DD298056A5

DD298056A5 - Arzneimittel

Info

Publication number: DD298056A5
Application number: DD90343919A
Authority: DD
Inventors: Anders Rosen
Original assignee: Aktiebolaget Astra,Se
Priority date: 1989-09-12
Filing date: 1990-09-10
Publication date: 1992-02-06
Also published as: HU9200821D0; AU641942B2; IE903233A1; GR900100679A; JPH05500216A; SE8903003D0; AU6433690A; HUT62932A; FI921058A0; CA2065454A1; EP0489113A1; GR1001151B; WO1991004320A1; PT95284A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung von B-lymphozytischer Leukaemie und bestimmter anderer boesartiger Erkrankungen. Das Arzneimittel enthaelt als Wirkstoff Thioredoxin oder wenigstens ein Thioredoxinanaloges und gegebenenfalls zusaetzlich wenigstens einen Co-Faktor.{Arzneimittel; Leukaemie, lymphozytisch; Erkrankung, boesartig; Thioredoxin; Thioredoxinanalog}

Description

Hierzu 5 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden in der Humanmedizin und Veterinärmedizin zur Behandlung bösartig veränderter Zellen verwendet.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Aus der WO88/06891 ist es bekannt, daß B-Zellwachstumsfaktoren und Antikörper, die diesen ähneln, für eine Differenzierung in bestimmten bösartigen Erkrankungen verwendet werden können.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein Arzneimittel für eine neue Strategie zur Behandlung von B-Lymphozytenleukämie und bestimmter anderer bösartiger Erkrankungen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist ein Mittel zur Potenzierung der Reaktivität von Lymphozyten als Reaktion auf Krebszellen, die Oberflächenstrukturen ausdrücken, welche von den eigenen zytotoxischen Zellen des Patienten erkannt werden. Beispiele solcher Krebsarten sind bösartige Melanome und Dickdarmkrebs.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Arzneimittel gelöst, das Thioredoxin oder Thioredoxinanaloge, die die aktive Stulle Cys-Gly-Pro-Cys enthalten, als Wirkstoff umfaßt.

Krebszellen sind durch unkontrolliertes Wachstum gekennzeichnet. Einige Zeit gab es ein Konzept, daß ihr Wachstum unterdrückt werden kann, indem man diese Zellen veranlaßt, zu einem nicht proliferativen Zustand zu differenzieren. Klinische Versuche wurden auch bei unterschiedlicher Leukämie mit Differenzierungsmitteln, wie Vitaminen und Interferonen, durchgeführt. Es wurden jedoch keine solche Versuche mit spezifischeren Wachstums- und Differenzierungsfaktoren oder Antikörpern, die nur mit definierten Rezeptorstrukturen reagieren, gemacht. Die Erfindung schlägt nun die Verwendung solcher spezifischer Faktoren für die Krebsbehandlung entweder alleine oder in Kombination mit unterstützenden Mitteln vor.

Die Entwicklung normale' Zellen zu Krebszellen ist ein mehrstufiges /erfahren. Während der bösartigen Veränderung bekommen einige Zelltypen, wie beispielsweise Lymphozyten B (Literaturstelle 1), die Fähigkeit, Rezeptoren für definierte Wachstumsfaktoren auszudrücken und durch Proliferation oder Reifung auf diese zu reagieren. Die Tumorzellbn werden somit in der spezifischen Differenzierungsstufe „eingefroren", was durch einen spezifischen Satz von Oberflächenrezeptoren gekennzeichnet ist. Dieser Block ist jedoch nicht irreversibel. Es wird erfindungsgemäß ein Verfahren für di) Verwendung eines Enzyms, das zu der Thioredoxinl amilie und zu Thioredoxinanalogen gehört, die die gleiche akiive Stelle Cys-Gly-Pro-Cys enthält, einschließlich monoklonaler Antikörper, die sich an die Zielstruktur binden, in alleiniger Verwendung oder gemeinsam mit Co-Paktoren für die Einleitung im Ende differenzierter Zellen (Endzellen), die sich nicht weiter teilen, präsentiert. Dieses Enzym und Co-Faktoren sind beschrieben. Die Strategie klinischer Behandlung ist beispielhalber mit chronischer lymphozytischer B-Zellen-Leukämie (B-CLL) abgehandelt, für die eine weitere Differenzierung (zu einer reiferen Stufe) eingeleitet wurde, die durch beeinträchtigte Fähigkeit zur Proliferation und den Ausdruck plasmazytoider Morphologie gekennzeichnet ist, wie durch Oberflächenmarkierungen, zytoplasmisches Immunoglobulin und endoplasmatisches Reticulum zu erkennen ist. Für eine ruhende B-ZeIIe muß auf das anlängliche Aktivierungssignal, das durch die Wechselwirkung von Antigen und Immunoglobulin (Ig) hervorgerufen wird, eine Reihe von freien abgestimmten Rezeptor-Ligandsignalen und ZeII-ZeII-Wechselwirkungen mit anderen immunokompetenten Zellen (1) folgen, um eine Endplasmazellenreifung zu gestntten. Mehrere Liganden für Rezeptoren bei der Übertragung von Wachstums- und Differenzierungssteuerungssignalen ir. menschlichen B-Zellen wurden definiert, und die Gene wurden geklont. Diese enthalten Interleukin 1 (IL-I> zu Interleukin 6 (IL-6), niedermolekularen B-Zellenwachstumsfaktor (LMWBCGF), sCD23, Lymphotoxin (LT), Tumornecrosefaktor (TNF), lnterferon-γ (IFN-Y) (1,2).

