JP2003530874A - 貧血の予防及び治療用の方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 エリトロポエチンの高グリコシル化類似体の投与から成る、哺乳動物体内のヘマトクリットの増加及び維持方法が開示されている。類似体は、組換えヒトエリトロポエチンと同等のヘマトクリット目標値に到達して貧血を治療するために、等価のモル量の組換えヒトエリトロポエチンよりも少ない頻度で投与され得る。あるいは、高グリコシル化類似体は、組換えヒトエリトロポエチンと同等のヘマトクリット目標値に到達して貧血を治療するために、組換えヒトエリトロポエチンよりも少ないモル量で投与し得る。また、新規な高グリコシル化エリトロポエチン類似体、該類似体の製造方法、及び、該類似体を含む組成物が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、哺乳動物のヘマトクリット増加を目的とするエリトロポエチンの高
グリコシル化類似体の使用に関する。より特定的には本発明は、ヘマトクリット
の増加及び維持並びに貧血治療の目的に組換えヒトエリトロポエチンに比較して
少ない投与頻度で使用される高グリコシル化類似体に関する。本発明はまた、ヘ
マトクリットの増加及び維持並びに貧血治療の目的に組換えヒトエリトロポエチ
ンに比較して等しい投与頻度では少ない量で投与される高グリコシル化類似体の
使用に関する。エリトロポエチンの新規な高グリコシル化類似体も提供される。

【０００２】 （発明の背景） エリトロポエチン（Ｅｐｏ）は赤血球系前駆細胞を赤血球に成熟させるために
必要な糖タンパク質ホルモンである。エリトロポエチンは腎臓で産生されており
、循環血中の赤血球のレベルを調節するために必須である。組織酸素のレベル低
下状態が生じるとＥｐｏの産生増加が指令され、次いで赤血球形成が刺激される
。例えば慢性腎不全（ＣＲＦ）に見られるように腎機能が失われると、典型的な
結果としてＥｐｏの産生量が減少し、これに付随して赤血球が減少する。

【０００３】 ヒト尿中のＥｐｏは、Ｍｉｙａｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，５
５５８（１９７７））によって再生不良性貧血の患者から精製された。しかしな
がら、このソースから得られた精製Ｅｐｏタンパク質の量は治療用途に十分では
なかった。ヒトＥｐｏをコードしている遺伝子の同定とクローニング及び組換え
タンパク質の発現は、Ｌｉｎの米国特許第４，７０３，００８号に開示されてい
る。該特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。細胞培地か
ら組換えヒトエリトロポエチンを精製する方法はＬａｉらの米国特許第４，６６
７，０１６号に開示されている。該特許は参照によって本発明に含まれるものと
する。哺乳動物の宿主細胞から生物活性Ｅｐｏを産生させることによって治療用
途に適した量のＥｐｏが初めて入手可能になった。更に、遺伝子配列の解明が進
みかつ精製タンパク質の入手可能性が拡大したことはこのタンパク質の作用モー
ドに関する理解を深めることに役立った。

【０００４】 ヒト尿に由来のＥｐｏ（Ｍｉｙａｋｅら、前出）及び哺乳動物細胞中で発現さ
れた組換えヒトＥｐｏの双方が、３つのＮ結合オリゴ糖鎖と１つのＯ結合オリゴ
糖鎖とを含んでおり、これらのオリゴ糖鎖は合わせて糖タンパク質の全分子量の
約４０％を構成している。Ｎ結合グリコシル化は２４、３８及び８３位に存在す
るアスパラギン残基で生じ、Ｏ結合グリコシル化は１２６位に存在するセリン残
基で生じる（Ｌａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，３１１６（１９８６
）；Ｂｒｏｕｄｙら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６５，３
２９（１９８８））。オリゴ糖鎖は末端シアル酸残基によって修飾されているこ
とが判明し、典型的にはＮ結合鎖が１つの鎖あたり４個までのシアル酸を有して
おり、Ｏ結合鎖が２個までのシアル酸を有している。従ってＥｐｏポリペプチド
は合計１４個までのシアル酸を含み得る。

【０００５】 種々の研究は、Ｅｐｏの糖鎖の変化が生物活性に影響を及ぼし得ることを示し
た。しかしながら１つの研究によれば、グリコシル化部位であるアスパラギンま
たはセリンの突然変異誘発によってＮ結合オリゴ糖鎖またはＯ結合オリゴ糖鎖が
単独でまたは一緒に除去されると、哺乳動物の細胞中で産生される改変Ｅｐｏの
ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は著しく減少する（Ｄｕｂｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６３，１７５１６（１９８８））。しかしながら、ＤｅＬｏｒｍｅら（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，９８７１−９８７６（１９９２））は、Ｅｐｏ中
のＮ結合グリコシル化部位の除去はｉｎ ｖｉｖｏの生物活性を減少させたがｉ
ｎ ｖｉｔｒｏの生物活性を減少させなかったと報告した。

【０００６】 Ｅｐｏのシアル酸含量とｉｎ ｖｉｖｏ生物活性との関係は単離したＥｐｏア
イソフォームのｉｎ ｖｉｖｏ活性を測定することによって明らかになった。等
モル濃度の単離Ｅｐｏアイソフォームの正常マウスのヘマトクリット増加能力を
測定し、Ｅｐｏ１分子あたりのシアル酸含量を段階的に増加させると、これに対
応してｉｎ ｖｉｖｏ生物活性が段階的に増加することが知見された（Ｅｇｒｉ
ｅら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１０，２６３（１９９３））。高い
シアル酸含量であるＥｐｏアイソフォームは、また血清半減期が長期であること
が示されたが、Ｅｐｏ受容体に対する親和性は低下していることより、血清半減
期がｉｎ ｖｉｖｏ生物活性の重要な決定要因であることが示唆された。

【０００７】 Ｅｐｏポリペプチド中に新しいグリコシル化部位を導入すると、その結果とし
て追加の糖鎖をもつ分子が産生される。国際特許公開ＷＯ９１／０５８６７及び
ＷＯ９４／０９２５７参照。これらの特許はその記載内容全部が参照によって本
発明に含まれるものとする。少なくとも１個の追加のＮ結合糖鎖及び／または少
なくとも１個の追加のＯ結合糖鎖を有しているＥｐｏのグリコシル化類似体が開
示されている。１個の追加Ｎ結合鎖を有しているグリコシル化類似体は、組換え
ヒトＥｐｏ（ｒＨｕＥｐｏ）（アイソフォーム９−１４）及び１分子あたり１４
個のシアル酸を有しているｒＨｕＥｐｏの精製アイソフォームに比較して循環半
減期が延長していることが判明した。

【０００８】 組換えヒトエリトロポエチン（ｒＨｕＥｐｏ）の投与は末期の腎臓病に罹患し
た貧血患者の赤血球レベルを上昇させるために有効である（Ｅｓｃｈｂａｃｈら
，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，７３−３８（１９８７））。その後の
研究は、ｒＨｕＥｐｏによる治療が多様な別の病態に付随する貧血を改善するこ
とを証明した。（Ｆｉｓｃｈｌら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２，１４
８８−１４９３（１９９０）；Ｌａｕｐａｃｉｓ，Ｌａｎｃｅｔ ３４１，１２
２８−１２３２（１９９３）。ＣＲＦに付随する貧血、ＨＩＶ感染患者のＡＺＴ
（ジドブジン）療法に関連する貧血、化学療法を受けている非骨髄性悪性腫瘍患
者の貧血、外科手術を受けた患者の貧血の治療において同種異系血液の輸血の必
要性を軽減するためにｒＨｕＥｐｏを使用することは規制付きで認可された。認
可された全部の適応症（外科適用を除く）に対する現行の治療方法では、示唆さ
れた目標ヘマトクリット範囲に達するまで５０−１５０単位／ｋｇの出発投与量
を週３回（ＴＩＷ）の頻度で静脈内（ＩＶ）注射または皮下（ＳＣ）注射によっ
て投与する。外科に適用するときは、ｒＨｕＥｐｏを手術前１０日間、手術当日
及び手術後４日間にわたって毎日投与する（ＥＰＯＧＥＮ^ＲＴＭ Ｐａｃｋａｇ
ｅ Ｉｎｓｅｒｔ，１２／２３／９６）。一般に、現在勧告されているｒＨｕＥ
ｐｏの出発投与量はヘマトクリットを約６週から８週で目標範囲に上昇させる。
いったん目標ヘマトクリット範囲に到達した後で維持投与スケジュールを作成す
る。これは患者次第で様々に異なるが、典型的には、ＣＲＦに付随する貧血の患
者では週３回である。上述のｒＨｕＥｐｏの投与は貧血を治療するための有効で
ありかつ十分な許容薬量の投与計画である。

【０００９】 ｒＨｕＥｐｏよりも効力の大きい治療薬を得ることが要望されている。このよ
うな分子の利点は、より少ない頻度及び／またはより少ない用量で投与できるこ
とであろう。現行の治療では、貧血に罹った患者にはＥＰＯＧＥＮ^ＲＴＭの週３
回投与が必要であり、外科手術患者には１日１回の投与が必要である。投与頻度
を減らしたスケジュールは医師及び患者の双方に都合がよく、特に医院または診
療所に定期的に通院しない患者、または、Ｅｐｏを自身で注射する患者に好都合
であろう。より高い効力をもつ分子の別の利点は、同等のヘマトクリット増加を
得るために患者の体内に導入する薬物の量を節減できることである。

【００１０】 従って本発明の目的は、投与頻度を減らしたスケジュールが可能であるような
より高い効力をもつ貧血治療用分子を同定することである。本発明の別の目的は
、節減用量で投与されてもＥｐｏで得られるレベルと少なくとも同等のレベルに
ヘマトクリットを増加及び維持する分子を提供することである。本発明の目的は
また、投与頻度を減らすように選択されたこれらの分子がｒＨｕＥｐｏと少なく
とも同様の許容薬量を有すること、ある種の患者にはｒＨｕＥｐｏよりも優れた
許容薬量を有し得ることである。

【００１１】 （発明の概要） Ｎ４７（Ａｓｎ^３０Ｔｈｒ^３２Ｖａｌ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０ Ｅｐｏ）と
呼ばれる高グリコシル化Ｅｐｏ類似体が組換えヒトエリトロポエチン（ｒＨｕＥ
ｐｏ）と同じ用量及び同じ頻度で投与されたときにｒＨｕＥｐｏよりも長い血清
半減期及び大きいｉｎ ｖｉｖｏ活性を有することが知見された。更に、該類似
体の週１回の投与によって得られるマウスのヘマトクリット増加がｒＨｕＥｐｏ
の週３回の投与によって得られるヘマトクリット増加と同等であることが証明さ
れた。Ｅｐｏ類似体Ｎ４７はマウスに投与されたときにもヒトに投与されたとき
にも同様の薬物動態を示した。

【００１２】 本発明は、治療有効量の高グリコシル化Ｅｐｏ類似体を医薬組成物として投与
することから成り、同等のヘマトクリット目標値を得るために類似体が等価のモ
ル量のｒＨｕＥｐｏよりも少ない頻度で投与されることを特徴とする哺乳動物の
ヘマトクリットの増加及び維持方法を提供する。患者の最適ヘマトクリット範囲
に到達するための本発明の投与頻度は週３回未満である。投与頻度は週２回、週
１回、または週１回未満、例えば、隔週１回、月１回、隔月１回などでもよい。
患者のヘマトクリット目標値を維持するために必要な投与頻度は週３回未満であ
る。投与頻度は、週２回、週１回、または週１回未満、例えば、隔週１回、月１
回、隔月１回などでもよい。

【００１３】 本発明はまた、治療有効量の高グリコシル化Ｅｐｏ類似体を投与することから
成り、同等のヘマトクリット目標値を得るために類似体がｒＨｕＥｐｏよりも少
ないモル量で投与されることを特徴とする哺乳動物のヘマトクリットの増加及び
維持方法を提供する。

【００１４】 本発明はまた、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体を含む医薬組成物であって、該組
成物が週３回未満の投与頻度に適しているような医薬組成物を提供する。該組成
物は、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体と共に使用するのに適した医薬として許容さ
れるアジュバントを含むであろう。

【００１５】 本発明はまた、腎機能の減退または低下（慢性腎不全）、骨髄抑制療法、癌、
ウイルス感染、慢性疾患、及び、外科処置中の出血過多に付随する貧血のような
赤血球のレベル低下を生じるいかなる病態にも使用され得る。１つの実施態様に
よれば、慢性腎不全から生じた貧血の治療が週１回またはそれ以下の投与頻度で
行われる。

【００１６】 また、Ｅｐｏの新規な高グリコシル化類似体が提供される。類似体はｒＨｕＥ
ｐｏに比較して少なくとも１個の追加の糖鎖を含み、少なくとも１個のＮ結合糖
鎖が５２、５３、５５、８６及び１１４位のいずれかの位置に付加されている。
新規な高グリコシル化類似体は、２個、３個または４個の追加の糖鎖を有してい
てもよく、４個よりも多い追加の鎖を有していてもよい。

【００１７】 （図面の簡単な説明） 図１（配列１）はヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列を示す。

【００１８】 図２は、無血清培地中のＣＨＯ細胞発現から得られたｒＨｕＥｐｏ及び高グリ
コシル化Ｅｐｏ類似体のウェスタンブロット分析を示す。類似体Ｎ５３及びＮ６
１の構築は実施例１に記載されている。各類似体のＮ結合糖鎖の数が示されてい
る。

【００１９】 図３は、重篤な低酸素症状（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ）の赤血球増加症マウスのバ
イオアッセイにおけるｒＨｕＥｐｏ、Ｅｐｏ類似体Ｎ４、Ｎ１８及びＮ５０（４
個のＮ結合糖鎖を含む）、Ｎ４７（５個のＮ結合糖鎖を含む）、及び、Ｎ５３（
６個のＮ結合糖鎖を含む）の活性を比較している。実験手順は実施例３に記載さ
れている。各点は、５匹の動物の平均応答を表す。類似体Ｎ４、Ｎ１８及びＮ４
７は先行文献ＷＯ９４／０９２５７に記載されている。

【００２０】 図４は、静注（ＩＶ）によって正常ラットに投与されたｒＨｕＥｐｏ及びＥｐ
ｏ類似体Ｎ４７の血清半減期を比較している。実験手順は実施例４に記載されて
いる。結果は各グループの平均（＋／−ＳＤ）である。

