HUT62932A - Process for producing pharmaceutical compositions comprising thioredoxin - Google Patents

Description

A találmány tárgya a B-limfocitás leukémiák - valamint bizonyos egyéb rosszindulatú megbetegedések - új típusú kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására vonatkozó eljárás, beleértve a beteg saját citotoxikus sejtjei által felismert felületi struktúrákat kifejlesztő ráksejtekre érzékeny limfociták reakcióképességének fokozására irányuló módszerek során alkalmazott gyógyszerkészítmények előállítására vonatkozó eljárást is. Az ide sorolható daganatos megbetegedések a rosszindulatú festékes bőrdaganat (melanoma malignum) és a vastagbélrák.

A WO 88/06891 számon közzétett PCT bejelentésből ismert, hogy a B-sejtek növekedési (szaporodási) faktorai - és az azokat utánozni képes antitestek - felhasználhatók bizonyos rosszindulatú megbetegedésekben, a sejtek differenciálódásának kiváltására. Találmányunkban az ilyenfajta differenciálódás előidézésére egy olyan enzim alkalmazását javasoljuk, mely a tioredoxin enzimcsaládba tartozik, éspedig az MP6 sejtvonalból származó tioredixonét (MP6/Trx). Ez az enzim használható önmagában, illetve bizonyos kofaktorokkal kombinált formában is.

A ráksejtekre jellemző a korlátlan mértékű szaporodás. Bizonyos idő óta ismeretes az a felfogás, hogy ezek szaporodása gátolható oly módon, hogy valamilyen módon előidézzük nem-proliferatív stádiumban lévő sejtekké történő differenciálódásukat. Már klinikai vizsgálatokat is végeztek - különböző leukémia-típusokban szenvedő betegeknél - bizonyos, differenciálódást kiváltó szerekkel, például vitaminokkal vagy interferonokkal. A fentieknél specifikusabb szaporodási és differenciálódást kiváltó faktorokkal, illetve antitestekkel - melyek csak meghatározott receptor-struktúrákra reagálnak - azonban eddig még nem végeztek vizsgálatokat. A találmány értelmében javasoljuk ilyen, specifikus tényezők alkalmazását a rák kezelése során, önmagukban, illetve valamilyen más, a hatást fokozó szerrel kombinálva.

A normális, egészséges sejteknek ráksejtekké történő átalakulása sok lépésből összetevődő folyamat. A malignus/rosszindulatú transzformáció folyamán egyes sejttípusok - például bizonyos B-limfociták (lásd az 1. irodalmi hivatkozást) - olyan képességre tesznek szert, hogy meghatározott növekedési (szaporodási) faktorokra reagáló receptorokat aktiválnak (receptor-expresszió), majd ezen növekedési faktorok hatására szaporodásuk vagy érésük meggyorsul. A tumorsejtek tehát fagyasztott állapotban vannak egy adott, jellegzetes differenciálódási stádiumban, melyre a felületi receptorok sajátos csoportja a jellemző. Ez a blokkoltság azonban nem irreverzibilis.

Találmányi leírásunkban bemutatunk egy olyan eljárást, melynek során valamely, a tioredoxin-csoportba tartozó enzim - vagy ugyanazon aktív helyet (Cys-Gly-Pro-Cys) tartalmazó tioredoxin-analógok, például a célstruktúrához kötődő monoklonális antitestek - önmagában vagy valamilyen kofaktorral (kofaktorokkal) együtt történő alkalmazására kerül sor, tovább nem osztódó, véglegesen differenciálódott sejtek (úgynevezett végsejtek) keletkezése céljából. A találmányi leírás ismerteti a megfelelő enzimet és kofaktorokat. A klinikai kezelés stratégiáját a B-sejtes krónikus limfocitás leukémiák (B-CLL - B-cell chronic lymphocytic leukémiás) példáján mutatjuk be, me lyekben olyan, további differenciálódást váltottunk ki (azaz érettebb stádiumba való eljutást), melyre a csökkent proliferációs (szaporodási) képesség és a plazmasejtszerű morfológia megjelenése a jellemző, azaz a felületi markerek, a citoplazma-immunglobulin és az endoplazmatikus reticulum.

Nyugvó B-sejtek esetében a kezdeti aktivációs jelzést

- melyet az antigén-immunglobulin (lg) kölcsönhatás vált ki - , finoman összehangolt receptor-ligandum jelzések sorozatának, valamint más, immunkompetens sejtekkel való sejt-sejt kölcsönhatásoknak (1) kell követniük ahhoz, hogy lehetővé váljék a végleges plazmasejt-érés. Az emberi B-sejtek szaporodását és differenciálódását szabályozó jelzések továbbításában szerepet játszó, számos receptor ligandumát sikerült már azonosítani és a géneket klónozni. Ezek közé tartoznak a következők: interleukin 1 (IL-1)-tői interleukin-6 (IL-6)-ig, alacsony molekulatömegű B-sejt növekedési faktor (LMW-BCGF - low molecular weight B cell growth factor), sCD23, limfotoxin (LT), tumor nekrózis faktor (TNF) és interferon-(f (IFN-fr) (1, 2).

Ahhoz, hogy megérthessük a differenciálódás elvén alapuló kezelésmód lényegét, meg kell ismernünk a normális sejtfejlődési folyamatot is. A csontvelőben a különböző, funkcionális szempontból specializálódott sejttípusok a multipotens őssejtek differenciálódásnak (bizonyos irányba való elkötelezettségének) eredményeképpen fejlődnek ki. E differenciálódási folyamat révén keletkeznek a különböző sejtvonalak (a B-sejtvonal, a T-sejtvonal, a mieloid sejtvonal) prekurzorai. Az unipotens sejteknek ezt követően végsejtekké történő fenotipiás változási folyamatát érésnek, illetve terminális (végső) differenciálódásnak nevezzük. A humán B-sejteknek a nyugvó stádiumból történő aktiválása - mely további differenciálódáshoz és éréshez vezet - , valamint a végső stádium legalább két lépésben lezajló folyamat.