Um das Konzept einer Differenzierungstherapie zu ergreifen, ist es wichtig zu verstehen, wie sich normale Zellen entwickeln. Im Knochenmark entwickeln sich verschiedene funktionell spezialisierte Zelltypen als ein Ergebnis einer Differenzierung (Bindung) der multipotenten Stammzellen. Diese Differenzierung läßt Vorläufer verschiedener Zellinien (B-ZeIMnie, T-Zellinie. Myeloidlinie) entstehen. Anschließende phenotypische Veränderungen solcher unipotenter Zellen zu Endzellen werden als Reifung oder Enddifferenzierung bezeichnet. Die Aktivierung menschlicher B-Zellen aus einer Ruhestufe, die zu weiterer Differenzierung und Reifung führt, und die Endstufe verläuft über wenigstens zwei Stufen.

1) Die Aktivierungsstufe, in der die Zellen aktivierenden Faktoren ausgesetzt werden. Für die B-Zellenreihe sind diese: Antigene; Antiimunoglobuline (Antiidiotypen); Interleukin 1,2 und 3 und Unterkomponenten hiervon, Interleukin 4 (IL4) und Antikörper zu dem IL4-Rezepto-; Reagenzien, die auf den C3d-Rezeptor (CD 11 c) wirken, wie polymerisierte Ergänzung 3d oder Antikörper zu C3d-Rezeptor (Anti-gp 140); Anti-gp35 (CD 20), Phorbolester, wie TPA oder PMA, werden experimentell in vitro als potente Kompetenz erzeugende Mittel verwendet, doch können diese nur als Modelle dienen, da sie toxisch und mit klinischer Verwendung unverträglich sind. Die Phorbolester wirken auf Proteinkinase C (PKC) ein und ähneln in ihrer Funktion biologisch aktiven Mitteln. Andere experimentell Kompetenz erzeugende Mittel von Bedeutung sind: Protein-Α in fester Phase, inaktiviertes Staphylococus aureus-Cowan I (SAC); Poke-weed-Mitogen (PWM); nicht vorändernder oder inaktivierter Epstein-Barr-Virus (EBV) (aus dem nicht verändernden Stamm P3HR1 oder UV-inaktivierter Virus), Lipopolysaccharide (LPS).

2) Die Progressionsstufe

Die Aktivierungsstufe induziert Rezeptoren für verschiedene Progressionssignale, wie: iL-2; B-Zellwachstumsfaktor Il oder TRF, nun als IL5 bezeichnet; niedermolekulares BCGF (12 K BCGF), sich von Namalwa herleitendes 6OK BCGF; Antikörper zu CD23 (ein p45-Protein ausgedrückt auf der B-Zellenoberfläche von IgM+, IgD+ Zellen, FcE-Rezeptor 2 (FcER2), Antikörper zu CD40, ein p50-Antigen, das hauptsächlich auf B-Zellen und Harnblasencarcinomzellen vorhanden ist, aber auch auf Hals- und Lungencarcinomzellen, außerdem IL-6 (bisher als B-Zellendifferenzierungsfaktor [BCDF] bezeichnet). Die nachfolgende Liste ist eine kurze Erklärung der in der vorliegenden Beschreibuno verwendeten Abkürzungen:

BCDF: B-Zellendifferenzierungsfaktor

BCGF: B-Zellenwachstumsfaktor

B-CLL: chronische lymphozytische B-Zellenleukämie

BSF: B-Zel'en stimulierender Faktor

C3d: Unterkomponente des Ergänzungsfaktors C3

CD 23: ein ρ 45-Protein ausgedrückt auf Zellen der B-Ly mphozytenlinie

CD40: ein p40-Protein ausgedrückt auf B-Zellen und auf Harnblasencarcinomzellen

EBV: Epstein-Barr-Virus

gp35: Glycoprotein 35K Molekulargewicht, zu der Gruppe CD20 (Differenzierungsgruppe) gehörig

gp140: Glyjoprotein ^OKMolekulargewichtmitCSd-Rezeptorfunktion

IgD: Im.nunoglobulinklasseD

IgM: ImmunoglobulinklasseM

IL-1,IL-2,IL-3,

IL-4.IL-5: Interleukin 1,2,3,4,5

LF¹S: Lipopolysaccharide

Molt4: eine sich von T-Lymphom herleitende Zellinie

p45: ein Membranprotein mit45K Molekulargewicht

PMA: 4-Phorbol-12-myristat-13-acetat

PWM: Poke-weed-Mitogen

SAC: Staphylus aureus-Cowan I

Pro ,.nA

in fester Phase: Protein A an eine Matrix (beispielsweise Sepharose) gebunden

TPA: Tumor föiderndes Mittel

TRF: T-Zellen ersetzend ,-aktor

T-T-Hybridom: ein somatisches Zellenhybriü zwischen zwei unterschiedlichen T-Zellen

