양외배엽 제거 없이) 넉아웃 혈청 대체물 (10% SR, Invitrogen), FBS (10% Hyclone), bFGF (30ng/ml), 인간 LIF (2000 units/ml, Sigma- Aldrich), 및 ROCK 억제제 (luM, Sigma-Aldrich)로 보충된 넉아웃-DMEM에서 유사분열-비활성화된 마우스 섬유아세포 (MEFs, Global Stem Inc.) 상에 배양하였다. 유도 배지는 다음 3일 동안 교체되지 않았으며, 그 후 1/2 배지는 이전에 설명된 바와 같이 ROCK 억제제가 없는 신선한 배지로 대체되었다(Chung et al, 2008). 3 계대 후, FBS의 양은 2%로 감소되어 SR로 대체되었다. 5 계대 후, ES 세포를 FGF (8 ng/ml, Invitrogen), SR (18%, Invitrogen), 및 FBS (2% Hyclone)가 보충된 DMEM/F12에서 배양하였다. 10 계대 후, ES 세포를 FGF (8 ng/ml) 및 20% SR로 보충된 DMEM/F 12에서 유지하였다.
ZGA 분석을 위한 8-세포 인간 배아의 제조
ZGA 분석을 위해 사용된 SCNT 배아는 한 명의 건강한 여성 (#64)에 의해 기증된 난모세포 및 AMD 환자 (DFB-8) 유래 피부 섬유아세포를 사용하여 생성되었다. SCNT 및 IVF 배아는 할구의 압축이 개시될 때 후기 8-세포기까지 배양되었고, 그 후 산 티로드(Tyrode) 용액으로 짧게 처리하여 투명대를 제거하였다. 8-세포 SCNT 배아를 준비하기 위해, 하나의 난모세포 공여자 유래 난모세포 및 하나의 체세포 핵 공여자 유래 피부 섬유아세포가 사용되었다. 모든 절차는 "인간 SCNT 절차 및 KMD4A mRNA 주입" 항목에서 설명된 바와 같다. 활성화 후 74시간에 동기화적으로 후기 8-세포기에 도달한 배아만이 수집되어 이 실험에 사용되었다.
대조군 IVF 배아의 준비를 위해, 몇몇의 기증된 초기 8-세포기 IVF 배아를 해동하고 5-7시간 동안 배양하여 가공하기 전에 후기 8-세포기에 도달하도록 하였다. 투명대의 제거 후, 노출되지 않은 배아를 PBS에서 3회 세척하고, RNAse 및 DNAse 프리 PCR 튜브에 넣고, 스핀 다운시키고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 그 다음, 사용하기 전까지 -80℃에서 보관했다. 대조군으로, 체세포 핵 공여자의 피부 섬유아세포도 준비되었다. 이들 섬유아세포는 DMEM 10% FBS에서 25 cm2 플라스크에서 배양되었고, 대략 10,000 세포들/기증자를 수집하고, 급속 동결하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관되었다.
면역염색
마우스 1-세포 SCNT 배아, 미분화된 인간 ESC 콜로니 또는 분화된 배아체 (EB)는 20분 동안 실온에서 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde: PFA)에 의해 고정되었다. 10 mg/ml BSA (PBS/BSA)를 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 고정된 시료는 0.5% 트립톤-X 100으로 인큐베이션하여 15분 동안 투과성을 유지하였다. PBS/BSA에서 1시간 동안 실온에서 블로킹한 후, 일차 항체의 혼합물에서 4℃에서 밤새 배양하였다. 사용된 일차 항체들은 다음과 같다: 항-H3K9me3 (Abeam, ab71604, 1 : 500), 항-NANOG (Abeam, abl09250, 1 : 200), 항-OCT-4 (Santa Cruz, sc-8628, 1 : 100), 항-TRA 160 (Millipore, MAB4360, 1 : 100), 항-SOX2 (R&D, AF2018, 1:200), 항-SSEA4 (Millipore, MAB4304, 1 : 100), 항-AFP (Alpha-1-Fetoprotein; Dako A0008, 1 : 100), 항-BRACHYURY (Abeam ab20680, 1 : 100), 및 TUJ1 (B-Tubulin; Covance PRB-435P, rabbit, 1 : 100). 3회 세척한 후에, 시료는 당나귀 항-염소 TRITC (Jackson ImmunoRe search, 705-026-147), 당나귀 항-마우스 488 (Jackson ImmunoRe search, 715-486-151), 당나귀 항-염소 649 (Jackson ImmunoResearch, 705-496147), 당나귀 항-래빗 TRITC (Jackson ImmunoResearch, 711026-152)를 포함하는 이차 항체로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 핵들은 DAPI (Vector Laboratories)로 공동-염색하였다.
ESC들의 인 비트로(in vitro) 분화 및 기형종 분석
인 비트로(in vitro) 분화 검사를 위해, ESC들은 배양체(EB)들을 형성할 때까지 1주 동안 bFGF 없는 ESC 배지에서 낮은-부착 디쉬에서 배양하였다. 그 후, EB들은 마트리겔 (BD Biosciences)로 코딩된 4-웰 디쉬 (Nunc)로 옮기고 추가 1주 동안 배양하였다. 1% BSA 및 0.1% 트리톤-X를 함유하는 PBS에서 세척, 블로킹 및 투과화 후, EB들은 일차 항체와 밤새 배양하였다. 1% BSA를 함유하는 PBS로 3회 세척 후, EB들을 이차 항체 및 DAPI로 1시간 동안 염색하고, 형광 현미경으로 관찰하였다. 기형종 검사를 위해, 대략 1 x 105의 미분화된 NTK-ESC들을 NOD/SCID 마우스의 고환에 주입하였다. 각 NTK-ESC 주를 위해, 3개 이상의 동물이 사용되었다. 12주 후, 기형종을 절제하고, 파라핀에 고정시키고, 절편화 한 다음 이전에 설명된 바와 같이 염색 후 조직학적으로 분석하였다(Chung et al, 2014).
염색체 분석
두 NTK-ESC 주에 대한 염색체 분석은 이전에 설명된 표준 프로토콜에 의해 수행하였다(Chung et al., 2014). 중기 스프레드(metaphase spreads)는 GTG (G-bands by trypsin using Giemsa)-밴딩 기술에 의해 염색하였고, 20개 중기가 2명의 세포유전학 전문가에 의해 분석되고 핵형 결정되었다. 기호는 이카로스(Ikaros) 핵형분석 시스템 (MetaSystems, Germany)에 의해 생성되었다.
RNA-시퀀싱 분석
각 그룹 당 5개의 8-세포 배아를 직접 용해시키고 SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit (Clontech)를 사용한 cDNA 합성을 위해 사용하였다. MEF 공여자에 대해, 10 ng 전체 RNA를 SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Ki를 사용한 cDNA 합성을 위해 사용하였다. 증폭 후, cDNA 시료는 Covaris 초음파발생장치 M220을 사용하여 평균 크기 150 bp로 단편화하였다 (Covaris). 시퀀싱 라이브러리는 제조사의 지시 (New England Biolabs)에 따라 다양한 바코드를 사용하여 NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina를 사용하여 단편화된 DNA로 만들었다. hESC들의 각 RNA-seq 분석을 위해, 1 μg 전체 RNA를 mRNA 정제를 위해 사용하였다. 바코된 RNA-seq 라이브러리는 NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs)를 사용하여 생성하였다. 단일 엔드 50 bp 시퀀싱은 HiSeq 2500 시퀀서 (Illumina)에서 수행하였다. 시퀀싱 리드(reads)는 Tophat2로 인간 게놈 (hg l9)에 맵핑되었다. 모든 프로그램은 기본 설정으로 수행되었다(달리 지정되지 않은 경우). 적어도 2200만개의 고유한 맵핑된 리드(reads)가 각 시퀀싱 라이브러리에 대해 얻어졌고, 이어서 Cufflinks v2.0.2를 갖는 참조 주석 (Refseq 유전자 모델)에 의해 안내되는 전사물로 집합되었다. 각 유전자의 발현 수준은 표준화된 FPKR(fragments per kilobase of exon per million mapped fragments)로 정량화되었다. 통계적 분석은 R로 수행되었다("www.r-project.org/"에서 이용 가능함). 독립적인 2 그룹 Wilcoxon 순위합 검증을 사용하여 R의 wilcox.test 함수를 사용하여 분포를 비교하였다. Pearson의 r 계수는 기본 매개변수가 있는 cor 함수를 사용하여 계산되었다. 서로 다른 샘플에서 전체 유전자 발현 패턴의 계층적인 클러스터링 분석은 R에서 heatmap.2 함수 (gplots package)를 사용하여 수행되었다.