1. Az aktivációs lépés jellemzője, hogy a sejteket aktiváló tényezők hatásának tesszük ki. A B-sejtvonalak esetében az ilyen faktorok a következők: antigének; anti-immunglobulinok (anti-idiotípusok); interleukin 1, 2 és 3, valamint ezek alkomponensei, interleukin 4 (IL4) és az IL4-receptorral szembeni antitestek; a C3d-receptorra (CDllc) ható reagensek, például a polimerizált 3d komplement, illetve a C3d receptorral szembeni antitestek (anti-gpl4O); anti-gp35 (CD2O). Forbol-észterek - például a TPA vagy a PMA - in vitro kísérletekben felhasználhatók ugyan, mint hatékony aktiváló szerek, ezek azonban csak modellnek tekinthetőek, mivel toxikusak és ezért klinikai használatra alkalmatlanok. A forbol-észterek a protein-kináz C-re hatnak (PKC - protein kinase C), és hatásuk hasonló a biológiailag aktív szerekéhez. Egyéb, a kísérletek során jól alkalmazhatónak bizonyult aktiváló (kompetencia-indukáló) szerek a következők: szilárd fázisú A-fehérje; inaktivált Staphylococcus aureus Cowan I (SAC); fehér zászpa/alkörmös mitogén (PWM - poke-weed mitogén); nem-transzformálódó, illetve inaktivált Epstein-Barr vírus (EBV) (a nem transz formálódó P3HR1 törzsből, illetve ultraibolya (UV) sugárzással inaktivált vírus) liposzaccharidok (LPS).

2. A progressziós lépés - Az aktivációs lépés különböző az alábbiakban felsorolt - progressziós jelzésekre vált ki receptor-indukciót: IL-2; B-sejt II növekedési (szaporodási) faktor vagy TRF - jelenlegi nevén IL5 - ; alacsony molekulasúlyú BCGF (12K BCGF); Namalwa eredetű 60K BCGF; a CD23-mal szembeni antitestek /p45 fehérje, mely az IgM+, IgD+ sejtek (B-sejtek) felületén és az FcE 2 receptoron (FcER2) jelenik meg/, antitestek a CD40-nel szemben, p50 antigén, mely főként a B-sejtekben és a hólyagrák sejtjeiben fordul elő, de megtalálható a méhnyak- és a tüdőrákos sejtekben is, továbbá az IL-6 (melyet korábban a B-sejt differenciálódási faktornak (BCDF) neveztek. Az alábbi lista rövid magyarázattal szol-

gál a	találmányi leírásban használt rövidítésekre:
BCDF:	B-sejt differenciálódási faktor
BCGF:	B-sejt növekedési (szaporodási) faktor

B-CLL: B-sejtes krónikus limfocitás leukémia

BSF:	B-sejt serkentő faktor
C3d:	a C3 komplement-faktor alkomponense
CD23 :	a B-limfocita sejtvonal sejtjein megjelenő p45 fehérj e
CD4O:	a B-sejteken és a hólyagrák sejtjein megjelenő p50 fehérje
EBV:	Epstein-Barr vírus
gp35:	35 kD molekulatömegű glikoprotein, mely a CD20-as csoportba tartozik (differenciálódási csoport-klasztér)
gpl4O:	140 kD molekulatömegű glikoprotein, C3d-receptor- funkcióval

IgD: D immunglobulin-osztály

IgM: M immunglobulin-osztály

IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5: interleukin 1, 2, 3, 4, 5

LPS: lipopoliszaccharidok

Molt4: T-limfoma eredetű sejtvonal p45: 45 kD molekulatömegü membránfehérje

PMA: 4-forbol-12-mirisztát-13-acetát

PWM: fehér zászpa/alkörmös mitogén

SAC: Staphylococcus aureus Cowan I

Solid phase protein-A: mátrixhoz (például Sepharose) kötött (szilárd fázisú protein-A

A-fehérje)

TPA: tumornövekedést serkentő faktor

TRF: T-sejtet helyettesítő faktor

T-T hibridóma: két különböző T-sejt között létrejött, szomatikus sejt-hibrid

TNF: tumor nekrózis-faktor

MP6/Trx: MP6 T-T hibridóma sejtvonal által termelt, a tioredoxin-csoportba tartozó enzim _z -p _{z z}

A humán CD4 T-sejtes hibridóma (MP6) áltál kiválasztott, 12 kDa-os B-sejt serkentő faktorról (BSF) korábban kimutatták, hogy gyorsítja a normális és malignus emberi B-limfociták szaporodását.

Sikerült ezt a limfokin anyagot tisztított formában előállítanunk, és azonosítanunk, mint a humán tioredoxin-család egyik tagját, és elneveztük MP6/Trx-nek. A tioredoxin egy olyan, igen jellegzetes enzim, mely katalizálja a tiol-diszulfid kicserélődési reakcióit, valamint a natúr fehérje-diszulfid redukciós folyamatokat, a Cys-Gly-Pro-Cys aktív • ···· ·· · ·· • · · · · * · • · ··· · · · · • · · · · · · ··· · ·· ··· ··

- 8 helyen. A biológiai aktivitás vizsgálata során célsejtekként normális perifériás vérből, illetve torokmandulából származó B-limfocitákat használtunk. A monoklonális B-sejtek, a B-limfoblasztoid sejtvonalak és a krónikus limfocitás leukémia B-típusából származó B-sejtek (B-CLL) a szó valódi értelmében vett célsejteknek tekinthetők, mivel MP6/Trx-et igényeltek a citokin által indukált in vitro proliierációhoz és differenciálódáshoz, szuboptimális sejtkultúra feltételei között vizsgálva.

Az előzetesen aktivált sejtek szaporodni kezdtek a rekombináns vagy természetes ligandumok hatására: interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), alacsony molekulatömegű BCGF (LMW-BCGF) , tumor nekrózis-faktor-<^ (TNF-P<) , illetve anti CD4O, csak abban az esetben, ha MP6/Trx-et adtunk hozzá.

A tioredoxin-antitestek blokkolták a hatást. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az extracelluláris tioredoxin fontos szerepet játszik azokban a szabályozó folyamatokban, melyek a receptor-ligandum interakciókra és az azt követő jelátalakításra, normális B-sejtek aktiválására és a B-CLL leukémia kialakulására jellemzőek.

A találmány tárgya olyan gyógyszerkészítmény előállítására vonatkozó eljárás, melynek segítségével újabb módszerrel válik lehetségessé az emlősök és az ember olyan, rosszindulatúan elfajult sejtjeinek kezelése, melyek érzékenyek az alábbiakban felsorolt kofaktorokra és tioredoxinra. A kezelési módszer lényege a tioredoxin terápiásán hatékony, megfelelő mennyiségben történő adagolása. Szükség esetén az enzimet egy olyan kofaktorral végzett előkezelési periódust követően alkalmazzuk, mely képes arra, hogy a maiig9 nus átalakulást szenvedett sejteket érzékennyé tegye az említett enzimre. Ilyen kofaktorokra említ példákat az 1. táblázat. A tioredoxin enzim adagolása történhet a kofaktorral egyidejűleg is.