TNF: Tumornecrosefaktor

MP6/Trx: Enzym derThioredoxinfamilie, erzeugt aus der MP6T-T-Hybridomzellenlinie

Von einem 12kDaB-Zellen stimulierenden Faktor (BSF), der von einem menschlichen Cd4⁺-T-Zellenhybrii!om (MP6) abgesondert wird, wurde bereits gezeigt, daß er das Wachstum normaler und bösartiger menschlicher B-Lymphozyten erleichtert. Es wurde nunmehr dieses Lymphokin gereinigt und als ein Glied der menschlichen Thioredoxinfamilie identifiziert und als MP6/Trx bezeichnet. Thioredoxin ist ein gut charakterisiertes Enzym, das Thiol-Disulfid-Wechselwirkungen und Proteindisulfidreduktionen über eine aktive Cys-Gly-Pro-Cys-Stelle katalysiert. Es werden normales peripheres Blut oder Mandel-B-Lymphozyten als Zielzellen für die Überwachung biologischer Aktivität verwendet. Aber monoklonale B-Zellen, B-Lymphoblastoidzellinien oder B-Zellen, die sich vom B-Typ chronischer lymphozytischer Leukämie (B-CLL) herleiten, waren Zielzellen par excellence, da sie beim Testen unter suboptimalen Zellkulturbedingungen für Cytokin-induzierte Proliferation und Differenzierung in vitro MP6/Trx benötigten.

Voraktivierte Zellen ergaben Proliferation in Reaktion auf das Wiedervereinigungsmittel oder neutrale Liganden: Interleukin 2 (IL-2), Interleukin4 (IL-4), niedermolekulares PCGF (LMW-BCGF), Tumornecrosefaktor-a (TNF-a) oder Anti-CD40, nur wenn MP6/Trx zugesetzt wurde. Antikörper zu Thioredoxin blockierten die Wirkung. Diese Ergebnisse spielen eine wichtige Rolle für extrazelluläres Thioredoxin in den regulierenden Fällen bei Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen und anschließender Signalübertragung bei normaler B-Zellenaktivierung und bei B-CLL-Leukemogenesis.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Behandlung solcher bösartig veränderter Zellen bei Säugetieren einschließlich Menschen, die empfindlich für die unten erwähnten Co-Faktoren und Thioredoxin sind. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man ei ,^ therapeutisch ausreichende Menge an Thioredoxin verabreicht. Wenn erforderlich, wird das Enzym nach einer Vorbehandlungsperiode mit einem Co-Faktor verabreicht, der in der Lage ist, die bösartig veränderten Zellen empfindlich für das Enzym werden zu lassen. Beispiele solcher Co-Faktoren sind in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführt. Es ist vorherzusagen, daß die Verabreichung des Enzyms Thioredoxin gleichzeitig mit dem Co-Faktor erfolgen kann.

Der Ausdruck „Thioredoxin", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, wird so verstanden, daß er die Thioredoxinenzymfamilie und Analoge von Thioredoxin einschließt, die die aktive Stelle Cys-Gly-Pro-Cys enthalten, insbesondere das Thioredoxin, das sich von der MP6-Zellinie herleitet.

Genauer kann das neue Behandlungsverfahren nach der Erfindung auf Stammzellens.örungen, Hämatopoetische Bösartigkeiten, wie beispielsweise Leukämie, B-Zellenleukämie und chronische lymphozytische B-Zellenleukämie und andere Tumoren angewendet werden, die Co-Faktorrezeptoren ausdrücken und auf Thioredoxin ansprechen. Beispielsweise kann Harnblasencarcinom, das das CD40-Antigen ausdrückt, potenziell in der beschriebenen Weise behandelt werden. Thioredoxin sowie die in der Tabelle I aufgeführten Co-Faktoren sind Substanzen, die als solche bekannt sind. Man weiß von ihnen aber in keinem Fall, daß sie therapeutische Brauchbarkeit besitzen.

Die Auswahl eines geeigneten Co-Faktors ist kein kritischer Parameter nach der Erfindung. Es sind experimentelle Methoden verfügbar, die es dem Fachmann ermöglichen festzustellen, ob ein spezieller in der Tabelle I aufgeführter Co-Faktor synergistisch mit dem Thioredoxin wirkt. Es ist jedoch bevorzugt, als Co-Faktor IL-2 zu verwenden. Auch IL-4 und TNF-a können als bevorzugte Co-Faktoren erwähnt werden.

Nach einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Thioredoxin für die Verwendung Dei der Behandlung bösartig veränderter Zellen bei Tieren und Menschen, insbesondere für die Verwendung bei selchen bösartig veränderten Zellen, die gegenüber Thioredoxin empfindlich sind. Auch nach diesem Aspekt wird, wenn erforderlich, Thioredoxin nach einer Vorbehandlungsperiode mit einem Co-Faktor, wie beschrieben, verabreicht, welcher in der Lage ist, bei den bösartig veränderten Zellen Empfindlichkeit für Thioredoxin zu induzieren. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von Thioredoxin bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von bösartigen Veränderungen. Ein solches Arzneimittel kann einen Co-Faktor, wie oben beschrieben, enthalten. Obwohl Thioredoxin sowie in der Tabelle I beispielhalber aufgeführte Co-Faktoren in der Technik bekannt sind, sind doch pharmazeutische Präparate, die Thioredoxin oder eine Kombination von Thioredoxin und einem Co-Faktor gemäß der Tabelle I enthalten, neu und stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.

Es ist vorauszusehen, daß bösartige Veränderungen, die für die Behandlung mit IL-2 empfindlich sind, wie bösartige Melanome, geeignete Ziele für die Behandlung mit Thioredoxin, zweckmäßig in Kombination mit einem Co-Faktor sind.

Es ist auch vorauszusehen, daß Zellimmunität (T-Zellen und NK-Zellen) durch Behandlung mit Thioredoxin, gegebenenfbüs in Kombination mit einem Co-Faktor, wie beschrieben, verstärkt werden kann.

