MXPA02010333A - Metodos y composiciones para la prefencion y tratamiento de anemia. - Google Patents

Abstract

Se describen metodos para incrementar y mantener los hematocritos en un mamifero, que comprende administrar un analogo hiperglicosilado de eritropoyetina. Un analogo puede administrarse menos frecuentemente que una cantidad molar equivalente de eritropoyetina humana recombinante para obtener un hematocrito objetivo comparable y tratar la anemia. Alternativamente, una cantidad molar menor de un analogo hiperglicosilado puede administrarse para obtener un hematocrito objetivo comparable y tratar la anemia. Tambien se describen nuevos analogos de eritropoyetina hiperglicosilados, metodos de produccion de los analogos, y composiciones que comprenden los analogos.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE ANEMIA Campo de la Invención La invención se refiere al incremento de los hematocritos en un mamífero, usando análogos hiperglicosilados de la eritropoyetina. Más particularmente, la invención se refiere a una dosificación menos frecuente de un análogo hiperglicosilado comparado con una eritropoyetina humana recombinante para elevar y conservar el hematocrito y tratar la anemia. La invención también se refiere a la administración de cantidades inferiores de un análogo hiperglicosilado comparado con la eritropoyetina humana recombinante a una frecuencia de dosis equivalente, con objeto de elevar y conservar el hematocrito y tratar la anemia. También se suministran nuevos análogos hiperglicosilados de la eritropoyetina. Antecedentes de la Invención La eritropoyetina (Epo) es una hormona de glicoproteína necesaria para la maduración de células progenitoras eritroides en eritrocitos. Se produce en el riñon y es esencial para regular los niveles de células de glóbulos rojos en la circulación. Las condiciones marcadas por niveles bajos de la señal de oxigeno de los tejidos, incrementan la producción de Epo, lo que a su vez estimula la eritropoyesis. Una pérdida de la función del riñon como se observa en la Ref: 142879 insuficiencia renal crónica (CRF) , por ejemplo, resulta típicamente en una producción disminuida de Epo y en una reducción concomitante en la células de glóbulos rojos. La Epo humana urinaria se purificó por Miyake et al. (J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)) a partir de pacientes con anemia aplástica. Sin embargo, la cantidad de proteína Epo purificada obtenida de esta fuente fue insuficiente para las aplicaciones terapéuticas. La identificación de la clonación del gen que codifica la Epo humana y la expresión de la proteína recombinante se describió en la patente de E.U.A. no. 4,703,008 para Lin, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia. Un método para la purificación de la eritropoyetina humana recombinante a partir de medios de célula, se describe en la patente de E.U.A. No. 4,667,016 para Lai et . al., que se incorpora en la presente como referencia. La producción de Epo biológicamente activa a partir de células hospedadoras de mamíferos ha hecho disponible por primera vez, cantidades de Epo adecuadas para aplicaciones terapéuticas. Además, el conocimiento de la secuencia de genes y la disponibilidad creciente de la proteína purificada, ha conducido a un mejor entendimiento del modo de acción de esta proteína. Tanto la Epo urinaria humana (Miyake et al. supra) como la Epo humana recombinante expresada en células de mamíferos, contienen tres cadenas de oligosacáridos ligadas en N y una ligada en O, que en conjunto comprenden alrededor del 40% del peso molecular total de la glicoproteína. La glicosilación ligada en N, sucede en los residuos de asparagina localizados en las posiciones 24, 38 y 83, mientras que la glicosilación ligada en O, sucede en un residuo de serina localizado en la posición 126 (Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)). Las cadenas de oligosacáridos han demostrado modificarse con residuos terminales del ácido siálico con cadenas ligadas en N que tienen típicamente hasta cuatro ácidos siálicos por cadena y cadenas ligadas en O que tienen hasta dos ácidos siálicos. Un polipéptido Epo puede por lo tanto acomodar hasta un total de 14 ácidos siálicos. Diversos estudios han demostrado que las alteraciones de las cadenas de carbohidrato de Epo pueden afectar la actividad biológica. En un estudio sin embargo, la separación de las cadenas de oligosacáridos ligadas en N o ligadas en 0, simplemente o en conjunto por mutagénesis de los residuos de serina que son sitios de glicosilación, reduce fuertemente la actividad in vitro de la Epo alterada que se produce en células de mamíferos (Dube et al. J. Bio. Chem. 263, 17516 (1988)). Sin embargo, DeLorme et . al. (Biochemistry 31, 9871- 9876 (1992)) reportan que la eliminación de los sitios de glicosilación ligados en N en la Epo, reduce la actividad biológica in vivo pero no la in vitro.

La relación entre el contenido de ácido siálico Epo y la actividad biológica in vivo, se describe al determinar la actividad in vivo de las isoformas aisladas en Epo. Se encontró que un incremento por etapas en el contenido de ácido siálico por molécula del Epo, da un incremento por etapas correspondiente en la actividad biológica in vivo, cuando se mide por la capacidad de las concentraciones equimolares de isoformas aisladas de Epo, para elevar el hematocrito de los ratones normales (Egrie et . al. Glycoconjugate J. 10, 263 (1993)). Aquellas isoformas de Epo tienen un contenido superior de ácido siálico, también muestran una vida media de suero más extensa, pero una afinidad disminuida para el receptor Epo, sugiriendo que la vida media del suero es una determinante importante en la actividad biológica in vivo. La introducción de nuevos sitios de glicosilación en el polipéptido Epo, puede resultar en la producción de moléculas con cadenas adicionales de carbohidratos. Ver la publicación PCT números O91/05867 y O94/09257 incorporadas por lo cual como referencia en su totalidad. Se describen los análogos de la glicosilación de Epo que tienen al menos una cadena adicional de carbohidratos ligada en N y/o que tienen al menos una cadena de carbohidratos adicional ligada en 0. Un análogo de la glicosilación que tiene una cadena adicional ligada en N se determinó para tener una vida media en circulación más prolongada en comparación con la Epo humana recombinante (rHuEpo) (isoformas 9-14) y para una isoforma purificada de rHuEpo que tiene 14 ácidos siálicos por molécula. La administración de la eritropoyetina humana recombinante (rHuEpo) es efectiva para la elevación de los niveles de células de glóbulos rojos en pacientes anémicos con insuficiencia renal en etapa terminal (Eschbach et . al. New Eng. J. Med. 316, 73-38 (1987)). Los estudios posteriores han demostrado que el tratamiento con rHuEpo puede corregir la anemia asociada en una diversidad de otras condiciones.

(Fischl et. al. New Eng. J. Med. 322, 1488-1493 (1990); Laupacis, Lancet 341, 1228-1232 (1993) . Las aprobaciones regulatorias se han dado para el uso de rHuEpo en el tratamiento de la anemia asociada con CRF, anemia relacionada con la terapia con AZT (zidovudina) en pacientes infectados con VIH, anemia en pacientes con malignidades no mieloides que reciben quimioterapias, y la anemia en pacientes que se someten a cirugía para reducir la necesidad de transfusiones sanguíneas alogénicas. La terapia actual para todas las indicaciones aprobadas (excepto la indicación de cirugía) involucra una dosis de partida de entre 50-150 unidades/kg, tres veces por semana (TI ) administrada por inyección intravenosa (IV) o subcutánea (SC) para alcanzar un rango sugerido del hematocrito objetivo. Para la indicación de cirugía, la rHuEpo se administra cada día 10 antes de la cirugía, el día de la cirugía y cuatro días posteriormente (Inserto de Empaque de EPOGEN®, 12/23/96) . En general, las dosis de partida actuales recomendadas para rHuEpo elevan el hematocrito dentro del rango objetivo en alrededor de seis hasta ocho semanas. Una vez que se ha alcanzado el rango del hematocrito objetivo, se establece un programa de dosificación de mantenimiento que variará dependiendo del paciente, pero que es típicamente tres veces por semana para pacientes anémicos con CRF. La administración de rHuEpo antes descrita es un régimen efectivo y bien tolerado para el tratamiento de anemia. Sería deseable tener una terapéutica con una potencia superior que la rHuEpo . Una ventaja para tal molécula sería que se puede administrar menos frecuentemente y/o a una dosis inferior. Los tratamientos actuales para los pacientes que padecen de anemia, buscan la administración del EPOGEN® tres veces por semana y para los pacientes de cirugía, la administración una vez por día. Un programa de dosificación menos frecuente, sería más conveniente para los médicos y los pacientes, especialmente para aquellos pacientes que no hacen visitas regularmente programadas a las oficinas o clínicas de los médicos, o aquellos que se autoinyectan su Epo. Otra ventaja de otra molécula más potente, es que se introducen menos fármacos en los pacientes para un incremento comparable en el hematocrito. Es por lo tanto un objetivo de la invención identificar moléculas más potentes para el tratamiento de la anemia, que permitirán un programa de dosificación menos frecuente. Es un objetivo adicional de la invención, proporcionar moléculas que incrementarán y conservarán el hematocrito en niveles que son al menos comparables con aquellos de la Epo cuando se administran a una dosis inferior. También es un objetivo de la invención, que estas moléculas seleccionadas para una dosificación menos frecuente, sean al menos también toleradas como rHuEpo y potencialmente mejor toleradas en algunos pacientes . Breve Descripción de la Invención Se ha encontrado que un análogo hiperglicosilado de Epo designado como N47 (Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 Epo) tiene una vida media de suero más prolongada que la eritropoyetina humana recombinante (rHuEpo) y una actividad superior in vivo cuando se administra a la misma dosis y frecuencia que la rHuEpo. Además, se ha demostrado que el análogo eleva el hematocrito en ratones en una administración de una vez por semana que es comparable con la elevación del hematocrito para la rHuEpo administrada tres veces por semana. La farmacocinética del análogo N47 del Epo administrado a ratones y a humanos fueron similares.

La invención proporciona un método para la elevación y conservación del hematocrito en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo hiperglicosilado de la Epo en una composición farmacéutica, en donde el análogo se administra menos frecuentemente que una cantidad molar equivalente de rHuEpo, para obtener un hematocrito objetivo comparable. La frecuencia de dosificación de la invención actual con objeto de alcanzar un rango óptimo de hematocrito en el paciente, es menos de tres veces por semana. Las frecuencias de dosificación pueden ser dos veces por semana, una vez por semana y menos de una vez por semana, tal como una vez cada tercer semana, una vez al mes o una vez cada dos meses. La frecuencia de dosificación requerida para mantener un hematocrito objetivo en el paciente, es menos de tres veces por semana. Las frecuencias de dosificación pueden ser dos veces por semana, una vez por semana o menos de una vez por semana, tal como una vez cada dos semanas, una vez por mes o una vez cada dos meses. La invención también suministra un método para la elevación y conservación de hematocrito en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo hiperglicosilado de la Epo, en donde el análogo se administra en una cantidad molar inferior que la rHuEpo para obtener un hematocrito objetivo comparable.

También se suministran composiciones farmacéuticas que comprenden análogos hiperglicosilados de Epo, en donde las composiciones son adecuadas para una frecuencia de dosificación de menos de tres veces por semana. Las composiciones incluirán adyuvantes farmacéuticamente aceptables, adecuados para su uso con análogos hiperglicosilados de Epo. La invención se puede emplear con cualquier condición que resulte en una disminución en los niveles de células de glóbulos rojos, tales como la anemia asociada con una declinación o pérdida de una función del riñon, (insuficiencia renal crónica) , terapia mielosupresora, cáncer, infección viral, enfermedad crónica y pérdida excesiva de sangre durante procedimientos quirúrgicos. En una modalidad, el tratamiento con una dosificación de una vez por semana, o menos frecuentemente, es para la anemia que resulta de la insuficiencia renal crónica. También se suministran nuevos análogos hiperglicosilados de la Epo. Los análogos comprenden al menos una cadena adicional de carbohidratos comparada con rHuEpo en donde al menos una cadena de carbohidrato ligada en N se agrega en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114. Los nuevos análogos hiperglicosilados pueden tener dos, tres o cuatro cadenas adicionales de carbohidratos o pueden tener más de cuatro cadenas adicionales.