A találmányi leírásban a tioredoxin kifejezés alatt a tioredoxin enzimcsaládot és azokat a tioredoxin-analógokat értjük, melyekben megtalálható a Cys-Gly-Pro-Cys aktív hely, előnyösen pedig az MP6 sejtvonalból származó tioredoxint.

Pontosabban, a találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítménnyel végzett kezelés végezhető őssejtes megbetegedésekben, vérképzőszervi rosszindulatő betegségekben, például leukémiákban, B-sejtes leukémiákban, B-sejtes krónikus limfocitás leukémiákban, valamint egyéb olyan daganatok esetén, melyekben kofaktor-receptorok jelennek meg, és amelyek reagálnak tioredoxinra. Például, a CD4O antigén expressziójával jellemezhető hólyagrák potenciálisan kezelhető ily módon. A tioredoxin, valamint az 1. táblázatban felsorolt kofaktorok olyan anyagok, melyek önmagukban ismertek. Nem minden esetben bizonyított azonban, hogy ezek az anyagok terápiás szempontból hasznosak lennének.

A megfelelő kofaktor kiválasztása nem tekinthető a találmány szerinti eljárás kritikus szempontjának. Vannak olyan kísérleti módszerek, melyek segítségével a gyakorlott szakember meg tudja állapítani, hogy az 1. táblázatban felsorolt, specifikus kofaktorok szinergista hatást fejtenek-e ki a tioredoxinnal együtt. Előnyösen alkalmaz10

ható azonban kofaktorként az IL-2. Szintén előnyös kofaktorként említhető az IL-4 és a TNF-</ is.

A találmány egy további, előnyös vonatkozása a tioredoxinnak állatok és emberek rosszindulatúan elfajult sejtjeinek kezelésére történő felhasználása, elsősorban olyan malignus sejtek esetében, melyek érzékenyek tioredoxinra. Ebben a vonatkozásban azt is meg kell említenünk, hogy - amennyiben szükséges - a tioredoxin adagolása történhet a fentieknek megfelelően - valamilyen kofaktorral végzett előkezelést követően is, mely képes arra, hogy a rosszindulatúan elfajult sejtekben kifejlessze a tioredoxin iránti érzékenységet. A találmány egy további vonatkozása a tioredoxinnak a rosszindulatú daganatok kezelésében alkalmazható gyógyszerkészítmények előállítása során történő felhasználására vonatkozik. Az ilyen típusú gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak valamely, a fentiekben ismertetett kofaktort is. Bár a tioredoxin, valamint az 1. táblázatban példákkal illusztrált kofaktorok ismertek a szakterületen jártas egyének számára, a tioredoxint, illetve a tioredoxin és valamely, az 1. táblázatban felsorolt kofaktor kombinációját tartalmazó gyógyszerkészítmények újdonságoknak tekinthetők, és a találmány egy további vonatkozását képviselik.

Láthatjuk tehát, hogy azok a rosszindulatú megbetegedések, melyek jól reagálnak az IL-2-vel végzett kezelésre - például a rosszindulatú festékes daganatok - , megfelelő célsejteknek bizonyulhatnak a tioredoxinnal végzett kezelés esetében, előnyösen valamilyen kofaktorral kombinált formában.

Azt is meg kell jegyeznünk, hogy a celluláris immunitás (T-sejtek és NK-sejtek) fokozható tioredoxinnal végzett kezeléssel, tetszés szerint valamilyen kofaktorral kombinált formában.

A klinikai gyakorlatban a tioredoxint, a kofaktorokat, illetve a kettő kombinációit hasonlóan adagolják ahhoz, ahogy a rák kezelésére használt gyógyszerkészítmények ismert módon való alkalmazása történik. Az adagolás tehát előnyösen infúzió vagy intramuszkuláris depókészítmény formájában végezhető.

A tioredoxin és/vagy a kofaktorok alkalmazott adagja igen széles tartományban változhat, külölböző feltételektől függően, mint például a betegség súlyossága és a beteg életkora, valamint állapota. Az előnyösen alkalmazható dózistartomány példájaként azt említhetjük, melynek adagolásával a szérum, illetve plazma tioredoxinszintje körülbelül 2-100-szorosa a normális körülmények között mérhető szérum-, illetve plazmaszinteknek .

Az 1. táblázatban az alkalmazható kofaktorokra sorolunk fel példákat. Az E betűvel való jelölés arra utal, hogy a kofaktor elsősorban kísérleti jellegű, és feltételezhetően alkalmas diagnosztikai célokra. A C megjelölés azt mutatja, hogy a kofaktor klinikai felhasználásra alkalmas.

1. táblázat

Kofaktorok:

E forbol-észterek, például a TPA

E antigének

C anti-immunglobulinok (anti-idiotípusok)

c	interleukin	1	és	alkomponensei
c	interleukin	2	és	a1komponensei
c	interleukin	3	és	alkomponensei
c	interleukin	4	(BSF1)

C anti-IL-4-receptor antitestek

E fehér zászpa/alkörmös mitogén

E lipopoliszaccharidok

E Epstein-Barr vírus, nem-transzformálódó, illetve inaktivált

C C3d receptor (CDllc) C' reaktív ágensek és anti-receptor (gp 140) antitestek

C anti-gp35 (CD20)

E SAC, inaktivált Staphylococcus aureus Cowan I

E szilárd fázisú A-fehérje

C interferonok (alfa, béta, gamma)

C vitaminok (előnyösen A- és D-vitamin, valamint biológiailag aktív származékaik)

C leukotrin B4

C TNF-g<

»· · * ·♦ · > · ··· · «·« « * · · · · · ··· · «ν ·*· ·«

- 13 A találmány szerinti eljárás során felhasznált tioredoxin előnyösen humán eredetű. A tioredoxin olyan enzim, mely katalizálja a tiol-diszulfid kicserélődési reakciókat és a natúr fehérje-diszulfid redukciós folyamatokat, a Cys-Gly-Pro-Cys aktív helyen. A humán tioredoxin előnyösen humán limfocita-eredetű, bár egyéb eredetű enzim is felhasználható. A találmány értelmében felhasználható az állati - beleértve az emlős - eredetű tioredoxin, a prokariota tioredoxin - melyet például E. coliból nyernek - , valamint azon tioredoxinok, melyeket a génsebészeti eljárásokkal előállított expressziós vektorok termelnek.