In der klinischen Praxis werden Thioredoxin, Co-Faktoren oder Kombinationen hiervon in einer Weise verabreicht, die analog zur Verabreichung von Arzneimitteln für die Behandlung von Krebs ist. So erfolgt die Verabreichung vorzugsweise durch Infusion oder intramuskulär.

Die Menge, in welcher Thioredoxin und/oder Co-Faktoren verabreicht werden, variiert innerhalb weiter Grenzen und hängt von verschiedenen Umständen ab., wie von der Stärke der Erkrankung und dem Alter und dem Zustand des Patienten. Als ein Beispiel eines geeigneten Dosierungsintervalles kann eine Dosierung erwähnt werden, die einen Serum- oder Plasmaspisgel von Thioredoxin etwa vom 2- bis lOOfachen des natürlich auftretenden Thi jredoxin-Serum- oder Plasmaspiegel ergibt.

Die folgende Tabelle I zeigt eine Liste von Beispielen brauchbarer Co-Faktoren. Die Bezeichnung E bedeutet, daß der Co-Faktor hauptsächlich experimentell ist und möglicherweise für diagnotische Zwecke verwendet werden kann. Die Bezeichnung C bedeutet, daß der Co-Faktor klinische Verwendung hat.

Tabelle I Co-Faktoren

E Phorbolester,wieTPA

E Antigene

C Antiimunoglobuline (Antiidiotypen)

C Interleukin 1 und Unterkomponenten hiervon

C Interleukin 2 und Unterkomponenten hiervon

C lnterleukin 3 und Unterkomponenten hiervon

C lnterleukin 4 (BSF 1)

C Anti-IL4-Re?.eptor-Antikörper

E Poke-weed-Mttogen

E Lipopolysaccharide

E Epstein-Barr-Virus, nicht verändernd oder inaktiviert

C C3 d-Rezeptor (CD 11 c)- reaktive Mittel C und Antirezeptor (gp 140)-Antikörper

C Anti-gp35(CD20)

E SAC, inaktiviertes Staphylococcus aureaus-Cowan I

E Protein A in fester Phase

C Interferone (α, β und γ)

C Vitamine (besonders Vitam A, D und biologisch aktive Derivate)

C Leukotrienß4

C TNF-a

Das Enzym Thioredoxin, wie es bei der Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise menschlichen Ursprungs. Es ist ein Enzym, das Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen und Protein-Disulfid-Reduktionen über die aktive Stelle Cys-Gly-Pro-Cys katalysiert. Menschliches Thioredoxin stammt vorzugsweise aus menschlichen Lymphozyten, obwohl auch andere Quellen verwendet werden können. Auch die Verwendung von Thioredoxin aus Tieren einschließlich Säugetieren, procaryotischem Thioredoxin, duS man beispielsweise aus E.coli erhält, und Thioredoxinen, die durch genetisch erzeugte Außerungsvektoren produziert wurden, liegt innerhalb des Erfindungsgedankens.

Thioredoxin, das auch als Thioloxidoreductase bekannt ist, ist ein allgegenwärtiges 12-kDa-Protein mit einem redoxaktiven Disulfid (3). Es wird gewöhnlich durch NADPH und die Flavoprotein-Thioredoxinreductase reduziert. Reduziertes Thioredoxin ist ein Wasserstoffdonor für Ribonucleolidreductase, ein essentielles Enzym, das Deoxyribonucleotide für die DNA-Synthese erzeugt. Thioredoxin ist auch in regulierenden Fällen (3) eingeschlossen, wie bei der lichtabhängigen Aktivierung von photosynthetischen Enzymen im Chlcoplast von Pflanzenzellen (4) und der Aktivierung von Glucocorticoidrezeptoren in einem Steroidbindungszustand (5). Thioredoxin reguliert die Enzymaktivität durch ThioUedoxsteuerung, die eine Reduktion von Proteindisulfiden mit einer Geschwindigkeit einschließt, die etwa 10⁶mal schneller als jene von Dithiotreitol (DTT) (3) ist. Säugetier-Thioredoxine wurden isoliert und gekennzeichnet (3,6). Die Verteilung wurde durch immunohistochemische Methoden studiert, und Thioredoxin erwies sich als verwandt mit der Proteinsekretion und als teilweise membranverbunden (6). In jüngster Zeit wurde ein Menschenthioredoxin-Gen von Wollman et al. geklont (7). Das Gen erwies sich als in aktivierten, nicht aber in ruhenden Lymphozyten ausgedrückt. Ursprünglich wurde von dem Thioredoxin berichtet, daß es ein IL-1-artiger Faktor ist, der von einer Epstein-Barr-Virus enthaltenden B-Zellinie stammt (7). Tagaya und Mitarbeiter (8) zeigten, daß der lL-2-Rezeptor/Tac-induzierende Faktor, der auch als Faktor (ADF) bezeichnet wird, welcher sich von Erwachsenen-T-Zellenleukämie (HTLV-1) herleitet, homolog zu oder identisch mit Thioredoxin aus der Analyse von c-DNA-Klon war. Die Erfindung zeigt neue biologische Funktionen für die Thioredoxin-Enzymfamilie und dehnt deren Rolle in der Lymphozytenaktivierung aus.

Zielzellen in klinischen Situationen sind alle bösartig veränderten Zellen, die auf Thioredoxin, insbesondere MP6/T:.<, durch Differenzierung reagieren können, wie alle jene bösartigen Zellen, die veranlaßt werden können, Bindungsstelle für Thioredoxin auszudrücken und auf dieses zu reagieren. Eine solche Veranlassung kann durch die Co-Faktornn, die in der Tabelle I beschrieben sind, oder durch andere Mittel erfolgen.