Descripción de las Figuras La figura 1 (SEQ ID NO: 1) muestra la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana. La figura 2 muestra un análisis del manchado Western de los análogos hiperglicosilados de la Epo y de la rHuEpo a partir de la expresión de células CHO en un medio libre de suero. La construcción de los análogos N53 Y N61 se describen en el ejemplo 1. Se indica el número de cadenas de carbohidratos ligadas en N en cada análogo. La figura 3 compara la actividad de rHuEpo, de análogos de Epo N4, N18, y N50 (que contienen cuatro cadenas de carbohidratos ligadas en N) , N47 (que contienen cinco cadenas de carbohidratos ligadas en N) , y N53 (que contienen seis cadenas de carbohidratos ligadas en N) en el bioensayo de ratón policitémico exhipóxico. Los procedimientos experimentales se describen en el ejemplo 3. Cada punto representa la respuesta media de cinco animales. Se han descrito previamente los análogos N4, N18 y N47 en WO94/09257. La figura 4 compara la vida media del suero del análogo N47 de Epo y rHuEpo, administrado a ratas normales por inyección intravenosa (IV) . Se describen los procedimientos experimentales en el ejemplo 4. Los resultados son la media (±SD) para cada grupo. La figura 5 compara la vida media del suero del análogo N47 de rHuEpo y Epo administrado a perros sabueso por inyección intravenosa (IV) . Los procedimientos experimentales se describen en el ejemplo 4. Los resultados son la media (±SD) para cada grupo. La figura 6 muestra el incremento en el hematocrito en ratones en respuesta a dosis variables del análogo N47 de rHuEpo o Epo administrado por inyección intraperitoneal (IP) tres veces por semana (TIW) por seis semanas. Los procedimientos experimentales se describen en el ejemplo 5. Los resultados mostrados son la media del grupo (±SD) del cambio en el hematocrito para cada grupo de dosis. La figura 7 compara la potencia relativa en los ratones de -los análogos N47 de rHuepo y Epo inyectados por vías de administración intraperitoneales (IP) o intravenosas (IV) a una frecuencia de una vez por semana (QW) o tres veces por semana (TIW) . Los procedimientos experimentales se describen en el ejemplo 5. Cada punto representa la media (±SD) de los datos a partir de experimentos separados como siguen: N47, IP, TIW (n=5) ; N47, IV, TIW (n=l) ; N47 IP, QW (n=2), N47, IV, QW (n=3) ; rHuEpo, IP, TIW (n=5) ; rHuEpo, IV, QW (n=2). Cada experimento utilizó 7 - 13 ratones por dosis. La figura 8 muestra el incremento en el hematocrito en ratones, en respuesta a dosis variables del análogo N47 de rHuEpo o Epo administrado por inyección intravenosa (IV) una vez por semana (QW) por aproximadamente seis semanas. Se describen los procedimientos experimentales en el ejemplo 5. Los resultados son la media del grupo (±SD) del cambio en el hematocrito para grupo de dosis. La figura 9 muestra el incremento en el hematocrito en ratones en respuesta a dosis variables del análogo N47 de Epo, administrado por inyección intravenosa (IV) una vez por semana (QW) o una vez cada dos semanas (EOW) por aproximadamente seis semanas. Los procedimientos experimentales se describen en el ejemplo 5. Los resultados mostrados son la media del grupo (±SD) del cambio en el hematocrito para cada grupo de dosis. La figura 10 (SEQ ID NO: 25) muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones de articulación, CH2 y CH3 de IgG?l humana. La figura 11 (SEQ ID NO: 26) muestra la secuencia de cADN y de aminoácidos del polipéptido de fusión de Epo N47-Fc incluyendo las secuencias de señal Epo. El residuo Fc en la terminal amino se fusiona al residuo arg-166 de la Epo. Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona un método para la elevación y conservación del hematocrito, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina en una composición farmacéutica. El análogo se administra menos frecuentemente que una cantidad molar equivalente de rHuEpo para obtener un hematocrito objetivo comparable. La invención también proporciona un método para la elevación y conservación del hematocrito que comprende administrar un análogo hiperglicosilado en cantidades molares inferiores a la rHuEpo para obtener un hematocrito obtenido comparable . La composición se puede administrar por vías intravenosa, subcutánea o intraperitoneal. Sorprendentemente, se ha encontrado que el análogo N47, un análogo de Epo hiperglicosilado descrito en WO94/09257, puede alcanzar un incremento en el hematocrito administrado una vez por semana que es comparable con aquel observado para la rHuEpo dado 3 veces por semana. El análogo N47 tiene los siguientes cambios de aminoácidos: ala a asn a 30; his a thr a 32; pro a val a 87; trp a asn a 88; y pro a thr a 90, lo que resulta en la adhesión de dos cadenas de carbohidratos ligadas en N en los residuos de asparagina 30 y 88. El análogo se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) (como se describen en el ejemplo 1) y se purifican como se describen en el ejemplo 2 para dar las isoformas de 17 hasta 22 ácidos siálicos. El análogo N47 muestra una vida media de suero superior en ratas y en perros sabuesos que el rHuEpo cuando se inyecta intravenosamente (figuras 4 y 5) . Cuando se inyecta intraperitonealmente tres veces por semana, el N47 induce incrementos en el hematocrito de ratones normales en comparación con la rHuEpo a concentraciones inferiores (figura 6) . La potencia de N47 se demuestra que es alrededor de 3 a 4 veces superior que la rHuEpo cuando se administra tres veces por semana (figuras 6 y 7) . Cuando se dan una vez por semana dosis similares, la rHuEpo muestra poca estimulación del hematocrito en ratones normales mientras que el N47 da un incremento marcado (figura 8) . La potencia de N47 es de alrededor de 14 veces superior a rHuEpo para una dosificación de una vez por semana (figura 7) . Significativamente, la respuesta del hematocrito para el análogo N47 dado una vez por semana, es comparable con aquel de rHuEpo dado tres veces por semana . Aun cuando se administra una vez cada dos semanas, el N47 produce todavía incrementos importantes en el hematocrito de ratones normales (figura 9) . Al tomarse en conjunto, los datos indican que los análogos hiperglicosilados de Epo y el análogo N47 en particular, se pueden usar ventajosamente para elevar el hematocrito usando una dosificación menos frecuente que para el tratamiento actual con rHuEpo. También se ha demostrado que los resultados antes descritos obtenidos en ratones, se pueden extrapolar a humanos. Los parámetros farmacocinéticos para la administración de rHuEpo y el análogo N47 a 11 pacientes con diálisis peritoneal continua ambulatoria (CAPD) demuestran que el análogo N47 tiene una vida media en el suero más prolongada por tres veces que la rHuEpo (ejemplo 6 y tabla 5) . Estos resultados sugieren que los análogos hiperglicosilados de Epo permiten una dosificación menos frecuente que la rHuEpo en humanos . Como se usa en la presente, el término "análogo Epo hiperglicosilado" se refiere a la Epo que comprende al menos un sitio adicional de glicosilación con una cadena adicional de carbohidratos agregada al sitio. Los sitios de glicosilación pueden ser cadenas de carbohidratos ligadas en N o ligadas en O. Los nuevos sitios de glicosilación ligados en N, se introducen por alteraciones en la secuencia de ADN para codificar el sitio de consenso para la adición de carbohidratos ligadas en N (los aminoácidos Asn-X-Ser/Thr) en la cadena de polipéptidos, mientras que se introducen nuevos sitios ligados en O por alteraciones en la secuencia de ADN para codificar una serina o un residuo de treonina. Los análogos se construyen por técnicas de mutagénesis al introducir adiciones, eliminaciones, o substituciones de residuos de aminoácidos que incrementan o alteran los sitios en el polipéptido Epo que están disponibles para la glicosilación. El ADN que codifica un análogo Epo hiperglicosilado, se transfecta en una célula hospedadora eucariótica y la glicoproteína expresada se analiza para la presencia de una cadena adicional de carbohidrato.

Los análogos hiperglicosilados de Epo han demostrado una actividad in vitro que es comparable con o aun menor que aquella determinada para rHuEpo, sugiriendo que el enlace al receptor Epo no se aumenta, y puede en algunos casos disminuirse, por la adición de cadenas de carbohidratos. Sin embargo, la hiperglicosilación puede incrementar típicamente la vida media del suero y conducir potencialmente a una actividad biológica in vivo incrementada. Un análogo Epo que tiene una cadena de carbohidratos adicional ligada en N en la posición 88, muestra una afinidad disminuida para el receptor en comparación con rHuEpo (isoformas 9-14) o con una isoforma purificada de rHuEpo que tiene 14 ácidos siálicos por molécula, demostrando todavía una vida media en circulación más prolongada y una actividad in vivo incrementada en comparación con una mezcla de isoformas 9-14 de Epo o la isoforma aislada Epo 14. Los análogos hiperglicosilados de Epo que se pueden administrar de conformidad con la presente invención, tendrán al menos una cadena de carbohidratos adicional ligada en N o ligada en O. En una modalidad, los análogos tendrán dos cadenas de carbohidratos adicionales ligadas en N. En otras modalidades, los análogos tendrán tres, cuatro ó más cadenas adicionales de carbohidratos ligadas en N. Como ejemplos, los análogos de la invención tendrán al menos una cadena adicional ligada en N en uno o más residuos de aminoácidos , 51, 57, 69, 88, 89, 136 y 138 de la secuencia de la Epo humana. En una modalidad, el análogo tiene cadenas adicionales de carbohidratos ligadas en N en los residuos 30 y 88 de la Epo humana. La numeración de los residuos de aminoácidos de la Epo humana es como se muestra en la figura 1 y en SEQ ID NO: 1. La figura 1 muestra un polipéptido Epo maduro predicho de 166 aminoácidos, mientras que la Epo producida recombinante tiene 165 aminoácidos después de la eliminación del residuo de arginina en la terminal C. Se entiende que rHuEpo y los análogos Epo hiperglicosilados pueden tener 165 ó 166 aminoácidos. Los análogos de la invención tendrán al menos cuatro cadenas de carbohidratos ligadas en N. De las cuatro cadenas, tres puede estar en sitios que se presentan naturalmente en las posiciones 24, 38 y 83. Sin embargo, se contempla que algunos análogos de la invención puedan tener alteraciones de uno o más de los sitios de glicosilación que se presentan naturalmente, tal que se elimine y substituya uno o más de los sitios, o un nuevo sitio. Tales análogos también se suministran por la invención. Por ejemplo, algunos de los sitios en las posiciones 24, 38 y 83 se pueden eliminar y substituir con un sitio en la posición 88. Opcionalmente los análogos pueden tener un sitio ligado en O en la posición 126. La invención también suministra nuevos análogos Epo hiperglicosilados que tienen al menos una cadena de carbohidratos adicional . Se ha encontrado que una cadena de carbohidratos ligada en N adicional, se agrega en cualesquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114, que se han modificado para ser un sitio de glicosilación. Las modalidades específicas incluyen los análogos N49 a N61 como se describe en la tabla 1. Los nuevos análogos tendrán al menos un nuevo sitio de glicosilación ligado en N en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114 y pueden comprender además cadenas de carbohidratos adicionales ligadas en O ó ligadas en N en otro sitio. Los análogos pueden tener una, dos, tres o cuatro cadenas adicionales de carbohidratos, o más de cuatro cadenas adicionales. En una modalidad preferida, los análogos tendrán tres cadenas adicionales de carbohidratos ligadas en N (seis cadenas ligadas en n en total) . En otra modalidad preferida, los análogos tendrán cuatro cadenas adicionales ligadas en N (siete cadenas ligadas en N en total) . Los análogos que tienen tres, cuatro o más de cuatro, cadenas de carbohidratos adicionales ligadas en N pueden tener pero no se limitan a una cadena adicional en cualesquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86, y 114. Sorprendentemente, se ha encontrado que un análogo hiperglicosilado con tres cadenas adicionales ligadas en N en las posiciones 30, 53 y 88 (seis cadenas ligadas en N en total) tiene una actividad in vivo superior que el análogo N47 con dos cadenas adicionales (cinco en total) . Los resultados se muestran en la figura 3. Es claro que la actividad in vivo de los análogos, depende directamente del número de cadenas de carbohidratos ligadas en N. Estos resultados se pueden extrapolar al parámetro terapéutico en donde los análogos que tienen más cadenas de carbohidratos ligadas en N que N47 se pueden dosificar aun menos frecuentemente . Además, la invención proporciona análogos hiperglicosilados de Epo con tres cadenas adicionales ligadas en N en las posiciones 30, 55 y 88; 30, 55 y 114; y 30, 88 y 114. También se proporcionan los análogos Epo con 4 cadenas adicionales ligadas en N o tres cadenas adicionales ligadas en N y una cadena adicional ligada en O en la posición 125. Los análogos se pueden preparar por una diversidad de técnicas de mutagénesis disponibles para alguien con experiencia en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis PCR y mutagénesis de cásete (Zoller et . al. Meth. Enz. 100, 468-500 (1983); Higuchi, in PCR Protocols pp. 177-183 (Academic Press, 1990); Wells et . al. Gene 34, 315-323 (1985)). El ejemplo 1 describe el uso de las técnicas de mutagénesis por PCR para construir nuevos análogos hiperglicosilados de Epo. Una secuencia de ADN de Epo que se ha sometido a la mutagénesis se inserta dentro de un vector de expresión usando técnicas estándar siendo el vector adecuado para el mantenimiento en una célula huésped de mamífero. El vector contendrá típicamente los siguientes elementos: promotor y/u otros elementos regulatorios "en la dirección ascendente" , origen de replicación, sitios de enlace de ribosomas, sitio de terminación de la transcripción, sitio de polienlace, y marcador seleccionable, que sea compatible con el uso v de una célula hospedadora mamífera. Los vectores también pueden contener elementos que permitan la propagación y mantenimiento también en células hospedadoras procarióticas.