공개된 ChIP-seq 및 DNA 메틸레이션 데이터 세트의 분석
도 1 및 5에서 히스톤 변형 농축 분석을 수행하기 위해, 본 발명자들은 하기의 공개된 ChIP-seq 및 DNaseI-seq 데이터 세트를 사용하였다: Nhlf 섬유아세포 (ENCODE/Broad Histone project)에서 H3K9me3, H3K4mel, H3K4me2, H3K4me3, H3K27me3, H3K36me3, H3K27ac 및 H4K20mel ChIP-seq, Hsmm and K562 세포 (ENCODE/Broad Histone project)에서 H3K9me3 ChIP-seq, Mcf7 세포 (ENCODE/Sydh Histone project)에서 H3K9me3 ChIP-seq, IMR90, Hsmm, K562 및 Mcf7 세포 (ENCODE/OpenChromDnase project)에서 DnaseI-seq. 본 발명자들은 또한 DNA 메틸레이션 분석을 위한 로드맵 후생유전학 프로젝트로부터 IMR90 세포의 전체 게놈 바이설파이트 서열 데이터 세트를 사용하였다(Roadmap Epigenomics et al., 2015). IMR90에서 가공된 DNA 메틸레이션 데이터는 월드-와이드 웹 "egg2.wustl.edu/roadmap/web_portal/"에서 다운로드되었다. ChIP-seq 강도는 표준화된 FPKM으로 정량화되었다. 시퀀싱 리드에 의한 게놈의 위치에 관한 범위(position wise coverage)가 결정되고 UCSC 게놈 브라우저에서 사용자 지정 트랙으로 시각화했다. 독립적인 2-그룹 Wilcoxon 순위합 검증은 R에서 wilcox.test 함수를 사용하여 각 그룹 간 ChIP-seq 분포를 비교하기 위해 사용되었다.
실시예 1
8-세포 인간 SCNT 배아에서 재프로그래밍 저항성 영역의 확인.
2-세포기에서 발생하는 마우스 접합 유전자 활성화 (ZGA)와 달리, 인간 접합 유전자 활성화 (ZGA)는 후기 4-세포기 내지 후기 8-세포기 동안 발생한다(Niakan et al., 2012) (도 1A). 정상의 인간 IVF 배아의 ZGA 동안 활성화된 게놈 영역을 확인하기 위해, 본 발명자들은 공개된 인간 이식 전 배아 RNA-시퀀싱 (RNA-seq) 데이터세트 (Xue et al, 2013)를 분석하고 4-세포기와 비교하여 8-세포기에서 5배 이상 활성화된 20-160 kb 범위의 크기의 707개의 게놈 영역 (표 5)을 확인하였다 (도 1B).
ZGA가 인간 SCNT에서 적절히 발생하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 SCNT 또는 IVF로부터 각각 유도된 후기 8-세포기 배아 (5/그룹)를 수집하고, RNA-seq를 수행하였다 (도 1A). 병행하여, 본 발명자들은 또한 공여자 피부 섬유아세포의 RNA-seq를 수행하였다(DFB-8, 방법 참조). 상기 정의된 707개 게놈 영역의 분석 (도 1B, 및 표 5)은 ZGA 영역의 대부분이 공여자 섬유아세포에서와 비교하여 SCNT 배아에서 활성화되었음을 나타낸다(도 1C). 그러나, 활성화의 수준은 IVF 배아에서의 그것에 필적하지 않는다(도 1C). 707개 게놈 영역 중, 169개가 IVF 배아에서와 필적하는 수준으로 활성화되었고(FC <= 2, IVF vs SCNT), 그러므로 우리의 이전 정의에 따라 완전히-재프로그래밍된 영역 (FRR)으로 지칭되었다(Matoba et al., 2014). 유사하게, 220개 영역은 IVF 배아와 비교하여 SCNT에서 부분적으로 활성화되었고(2 < FC <= 5), "부분적으로 재프로그래밍된 영역" (PRR)으로 지칭되었다. 그러나, "재프로그래밍 저항성 영역" (RRR)으로 지칭된 나머지 318개 영역 (표 6)은 SCNT 배아에서 활성화되는 것에 실패했다 (FC > 5). 따라서, 비교 전사체 분석은 인간 8-세포 SCNT 배아에서 전사 재프로그래밍에 대해 난치였던 318개 RRR을 확인하는 것을 가능하게 했다.
표 5: 인간 ZGA -활성화된 영역으로부터의 전사물의 발현 수준 (도 1에 관련됨). # = RNA-seq 데이터세트는 Xue et al., 2013으로부터 얻었다.
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#: RNA-seq 데이터세트는 Xue et al., 2013로부터 얻었다.
표 6: 인간 재프로그래밍 저항성 영역 (RRR)으로부터의 전사물의 발현 수준, (도 1에 관련됨)
Figure pct00040
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RRR의 이종염색질 특징은 인간 체세포에서 보존된다
본 발명자들은 다음으로 인간 RRR이 마우스 RRR과 같은 이종염색질 특징을 보유하는지 여부를 평가하였다. 인간 섬유아세포 유래 8개 주요 히스톤 변형의 공개적으로-이용가능한 ChIP-seq 데이터세트의 분석 (Bernstein et al, 2012; The Encode Consortium Project, 2011)은 인간 RRR에서 H3K9me3의 특이적 농축을 나타냈다 (도 1D 및 5A). H3K9me3의 농축은 RRR에 대해 독특한데, 유사한 농축이 FRR 또는 PRR에서 관찰되지 않았기 때문이다 (도 1D 및 5A). 유사한 분석은 또한 K562 적백혈병성 세포, Hsmm 골격근 근육 모세포, 및 Mcf7 유방 선암 세포에서 RRR에 H3K9me3의 농축을 나타내었으며(도 1E 및 5B), 이는 RRR에서 H3K9me3 농축이 체세포의 흔한 특징임을 나타낸다.
다음으로, 본 발명자들은 ENCODE 프로젝트에 의해 생성된 데이터세트를 사용하여 4개의 상이한 체세포 유형의 DNaseI 과민성을 분석하였다. 분석은 분석된 모든 인간 체세포-유형에서 FRR 및 PRR과 비교하여 RRR이 DNaseI에 유의적으로 덜 민감하다는 것을 나타내었다 (도 1F 및 5C). 그들의 이종염색질 특징과 일치하여, 인간 RRR은 FRR 또는 PRR과 비교하여 상대적으로 유전자가 부족하고 (도 5D), LINE 및 LTR과 같은 특이적 반복 서열이 풍부하지만, SINE는 그렇지 않았다 (도 5E). 종합적으로, 이러한 결과는 RRR의 이종염색질 특징, H3K9me3의 농축 및 DNaseI에 대한 감소된 접근가능성이 마우스 및 인간 체세포 모두에서 보존됨을 나타낸다.
실시예 2
인간 KDM4A mRNA 주입은 마우스 SCNT 배아의 발달을 개선시킨다
인간 RRR이 H3K9me3에 대해 풍부하다는 것을 확인한 후, 본 발명자들은 다음으로 H3K9me3의 제거가 인간 SCNT 배아에서 재프로그래밍 장벽을 극복하는 데 도움이 될 수 있는지를 평가했다. 본 발명자들은 이전에 마우스 SCNT 모델을 사용하여 H3K9me3 장벽이 마우스 H3K9me3 데메틸라제, KDM4d를 코딩하는 mRNA를 주입하는 것에 의해 제거될 수 있다는 것을 증명하였다(Matoba et al., 2014). 인간 SCNT 모델로 이동하기 전에, H3K9me3 데메틸라제 활성을 갖는 KDM4 패밀리의 다수 구성원이 마우스 및 인간에 존재한다는 것을 고려하여(Klose et al, 2006; Krishnan and Trievel, 2013; Whetstine et al., 2006), 본 발명자들은, SCNT 재프로그래밍을 가능하게 하는 데 KDM4D를 사용하는 대신, KDM4A와 같은 KDM4 패밀리의 다른 구성원이 사용될 수 있는지를 평가하였다. 또한, 본 발명자들은 KDM4 패밀리 구성원들이 종 전체에서 기능할 수 있는지를 평가하였다.
이를 위해, 본 발명자들은 성체 암컷 마우스의 난구세포를 핵 공여자로 사용하여 SCNT를 수행하였고, 본 발명자들의 이전 연구에서 사용된 동일한 절차에 따라 활성화 후 5 시간 (hpa)에 인간 KDM4A mRNA를 주입하였다 (도 2A) (Matoba et al, 2014). 면역염색법은 야생형이나 촉매성 돌연변이가 아닌 인간 KDM4A mRNA의 주입은 마우스 SCNT 배아의 핵에서 H3K9me3 수준을 크게 감소시킨다는 것을 보여주었다 (도 1B). 중요하게, KDM4A mRNA의 주입은 SCNT 배아의 발달 잠재력을 크게 증가시켜서 그들 중 90.3%가 배반포 단계로 발달하였고, 이는 대조군에서 26% 배반포 형성률과 대조적이다 (도 2C 및 2D, 표 3). 배반포 형성의 극도로 높은 효율은 KDM4d-주입된 마우스 SCNT 배아에서 관찰된 88.6%와 유사하다 (Matoba et al, 2014). 이들 결과는 체세포 게놈에서 재프로그래밍 장벽인 H3K9me3이 그것이 H3K9me3 데메틸라제 활성을 함유하는 한 KDM4 패밀리 데메틸라제의 임의의 구성원에 의해 제거될 수 있다는 점을 놀랍게도 증명한다.