A tioredoxin - más néven tiol-oxidoreduktáz - mindenütt előforduló (ubiquitaer), 12 kD-os fehérje, mely redox-aktív diszulfidot tartalmaz (3); általában redukálódik NADPH és a flavoprotein tioredoxin-reduktáz hatására. A redukált tioredoxin hidrogén-donorként játszik szerepet a ribonukleotid-reduktáz esetében, mely nélkülözhetetlen enzim a DNS-szintézis során, a dezoxiribonukleotidok előállításában. A tioredoxin a szabályozó folyamatokban (3) is szerepet játszik, például a fotoszintézis enzimeinek fénytől függő aktiválásában, a növényi sejtek kloroplasztjában (4), valamint a glukokortikoid-receptoroknak a szteroid-kötési állapothoz szükséges aktiválásában (5). A tioredoxin az enzimaktivitást tio-redox kontroll útján szabályozza, melynek során a fehérje-diszulfidők redukcioja korulbeul 10 -szer gyorsabban történik, mint a ditiotreitolé (DTT) (3). Az emlős eredetű tioredoxinokat sikerült izolálni és jellegzetességeiket meghatározni (3, 6). Megoszlásukat immunhisztokémiai módszerekkel vizsgálják, és a tioredoxinról kimutatták, hogy összefüggésbe hozható a fehérje-szekrécióval, és részben a sejtmembránhoz kapcso• ·

- 14 lódik (6). Újabban Wollmannak és munkatársainak (7) sikerült klónozniuk az emberi tioredoxin-gént. A génnel kapcsolatban azt figyelték meg, hogy aktivált limfociták esetében megjelenik (gén-expresszió), nyugvó limfocitáknál azonban nem. Eredetileg a tioredoxint egy IL-l-szerű faktornak tekintették, melyet az Epstein-Barr vírust tartalmazó B-sejtvonalból nyertek (7). Tagaya és munkatársai (8) kimutatták, hogy az IL-2-receptor/Tac-indukáló faktor - melyet felnőtt T-sejtes leukémia (HTLV-1)-eredetű faktornak (ADF) is neveznek - hasonló vagy azonos volt a tioredoxinnal egy c-DNS-klón analízise során.

A találmány értelmében a tioredoxin enzimcsalád új biológiai funkciói kerülnek előtérbe, és szerepe kiterjed a limfocita aktiválásra is.

Célsejtek klinikai szituációkban

A célsejtek klinikai szituációk esetében mindig olyan, rosszindulatúan elfajult sejtek, melyek érzékenyek tioredoxinra - különösen MP6/Trx-re - , differenciálódással reagálnak, beleértve minden olyan malignus sejtet is, melyeknél tioredoxin kötőhelyek expressziója idézhető elő, és érzékenyek is e szerre. Az ilyenfajta indukció az 1. táblázatban felsorolt kofaktorokkal, illetve egyéb módon hozható létre.

Kísérletes bizonyíték

Az MP6 egy CD4⁺ T helper-sejt hibridóma, melyet korábban már sikerült izolálnunk és klónoznunk (9). Az MP6 klón egy 12-14 kDa-os B-sejt serkentő faktort (BSF-MP6) szekretál, mely proliferációt és IgM/IgG elválasztást idéz elő normái (9, 10), valamint B-típusú krónikus limfocitás leukémia (B-CLL) előzetesen aktivált, malignus B-sejtjeiben (11). A BSF-MP6 az IL-2 receptor expresszióját is fokozta (12). Kishimoto és Honjo, valamint munkatársaik kimutatták, hogy az MP6 sejtekből származó mRNS nem hibridizálódott a cDNS-mintákkal, IL-1C\, IL-1B, IL-4, IL-5, illetve IL-6 tekintetében (12). Különböző sejtszintű vizsgálatok segítségével azt mutattuk ki, hogy az MP6 felülúszó nem mutat LMW-BCGF, TNFo<, TNF-β, IFN-K, -B, fr- , granulocita-monocita kolónia-stimuláló faktor (GM-CSF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 és IL-6 aktivitást (9).

Az 1A és 1B ábrákon bemutatott kísérletekben B-CLL-ben szenvedő betegektől származó monoklonális sejteket használtunk. Ez a klón (183) olyan, G_q stádiumban maradt (rögzült) B-sejteket jelent, melyeknél differenciálódás, illetve proliferációval kísért differenciálódás indukálható, az egyidejűleg alkalmazott, stimuláló jelzések függvényében (11), amennyiben a sejteket 12-0-tetradekanoil-forbol-13-acetáttal (TPA) vagy Staphylococcus aureus Cowan I-gyel (SAC) aktiváltuk. Az 183 sejteket előzetesen SAC-aktiválásnak vetettük alá 2 napon keresztül, az antigén által kiváltott jelzések utánzása céljából, illetve 1 órán át _7

TPA szuboptimális dózisával aktiváltuk őket (1,6 x 10 M TPA).

A sejtek nem reagáltak egyik rekombináns vagy természetes B-limfotrop limfokinre, illetve kombinációikra sem az alábbiak közül: rIL-1/3, rIL-2, rIL-4, rIL-6_z rTNFa, LMW-BCGF, rlFN-f, anti-CD40. A SAC-aktivált sejtek azonban reagálnak a limfokinekre - rIL-2, rTNFa, LMW-BCGF - , amennyiben BSF-MP6-ot adunk hozzájuk (l.A ábra). A SAC és a TPA esetében különböző a jelzések hatásmechanizmusa, amennyiben a TPA egy olyan nem-fiziológiai jelzést hoz létre, mely közvetlenül aktiválja a protein-kináz C-t, megindítva a sejtekben a sejtciklust. Az l.B ábra azt szemléteti, hogy a TPA által aktivált sejtek az önmagában alkalmazott BSF-MP6-ra is reagáltak, és hogy a BSF-MP6 kombinációi néhány különböző B-limfokinnel nem fokozták tovább a DNS-szintézist.

Az IL-4 és a TNF-α kivételnek tekinthető, mert esetükben szignifikáns növekedés volt megfigyelhető. Ez összhangban áll azzal az újabb észleléssel, hogy a TNF-α autokrin növekedési faktor a humán B-sejtek esetében (14), és korábbi kísérletsorozatunkban kimutattuk, hogy az IL-4 erős szinergistája a BSF-MP6-nak a DNS-szintézis indukciója és a TPA-aktivált sejtek IgM szekréciója tekintetében (11).

A humán tioredoxinra erősen specifikus radioimmunoassay (13) (2. ábra) vagy hasonló (homológ), vagy azonos (analóg) a tioredoxinnal, amint azt a korábbiakban ismertettük.