Las células adecuadas o líneas celulares incluyen cualquier forma de fuentes mamíferas incluyendo fuentes humanas. Ejemplos incluyen COS-7 (número de acceso ATCC CRL 1651) , 293 humanas, células de riñon de hámster de bebé (BHK; número de acceso ATCC CCL 10) , células de ovario de hámster chino (incluyendo células deficientes en la dihidrofolato reductasa (DHFR), Urlab et. al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)). Otras líneas celulares mamíferas adecuadas incluyen pero no se limitan a HeLa, L-929 de ratón, y 3T3. En una modalidad preferida, se usan las células CHO deficientes en DHFR. Los vectores que comprenden secuencias que codifican a los análogos de hiperglicosilación de Epo, se introducen en células hospedadoras por técnicas de transformación o transfección estándar. El cultivo, amplificación y separación por exclusión de células hospedadoras y transformadas o transfectadas se lleva a cabo usando métodos públicamente disponibles (Gething et . al. Nature 293, 620-625 (1981); Kaufman et . al. Mol Cell. Biol. 5, 1750-1759 (1985); patente E.U.A. No. 4,419,446). Las células hospedadoras que alojan secuencias de ADN que codifican análogos hiperglicosilados de Epo, se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión de los análogos . Los análogos se recuperan de los medios de células y se purifican usando procedimientos esencialmente como se describen previamente (WO94/09257) y aquellos en el ejemplo 2. Los procedimientos de purificación permiten el aislamiento de un ácido siálico superior que contiene isoformas Epo que resultan de agregar cadenas de carbohidratos adicionales. Los análogos hiperglicosilados de Epo pueden incluir además de los nuevos sitios de glicosilación, adiciones, eliminaciones o substituciones de residuos de aminoácidos, que no crean nuevos sitios de glicosilación y no alteran substancialmente la actividad biológica del análogo hiperglicosilado. Aquellos sitios o regiones individuales de la Epo que se pueden alterar sin afectar la actividad biológica, se pueden determinar por el examen de la estructura del complejo receptor Epo-Epo como se describe en Syed et . al. Nature 395, 511 (1998). El examen de la estructura del complejo receptor Epo-Epo revela aquellos residuos que interactúan con o están en cercana proximidad al sitio de enlace del receptor de Epo, y que se deben evitar cuando se hacen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de Epo. Alternativamente, se pueden determinar empíricamente aquellas regiones que tolerarían substituciones de aminoácidos por la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham et . al. Science 244, 1081-1085 (1989). En este método, los residuos selectos de aminoácidos se substituyen individualmente con un aminoácido neutral (por ejemplo, alanina) con objeto de determinar los efectos en la actividad biológica) . Se reconoce generalmente que los cambios conservadores de aminoácidos es menos probable que afecten la estructura y/o función de un polipéptido. De esta manera, la invención abarca uno o más cambios conservadores de aminoácidos dentro de un análogo hiperglicosilado de Epo. Los cambios conservadores de aminoácidos involucran generalmente la substitución de un aminoácido con otro que es similar en estructura y/o función (por ejemplo, aminoácidos con cadenas laterales similares en tamaño, carga y forma) . La naturaleza de estos cambios es bien conocida por aquellos expertos en la técnica y se resume en la tabla 1 a continuación. Tales substituciones conservadoras se muestran bajo el encabezado de "substituciones preferidas" . También se contemplan cambios más substanciales ("substituciones ejemplares") que se pueden introducir. Un técnico experto apreciará que inicialmente se deben modificar los sitios por substitución en una forma relativamente conservadora. Si tales substituciones resultan en una retención de una actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más substanciales (substituciones ejemplares) y/o se pueden hacer otras adiciones/eliminaciones y separarse los productos resultantes. Tabla 1: Substituciones de Aminoácidos Residuo Substituciones Substituciones ejemplares original preferidas Ala (A) Val Val; Leu; lie Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln Gln; His; Lys; Arg Asp (D) Glu Glu Cys (R) Ser Ser Gln (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro Pro His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg He (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu (L) He Norleucina; lie; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; He Phe (F) Leu Leu; Val; lie; Ala Pro (P) Gly Gly Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr Typ (Y) Phe Trp; Phe; Th ; Ser Val (V) Leu He; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina También se suministran por la invención eliminaciones o adiciones de aminoácidos de un análogo de Epo hiperglicosilado que no afecta substancialmente la actividad biológica. Tales adiciones y eliminaciones pueden ser en la terminal N o en la terminal C del polipéptido, o pueden ser internas en él. En general, las eliminaciones o adiciones relativamente pequeñas son menos probable que afecten la estructura y/o función de la Epo o de un análogo hiperglicosilado. En una modalidad, las eliminaciones o adiciones pueden ser desde 5-10 residuos, alternativamente desde 2-5 residuos de aminoácidos o desde 1-2 residuos.

La invención proporciona proteínas de fusión que comprenden análogos hiperglicosilados de Epo y composiciones de los mismos. En un aspecto, la invención proporciona proteínas de fusión de análogos hiperglicosilados de Epo y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones se pueden hacer en la terminación amino del análogo hiperglicosilado de Epo, esto es, la terminación carboxi de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se fusiona a la terminación amino de un análogo hiperglicosilado de Epo, esto es, la terminación carboxi de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se fusiona a la terminación amino de un análogo hiperglicosilado de Epo. Alternativamente, puede ser deseable fusionar la terminación carboxi de un análogo hiperglicosilado de Epo con la terminación amino de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto de la invención, la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una región Fc. Los análogos hiperglicosilados de Epo, cuando forman parte de un polipéptido de fusión, pueden ser de 165 ó 166 aminoácidos de longitud, o pueden tener más o menos residuos si se agregan o eliminan los aminoácidos. En una modalidad, se fusionan el análogo N47 en su terminación C a la terminación N de una región Fc derivada del IgG?l humano, (ver ejemplo 2) . En el ejemplo actual, el análogo N47 incluye el residuo de arginina en la posición 166. Sin embargo, se contempla que el análogo N47 así como otros análogos hiperglicosilados de los residuos 1-165 (que carecen del residuo de arginina en la terminal C) también pueden comprender los polipéptidos de fusión de la invención. El término "Fc" se refiere a una molécula o secuencia que comprende la secuencia de una porción de enlace que no es de antígeno del anticuerpo, ya sea en forma monomérica o multimérica. La fuente original de inmunoglobulina de un Fc es preferiblemente de origen humano y puede ser de cualquier isotipo por ejemplo, IgG, IgA, IgM, IgE o IgD. Un método de preparación de un molécula aislada Fc involucra la digestión de un anticuerpo con papaína para separar las porciones de enlace de antígeno y que no son de antígeno del anticuerpo. Otro método de preparación de unas moléculas aisladas de Fc, es la producción por expresión de ADN recombinante seguida por la purificación de moléculas Fc así expresadas. Un Fc de longitud completa consiste de las siguientes regiones Ig de cadena pesada: CH1, CH2 Y CH3 en donde las regiones CH1 y CH2 se conectan típicamente por una región de articulación flexible. En una modalidad, un Fc tiene la secuencia de aminoácidos IgGl tal como aquella que se muestra en la figura 10. Los términos "Proteína Fc", "Secuencia Fc" , "Molécula Fc" , "Región Fc" , y "Porción Fc" se toman para tener el mismo significado que "Fc" . El término "Fragmento Fc" cuando se usa con asociación con la molécula Fc o los polipéptidos de fusión de la misma, se refiere a un péptido o polipéptido que comprende menos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de una molécula Fc. Tal fragmento puede aparecer por ejemplo, de un truncamiento en la terminación amino, un truncamiento en la terminación carboxi, y/o una eliminación interna de un residuo de la secuencia de aminoácidos. Los fragmentos Fc pueden resultar del empalme alterno del ARN o de una actividad in vivo de la proteasa. El término "Variante Fc" cuando se usa en asociación con una molécula Fc, o con polipéptidos de fusión de la misma, se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene una o más substituciones, eliminaciones y/o adiciones en la secuencia de aminoácidos, en comparación con las secuencias naturales de aminoácidos Fc. Las variantes se pueden presentar naturalmente o construirse artificialmente. Las variantes de la invención se pueden preparar a partir de las moléculas correspondientes de ácido nucleico que codifican las variantes, que tienen una secuencia de ADN que varía de esta forma con las secuencias de ADN para una molécula de origen de Fc . El término "Derivado" cuando se usa en asociación con una molécula Fc, o con polipéptidos de fusión de la misma, se refiere a variantes Fc o fragmentos de la misma, que se han modificado químicamente como por ejemplo, por la colocación covalente de uno o más polímeros incluyendo pero no limitando a polímeros solubles en agua, carbohidratos ligados en N o ligados en O, azúcares, fosfatos, y/u otras de tales moléculas. Los derivados se modifican de una forma que es diferente del Fc de origen, ya sea en el tipo o ubicación de las moléculas colocadas en el polipéptido. Los derivados incluyen además la eliminación de uno o más grupos químicos colocados naturalmente a una molécula Fc. El término "Fusión" se refiere a la unión de segmentos diferentes de péptidos o proteínas por métodos químicos o genéticos, en donde los extremos unidos de los segmentos de péptido o de proteína, pueden estar directamente adyacentes uno con el otro, o se pueden separar por porciones de enlazador o espaciador tales como residuos de aminoácidos u otros grupos de enlace. Un Fc, o una variante, fragmento o derivado del mismo puede ser de una clase Ig. En una modalidad, un Fc es de la clase IgG tal como IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4. En una modalidad, un Fc es de IgGl . Un Fc puede también comprender residuos de aminoácidos representados por una combinación de cualquiera de dos o más de las clases Ig tales como residuos de IgGl y IgG2, o de IgGl, IgG2 y IgG3 , y así sucesivamente. En una modalidad, una región Fc de un análogo hiperglicosilado Epo de proteína de fusión, tiene la secuencia como se establece en la figura 10 (SEQ ID NO: 25) (ver Ellison et . al., Nucleic Acids Res. 10, 4071-4079 (1982)) comenzando en el residuo 6 (esto es, se eliminan los residuos 1-5) . Además de las variaciones que se presentan naturalmente en las regiones Fc, variantes Fc, los fragmentos y derivados pueden contener cambios que no se presentan naturalmente en Fc que se construyen mediante por ejemplo, la introducción de substituciones, adiciones, inserciones, o eliminaciones de residuos o secuencias en un Fc que se presenta naturalmente o de origen, o al modificar la porción Fc por una modificación química y similares. En general, las variantes, fragmentos y derivados Fc se preparan de manera tal que se conserva ampliamente la vida media en circulación creciente de las fusiones Fc para los análogos de glicosilación Epo. También se suministran por la invención variantes Fc con substituciones conservadoras de aminoácidos. Los ejemplos de las substituciones conservadoras de aminoácidos se establecen en la presente, y también se ejemplifican por la substitución de residuos de aminoácidos que no se presentan naturalmente, que se incorporan típicamente por una síntesis química de péptidos, más que por la síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos, y otras formas reversas o invertidas de porciones de aminoácidos. Las modificaciones conservadoras para la secuencia de aminoácido de una región Fc (y las modificaciones correspondientes a los nucleótidos de codificación) se espera que produzcan moléculas Fc (y proteínas de fusión que comprenden análogos hiperglicosilados de Epo y regiones Fc) que tienen características funcionales y químicas similares con aquellas de las moléculas Fc no modificadas, y proteínas de fusión que comprenden regiones Fc no modificadas. Además de las substituciones establecidas en la tabla 1, cualquier residuo de origen en una molécula Fc (o en una región Fc de una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado de Epo) también se puede substituir con alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis de barrido de alanina" (Cunningham et . al. Science 244, 1081-1085 (1989) ) . Las modificaciones substanciales en las características funcionales y/o químicas de una molécula Fc (y en una región Fc de una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado de Epo) se pueden alcanzar por substituciones selectas que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) La estructura de la columna molecular en el área de substitución, por ejemplo, como una lámina o con formación en el hélice, (b) la carga o capacidad hidrofóbica de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral . Los residuos que se presentan naturalmente se pueden dividir en grupos con base en sus propiedades comunes de cadena lateral : 1) hidrofóbico: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He; 2) hidrofílico neutral: Cys, Ser, Thr; 3) ácido: Asp, Glu; 4) básico: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5) Residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena: Gly, Pro, y 6) Aromático; Trp, Tyr, Phe. Las substituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales residuos substituidos se pueden introducir en regiones de una molécula Fc que son homólogos con una molécula no humana Fc, o dentro de regiones no homologas de la molécula. Los residuos de cisteína en las moléculas Fc se pueden eliminar o reemplazar con otros aminoácidos para evitar la formación de reticulaciones disulfuro. En particular, se puede substituir un residuo de cisteína en la posición 5 de la figura 10 (SEQ ID NO:_) con uno o más aminoácidos tales como alanina o serina. Alternativamente, el residuo de cisteína en la posición 5 se puede eliminar. Se puede preparar un fragmento Fc por la eliminación de 1 o más aminoácidos en cualquiera de las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5 como se muestra en la figura 10 (SEQ ID NO: 25) . En una modalidad, los residuos de aminoácido en las posiciones 1-5 inclusive se eliminan. También se pueden hacer substituciones en estas posiciones y están dentro del alcance de esta invención. Se pueden también hacer la variantes Fc que muestran un enlace reducido a los receptores Fc que activan las funciones del efector tal como la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la activación del complemento (ver por ejemplo, Molec. Immunol . 29, 633-639, (1992)). Tales variantes pueden incluir la leucina en la posición 20 eliminada o substituida con un residuo de glutamina, glutamato en la posición 103 eliminado o substituido con un residuo de alanina, y lisinas en las posiciones 105 y 107, eliminadas o substituidas con residuos de alanina (después de la numeración como se establece en la figura 1) . Se contemplan una o más de tales substituciones. En una modalidad, las variantes Fc mostrarán un enlace más fuerte al receptor FcRn ("Receptor de rescate") y una vida media en circulación más prolongada en comparación con el Fc de origen tal como el que se muestra en la figura 1. Los ejemplos de tales variantes incluyen substituciones del aminoácido en uno o más de los residuos 33, 35-42, 59, 72, 75, 77, 95-98, 101, 172-174, 215 y 220-223, en donde las substituciones otorgan un enlace más fuerte de una variante Fc a un receptor FcRn. En otra modalidad, las variantes Fc tienen uno o más sitios de glicosilación eliminados. Los sitios de glicosilacion ligados en N se pueden eliminar por la eliminación o substitución de residuos de asparagina que tienen cadenas de carbohidrato colocadas. Otras variantes Fc incluyen uno o más residuos de tirosina reemplazados con por ejemplo, residuos de fenilalanina. Además, también se contemplan otras inserciones de variantes de aminoácidos, eliminaciones y/o substituciones y están dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos incluyen variantes Fc descritas en W096/32478 y WO97/34630 que se incorporan por lo cual como referencia. Adicionalmente, las alteraciones pueden estar en forma de aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos. La proteína Fc también se puede ligar a los análogos de glicosilación de Epo por porciones de "Enlace" que comprenden grupos químicos o aminoácidos de longitudes variables. Tales ligaduras químicas son bien conocidas en la técnica. Las secuencias de ligadura de aminoácidos pueden incluir pero no se limitan a: (a) ala-ala-ala; (b) ala-ala-ala-ala; (SEQ ID NO: 6) (c) ala-ala-ala-ala-ala; (SEQ ID NO: 7) (d) gly-gly; (e) gly-gly-gly; (f) gly-gly-gly-gly-gly; (SEQ ID NO: 8) (g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly (SEQ ID NO: 9) (h) gly-pro-gly; (i) gly-gly-pro-gly-gly; (SEQ ID NO: 10) y (j) cualquier combinación de sus partes (a) a la (i). Aunque se prefieren moléculas Fc como componentes de las proteínas de fusión con análogos de glicosilación de Epo, también se contempla que se puedan usar otras secuencias de aminoácidos que se enlazan a un receptor FcRn, y que proporcionan una vida media in vivo aumentada. Ejemplos de tales moléculas alternativas se describen en la patente de E.U.A. No. 5,739,277, concedida el 14 de abril, 1998 a Presta et. al. El término "cantidad molar" se refiere a una cantidad de un análogo hiperglicosilado o rHuEpo que se basa en el peso molecular del polipéptido correspondiente de eritropoyetina sin glicosilación. Las cantidades equivalentes de rHuEpo y del análogo, se refieren a cantidades que son iguales cuando se toman en cuenta variaciones normales en el procedimiento usadas para determinar tales cantidades. Es necesario determinar cantidades equivalentes de esta forma, ya que el peso molecular de rHuEpo y los análogos variará dependiendo del número de cadenas de carbohidratos. Para rHuEpo, el peso molecular del polipéptido de eritropoyetina se calcula con base en residuos del aminoácido 1-165 como se muestra en la figura 1 y SEQ ID NO: 1. Para los análogos hiperglicosilados, se ajustan los pesos moleculares dependiendo de los cambios de aminoácidos en los residuos 1-165 de la figura 1 y SEQ ID NO: 1. La frecuencia de dosificación para un análogo hiperglicosilado, variará dependiendo de la condición a tratarse y del hematocrito objetivo, pero en general será menor a tres veces por semana, la frecuencia de dosificación será alrededor de dos veces por semana, alrededor de una vez por semana. La frecuencia de dosificación también puede ser menos de alrededor de una vez por semana, por ejemplo, alrededor de una vez cada dos semanas (alrededor de una vez cada 14 días), una vez por mes o una vez cada dos meses. Se entiende que las frecuencias de dosificación actualmente utilizadas, pueden variar de alguna manera de las frecuencias descritas en la presente debido a variaciones en las respuestas por diferentes individuos a los análogos Epo; el término "alrededor" se pretende que refleje tales variaciones . Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un análogo hiperglicosilado (o una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado de Epo y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina) que proporciona un incremento en el hematocrito para un hematocrito objetivo, o para un rango de hematocrito objetivo que proporciona un beneficio al paciente, o alternativamente, mantiene a un paciente en un hematocrito objetivo, o dentro de un rango de hematocrito objetivo. La cantidad variará de un individuo al otro y dependerá de un número de factores, incluyendo la condición física global del paciente, la severidad y la causa subyacente de la anemia y el hematocrito objetivo final para el paciente individual. Un hematocrito objetivo es típicamente al menos alrededor de 30%, o en el rango de 30%-38%, preferiblemente arriba de 38% y más preferiblemente 40%-45%. Los lineamientos generales con relación a los rangos de hematocrito objetivo para rHuEpo también se encuentran en el inserto de empaque EPOGEN® con fecha de 12/23/96 y es 30%-36%, o alternativamente 32%-38% como se establece en la presente. Se entiende que tales objetivos variarán de un individuo al otro, de manera que puede ser adecuada la discreción del médico al determinar un hematocrito objetivo actual para algún paciente determinado.