표 3. KDM4A - 보조된 마우스 SCNT 배아의 이식 전 발달, 도 2에 관련됨
Figure pct00050
* 물 주입된 대조군과 비교하여 P < 0.01.
KDM4A mRNA 주입은 인간 SCNT 배아의 배반포 형성률을 유의적으로 증가시킨다
본 발명자들은 다음으로 KDM4A mRNA 주입이 또한 히스톤 데아세틸라제 억제제인 트리코스타틴 A (Trichostatin A: TSA)의 사용을 포함하는 최적화된 SCNT 조건을 사용하여 인간 SCNT에서 재프로그래밍 장벽을 극복하는 데 도움을 줄 수 있는지 평가했다 (Tachibana et al., 2013). KDM4A-보조된 SCNT의 미래 임상 적용을 염두에 두고, 본 발명자들은 연령-관련 황반 변성 (Age-related Macular Degeneration: AMD) 환자의 피부 섬유아세포 (Bressler et al., 1988)를 핵 공여자로 사용하였다.
인간 SCNT에 대한 KDM4A의 유익한 효과를 재확인하기 위해, 본 발명자들은 그의 난모세포가 정규 IVF 절차를 사용한 이전의 시도에서 확장된 배반포로의 발달에 실패한 난모세포 기증자들을 선택했다(Chung et al, 2014). 제핵 후, 4명의 난모세포 기증자로부터 수집된 총 114개 MII 난모세포를 HVJ-E에 의해 공여자 섬유아세포로 융합하였다. 활성화 시, 재구성된 SCNT 난모세포 중 63개에는 인간 KDM4A mRNA가 주입되고, 나머지 (51개)는 비-주입된 대조군의 역할을 했다 (도 2E, 표 4). 본 발명자들은 이들 SCNT 배아의 발달 과정을 모니터하였고, 두 그룹이 2-세포 배아를 형성하는 유사한 분열 효율을 특징으로 한다는 것을 발견했다 (대조군: 48/51=94.1%, KDM4A: 56/63=88.9%) (표 4). 예상대로, KDM4A mRNA 주입은 8-세포기의 말에 ZGA가 완료되기 전에 SCNT 배아의 발달률에 어떠한 유익한 효과도 나타내지 않았다 (68.8% vs 71.4%) (도 2F 및 표 4). 그러나, 유익한 효과는 상실배 단계에서 분명해졌다 (16.7% vs 32.1%) (도 2F 및 표 4). 놀랍게도, 6일째, KDM4A-주입된 배아의 26.8% (15/56)가 배반포 단계에 성공적으로 도달하였고, 이는 대조군 배아의 오직 4.2% (2/48)만인 것과 비교되었다. 7일째, KDM4A-주입된 배아의 14.3%가 확장된 배반포 단계로 발달된 반면, 대조군 배아의 어느 것도 이 단계로 발달하지 않았다 (도 2F 및 2G). 중요하게, KDM4A의 유익한 효과는 시험된 모든 4명의 기증자에서 관찰되었다 (도 2H). 따라서, 본 발명자들은 KDM4A mRNA 주입이 특히 ZGA 이상의 인간 SCNT 배아의 발달 잠재력을 개선시킬 수 있음을 분명히 증명한다.
표 4: KDM4A-보조된 인간 SCNT 배아의 이식 전 발달, 도 2에 관련됨. * 주입된 인간 KDM4A mRNA의 농도는 1500 ng/μl이다. 대조군 배아는 미-주입되었다. Blast: 배반포, ex-blast: 확장된 배반포.
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실시예 3
KDM4A-주입된 SCNT 배반포로부터 유도된 인간 ESC의 확립 및 특징화
본 발명자들은 다음으로 KDM4A-주입된 SCNT 배반포로부터 핵 이식 ESC들 (NT-ESC들)을 유도하였다. 본 발명자들은 KDM4A-주입된 SCNT 배아로부터 총 8개의 확장된 배반포를 얻었다 (도 3A 및 표 4). 투명대의 제거 후, 확장된 배반포를 통상적인 ESC 유도 배지에서 조사된(irradiated) 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)에 배양하였다. 8개의 배반포 중 7개가 MEF 피더 세포에 부착되어 성장(outgrowth)을 개시하였다. 5회의 계대 후, 본 발명자들은 4개의 안정한 NT-ESC 계통을 성공적으로 유도했고, 이는 NTK (KDM4A에 의해 보조된 NT)-ESC #6-9로 각각 지정되었다 (도 3A, CHA-NT #6-9로도 명명됨).
면역염색법은 OCT4, NANOG, SOX2, SSEA-4 및 TRA1-60가 IVF에 의해 유도된 대조군 인간 ESC 계통의 그것과 유사한 패턴으로 모두 발현되었음을 나타내었다 (도 3B, 도 6A 및 6B). RNA-seq (도 6C)는 NTK-ESC들이 대조군 ESC들과 유사한 수준으로 다능성 마커 유전자를 발현하는 것을 나타내었다 (도 3C). 전체 전사체의 쌍 비교는 NTK-ESC들과 대조군 ESC들 사이의 높은 상관관계를 나타내었다 (도 3D 및 6D). 전사체의 계층적 클러스터링 분석은 NTK-ESC들이 대조군 ESC들과 함께 클러스터된 것으로 나타났다 (도 3E). 이들 결과는 NTK-ESC가 분자 수준에서 대조군 ESC와 구별할 수 없음을 시사한다.
본 발명자들은 인 비트로(in vitro) 분화 및 인 비보(in vivo) 기형종 분석에 의해 NTK-ESC들의 분화 능력을 조사하였다. 인 비트로(in vitro) 배양 2주 후 배양체 (EB)의 면역염색은 NTK-ESC가 모든 세 개의 배엽 세포를 효율적으로 생성할 수 있음을 나타내었다 (도 3F 및 6E). 또한, NTK-ESC는 이식 12주 이내에 모든 세 개의 배엽 세포를 함유하는 기형종을 형성했다 (도 3G 및 6F). 이들 결과는 NTK-ESC가 다능성이라는 것을 나타낸다.
핵형분석은 이들 NTK-ESC가 정상의 수의 염색체를 유지하고, 핵 공여자 체세포와 동일한 예상된 쌍의 성 염색체를 가진다는 것을 증명했다 (NTK6/7에 대해 46, XX; NTK8에 대해 46, XY; 도 3H 및 S3A). 짧은 직렬 반복 (Short Tandem Repeat: STR) 분석은 게놈 전체에 걸쳐 위치한 16개의 반복 마커가 공여자 체세포와 그 유도체 NTK-ESC 사이에 완벽한 일치를 보여줌을 증명하였다 (도 3I 및 7B). 미토콘드리아 DNA 서열 분석은 NTK-ESC의 두 SNP가 난모세포-공여자의 그것과 정확히 일치하나, 핵 공여자의 그것과는 일치하지 않음을 보여주었다 (도 3J 및 7C). 종합적으로, 이들 결과는 우리의 SCNT 방법의 신뢰성을 확립하며, KDM4A mRNA 주입이 확립된 NTK-ESC의 다능성 또는 게놈 안정성을 손상시키지 않으면서 SCNT-매개된 ESC 유도를 개선시킨다는 것을 증명한다.
KDM4A는 8-세포 SCNT 배아에서 RRR의 ZGA를 가능하게 한다
KDM4 mRNA 주입이 ZGA 후 hSCNT 배아 발달을 유의하게 개선시킨다는 사실은 공여자 체세포 게놈에서 H3K9me3이 실제로 인간 SCNT 배아에서 ZGA에 대해 장벽으로 기능한다는 것을 증명한다. KDM4A mRNA의 주입이 SCNT 배아에서 ZGA 결함을 어느 정도로 극복할 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 KDM4A 주입 유무 시 8-세포 SCNT 배아의 RNA-seq를 수행하였다. 비교 전사체 분석은 318개 RRR 중 50% (158)가 KDM4A mRNA 주입에 의해 현저하게 상향 조절되었음을 나타내며 (도 4A, FC > 2), 이는 H3K9me3의 소거가 SCNT 배아에서 ZGA를 적어도 부분적으로 가능하게 할 수 있다는 것을 나타낸다.