A 24 órás kondicionált MP6-médium szérummentes közege 34 ng/ml tioredoxint tartalmazott. A biológiai aktivitás észlelése/követése az 183 B-CLL klón- vagy normális (torok) mandula eredetű B-sejtek felhasználásával történt, és a gélfiltrációs kísérletekben a 12 kDa-os területre korlátozódott.

Az emlős tioredoxinok - a levegőn történő oxidálódást követően - extrastruktúrális, intramolekuláris diszulfidkötéseket hoznak létre, ami inaktiváláshoz és aggregációhoz vezet (6).

A tisztítási eljárások és a tárolás folyamán a BSF-MP6 készítmények is könnyen oxidálódnak a levegő oxigénjének hatására, aminek következtében csökkent az aktivitás. Amikor ezt a tényt megfigyeltük, a B-CLL aktivációs kísérleteket oly módon kezdtük végezni, hogy a 0,1 μΜ-os /3-merkapto-etanolnak a szuboptimális dózisa került alkalmazásra a sejttenyésztési periódus folyamán. A /3-merkapto-etanol magasabb koncentrációi (50-200 μΜ) azonban önmagában a DNS-szintézisben fokozták a növekedést. Jól ismert jelenség a leukémiás sejtek szaporodásának in vitro körülmények között, tiolokkal és diszulfidokkal történő stimulálása (22). A 3. ábra egy 8 hónapos és inaktív BSF-MP6-készítmény teljes biológiai aktivitásának helyreállítását szemlélteti, DTT-vel végzett inkubálást követően. Az a megfigyelés, hogy a BSF-MP6 redukciós folyamattal aktiválható, jellegzetes tulajdonsága a tioredoxinoknak (6). A mintát (az MP6 +4 ’C hőmérsékleten tárolt, szérummentes, steril, 24 órán keresztül kondicionált médiumát) 30 percen keresztül redukáltuk 37 °C hőmérsékleten, 2 mM DTT-vel, a HPLC-gélfiltráció előtt. Szinte a teljes biológiai aktivitást a 12 kD-os területen lehetett visszanyerni.

A radioimmunassay és a rekonstrukciós kísérletek nyújtotta, arra vonatkozó bizonyítékok, hogy a BSF-MP6 hasonló vagy azonos a tioredoxinnal (tioredoxin-homológ vagy analóg) - amint azt korábban már ismertettük - , arra ösztönöztek minket, hogy meg vizsgáljuk, vajon a más forrásból származó tioredoxin helyettesítheti-e a BSF-MP6-ot a biológiai vizsgálat során. Placenta-eredetű, humán homogén tioredoxint vizsgáltunk — 7 —14

0,5 x 10 M - 0,5 x 10 M koncentrációban, és — 9

0,5 x 10 M koncentrációig (lefelé haladva) találtunk biológiai aktivitást.

A vizsgálati eredményeket a 2. táblázat szemlélteti.

A B-CLL-sejteket SAC 1:100.000 és IL 2 10 U/ml (E/ml) koncentrációjával előkezeltük. A 72 órás inkubációs periódus utolsó 18 órájában []-timidint ((^H)-Thy) adtunk hozzá. Amint azt a 2. táblázatból láthatjuk, a tioredoxin igen aktívnak bizonyult.

2. táblázat

A B-CLL-sejtek stimulálása humán placentából származó tioredoxinnal

Tioredoxin

IMI

0,5 x 10⁷ kontroll médium

DNS-szintézis r^Hl-timidin inkorporáció (cpm)

6327

1240

Ezen, T-helper sejtből származó tioredoxin biokémiai jellemzését/vizsgálatát immunoszorbens affinitásos kromatográfiával végeztük, Sepharose-hoz kötött juh-antitioredoxin antitestek segítségével, HPLC-gélfiltrációval kombinálva. Az eljárás eredményeként rendkívül tiszta tioredoxint nyertünk, amint azt

a 4. ábra mutatja. A kiindulási anyag 24 órás MP6 szérummentes médium volt. Az ábrába illesztett SDS-PAGE kép bizonyítja az affinitásos módszerrel tisztított anyag tisztaságát és molekulasúlyát .

A B-sejt differenciálódásának megértéséhez a B-CLL malignus kiónja igen hasznos modellnek bizonyult (11). A B-CLL alacsony szaporodási képessége in vivő körülmények között - legalábbis részben - annak lehet a következménye, hogy az autológ nem-B-sejtek nem termelnek elegendő mennyiségű szaporodási faktort. Az itt feltárt bizonyíték szerint a BSF-MP6/tíoredoxin az egyik hiányzó láncszem. Azon bizonyíték, hogy a BSF-MP6 - tioredoxin aktivitásával - elősegíti az IL-2, IL-4, LMW-BCGF és TNF-α eredetű T-sejtek megfelelő válaszreakciójának kialakulását, első ízben ad valószínűnek tűnő magyarázatot a B-CLL-sejtek szaporodásának leállására. A B-CLL-ben szenvedő betegek T helper limfocitáinak közismert működési zavara (15) azzal a következménnyel járhat, hogy megszűnik a B-CLL-sejtek aktiválásához szükséges tioredoxin-termelés, amint azt eredményeink mutatják. Másrészt viszont az is lehetséges, hogy magukban a B-CLL-sejtekben kevés az autokrin tioredoxin, illetve kívülről bevitt, kezdeti tioredoxin adagra van szükségük ahhoz, hogy beinduljon saját autokrin termelésük.

Az az általunk felismert tény, hogy a tioredoxin azonos a B-sejt serkentő faktorral, erősen amellett szól, hogy ez az enzim igen fontos immunológiai szerepet tölt be. Elősegíti a megfelelő jelátalakítást, és az enzim azon, jól ismert szerepe, hogy katalizálja a tiol-diszulfid kicserélődési reakciókat (3) feltételezhetően elősegíti a dinamikus, háromdimen20

ziós receptor-kötődési folyamat létrejöttét, bár még további vizsgálatok szükségesek ahhoz, hogy többet tudjunk meg ennek pontos mechanizmusáról.