Sin embargo, la determinación del hematocrito objetivo se encuentra bien dentro del nivel de experiencia en la técnica.

Se puede determinar. fácilmente una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones actuales por alguien experto en la técnica. El ejemplo 6 establece un protocolo clínico que tiene como un objetivo determinar una cantidad terapéuticamente efectiva del análogo N47 en una dosificación de una vez por semana y de tres veces por semana. Un rango de dosis para una administración de una vez por semana es desde alrededor de 0.075 hasta alrededor de 4.5 µg de péptido de eritropoyetina por kg por dosis. Un rango de dosis para la administración de tres veces por semana es de 0.025 hasta alrededor de 1.5 µg de péptido de eritropoyetina por kg por dosis. Este rango de dosis puede emplearse con otros análogos hiperglicosilados de Epo, con algunos ajustes en el rango de dosis siendo de rutina para alguien experto en la técnica. Una ventaja importante para la presente invención, es la capacidad correlacionar el grado de hiperglicosilación con una cantidad de dosis o con un intervalo de dosis que permitiría que alguien "haga a la medida" un análogo Epo para una dosis dada o programa de dosis. Con base en el incremento de las actividades in vivo de los análogos Epo que tienen 1, 2 ó 3 cadenas adicionales de carbohidratos como se muestran en la figura 3, el médico tratante puede seleccionar un análogo que sea adecuado y conveniente para la condición anémica a tratarse. Por ejemplo, en pacientes que son agudamente anémicos y que necesitan una dosis efectiva grande, o en pacientes que requieren un tratamiento de larga duración, se puede preferir la administración de un análogo hiperglicosilado con tres o cuatro o aun más cadenas adicionales de carbohidratos. Para otros pacientes que experimentan una anemia menos severa o que requieren de tratamiento por un tiempo relativamente corto, se puede preferir un análogo con una o dos cadenas de carbohidratos adicionales. Los análogos de la presente invención le suministran al médico una flexibilidad considerable para prevenir y tratar la anemia que puede resultar de una amplia variedad de condiciones subyacentes . La invención también suministra la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de hierro, con objeto de mantener una eritropoyesis creciente durante la terapia. La cantidad a darse puede determinarse fácilmente por alguien experto en la técnica con base en la terapia rHuEpo. La presente invención puede usarse para estimular la producción de células de glóbulos rojos y para prevenir y tratar la anemia. Entre las condiciones que se pueden tratar por la presente invención, se incluye la anemia asociada con una disminución o pérdida de la función del riñon (insuficiencia renal crónica) , anemia asociada con terapia mielosupresora, tal como quimioterapia o fármacos anti-virales (tales como AZT) , anemia asociada con el avance de tipos de cáncer no mieloide, anemia asociada con infecciones virales (tales como VIH) , y anemia de enfermedad crónica. También se pueden tratar condiciones que pueden llevar a la anemia en un individuo de otra manera saludable, tal como una pérdida anticipada de sangre durante la cirugía. En general, cualquier condición tratable con rHuEpo también puede tratarse con los análogos hiperglicosilados de Epo de la invención. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo hiperglicosilado Epo, junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsificante, conservador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado Epo y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsificante, conservador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición será apropiada para un régimen de dosis de menos de tres veces por semana. La composición puede estar en una forma líquida o liofilizada y comprende un diluyente (amortiguadores Tris, citrato, acetato o fosfato) que tiene diferentes valor de pH y resistencia iónica, solubilizantes tales como Tween o polisorbato, portadores tales como albúmina de suero humano o gelatina, conservadores tales como timerosal, parabenos, cloruro de bencilalconio o alcohol bencílico, antioxidantes tales como ácido ascórbico o metabisulfito de sodio, y otros componentes tales como lisina o glicina. La selección de una composición particular dependerá de un número de factores, que incluyen la condición a tratarse, la vía de administración y los parámetros farmacocinéticos deseados.