【００２１】 図５は、静注（ＩＶ）によってビーグル犬に投与されたｒＨｕＥｐｏ及びＥｐ
ｏ類似体Ｎ４７の血清半減期を比較している。実験手順は実施例４に記載されて
いる。結果は各グループの平均（＋／−ＳＤ）である。

【００２２】 図６は、腹腔内注射（ＩＰ）によって週３回（ＴＩＷ）の頻度で６週間継続で
投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏ類似体Ｎ４７に応答したマウス
のヘマトクリットの増加を示す。実験手順は実施例５に記載されている。示した
結果は各投与量グループのヘマトクリットの変化のグループ平均（＋／−ＳＤ）
である。

【００２３】 図７は、腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）の投与経路によって週１回（Ｑ
Ｗ）または週３回（ＴＩＷ）の頻度で注射したｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ類似体Ｎ
４７のマウス体内での相対的効力を示す。実験手順は実施例５に記載されている
。各点は以下のような別々の実験から得られたデータの平均（＋／−ＳＤ）を表
す：Ｎ４７、ＩＰ、ＴＩＷ（ｎ＝５）；Ｎ４７、ＩＶ、ＴＩＷ（ｎ＝１）；Ｎ４
７、ＩＰ、ＱＷ（ｎ＝２）；Ｎ４７、ＩＶ、ＱＷ（ｎ＝３）；ｒＨｕＥｐｏ、Ｉ
Ｐ、ＴＩＷ（ｎ＝５）；ｒＨｕＥｐｏ、ＩＶ、ＱＷ（ｎ＝２）。各実験では１用
量あたり７−１３匹のマウスを使用した。

【００２４】 図８は、静注（ＩＶ）によって週１回（ＱＷ）の頻度でほぼ６週間継続投与し
た種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏ類似体Ｎ４７に応答したマウスのヘマ
トクリットの増加を示す。実験手順は実施例５に記載されている。示した結果は
各用量グループのヘマトクリットの変化のグループ平均（＋／−ＳＤ）である。

【００２５】 図９は、静注（ＩＶ）によって週１回（ＱＷ）または隔週１回（ＥＯＷ）の頻
度でほぼ６週間継続投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏ類似体Ｎ４
７に応答したマウスのヘマトクリットの増加を示す。実験手順は実施例５に記載
されている。示した結果は各用量グループのヘマトクリットの変化のグループ平
均（＋／−ＳＤ）である。

【００２６】 図１０（配列：２５）は、ヒトＩｇＧγ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ
３領域のアミノ酸配列を示す。

【００２７】 図１１（配列：２５）は、Ｅｐｏシグナル配列を含むＥｐｏ Ｎ４７−Ｆｃ融
合ポリペプチドのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。Ｆｃのアミノ末端残基がＥ
ｐｏのａｒｇ−１６６残基に融合している。

【００２８】 （詳細な説明） 本発明は、治療有効量の高グリコシル化エリトロポエチン類似体を医薬組成物
として投与することから成り、同等のヘマトクリット目標値を得るための類似体
の投与頻度が等価モル量のｒＨｕＥｐｏよりも少ないことを特徴とする哺乳動物
のヘマトクリットの増加及び維持方法を提供する。。本発明はまた、同等のヘマ
トクリット目標値を得るために高グリコシル化類似体をｒＨｕＥｐｏよりも少な
いモル量で投与することから成る哺乳動物のヘマトクリットの増加及び維持方法
を提供する。組成物は、静脈内、皮下または腹腔内の経路で投与され得る。

【００２９】 高グリコシル化Ｅｐｏ類似体としてＷＯ９４／０９２５７に記載されている類
似体Ｎ４７は意外にも、週３回の頻度で投与されたｒＨｕＥｐｏによって観察さ
れたヘマトクリット増加と同等のヘマトクリット増加を週１回の投与頻度で達成
することが知見された。類似体Ｎ４７は以下のアミノ酸変化、即ち、３０位のａ
ｌａがａｓｎ；３２位のｈｉｓがｔｈｒ；８７位のｐｒｏがｖａｌ；８８位のｔ
ｒｐがａｓｎ；９０位のｐｒｏがｔｈｒによって置換されたアミノ酸変化を有し
ており、その結果として３０位及び８８位のアスパラギン残基に２個のＮ結合糖
鎖が付加されている。類似体は、（実施例１に記載されているように）チャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現され、実施例２に記載されているよ
うに精製すると、１７−２２個のシアル酸を含むアイソフォームを得た。ラット
及びビーグル犬に静注したとき、類似体Ｎ４７はこれらの動物の体内でｒＨｕＥ
ｐｏよりも長い血清半減期を示した（図４及び図５）。週３回の頻度で腹腔内注
射したとき、正常マウスの体内で、ｒＨｕＥｐｏよりも低濃度のＮ４７はｒＨｕ
Ｅｐｏと同等のヘマトクリット増加を誘発した（図６）。週３回の頻度で投与さ
れたとき、Ｎ４７の効力はｒＨｕＥｐｏのほぼ３−４倍であることが判明した（
図６及び７）。週１回の頻度で投与したとき、同じ用量でｒＨｕＥｐｏは正常マ
ウスの体内でヘマトクリットをほとんど刺激しなかったが、Ｎ４７は顕著な増加
を誘発した（図８）。週１回の投与でＮ４７の効力はｒＨｕＥｐｏのほぼ１４倍
であった（図７）。週１回の頻度で投与された類似体Ｎ４７に対するヘマトクリ
ットレスポンスは週３回の頻度で投与されたｒＨｕＥｐｏのヘマトクリットレス
ポンスと同等であることは重要である。隔週１回の頻度で投与されたときにも、
Ｎ４７は正常マウスの体内でヘマトクリットの有意な増加を生じさせた（図９）
。総合的に考察すると、データは、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体、特に類似体４
７は現行のｒＨｕＥｐｏによる治療よりも少ない投与頻度で使用したときにもヘ
マトクリットの増加に有利であることを示唆した。

【００３０】 また、マウスで得られた上述の結果に基づいてヒトに対する結果を推定できる
ことも判明した。１１人の連続通院腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者に投与したｒＨｕ
Ｅｐｏ及び類似体４７の薬物動態パラメーターは、類似体Ｎ４７がｒＨｕＥｐｏ
の３倍に延長された血清半減期を有していることを示す（実施例６及び表５）。
これらの結果は、ヒトの場合にも高グリコシル化Ｅｐｏ類似体の投与頻度をｒＨ
ｕＥｐｏよりも少なくできることを示唆する。

【００３１】 本文中で使用された“高グリコシル化Ｅｐｏ類似体”という用語は、少なくと
も１つの追加のグリコシル化部位を含み、該部位に追加の糖鎖が付加されている
Ｅｐｏを意味する。Ｎ結合糖鎖またはＯ結合糖鎖がグリコシル化部位でもよい。
新しいＮ結合グリコシル化部位は、ポリペプチド鎖中でＮ結合糖質付加用コンセ
ンサス部位（アミノ酸Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）をコードするようにＤＮＡ
配列を変化させることによって導入し、新しいＯ結合部位は、セリン残基または
トレオニン残基をコードするようにＤＮＡ配列を変化させることによって導入す
る。類似体は、Ｅｐｏポリペプチド中のグリコシル化に利用できる部位を増加ま
たは変更するアミノ酸残基の付加、欠失または置換を導入する突然変異誘発技術
によって構築される。高グリコシル化Ｅｐｏ類似体をコードするＤＮＡを真核宿
主細胞にトランスフェクトし、発現された糖タンパク質について追加の糖鎖の存
在を分析する。

【００３２】 高グリコシル化Ｅｐｏ類似体はｉｎ ｖｉｔｒｏではｒＨｕＥｐｏで測定され
た値と同等または同等以下の活性を示した。これはＥｐｏ受容体に対する結合が
糖鎖の付加によって増進されないこと、いくつかの場合には該結合の減少もあり
得ることを示唆している。しかしながら、高グリコシル化は典型的に血清半減期
を延長し、潜在的にｉｎ ｖｉｖｏ生物活性を増加させ得る。１つの追加のＮ結
合糖鎖を８８位に有している１つのＥｐｏ類似体はｒＨｕＥｐｏ（アイソフォー
ム９−１４）または１分子あたり１４個のシアル酸を有している精製ｒＨｕＥｐ
ｏアイソフォームに比較して受容体に対する親和性が減少していることを示した
が、Ｅｐｏアイソフォーム９−１４の混合物または単離されたＥｐｏアイソフォ
ーム１４に比較して循環半減期の延長及びｉｎ ｖｉｖｏ活性の増進を示した。

【００３３】 本発明に従って投与され得る高グリコシル化Ｅｐｏ類似体は少なくとも１個の
追加のＮ結合糖鎖またはＯ結合糖鎖を有しているであろう。１つの実施態様にお
いては、該類似体が２個の追加のＮ結合糖鎖を有しているであろう。別の実施態
様では、類似体が３個、４個またはそれ以上の追加のＮ結合糖鎖を有しているで
あろう。例えば、本発明の類似体がヒトＥｐｏの配列の３０、５１、５７、６９
、８８、８９、１３６及び１３８位のアミノ酸残基の１つ以上に少なくとも１個
の追加のＮ結合鎖を有しているであろう。１つの実施態様では、類似体がヒトＥ
ｐｏの残基３０及び８８に追加のＮ結合糖鎖を有している。ヒトＥｐｏのアミノ
酸残基の番号は図１及び配列：１に示す。図１は、１６６アミノ酸から成る成熟
Ｅｐｏポリペプチドの予測配列を示すが、組換え産生されたＥｐｏはＣ末端アル
ギニン残基が除去された１６５個のアミノ酸を有している。ｒＨｕＥｐｏ及び高
グリコシル化Ｅｐｏ類似体は１６５個または１６６個のアミノ酸を有し得ること
が理解される。

【００３４】 本発明の類似体は少なくとも４個のＮ結合糖鎖を有しているであろう。４個の
鎖のうちで、３個は２４、３８及び８３位の天然発生部位であろう。しかしなが
ら、本発明のいくつかの類似体は１つまたは複数の天然発生グリコシル化部位に
変異を有していてもよい、例えば、１つまたは複数の部位が欠失しているかまた
は新しい部位で置換されていてもよいと考えられる。このような類似体も本発明
によって提供される。例えば、２４、３８及び８３位の部位のいずれかが欠失し
ているかまたは８８位の部位で置換されていてもよい。場合によっては類似体が
１２６位にＯ結合部位を有していてもよい。

【００３５】 本発明はまた、少なくとも１個の追加の糖鎖を有している新規な高グリコシル
化Ｅｐｏ類似体を提供する。グリコシル化部位になるように修飾された追加のＮ
結合糖鎖が５２、５３、５５、８６及び１１４位のいずれかの位置に付加されて
いることが知見された。特定実施態様としては、表１に記載のような類似体Ｎ４
９からＮ６１がある。新規な類似体は５２、５３、５５、８６及び１１４位のい
ずれかの位置に少なくとも１個の新しいＮ結合グリコシル化部位を有しており、
更に別の部位に追加のＮ結合糖鎖またはＯ結合糖鎖を有していてもよい。類似体
が１、２、３または４個の追加の糖鎖を有していてもよく、またはそれ以上の数
の追加の鎖を有していてもよい。１つの好ましい実施態様では、類似体が３個の
追加のＮ結合糖鎖（合計で６個のＮ結合鎖）を有しているであろう。別の好まし
い実施態様では、類似体が４個の追加のＮ結合鎖（合計で７個のＮ結合鎖）を有
しているであろう。３個または４個またはそれ以上の追加のＮ結合糖鎖を有して
いる類似体の非限定例は、５２、５３、５５、８６及び１１４位のいずれかの位
置に追加の鎖を有しているであろう。

【００３６】 意外にも、３０、５３及び８８位に３個の追加のＮ結合鎖（合計で６個のＮ結
合鎖）を有している高グリコシル化類似体は２個の追加の鎖（合計で５個）を有
している類似体Ｎ４７よりも大きいｉｎ ｖｉｖｏ活性を有することが知見され
た。結果を図３に示す。類似体のｉｎ ｖｉｖｏ活性がＮ結合糖鎖の数に直接従
属することは明らかである。これらの結果から推定して、Ｎ４７よりも多い数の
Ｎ結合糖鎖を有する類似体はより少ない頻度で投与し得るという治療計画を設定
できる。

【００３７】 本発明は更に、３０、５５及び８８位；３０、５５及び１１４位；並びに３０
、８８及び１１４位に３個の追加のＮ結合鎖をもつ高グリコシル化Ｅｐｏ類似体
を提供する。４個の追加のＮ結合鎖または３個の追加のＮ結合鎖をもちかつ１２
５位に１個の追加のＯ結合鎖をもつＥｐｏ類似体が提供される。

【００３８】 類似体は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変
異誘発（Ｚｏｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１００，４６８−５００（１９８
３）；Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｐｐ．１７７−１８３（
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ ３４，
３１５−３２３（１９８５））のような当業者が利用できる多様な突然変異誘発
技術によって作製され得る。実施例１は、新規な高グリコシル化Ｅｐｏ類似体を
構築するためのＰＣＲ突然変異誘発技術の使用を記載している。

【００３９】 突然変異誘発によって処理したＥｐｏ ＤＮＡ配列を標準技術を使用して発現
ベクターに挿入する。ベクターは哺乳動物宿主細胞中で適正に維持される。ベク
ターは典型的には以下の要素、即ち、哺乳動物宿主細胞中の使用に適合するプロ
モーター及びその他の“上流”調節要素、複製起点、リボソーム結合部位、転写
終結部位、ポリリンカー部位及び選択可能マーカーを含むであろう。ベクターは
更に、原核性宿主細胞中で増殖及び維持させるための要素を含み得る。

【００４０】 適当な細胞または細胞系はヒト起原のような哺乳動物起原である。その例は、
ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ登録番号ｎｏ．ＣＲＬ １６５１）、ヒト２９３、ベビー
ハムスター腎臓（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ登録ｎｏ．ＣＣＬ １０）、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損細胞、
Ｕｒｌａｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，４２１
６−４２２０（１９８０））である。その他の適当な哺乳動物細胞系の非限定例
は、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９及び３Ｔ３である。好ましい実施態様では、Ｄ
ＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞が使用される。