A B-sejtek szaporodását és differenciálódását szabályozó jelzések vizsgálatához igen hasznos in vitro modellrendszernek bizonyult a humán B-limfocitás herpeszvirus (Epstein-Barr vírus) (EBV), mivel proliferációt és differenciálódást vált ki (16) azáltal, hogy beindítja a B-sejtek szaporodásához nélkülözhetetlen gének működését (17) . A B-CLL-sejtek azonban nem reagáltak az EBV-transzformációs próbálkozásokra; ezen rezisztencia egyik lehetséges magyarázata abban a tényben rejlik, hogy a B-CLL-sejtek - amellett, hogy csekély az EBV-receptorok (CD21) expressziója esetükben - , tioredoxin génexpreszsziójuk is csökkent mértékű lehet, amint erre a találmányi leírásunk, valamint előzetesen végzett immunfluoreszcenciás vizsgálataink is utalnak. A celluláris (sejt-) tioredoxint újabban a legfőbb hidrogéndonorként említik a herpeszvírus (herpes simplex vírus) 1 típusának kódolt ribonukleotid-reduktáz enzime esetében (18). Ily módon tehát a tioredoxin hiánya a B-sejtekben hatékonyan blokkolhatja ezen sejtekben a herpeszvírus szaporodását.

A kezelés stratégiája

1) A tioredoxint önmagában - előnyösen MP6/Trx-et - akkor kell adagolni, amikor a rosszindulatú sejteken már megjelentek a tioredoxin kötőhelyek (kötőhely-expresszió).

··«· ·· · ·· • · · · · • ··· · ···

2) A tioredoxin és az 1. táblázatban felsorolt vegyületek kombinációinak adagolására előnyösen akkor kerüljön sor, ha a malignus sejteken nem jelennek meg tioredoxin-kötőhelyek (nincs receptor-expresszió). A fent elmondottak minden, a táblázatban felsorolt vegyületre vonatkoznak.

Ábramagyarázatok

l.A és 2.B ábra

Az MP6 a DNS-szintézisre vonatkozó jelzéseket indukál.

Az 183 B-CLL kiónból származó sejteket - folyékony nitrogénben lefagyasztva tartva - aktiváltuk, és DNS-szintézist (l.A és l.B ábra), valamint immunglobulin-elválasztást (erre vonatkozó adatok nincsenek feltüntetve) idéztünk elő SAC (l.A ábra) vagy TPA (l.B ábra) aktiváló jelzések alkalmazásával. A SAC által indukált sejtszaporodás és differenciálódás érdekében a sejteket 2 napon keresztül meghatározott baktériumokkal inkubáltuk, majd 100 NE/ml (U/ml) rekombináns interleukin vagy természetes B-sejt-citokin hatásának tettük ki, 25 térfogatszázaléknyi BSF-MP6 jelenlétében, illetve anélkül. A sejtek tenyésztése lapos aljú, 96 vájatot tartalmazó Petri-csészékben történt, éspedig 0,2 ml-es (4 χ 10⁵ sejt/vájat), illetve 2 ml-es (4 χ 10θ sejt/vájat) kultúrákban (Costar, Cambridge, MA), RPMI 1640 médiumban (Flow Laboratories, Ayshire, GB), 10 %-nyi újszülött borjú-szérum (Gibco, Glasgow, G. B.), 2 mM L-glutamin, 50 ^g/ml gentamicin, 100 NE/ml (IU/ml) penicillin és 100 yug/ml streptomycin jelenlétében. A sejteket 6 napon keresztül 37 °C hőmérsékleten te ·

nyésztettük 5 %-os széndioxidtartalmú atmoszférában. A DNS-szintézis mérése oly módon történt, hogy vágatonként meghatároztuk 1 pCi (= 37 kBq) tritiummal jelzett timidin inkorporációját ([ HJdThd; specifikus aktivitás 6,7 Ci/mmol; Dupont Scandinavia, Stockholm, Svédország), a tenyésztési periódus utolsó 20-24 órája folyamán.

Hővel inaktivált, formalinnal fixált SAC-részecskéket használtunk, 0,1 %-os végső koncentrációban; TPA-t (Sigma Chemical _ 7

Co., St. Louis, MO) használtunk 1,6 x 10 M koncentrációban;

BSF—MP6—ot oly módon állítottunk elő, hogy MP6 T-sejt hibridóma szérummentes, 24 órás tenyészetét olyan Iscove táptalajban szaporítottuk, melyet 400 //g/ml BSA-val (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Németország), 12,5 ^g/ml humán transzferinnel (Kabi, Stockholm, Svédország), 50 pm β-merkapto-etanollal, 2 mM L-glutaminnal, penicillinnel/streptomycinnel kiegészítve, YM2 szűrővel ellátott Amicon-készüléken koncentráltunk. Az rIL-2-t az Amgen cégtől (Amersham, Amersham, G. B.) szereztük be. Az

O rIL-1/3 (Genzyme, Boston, MA) specifikus aktivitása 10 E/mg (U/mg) volt, és 10 U/ml-nyi koncentrációban alkalmaztuk. Az rIL-4-et a Genzyme-től szereztük be (Boston, MA) , és 100 E/ml-es (U/ml) végső koncentrációban alkalmaztuk. Az rIL-6-ot ajándékba kaptuk dr. Kishimototól (Osaka, Japán), és 100 E/ml-es koncentrációban használtuk fel. A 6 x 10 E/mg (U/mg) specifikus aktivitású rekombináns TNFa-t 100 ng/ml-es koncentrációban alkalmaztuk; ezt Dr. G. R. Adolftól (Ernst Boehringer Institute, Bécs, Ausztria) kaptuk ajándékba. Az LMW-BCGF-et a Cellular Products (Buffalo, NY) cégtől szereztük be, és 10 térfogatszázalékos koncentrációban használtuk fel. A monoklonális anti-CD40-et • · · · · • · · ··· · ·· ··· ·· (G28-5 Mab) 1 ^g/ml-es koncentrációban alkalmaztuk, és Dr. E. Clarktól (Seattle, WA) kaptuk ajándékba. Az rIFN-$-t a Genentech-től (San Francisco, CA) vásároltuk. Specifikus aktivitása 3 0 10⁷ E/mg (U/mg) volt, és 500 E/ml (U/ml) koncentrációban alkalmaztuk.

2. ábra

A tioredoxin radioimmunassay vizsgálata azt mutatta, hogy a BSF-MP6 azonos a tioredoxinnal.

A folytonos vonal a tisztított, humán placenta-eredetű tioredoxint, a szaggatott vonal pedig a BSF-MP6-ot jelzi.