Una investigación más amplia de los componentes apropiados para composiciones farmacéuticas se encuentra en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. A.R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980) . En una modalidad preferida, los análogos de glicosilación de la Epo de la invención, se formulan en forma líquida en una solución amortiguada en cloruro de sodio/citrato de sodio isotónica, que contiene albúmina humana, y contiene opcionalmente alcohol bencílico como conservador. Las composiciones preferiblemente contienen análogos que tienen una, dos, tres, cuatro o más cadenas de carbohidrato adicionales. Las composiciones de la invención se administran preferiblemente por inyección, ya sea subcutánea o intravenosa. La vía de administración eventualmente elegida dependerá de un número de factores y puede determinarse por alguien experto en la técnica. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no se construyen como limitantes del alcance de la misma. EJEMPLO 1 Construcción de Análogos de Epo Hiperglicosilados . Construcción de ADNc que codifican los Análogos de Epo Hiperglicosilados . Los análogos Epo se hacen por mutagénesis in vitro con el uso de varios métodos diferentes. Los análogos N49 y N50 se construyen como se describe en la WO94/09257. Los análogos también se construyen por variaciones de métodos PCR de traslape (reacción en cadena de polimerasa) . El procedimiento básico incluye dos etapas sucesivas. En la primer etapa, se realizan dos reacciones (PCR1 y PCR2) en la Epo o en el ADN de plantilla de análogo de la Epo con el uso de un total de cuatro oligonucleótidos: un cebador 5' (delantero), un cebador mutagénico inverso, un cebador mutagénico delantero (usualmente complementario al cebador mutagénico inverso) y un cebador 3' (inverso). Los cebadores mutagénicos contienen los cambios de nucleótido deseados así como 6-14 nucleótidos de correspondencia en cada lado de estos cambios. El PCR1 usa el cebador 5' (delantero) y el cebador mutagénico inverso. El PCR2 usa el cebador 3' (inverso) y el cebador mutagénico delantero. Los fragmentos de ADN amplificados se separan por electroforesis en gel de agarosa. Piezas pequeñas de agarosa que contienen fragmentos de ADN del tamaño correcto se extirpan del gel. Los fragmentos de ADN de PCR1 y PCR2 se combinan juntos y se realiza una tercera reacción PCR usando solamente los cebadores 5' delantero y 3' inverso. De esta manera, se amplifica un segmento de ADN de longitud completa que contiene las mutaciones deseadas. En varios casos, se combinan dos o tres mutaciones por la introducción de una nueva substitución en el ADN que ya que contiene un cambio, con el uso del mismo procedimiento PCR. Para construir estos análogos de sitio de glicosilación múltiple, se usan análogos de sitio sencillos, dobles o triples (producidos como se describe arriba) como plantilla PCR, y se introduce un sitio de glicosilación adicional por mutagénesis dirigida al sitio con los cebadores apropiados . Los análogos de la Epo N51, N52 y N53 se construyen por el método 1 de traslape de PCR (reacción en cadena de polimerasa) . Se introduce un sitio adicional de N-glicosilación en cada caso. El N56 agrega un sitio de glicosilación (N114 T116) a la secuencia de origen HuEpo por el uso de pDSRa2 Epo como una plantilla PCR, N51 agrega un sitio de glicosilación enlazado a O (Thrl25) para N47 de la Epo por el uso de una plantilla pDSRa2 Epo N47 (Asn30, Thr32, Vall87, Asn88, Thr90) , y el N59 análogo agrega un sitio de glicosilación (Asn53) al N47 análogo con el uso de una plantilla pDSRa2 EpoN47. Las reacciones en cadena de polimerasa para el método 1 se realizan con el uso de un protocolo adaptado de Cheng y colaboradores, (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 5695 (1994)). El cebador 3' (inverso) contiene secuencias que introducen un codón de detención seguido por un sitio de restricción Xba I: ATCTAGAAGTTGCTCTCTGGACAGTTCCT (SEQ ID NO : 2) . El cebador de reacción delantero 5' : GAAGCTTGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATG (SEQ ID NO: 3) tiene un sitio de restricción Hind III seguido por una secuencia Kozak en dirección 5' del codón iniciador Epo (ATG). La mezcla de reacción típica PCR contiene: 4 µl de cada uno de los cebadores delantero e inverso (5 pmol/µl) , lµl de plantilla (25 ng) , lOµl de solución amortiguadora 5X LP (tricina 100 mM, pH 8.7/glicerol al 25%/KOAc 425 mM) , lOµl de solución madre dNTP (lmM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0.8µl de polimerasa rtTh (Perkin Elmer; 2.5 U/µl), y 2µl de polimerasa Vent (NEB; 0.01 U/µl después 1:100 de dilución fresca en solución amortiguadora IX LP) . Se agregó H20 para llevar al volumen final hasta 50 µl . Todos los componentes se agregan juntos en el orden mostrado y el PCR se inició cuando la temperatura durante el primer ciclo estuvo arriba de 60°C al agregar 1 µl de MgOAc 50mM. Las condiciones de reacción típicas fueron: 2 ciclos de 94°C, 10 segundos/50°C, 1 minuto/68°C, 5 minutos seguido por 25 ciclos de 94°C, 10 segundos/55°C, 1 minuto/68°C, 5 minutos. Los fragmentos amplificados se separaron por electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de ADN de tamaño correcto se purificó con el uso de un kit Geneclean® y procedimientos suministrados por el fabricante (Bio 101, Inc.). El ADN purificado se digirió con Hind III y Xba I, después se purificó nuevamente con el uso del kit Geneclean®. El fragmento se ligó después en Hind III y el Xba I se cortó con el vector pDSRa2. El ADN ligado se precipitó con 2 volúmenes de etanol en NaOAc 0.3M pH 5.2 en presencia de ARNt portador y se transformó en E. coli. Los análogos Epo se separaron por exclusión por digestión de restricción en mini ADN preparativo. Los plásmidos de los clones positivos se prepararon después y el inserto se procesó por secuencia para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas y para asegurar que no se introducen cambios adicionales de aminoácido. Los N54 hasta N61 análogos se . construyen con el uso del método 2 de estrategia PCR de traslape. El cebador 3' (inverso) contiene secuencias que introducen un codón de detención seguido por un sitio de restricción Xbal : GATCCTCTAGAGTTGCTCTCTGGACAG (SEQ ID NO: 4) . El cebador de reacción delantero 5' : CAACAAGCTTGCGCCGCCATGGGGG (SEQ ID NO: 5) tiene un sitio de restricción HindIII seguido por una secuencia Kozak en dirección 5' del codón iniciador Epo (ATG) . Se realiza una estrategia PCR de alta fidelidad con el uso de la polimerasa de ADN Perkin Elmer UlTma y reactivos acompañantes; 10 µl de solución amortiguadora 10X PCR, 3µl de dNTP 1 mM, 5 pmol de cada cebador, y agua en un volumen final de 100 µl . Se agregaron 0.5 unidades de polimerasa UlTma después de que la mezcla PCR alcanzó 94°C. Las reacciones PCR se llevan a cabo después por 5 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, y 72°C durante 90 segundos. Se realizan 25 ciclos posteriores a 94°C durante 30 segundos, y 72 °C durante 90 segundos. Las bandas de producto de los tamaños corregidos se extirpan del gel de agarosa después de la electroforesis. Los productos PCR resultantes para cada análogo se limpiaron con el uso del kit de extracción en gel Qiagen. El ADN purificado se digirió en lOOµl de digestión de restricción con enzimas de restricción HindIII y Xbal (Boehringer Mannheim) a 37°C durante 1 hora. Los digeridos se purificaron en gel nuevamente y el fragmento digerido se ligó entonces en el vector pDSa2 digerido en HindIII y Xbal. El ADN ligado se precipitó con 2 volúmenes de etanol en NaOAc 0.3 M pH 5.2 en presencia de ARNt portador y se transformó en E. coli. Los análogos hiperglicosilados de Epo se separaron por exclusión inicialmente por PCR de colonia, para identificar clones que contienen el tamaño correcto y de tipo de ADN insertado. Con este procedimiento, las células que contienen los plásmidos se colocan en tubos PCR en presencia de cebadores delanteros e inversos Epo. La mezcla se somete después a PCR con el uso de las condiciones de reacción descritas arriba. Los plásmidos de clones positivos se preparan después y el análogo Epo insertado se procesa por secuencia para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas y para asegurar que no se introducen cambios de aminoácido adicionales. TABLA 1 ANÁLOGOS DE ERITROPOYETINA QUE TIENEN SITIOS PARA CADENAS DE CARBOHIDRATO ENLAZADAS A N Análogo Substitución de Aminoácido Cambios de Secuencia N49 Lys, Met?Asn52, Thr54 AAG, ATG?AAT, ACC N50 Arg, Glu?Asn53, Thr55 AGG, GAG?AAT, ACG N51 Ala, His, Pro, Trp, Pro, GCT, CAC, CCG, TGG, Ala ?N30, T32, V87, N88, CCC, GCC?AAT, ACG, T90, T125 GTG, AAT, ACC, ACC N52 Ala, Lys, ? Ansll4, Thrll6 GCC, AAG?AAC, ACG N53 Ala, His, Arg, Glu, Pro, GCT, CAC, AGG, GAG, Trp, Pro ? N30, T32, N53, CCG, TGG, CCC?AAT, T55, V87, N88, T90 ACG, AAT, ACG, GTG, AAT, ACC N54 Glu, Gly ? Asn55, Thr57 GAG, GGG?AAT, ACT N55 Gln, Pro, Trp ? Asn86, CAG, CCG, TGG -> ACC, Val87, Thr88 GTG, ACG N56 pro, Trp, Pro ? Ala87, CCG, TGG, CCC ? GCG, Asn88, Thr90 AAT, ACC N57 ro, Trp, Pro ? Val87, CCG, TGG, CCC ? GTG, Asn88, Ser90 AAT, ACG N58 pro, Trp, Glu, Pro ? CCG, TGG, GAG, CCC ? Val87, Asn88, Gly89, Thr90 GTG, AAT, GGG, ACC N59 Ala, His, Arg, Glu ? GCT, CAC, AGG, GAG ? Asn30, Thr32, Asn53, Asn55 AAT, ACG, AAT, ACG N60 Ala, His, Ala, Lys ? GCT, CAC, GCC, AAG? Asn30, Thr32, Asnll4, Thr AAT, ACG, AAC, ACG 116 N61 A, H, R, E, P, W, P, A, K GCT, CAC, ACG, GAG, ? N30, T32, N53, T55, V87, CCG, TGG, CCC, GCC, N88, T90, N114, T115 AAG ? AAT, ACG, AAT, ACG, GTG, AAT, ACC, AAC, ACG Análisis de adición de carbohidratos. Los constructos para los análogos Epo hiperglicosilados que se insertan en el vector de expresión pDSRa2 se transfectan en células COS. Los sobrenadantes de las células COS transfectadas se analizan por manchado Western para determinar si el análogo Epo expresado y secretado contiene carbohidratos adicionales. Se cargaron muestras directamente en los pozos de geles SDS-PAGE y después se analizan por inmunomanchado con el uso del anticuerpo monoclonal, 9G8A (Elliott y colaboradores (1996) Blood 87:p2714). Las movilidades de las muestras análogas se compararon con las muestras que contenían rHuEpo. La Figura 1 muestra una movilidad reducida de los análogos N53 y N61 en comparación con los análogos N4 (cuatro cadenas de carbohidratos) y N47 (cinco cadenas de carbohidratos) . La movilidad es consistente con la presencia de seis cadenas de carbohidratos para el análogo N53 y siete cadenas de carbohidratos para el análogo N61. Los datos para todos los análogos hiperglicosilados se muestran en la Tabla 2. Bioensayos in vitro. Se ensayaron medios acondicionados con células COS o CHO que expresan rHuEpo o análogos, para la estimulación de la absorción de 3H-timidina por células UT7-Epo (Komatsu y colaboradores, Blood 82, 456). Las células UT7-Epo son las responsables de los receptores Epo y Epo humano expresados en la superficie de estas células. Las células UT7-Epo crecen en un medio de crecimiento (medio Dulbecco Modificado Iscove IX con L-glutamina, solución amortiguadora HEPES 25 mM, y 3024 mg/L de bicarbonato de sodio, pero sin alfa-tioglicerol o beta-mercaptoetanol (GIBCO) /Suero de Bovino Fetal al 10% v/v/solución de L-glutamina-penicilina-estreptomicina al 1% v/v (Irvine Scientific)/! Unidad/mL rHuEpo) hasta aproximadamente 3xl05 células/mL. Las células se recolectan por centrifugación (aproximadamente 500xG) se lavan dos veces con solución salina amortiguada en fosfato, y se vuelven a suspender a 5xl04 células/mL en un medio de ensayo (medio lx RPMI 1640 sin L-glutamina (Gibco) /L-glutamina al 1%/suero de bovino fetal al 4%) . Las muestras de prueba o estándar de Epo (rHuEpo) , 100 uL diluido en un medio de ensayo al menos 5 veces, se agregaron a los pozos en una placa microtitulada de 96 pozos. Se agregó después 50µL de células suspendidas (5000 células/pozo) y las placas se incubaron en un incubador humidificado a 37°C y C02 al 5%. Después de 72 horas, se agregó 50 uL de metil-3H-timidina (1 mCi/mL; 20 Ci/ Mol) diluido 1:100 en un medio de ensayo. Las células se incubaron durante 4 horas adicionales a 37°C y C02 al 5%. Las células etiquetadas se cosecharon en filtros de tela de fibra de vidrio, se lavan con agua desionizada seguido por 2 -propanol, se secan y se cuentan. La actividad se determinó al comparar la respuesta determinada por cada análogo al estándar rHuEpo. La actividad biológica específica se determinó después al dividir la actividad in vitro por la concentración de cada análogo como se determina por el inmunoensayo (Elliott y colaboradores (1996) Blood 87:p2714). Los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2 ANÁLOGO Número de Cadenas de Actividad in Carbohidratos enlazadas a N vitro** rHuEpo 3 --------- N49 4 +++ N50 4 +++ N51 5* +++ N52 3 - 4 +++ N53 6 ++ N54 4 NP N55 4 --------- N56 4 +++ N57 3 - 4 --------- N58 4 +++ N59 5 ++ N60 4 - 5 +++ N61 6 - 7 NP * contiene 1-2 cadenas enlazadas a O ** actividad in vitro es relativa a la actividad rHuEpo +++ actividad equivalente a rHuEpo ++ actividad es 25-75% de rHuEpo NP No Probado Los análogos Epo N62-N69 se hacen por métodos de traslape de PCR (reacción en cadena de polimerasa) . El procedimiento básico incluye dos etapas sucesivas. En la primera etapa, se realizan dos reacciones (PCRl y PCR2) en un Epo o un ADN de plantilla análogo Epo con el uso de un total de cuatro oligonucleótidos: un cebador 5' (delantero), un cebador mutagénico inverso, un cebador mutagénico delantero complementario al cebador mutagénico inverso y un cebador 3' (inverso) . Los cebadores mutagénicos contienen los cambios de nucleótido deseados así como 6-14 concentraciones exactas de nucleótidos en cada lado de estos cambios. El PCRl usa el cebador 5' (delantero) y el cebador mutagénico inverso. El PCR2 usa el cebador 3' (inverso) y el cebador mutagénico delantero. Los fragmentos de ADN amplificados se separan por electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos de ADN del tamaño correcto se extirpan y eluyen del gel. Los fragmentos de ADN de PCRl y PCR2 se combinan juntos y se realiza una tercera reacción PCR usando solamente los cebadores delantero 5' e inverso 3'. Para algunos análogos, las tres reacciones PCR se requieren para generar la secuencia deseada. Esto se lleva a cabo como arriba, con un segundo par de cebadores mutagénicos usados para generar el tercer producto. Nuevamente, los fragmentos de ADN amplificados se purifican en gel y se combinan en una reacción final que contiene solo los cebadores 5' delantero y 3' inverso. En cada caso, se amplifica un segmento de ADN de longitud completa que contiene las mutaciones deseadas.

El N62 agrega dos sitios de glicosilación (N30 T32 N55 T57) a la secuencia de origen HuEpo al usar pDSRa2 Epo N4 (N30 T32) como plantilla PCR. El N63 agrega tres sitios de glicosilación (N30 T32 N55 T57 V87 N88 T90) a la secuencia de origen HuEpo al usar pDSRa2 Epo N4 (N30 T32) y pDSRa2 Epo N47 (N30 T32 N55 T57) como plantillas PCR. El N64 agrega tres sitios de glicosilación (N30 T32 N55 T57 N114 T116) a la secuencia de origen HuEpo al usar pDSRa2 Epo N4 (N30 T32) y pDSRa2 Epo N60 como plantillas PCR. El N65 agrega tres sitios de glicosilación (N30 T32 V87 N88 T90 N114 T116) a la secuencia de origen HuEpo al usar pDSRa2 Epo N4 (N30 T32) y pDSRa2 Epo N60 como plantillas PCR. El N66 agrega cuatro sitios de glicosilación (N30 T32 N55 T57 V87 N88 T90 N114 T116) a la secuencia de origen HuEpo al usar pDSRa2 Epo N4 (N30 T32) y pDSRa2 Epo N60 como plantillas PCR. El N67 agrega un sitio de glicosilación enlazado a O (P124 T125 T 126) al N64 Epo. El N68 agrega un sitio de glicosilación enlazado a O (P124 T125 T 126) al N65 Epo. El N69 agrega un sitio de glicosilación enlazado a O (P124 T125 T 126) al N66 Epo. Para cada análogo, los mismos cebadores externos se usaron. El cebador 3' (inverso) contenía secuencias que introducían un codón de detención seguido por un sitio de restricción Sal I : AGGTGGACAGTCGACATTATCTGTCCCCTGTC (SEQ ID NO: 11) .