【００４１】 高グリコシル化Ｅｐｏ類似体をコードしている配列を含むベクターを形質転換
またはトランスフェクションのような標準技術によって宿主細胞に導入する。形
質転換するかまたはトランスフェクトした宿主細胞の培養、増幅及びスクリーニ
ングは公然と利用できる方法（Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２９３，６２
０−６２５（１９８１）；Ｋａｕｆｍａｎら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５ ，１７５０−１７５９（１９８５）；米国特許第４，４１９，４４６号）を使用
して行う。高グリコシル化Ｅｐｏ類似体をコードしているＤＮＡ配列を含む宿主
細胞を類似体が発現できる条件下で培養する。細胞培地から類似体を回収し、本
質的に先行文献（ＷＯ９４／０９２５７）に記載された手順及び実施例２の手順
を使用して精製する。追加の糖鎖を付加することによって得られた高いシアル酸
含量を有するＥｐｏアイソフォームを精製手順によって単離し得る。

【００４２】 高グリコシル化Ｅｐｏ類似体は、新しいグリコシル化部位に加えて、新しいグ
リコシル化部位を形成せず高グリコシル化類似体の生物活性を実質的に変化させ
ないようなアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含み得る。Ｅｐｏの生物活性
に影響を及ぼすことなく変異し得るような個々の部位または領域はＳｙｅｄら，
Ｎａｔｕｒｅ ３９５，５１１（１９９８）に記載されているようにＥｐｏ−Ｅ
ｐｏ受容体複合体の構造を試験することによって決定できる。Ｅｐｏ−Ｅｐｏ受
容体複合体の構造を試験することによって、Ｅｐｏの受容体結合部位と相互作用
するかまたはＥｐｏの受容体結合部位に極めて近接している残基が明らかになる
。Ｅｐｏのアミノ酸配列に変異を導入するときにはこれらの残基を避けなければ
ならない。あるいは、アラニン走査型の突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，１０８１−１０８５（１９８９）によってアミノ酸
置換を許容する領域を経験的に決定し得る。この方法では、生物活性に対する効
果を判定するために、選択されたアミノ酸残基を個別に中立アミノ酸（例えばア
ラニン）で置換する。

【００４３】 一般には、保存性アミノ酸の変化がポリペプチドの構造及び／または機能を最
も撹乱し難いと認識されている。従って、本発明は高グリコシル化Ｅｐｏ類似体
の内部の１つまたは複数の保存性アミノ酸の変化を包含する。保存性アミノ酸の
変化は一般に、１つのアミノ酸が同様の構造及び／または機能（例えば同様のサ
イズ、電荷及び形状をもつ側鎖を有しているアミノ酸）をもつ別のアミノ酸によ
って置換されることを意味する。これらの変化の特性は当業者に公知であり、後
出の表１にまとめられている。このような保存性置換は“好ましい置換”という
見出しで示されている。また、もっと実質的な変化（“模範的置換”）を導入す
ることも考察されている。最初は比較的保存的な置換によって部位を修飾すべき
であることが当業者には理解されよう。このような置換の結果として生物活性が
保持されているならば、次いでもっと実質的な変化（模範的置換）を導入するか
及び／または別の付加／欠失を生じさせ、得られた産生物をスクリーニングし得
る。

【００４４】

【表１】

【００４５】 また、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体の生物活性に実質的な影響を与えないアミ
ノ酸の欠失または付加も本発明で提案される。このような付加及び欠失はポリペ
プチドのＮ末端またはＣ末端に存在してもよく、または、ポリペプチド内部に存
在してもよい。一般に、比較的小さい欠失または付加はＥｐｏまたは高グリコシ
ル化類似体の構造及び／または機能に影響を及ぼすことが少ない。１つの実施態
様では、欠失または付加が５−１０残基の範囲、あるいは２−５アミノ酸残基ま
たは１−２残基の範囲でよい。

【００４６】 本発明は、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体を含む融合タンパク質及びその組成物
を提供する。１つの特徴によれば本発明は、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体と免疫
グロブリンＨ鎖定常領域との融合タンパク質を提供する。融合は、高グリコシル
化Ｅｐｏ類似体のアミノ末端で生じる。即ち、免疫グロブリンＨ鎖定常領域のカ
ルボキシ末端が高グリコシル化Ｅｐｏ類似体のアミノ末端に融合する。あるいは
、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体のカルボキシ末端を免疫グロブリンＨ鎖定常領域
のアミノ末端に融合させるのが望ましい場合もある。本発明の１つの特徴によれ
ば、免疫グロブリンＨ鎖定常領域がＦｃ領域である。高グリコシル化Ｅｐｏ類似
体は融合ポリペプチドの一部を形成しているとき、１６５アミノ酸もしくは１６
６アミノ酸の長さを有し得るが、アミノ酸の付加もしくは欠失があるときは該類
似体がもっと多い数またはもっと少ない数の残基を有し得る。１つの実施態様に
よれば、類似体Ｎ４７のＣ末端がヒトＩｇＧγ１に由来のＦｃ領域のＮ末端に融
合している（実施例２参照）。該実施例では、類似体Ｎ４７が１６６位にアルギ
ニン残基を含む。しかしながら、残基１−１６５（Ｃ末端アルギニン残基が欠失
）から成る別の高グリコシル化類似体も類似体Ｎ４７と同様に本発明の融合ポリ
ペプチドを構成し得ると考えられる。

【００４７】 “Ｆｃ”という用語は、モノマー形態であるかマルチマー形態であるかにかか
わりなく、抗体の抗原非結合部分の配列を含む分子または配列を意味する。Ｆｃ
の出発免疫グロブリンソースは好ましくはヒト起原であり、任意のアイソタイプ
、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤに由来し得る。単離Ｆ
ｃ分子の１つの調製方法では、抗体をパパインで消化して抗原と抗体の抗原非結
合部分とを分離する。単離Ｆｃ分子の別の調製方法では、組換えＤＮＡを発現さ
せ、次いで発現されたＦｃ分子を精製することによって単離Ｆｃ分子を産生させ
る。全長Ｆｃは、以下のＩｇＨ鎖領域：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成され
、ＣＨ１領域とＣＨ２領域とが典型的には可撓性ヒンジ領域によって連結されて
いる。１つの実施態様では、Ｆｃが図１０に示すようなＩｇＧ１のアミノ酸配列
を有している。“Ｆｃタンパク質”、“Ｆｃ配列”、“Ｆｃ分子”、“Ｆｃ領域
”及び“Ｆｃ部分”という用語は、“Ｆｃ”と同じ意味を有していると理解され
たい。

【００４８】 Ｆｃ分子またはその融合ポリペプチドに関連して使用された“Ｆｃフラグメン
ト”という用語は、Ｆｃ分子の全長アミノ酸配列よりも短いペプチドまたはポリ
ペプチドを意味する。このようなフラグメントは、例えば、アミノ末端の欠損、
カルボキシ末端の欠損及び／またはアミノ酸配列から（１つまたは複数の）内部
残基を欠損させることによって得られる。Ｆｃフラグメントは選択的ＲＮＡスプ
ライシングまたはｉｎ ｖｉｖｏプロテアーゼ活性によって得られてもよい。

【００４９】 Ｆｃ分子またはその融合ポリペプチドに関連して使用された“Ｆｃ変異体”と
いう用語は、天然型Ｆｃアミノ酸配列に比較して１つまたは複数のアミノ酸配列
置換、欠失及び／または付加を含んでいるアミノ酸配列から成るポリペプチドを
意味する。変異体は、天然産生でもよくまたは人工的に構築されてもよい。本発
明の変異体は、該変異体をコードしている対応する核酸分子から作製され得る。
従って該核酸分子は天然型Ｆｃ分子のＤＮＡ配列から変異したＤＮＡ配列を有し
ている。

【００５０】 Ｆｃ分子またはその融合ポリペプチドに関連して使用された“誘導体”という
用語は、例えば、１つまたは複数のポリマーの共有結合によって化学的に修飾さ
れたＦｃ変異体またはそのフラグメントを意味する。ポリマーの非限定例は、水
溶性ポリマー、Ｎ結合またはＯ結合した糖質、糖類、リン酸塩及び／またはその
他の同様の分子である。誘導体は、ポリペプチドに結合した分子のタイプまたは
位置が天然型Ｆｃとは異なるように修飾されている。誘導体は更に、Ｆｃ分子に
天然に結合した１つまたは複数の化学基の欠失を含む。

【００５１】 “融合”という用語は、互いに異なるペプチドまたはタンパク質のセグメント
を遺伝的方法または化学的方法によって接合し、ペプチドまたはタンパク質のセ
グメントの接合端が互いに直接的に隣接しているかまたはアミノ酸残基もしくは
その他の結合基のようなリンカーもしくはスペーサー部分によって隔てられてい
ることを意味する。

【００５２】 Ｆｃまたは変異体、フラグメントまたはその誘導体はＩｇクラスに由来し得る
。１つの実施態様では、ＦｃがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のよ
うなＩｇＧクラスに由来する。別の実施態様では、ＦｃがＩｇＧ１に由来する。
Ｆｃはまた、２つ以上のＩｇクラスの組合せによって表されるアミノ酸残基、例
えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２に由来のアミノ酸残基、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩ
ｇＧ３に由来のアミノ酸残基、などを含み得る。１つの実施態様では、高グリコ
シル化Ｅｐｏ類似体融合タンパク質のＦｃ領域が図１０に示すように残基６を起
点とする（即ち、残基１−５が欠失した）配列（配列：２５）を有している（Ｅ
ｌｌｉｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，４０７１−４０
７９（１９８２）参照）。

【００５３】 Ｆｃ変異体、フラグメント及び誘導体は、Ｆｃ領域中で天然に発生する変異に
加えて、例えば天然型もしくは天然発生Ｆｃに残基もしくは配列の置換、付加、
挿入もしくは欠失を導入することによって、または、Ｆｃ部分を化学的修飾など
で修飾することによって構築されたＦｃに非天然に発生する変化を含み得る。一
般に、Ｆｃ変異体、フラグメント及び誘導体は、グリコシル化Ｅｐｏ類似体とＦ
ｃとの融合物の循環半減期の延長がほぼ維持されるように調製される。

【００５４】 本発明はまた、保存性アミノ酸置換をもつＦｃ変異体を提供する。保存性アミ
ノ酸置換の例は上記に示したが、代表例としてはまた、生物系中の合成でなく化
学的ペプチド合成によって典型的に取込まれる非天然発生アミノ酸残基の置換も
ある。これらの例は、ペプチド模擬体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）及び
その他の反対方向もしくは逆方向のアミノ酸部分である。Ｆｃ領域のアミノ酸配
列に対する保存性修飾（及び対応するコーディングヌクレオチドの修飾）は、非
修飾のＦｃ分子及び非修飾Ｆｃ領域を含む融合タンパク質と同様の機能的及び化
学的特性値を有しているＦｃ分子（及び高グリコシル化Ｅｐｏ類似体とＦｃ領域
とから成る融合タンパク質）を産生すると期待される。

【００５５】 表１に示した置換に加えて、Ｆｃ分子中（または高グリコシル化Ｅｐｏ類似体
を含む融合タンパク質のＦｃ領域中）の天然型残基はまた、“アラニン走査型突
然変異誘発”に関して前述したようにアラニンで置換され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇ
ｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，１０８１−１０８５（１９８９））。

【００５６】 Ｆｃ分子中（及び高グリコシル化Ｅｐｏ類似体を含む融合タンパク質のＦｃ領
域中）の機能的及び／または化学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域の分
子主鎖の構造、例えば、シート状または螺旋状のコンホメーション、（ｂ）目標
部位の分子の電荷または疎水性、または、（ｃ）側鎖の嵩高さ（ｂｕｌｋ）、の
維持に関して有意に異なる効果を生じるような置換を選択することによって行わ
れる。天然に発生する残基は共通側鎖の特性に基づいて以下のグループに分類さ
れ得る： （１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ； （２）中立親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ； （３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ； （４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ； （５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び （６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【００５７】 非保存性置換では、これらのクラスの１つから成る残基が別のクラスから成る
残基で交換されてもよい。このような置換残基はヒト以外のＦｃ分子に相同なＦ
ｃ分子の領域または該分子の非相同領域に導入し得る。

【００５８】 ジスルフィド架橋の形成を阻止するためにＦｃ分子中のシステイン残基を欠失
させるかまたは別のアミノ酸で置換してもよい。特に図１０（配列Ｎｏ． ）
の５位のシステイン残基をアラニンまたはセリンのような１つまたは複数のアミ
ノ酸残基で置換し得る。あるいは、５位のシステイン残基を欠失させてもよい。

【００５９】 Ｆｃフラグメントは、図１０（配列：２５）に示すような１、２、３、４及び
５位のいずれかに位置する１つまたは複数のアミノ酸の欠失によって作製できる
。１つの実施態様では、１−５位の（両端位置を含む）アミノ酸残基を欠失させ
る。また、これらの位置で置換を生じさせてもよく、このような置換も本発明の
範囲に包含される。

【００６０】 抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び補体の活性化のようなエフェクター機
能をトリガするＦｃ受容体に対する結合の抑制を示すＦｃ変異体も作製し得る（
例えば、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，６３３−６３９（１９９２）参照
）。このような変異体としては、２０位のロイシンが欠失しているかまたはグル
タミン残基で置換されているもの、１０３位のグルタメートが欠失しているかま
たはアラニン残基で置換されているもの、１０５位及び１０７位のリシンが欠失
しているかまたはアラニン残基で置換されているもの（位置は図１の示す番号に
拠る）がある。１つまたは複数のこのような置換が考察される。

【００６１】 １つの実施態様では、Ｆｃ変異体が、図１に示すような天然型Ｆｃに比較して
ＦｃＲｎ受容体（“サルベージ受容体”）に対する結合が強化され、循環半減期
が延長していることを示すであろう。このような変異体の例は、３３、３５−４
２、５９、７２、７５、７７、９５−９８、１０１、１７２−１７４、２１５及
び２２０−２２３位の１つまたは複数の残基にアミノ酸置換を含み、（１つまた
は複数の）このような置換基がＦｃ変異体をＦｃＲｎ受容体に緊密に結合させて
いる変異体である。別の実施態様では、Ｆｃ変異体の１つまたは複数のグリコシ
ル化部位が除去されている。Ｎ結合グリコシル化部位は、糖鎖が結合したアスパ
ラギン残基の欠失または置換によって除去され得る。

【００６２】 別のＦｃ変異体では、１つまたは複数のチロシン残基が例えばフェニルアラニ
ン残基で置換されている。更に、別の変異性アミノ酸の挿入、欠失及び／または
置換も考えることができ、これらも本発明の範囲内に包含される。その例は、Ｗ
Ｏ９６／３２４７８及びＷＯ９７／３４６３０に開示されたＦｃ変異体である。
これらの特許は参照によって本発明に含まれるものとする。更に、変異が、ペプ
チド模擬体またはＤ−アミノ酸のような改造アミノ酸の形態でもよい。