KDM4A 주입된 SCNT 배아의 개선된 발달을 설명하는 데 도움을 줄 수 있는 후보자 유전자(들)을 확인하기 위해, 본 발명자들은 확인된 유전자의 분석에 초점을 맞추었다. KDM4A 주입에 의해 발현이 유의하게 상향 조절된 206개 유전자들 (FPKM > 5, FC > 2) (표 7). 유전자 온톨로지 분석은 이들 유전자가 전사 조절, 리보솜 생물발생 및 RNA 가공에 대해 풍부해졌음을 보여주었고 (도 4B), 이는 이들 발달적으로 중요한 조직(machineries)의 조절 장애가 SCNT 배아의 발달 정지의 원인이 될 수 있음을 시사한다. 이식 전 발달에서 206개 유전자의 대다수의 기능이 현재 알려지지 않았다고 하더라도, 그들 중 2개, UBTFL1 및 THOC5 (도 4C)는 마우스에서 정상적인 이식 후 발달에 필요하다고 알려져 있다 (Wang et al., 2013; Yamada et al., 2009). 그러므로, 이들 유전자의 결함 있는 활성화는 인간 SCNT 배아의 좋지 못한 발달에 적어도 부분적으로 원인이 된다.
표 7: KDM4A-반응성 ZGA 유전자의 발현 수준 (도 4에 관련됨).
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실시예 5
수십 년의 노력 끝에, 인간 NT-ESC가 최근에 마침내 유도되었다 (Chung et al., 2014; Tachibana et al., 2013; Yamada et al., 2014). 이들 진보는 SCNT 유도 조건의 최적화에 주로 기인한다. 그러나, 인간 SCNT 배아의 발달 정지를 일으키는 후생유전학적 재프로그래밍에서 내재적 결함은 확인되지 않았다. 본원에서, 본 발명자들은 체세포 게놈에서 H3K9me3이 인간 SCNT 재프로그래밍에 대한 장벽을 나타낸다는 것을 증명한다. H3K9me3 데메틸라제, KDM4A를 과발현하는 것에 의한 이 장벽의 제거는 ZGA에서 전사 재프로그래밍을 가능하게 하고, 그것에 의하여 인간 SCNT 배아가 보다 효율적으로 발달하여 배반포를 생성하는 것을 가능하게 하고, 그것으로부터 본 발명자들은 게놈 안정성 또는 다능성을 손상시키지 않고 다수의 AMD 환자-특이적 NT-ESC 계통을 성공적으로 확립하였다. 따라서, 본 발명자들은 SCNT에 의한 인간 체세포 재프로그래밍에서 일반적인 재프로그래밍 장벽으로서 H3K9me3을 증명할 뿐만 아니라 복제 효율을 개선시키기 위한 실제적 접근법을 확립한다.
SCNT 배아 발달을 지지하는 인간 난모세포의 능력은 난모세포 기증자들 사이에 크게 다르다는 것이 잘 알려져 있다. 실제로, 인간 NT-ESC는 소수 그룹의 여성에 의해 기증된 고품질 난모세포가 수용자로 사용될 때만 유도할 수 있으나 (Chung et al., 2014; Tachibana et al, 2013; Yamada et al., 2014), 난모세포 품질에 대한 의존성의 이유는 아직 찾기 힘들다. 일관되게, 4명의 기증자 중 오직 한 명 (ID #58)의 난모세포가, 배반포 형성을 향상시키는 것으로 보고된 TSA의 존재 하에서도 KDM4A mRNA 주입 없이 SCNT 배반포 형성을 지지하였다 (Tachibana et al., 2013) (도 2H 및 표 4). 대조적으로, 검사된 모든 4명의 공여자의 난모세포는 KDM4A mRNA를 주입하였을 때 배반포 형성을 지지하였고, 이는 KDM4A가 공여자 변이 문제를 극복할 수 있음을 나타냈다. KDM4A가 IVF 배아 발달을 개선시킬 수 있는지 여부는 아직 결정되지 않고 있다.
배반포 단계에 도달하는 인간 SCNT 배아의 발달 잠재력이 KDM4A mRNA 주입에 의해 유의적으로 및 지속적으로 개선되었을지라도, 개선의 크기는 마우스에 비해 급격하지 않았다 (마우스에서 90% vs 인간에서 27%). 종의 차이 및/또는 인간 난모세포의 품질은 단일 배란으로부터 유도된 동일한 배치의 난모세포 내에서도 크게 다양할 수 있고, 그들 중 일부만 IVF에 의해서도 배반포 단계로의 발달을 지지하는 능력을 가져서, 15-60%의 다양한 성공률을 가지는 것이 가능하다 (Shapiro et al., 2002; Stone et al, 2014). 이것은 배아의 90% 이상이 배반포 단계로 발달할 수 있는 마우스 IVF와 분명히 대조된다. 그러므로, 마우스 난모세포와 비교하여 인간 난모세포의 낮은 품질을 고려하면 KDM4A 주입으로 hSCNT 효율이 개선되었다는 것은 놀라운 일이다. 실험에 사용된 인간 난모세포의 일부가 IVF에 의해서 조차도 배반포 형성을 지지할 수 없었을 가능성도 있다.
인간 SCNT 효율 및 NT-ESC 유도를 개선하는 KDM4A의 효능을 입증하는 것에 더하여, 또 다른 중요한 발견은 KDM4A가 인간 SCNT 재프로그래밍을 가능하게 할 수 있다는 것이다. 인간 KDM4A는 마우스 SCNT 배아에서 KDM4d와 유사한 효과를 달성하는 기능을 할 수 있음을 고려할 때, 본 발명자들은 KDM4 패밀리의 모든 구성원이 H3K9me3 데메틸라제 활성을 보유하는 한 hSCNT를 가능하게 하기 위해 사용될 수 있다는 것을 증명했다.
요약하면, 본 발명자들은 본원에서 개선된 KDM4-보조된 인간 SCNT 방법을 증명했다. 이 방법을 사용하여, 본 발명자들은 성체 AMD 환자 세포로부터 인간 배반포를 유도했고, 이어서 공여자 환자와 동일한 게놈을 갖는 다수의 NT-ESC들 (NTK-ESC들)을 확립했다. 이것은 AMD 치료에 대한 치료적 약물 스크리닝을 위해서뿐만 아니라 AMD를 이해하기 위한 독특하고 중요한 세포 근원을 제공한다. 동일한 전략이 다른 인간 질병의 연구에 적용될 수 있다고 가정하면, 본 발명자들은 인간 치료법에 대한 일반적인 영향을 미칠 것인 환자-특이적 NT-ESC를 생성하는 새로운 방법을 증명했다. 추가적으로, 본원에서 증명된 바와 같이 hSCNT는 체세포 미토콘드리아를 수용자 난모세포의 미토콘드리아로 대체할 수 있으므로(도 3H-J 및 7), 본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트는 미토콘드리아 DNA-관련 질병을 치료하기 위한 기회를 제공한다. 실제로, 최근 연구는 mtDNA 돌연변이에 의해 발생하는 대사 증후군 표현형이 SCNT를 통한 mtDNA의 대체에 의해 교정될 수 있다는 것이 증명됐다 (Ma et al., 2015). 따라서, 본원에 개시된 KDM4-보조된 SCNT 방법은 mtDNA-대체 치료법에도 유용하다.
참조문헌
본원에 개시된 참조문헌은 그 전체가 참조로서 통합된다.