El cebador de la reacción delantera 5' : AACAAGCTTCTAGACCACCATGGGGGTG (SEQ ID NO: 12) tenía un sitio de restricción Hind III seguido por una secuencia Kozak en la dirección 5' del codón iniciador de la Epo (ATG) . Los cebadores mutagénicos fueron como siguen: N30 T32 cebador mutagénico delantero ACG ACG GGC TGT AAT GAA ACG TGC AGC TTG (SEQ ID NO: 13) N30 T32 cebador mutagénico inverso CAÁ GCT GCA CGT TTC ATT ACÁ GCC CGT CGT G (SEQ ID NO: 14) N55 T57 cebador delantero mutagénico GCC TGG AAG AGG ATG AAT GTC ACGCAG CAG GCC GTA GAA (SEQ ID NO: 15) N55 T57 cebador mutagénico inverso TTC TAC GGC CTG CTG CGT GAC ATTCAT CCT CTT CCA GGC A (SEQ ID NO: 16) V87 N88 T90 cebador mutagénico delantero TCT TCC CAG GTG AAT GAG ACC CTG CAG CTG (SEQ ID NO: 17) V87 N88 T90 cebador mutagénico inverso CAG CTG CAG GGT CTC ATT CAC CTG GGA AGA GTT G (SEQ ID NO: 18) P124 T125 T126 cebador mutagénico delantero CCA GAT CCG ACC ACÁ GCT GCT CCA (SEQ ID NO : 19) P124 T125 T126 cebador mutagénico inverso TGG AGC AGC TGT GGT CGG ATC TGG A (SEQ ID NO: 20) Los cambios N114 T116 se introdujeron usando una plantilla que contenía las mutaciones apropiadas, ?e manera que no se requirieron cebadores mutagénicos para generar este sitio. La mezcla de reacción típica PCRl contenía: 2.5 µl de cada uno de los cebadores inverso mutagénico y delantero (10 pmol/µl) , 1 µl de plantilla (25 ng) , 10 µl de solución amortiguadora 10X Taq Extend (Stratagene) , 2 µl de reserva dNTP (10 mM cada uno de dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0.5 µl de polimerasa Taq (BMB) , y 0.5 µl de Taq Extend (Stratagene). Se agregó agua para llegar a un volumen final hasta 100 µl . Las condiciones típicas de reacción fueron: 1 ciclo a 94°C, 5 min./55°C, 1 min./68°C, 1 min. seguido por 25 ciclos de 94°C, 1 min./55°C, 1 min./ 68°C, 1 min. La reacción típica PCR2 fue idéntica a aquella descrita para PCR 1, excepto que se utilizaron los cebadores inverso y mutagénico delantero. En donde se requería una tercera reacción inicial, la reacción contenía a los cebadores mutagénico delantero y mutagénico inverso. Se separaron los fragmentos amplificados por electroforesis con gel de agarosa y el fragmento de ADN correcto dimensionado se purificó usando un kit de extracción de gel y los procedimientos utilizados por el fabricante (Qiagen) . Los fragmentos complementarios se combinaron después en una tercera reacción por PCR usando solamente los cebadores delantero e inverso exterior. Se separaron los fragmentos amplificados por electroforesis con gel de agarosa y se purificaron del gel como se describe arriba. El ADN purificado se digirió con Hind III y Sal I, después se purificó nuevamente con gel. El fragmento se ligó después en un vector pDSRal9 en corte Hind III y Sal I. El ADN ligado transformado por electroporación en análogos hiperglicosilados de la Epo de E. coli., se separaron por exclusión inicialmente por PCR de colonias para identificar clones que contenían el inserto de ADN correctamente dimensionado. El ADN de plásmido de los clones seleccionados se preparó después y se formaron secuencias del inserto para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas y para asegurar que no se introdujeran cambios adicionales de aminoácidos. Tabla 3 ANÁLOGOS DE ERITROPOYETINA QUE TIENEN SITIOS PARA CADENAS DE CARBOHIDRATOS LIGADAS EN N Análogo Sustitución de aminoácido Cambios de secuencia N62 Ala, His, Glu, Gly ? GCT, CAC, GAG, GGG? Asn30, <,Thr32, Asn55 Thr57 AAT, ACG, AAT, ACT N63 A, H, E, G, P, W, P? N30, GCT, CAC, GAG, GGG, T32, N55, T57, V87, N88, CCG, TGG, CCC? AAT, T90 ACG, AAT, ACT, GTG, AAT, ACC N64 A, H, E, G, A, K? N30, GCT, CAC, GAG, GGG, T32, N55, T57, N114, T116 GCC, AAG? AAT, ACG, AAT, ACT, AAC, ACG N65 A, H, P, W, P, A, K? N30, GCT, CAC, CCG, TGG, T32, V87, N88, T90, N114, CCC, GCC, AAG? AAT, T116 ACG, GTG, AAT, ACC, AAC, ACG N66 A, H, E, G, P, W, P, A, K? GCT, CAC, GAG, GGG, N30, T32, N55, T57, V87, CCG, TGG, CCC, GCC, N88, T90, N114, T116 AAG? AAT, ACG, AAT, ACT, GTG, AAT, ACC, AAC, ACG N67 A, H, E, G, P, W, P, A, A, GCT, CAC, GAG, GGG, S? N30, T32, N55, T57, CCG, TGG, CCC, GCG, V87, N88, T90, P124, T125, GCC, TCA? AAT, ACG, T126 AAT, ACT, GTG, AAT, ACC, CCG, ACC, ACÁ N68 A, H, E, G, A, K, A, A, S? GCT, CAC, GAG, GGG, N30, T32, N55, T57, N114 GCC, AAG, GCG, GCC, T116, P124, T125, T126 TCA? AAT, ACG, AAT, ACT, AAC, ACG, CCG, ACC, ACÁ N69 A, H, E, G, P, W, P, A, K, GCT, CAC, GAG, GGG, A, A, S? N30, T32, N55, CCG, TGG, CCC, GCC, T57, V87, N88, T90, N114, AAG, GCG, GCC, TCA? T116, P124, T125, T126 AAT, ACG, AAT, ACT, GTG, AAT, ACC, AAC, ACG, CCG, ACC, ACÁ N70 Ala, His, Pro, Trp, Pro? GCT, CAC, CCG, TGG, N30, T32, V87, N88, T90, CCC?AAT, ACG, GTG, IgGl fusión AAT, ACC Construcción del cADN que codifica al polipéptido de fusión análogo de la Epo glicosilado Se hizo también el análogo N70 de la Epo por PCR de traslape. El plásmido DSRa2 que contenía la secuencia de cADN que codificaba al análogo N47 (N30 T32 V87 N88 T90) y el plásmido pAMG21 (número de acceso ATCC 98113) que contenía el cADN que codifica una región Fc, se usaron como plantillas para las reacciones en cadena de la polimerasa. La porción Fc de la cadena pesada IgGl inmunoglobulina humana del residuo 104 del dominio de articulación (Asp- 104) para la terminación carboxilo (Ellison et al., supra, ver también figura 10 partiendo del residuo de ácido aspártico en la posición 6) se generó por amplificación de PCR de una colección de cADN de bazo humano (Clontech) . Los productos de traslape de PCR se generaron en dos reacciones usando los siguientes cebadores de oligonucleótidos. Cebador de reacción delantero 5' 2343-85 (específico de Epo) : AAC AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGG GGT G (SEQ ID NO: 21) Cebador de reacción inverso 3' 2343-87 (homología con ambos Epo y Fc): AGG TGG ACÁ TGT GTG AGT TTT GTC TCT GTC CCC TCT CCT GCA GGC CTC C (SEQ ID NO: 22) Cebador de reacción delantero 2343-86 (homología con ambos Epo y Fc): GAG GCC TGC AGG ACÁ GGG GAC AGA GAC AAA ACT CAC ACÁ TGT CCA CCT (SEQ ID NO: 23) Cebador de reacción inverso 3' 2343-88 (específico para Fc) : TGG ACÁ GTC GAC ATT ATT TAC CCG GAG ACÁ GGG AGA GGC TCT TCT GC (SEQ ID NO: 24) El PCRl contenía 2.5 µl de cada uno de los cebadores delantero (2343-85) e inverso (2343-87) (10 pmol/µl), mientras que el PCR2 contenía 2.5 µl de cada uno de los cebadores delantero (2343-86) e inverso (2343-88) (10 pmol/µl) . Las condiciones fueron como se describieron arriba. Los productos amplificados resultantes contenían una región de traslape (48 nucleótidos) que codificaba los últimos 8 aminoácidos de la Epo y los primeros 8 aminoácidos de Fc . Los fragmentos complementarios se purificaron con gel y se combinaron en una tercera reacción por PCR usando solamente los cebadores inverso y delantero externo. El fragmento amplificado se separó por electroforesis con gel de agarosa y se purificó del gel como se describió arriba. El ADN purificado se digirió con Hind III y Sal I, después se purificó nuevamente con gel. El fragmento se ligó después en un vector pDSRal9 de corte Hind III y Sal I. El ADN ligado transformado por electroporación en E.coli. Se separaron por exclusión inicialmente los transformantes por el PCR de colonia para identificar clones que contenían el inserto de ADN correctamente dimensionado. El ADN de plásmido de los clones seleccionados, se preparó después y se formó la secuencia del inserto, para confirmar la secuencia de la proteína de fusión y para asegurar que no se introdujeran cambios adicionales de aminoácidos. Análisis de la adición de carbohidratos Los constructos de los análogos N62 a N69 de la Epo hiperglicosilados y la proteína de fusión (análogo N70) se insertaron dentro del vector de expresión pDSRal9 y se transfectaron en células CHO. Los sobrenadantes de la célula CHO transfectada se analizan por manchado Western para determinar si los análogos expresados y secretados de Epo contienen carbohidratos adicionales, usando los procedimientos antes descritos para los análogos N49 a N62. Bioensayos in vitro Los ensayos in vitro para los análogos N62 a N70 expresados en células transfectadas de CHO, se llevan a cabo como se describen arriba para los análogos N49 a N61. EJEMPLO 2 Preparación de la eritropoyetina humana recombinante y los análogos de eritropoyetina hiperglicosilados. La eritropoyetina humana recombinante (rHuEpo) usada para los experimentos descritos en la presente, se expresó por células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con un plásmido recombinante que lleva el gen de la eritropoyetina humana. El producto recombinante se recuperó del medio acondicionado y se purificó esencialmente como se describe por Lai et al., supra. La preparación resultante de rHuEpo, tiene predominantemente las isoformas de 9 a 14 ácidos siálicos como se determina por la focalización isoeléctrica. Los análogos de eritropoyetina hiperglicosilados recombinantes, se expresaron en células CHO transfectadas con un plásmido recombinante que lleva el gen análogo Epo como se describe WO91/05867 y WO94/09257 incorporado en la presente como referencia. Los análogos hiperglicosilados se purificaron de sobrenadantes de cultivo como se describen arriba.

Concentración y diafiltración de los medios acondicionados Se recolectó el medio acondicionado (libre de suero) de tres cosechas sucesivas (5-8 días cada una) de la línea celular de CHO transfectada, se filtró a través de un filtro 0.45 µm, se concentró alrededor de 30 veces y se diafiltró en 10 mM Tris, 20 µm CuS04, pH 7.0 usando un sistema de ultrafiltración de flujo tangencial (Millipore) con una membrana de corte de peso molecular de 10,000. Los medios diafiltrados (DFM) se filtraron (0.45 µm) una segunda vez y se almacenaron a -20°C hasta que se usaron para la purificación. Purificación Todos los procedimientos se llevaron a cabo a 2 hasta 8°C. Cromatografía de intercambio de aniones (10) Se aplicó el DFM clarificado a una columna de flujo rápido de Q-sefarosa (Pharmacia, 6 cm x 18 cm) equilibrada en bis Tris propano 10 mM (BTP) , pH 7.0 y se lavó con dos volúmenes de columna de 10 mM BTP para eluir todas las especies que no se enlazan. Se operaron los siguientes gradientes dependiendo de si el análogo hiperglicosilado tenía cuatro, cinco o seis cadenas de carbohidratos ligadas en N. Todas las soluciones amortiguadoras usadas en esta etapa, contienen glicina 1 mM, CuS04 20 µm, urea 6 M, leupeptina 5 µg/mL y pepstatina 1 µg/mL. Para los análogos con cuatro cadenas de carbohidratos ligadas en N, el gradiente fue ácido acético 10 mM, NaCl 0.1 mM hasta ácido acético 500 mM, NaCl 5 mM sobre volúmenes de 49 columnas con un volumen de dos columnas mantenido a altas condiciones de sal . Para los análogos con cinco cadenas de carbohidratos ligadas en N, el gradiente fue ácido acético 0.7 M, NaCl 7 mM hasta ácido acético 1.0 M, NaCl 12 mM sobre 30 volúmenes de columna con un volumen de dos columnas mantenido a altas condiciones de sal. Para los análogos con seis cadenas de carbohidratos ligadas en N, el gradiente fue ácido acético 1.0 M, NaCl 10 mM hasta ácido acético 1.5 mM, NaCl 20 mM sobre 50 volúmenes de columna con un volumen de dos columnas mantenido a altas condiciones de sal. Después del gradiente, la columna se lavó con dos volúmenes de columna de 10 mM BTP, pH 7.0 y se eluyó la fracción de alta isoforma con 0.6 M NaCl, 100 mM BTP, pH 7.0. Cromatografía de fase inversa (C4) El producto recuperado de alta sal de la columna de Q-sefarosa (ÍQ) , se aplicó a una columna de fase inversa Vydac C4 (partículas de 30 µ, 4 cm x 18 cm) equilibrado en 20% de etanol, 10 mM BTP, pH 7.0 y eluido de una columna con un gradiente de volumen de treinta columnas hasta 94% de etanol, amortiguado en 10 M BTP, pH 7.0. El producto acumulado alcanzó un pico, eluyéndose en aproximadamente 60% de etanol, se diluyó con cuatro volúmenes de 10 mM BTP, pH 7.0 para minimizar la posibilidad de agregación en presencia de etanol . Cromatografía de intercambio de aniones (20) El eluato diluido de la columna de fase inversa se aplicó a una segunda columna de flujo rápido de Q-sefarosa (Pharmacia, 3 cm x 9 cm) equilibrada con 10 mM BTP, pH 7.0. La columna se lavó con solución amortiguadora de equilibrio, y el análogo de Epo hiperglicosilado se eluyó con cloruro de sodio 0.6 M, citrato de sodio 20 M, pH 6.0. La proteína purificada se intercambió en 20 mM NaP04, pH 6.0, 140 mM NaCl por medio de centricon (peso molecular de corte 10,000), seguido por el paso a través de un filtro de 0.2 µm y almacenamiento a 2-8°C. EJEMPLO 3 Bioactividad in vivo de los análogos de rHuEpo y rHuEpo que contienen cuatro, cinco y seis cadenas de carbohidrato ligadas en N. La actividad in vivo de los análogos Epo que contienen cuatro, cinco y seis cadenas de carbohidratos ligadas en N se comparó con aquella de rHuEpo en el bioensayo de ratón policitémico exhipóxico. Este ensayo cuantifica la incorporación de 59Fe en células de glóbulos rojos recientemente sintetizadas, como una medida del incremento en la eritropeyesis en ratones en respuesta a una muestra de prueba administrada exógenamente. El ensayo llevado a cabo como se describe abajo, es una modificación del método de Cotes y Bangham (Nature 191, 1065 (1961)). En este ensayo, ratones hembra BDFi se preacondicionan primero por exposición a condiciones bajas de oxígeno en una cámara hipobárica (0.4 -0.5 atm.) por aproximadamente 18 horas por día durante 14 días. Para compensar las bajas condiciones de oxígeno, los ratones responden al estimular la eritropoyesis para incrementar el número de células de glóbulos rojos y con lo cual, la capacidad relativa de transporte de oxígeno. Después de la terminación de la exposición hipobárica final, se dejan los ratones que permanezcan a presión ambiente por aproximadamente 72 horas previo a la administración de muestras de prueba por inyección intraperitoneal. A presión ambiente, los ratones son relativamente policitémicos y responden al disminuir la producción endógena de eritropoyetina y la tasa de la eritropoyesis. Cinco días después de la administración de la muestra, 0.2 -0.3 µCi de 59FeCl3 en 0.2 mL se inyectan intravenosamente en la vena de la cola. 48 horas después, se sacrifican los animales y se determina el incremento en la eritropoyesis producida por las muestras de prueba, al medir la cantidad de 59Fe incorporado en una muestra de 0.5 mL de sangre entera.