【００６３】 Ｆｃタンパク質はまた、種々の長さの化学基またはアミノ酸から成る“リンカ
ー”部分によってグリコシル化Ｅｐｏ類似体に結合され得る。このような化学的
リンカーは当業界で公知である。アミノ酸リンカー配列の非限定例は、 （ａ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ； （ｂ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ；（配列：６） （ｃ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ；（配列：７） （ｄ）ｇｌｙ−ｇｌｙ； （ｅ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ； （ｆ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ；（配列：８） （ｇ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ；（配列：９
） （ｈ）ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ； （ｉ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｇｌｙ；（配列：１０）、及び、 （ｊ）サブパート（ａ）から（ｉ）のいずれかの組合せ である。

【００６４】 グリコシル化Ｅｐｏ類似体と融合タンパク質を構成する成分としてはＦｃ分子
が好ましいが、ＦｃＲｎ受容体に結合しｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させる別の
アミノ酸配列も使用し得ると考えられる。このような代替分子の例は、１９９８
年４月１４日付けでＰｒｅｓｔａらに許諾された米国特許第５，７３９，２７７
号に記載されている。

【００６５】 “モル量”という用語は、非グリコシル化の対応するエリトロポエチンポリペ
プチドの分子量に基づく高グリコシル化類似体またはｒＨｕＥｐｏの量を意味す
る。均等量のｒＨｕＥｐｏ及び類似体という表現は、このような量を決定するた
めに使用した手順で普通に生じる変動値を考慮した上で等しいと考えられる量を
意味する。ｒＨｕＥｐｏ及び類似体の分子量は糖鎖の数次第で変化するのでこの
ようにして均等量を決定することが必要である。ｒＨｕＥｐｏの場合、エリトロ
ポエチンポリペプチドの分子量は、図１及び配列：１に示すようなアミノ酸残基
１−１６５に基づいて計算される。高グリコシル化類似体の場合、分子量は、図
１及び配列：１の残基１−１６５中のアミノ酸変化に応じて調節される。

【００６６】 高グリコシル化類似体の投与頻度は、治療される病態及びヘマトクリット目標
値に応じて変更されるであろうが、一般には週３回未満であろう。投与頻度はほ
ぼ週２回、または、ほぼ週１回であろう。投与頻度はまた、ほぼ週１回未満、例
えば、ほぼ隔週１回（ほぼ１４日毎に１回）、月１回または隔月１回でもよい。
異なる個体はＥｐｏ類似体に対して異なるレスポンスを示すので、実際に使用さ
れる投与頻度が本文中に開示した頻度と幾らか違っていてもよい。“ほぼ”とい
う用語はこのような違いを表すために使用した。

【００６７】 本文中に使用した“治療有効量”という用語は、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体
（または高グリコシル化Ｅｐｏ類似体と免疫グロブリンＨ鎖定常領域とから成る
融合タンパク質）の量が、患者に有益な効果を与えるヘマトクリット目標値また
はヘマトクリット目標範囲までヘマトクリットを増加させる量であるか、あるい
は、患者をヘマトクリット目標値またはヘマトクリット目標範囲内に維持する量
であることを意味する。この量は、個体毎に異なる量であり、患者の全身的健康
状態、貧血の重篤度及び隠れた原因、患者個人のヘマトクリットの最終目標値の
ような複数の要因に左右されるであろう。ヘマトクリット目標値は典型的には、
少なくとも約３０％、または３０％−３８％の範囲、好ましくは３８％以上、よ
り好ましくは４０％−４５％である。ｒＨｕＥｐｏのヘマトクリット目標範囲に
関する一般的な指針は１２／２３／９６日付のＥＰＯＧＥＮ^ＲＴＭ ｐａｃｋａ
ｇｅ ｉｎｓｅｒｔに見出され、該文献の記述によれば３０％−３６％であるか
、あるいは、３２％−３８％である。このような目標値が個体毎に異なる値であ
り、所与の患者に対する実際のヘマトクリット目標値を決定するためには医師の
裁量が適当であることは理解されよう。どちらにしても、ヘマトクリット目標値
の決定は当業者の知識レベルの範囲内である。

【００６８】 本発明組成物の治療有効量は当業者が容易に確認できる。実施例６は週１回及
び週３回の双方の投与頻度を使用するときに類似体Ｎ４７の治療有効量を決定す
ることを１つの目的とする臨床プロトコルを示す。週１回投与する場合の用量範
囲は、投与毎に体重１ｋｇあたり約０．０７５−約４．５μｇのエリトロポエチ
ンペプチドである。週３回投与する場合の用量範囲は、投与毎に体重１ｋｇあた
り０．０２５−１．５μｇのエリトロポエチンペプチドである。この用量範囲は
別の高グリコシル化Ｅｐｏ類似体に関しても使用でき、用量範囲の調整は当業者
の常識である。

【００６９】 本発明の有意な利点は、Ｅｐｏ類似体が所与の用量または投与スケジュールに
“適合する”ように、高グリコシル化の程度を用量または投与間隔に相関させる
のが可能なことである。図３に示すように１、２または３個の追加の糖鎖を有し
ているＥｐｏ類似体のｉｎ ｖｉｖｏ活性が増加を示すことに基づいて、治療担
当医師は治療される貧血状態に対する適正で好都合な類似体を選択できる。例え
ば、急性貧血を示し大量の有効用量が必要な患者、または、長期持続治療が必要
な患者には、３または４個またはそれ以上の追加糖鎖を有する高グリコシル化類
似体の投与が好ましいであろう。貧血がそれほど重篤でない患者または比較的短
期間の治療が必要な別の患者には、１または２個の追加糖鎖をもつ類似体が好ま
しいであろう。本発明の類似体は、様々な隠れた障害の結果として生じる貧血の
予防及び治療に携わる医師にかなりの選択の自由を与える。

【００７０】 本発明はまた、治療中に赤血球形成の増進を維持するために治療有効量の鉄を
投与することを提案する。鉄の投与量は、ｒＨｕＥｐｏによる治療に基づいて当
業者が容易に決定し得る。

【００７１】 本発明は、赤血球産生を刺激し、貧血を予防及び治療するために使用され得る
。本発明によって治療できる病態としては、腎機能の減退または低下（慢性腎不
全）に付随する貧血、化学療法剤または抗ウイルス薬（例えばＡＺＴ）のような
骨髄抑制性療法に付随する貧血、非骨髄性癌の進行に付随する貧血、ウイルス（
例えばＨＩＶ）感染に付随する貧血、慢性疾患の貧血がある。また、外科手術中
に予想される失血のような他の面では健康な個体の貧血を生じさせる状態も治療
し得る。一般に、ｒＨｕＥｐｏで治療できる病態は本発明の高グリコシル化Ｅｐ
ｏ類似体でも治療され得る。

【００７２】 本発明はまた、治療有効量の高グリコシル化Ｅｐｏ類似体を、医薬として許容
される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／またはアジュバントと共
に含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体と免
疫グロブリンＨ鎖定常領域とから成る治療有効量の融合タンパク質を医薬として
許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／またはアジュバント
と共に含む医薬組成物を提供する。組成物は週３回未満の投薬スケジュールに適
しているであろう。組成物は液体または凍結乾燥形態でよく、種々のｐＨ値及び
イオン強度を有する希釈剤（トリスバッファ、クエン酸塩バッファ、酢酸塩バッ
ファまたはリン酸塩バッファ）、トゥィーンまたはポリソルベート（Ｐｏｌｙｓ
ｏｒｂａｔｅ）のような可溶化剤、ヒト血清アルブミンまたはゼラチンのような
担体、チメロサール、パラベン、ベンジルアルコニウムクロリドまたはベンジル
アルコールのような保存剤、アスコルビン酸またはメタ重亜硫酸ナトリウムのよ
うな抗酸化剤、リシンまたはグリシンのようなその他の成分を含む。特定組成物
の選択は、治療される病態、投与経路及び所望の薬物動態パラメーターのような
複数の要因に従属するであろう。医薬組成物に適した成分に関しては、Ｒｅｍｉ ｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ，１８ｔｈ
ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９
８０）にもっと広汎に概説されている。好ましい実施態様では、本発明のグリコ
シル化Ｅｐｏ類似体は、ヒトアルブミンを含有しておりかつ場合によってはベン
ジルアルコールを保存剤として含有している等張性塩化ナトリウム／クエン酸ナ
トリウム緩衝溶液中で液体形態に配合される。組成物は好ましくは、１、２、３
、４個またはそれ以上の追加の糖鎖を有する類似体を含有している。

【００７３】 本発明組成物は好ましくは、皮下注射または静脈内注射によって投与される。
任意に選択される投与経路は複数の要因に従属し、当業者によって確認され得る
。

【００７４】 以下の実施例は本発明をより完全に説明するために示したものであるが、本発
明の範囲を限定すると解釈してはならない。

【００７５】 実施例１ 抗グリコシル化Ｅｐｏ類似体の構築 抗グリコシル化Ｅｐｏ類似体をコードするｃＤＮＡの構築 複数の異なる方法を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によってＥｐｏ類
似体を製造した。類似体Ｎ４９及びＮ５０はＷＯ９４／０９２５７に記載の手順
で構築した。また、オーバーラップＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の変形に
よって類似体を構築した。基本的手順は連続する２つの段階を含んでいた。第一
段階では、合計４個のオリゴヌクレオチド：１つの５′（順方向）プライマー、
１つの逆方向突然変異誘発プライマー、１つの順方向突然変異誘発プライマー（
通常は、逆方向突然変異誘発プライマーに相補的）及び１つの３′（逆方向）プ
ライマーを使用してＥｐｏまたはＥｐｏ類似体の鋳型ＤＮＡに対して２つの反応
（ＰＣＲ１及びＲＣＲ２）を生じさせた。突然変異誘発プライマーは所望のヌク
レオチド変化を含んでおり、また、これらの変化の両側に６−１４個の正確な適
合ヌクレオチドを含んでいた。ＰＣＲ１は５′（順方向）プライマーと逆方向突
然変異誘発プライマーとを使用した。ＰＣＲ２は３′（逆方向）プライマーと順
方向突然変異誘発プライマーとを使用した。増幅されたＤＮＡフラグメントをア
ガロースゲル電気泳動によって分離した。正しいサイズのＤＮＡフラグメントを
含有するアガロースの小片をゲルから切り出した。ＲＣＲ１及びＰＣＲ２で得ら
れたＤＮＡフラグメントを集めて、５′順方向プライマーと３′逆方向プライマ
ーとだけを使用して第三のＰＣＲ反応を実施した。このようにして、所望の突然
変異を含む全長ＤＮＡセグメントを増幅した。幾つかの場合には、同じＰＣＲ法
を使用し、１つの変化を既に含むＤＮＡに新しい置換を導入することによって２
つまたは３つの突然変異を組合せた。これらの多重グリコシル化部位類似体を構
築するために、２つまたは３つの部位を含む単一類似体（上述の手順で作製）を
ＰＣＲ鋳型として使用し、適当なプライマーによる部位特異的突然変異誘発によ
って追加のグリコシル化部位を導入した。

【００７６】 Ｅｐｏ類似体Ｎ５１、Ｎ５２及びＮ５３はオーバーラップＰＣＲ（ポリメラー
ゼ連鎖反応）の方法１によって構築した。どの場合にも各１つの追加Ｎグリコシ
ル化部位を導入した。Ｎ５６はｐＤＳＲα２ ＥｐｏをＰＣＲ鋳型として使用す
ることによって天然型ＨｕＥｐｏ配列にグリコシル化部位（Ｎ１１４ Ｔ１１６
）を付加したものであり、Ｎ５１はｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４７鋳型（Ａｓｎ
３０、Ｔｈｒ３２、Ｖａｌ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｈｒ９０）を使用することによ
ってＮ４７ ＥｐｏにＯ結合グリコシル化部位（Ｔｈｒ１２５）を付加したもの
であり、類似体Ｎ５９はｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４７鋳型を使用することによ
って類似体Ｎ４７にグリコシル化部位（Ａｓｎ５３）を付加したものである。

【００７７】 方法１のポリメラーゼ連鎖反応はＣｈｅｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，５６９５（１９９４））の応用プロトコルを使用し
て行った。３′（逆方向）プライマーは、終結コドンとその直後のＸｂａＩ制限
部位とを導入する配列： ＡＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴ（配列：２） を含んでいた。

【００７８】 ５′順方向反応プライマー： ＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧ（配列：
３） は、Ｅｐｏ開始コドン（ＡＴＧ）の上流にＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位とその直後
のＫｏｚａｋ配列とを有していた。典型的なＰＣＲ反応ミックスは、各４μｌの
順方向プライマー及び逆方向プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの鋳型（
２５ｎｇ）、１０μｌの５×ＬＰバッファ（１００ｍＭのトリシン，ｐＨ８．７
／２５％のグリセロール／４２５ｍＭのＫＯＡｃ）、１０μｌのｄＮＴＰ予製液
（各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、０．８μｌのｒｔＴ
ｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；２．５Ｕ／μｌ）及び２μｌのＶ
ｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ；１×ＬＰバッファで新しく１：１００に希釈後に
０．０１Ｕ／μｌ）を含有していた。Ｈ_２Ｏを最終容量が５０μｌになるまで添
加した。全部の成分を上記の順序で混ぜ合わせて、第一サイクル中の温度が６０
℃を上回る値になったとき、１μｌの５０ｍＭのＭｇＯＡｃを添加することによ
ってＰＣＲを開始させた。典型的な反応条件としては、９４℃、１０秒／５０℃
、１分／６８℃、５分を２サイクル、次いで、９４℃、１０秒／５５℃、１分／
６８℃、５分を２５サイクル行った。増幅されたフラグメントをアガロースゲル
電気泳動によって分離し、正しいサイズのＤＮＡフラグメントをＧｅｎｅｃｌｅ
ａｎ^ＴＭキット及び製造業者（Ｂｉｏ １０１，Ｉｎｃ．）によって提供された
手順を使用して精製した。精製したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化
し、次いでＧｅｎｅｃｌｅａｎ^ＴＭキットを使用して再度精製した。フラグメン
トを次に、ＨｉｎＩＩ及びＸｂａＩで切断したｐＤＳＲα２ベクターに結合した
。結合したＤＮＡを０．３ＭのＮａＯＡｃ，ｐＨ５．２中の２倍容のエタノール
によってキャリアｔＲＮＡの存在下で沈降させ、大腸菌を形質転換させた。ミニ
ＤＮＡプレップの制限消化によってＥｐｏ類似体をスクリーニングした。次に陽
性クローンからプラスミドを調製し、インサートを配列決定して所望の突然変異
の存在を確認しかつ追加のアミノ酸変化が導入されていないことを確認した。