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Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 7 gaaacgaguc cguauugaat t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 8 uucaauacgg acucguuuct t 21 <210> 9 <211> 1064 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Ser Glu Ser Glu Thr Leu Asn Pro Ser Ala Arg Ile Met Thr 1 5 10 15 Phe Tyr Pro Thr Met Glu Glu Phe Arg Asn Phe Ser Arg Tyr Ile Ala 20 25 30 Tyr Ile Glu Ser Gln Gly Ala His Arg Ala Gly Leu Ala Lys Val Val 35 40 45 Pro Pro Lys Glu Trp Lys Pro Arg Ala Ser Tyr Asp Asp Ile Asp Asp 50 55 60 Leu Val Ile Pro Ala Pro Ile Gln Gln Leu Val Thr Gly Gln Ser Gly 65 70 75 80 Leu Phe Thr Gln Tyr Asn Ile Gln Lys Lys Ala Met Thr Val Arg Glu 85 90 95 Phe Arg Lys Ile Ala Asn Ser Asp Lys Tyr Cys Thr Pro Arg Tyr Ser 100 105 110 Glu Phe Glu Glu Leu Glu Arg Lys Tyr Trp Lys 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ctaagctcat 2580 tgctccaggc tttgattacc taaaataagc ttggataaaa ttgaaccaac ttcaagaatg 2640 cagcacttct taatctttag ctctttcttg ggagaagcta gactttattc attatattgc 2700 tatgacaact tcactctttc ataatatata ggataaattg tttacatgat tggaccctca 2760 gattctgtta accaaaattg cagaatgggg ggccaggcct gtgtggtggc tcacacctgt 2820 gatcccagca ctttgggagg ctgaggtagg aggatcacgt gaggtcggga gttcaagacc 2880 agcctggcca tcatggtgaa accctgtctc tactgaaaat acaaaaatta gccgggcgtg 2940 gtggcacacg cctgtagtcc cagctactca ggaggctgag gcaggagaat cacttgaatt 3000 caggaggcgg aggttgcagt gagccaagat cataccactg cactgcagcc tgagtgacac 3060 agtaagactg tctccaaaaa aaaaaaaaaa aaa 3093 <210> 16 <211> 4449 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ggcactaaag gtttgcttcc gggcgtttct tttgcttccc cttccctctt tcacgcttcc 60 tcccctcccc ctcctccctt atcccttcgc tttcgctctt ttccgtcgag gccgacccct 120 gagttgtgag tctggggtct ggttggtgaa aaagagccct tgaagctgga agacgggaga 180 ggacaaaagc atgtcttccc ttcctgggtg cattggtttg gatgcagcaa cagctacagt 240 ggagtctgaa gagattgcag agctgcaaca 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tatcccattt gccggccact 1140 gaaaaagact tgggaggaca tagaagacat ctcctgccgt gacttcatag aggagtatgt 1200 cactgcctac cccaaccgcc ccatggtact gctcaagagt ggccagctta tcaagactga 1260 gtgggaaggc acgtggtgga agtcccgagt tgaggaggtg gatggcagcc tagtcaggat 1320 cctcttcctg gatgacaaaa gatgtgagtg gatctatcga ggctctacac ggctggagcc 1380 catgttcagc atgaaaacat cctcagcctc tgcactggag aagaagcaag gacagctcag 1440 gacacgtcca aatatgggtg ctgtgaggag caaaggccct gttgtccagt acacacagga 1500 tctgaccggt actggaaccc agttcaagcc agtggaaccc ccacagccta cagctccacc 1560 tgccccacct ttcccacctg ctccacctct atccccccaa gcaggtgaca gtgacttgga 1620 aagccagctt gcccagtcac ggaagcaggt agccaaaaag agcacgtcct ttcgaccagg 1680 atctgtgggc tctggtcatt cctcccctac atctcctgca ctcagtgaaa atgtctctgg 1740 tgggaaacct gggatcaacc agacatatag atcaccttta ggctccacag cctctgcccc 1800 agcaccctca gcactcccgg cccctccagc acccccagtc ttccatggca tgctggagcg 1860 ggccccagca gagccctcct accgtgctcc catggagaag cttttctact tacctcatgt 1920 ctgcagctat acctgtctgt ctcgagtcag acctatgagg 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540 gtctcatttt gtgaatcaca gctgtgaccc aaatcttcag gtgttcaatg ttttcattga 600 taacctcgat actcgtcttc cccgaatagc attgttttcc acaagaacca taaatgctgg 660 agaagagctg acttttgatt atcaaatgaa aggttctgga gatatatctt cagattctat 720 tgaccacagc ccagccaaaa agagggtcag aacagtatgt aaatgtggag ctgtgacttg 780 cagaggttac ctcaactgaa ctttttcagg aaatagagct gatgattata atattttttt 840 cctaatgtta acatttttaa aaatacatat ttgggactct tattatcaag gttctaccta 900 tgttaattta caattcatgt ttcaagacat ttgccaaatg tattaccgat gcctctgaaa 960 agggggtcac tgggtctcat agactgatat gaagtcgaca tatttatagt gcttagagac 1020 caaactaatg gaaggcagac tatttacagc ttagtatatg tgtacttaag tctatgtgaa 1080 cagagaaatg cctcccgtag tgtttgaaag cgttaagctg ataatgtaat taacaactgc 1140 tgagagatca aagattcaac ttgccataca cctcaaattc ggagaaacag ttaatttggg 1200 caaatctaca gttctgtttt tgctactcta ttgtcattcc tgtttaatac tcactgtact 1260 tgtatttgag acaaataggt gatactgaat tttatactgt tttctacttt tccattaaaa 1320 cattggcacc tcaatgataa agaaatttaa ggtataaaat taaatgtaaa aattaatttc 1380 agcttcattt cgtatttcga agcaatctag actgttgtga tgagtgtatg tctgaacctg 1440 taattcttaa aagacttctt aatcttctag aagaaaaatc tccgaagagc tctctctaga 1500 agtccaaaat ggctagccat tatgcttctt tgaaaggaca tgataatggg accaggatgg 1560 ttttttggag taccaagcaa ggggaatgga gcactttaag ggcgcctgtt agtaacatga 1620 attggaaatc tgtgtcgagt acctctgatc taaacggtaa aacaagctgc ctggagagca 1680 gctgtaccta acaatactgt aatgtacatt aacattacag cctctcaatt tcaggcaggt 1740 gtaacagttc ctttccacca gatttaatat ttttatactt cctgcaggtt cttcttaaaa 1800 agtaatctat atttttgaac tgatacttgt tttatacata aatttttttt agatgtgata 1860 aagctaaact tggccaaagt gtgtgcctga attattagac ctttttatta gtcaacctac 1920 gaagactaaa atagaatata ttagttttca agggagtggg aggcttccaa catagtattg 1980 aatctcagga aaaactattc tttcatgtct gattctgaga tttctaattg tgttgtgaaa 2040 atgataaatg cagcaaatct agctttcagt attcctaatt tttacctaag ctcattgctc 2100 caggctttga ttacctaaaa taagcttgga taaaattgaa ccaacttcaa gaatgcagca 2160 cttcttaatc tttagctctt tcttgggaga agctagactt tattcattat attgctatga 2220 caacttcact ctttcataat atataggata aattgtttac atgattggac cctcagattc 2280 tgttaaccaa aattgcagaa tggggggcca ggcctgtgtg gtggctcaca cctgtgatcc 2340 cagcactttg ggaggctgag gtaggaggat cacgtgaggt cgggagttca agaccagcct 2400 ggccatcatg gtgaaaccct gtctctactg aaaatacaaa aattagccgg gcgtggtggc 2460 acacgcctgt agtcccagct actcaggagg ctgaggcagg agaatcactt gaattcagga 2520 ggcggaggtt gcagtgagcc aagatcatac cactgcactg cagcctgagt gacacagtaa 2580 gactgtctcc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2608 <210> 53 <211> 2566 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 agtttgaatg aaagctctac aagatggcgg cggtcggggc cgaggcgcga ggaggtgagg 60 ctggagcgcg gccccctcgc cttccctgtt cccagcttgg tgtgtgcctt gcctagtttc 120 acttgatact cttcaggaat tatgtagaaa agaaaagctc acatgtaaat cgattggaat 180 caccaaaagg aatctaaaca attatgaggt ggaatacttg tgtgactaca aggtagtaaa 240 ggatatggaa tattatcttg taaaatggaa aggatggcca gattctacaa atacttggga 300 acctttgcaa aatctgaagt gcccgttact gcttcagcaa ttctctaatg acaagcataa 360 ttatttatct caggtaatca caagtgaaga agctgaaaga cgaggacagt tctatgacaa 420 caagggaatc acgtatctct ttgatctgga ctatgagtct gatgaattca cagtggatgc 480 ggctcgatac ggcaatgtgt ctcattttgt gaatcacagc tgtgacccaa atcttcaggt 540 gttcaatgtt ttcattgata acctcgatac tcgtcttccc cgaatagcat tgttttccac 600 aagaaccata aatgctggag aagagctgac ttttgattat caaatgaaag gttctggaga 660 tatatcttca gattctattg accacagccc agccaaaaag agggtcagaa cagtatgtaa 720 atgtggagct gtgacttgca gaggttacct caactgaact ttttcaggaa atagagctga 780 tgattataat atttttttcc taatgttaac atttttaaaa atacatattt gggactctta 840 ttatcaaggt tctacctatg ttaatttaca attcatgttt caagacattt gccaaatgta 900 ttaccgatgc ctctgaaaag ggggtcactg ggtctcatag actgatatga agtcgacata 960 tttatagtgc ttagagacca aactaatgga aggcagacta tttacagctt agtatatgtg 1020 tacttaagtc tatgtgaaca gagaaatgcc tcccgtagtg tttgaaagcg ttaagctgat 1080 aatgtaatta acaactgctg agagatcaaa gattcaactt gccatacacc tcaaattcgg 1140 agaaacagtt aatttgggca