Un ejemplo de los resultados obtenidos cuando se probaron en este ensayo rHuEpo y cinco análogos diferentes de Epo, que contenían cuatro, cinco o seis cadenas de carbohidrato ligadas en N, se muestra en la figura 3. Cada muestra se ensayó a 6 ó 7 diluciones diferentes dentro de un rango de concentración apropiado. Todas las muestras se diluyeron en solución salina amortiguada con fosfato que contenía 0.5% de albúmina de suero de bovino y 0.4 mL de cada dilución se administraron a cinco ratones preacondicionados. Cuarenta y ocho horas después de la administración de 59Fe, se midió la cantidad incorporada en 0.5 mL de sangre por conteo gamma. Los resultados para cada una de las muestras se grafican como el porcentaje de 59Fe incorporado contra el log de la dosis administrada. Como se muestra en la figura 3, todos los cinco análogos de Epo hiperglicosilados probados en este ensayo fueron más potentes que con rHuEpo. Además, la potencia de cada análogo fue directamente dependiente del número de cadenas de carbohidratos ligadas en N, con aquellos análogos que tienen un número creciente de cadenas de carbohidratos que tenían la actividad mayor. Así, el análogo N53, que contiene 6 cadenas de carbohidratos ligadas en N, fue el análogo más potente. El análogo N47, que contiene cinco cadenas de carbohidratos ligadas en N fue a su vez, más potente que aquellos análogos que contenían cuatro cadenas ligadas en N. Las potencias de los tres análogos que contenían cuatro cadenas de carbohidratos ligadas en N (N4, NI8 y N50) fueron aproximadamente iguales una con la otra y superiores a aquella de rHuEpo. En este experimento, la dosis de rHuEpo y los análogos que contienen cuatro, cinco o seis cadenas de carbohidratos ligadas en N, requieren producir el 40% de la incorporación de 59Fe fueron 10,700 ng, 640 ng, 140 ng y 38 ng, respectivamente. Con base en la cantidad de material requerido para producir este nivel de eritropoyesis, los análogos de Epo que contenían cuatro, cinco o seis cadenas de carbohidratos ligadas en N son 17 veces, 77 veces y 280 veces más potentes que rHuEpo. EJEMPLO 4 Farmacocinética IV del análogo N47 de Epo y rHuEpo en ratas y perros sabuesos Se llevaron a cabo dos estudios separados en ratas y perros para comparar los parámetros farmacocinéticos del análogo N47 de Epo y rHuEpo. En los estudios de ratas, se inyectó intravenosamente 1 µCi (~0.1 µg de péptidos/kg) de un análogo 125I-Epo N47 o de eritropoyetina humana recombinante 125I (Amersham) , dentro de una cánula carótida implantada quirúrgicamente en ratas macho normales Sprague-Dawley que pesaban entre 314-363 g. En diversos puntos de tiempo después de la administración, se recolectaron 0.3 mL de sangre y se preparó el suero por centrifugación. El nivel de 125I-rHuEpo o del análogo 125I Epo N47 en 0. lmL de cada muestra de suero, se determinó después siguiendo una incubación durante la noche a 4°C con 90% de etanol . La proteína precipitada con etanol en cada muestra de suero, se recolectó por centrifugación y se contó la radioactividad en un contador gamma. La concentración de suero resultante contra las curvas farmacocinéticas de tiempo, se muestra en la figura 4. Cada punto representa una media del grupo de 5 ratas en el grupo análogo N47 y seis ratas en el grupo rHuEpo. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron para cada rata usando un análisis de regresión no lineal PCNONLIN 4.0 (Statistical Consultants, 1992) y los resultados para cada grupo se promediaron. Los resultados se muestran en la tabla 3. TABLA 3 Comparación de los parámetros farmacocinéticos IV de N47 y rHuEpo en ratas Vida media Muestra de a ß V4 Depuración del prueba (horas) (horas) (mL/kg) suero (mL/kg-hr) N47 (n= ratas) 0.57 + 0.49 6.9 + 0.3 33+5 4.8+1.2 r-HuEpo (n= 0.18+0.03 2.5+0.2 36+6 17.7+3.4 ratas) a. Los resultados se presentan como el promedio del grupo + SD para cinco ratas en el grupo N47 y seis ratas en el grupo r-HuEpo. En los estudios con perros, los perros sabuesos normales que pesaban entre 7.8-9.5 kg recibieron una inyección de bolo intravenoso de ~29µCi de ya sea 125I-rHuEpo o 125I-N47 (~0. lµg péptido/kg) dentro de la vena cefálica. En diversos puntos de tiempo a través de 24 horas después de la administración, se recolectaron aproximadamente de 1 a 2 mL de sangre y se preparó el suero. La concentración de 125I-rHuEpo y 125I-N47 en 0.1 mL de suero, se determinó y se calcularon los parámetros farmacocinéticos como se describen arriba. La concentración del suero contra las curvas farmacocinéticas de tiempo para los estudios con perros, se muestran en la figura 5. Los puntos de tiempo son las medias del grupo de dos animales en cada grupo. Los parámetros farmacocinéticos se resumen en la tabla 4. TABLA 4 Comparación de los parámetros farmacocinéticos IV de N47 y r- HuEpo en perros Vida media Muestra de (horas) ß (horas) V4 Depuración del prueba (mL/kg) suero (mL/kg-hr) N47 0.34 25.0 55.9 2.4 r-HuEpo 0.04 7.2 60.8 8.4 a. Los resultados presentados son los parámetros promedio para los dos perros en cada grupo. En los estudios con ratas y con perros, el análogo r- HuEpo y Epo N47 mostró una depuración de suero bifásica la depuración en ratas fue de alrededor de 3.7 veces más rápida para r-HuEpo que para el análogo de Epo N47 y la vida media ß fue de alrededor de 2.8 veces más prolongada para el análogo Epo N47 que para r-HuEpo. Los parámetros farmacocinéticos en los estudios con perros, fueron generalmente consistentes con aquellos observados en las ratas. En los perros la depuración de r-HuEpo fue 3.5 veces más rápida que para el análogo Epo N47 y la vida media ß fue 3.5 veces más prolongada para el análogo Epo N47 en comparación con aquel para r-HuEpo. EJEMPLO 5 Respuesta de dosis del hematocrito después de la administración de r-HuEpo y del análogo N47 de Epo Estudios de respuesta de dosis de hematocrito tres veces por semana (TIW) Los efectos biológicos in vivo de r-HuEpo y del análogo N47 de Epo en ratones normales, se compararon después de administrar un rango de dosis por inyección intraperitoneal o intravenosa tres veces por semana por hasta seis semanas. Se efectuaron las determinaciones del hematocrito dos veces por semana por sangrado retro-orbital. Los ratones normales CDl que pesaban aproximadamente 30g (10-13 ratones por grupo) se inyectaron intraperitonealmente tres veces por semana por un total de seis semanas con r-HuEpo (sobre el rango de dosis de 0.625-10µg péptido/kg/dosis) , análogo Epo N47 (sobre el rango de dosis de 0.156-1.25µg péptido/kg/dosis) o control de vehículo. El control de vehículo y el diluyente para los diversos rHuEpo y análogo Epo N47 preparaciones de dosificación fue solución salina amortiguada con fosfato (PBS), que contenía 0.025% de albúmina de suero de ratón. Los hematocritos de todos los ratones se determinaron en la línea base y dos veces por semana posteriormente por sangrados retro-orbitales. A la conclusión del experimento, se recolectó el suero de todos los animales y se ensayó para anticuerpos para el producto inyectado por un ensayo de solución de radio inmunoprecipitación. Los datos de hematocrito de los animales se juzgaron negativos para los anticuerpos neutralizantes se usaron para el análisis posterior. Como se muestra en la figura 6, tanto el rHuEpo como el análogo de Epo N47 produjeron un incremento dependiente de la dosis en el hematocrito en el estudio de seis semanas, aunque el análogo N47 promueve un incremento superior en el hematocrito comparado con rHuEpo a una concentración dada. En este experimento, el análogo Epo N47 es alrededor de 3 a 4 veces más potente cuando se dosifica tres veces por semana por inyección intraperitoneal. Los estudios de respuesta de dosis de rHuEpo y del análogo N 47 se llevaron a cabo por inyección intravenosa tres veces por semana usando procedimientos similares a aquellos para la inyección intraperitoneal. Los resultados obtenidos fueron similares con aquellos para la administración intraperitoneal y en particular, los estudios confirmaron además que el análogo Epo N47 tenia una potencia superior que rHuEpo cuando se administraba tres veces por semana . Para comparar mejor y cuantificar la actividad biológica de rHuEpo y del análogo Epo N47 al elevar el hematocrito de los ratones normales, se analizaron también los resultados de los experimentos por gráficas de potencia relativa. Para cada experimento, la actividad de rHuEpo o del análogo N47 en cada dosis, se determinó al sumar el incremento en el hematocrito sobre los primeros 38 días de estudio por suma trapezoidal para obtener el área bajo la curva (AUC) . Esto se gráfico después contra la dosis logarítmica en µg péptido/kg/semana. La diferencia en la potencia entre los compuestos administrados por vías de administración iguales o diferentes o frecuencias de dosificación, se puede determinar al medir la distancia entre las líneas de respuesta de dosis logarítmica relevante. La figura 7 resume los datos de potencia relativa para todos los experimentos llevados a cabo comparando la actividad de rHuEpo y el análogo Epo N47 administrado por dos vías diferentes (intraperitoneal y intravenosa) y en dos programas de dosis diferentes. Como se muestra en la figura 7, cuando se administra tres veces por semana, el análogo Epo N47 tiene la misma potencia cuando se inyecta por vía intravenosa o intraperitoneal, y es 3.6 veces más potente que el rHuEpo inyectado intraperitonealmente tres veces por semana. Estudios de respuesta de dosis de hematocrito una vez por semana (OW) Las comparaciones de rHuEpo y del análogo N47 de Epo a un incremento de hematocrito en ratones normales, se llevaron a cabo con una dosificación una vez por semana por vías de administración intraperitoneal o intravenosa durante seis semanas . Se inyectaron intravenosamente ratones normales CDl que pesaban aproximadamente 30g (8-10 ratones por grupo) una vez por semana para un total de seis semanas con concentraciones variables de rHuEpo o del análogo Epo N47 preparado en PBS que contenía 0.025% de albúmina de suero de ratón o con un control de vehículo (PBS con 0.025% albúmina de suero de ratón). La dosis del análogo varió de 6.25-25 µg de péptido/kg/dosis y la dosis de rHuEpo varió de 25-200 µg/kg/dosis. Los hematocritos de todos los ratones se determinaron en la línea base y dos veces por semana posteriormente por sangrados retro-orbitales. A la conclusión del experimento, se recolectó y ensayó el suero de todos los animales para anticuerpos al producto inyectado por una radioinmunoprecipitación en solución. Los datos de los animales que se juzgaron negativos para los anticuerpos neutralizantes, se usaron para análisis posteriores. Como se muestra en la figura 8, mientras que el rHuEpo y el análogo N47 pueden incrementar el hematocrito de los ratones normales cuando se dosifican una vez por semana, la dosis de rHuEpo requerida para producir una respuesta, fue significativamente superior a aquella del análogo N47. Por ejemplo, en este experimento 25µg péptido/kg/semana de N47 incrementaron el hematocrito de ratones por 41.2 puntos en seis semanas, mientras que la misma dosis de rHuEpo produjo solamente una elevación de hematocrito de 12.5 puntos. Los estudios de respuesta de dosis de rHuEpo y del análogo N47 se efectuaron por inyección intraperitoneal una vez por semana usando procedimientos similares a aquellos antes descritos. Los resultados obtenidos fueron consistentes con los resultados para la administración intravenosa y confirmaron además la potencia superior del análogo N47 comparado con rHuEpo cuando se administra una vez por semana. Para cuantificar la diferencia de actividad entre rHuEpo y el análogo N47, cuando cada uno se dosifica una vez por semana, se generaron gráficas de potencia relativa de todos los experimentos relevantes como se describen arriba. Como se muestra en la figura 7, cuando se administra una vez por semana, el análogo N47 tiene la misma potencia cuando se inyecta por vía intravenosa e intraperitoneal. El análogo N47 es aproximadamente 14 veces más potente que la rHuEpo cuando cada uno se administra una vez por semana. Además, las gráficas de respuesta de dosis logarítmica en la figura 6 también ilustran los siguiente: (1) Una dosis dada del análogo N47 administrada una vez por semana (QW) es aproximadamente tan efectiva como la misma dosis semanal total de rHuEpo dada como tres dosis divididas (TIW) ; (2) Una dosis dada de rHuEpo administrada una vez por semana (QW) es solamente aproximadamente 2% tan efectiva como la misma dosis semanalmente total de análogo N47 dada como tres dosis divididas (TIW) ; (3) El análogo N47 es aproximadamente 4 veces más potente en ratones cuando se administra TIW en comparación con QW. Estudios de respuesta de dosis de hematocrito cada dos semanas (EOW) Se llevaron a cabo también experimentos para evaluar la capacidad del análogo N47 para incrementar el hematocrito de ratones cuando se inyectan una vez cada dos semanas. Se inyectaron intravenosamente ratones normales CDl (10 ratones por grupo) una vez por semana o una vez cada dos semanas para un total de aproximadamente seis semanas con concentraciones variables del análogo Epo N47 preparado en PBS que contenía 0.025% de albúmina de suero de ratón. El análogo N47 se administró a 200, 100 o 25 µg/kg/dosis cada dos semanas o a 12.5 µg/kg/dosis una vez por semana. Se determinaron los hematocritos de todos los ratones en la línea base y dos veces por semana de allí en adelante por sangrados retro-orbitales. Como se muestra en la figura 9, el análogo N47 puede incrementar el hematocrito de los ratones normales en una forma dependiente de la dosis aún cuando se administra cada dos meses. Como se esperaba, cuando se dosifican menos frecuentemente, se requiere una cantidad superior de análogo N47 para incrementar el hematocrito. Una dosis de 200 µg/kg del análogo N47 administrada cada dos semanas, incrementa el hematocrito hasta aproximadamente el mismo grado en 6 semanas como lo hizo 12.5 µg/kg cuando se dosifica semanalmente. EJEMPLO 6 Farmacocinética IV del análogo Epo N47 y rHuEpo en diálisis peritoneal ambulatoria continua (CAPD) en pacientes En vista del incremento sostenido en la vida media del suero en el análogo Epo N47 en comparación con rHuEpo en el perro sabueso y en la rata, fue de interés determinar si un incremento se podía observar en humanos . Se llevó a cabo un estudio de diseño cruzado aleatorio, de doble ciego de once pacientes estables de CAPD (7 masculinos, 4 femeninos, edades de 27-75 años) . Un grupo de pacientes recibió lOOU/kg de rHuEpo (equivalente a 0.5 µg de péptido/kg) mientras que un segundo grupo de pacientes recibió 0.5 µg péptido/kg del análogo Epo N47 administrando ambos como una inyección intravenosa de bolo simple. Se obtuvieron muestras de sangre venosa (3 mL) por medio de una cánula interior y se tomaron predosis a 5, 10, 15, 30 minutos y 1, 2, 5, 8, 12, 16, 24, 30, 36, 48, 60, 72 y 96 horas después del bolo intravenoso. Después de un periodo de depuración de 28 días, el primer grupo de pacientes recibió una dosis simple intravenosa del análogo Epo N47 mientras que el segundo grupo recibió una dosis simple intravenosa de rHuEpo. Se tomaron muestras de sangre como en el primer ciclo de tratamiento. Los niveles de rHuEpo y del análogo Epo N47 se determinaron en suero por ELISA después de la sustracción de los niveles endógenos en la línea base de Epo. Los parámetros farmacocinéticos (media + SE) estimados después del ajuste por efectos del diseño cruzado, se muestra en la tabla 5. La concentración de suero en AUC se calculó usando la suma trapezoidal lineal, tl/2z que se define como: log(2)/Kz, donde Kz se calcula como la pendiente de la porción terminal de la curva de tiempo ln (concentración de suero) . La depuración (Cl) se define como: dosis/AUC. El volumen de distribución (Vd) se define como: Cl/K. TABLA 5 Grupo de AUC T12z (h) Cl Vd (mL/kg) dosis (ng.h/mL) (mL/h/kg) N47 291.0+7.6 25.3 + 2.2 1.6 + 0.3 52.4 + 2.0 rHuEpo 131.9+8.3 8.5 + 2.4 4.0 + 0.3 48.7 + 2.1 La vida media del suero promedio para el análogo Epo N47 (25.3 hr) fue tres veces más prolongada que para rHuEpo (8.5 hr) y la depuración fue 2.5 veces más rápida para rHuEpo que para el análogo N47. EJEMPLO 7 Un estudio de hallazgo de dosis de fase II y programación de dosis para el análogo Epo N47 Se iniciaron estudios de escalamiento de dosis secuenciales, aleatorios, multicentro, para investigar la dosis óptima y el programa de dosis para el análogo N47 cuando se administra por inyección subcutánea o intravenosa en pacientes con CRF que reciben diálisis. El programa de dosis fue como sigue: Dosificación una vez por semana: 0.075, 0.225, 0.45, 0.75, 1.5 y 4.5 µg de péptido/kg/dosis. Dosificación tres veces por semana: 0.025, 0.075, 0.15, 0.25, 0.5 y 1.5 µg de péptido/kg/dosis. Los estudios se llevaron a cabo en dos partes: la primera parte es un estudio de escalamiento de dosis diseñado para evaluar la dosis del análogo N47 que se da una o tres veces por semana, lo que incrementa la hemoglobina a una tasa óptima sobre cuatro semanas (superior o igual a 1 g/dL pero menos de 3 g/dL) . La segunda parte de cada estudio se diseñó para determinar las dosis requeridas (cuando se administran una vez o tres veces por semana por vías de administración intravenosa o subcutánea) para mantener el hematocrito en un objetivo terapéutico. Los resultados preliminares indican que una dosificación de una vez por semana con el análogo N47 se puede usar para incrementar y mantener el hematocrito de pacientes anémicos con CRF. Los resultados iniciales sugieren que las dosis preferidas para iniciar la terapia en un programa de dosificación de tres veces por semana son 0.15 y 0.25 µg/péptido/kg/dosis, y en un programa de dosificación de una vez por semana son 0.45 y 0.75 µg/péptido/kg/dosis por ambas vías de administración. Aunque la invención se ha descrito en lo que se considera son las modalidades preferidas, no se debe limitar a las modalidades descritas, sino por el contrario, se pretende que cubra diversas modificaciones y equivalentes incluidos dentro del alcance y espíritu de las reivindicaciones anexas, cuyo alcance se conviene para la interpretación más amplia de manera que abarque todas las modificaciones y equivalentes. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS < 110> AMGEN INC . < 1 0> Métodos y Composiciones para la prevención y el tratamiento de la anemia <130> A-460A <140> PCT/US01/12836 <141> 2001-04-19 <150> 09/559,001 <151> 2000-04-21 <160> 27 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> s?g_peptido <222> (3).. (27) <223> <220> <221> mat_pepti?? <222> (28) .. 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<213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (17).. (1276) <223> <400> 26 aagcctctag accacc atg ggg gtg cac gaa tgc ecc gcc cgg ceg cgg ecc 52 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu 1 5 10 ctc ctg tcc ceg ctg teg ctc cct ctg ggc ctc cca gtc ctg ggc gcc 100 Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala 15 20 25 cca cca cgc ctc ate cgt gac age cga gtc ctg gag agg tac ctc ttg 148 Pro Pro Arg Leu He Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu 30 35 40 gag gcc aag gag gcc gag aat ate acg acg ggc tgt aat gaa acg tgc 196 Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn He Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr Cys 45 50 55 60 age ttg aat gag aat ate act gtc cca gac acc aaa gtt aat ttc tat 244 Ser Leu Asn Glu Asn He Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr 65 70 75 gcc tgg aag agg atg gag gtc ggg cag cag gcc gta gaa gtc tgg cag 292 Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln 80 85 90 ggc ctg gcc ctg ctg ceg gaa gct gtc ctg cgg ggc cag gcc ctg ttg 340 Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu 95 100 105 gtc aac tet cc cag gtg aat gag acc ctg cag ctg cat gtg gat aaa 388 Val Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys 110 115 120 gcc gtc agt ggc ctt cgc age ctc acc act ctg ctt cgg gct ctg gga 436 Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly 125 130 135 140 gcc cag aag gaa gcc ate tcc cct cca gat gcg gcc tea gct gct cca 484 Ala Gln Lys Glu Ala He Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro 145 150 155 ctc cga acá ate act gct gac act ttc cgc aaa ctc ttc cga gtc tac 532 Leu Arg Thr He Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr 160 165 170 tcc aat ttc ctc cgg gga aag ctg aag ctg tac acá ggg gag gcc tgc 580 Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys 175 180 185 agg acá ggg gac aga gac aaa act cac acá tgt cca cct tgt cca gct 628 Arg Thr Gly Asp Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 190 195 200 ceg gaa ctc ctg ggg ggt cct tea gtc ttc ctc ttc ecc cca aaa ecc 676 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 205 210 215 220 aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc acá tgc gtg gtg 724 Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 225 230 235 gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg 772 Vai Asp Val Ser His Giu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 240 245 250 " gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag acá aag ceg cgg gag gag cag 820 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 255 260 265 tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac cag 868 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Glp 270 275 280 gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc 916 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 285 290 295 300 ctc cca gcc ecc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag ecc 964 Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 305 310 315 cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ecc cca tcc cgg gat gag ctg acc 1012 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 320 325 330 aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ecc age 1060 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 335 340 345 gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ceg gag aac aac tac 1108 Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 350 355 360 aag acc acg cct ecc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac 1156 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 365 370 375 380 age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 1204 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 385 390 395 tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag 1252 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 400 405 410 age ctc tcc ctg tet ceg ggt aaa taatgtcgac 1286 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 415 420 <210> 27 <211> 420 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 1 He Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn He Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn He Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala He Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr He 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 195 200 205 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 210 215 220 Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 225 230 235 240 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 245 250 255 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 260 265 270 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 275 280 285 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 290 295 300 lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 305 310 315 320 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Glp Val 325 330 335 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val 340 345 350 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 355 360 365 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 370 375 380 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 385 390 395 400 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 405 410 415 Ser Pro Gly Lys 420