【００７９】 類似体Ｎ５４からＮ６１はオーバーラップＰＣＲ戦略法２を使用して構築した
。３′（逆方向）プライマーは、終結コドンとその直後のＸｂａＩ制限部位とを
導入する配列： ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧ（配列：４） を含んでいた。

【００８０】 ５′順方向反応プライマー： ＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＧＧ（配列：５） は、Ｅｐｏ開始コドン（ＡＴＧ）の上流にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とその直後の
Ｋｏｚａｋ配列とを含んでいた。高い確度のＰＣＲ戦略をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼと、１０μｌの１０×ＰＣＲバッファ、
３μｌの１ｍＭのｄＮＴＰ、５ｐｍｏｌの各プライマー及び最終容量１００μｌ
にする量の水とから成る付随試薬とを使用して実施した。ＰＣＲ混合物が９４℃
に達した後、０．５単位のＵｌＴｍａポリメラーゼを添加した。次に、９４℃で
３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で９０秒のサイクルを５回繰り返してＰＣＲ
反応を実施した。その後に、９４℃で３０秒及び７２℃で９０秒のサイクルを２
５回繰り返した。産生物の正しいサイズのバンドを電気泳動後のアガロースゲル
から切り出した。

【００８１】 各類似体毎に得られたＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して洗
浄した。精製したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＸｂａＩ制限酵素（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって３７℃で１時間消化して１００
μｌの制限消化物を得た。消化物を再度ゲル精製し、次に、消化したフラグメン
トをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化したｐＤＳＲα２ベクターに結合した。

【００８２】 結合したＤＮＡを０．３ＭのＮａＯＡｃ，ｐＨ５．２中の２倍容のエタノール
によってキャリアｔＲＮＡの存在下で沈殿させ、大腸菌を形質転換させた。高グ
リコシル化Ｅｐｏ類似体を先ずコロニーＰＣＲによってスクリーニングし、正し
いサイズ及びタイプのＤＮＡインサートを含むクローンを同定した。この手順で
、プラスミドを含有する細胞をＥｐｏ順方向プライマー及び逆方向プライマーの
存在下のＰＣＲ管に入れた。次に上述の反応条件を使用して混合物をＰＣＲ処理
した。次いで陽性クローンからプラスミドを調製し、Ｅｐｏ類似体インサートを
配列決定して、所望の突然変異の存在を確認し、追加のアミノ酸変化が導入され
ていないことを確認した。

【００８３】

【表２】

【００８４】 糖質付加の分析 発現ベクターｐＤＳＲα２に挿入された高グリコシル化Ｅｐｏ類似体の構築物
をＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の上
清をウェスタンブロットによって分析し、発現及び分泌されたＥｐｏ類似体が追
加の糖質を含有するか否かを判定した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェ
ルに直接充填し、次いでモノクローナル抗体９Ｇ８Ａ（Ｅｌｌｉｏｔｔら（１９
９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：ｐ２７１４）を使用するイムノブロットによって分析
した。類似体サンプルの移動度をｒＨｕＥｐｏ含有サンプルの移動度に比較した
。図１は、類似体Ｎ５３及びＮ６１の移動度が類似体Ｎ４（４個の糖鎖）及びＮ
４７（５個の糖鎖）の移動度に比較して小さいことを示す。移動度は類似体Ｎ５
３の６個の糖鎖の存在、類似体Ｎ６１の７個の糖鎖の存在に符合する。全部の高
グリコシル化類似体に関するデータを表２に示す。

【００８５】 ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ ｒＨｕＥｐｏまたは類似体を発現しているＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞によっ
て馴化した培地で、ＵＴ７−Ｅｐｏ細胞による３Ｈ−チミジン吸収の刺激を検定
した（Ｋｏｍａｔｓｕら，Ｂｌｏｏｄ ８２，４５６）。ＵＴ７−Ｅｐｏ細胞は
Ｅｐｏ感受性であり、細胞表面にヒトＥｐｏ受容体を発現する。ＵＴ７−Ｅｐｏ
細胞を増殖培地（Ｌ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ及び３０２４
ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含むがアルファ−チオグリセロールまたはベー
タ−メルカプエタノールを含まない１×Ｉｓｃｏｖｅの改質ダルベッコ培地（Ｇ
ＩＢＣＯ）／１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清／１％ｖ／ｖのＬ−グルタミン−ペニ
シリン−ストレプトマイシン溶液（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）／１
単位／ｍＬのｒＨｕＥｐｏ）でほぼ３×１０^５細胞／ｍＬまで増殖させた。細胞
を遠心（約５００×Ｇ）によって収集し、リン酸塩緩衝生理食塩水で２回洗浄し
、５×１０^４細胞／ｍＬでアッセイ培地（Ｌ−グルタミン非含有の１×ＲＰＭＩ
培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）／１％のＬ−グルタミン／４％のウシ胎仔血清）に
再浮遊させた。アッセイ培地で少なくとも５倍に希釈した１００μｌの被験サン
プルまたはＥｐｏ標準（ｒＨｕＥｐｏ）を９６ウェルのマイクロタイタープレー
トのウェルに加えた。次に５０μｌの浮遊細胞を加え（５０００細胞／ウェル）
、プレートを湿潤インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし
た。７２時間後、アッセイ培地で１：１００に希釈した５０μｌのメチル−^３Ｈ
−チミジン（１ｍＣｉ／ｍＬ；２０Ｃｉ／ｍＭｏｌｅ）を加えた。細胞を３７℃
、５％ＣＯ_２で更に４時間インキュベートした。標識した細胞をガラス繊維フィ
ルターマットに集め、脱イオン水及び２−プロパノールを順次に用いて洗浄し、
乾燥し、カウントした。各類似体で測定したレスポンスをｒＨｕＥｐｏ標準のレ
スポンスに比較することにって活性を測定した。次に、イムノアッセイ（Ｅｌｌ
ｉｏｔｔら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：ｐ２７１４）によって測定した各類
似体の濃度によってｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を除算することによって生物学的比活
性を決定した。結果を表２に示す。

【００８６】

【表３】 ^＊１−２個のＯ結合鎖を含む^＊＊ ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性はｒＨｕＥｐｏ活性に対する相対値である ＋＋＋ ｒＨｕＥｐｏに等価の活性 ＋＋ 活性はｒＨｕＥｐｏの２５−７５％ ＮＴ 非試験

【００８７】 オーバーラップＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によってＥｐｏ類似体Ｎ６
２−Ｎ６９を製造した。基本的手順は２つの連続段階を含んでいた。第一段階で
は、合計４個のオリゴヌクレオチド、即ち、５′（順方向）プライマーと、逆方
向突然変異誘発プライマーと、逆方向突然変異誘発プライマーに相補的な順方向
突然変異誘発プライマーと、３′（逆方向）プライマーとを使用してＥｐｏまた
はＥｐｏ類似体の鋳型ＤＮＡに２つの反応（ＰＣＲ１及びＰＣＲ２）を生じさせ
た。突然変異誘発プライマーは、所望のヌクレオチド変化とこれらの変化の両側
の６−１４個の正確な適合ヌクレオチドとを含んでいた。ＰＣＲ１は５′（順方
向）プライマーと逆方向突然変異誘発プライマーとを使用した。ＰＣＲ２は３′
（逆方向）プライマーと順方向突然変異誘発プライマーとを使用した。増幅され
たＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、正しいサイズ
のＤＮＡフラグメントを切り出し、ゲルから溶出させた。ＰＣＲ１及びＰＣＲ２
で得られたＤＮＡフラグメントを合わせて、５′順方向プライマーと３′逆方向
プライマーとだけを使用して第三のＰＣＲ反応を行った。幾つかの類似体では、
所望の配列を得るために３つのＰＣＲ反応が必要であった。これらの反応は上述
のように行ったが、２つの突然変異誘発プライマーの対を使用して３番目の産生
物を得る。増幅されたＤＮＡフラグメントをゲル精製し、５′順方向プライマー
と３′逆方向プライマーとだけを含む最終反応で組合せた。どの場合にも、所望
の突然変異を含む全長ＤＮＡセグメントが増幅された。

【００８８】 Ｎ６２は、ｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４（Ｎ３０ Ｔ３２）をＰＣＲ鋳型とし
て使用することによって天然型配列ＨｕＥｐｏに２個のグリコシル化部位を付加
したもの（Ｎ３０ Ｔ３２ Ｎ５５ Ｔ５７）である。Ｎ６３は、ｐＤＳＲα２
Ｅｐｏ Ｎ４（Ｎ３０ Ｔ３２）及びｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４７（Ｎ３０
Ｔ３２ Ｎ５５ Ｔ５７）をＰＣＲ鋳型として使用することによって天然型配
列ＨｕＥｐｏに３個のグリコシル化部位を付加したもの（Ｎ３０ Ｔ３２ Ｎ５
５ Ｔ５７ Ｖ８７ Ｎ８８ Ｔ９０）である。Ｎ６４は、ｐＤＳＲα２ Ｅｐ
ｏ Ｎ４（Ｎ３０ Ｔ３２）及びｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ６０をＰＣＲ鋳型と
して使用することによって天然型配列ＨｕＥｐｏに３個のグリコシル化部位を付
加したもの（Ｎ３０ Ｔ３２ Ｎ５５ Ｔ５７ Ｎ１１４ Ｔ１１６）である。
Ｎ６５は、ｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４（Ｎ３０ Ｔ３２）及びｐＤＳＲα２
Ｅｐｏ Ｎ６０をＰＣＲ鋳型として使用することによって天然型配列ＨｕＥｐｏ
に３個のグリコシル化部位を付加したもの（Ｎ３０ Ｔ３２ Ｖ８７ Ｎ８８
Ｔ９０ Ｎ１１４ Ｔ１１６）である。Ｎ６６は、ｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４
（Ｎ３０ Ｔ３２）及びｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ６０をＰＣＲ鋳型として使用
することによって天然型配列ＨｕＥｐｏに４個のグリコシル化部位を付加したも
の（Ｎ３０ Ｔ３２ Ｎ５５ Ｔ５７ Ｖ８７ Ｎ８８ Ｔ９０ Ｎ１１４ Ｔ
１１６）である。Ｎ６７は、Ｎ６４ ＥｐｏにＯ結合グリコシル化部位（Ｐ１２
４ Ｔ１２５ Ｔ１２６）を付加したものである。Ｎ６８は、Ｎ６５ Ｅｐｏに
Ｏ結合グリコシル化部位（Ｐ１２４ Ｔ１２５ Ｔ１２６）を付加したものであ
る。Ｎ６９は、Ｎ６６ ＥｐｏにＯ結合グリコシル化部位（Ｐ１２４ Ｔ１２５
Ｔ１２６）を付加したものである。

【００８９】 各類似体に対して同じ外部プライマーを使用した。３′（逆方向）プライマー
は終結コドンとその直後のＳａｌＩ制限部位とを導入した配列： ＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＴＣＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣ（配列：
１１）。 を含んでいた。

【００９０】 ５′順方向反応プライマー： ＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧ（配列：１２） は、Ｅｐｏ開始コドン（ＡＴＧ）の上流にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とその直後の
Ｋｏｚａｋ配列とを有していた。

【００９１】 突然変異誘発プライマーは以下の配列を有していた： Ｎ３０ Ｔ３２突然変異誘発順方向プライマー： ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＧＣ ＴＧＴ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＣＧ ＴＧＣ ＡＧＣ
ＴＴＧ（配列：１３） Ｎ３０ Ｔ３２突然変異誘発逆方向プライマー： ＣＡＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＧＴ ＴＴＣ ＡＴＴ ＡＣＡ ＧＣＣ ＣＧＴ
ＣＧＴ Ｇ（配列：１４） Ｎ５５ Ｔ５７突然変異誘発順方向プライマー： ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＴＧ ＡＡＴ ＧＴＣ ＡＣＧＣＡＧ Ｃ
ＡＧ ＧＣＣ ＧＴＡ ＧＡＡ（配列：１５） Ｎ５５ Ｔ５７突然変異誘発逆方向プライマー： ＴＴＣ ＴＡＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＧＴ ＧＡＣ ＡＴＴＣＡＴ Ｃ
ＣＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＧＣ Ａ（配列：１６） Ｖ８７ Ｎ８８ Ｔ９０突然変異誘発順方向プライマー： ＴＣＴ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＡＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＣＡＧ
ＣＴＧ（配列：１７） Ｖ８７ Ｎ８８ Ｔ９０突然変異誘発逆方向プライマー： ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＴＧ ＧＧＡ
ＡＧＡ ＧＴＴ Ｇ（配列：１８） Ｐ１２４ Ｔ１２５ Ｔ１２６突然変異誘発順方向プライマー： ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＣＡ（配列：１
９） Ｐ１２４ Ｔ１２５ Ｔ１２６突然変異誘発逆方向プライマー： ＴＧＧ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＴ ＧＧＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＴＧＧ Ａ（配列
：２０）。