Ausführung sboisplole

Das MP6 ist ein CD4⁺ T-Helferzellenhybridom, das bereits isoliert und geklont wurde (9). Das MP6-Klon scheidet einen 12-14 kDa B-Zellenstimulierungsfaktor (BSF-MP6) ab, der Proliferation und IgM/lgG-Abscheidung in normalen (9,10) sowie in bösartigen voraktivierten B-Zellen vom chroniscchen lymphozytischen B-Leukämietyp (B-CLL) (11) einleitet. Der IL-2-Rezeptorausdruck wurde auch durch BSF-MP6 verstärkt (12). Kishimoto und Honjo et al. demonstrierten, daß mRNA aus MP6-Zellen nicht mit cDNA-Sonden für IL-Ia, IL1 -ß, IL-4, IL-5 noch für IL-6 hybridisiert (12). Unter Verwendung verschiedener Zeliproben zeigt sich, daß das oben schwimmende MP6 keine Aktivitäten von LMW-BCGF, TNF-a und -ß, IFN-a, -β, -γ, Granulozyt-Monozytkoloniestimulierenden Faktoren (GM-CSF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 und IL-6 hatte (9).

In den in den Figuren 1A und 1B wiedergegebenen Experimenten wurden monoklonale Zellen benutzt, die sich von einem Patienten mit B-CLL herleiteten. Dieser Klon (I83) repräsentiert G₀-gehemmte B-Zellen, die zur Differenzierung gegebenenfalls verbunden mit Proliferation je nach den co-stimulierenden Signalen (11) bei Aktivierung mit ^-O-Tetradecanoylphorbol-IS-acetat (TPA) oder durch Staphylococcus aureus-Cowan I (SAC) veranlaßbar sind. 183-Zellen wurden mit SAC zwei Tage voraktiviert, um durch Antigen ausgelöste Signale zu kopieren, oder sie wurden durch eine suboptimale DosU von TPA (1,6 χ 70"' M) während einer Stunde voraktiviert. Die Zellen waren widerstandsfähig gegen das Kombinationsmittel oder natürliche B-Iymphotrope Lymphokine rlL-1 ß, rlL-2, rlL-4, rlL-6, rTNFa, LMW-BCGF, rlFN-γ, Anti-CD40 oder Kombinationen hiervon. SAC-aktivierte Zellen reagierten jedoch auf die Lymphokine rlL-2, rTNFa, LMW-BCGF, wenn BSF-MP6 zugegeben wurde (Figur 1 A). Der Signalweg für SAC und TPA ist verschieden, da TPA ein nicht physiologisches Signal liefert, das direkt Proteinkinase C aktiviert und die Zellen in den Zellkreislauf bewegt. Figur 1 B erläutert, daß TPA-aktivierte Zellen auf BSF-MP6 alleine reagierten und daß die Kombinatioen von BSF-MP6 mit mehreren verschiedenen B-Lymphokinen keine weitere DNA-Synthese steigerten. Die Ausnahmen sind IL-4 und DNF-a, die wesentliche Steigerung zeigten. Dies steht in Übereinstimmung mit jüngsten Feststellung Jn, daß DNF-a ein autokriner Wachstumsfaktor für menschliche B-Zellen ist (14), und weiterhin wurde kürzlich in einer Reihe von Experimenten gozeigt, daß IL-4 stark synergistisch mit BSF-MP6für die Einleitung der DNA-Synthese und für die IgM-Abscheidung in TPA-aktivierten Zellen ist (11).

Ein stark spezifischer Radioimmunoassay für menschliches Thioredoxin (13) (Figur 2) zeigt, daß der BSF-MP 6-Faktor homolog zu Thioredovin oder einem Thioredoxinanalogen ist, wie bereits beschrieben wurde.

S6rumfreies Medium von 24 Stunden konditioniertem Medium MP6 enthielt 34 ng/ml Thioredoxin. Biologische Aktivität wurde unter Verwendung des 183 B-CLL-Klons oder normaler Hals-B-Zellen festgestellt und war auf den 12-kDa-Bereich in den Gelfiltrationsexperimenten beschränkt. Säuget'ierthioredo:'ine bilden nach Luftoxidation außerstrukturelle intramolekulare Disulfidbindungen, die zu einer Inaktivierung und Aggregation führen (6). Während der Reinigungsverfahren und der Lagerung wurden Präparate von BSF-MP6 auch leicht durch atmosphärischen Sauerstoff unter Aktivitätsverlust oxidiert. Wenn diese Tatsache realisiert wurde, wurde begonnen, die B-CLL-Aktivierungsexperimente mit einer suboptimalen Dosis von 0,1 μΜ ß-Mercaptoethanol, das während dieser Züchtungsperiode vorhanden war, durchzuführen. Höhere Konzentrationen von ß-Morcaptoethanol (50-200μΜ) förderten jedoch eine Steigerung der DNA-Synthese in sich selbst. Wachstumsstimulierung von leukemischen Zellen durch Thiole und Disulfide in vitro ist ein bekanntes Phänomen (22). Figur 3 demonstriert die Wiederherstellung der vollen biologischen Aktivität in einem acht Monate slten und inaktiven BSF-MP6-Präparat nach Inkubation mit DTT. Die Beobachtung, daß BSF-MP6 durch Reduktion wiederbelebt werden konnte, ist ein typisches Merkmal von Thioredoxin (6). Die Probe (serumfreies steriles, 24 Stunden konditioniertes Medium von bei +4°C gelagertem MP6) wurde 30 Minuten bei 37 ⁰C mit 2 mM DTT vor der HPLC-Gelfiltration reduziert. Fast die gesamte biologische Aktivität wurde in dem 12-kDa-Bereich zurückgewonnen.