Claims (44)

1. Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para elevar y mantener los hematocritos en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina en una composición farmacéutica, en donde el análogo se administra menos frecuentemente que una cantidad equivalente molar de eritropoyetina humana recombinante para obtener un hematocrito objetivo comparable.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de análogo hiperglicosilado de eritropoyetina se administra alrededor de dos veces por semana .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de análogo hiperglicosilado de eritropoyetina se administra alrededor de una vez por semana.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de análogo hiperglicosilado de eritropoyetina se administra alrededor de una vez cada otra semana.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de análogo hiperglicosilado de eritropoyetina se administra alrededor de una vez por mes.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la cantidad de análogo hiperglicosilado de eritropoyetina que se administra es de alrededor de 0.075 hasta 4.5 µg por péptido de eritropoyetina por kg por dosis.
7. 7. Un método para elevar y mantener los hematocritos en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina en una composición farmacéutica, en donde el análogo se administra a una cantidad molar más baja que la eritropoyetina humana recombinante, para obtener un hematocrito objetivo comparable.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la cantidad de análogo hiperglicosilado de eritropoyetina que se administra es de alrededor de 0.025 hasta 1.5 µg de péptido de eritropoyetina por kg por dosis tres veces por semana.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicació 1 ó 7, caracterizado porque el análogo hiperglicosilado de eritropoyetina comprende al menos un sitio de glicosilación adicional en comparación con la eritropoyetina humana, en donde se agrega una cadena de carbohidratos al sitio.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 7, caracterizado porque el hematocrito objetivo es al menos de alrededor del 30%.
11. 11. El análogo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la cadena de carbohidratos es una cadena de carbohidratos enlazada a N en una o más de las posiciones 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 y 138 de la secuencia de la eritropoyetina humana.
12. 12. El análogo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque tiene cadenas de carbohidratos enlazadas a N adicionales en las posiciones 30 y 88 de la secuencia de eritropoyetina humana.
13. 13. El análogo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque es Asn30Thr32Val87 Asn88Thr90 Epo.
14. 14. El método de conformidad con a reivindicación 1 ó 7, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende un diluyente, portador, solubilizante, emulsificante, conservador, y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
15. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el diluyente es una solución amortiguadora de citrato de sodio o fosfato de sodio.
16. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el portador es albúmina de suero humana .
17. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el conservador es alcohol bencílico.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 7, caracterizado porque el mamífero sufre de anemia asociada con una reducción o pérdida de la función del riñon.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 7, caracterizado porque el mamífero sufre de anemia asociada con terapia mielosupresora.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la terapia mielosupresora comprende fármacos quimioterapéuticos o anti-virales.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 1, caracterizado porque el mamífero sufre de anemia asociada con pérdida sanguínea excesiva.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 7, caracterizado porque comprende además administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de hierro.
23. 23. Un análogo de la eritropoyetina humana, caracterizado porque comprende al menos un sitio de glicosilación adicional en cualesquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114 de la secuencia de eritropoyetina humana, en donde la cadena de carbohidratos enlazada a N se agrega al sitio.
24. 24. El análogo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende al menos dos sitios de glicosilación adicionales en donde la cadena de carbohidratos se enlaza a cada uno de los sitios.
25. 25. El análogo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende al menos tres sitios de glicosilación adicionales en donde la cadena de carbohidratos se enlaza a cada uno de los sitios.
26. 26. El análogo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende al menos cuatro sitios de glicosilación adicionales en donde la cadena de carbohidratos se enlaza a cada uno de los sitios.
27. 27. Un análogo de eritropoyetina humana, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: Asn52 Thr54 Epo; Asn53 Thr55 Epo; Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 Thr125 Epo; Asn114 Thr116 Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Val87 Asn88Thr90 Epo; Asn55 Thr57 Epo; Asn86 Val87 Thr88 Epo; Ala87 Asn88 Thr90 Epo ; Val87 Asn88 Ser90 Epo ; Val87 Asn88 Gly89 Thr90 Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Epo ; Asn30 Thr32 Asn114 Thr116 Epo; y Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Val87 Asn88 Thr90 Asn114 Thr116 Epo .
28. 28 . El análogo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-27, caracterizado porque es el producto de expresión de una secuencia de ADN exógena.
29. 29. Una secuencia de ADN, caracterizada porque codifica el análogo de conformidad con las reivindicaciones 23-27.
30. 30. Una célula hospedadora eucariótica transfectada con la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque de esta manera se permite que la célula hospedadora exprese el análogo.
31. 31. Una composición, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del análogo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-27 junto con un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.
32. 32. Un método para elevar y mantener los hematocritos en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del análogo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-27, en una composición farmacéutica.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el análogo se administra menos frecuentemente que una cantidad molar equivalente de eritropoyetina humana recombinante para obtener un hematocrito objetivo comparable.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la cantidad de análogo se administra alrededor de una vez por semana, alrededor de una vez cada otra semana, o alrededor de una vez por mes.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el análogo se administra en una cantidad molar más baja que la eritropoyetina humana recombinante para obtener un hematocrito objetivo comparable.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la cantidad de análogo que se administra es de alrededor de 0.025 hasta 1.5 µg de péptido de eritropoyetina por kg por dosis tres veces por semana.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la cantidad de análogo que se administra es de menos de alrededor de 0.025 µg de péptido de eritropoyetina por kg por dosis tres veces por semana.
38. 38. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.
39. 39. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una región Fc.
40. 40. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la región Fc es de IgG humana o derivada de IgG humana.
41. 41. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la IgG es IgGl, IgG2, IgG3 ó IgG4, o una combinación de las mismas.
42. 42. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende al menos un sitio de glicosilación adicional en cualesquiera de las posiciones 30, 51, 52, 53, 55, 57, 69, 86, 88, 89, 114, 136 y 138 de la secuencia de eritropoyetina humana, en donde la cadena de carbohidratos enlazada a N se agrega al sitio.
43. 43. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 Epo fusionada a una región Fc.
44. 44. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque consiste de la secuencia de aminoácido maduro como se coloca en la Figura 11 (SEQ ID NO: 26) que carece de la secuencia de señal.