【００９２】 Ｎ１１４ Ｔ１１６変化は適正な突然変異を含む鋳型を使用して導入され、従
ってこの部位を作製するために突然変異誘発プライマーは全く不要であった。

【００９３】 典型的なＰＣＲ１反応ミックスは、各２．５μｌの順方向プライマー及び逆方
向プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）と、１μｌの鋳型（２５ｎｇ）と、１０μ
ｌの１０×Ｔａｑ Ｅｘｔｅｎｄバッファ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と、２μｌ
のｄＮＴＰ予製液（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）と
、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（ＢＭＢ）と、０．５μｌのＴａｑ Ｅｘｔ
ｅｎｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とを含有していた。Ｈ_２Ｏを最終容量１００μ
ｌになるまで添加した。典型的な反応条件としては、９４℃、５分／５５℃、１
分／６８℃、１分を１サイクル、次いで、９４℃、１分／５５℃、１分／６８℃
、１分を２５サイクル行った。典型的なＰＣＲ２反応は、逆方向プライマーと突
然変異誘発順方向プライマーとを使用する以外は記載のＰＣＲ１反応と同じであ
った。３番目の初期反応が必要な場合には、反応が突然変異誘発順方向プライマ
ーと突然変異誘発逆方向プライマーとを含んでいた。増幅されたフラグメントを
アガロースゲル電気泳動によって分離し、正しいサイズのＤＮＡフラグメントを
ゲル抽出キットを使用して製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供された手順で
精製した。次に、相補的フラグメントを、順方向及び逆方向の外部プライマーだ
けを使用する第三のＰＣＲ反応で組合せた。増幅されたフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動によって分離し、上述の手順でゲルから精製した。精製したＤＮ
ＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩによって消化し、再度ゲル精製した。次に、フ
ラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで切断したｐＤＳＲα１９ベクターに
結合した。結合したＤＮＡを使用し電気穿孔によって大腸菌の形質転換を行った
。高グリコシル化Ｅｐｏ類似体を先ずコロニーＰＣＲによってスクリーニングし
て、正しいサイズのＤＮＡインサートを含むクローンを同定した。選択したクロ
ーンから得られたプラスミドＤＮＡを次に作製し、インサートを配列決定して、
所望の突然変異の存在を確認し、追加のアミノ酸変化が全く導入されていないこ
とを確認した。

【００９４】

【表４】

【００９５】 高グリコシル化Ｅｐｏ類似体融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの構築
また、Ｅｐｏ類似体Ｎ７０をオーバーラップＰＣＲによって製造した。類似体
Ｎ４７（Ｎ３０ Ｔ３２ Ｖ８７ Ｎ８８ Ｔ９０）をコードしているｃＤＮＡ
配列を含むプラスミドＤＳＲα２とＦｃ領域をコードしているｃＤＮＡを含むプ
ラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ登録番号９８１１３）とをポリメラーゼ連鎖反
応の鋳型として使用した。ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＨ鎖のヒンジドメイン
（Ａｓｐ−１０４）からカルボキシ末端までのＦｃ部分（Ｅｌｌｉｓｏｎら，前 出 、６位のアスパラギン酸残基を起点とする図１０も参照）をヒト脾臓ｃＤＮＡ
ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＰＣＲ増幅によって作製した。オーバーラ
ップＰＣＲ産物は以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する２つの反応で
製造した。

【００９６】 ５′順方向反応プライマー２３４３−８５（Ｅｐｏ特異的）： ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＧＧＴ
Ｇ（配列：２１） ３′逆方向反応プライマー２３４３−８７（Ｅｐｏ及びＦｃの双方に相同性）：
ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＣＡ ＴＧＴ ＧＴＧ ＡＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＴＣＴ
ＧＴＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＴＣ Ｃ（配列：２２） ５′順方向反応プライマー２３４３−８６（Ｅｐｏ及びＦｃの双方に相同性）：
ＧＡＧ ＧＣＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＡＣ
ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＴ ＣＣＡ ＣＣＴ（配列：２３） ３′逆方向反応プライマー２３４３−８８（Ｆｃ特異的）： ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＡＧ
ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＧＡ ＧＧＣ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＣ（配列：２４）。

【００９７】 ＰＣＲ１は各２．５μｌの順方向（２３４５−８５）及び逆方向（２３４３−
８７）のプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を含み、ＰＣＲ２は各２．５μｌの
順方向（２３４３−８６）及び逆方向（２３４３−８８）のプライマー（１０ｐ
ｍｏｌ／μｌ）を含んでいた。上述の条件を使用した。得られた増幅産物は、Ｅ
ｐｏの最後の８アミノ酸とＦｃの最初の８アミノ酸とをコードするオーバーラッ
プ領域（４８ヌクレオチド）を含んでいた。相補的フラグメントをゲル精製し、
順方向及び逆方向の外部プライマーだけを使用する第三のＰＣＲ反応で組合せた
。増幅したフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、上述の手順
でゲルから精製した。精製したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩによって消
化し、再度ゲル精製した。次に、フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで
切断したｐＤＳＲα１９ベクターに結合した。結合したＤＮＡを使用し電気穿孔
によって大腸菌を形質転換させた。形質転換体を先ずコロニーＰＣＲによってス
クリーニングして、正しいサイズのＤＮＡインサートを含むクローンを同定した
。選択したクローンから得られたプラスミドＤＮＡを次に作製し、インサートを
配列決定して、融合タンパク質の配列を確認し、追加のアミノ酸変化が全く導入
されていないことを確認した。

【００９８】 糖質付加の分析 高グリコシル化Ｅｐｏ類似体Ｎ６２からＮ６９までを得るため及び融合タンパ
ク質（類似体Ｎ７０）を得るための構築物を発現ベクターｐＤＳＲα１９に挿入
し、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上
清をウェスタンブロットによって分析し、発現及び分泌されたＥｐｏ類似体が追
加の糖質を含むか否かを類似体Ｎ４９からＮ６２までに使用した上述の手順を用
いて判定した。

【００９９】 ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ トランスフェクトＣＨＯ細胞中で発現された類似体Ｎ６２−Ｎ７０のｉｎ ｖ
ｉｔｒｏアッセイは、類似体Ｎ４９からＮ６１までに使用した上述の手順で行っ
た。

【０１００】 実施例２ 組換えヒトエリトロポエチン及び高グリコシル化エリトロポエチン類似体の製
造 本文中に記載の実験に使用した組換えヒトエリトロポエチン（ｒＨｕＥｐｏ）
は、ヒトエリトロポエチン遺伝子を含む組換えプラスミドをトランスフェクトし
たチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって発現された。組換え産物
をならし培地から回収し、本質的にＬａｉら、前出、に記載の手順で精製した。
得られたｒＨｕＥｐｏ調製物は、等電点電気泳動によって判定すると、主として
９−１４個のシアル酸を含むアイソフォームであった。

【０１０１】 組換え高グリコシル化エリトロポエチン類似体は、ＷＯ９１／０５８６７及び
ＷＯ９４／０９２５７に記載のＥｐｏ類似体遺伝子を含む組換えプラスミドをト
ランスフェクトしたＣＨＯ細胞中で発現された。これらの特許は参照によって本
発明に含まれるものとする。高グリコシル化類似体を上述の手順で培養上清から
精製した。

【０１０２】 ならし培地の濃縮及び透析濾過 トランスフェクトＣＨＯ細胞系の３つの継続採取標本（各５−８日）からなら
し培地（無血清）を収集し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、約３０倍に濃
縮し、分子量カットオフ１０，０００の膜をもつ正接流限外濾過システム（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１０ｍＭのトリス、２０μＭのＣｕＳＯ_４，ｐＨ７
．０、に透析濾過した。透析濾過した培地（ＤＦＭ）を再度濾過し（０．４５μ
ｍ）、精製に使用するまで−２０℃で保存した。

【０１０３】 精製 全手順を２℃−８℃で実施した。

【０１０４】 アニオン交換クロマトグラフィー（１０） 清澄化したＤＦＭを、１０ｍＭのビストリスプロパン（ＢＴＰ），ｐＨ７．０
で平衡させたＱ−セファロース高速流（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏ
ｗ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，６ｃｍ×１８ｃｍ）に加え、カラムの２倍容
量の１０ｍＭのＢＴＰで洗浄して未結合種を完全に溶出させた。次に、高グリコ
シル化類似体のＮ結合糖鎖の数が４個、５個または６個のいずれであるかに従属
する勾配によって処理した。この段階で使用したバッファはいずれも、１ｍＭの
グリシン、２０μＭのＣｕＳＯ_４、６Ｍの尿素、５μｇ／ｍＬのロイペプチン及
び１μｇ／ｍＬのペプスタチンを含有していた。４個のＮ結合糖鎖をもつ類似体
の場合、４９カラム容量にわたって１０ｍＭの酢酸、０．１ｍＭのＮａＣｌから
５００ｍＭの酢酸、５ｍＭのＮａＣｌになる勾配を使用し、２カラム容量を高塩
状態に維持した。５個のＮ結合糖鎖をもつ類似体の場合、３０カラム容量にわた
って０．７ｍＭの酢酸、７ｍＭのＮａＣｌから１．０Ｍの酢酸、１２ｍＭのＮａ
Ｃｌになる勾配を使用し、２カラム容量を高塩状態に維持した。６個のＮ結合糖
鎖をもつ類似体の場合、５０カラム容量にわたって１．０ｍＭの酢酸、１０ｍＭ
のＮａＣｌから１．５Ｍの酢酸、２０ｍＭのＮａＣｌになる勾配を使用し、２カ
ラム容量を高塩状態に維持した。勾配処理後に、カラムを２カラム容量の１０ｍ
ＭのＢＴＰ，ｐＨ７．０で洗浄し、高アイソフォーム画分を０．６ＭのＮａＣｌ
、１００ｍＭのＢＴＰ，ｐＨ７．０で溶出させた。

【０１０５】 逆相クロマトグラフィー（Ｃ４） Ｑ−セファロースカラムから得られた高塩ストリップ（１Ｑ）を２０％のエタ
ノール、１０ｍＭのＢＴＰ，ｐＨ７．０で平衡させたＶｙｄａｃ Ｃ４逆相カラ
ム（３０μ粒子、４ｃｍ×１８ｃｍ）に加え、１０ｍＭのＢＴＰ，ｐＨ７．０で
緩衝した９４％エタノールまでの３０カラム容量の勾配でカラムから溶出させた
。約６０％エタノールに溶出するプール産物ピークを４倍容量の１０ｍＭのＢＴ
Ｐ，ｐＨ７．０で希釈して、エタノールの存在下の凝集の可能性を最小に抑制し
た。

【０１０６】 アニオン交換クロマトグラフィー（２０） 逆相カラムから溶出した希釈溶出液を１０ｍＭのＢＴＰ，ｐＨ７．０で平衡さ
せた第二のＱ−セファロース高速流（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，３ｃｍ×９ｃｍ）カ
ラムに加えた。カラムを平衡バッファで洗浄し、高グリコシル化Ｅｐｏ類似体を
０．６Ｍの塩化ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ６．０で溶出
させた。

【０１０７】 精製したタンパク質をｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（カットオフ分子量１０，０００）
経由で２０ｍＭのＮａＰＯ_４，ｐＨ６．０、１４０ｍＭのＮａＣｌに交換し、次
いで０．２μｍのフィルターで濾過し、２−８℃で保存した。

【０１０８】 実施例３ ４、５及び６個のＮ結合糖鎖を含むｒＨｕＥｐｏ及びｒＨｕＥｐｏ類似体のｉ
ｎ ｖｉｖｏ生物活性 重篤な低酸素症状の赤血球増加症マウスのバイオアッセイで４、５及び６個の
Ｎ結合糖鎖を含むＥｐｏ類似体のｉｎ ｖｉｖｏ活性をｒＨｕＥｐｏの対応する
活性に比較した。このアッセイは、外部から投与された被験サンプルに反応した
マウスの赤血球形成の増進を測定する指標として、新しく合成された赤血球の^５９ Ｆｅの取込みを定量する。以下に記載の手順で実施されたアッセイはＣｏｔ
ｅｓ ａｎｄ Ｂａｎｇｈａｍ（Ｎａｔｕｒｅ １９１，１０６５（１９６１）
）の方法の修正方法である。

【０１０９】 このアッセイでは先ず、雌のＢＤＦ１マウスを低圧室（０．４−０．５気圧）
で１日あたり約１８時間の低酸素状態に１４日間維持することによって前処理す
る。マウスは低酸素状態を補償するような応答を生じる。即ち、赤血球形成が刺
激されて、赤血球数が増加し、これによって相対的な酸素運搬容量が増加する。
最終日の低圧維持の終了後、腹腔内注射によって被験サンプルを投与する前にマ
ウスを約７２時間常圧に維持する。常圧下でマウスは比較的赤血球増加性であり
、これに対する応答として内因性エリトロポエチンの産生量が減少し赤血球形成
速度が低下する。サンプル投与の５日後、０．２ｍＬ中の０．２−０．３μＣｉ
の^５９ＦｅＣｌ_３を尾の静脈に静注する。４８時間後、動物を殺し、０．５ｍＬ
の全血サンプル中に取込まれた^５９Ｆｅの量を測定することによって被験サンプ
ルによって惹起された赤血球形成の増進を測定する。ｒＨｕＥｐｏ、及び、４、
５または６個のＮ結合糖鎖を含む異なる５つのＥｐｏ類似体をこのアッセイで試
験したときに得られた結果の一例を図３に示す。各サンプルは適当な濃度範囲内
の６種類または７種類の異なる希釈度でアッセイにかけた。全部のサンプルを、
０．５％のウシ血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水で希釈し、前処理
した５匹のマウスに０．４ｍＬの各希釈液を投与した。^５９Ｆｅの投与の４８時
間後に、０．５ｍＬの血液に取込まれた量をガンマカウンティングによって測定
した。各サンプルの結果を、投与用量の対数に対する^５９Ｆｅの取込みパーセン
トとしてプロットする。

【０１１０】 図３に示すように、このアッセイで試験した５種類の高グリコシル化Ｅｐｏ類
似体の全部がｒＨｕＥｐｏよりも高い効力を有していた。更に、各類似体の効力
はＮ結合糖鎖の数に直接的に従属しており、類似体の糖鎖の数が多くなるほど活
性が高くなっていた。従って、６個のＮ結合糖鎖を有している類似体Ｎ５３が最
も高い効力をもつ類似体であった。次いで、５個のＮ結合糖鎖を有している類似
体Ｎ４７は、４個のＮ結合鎖を有している類似体よりも高い効力を有していた。
４個のＮ結合糖鎖を有している３つの類似体（Ｎ４、Ｎ１８及びＮ５０）の効力
は互いにほぼ等しく、ｒＨｕＥｐｏの効力よりも高い値であった。

【０１１１】 この実験で、ｒＨｕＥｐｏ及び４個、５個または６個のＮ結合糖鎖を有してい
る類似体のそれぞれについて４０％の^５９Ｆｅ取込み率を生じさせるために必要
な投与量はそれぞれ１０，７００ｎｇ、６４０ｎｇ、１４０ｎｇ及び３８ｎｇで
あった。このような赤血球形成レベルを生じさせるために必要な物質の量に基づ
いて計算すると、４個、５個または６個のＮ結合糖鎖を有しているＥｐｏ類似体
はｒＨｕＥｐｏの１７倍、７７倍及び２８０倍の効力を有している。