Die Erkenntnis aus dem Radioimmunoassay und den Wiederherstellungsexperimenten, daß BSF-MP6 homolog zu Thioredoxin oder einem Thioredoxinanalogen, wie beschrieben, ist, war Anlaß zu demonstrieren, ob Thioredoxin aus einer anderen Quelle BSF-MP6 im biologischen Versuch ersetzen kann. Aus Plazenta stammendes homogeriöo ι .-.cr.cchliches Thioredoxin (13) wurde in einer Konzentration von 0,5 χ 10"⁷M bis 0,5 x 10"¹⁴M getestet und zeigte biologische Aktivität bis herab zu 0,5 χ 10"⁹M. Die Testergebnisse finden sich in der nachfolgenden Tabelle II.

Die B-CLL-Zellen 2 wurden mit SAC 1:100000 und IL-2 10U/ml vorbehandelt. 3H-Thy wurde während wenigstens 18 Stunden während einer 72stündigen Inkubationsperiode zugegeben. In Tabelle Il ist ersichtlich, daß das Thioredoxin hochaktiv war. Tabelle II. Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Thioredoxin aus Menschenplazenta.

Thioredoxin DNA-Synthese

(M) 3H-Thymidin-Einführung

(cpm)

0,5 x 10~⁷ 6327

Kontrollmedium 1240

Biochemische Charakterisierung dieser sich von Thioredoxin herleitenden T-Helferzelle erfolgte durch Immunosorbens-Affinitätschromatographie mit an Sepharose gebundenen Schaf-Antithioredoxinantikörpern in Verbindung mit HPLC-Gelfiltration. Dieses Verfahren ergab hochgereinigtes Thioredoxin, wie in Figur 4 ersichtlich ist. Das Ausgangsmaterial war 24-Stunden-MP6-serumfreies Medium. Das SDS-PAGE-Gelbild bestätigt die Reinheit und das Molekulargewicht des affinitätsgereinigten Materials.

Für das Verständnis der B-Zellendifferenzierung wurde die klonale Bösartigkeit von B-CLL als ein sehr brauchbares Modell gefunden (11). Die geringe Proliferationsfähigkeit von B-CLL in vivo könnte teilweise das Ergebnis eines Mangels an Wachstumsfaktoren, die von autologen Nicht-B-Zellen erzeugt werden, sein. BSF-MP6/Thioredoxin ist gemäß dem hier vorl" genden Beweis eines der fehlenden Bindeglieder. Der Beweis, daß BSF-MP6 mit seinerThioredoxinaktivität ein geeignetes Ansprechen auf aus T-Zellen stammendes IL-2, IL-4, LMW-BCGF und TNF-a erleichtert, liefert erstmalig eine mögliche Erklärung für die Wachstumshämmung von B-CLL-Zellen. Die allgemein bekannte Dys-Regulierung von T-Helferlymphozyten in B-CLL-Patienton (15) könnte zu einem Verlust von Thioredoxinproduktion führen, die für die Aktivierung der B-CLL-Zellen erforderlich ist, wie durch die vorliegenden Ergebnisse gezeigt ist. Alternativ könnten die B-CLL-Zellen selbst einen Mangel an autokrinem Thioredoxin haben oder eine Anfangsdosis von von außen zugeführten Thioredoxin erfordern, um ihre autokrine Produktion einzuleiten.

Die Auffindung der Identität zwischen Thioredoxin und einem B-Zellensimulationsfaktor spricht stark für eine entscheidende immunologische Rolle dieses Enzyms. Es erleichtert eine geeignete Signalumwandlung, und die bekannte Funktion des Enzyms, Thiol-Disulfidwechselreaktionen zu katalysieren, kann (3) vermutlich zulassen, daß dynamische dreidimensionale korrekte Rezeptorabschwächungen stattfinden, obwohl, um Erkenntnisse bezüglich des genauen Mechanismus zu bekommen, weitere Studien erforderlich sind.

Ein brauchbares Modellsystem in vitro für Studien von B-Zellenwachstum und differenzierungssteuernden Signalen war der menschliche B-lymphotrope Herpesvirus Epstein-Barr-Virus (EBV), da er Proliferation und Differenzierung hervorruft (16), indem Gene vorliegen, die für B-Zellwachstum notwendig sind (17). Die B-CLL-Zellen erwiesen sich jedoch als widerstandsfähig gegenüber Versuchen von EBV-Veränderung, und eine mögliche Erklärung für diese Widerstandsfähigkeit könnte in der Tatsache gefunden werden, daß B-n.L-Zellen außer ihrem geringen Ausdrücken von EBV-Rezeptoren (CD21) mangelhaft in ihrem Thioredoxin-Genausdruck sei., könnten, wie in diesem Bericht und durch eine vorausgehende Immunofluoreszensanalyse gezeigt. Zellthioredoxin wurde in jüngster Zeit als ein Hauptwasserstoffdonor für Herpesvirus vom Simplextyp 1-codierte Ribonucleotidreductase vorgeschlagen (18). So könnte ein Mangel ein Thioredoxin in den B-CLL-Zellen eine wirksame Blockierung der Herpesvirusvermehrung in jenen Zellen sein.