aatctacagt tctgtttttg ctactctatt gtcattcctg 1200 tttaatactc actgtacttg tatttgagac aaataggtga tactgaattt tatactgttt 1260 tctacttttc cattaaaaca ttggcacctc aatgataaag aaatttaagg tataaaatta 1320 aatgtaaaaa ttaatttcag cttcatttcg tatttcgaag caatctagac tgttgtgatg 1380 agtgtatgtc tgaacctgta attcttaaaa gacttcttaa tcttctagaa gaaaaatctc 1440 cgaagagctc tctctagaag tccaaaatgg ctagccatta tgcttctttg aaaggacatg 1500 ataatgggac caggatggtt ttttggagta ccaagcaagg ggaatggagc actttaaggg 1560 cgcctgttag taacatgaat tggaaatctg tgtcgagtac ctctgatcta aacggtaaaa 1620 caagctgcct ggagagcagc tgtacctaac aatactgtaa tgtacattaa cattacagcc 1680 tctcaatttc aggcaggtgt aacagttcct ttccaccaga tttaatattt ttatacttcc 1740 tgcaggttct tcttaaaaag taatctatat ttttgaactg atacttgttt tatacataaa 1800 ttttttttag atgtgataaa gctaaacttg gccaaagtgt gtgcctgaat tattagacct 1860 ttttattagt caacctacga agactaaaat agaatatatt agttttcaag ggagtgggag 1920 gcttccaaca tagtattgaa tctcaggaaa aactattctt tcatgtctga ttctgagatt 1980 tctaattgtg ttgtgaaaat gataaatgca gcaaatctag ctttcagtat tcctaatttt 2040 tacctaagct cattgctcca ggctttgatt acctaaaata agcttggata aaattgaacc 2100 aacttcaaga atgcagcact tcttaatctt tagctctttc ttgggagaag ctagacttta 2160 ttcattatat tgctatgaca acttcactct ttcataatat ataggataaa ttgtttacat 2220 gattggaccc tcagattctg ttaaccaaaa ttgcagaatg gggggccagg cctgtgtggt 2280 ggctcacacc tgtgatccca gcactttggg aggctgaggt aggaggatca cgtgaggtcg 2340 ggagttcaag accagcctgg ccatcatggt gaaaccctgt ctctactgaa aatacaaaaa 2400 ttagccgggc gtggtggcac acgcctgtag tcccagctac tcaggaggct gaggcaggag 2460 aatcacttga attcaggagg cggaggttgc agtgagccaa gatcatacca ctgcactgca 2520 gcctgagtga cacagtaaga ctgtctccaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2566 <210> 54 <211> 410 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Met Ala Ala Val Gly Ala Glu Ala Arg Gly Ala Trp Cys Val Pro Cys 1 5 10 15 Leu Val Ser Leu Asp Thr Leu Gln Glu Leu Cys Arg Lys Glu Lys Leu 20 25 30 Thr Cys Lys Ser Ile Gly Ile Thr Lys Arg Asn Leu Asn Asn Tyr Glu 35 40 45 Val Glu Tyr Leu Cys Asp Tyr Lys Val Val Lys Asp Met Glu Tyr Tyr 50 55 60 Leu Val Lys Trp Lys Gly Trp Pro Asp Ser Thr Asn Thr Trp Glu Pro 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Lys Cys Pro Leu Leu Leu Gln Gln Phe Ser Asn Asp 85 90 95 Lys His Asn Tyr Leu Ser Gln Val Lys Lys Gly Lys Ala Ile Thr Pro 100 105 110 Lys Asp Asn Asn Lys Thr Leu Lys Pro Ala Ile Ala Glu Tyr Ile Val 115 120 125 Lys Lys Ala Lys Gln Arg Ile Ala Leu Gln Arg Trp Gln Asp Glu Leu 130 135 140 Asn Arg Arg Lys Asn His Lys Gly Met Ile Phe Val Glu Asn Thr Val 145 150 155 160 Asp Leu Glu Gly Pro Pro Ser Asp Phe Tyr Tyr Ile Asn Glu Tyr Lys 165 170 175 Pro Ala Pro Gly Ile Ser Leu Val Asn Glu Ala Thr Phe Gly Cys Ser 180 185 190 Cys Thr Asp Cys Phe Phe Gln Lys Cys Cys Pro Ala Glu Ala Gly Val 195 200 205 Leu Leu Ala Tyr Asn Lys Asn Gln Gln Ile Lys Ile Pro Pro Gly Thr 210 215 220 Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser Arg Cys Gln Cys Gly Pro Asp Cys Pro 225 230 235 240 Asn Arg Ile Val Gln Lys Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Cys Ile Phe Arg 245 250 255 Thr Ser Asn Gly Arg Gly Trp Gly Val Lys Thr Leu Val Lys Ile Lys 260 265 270 Arg Met Ser Phe Val Met Glu Tyr Val Gly Glu Val Ile Thr Ser Glu 275 280 285 Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Phe Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr 290 295 300 Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala 305 310 315 320 Arg Tyr Gly Asn Val Ser His Phe Val Asn His Ser Cys Asp Pro Asn 325 330 335 Leu Gln Val Phe Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp Thr Arg Leu Pro 340 345 350 Arg Ile Ala Leu Phe Ser Thr Arg Thr Ile Asn Ala Gly Glu Glu Leu 355 360 365 Thr Phe Asp Tyr Gln Met Lys Gly Ser Gly Asp Ile Ser Ser Asp Ser 370 375 380 Ile Asp His Ser Pro Ala Lys Lys Arg Val Arg Thr Val Cys Lys Cys 385 390 395 400 Gly Ala Val Thr Cys Arg Gly Tyr Leu Asn 405 410 <210> 55 <211> 350 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Met Glu Tyr Tyr Leu Val Lys Trp Lys Gly Trp Pro Asp Ser Thr Asn 1 5 10 15 Thr Trp Glu Pro Leu Gln Asn Leu Lys Cys Pro Leu Leu Leu Gln Gln 20 25 30 Phe Ser Asn Asp Lys His Asn Tyr Leu Ser Gln Val Lys Lys Gly Lys 35 40 45 Ala Ile Thr Pro Lys Asp Asn Asn Lys Thr Leu Lys Pro Ala Ile Ala 50 55 60 Glu Tyr Ile Val Lys Lys Ala Lys Gln Arg Ile Ala Leu Gln Arg Trp 65 70 75 80 Gln Asp Glu Leu Asn Arg Arg Lys Asn His Lys Gly Met Ile Phe Val 85 90 95 Glu Asn Thr Val Asp Leu Glu Gly Pro Pro Ser Asp Phe Tyr Tyr Ile 100 105 110 Asn Glu Tyr Lys Pro Ala Pro Gly Ile Ser Leu Val Asn Glu Ala Thr 115 120 125 Phe Gly Cys Ser Cys Thr Asp Cys Phe Phe Gln Lys Cys Cys Pro Ala 130 135 140 Glu Ala Gly Val Leu Leu Ala Tyr Asn Lys Asn Gln Gln Ile Lys Ile 145 150 155 160 Pro Pro Gly Thr Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser Arg Cys Gln Cys Gly 165 170 175 Pro Asp Cys Pro Asn Arg Ile Val Gln Lys Gly Thr Gln Tyr Ser Leu 180 185 190 Cys Ile Phe Arg Thr Ser Asn Gly Arg Gly Trp Gly Val Lys Thr Leu 195 200 205 Val Lys Ile Lys Arg Met Ser Phe Val Met Glu Tyr Val Gly Glu Val 210 215 220 Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Phe Tyr Asp Asn Lys 225 230 235 240 Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr 245 250 255 Val Asp Ala Ala Arg Tyr Gly Asn Val Ser His Phe Val Asn His Ser 260 265 270 Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Phe Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp 275 280 285 Thr Arg Leu Pro Arg Ile Ala Leu Phe Ser Thr Arg Thr Ile Asn Ala 290 295 300 Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Gln Met Lys Gly Ser Gly Asp Ile 305 310 315 320 Ser Ser Asp Ser Ile Asp His Ser Pro Ala Lys Lys Arg Val Arg Thr 325 330 335 Val Cys Lys Cys Gly Ala Val Thr Cys Arg Gly Tyr Leu Asn 340 345 350 <210> 56 <211> 230 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Met Ala Ala Val Gly Ala Glu Ala Arg Gly Ala Trp Cys Val Pro Cys 1 5 10 15 Leu Val Ser Leu Asp Thr Leu Gln Glu Leu Cys Arg Lys Glu Lys Leu 20 25 30 Thr Cys Lys Ser Ile Gly Ile Thr Lys Arg Asn Leu Asn Asn Tyr Glu 35 40 45 Val Glu Tyr Leu Cys Asp Tyr Lys Val Val Lys Asp Met Glu Tyr Tyr 50 55 60 Leu Val Lys Trp Lys Gly Trp Pro Asp Ser Thr Asn Thr Trp Glu Pro 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Lys Cys Pro Leu Leu Leu Gln Gln Phe Ser Asn Asp 85 90 95 Lys His Asn Tyr Leu Ser Gln Val Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg 100 105 110 Arg Gly Gln Phe Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Asp Leu 115 120 125 Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala Arg Tyr Gly Asn 130 135 140 Val Ser His Phe Val Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Phe 145 150 155 160 Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp Thr Arg Leu Pro Arg Ile Ala Leu 165 170 175 Phe Ser Thr Arg Thr Ile Asn Ala Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr 180 185 190 Gln Met Lys Gly Ser Gly Asp Ile Ser Ser Asp Ser Ile Asp His Ser 195 200 205 Pro Ala Lys Lys Arg Val Arg Thr