【０１１２】 実施例４ ラット及びビーグル犬にＩＶ投与したｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ Ｎ４７類似体
の薬物動態 Ｅｐｏ Ｎ４７類似体とｒＨｕＥｐｏとの薬物動態パラメーターを比較するた
めにラット及びイヌで別々の２つの試験を行った。

【０１１３】 ラットの試験では、１μＣｉ（０．１μｇペプチド／ｋｇまでの量）の^１２５ Ｉ−Ｅｐｏ Ｎ４７類似体または^１２５Ｉ−組換えヒトエリトロポエチン（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）を体重３１４ｇ−３６３ｇの正常な雄のスプレーグ・ドーリーネ
ズミに外科的に留置させた頸動脈カニューレから静注した。投与後の種々の時点
で０．３ｍＬの血液を採取し、遠心によって血清を調製した。次に、０．１ｍＬ
の各血清サンプル中の^１２５Ｉ−ｒＨｕＥｐｏまたは^１２５Ｉ Ｅｐｏ Ｎ４７
類似体のレベルを９０％エタノールと共に４℃で一夜インキュベーション後に測
定した。各血清サンプル中のエタノール沈殿したタンパク質を遠心によって収集
し、放射能をガンマカウンターでカウントした。得られた血清濃度を時間の関数
として示す薬物動態曲線を図４に示す。各点は、Ｎ４７類似体グループでは５匹
のラットのグループ平均及びｒＨｕＥｐｏグループでは６匹のラットのグループ
平均を表す。各ラット毎の薬物動態パラメーターをＰＣＮＯＮＬＩＮ ４．０非
線形回帰分析（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ，１９９２）
を使用して測定し、各グループの結果を平均化した。結果を表３に示す。

【０１１４】

【表５】

【０１１５】 イヌの試験では、２９μＣｉ以下の^１２５Ｉ−ｒＨｕＥｐｏまたは^１２５Ｉ−
Ｎ４７（０．１μｇペプチド／ｋｇ以下の量）を、体重７．８−９．５ｋｇの正
常なビーグル犬の頭部静脈に全量（ｂｏｌｕｓ）静注によって投与した。投与２
４時間後までの種々の時点で約１−２ｍＬの血液を収集し、血清を調製した。０
．１ｍＬの血清中の^１２５Ｉ−ｒＨｕＥｐｏ及び^１２５Ｉ−Ｎ４７の濃度を測定
し、薬物動態パラメーターを上述の手順で計算した。イヌで試験した血清濃度を
時間の関数として示す薬物動態曲線を図５に示す。時間点は各グループ２匹から
成る動物のグループ平均である。薬物動態パラメーターを表４にまとめる。

【０１１６】

【表６】

【０１１７】 ラット試験及びイヌ試験の双方で、ｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ Ｎ４７類似体は
２相性の（ｂｉｐｈａｓｉｃ）血清クリアランスを示した。ラット体内で、クリ
アランスはｒＨｕＥｐｏがＥｐｏ Ｎ４７類似体の約３．７倍の速さであり、β
半減期は、Ｅｐｏ Ｎ４７がｒＨｕＥｐｏの約２．８倍の長さであった。イヌ試
験の薬物動態パラメーターはラットで観察された結果にほぼ符合した。イヌ体内
で、クリアランスはｒＨｕＥｐｏがＥｐｏ Ｎ４７の３．５倍の速さであり、β
半減期はＥｐｏ Ｎ４７がｒＨｕＥｐｏの３．５倍の長さであった。

【０１１８】 実施例５ ｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ類似体Ｎ４７の投与後のヘマトクリットの用量応答 週３回（ＴＩＷ）の投与頻度に対するヘマトクリットの用量応答試験 正常マウス体内のｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ類似体Ｎ４７のｉｎ ｖｉｖｏ生物
作用を比較するために、一連の用量を腹腔内注射または静脈内注射で週３回の頻
度で６週目まで投与した。眼窩後方からの採血によるヘマトクリットの定量を週
２回の頻度で行った。

【０１１９】 体重約３０ｇの正常なＣＤ１マウス（１０−１３匹を１グループとする）に、
ｒＨｕＥｐｏ（０．６２５−１０μｇペプチド／ｋｇ／投与の用量範囲）、Ｅｐ
ｏ Ｎ４７類似体（０．１５６−１．２５μｇペプチド／ｋｇ／投与の用量範囲
）またはビヒクル対照を、腹腔内注射によって週３回の頻度で合計６週間投与し
た。ビヒクル対照として、及び、ｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ Ｎ４７類似体の投与
用調製物の希釈剤として、０．０２５％のマウス血清アルブミンを含むリン酸塩
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用した。全部のマウスのヘマトクリットの基線量
を測定し、その後は眼窩後方から採血することによって週２回の頻度で測定した
。実験の終了後、全部の動物から得られた血清を収集し、注射した物質に対する
抗体を溶液放射性免疫沈降法によって検定した。抗体中和に陰性であると判定さ
れた動物のヘマトクリットデータを以後の分析に使用した。

【０１２０】 図６に示すように、ｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ Ｎ４７類似体の双方が６週間の
試験中にヘマトクリットの用量依存性増加を生じるが、所与の濃度ではＮ４７類
似体がｒＨｕＥｐｏに比較してヘマトクリットをより大きく増加させる。この実
験では週３回の頻度で腹腔内注射によって投与したときにＥｐｏ Ｎ４７類似体
の効力は約３−４倍になっている。

【０１２１】 腹腔内注射と同様の手順を使用し、週３回の頻度で静脈内注射することによっ
てｒＨｕＥｐｏ及び類似体Ｎ４７の用量応答試験を実施した。得られた結果は腹
腔内注射で得られた結果と同様であった。特にこの試験は、週３回の頻度で投与
したときにｒＨｕＥｐｏに比較してＥｐｏ Ｎ４７類似体のほうが大きい効力を
有していることを追認した。

【０１２２】 正常マウスのヘマトクリットを増加させるｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ Ｎ４７の
生物活性をより十分に比較し定量するために、実験結果を更に相対的効力プロッ
トによって分析した。各実験では、試験開始後３８日間のヘマトクリットの増加
量の合計を曲線下方面積（ＡＵＣ）が得られる台形加法で計算することによって
、各用量のｒＨｕＥｐｏまたはＮ４７類似体の活性を測定した。次いでＡＵＣを
μｇペプチド／ｋｇ／週で表す対数用量に対してプロットした。同じまたは異な
る投与経路または投与頻度によって投与された化合物間の効力の差は、該当する
対数用量応答線間の距離を測定することによって決定できる。図７は、実施した
全部の実験に関する相対的効力データの要約を示しており、２つの異なる経路（
腹腔内及び静脈内）及び２つの異なる投与スケジュールによって投与されたｒＨ
ｕＥｐｏ及びＥｐｏ Ｎ４７類似体の活性が比較されている。

【０１２３】 図７に示すように、週３回の頻度で投与されたとき、Ｅｐｏ Ｎ４７類似体は
、静脈内または腹腔内のいずれの経路で注射されても同じ効力を有しており、そ
れらの効力は週３回の頻度で腹腔内に注射されたｒＨｕＥｐｏの３．６倍である
。

【０１２４】 週１回（ＯＷ）の投与頻度に対するヘマトクリットの用量応答試験 正常マウス体内のヘマトクリット増加に対する効果についてｒＨｕＥｐｏとＥ
ｐｏ類似体Ｎ４７とを比較するために、腹腔内または静脈内の投与経路で週１回
の投与を６週間継続した。

【０１２５】 体重約３０ｇの正常ＣＤ１マウス（１グループ８−１０匹）に、０．０２５％
のマウス血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で調製した種々の濃度のｒＨｕＥｐ
ｏもしくはＥｐｏ Ｎ４７類似体またはビヒクル対照（０．０２５％のマウス血
清アルブミンを加えたＰＢＳ）を週１回の頻度で合計６週間静脈内投与した。類
似体の用量は６．２５−２５μｇのペプチド／ｋｇ／投与の範囲、ｒＨｕＥｐｏ
の用量は２５−２００μｇ／ｋｇ／投与の範囲で変化させた。全部のマウスのヘ
マトクリットの基線量を測定し、その後は週２回の頻度で眼窩後方から採血によ
って測定した。実験の終了後、全部の動物から得られた血清を収集し、注射した
物質に対する抗体を溶液放射性免疫沈降法によって検定した。抗体中和に陰性で
あると判定された動物のデータを以後の分析に使用した。

【０１２６】 図８に示すように、ｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ Ｎ４７類似体の双方が週１回投
与されたときに正常マウスのヘマトクリットを増加させ得る。応答を生じさせる
ために必要なｒＨｕＥｐｏの用量は類似体Ｎ４７の必要量よりも有意に多い。例
えばこの実験で、２５μｇペプチド／ｋｇ／週のＮ４７は６週間でマウスのヘマ
トクリットを４１．２ポイント増加させたが、同じ用量のｒＨｕＥｐｏはヘマト
クリットを１２．５ポイントしか増加させなかった。

【０１２７】 上述の手順と同様の手順を使用し、週１回の頻度の腹腔内注射によってｒＨｕ
Ｅｐｏ及び類似体Ｎ４７の用量応答試験を実施した。得られた結果は静脈内投与
で得られた結果に符合しており、また、週１回の頻度で投与したときにｒＨｕＥ
ｐｏに比較して類似体Ｎ４７のほうが大きい効力を有していることを追認した。

【０１２８】 各々を週１回の頻度で投与したときのｒＨｕＥｐｏとＮ４７類似体との活性の
差を定量するために、上述のようなすべての関連実験から相対的効力のプロット
を作成した。図７に示すように、週１回の頻度で投与されたとき、類似体Ｎ４７
は、静脈内または腹腔内のいずれの経路で注射されても同じ効力を有している。
各々を週１回の頻度で投与したとき、類似体Ｎ４７はｒＨｕＥｐｏのほぼ１４倍
の効力を有している。

【０１２９】 更に、図６の対数−用量応答プロットは以下の結果を表す：（１）週１回（Ｑ
Ｗ）の頻度で投与された所与の用量の類似体Ｎ４７は３回の分割用量（ＴＩＷ）
として投与された１週の合計用量が等しいｒＨｕＥｐｏとほぼ同じ効力を有して
いる；（２）週１回（ＱＷ）の頻度で投与された所与の用量のｒＨｕＥｐｏは３
回の分割用量（ＴＩＷ）として投与された１週の合計用量が等しい類似体Ｎ４７
の約２％の効力しかもたない；（３）ＴＩＷでマウスに投与された類似体Ｎ４７
はＱＷに比較してほぼ４倍の効力を示す。

【０１３０】 隔週１回（ＥＯＷ）の投与頻度に対するヘマトクリットの用量応答試験 また、隔週１回の頻度で注射したときに類似体Ｎ４７がマウスのヘマトクリッ
トを増加させる能力を評価する実験を行った。正常ＣＤ１マウス（１グループ１
０匹）に、０．０２５％のマウス血清アルブミンを含むＰＢＳ中で調製した種々
の濃度のＥｐｏ Ｎ４７類似体を週１回または隔週１回の頻度で合計６週間静注
した。類似体Ｎ４７の投与量は２００、１００または２５μｇ／ｋｇ／投与を隔
週１回、または、１２．５μｇ／ｋｇ／投与を週１回とした。全部のマウスのヘ
マトクリットの基線量を測定し、その後は週２回の頻度で眼窩後方から採血する
ことによって測定した。

【０１３１】 図９に示すように、類似体Ｎ４７は隔週１回の投与でも正常マウスのヘマトク
リットを用量従属的に増加させ得る。投与頻度が少なくなるほどヘマトクリット
を増加させるために必要なＮ４７類似体の量が多くなることは予想通りである。
Ｎ４７類似体を隔週１回の頻度で２００μｇ／ｋｇの用量で投与したときに６週
間で生じたヘマトクリットの増加は、週１回の頻度で１２．５μｇ／ｋｇの用量
を投与したときとほぼ同じであった。

【０１３２】 実施例６ 持続通院腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者にＩＶ投与したＥｐｏ Ｎ４７類似体及び
ｒＨｕＥｐｏの薬物動態 ラット及びビーグル犬の体内ではＥｐｏＮ４７類似体の半減期がｒＨｕＥｐｏ
に比べて顕著に延長したので、ヒトの体内でも同様の延長が観察されるか否かを
判定することは有益であった。

【０１３３】 １１人の安定なＣＡＰＤ患者（７人の男性と４人の女性、２７−７５歳）に二
重盲検方式で無作為化クロスオーバーデザインの試験を実施した。１つの患者グ
ループには１００Ｕ／ｋｇのｒＨｕＥｐｏ（０．５μｇ／ｋｇのペプチド等価量
）を投与し、第二グループの患者には０．５μｇ／ｋｇのＥｐｏ Ｎ４７類似体
を投与した。双方とも１回の全量静注で投与した。静脈血サンプル（３ｍＬ）を
留置カニューレから、投与前、並びに、全量静注の５、１０、１５、３０分後及
び１、２、５、８、１２、１６、２４、３０、３６、４８、６０、７２、９６時
間後に採取した。２８日間の効果消去（ｗａｓｈｏｕｔ）期間後に、第一患者グ
ループにＥｐｏ類似体Ｎ４７を１回静脈内投与し、第二グループの患者にはｒＨ
ｕＥｐｏを１回静脈内投与した。最初の処置サイクルと同様に血液サンプルを採
取した。血清中のｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ Ｎ４７類似体のレベルは基線量の内
因性Ｅｐｏのレベルを減算した後でＥＬＩＳＡによって測定した。クロスオーバ
ーデザイン効果の補正後に推定された薬物動態パラメーター（平均＋／−ＳＥ）
を表５に示す。血清濃度ＡＵＣは一次台形加法を使用して計算した。ｔ１／２_Ｚ はｌｏｇ（２）／Ｋ_Ｚとして定義され、ここにＫ_Ｚはｌｎ（血清濃度）時間曲線
の末端部分の勾配として計算される。クリアランス（Ｃｌ）は用量／ＡＵＣとし
て定義される。分布体積（Ｖ_ｄ）はＣｌ／Ｋとして定義される。

【０１３４】

【表７】 平均血清半減期はＥｐｏ Ｎ４７類似体（２５．３時間）がｒＨｕＥｐｏ（８
．５時間）の３倍の長さであり、クリアランスはｒＨｕＥｐｏが類似体Ｎ４７の
２．５倍の速さであった。