Therapieverlauf

1) Thioredoxin selbst, besonders MP6/Trx, sollte verabreicht weiden, venn bösartige Zellen boioits Bindungsstellen für Thioredoxin ausdrücken.

2) Thioredoxin plus Verbindungen gemäß Tabelle I sollten in Kombination miteinander verabreicht werden, wenn die bösartigen Zellen keine Bindungsstellen für Thioredoxin ausdrücken. Dies schließt jede der speziellen aufgeführten Verbindungenein.

Es folgt nun eine Beschreibung der Figuren der Zeichnungen.

Figuren 1Aund 1B

MPC ergibt Signale für DNA-Synthese.

Zellen, die sich von dem B-CLL-Klon 183 herleiten, welcher in flüssigem Stickstoff gefroren genommen wurde, wurden wiederbelebt und zu DNA-Synthese (Figur 1A und 1 B) und Immunoglobulinabscheidung (Werte nicht gezeigt) entweder mit SAC (Figur 1 A) oder mit TPA (Figur 1 B) als aktivierende Signale induziert. Um Proliferation und Differenzierung mit SAC einzuleiten, wurden Zellen mit fixierten Bakterien zwei Tage inkubiert und dann 100U/ml rekombinierenden Interleukinen oder neutralen B-Zell-Cytokinen mit oder ohne 25% BSF-MP6 (Volumen/Volumen) ausgesetzt. Zellen wurden in flatten mit flachem Boden und 96 Vertiefungen als 0,2-ml-Kulturen (4 χ 10⁵ Zellen/Vertiefung) oder 2-ml-Kulturen (4 χ 10^eZellen/Vertiefung) (Cos' r, Cambridge, MA) in RPMI 1640-Medium (Flow Laboratories, Ayshire, GB), ergänzt mit 10% Serum von neugeborenen Kälbern (Gibco, Glasgow, GB), 2mM L-Glutamin, 50pg/ml Gentamycin, 100IU/ml Penicillin und 10(^g/ml Strepomycin, gezüchtet. Die Zellen wurden sechs Tage bei 37°C in einer Luft isphäre mit 5% CO₂ gezüchtet. Die DNA-Synthese wurde gemessen, wobei die Einführung von 1 pCi (= 37 kBq) je Vertiefung an mit Tritium behandeitern Thymidin (l³H]dThd; spec. act. 6,7 Ci/mMol; Dupont Scandinavia, Stockholm, Schweden) während der letzten 20 bis 24 Stunden der Züchtungsperiode geprüft wurde.

Durch Hitze inaktivierte, mit Formalin fixierte SAC-Teilchen wurden bei einer Endkonzentration von 0,1 % verwendet. TPA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde in einer Konzentration von 1,6 χ 10"⁷M verwendet. BSF-MP6 verwendet. BSfMP 6 wurde aus serumfreien 24-Stunden-Kulturen des MP6 T-Zellhybridom erhalten, das in Iscoves-Medium gezüchtet wurde, welches mit 400μg/ml BSA (Boehringer-Mannheim, Mannheim, West-Deutschland), 12^g/ml Menschentransferrin (Kabi, Stockholm, Schweden), 50 μΜ ß-Mercaptoethanol, 2mM L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin ergänzt war. Es wurde auf einer Amicon-Vorrichtung mit einem YM 2-Filter konzentriert. rlL-2 wurde von Amgen (Amersham, Amersham, GB) bezogen. rlL-1 β (Genzyme, Boston, MA) hatte eine spezifische Aktivität von 10³ U/mg und wurde mit 10 U/ml verwendet. rlL-4 wurde von Genzyme (Boston, MA) bezogen und mit einer Endkonzentration von 100U/ml verwendet. rlL6 war ein Geschenk von Dr. Kishimoto, Osaka, Japan, und wurde mit 100U/ml verwendet. Rekombinierendes TNFa mit einer spezifischen Aktivität von 6 χ 10⁷U/mg wurde mit 100ng/ml verwendet und war ein Geschenk von Dr. G. R. Adolf, f-rnst Boehring Institut (Wien, Österreich). LMW-BCGF wurde von Cellular Products (Buffalo, NY) bezogen und in einer Konzentration von 10% (Volumen/Volumen) verwendet. Monoklonales Anti-CD40 (G28-5Mab), das in einer Konzentration von 1 pg/ml verwendet wurde, war ein Geschenk von Dr. E. Clark (Seattle, WA). rlFN-γ wurde von Genentech (San Fransisco, CA) erhalten. Es hatte eine spezifische Aktivität von 3 χ 10⁷U/mg und wurde mit 500 U/ml verwendet.