Val Cys Lys Cys Gly Ala Val Thr 210 215 220 Cys Arg Gly Tyr Leu Asn 225 230 <210> 57 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Met Glu Tyr Tyr Leu Val Lys Trp Lys Gly Trp Pro Asp Ser Thr Asn 1 5 10 15 Thr Trp Glu Pro Leu Gln Asn Leu Lys Cys Pro Leu Leu Leu Gln Gln 20 25 30 Phe Ser Asn Asp Lys His Asn Tyr Leu Ser Gln Val Ile Thr Ser Glu 35 40 45 Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Phe Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr 50 55 60 Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala 65 70 75 80 Arg Tyr Gly Asn Val Ser His Phe Val Asn His Ser Cys Asp Pro Asn 85 90 95 Leu Gln Val Phe Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp Thr Arg Leu Pro 100 105 110 Arg Ile Ala Leu Phe Ser Thr Arg Thr Ile Asn Ala Gly Glu Glu Leu 115 120 125 Thr Phe Asp Tyr Gln Met Lys Gly Ser Gly Asp Ile Ser Ser Asp Ser 130 135 140 Ile Asp His Ser Pro Ala Lys Lys Arg Val Arg Thr Val Cys Lys Cys 145 150 155 160 Gly Ala Val Thr Cys Arg Gly Tyr Leu Asn 165 170 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 aaggattaga ctgaaccgaa ttggtatata gtt 33 <210> 59 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 aaggattaga ctgagctgaa ttggtatata gt 32 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 caaactacca cttacctccc tcaccaaagc cca 33 <210> 61 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 caaactacca cttacctccc tcaccaaagc ccat 34 <210> 62 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 caaactacca cctacctccc tcaccaaagc cca 33 <210> 63 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 attaatgcaa acaataccta acagacccac ag 32 <210> 64 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 attaatgcaa acaataccta acagacccac a 31 <210> 65 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 attaatgcaa acagtaccta acaaacctac ag 32 <210> 66 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 gtactcccga ttgaaacccc cattcgtata ata 33 <210> 67 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 gtactcccga ttgaaacccc cattcgtata ataa 34 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 gtactcccga ttgaagcccc cattcgtata ata 33 <210> 69 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 ctccctagga ggcctgcccc cgctaaccgg ctt 33 <210> 70 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 ctccctagga ggcctacccc cgctaaccgg ctt 33

Claims (73)

  1. 하이브리드 난모세포를 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 구성원의 발현을 증가시키는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 하이브리드 난모세포는 인간 체세포의 유전 물질을 포함하는 제핵(enucleated) 인간 난모세포인 것인, 인간 체세포 핵 이식(human somatic nuclear transfer: hSCNT)의 효율을 증가시키는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 하이브리드 난모세포의 활성화 또는 융합 후에 일어나지만, 인간 접합 유전자 활성화(zygotic genome activation: ZGA)가 시작되기 전에 일어나는 것인 방법.
  3. (iv) 공여자 인간 체세포 또는 수용자 인간 난모세포를 상기 공여자 인간 체세포 또는 상기 수용자 인간 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 수용자 인간 난모세포는 유핵 또는 제핵 난모세포인 단계; 상기 인간 난모세포가 유핵인 경우 수용자 인간 난모세포에서 핵을 제거하는 단계; 상기 핵을 상기 공여자 인간 체세포에서 상기 제핵 난모세포로 이식하여 하이브리드 난모세포를 형성하는 단계; 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는
    (v) 하이브리드 난모세포를 상기 하이브리드 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 상기 하이브리드 난모세포는 인간 체세포의 유전 물질을 포함하는 제핵 인간 난모세포인 것인 단계, 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는
    (vi) 활성화 후의 인간 SCNT 배아를 상기 인간 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 SCNT 배아는 제핵 인간 난모세포와 인간 체세포의 유전 물질의 융합으로부터 생성된 것인 단계; 중 하나 이상을 포함하고,
    상기 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 상기 인간 SCNT 배아 중 어느 하나에서 H3K9me3 메틸레이션의 감소는 SCNT의 효율을 증가시키는 것인, 인간 체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer: SCNT)의 효율을 증가시키는 방법.
  4. a. (i) 공여자 인간 체세포 또는 수용자 인간 난모세포를 상기 공여자 인간 체세포 또는 상기 수용자 인간 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계; 여기에서 상기 수용자 인간 난모세포는 유핵 또는 제핵 난모세포이고; 상기 인간 난모세포가 유핵인 경우 상기 수용자 인간 난모세포에서 핵을 제거하는 단계; 상기 핵을 상기 공여자 인간 체세포에서 상기 제핵 난모세포로 이식하여 하이브리드 난모세포를 형성하는 단계; 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는
    (ii) 하이브리드 난모세포를 상기 하이브리드 난모세포에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 상기 하이브리드 난모세포는 인간 체세포의 유전 물질을 포함하는 제핵 인간 난모세포인 것인 단계, 및 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시켜 인간 SCNT 배아를 형성하는 단계; 또는
    (iii) 활성화 후의 인간 SCNT 배아를 상기 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 SCNT 배아는 제핵 인간 난모세포와 인간 체세포의 유전 물질의 융합으로부터 생성된 것인 단계; 중 하나 이상,
    b. 상기 SCNT 배아를 배반포를 형성하기 위한 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 상기 배반포로부터 하나 이상의 할구를 수집하는 단계 및 상기 하나 이상의 할구를 배양하여 하나 이상의 인간 NT-ESC를 형성하는 단계를 포함하는,
    인간 핵 이식 배아줄기세포(human nuclear transfer embryonic stem cell: hNT-ESC)를 제조하는 방법.
  5. 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포 또는 인간 체세포 핵 이식(SCNT) 배아 중 하나 이상을 상기 공여자 인간 체세포, 상기 수용자 인간 난모세포 또는 상기 인간 SCNT 배아에서 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 수용자 인간 난모세포는 유핵 또는 제핵 난모세포인 것인 단계;
    상기 인간 난모세포가 유핵인 경우 상기 수용자 인간 난모세포에서 핵을 제거하는 단계;
    상기 핵을 상기 공여자 인간 체세포에서 상기 제핵 난모세포로 이식하여 하이브리드 난모세포를 형성시키는 단계; 상기 하이브리드 난모세포를 활성화시키는 단계 및
    상기 하이브리드 난모세포를 상기 인간 SCNT 배아를 형성하기 위해 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 인간 체세포 핵 이식(SCNT) 배아를 제조하는 방법.
  6. 청구항 2 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제는 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 패밀리의 구성원의 발현을 증가시키는 제제인 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 제제는 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 (JMJD2) 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 KDM4A (JMJD2A), KDM4B (JMJD2B), KDM4C (JMJD2C), KDM4D (JMJD4D) 또는 KDM4E (JMJD2E) 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 KDM4A (JMJD2A)의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45에 상응하는 핵산 서열, 또는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45의 상응하는 서열과 비교하여 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1에 상응하는 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 핵산 서열과 비교하여 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제인 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제는 SUV39h1 또는 SUV39h2인 것인 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제는 SETDB1인 것인 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, SUV39h1, SUV39h2 및 SETDB 1 중 둘 이상이 억제된 것인 방법.
  16. 청구항 12에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제는 RNAi 제제, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpfl 올리고뉴클레오티드, 중화 항체 또는 항체 단편, 압타머, 소분자, 펩티드 억제제, 단백질 억제제, 아비디미르(avidimir), 및 그의 기능성 단편 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 RNAi 제제는 siRNA 또는 shRNA 분자인 것인 방법.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 14-16, 47, 49, 51, 52 또는 53 중 어느 하나의 발현을 억제하기 위한 핵산 억제제를 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 RNAi 제제는 서열번호 14-16, 47, 49, 51, 52 또는 53의 적어도 일부에 혼성화하는 것인 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 RNAi 제제는 서열번호 7, 8, 또는 서열번호 18 또는 19의 핵산 또는 그의 10개 이상의 연속적인 핵산의 단편, 또는 서열번호 7, 8 또는 서열번호 18 또는 19와 80% 이상 동일한 서열을 가지는 동족체(homologue) 중 어느 하나 또는 조합을 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용자 인간 난모세포는 제핵 인간 난모세포인 것인 방법.