A radioimmunassay-t a korábban ismertetett módon végeztük (13); ennek lényege a következő: 0,1 ml (0,2 pmol) ¹²⁵I-dal jelzett humán placenta-eredetű tioredoxint standard humán tioredoxin vagy ismeretlen minta (MP6 felülúszó, ammónium-szulfáttal végzett kicsapással 50-szeresre koncentrálva) 0,1 ml-ével inkubáltuk, sorozathigítást készítettünk, majd 0,1 ml (5 μρ) humán tioredoxin-ellenes nyúl antiszérum IgG-frakciót adtunk hozzá, és 37 ’C hőmérsékleten, rázás közben inkubáltuk 4 órán keresztül. Az inkubációs periódus végén 0,1 ml 1:5 higítású, juhban termeltetett nyúl-IgG-ellenes antiszérumot adtunk hozzá, és az inkubációt 16 órán keresztül folytattuk 4 °C hőmérsékleten. A kötött radioaktivitást (B) elkülönítettük a szabadtól (F) - 30 percen keresztül, 10.000 g fordulatszámmal végzett centrifugálással - , majd ezt követően óvatosan eltávolítottuk a felülúszót. A radioaktivitást mind az üledékben, mindpedig a felülúszó frakcióban megmértük, LKB gamma-számláló24 • ·«·· ·· · ·· • · · · · · · • · ··· * ··· • · · · · · ··· · ·· ·· · · · berendezés segítségével (Bromma, Svédország). Kiszámítottuk a B/F arányt, és különböző standard tioredoxin-koncentrációkkal szemben ábrázoltuk. Negatív kontrollként azokat a reakciókat használtuk, melyek a kompetitív humán tioredoxin és a nyúl anti-humán-tioredoxin antitestek (nyúlban emberi tioredoxin ellen termeltetett antitestek) hiányában megfigyelhetőek voltak. A tioredoxin radioaktív jóddal történő jelölését oly módon végeztük, ahogy azt a klomarin-T-módszer előírja (13). Valamennyi hígítást és inkubálást foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) végeztük, mely 1 mg/ml BSA-t tartalmazott.

3. ábra

A BSF-MP6 aktivitását DTT-vel végzett redukcióval rekonstruáltuk. Amint azt a korábbiakban már említettük, a BSF-MP6 biológiai aktivitása redukció révén visszanyerhető. A tioredoxin-expresszióval jellemezhető T-hibridóma klón MP6-ot 24 órán keresztül inkubáltuk Iscoves médiumban - mely 400 gg/ml BSA-t, 12,5 gg/ml humán transzferrint, 50 μΜ β-merkapto-etanolt, 100 Mg/ml streptavidint, 100 E/ml penicillint és 2 nM L-glutamint tartalmazott - , a felülúszó biológiai aktivitása azonban +4 ’C hőmérsékleten 2 hétig tartó tárolás hatására elveszett. A kromatogram az O₂₀₅ nm-nél mért fehérjeprofilt mutatja (teljes skála: A = 0,5), 200 μ! MP6 felülúszó esetében, melyet 2 mM DTT-vel előkezeltünk, majd steril, foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH = 7,2) equilibrált Superose-12

FPLC gélfiltrációs oszlopon (Pharmacia, Uppsala, Svédország) szeparáltunk.

Az áramlási sebesség 0,4 ml volt percenként. 2 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, majd, ezek biológiai aktivitását B-CLL-sejteken, illetve normális (torok)mandula-eredetű B-sejteken hatá3 roztuk meg, a [ H]-timidin inkorporáció mérésével, amint azt a kromatogram függőleges oszlopai mutatják. A feltüntetett molekulasúly-markerek a következők voltak: szarvasmarha-szérum-albumin (68K) és ribonukleáz A (13,7 K).

4. ábra

Anti-tioredoxin affinitásos oszlopkromatográfiával és HPLC-gélfiltrációval tisztított BSF-MP6 kromatogramja

HPLC-kromatográfiát végeztünk egy olyan anyagon, melyet juh-eredetü anti-tioredoxin Sepharose-protein A oszlophoz /1,5 x 6 cm; a kapcsolásra vonatkozólag lásd a korábbi közleményt (21)/ kötöttünk, illetve onnan leoldottunk (pH = 3,0-as értéknél). 1 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Az equilibráláshoz használt puffer héliumgázzal légtelenített PBS volt. A biológiai aktivitást a 12 kD-nál látható, első csúcs jelzi. A második csúcsot a só hozza létre.

Az SDS-poliakrilamid-gél darabjának magyarázata:

A tisztaság vizsgálatára egy 8-25 %-os grádiensű SDS-poliakrilamid minigélt (Pharmacia Phast gél system) használtunk. A minták - balról jobbra haladva a következők - : MP6 szérummentes felülűszó, az affinitás oszlop előtt; affinitás - tisztított BSF-MP6/tioredoxin; humán-placenta-tioredoxin; molekula • · · • · tömeg markerek (Pharmacia) - felülről lefelé: 92,5 kD, 67 kD, kD, 30,1 kD, 20,1 kD, 14,7 kD.

Irodalmi hivatkozások:

E. A. Clark and J. A. Ledbetter, Adv. Cancer Rés. 52, 1989;

M. F. Greaves, lás ugyanott 234, 697 (1986).

A. O'Garra, S. Umland, T. DeFrance, és J. Christiansen, Immunoi. Today 9, 45 (1988); J. G. Gordon és G. R. Guy, Immunoi. Today 8, 339 (1987) általános tájékoztatás; IL-1: C. J. March et al., Natúré 315, 641 (1985); IL-2: T. Taniguchi et al. , Natúré 302,

305 (1983); IL-4: T. Yakota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5894 (1986);

IL-5: C. Azuma et al., Nucleic Acid Rés. 14. 9149 (1986);

IL-6: T. Hirano et al., Natúré 234, 73 (1986); LMW-BCGF:

S. Sharma, S. Mehta,	J.	Morgan és A. Maizei,	lásd ugyanott 235
1489 (1987);
IFN-(p D. V.	Goeddel	et	al., Natúré 287, 411	(1980);
Limphotoxin	(TNF-ot) :	P.	W. Gray, Natúré 312,	712 (1984);

TNF: T. Shirai, H. Yamaguchi, H. Ito, C. W. Todd és B. Wallace, Natúré 313, 803 (1985); TGF-/3: R. D. Derynck et al. , 316, 701 (1985) .

A. Holmgren, Ann Rév. Biochem. 54, 237 (1985); F. K. Gleason és A. Holmgren, FEMS Microbiol. Rév. 54, 271 (1988); A. Holmgren, In: Thioredoxin an glutaredoxin systems: Structure and function. Proceedings of the Ninth Karolinska Institute Nobel Conference 1985 (Ed. A. Holmgren) Raven Press ρ. 1. (1986); A. Holmgren, • · « · • · •t • ···

J. Bioi. Chem. 254, 9113 (1979); A. Holmgren, J. Bioi. Chem.

254, 9627 (1979).