【０１３５】 実施例７ Ｅｐｏ Ｎ４７類似体のフェーズＩＩの用量決定及び投与スケジュール決定に
関する試験 透析治療を受けているＣＲＦ患者に皮下注射または静脈内注射によって投与し
たときの類似体Ｎ４７の最適な用量及び投与スケジュールを検討するために多中
心性（ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ）の無作為化逐次用量増加試験を開始した。

【０１３６】 以下の投与スケジュールを試験した： 週１回の投与：０．０７５、０．２２５、０．４５、０．７５、１．５及び４
．５μｇのペプチド／ｋｇ／投与 週３回の投与：０．０２５、０．０７５、０．１５、０．２５、０．５及び１
．５μｇのペプチド／ｋｇ／投与。

【０１３７】 試験は二部式で行った。第一部は、週１回または週３回の頻度で与えたときに
４週間でヘモグロビンを最適の割合（１ｇ／ｄＬ以上でかつ３ｇ／ｄＬ未満）に
増加させる類似体Ｎ４７の用量を推定するために設計した用量増加試験である。
各試験の第二部は、（静脈内または皮下の投与経路で週１回または週３回投与し
たときに）ヘマトクリットを治療目標値に維持するために必要な用量を決定する
ように設計されている。

【０１３８】 予備的結果は、類似体Ｎ４７の週１回の投与が貧血性ＣＲＦ患者のヘマトクリ
ットの増加及び維持の双方に使用できることを示す。初期結果は、双方の投与経
路で治療を開始するための好ましい用量が、週３回の投与スケジュールでは０．
１５及び０．２５μｇペプチド／ｋｇ／投与であり、週１回の投与スケジュール
では０．４５及び０．７５μｇペプチド／ｋｇ／投与であることを示唆する。

【０１３９】 本発明を好ましい実施態様に基づいて説明してきたが、本発明は開示された実
施態様に限定されない。逆に、本発明は、特許請求の範囲の要旨及び範囲に含ま
れる様々な変更及び等価の概念を包含する。特許請求の範囲はこのような変更及
び等価の概念をすべて包含するように最も広義に解釈されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列（配列１）を示す。

【図２】 無血清培地中のＣＨＯ細胞発現から得られたｒＨｕＥｐｏ及び高グリコシル化
Ｅｐｏ類似体のウェスタンブロット分析を示す。類似体Ｎ５３及びＮ６１の構築
は実施例１に記載されている。各類似体のＮ結合糖鎖の数が示されている。

【図３】 重篤な低酸素症状（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ）の赤血球増加症マウスのバイオアッ
セイにおけるｒＨｕＥｐｏ、Ｅｐｏ類似体Ｎ４、Ｎ１８及びＮ５０（４個のＮ結
合糖鎖を含む）、Ｎ４７（５個のＮ結合糖鎖を含む）、及び、Ｎ５３（６個のＮ
結合糖鎖を含む）の活性を比較している。実験手順は実施例３に記載されている
。各点は、５匹の動物の平均レスポンスを表す。類似体Ｎ４、Ｎ１８及びＮ４７
は先行文献ＷＯ９４／０９２５７に記載されている。

【図４】 静注（ＩＶ）によって正常ラットに投与されたｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ類似体
Ｎ４７の血清半減期を比較している。実験手順は実施例４に記載されている。結
果は各グループの平均（＋／−ＳＤ）である。

【図５】 静注（ＩＶ）によってビーグル犬に投与されたｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ類似体
Ｎ４７の血清半減期を比較している。実験手順は実施例４に記載されている。結
果は各グループの平均（＋／−ＳＤ）である。

【図６】 腹腔内注射（ＩＰ）によって週３回（ＴＩＷ）の頻度で６週間継続投与した種
々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏ類似体Ｎ４７に応答したマウスのヘマトク
リットの増加を示す。実験手順は実施例５に記載されている。示した結果は各用
量グループのヘマトクリットの変化のグループ平均（＋／−ＳＤ）である。

【図７】 腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）の投与経路によって週１回（ＱＷ）また
は週３回（ＴＩＷ）の頻度で注射したｒＨｕＥｐｏ及びＥｐｏ類似体Ｎ４７のマ
ウス体内での相対的効力を示す。実験手順は実施例５に記載されている。各点は
以下のような別々の実験から得られたデータの平均（＋／−ＳＤ）を表す：Ｎ４
７、ＩＰ、ＴＩＷ（ｎ＝５）；Ｎ４７、ＩＶ、ＴＩＷ（ｎ＝１）；Ｎ４７、ＩＰ
、ＱＷ（ｎ＝２）；Ｎ４７、ＩＶ、ＱＷ（ｎ＝３）；ｒＨｕＥＰｏ、ＩＰ、ＴＩ
Ｗ（ｎ＝５）；ｒＨｕＥｐｏ、ＩＶ、ＱＷ（ｎ＝２）。各実験では１用量あたり
７−１３匹のマウスを使用した。

【図８】 静注（ＩＶ）によって週１回（ＱＷ）の頻度でほぼ６週間継続投与した種々の
用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏ類似体Ｎ４７に応答したマウスのヘマトクリッ
トの増加を示す。実験手順は実施例５に記載されている。示した結果は各用量グ
ループのヘマトクリットの変化のグループ平均（＋／−ＳＤ）である。

【図９】 静注（ＩＶ）によって週１回（ＱＷ）または隔週１回（ＥＯＷ）の頻度でほぼ
６週間継続投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏ類似体Ｎ４７に応答
したマウスのヘマトクリットの増加を示す。実験手順は実施例５に記載されてい
る。示した結果は各用量グループのヘマトクリットの変化のグループ平均（＋／
−ＳＤ）である。

【図１０】 ヒトＩｇＧγ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域のアミノ酸配列（配
列：２５）を示す。

【図１１】 Ｅｐｏシグナル配列を含むＥｐｏ Ｎ４７−Ｆｃ融合ポリペプチドのｃＤＮＡ
及びアミノ酸配列（配列：２５）を示す。Ｆｃのアミノ末端残基がＥｐｏのａｒ
ｇ−１６６残基に融合している。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/06 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/505 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 15/00 ＺＮＡＡ 1/19 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エリオツト，ステイーブン・ジー アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーベリー・パーク、ゴールデン・クレ スト・アベニユー・1040 (72)発明者 ブラウン，ジエフリー・ケイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・93010、 カマリロ、カリエ・アローラ・1244 (72)発明者 シツトニー，カレン・シー アメリカ合衆国、カリフオルニア・91604、 ストウーデイオ・シテイ、グツドランド・ アベニユー・4205 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 CA07 DA06 EA04 GA11 HA01 HA12 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA33 CA44 4C076 AA11 CC30 DD26E DD37Q DD42E EE41A FF63 4C084 AA01 AA02 BA02 BA08 BA22 CA18 CA36 CA53 DB01 NA05 ZA55 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA40 DA13 EA24 FA74

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 治療有効量の高グリコシル化エリトロポエチン類似体を医薬
   組成物として投与することから成り、同等のヘマトクリット目標値を得るために
   前記類似体の投与頻度が等価モル量の組換えヒトエリトロポエチンよりも少ない
   ことを特徴とする、哺乳動物のヘマトクリットの増加及び維持方法。
2. 【請求項２】 前記量の高グリコシル化エリトロポエチン類似体をほぼ週２
   回の頻度で投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記量の高グリコシル化エリトロポエチン類似体をほぼ週１
   回の頻度で投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記量の高グリコシル化エリトロポエチン類似体をほぼ隔週
   １回の頻度で投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記量の高グリコシル化エリトロポエチン類似体をほぼ月１
   回の頻度で投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 高グリコシル化エリトロポエチン類似体の投与量が、１回の
   投与毎に体重１ｋｇあたり約０．０７５−４．５μｇのエリトロポエチンペプチ
   ドであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
7. 【請求項７】 治療有効量の高グリコシル化エリトロポエチン類似体を医薬
   組成物として投与することから成り、同等のヘマトクリット目標値を得るために
   前記類似体が組換えヒトエリトロポエチンよりも少ないモル量で投与されること
   を特徴とする、哺乳動物のヘマトクリットの増加及び維持方法。
8. 【請求項８】 高グリコシル化エリトロポエチン類似体の投与量が、１回の
   投与毎に体重１ｋｇあたり約０．０２５−１．５μｇのエリトロポエチンペプチ
   ドを週３回投与する量であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 高グリコシル化エリトロポエチン類似体がヒトエリトロポエ
   チンに比べて少なくとも１つの追加グリコシル化部位を含んでおり、前記部位に
   糖鎖が付加されていることを特徴とする請求項１または７に記載の方法。
10. 【請求項１０】 ヘマトクリット目標値が少なくとも約３０％であることを
    特徴とする請求項１または７に記載の方法。
11. 【請求項１１】 糖鎖が、ヒトエリトロポエチンの配列の３０、５１、５７
    、６９、８８、８９、１３６及び１３８位の１つまたは複数の位置に存在するＮ
    結合糖鎖であることを特徴とする請求項９に記載の類似体。
12. 【請求項１２】 ヒトエリトロポエチンの配列の３０位及び８８位に追加の
    Ｎ結合糖鎖を有していることを特徴とする請求項９に記載の類似体。
13. 【請求項１３】 Ａｓｎ^３０Ｔｈｒ^３２Ｖａｌ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０
    Ｅｐｏであることを特徴とする請求項１２に記載の類似体。
14. 【請求項１４】 医薬組成物が医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化
    剤、乳化剤、保存剤及び／またはアジュバントを含むことを特徴とする請求項１
    または７に記載の方法。
15. 【請求項１５】 希釈剤がクエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムのバ
    ッファ溶液であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
16. 【請求項１６】 担体がヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項
    １４に記載の組成物。
17. 【請求項１７】 保存剤がベンジルアルコールであることを特徴とする請求
    項１４に記載の組成物。
18. 【請求項１８】 哺乳動物が腎機能の減退または低下に付随する貧血に罹っ
    ていることを特徴とする請求項１または７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 哺乳動物が骨髄抑制療法に付随する貧血に罹っていること
    を特徴とする請求項１または７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 骨髄抑制療法が化学療法剤または抗ウイルス薬を含むこと
    を特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 哺乳動物が出血過多に付随する貧血に罹っていることを特
    徴とする請求項１または７に記載の方法。
22. 【請求項２２】 治療有効量の鉄の投与を更に含む請求項１または７に記載
    の方法。
23. 【請求項２３】 ヒトエリトロポエチンの配列の５２、５３、５５、８６及
    び１１４位のいずれかの位置に少なくとも１つの追加グリコシル化部位を含み、
    前記部位にＮ結合糖鎖が付加されていることを特徴とするヒトエリトロポエチン
    類似体。
24. 【請求項２４】 少なくとも２個の追加グリコシル化部位を含み、前記部位
    の各々に糖鎖が付加されていることを特徴とする請求項２２に記載の類似体。
25. 【請求項２５】 少なくとも３個の追加グリコシル化部位を含み、前記部位
    の各々に糖鎖が付加されていることを特徴とする請求項２２に記載の類似体。
26. 【請求項２６】 少なくとも４個の追加グリコシル化部位を含み、前記部位
    の各々に糖鎖が付加されていることを特徴とする請求項２２に記載の類似体。
27. 【請求項２７】 【化１】 から成るグループから選択されたヒトエリトロポエチン類似体。
28. 【請求項２８】 外因性ＤＮＡ配列の発現産物であることを特徴とする請求
    項２３から２７のいずれか一項に記載の類似体。
29. 【請求項２９】 請求項２３から２７のいずれか一項に記載の類似体をコー
    ドするＤＮＡ配列。
30. 【請求項３０】 宿主細胞が類似体を発現できるように請求項２９に記載の
    ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた真核宿主細胞。
31. 【請求項３１】 治療有効量の請求項２３から２７のいずれか一項に記載の
    類似体を医薬として許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と共に含む組成
    物。
32. 【請求項３２】 治療有効量の請求項２３から２７のいずれか一項に記載の
    類似体を医薬組成物として投与することから成る哺乳動物のヘマトクリットの増
    加及び維持方法。
33. 【請求項３３】 同等のヘマトクリット目標値を得るために類似体を等価の
    モル量の組換えヒトエリトロポエチンよりも少ない頻度で投与することを特徴と
    する請求項３２に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記量の類似体をほぼ週１回、ほぼ隔週１回、または、ほ
    ぼ月１回の頻度で投与することを特徴とする請求項３３に記載の方法。
35. 【請求項３５】 同等のヘマトクリット目標値を得るために類似体を組換え
    ヒトエリトロポエチンよりも少ないモル量で投与することを特徴とする請求項３
    ２に記載の方法。
36. 【請求項３６】 類似体の投与量が１回の投与毎に体重１ｋｇたり約０．０
    ２５−１．５μｇのエリトロポエチンペプチドを週３回投与する量であることを
    特徴とする請求項３４に記載の方法。
37. 【請求項３７】 類似体の投与量が１回の投与毎に体重１ｋｇあたり約０．
    ０２５μｇ未満のエリトロポエチンペプチドを週３回投与する量であることを特
    徴とする請求項３４に記載の方法。
38. 【請求項３８】 高グリコシル化エリトロポエチン類似体と免疫グロブリン
    Ｈ鎖定常領域とから成る融合タンパク質。
39. 【請求項３９】 免疫グロブリンＨ鎖定常領域がＦｃ領域であることを特徴
    とする請求項３８に記載の融合タンパク質。
40. 【請求項４０】 Ｆｃ領域がヒトＩｇＧから得られるかまたはヒトＩｇＧか
    ら誘導されることを特徴とする請求項３９に記載の融合タンパク質。
41. 【請求項４１】 ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４
    であるかまたはその組合せであることを特徴とする請求項４０に記載の融合タン
    パク質。
42. 【請求項４２】 ヒトエリトロポエチンの配列の３０、５１、５２、５３、
    ５５、５７、６９、８６、８８、８９、１１４、１３６及び１３８位のいずれか
    の位置に少なくとも１つの追加のグリコシル化部位を含み、前記部位にＮ結合糖
    鎖が付加されていることを特徴とする請求項３８に記載の融合タンパク質。
43. 【請求項４３】 Ｆｃ領域に融合したＡｓｎ^３０Ｔｈｒ^３２Ｖａｌ^８７Ａｓ
    ｎ^８８Ｔｈｒ^９０ Ｅｐｏであることを特徴とする請求項３８に記載の融合タン
    パク質。
44. 【請求項４４】 シグナル配列の欠失した図１１に示す成熟アミノ酸配列（
    配列：２６）から成ることを特徴とする請求項４３に記載の融合タンパク質。