Figur 2

Radioimmunoassay für Thioredoxin zeigt Identität zwischen BSF-MP6 und Thioredoxin. Die ausgezogene Linie zeigt reines menschliches Plazenta-Thioredoxin. Die gestrichelte Linie zeigt BSF-MP 6. Der Radioimmunoassay wurde, wie früher beschrieben (13), kurz folgendermaßen durchgeführt: 0,1 ml (0,2pMol) von '"!-markiertem menschlichem Plazenta-Thioredoxin wurde mit 0,1 ml Standardmenschenthioredoxin oder einer unbekannten Probe (oben schwimmendes MP6 durch Ammoniumsulfatausfällung 50fach konzentriert), in Serie verdünnt und 0,1 ml (5pg) der IgG-Fraktion eines Kaninchenantiserums gegen Menschenthioredoxin bei 37°C unter Schütteln während vier Stunden inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde 0,1 ml eines auf 1:5 verdünnten Schaf-Antikaninchen-lgG-Antiserum zugegeben, und die Inkubation wurde 16 Stunden bei 4°C fortgesetzt. Die gebundene Radioaktivität (B) wurde von der freien (F) durch Zentrifugieren während 30 Minuten mit 10000 G und anschließende sorgfältige Entfernung des oben schwimmenden getrennt. Die Radioaktivität wurde im Pellet und in den oben schwimmenden Fraktionen unter Verwendung eines LKB-Gammazählers (Bromma, Schweden) gemessen. Das Verhältnis B/F wurde berechnet und gegen verschiedene Standardthioredoxinkonzentrationen aufgetragen. Die Reaktionen in Abwesenheit von konkurrierendem Menschenthioredoxin und des Kaninchen-Antimenschenthioredoxinantikörpers wurden als Negativkontrollen verwendet. Die Radioiodierung von Thioredoxin wurde gemäß dur Chloramin-T-Methode (13) durchgeführt. Alle Verdünnungen und Inkubationen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem Gehalt von 1 mg/ml BSA durchgeführt.

Figur 3

Wiederherstellung von BSF-MP6-Aktivität durch Reduktion mit DTT.

Die biologische Aktivität von BSF-MP 6 konnte durch Reduktion, wie oben gezeigt, zurückgewonnen werden. Der Thioredoxin ausdrückendeT-Hybridomklon MP6wurde 24 Stunden in Iscoves-Medium gezüchtet, das400Mg/ml BSA, 12^g/ml Menschentransferrin, 50μΜ ß-Mercaptoethanol, 100μg/ml Streptavidin und 100U/ml Penicillin sowie 2mM L-Glutamin enthielt, doch die biologische Aktivität des oben Schwimmenden ging nach zwei Wochen Lagerung bei +4⁰C verloren. Das Chromatogramm zeigt das Proteinprofil gemessen bei ^OD205nm (voller Maßstab: A = 0,5) von 200μΙ MP6-oben schwimmendem, vorbehandelt mit zwei mM DTT, dann getrennt auf einer Superose-12-FPLC-Gelfiltrationssäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden), äquilibriert mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH7,2. Die Fließgeschwindigkeit war O,4ml/Minute. Fraktionen von 2ml wurden gesammelt und hinsichtlich der biologischen Aktivität auf B-CLL-Zellen oder auf normalen Hals-B-Zellen durch Messung der [³H-]-Thymidineinführung geprüft, wie durch die vertikalen Balken in dem Chromatogramm angezeigt ist. Die angegebenen Molekulargewichtsmarkierungen waren Rinderserumalbumin (68K) und RibonucleaseA(13,7K).

Figur 4

Chromatogramm auf BSF-MP6, gereinigtauf Antithioredoxin-Affinitätssäule plus HPLC-Gelfiltration.

HPLC-Chromatographie wurde auf Material durchgeführt, das gebunden und von einer Schaf-Antithioredoxin-Sepharose-ProteinA-Säule(1,5 χ 6cm), gekoppelt wie oben beschrieben (21), eluiert wurde. Fraktionen von 1 mm wurden aufgefangen.

Äquilibrierungspuffer war PBS entlüftet in He₂. Der erste Peak bei 12 kDa enthält die biologische Aktivität. Der zweite Peak ist Salz.

Ein Salz von SDS-Polyacrylamidgel:

Ein SDS-Polyacrylamidminigel mit einem Gradienten von 8 bis 25% (Pharmacia Phast-Gelsystem) wurde für die Analyse der Reinheit verwendet. Die Proben sind von links nach rechts: MP6-serumfreies oben Schwimmendes vor der Affinitätssäule, durch

Affinität gereinigtes BSF-MP6/Thioredoxin, menschliches Plazentathioredoxin, Molekulargewichtsmarkierungen (Pharmacia) von oben nach unten: 92,5kDa, 67 kDa, 45kDa, 30,1 kDa, ίθ,1 kDa, 14,7 kDa.

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Claims

1. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff Thioredoxin oder wenigstens ein Thiorodoxinanaloges, die die aktive Stelle Cys-Gly-Pro-Cys enthalten, umfaßt.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Thioredoxin MP6/Trx enthält.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Thioredoxin tierischen Ursprungs, menschlichen Ursprungs, procyryotischen Ursprungs oder aus Rekombination enthält.

4. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es Thioredoxin von menschlichen Lymphozyten oder anderen menschlichen Ursprungs enthält.

5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Co-Faktor enthält, der in der Lage ist, bösartig veränderten Zellen Bindungsstellen fürThioredoxin oderThioredoxinanaloge zu verleihen.

6. Arzneimittel naci*. Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens einen der folgenden Co-Faktoren enthält:

(a) Antiimmunoglobuline (Antiidiotypen),

(b) Interleukin 1 und Unterkomponenten hiervon,

(c) Interleukin 2 und Unterkomponenten hiervon,

(d) Interleukin 3 und Unterkomponenten hiervon,

(e) Interleukin 4 (BSF 1),

(f) Anti-IL4-Rezeptorantikötper,

(g) C3d-Rezeptor (CD11 c)-reaktive C'-Mittel und Antirezeptor (gp 140)-Antikörper, (h) Anti-gp35(CD20),

(i) Interferone (alfa, beta und gamma),

(j) Vitamine,

(k) LeukotrienB4und

(I) TNF-a.

7. Arzneimittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es als Co-Faktor lnterleukin-2 enthält.