  22. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 1-세포기 SCNT 배아, 활성화 후 5시간(5 hours post activation: 5hpa) SCNT 배아, 활성화 후 10-12시간(10-12 hours post activation: 10-12hpa) SCNT 배아, 활성화 후 20-28시간(20-28 hours post activation: 20-28hpa) SCNT 배아, 2-세포기 SCNT 배아 중 임의의 것으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 핵 이식 이전에 수용자 인간 난모세포 또는 제핵 인간 난모세포와 접촉하는 것인 방법.
  24. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 활성화 후 약 5시간 이전에, 또는 활성화 후 약 5시간에, 또는 SCNT 배아가 1-세포기에 있을 때 인간 SCNT 배아와 접촉하는 것인 방법.
  25. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 활성화 후 5시간(5hpa) 후, 또는 활성화 후 12시간(hpa) 후, 또는 활성화 후 20시간(20hpa) 후, 또는 SCNT 배아가 2-세포기에 있을 때, 또는 5hpa와 28hpa 사이의 임의의 시간에 인간 SCNT 배아와 접촉하는 것인 방법.
  26. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 수용자 인간 난모세포 또는 하이브리드 난모세포, 또는 인간 SCNT 배아를 제제와 접촉시키는 단계는 상기 제제를 상기 수용자 인간 난모세포 또는 하이브리드 난모세포, 또는 인간 SCNT 배아의 핵 또는 세포질에 주입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  27. 청구항 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 방법.
  28. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 제핵 인간 난모세포로 주입하기 위한 핵의 제거 이전에 공여자 인간 체세포의 세포질 또는 핵과 접촉하는 것인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 상기 공여자 인간 체세포의 핵을 제핵 인간 난모세포로 주입하기 이전에 24시간 이상, 또는 1일 이상 동안 접촉되는 것인 방법.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 제제는 상기 공여자 인간 체세포의 핵을 제핵 인간 난모세포로 주입하기 이전에 24시간 이상, 또는 48시간 이상, 또는 3일 이상 동안 상기 공여자 인간 체세포와 접촉하는 것인 방법.
  31. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 것인 방법.
  32. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제는 SUV39h1 또는 SUV39h2, 또는 SUV39h1 및 SUV39h2 (SUV39h1/2)인 것인 방법.
  33. 청구항 1 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 최종 분화 체세포인 것인 방법.
  34. 청구항 1 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 배아줄기세포, 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPS cell), 또는 태아세포(fetal cell), 또는 배아세포(embryonic cell)가 아닌 것인 방법.
  35. 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질형성세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, 적혈구, 대식세포, 단핵구, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아줄기세포, 배아생식세포, 태아세포, 태반세포, 및 성체세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  36. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 섬유아세포 또는 난구세포인 것인 방법.
  37. 청구항 1 또는 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 제핵 수용자 인간 난모세포로 주입하기 위한 핵이 공여자 인간 체세포로부터 제거될 때까지 공여자 인간 체세포의 핵과 접촉하는 것인 방법.
  38. 청구항 1 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제의 부존재 하에 수행된 hSCNT와 비교하여 hSCNT의 배반포 단계까지 효율의 10% 이상 증가를 야기하는 것인 방법.
  39. 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제의 부존재 하에 수행된 hSCNT와 비교하여 hSCNT의 효율의 10-20% 증가를 야기하는 것인 방법.
  40. 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제의 부존재 하에 수행된 hSCNT와 비교하여 hSCNT의 효율의 20% 이상 증가를 야기하는 것인 방법.
  41. 청구항 38 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, SCNT 효율의 증가는 인간 SCNT 배아의 배반포 단계로의 발달의 증가인 것인 방법.
  42. 청구항 38 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, SCNT 효율의 증가는 인간 SCNT 배아 유도 배아줄기세포(human SCNT embryo-derived embryonic stem cells: hNT-ESC)들의 유도의 증가인 것인 방법.
  43. 청구항 1 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포는 유전적으로 변형된 공여자 인간 세포인 것인 방법.
  44. 청구항 5에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아를 인 비트로(in vitro) 배양하여 인간 배반포를 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 하나 이상의 4-세포 인간 SCNT 배아인 것인 방법.
  46. 청구항 44에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 하나 이상의 4-세포 SCNT 배아인 것인 방법.
  47. 청구항 44에 있어서, 인간 배반포에서 내부 세포 덩어리로부터 세포를 분리하는 단계; 및 미분화된 상태의 상기 내부 세포 덩어리 유래 세포를 배양하여 인간 배아줄기(embryonic stem: ES) 세포를 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
  48. 청구항 1 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포 또는 인간 SCNT 배아 중 어느 하나 이상은 동결 및 해동된 것인 방법.
  49. 청구항 1 내지 48 중 어느 한 항의 방법으로부터 제조된 인간 SCNT 배아 유도 배아줄기세포(hNT-ESC)들의 집단.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 hNT-ESC들은 유전적으로 변형된 hNT-ESC들인 것인 hNT-ESC들의 집단.
  51. 청구항 49에 있어서, 상기 hNT-ESC들은 다능성줄기세포 또는 전능성줄기세포인 것인 hNT-ESC들의 집단.
  52. 청구항 49에 있어서, 상기 hNT-ESC들은 배양 배지에 존재하는 것인 hNT-ESC들의 집단.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 배양 배지는 상기 hNT-ESC들을 다능성 또는 전능성 상태로 유지하는 것인 hNT-ESC들의 집단.
  54. 청구항 52에 있어서, 상기 배양 배지는 상기 hNT-ESC들의 동결 또는 냉동보존에 적합한 배지인 것인 hNT-ESC들의 집단.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 hNT-ESC의 집단은 동결 또는 냉동보존된 것인 hNT-ESC들의 집단.
  56. 청구항 1 내지 55의 방법에 의해 제조된 인간 SCNT 배아.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 유전적으로 변형된 것인 인간 SCNT 배아.
  58. 청구항 56에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 수용자 인간 난모세포 유래가 아닌 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA: mtDNA)를 포함하는 것인 인간 SCNT 배아.
  59. 청구항 56에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 배양 배지에 존재하는 것인 인간 SCNT 배아.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 배양 배지는 인간 SCNT의 동결 또는 냉동보존에 적합한 배지인 것인 인간 SCNT 배아.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 인간 배아는 동결 또는 냉동보존된 것인 인간 SCNT 배아.
  62. 인간 SCNT 배아, 수용자 인간 난모세포, 인간 하이브리드 난모세포 또는 배반포 중 하나 이상 및
    a. 히스톤 데메틸라제의 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제; 또는
    b. H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
  63. 청구항 62에 있어서, 상기 히스톤 데메틸라제의 KDM4 (JMJD2) 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제는 KDM4A (JMJD2A), KDM4B (JMJD2B), KDM4C (JMJD2C), KDM4D (JMJD2D) 또는 KDM4E (JMJD2E) 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 조성물.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 제제는 KDM4D (JMJD2D) 또는 KDM4A (JMJD2A)의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 조성물.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45에 상응하는 핵산, 또는 서열번호 1-4 또는 서열번호 45의 상응하는 서열과 비교하여 인간 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것인 조성물.
  66. 청구항 64에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1에 상응하는 핵산, 또는 서열번호 1의 핵산 서열과 비교하여 SCNT의 효율을 유사 이상의 정도로 증가시키는 그의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것인 조성물.
  67. 청구항 62에 있어서, 상기 H3K9 메틸트랜스페라제의 억제제는 SUV39h1, SUV39h2, 또는 SETDB 1 중 하나 이상 또는 임의의 조합을 억제하는 것인 조성물.
  68. 청구항 62에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 1-세포기, 2-세포기, 또는 4-세포기 인간 SCNT 배아인 것인 조성물.
  69. 청구항 62에 있어서, 상기 수용자 인간 난모세포는 제핵 수용자 인간 난모세포인 것인 조성물.
  70. 청구항 62에 있어서, 상기 인간 SCNT 배아는 최종 분화 인간 체세포의 핵의 주입으로부터 제조된 것이거나, 또는 상기 배반포는 최종 분화 인간 체세포의 핵을 제핵 인간 난모세포로 주입하는 것으로부터 제조된 인간 SCNT 배아로부터 발달된 것인 조성물.
  71. (i) 히스톤 데메틸라제의 인간 KDM4 패밀리의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제 및/또는 H3K9 메틸트랜스페라제를 억제하는 제제 및 (ii) 인간 난모세포를 포함하는 키트.
  72. 청구항 92에 있어서, 상기 인간 난모세포는 제핵 난모세포인 것인 키트.
  73. 청구항 92에 있어서, 상기 인간 난모세포는 비-인간 난모세포인 것인 키트.
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