Β. B. Buchanan, R. A. Wolosiuk és P. Schurmann, Trends Biochem.

Sci. 4, 93 (1979); A. Holmgren, B.

FEBS Lett. 82, 351 (1977) .

J. F. Grippo, A. Holmgren és W. B.

(1985); W. Tienroungroj et al.,

B. Buchanan, R. A. Wolosiuk,

Pratt, J. Bioi. Chem. 260,

J. Bioi. Chem. 262, 6992 (1987) .

N. E. Engström et al., J. Bioi. Chem. 249, 205 (1974); A. Holmgren,

J. Bioi. Chem. 252, 4600 (1977); B. Rozell et al., Eur. J. Cell.

Bioi. 38, 79 (1985);

E. E. Wollman et al., J. Bioi. Chem. 263, 15506 (1988); H. Wakasugi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84, 804 (1987).

Y. Tagaya et al., EMBO J. 8, 757 (1989); Y. Tagaya et al.,

J. Immunoi. 140, 2614 (1989).

A. Rosén, C. Uggla, R. Szigeti, B. Kallin és J. Zeuthen, Lymphokine Rés. 5, 185 (1986); A. Rosén, T. Noma, V. Wendel-Hansen,

J. Zeuthen, C. Y. Lin és T. Honjo, In: In vitro immunization (Ed. C. A. K. Borrebaeck) Elsevler Sci. Publ., 311. oldal (1988).

o

J. Gordon, P. Aman, A. Rosén et al., Int. J., Cancer 35, 251 (1985) .

M. Carlsson, P. Matsson, A. Rosén et al., Leukémia 2, 734 (1988).

M. Carlsson et al., Eur. J. Immunoi. 19, 913 (1989).

T. Noma, T. Mizuta, A. Rosén, T. Hirano, T. Kishimoto és T. Honjo, Immunoi. Lett. 15, 249 (1987).

A. Holmgren és M. Luthman, Biochem. 17, 4071 (1978);

F. T. Cordingley et al., Láncét 969 (1988); J. H. Kehrl, A.

. F.

Miller és A. S. Fauci, J. Exp. Med. 166, 786 (1987); E

Jelinek és P. E. Lipsky, J. Immunoi. 139, 2970 (1987).

N. Chiorazzi et al., J. Immunoi. 122, 1087 (1979).

A. Rosén et al., Natúré 267, 52 (1977); A. Rosén és G.

Natúré 306, 189 (1983);

J. Gordon et al., Immunoi. Today 10, 153 (1989).

A. J. Darling, J. Gén. Virol. 69, 515, 1988.

Claims (24)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Állatok és emberek vérképzőszervi rendellenességeinek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására vonatkozó eljárás, mely készítmény terápiásán hatékony mennyiségű tioredoxint, illetve annak valamely olyan analógját - előnyösen MP6/Trx-et - tartalmaz, melyben megtalálható a Cys-Gly-Pro-Cys aktív hely.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tioredoxin eredete

   - állati,

   - emlős,

   - humán,

   - prokarióta vagy

   - rekombináns.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tioredoxin humán limfocita- vagy egyéb humán eredetű.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előkezelést egy olyan kofaktorral végezzük, mely képes arra, hogy a tioredoxin számára kötőhelyeket indukáljon .
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kofaktort az alábbiak közül választjuk ki:

   (a) anti-immunglobulinok (anti-idiotípusok)

   (b) interleukin 1 és szubkomponensei (c) interleukin 2 és szubkomponensei (d) interleukin 3 és szubkomponensei (e) interleukin 4 (BSF1)

   ·♦·< ·

   4 · »«· · « * * « 9 • *· ·«» ·· anti-receptor jellemezve, eljárás, azzal

   - 30 - .:.

   (f) anti-IL-4-receptor antitestek (g) C3d-receptor (CDllc) reaktív C'-ágensek és (gp 140) antitestek (h) anti-gp35 (CD20) (i) interferonok (alfa, béta és gamma) (j) vitaminok (k) leukotrin B4 (l) TNF-ct.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal hogy az alkalmazott kofaktor interleukin 2.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti jellemezve, hogy az előállított gyógyszerkészítmény B-sejtes leukémiák kezelésére alkalmazható.
8. 8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előállított gyógyszerkészítmény B-sejtes krónikus limfocitás leukémia kezelésére alkalmazható.
9. 9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előállított gyógyszerkészítmény egyéb olyan tumorok kezelésére alkalmazható, melynek tioredoxinra, illetve az 1. igénypontban meghatározott analógjaira kötőhelyeket/receptorokat fejlesztenek ki (receptor-expresszió), és reagálnak az említett vegyületekre.
10. 10. Tioredoxin állatok és ember vérképzőszervi rosszindulatú megbetegedéseinek kezelésére.
11. 11. Tioredoxin a 7., 8. és 9. igénypontokban felsorolt rendellenességek kezelésére.
12. 12. Tioredoxin a 10. és 11. igénypontoknak megfelelően, olyan kofaktorokkal kombinált formában, melyek képesek arra, hogy a rosszindulatúan elfajult sejteknél tioredoxin kötőhelyek (receptorok) expresszióját idézzék elő (indukálják).
13. 13. A 12. igénypont szerinti tioredoxin az 5. igénypontban (a)-tói (l)-ig terjedő pontokban felsorolt kofaktorokkal együtt.
14. 14. A tioredoxin terápiás célokra történő felhasználásra, tetszés szerinti kofaktorokkal kombinált formában, a 12. igénypontban leírtaknak megfelelően.
15. 15. Aktív hatóanyagként tioredoxint, illetve Cys-Gly-Pro-Cys aktív hellyel jellemezhető analógjait tartalmazó gyógyszerkészítmény.
16. 16. A 15. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amely egy, a 12. igénypontban említett típusú kofaktort is tartalmaz.
17. 17. A 16. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, mely egy, az 5. igénypontban (a)-tói (l)-ig felsorolt kofaktort is tartalmaz .
18. 18. A 17. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a kofaktor az interleukin-2.
19. 19. A tioredoxin felhasználása állatok és ember vérképzőszervi rosszindulatú megbetegedéseinek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
20. 20. A tioredoxin felhasználása olyan megbetegedések kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, melyeket a 7., 8. és 9. igénypontokban említettünk.
21. 21. Eljárás a beteg saját citotoxikus sejtjei által felismert felületi struktúrákat megjelenítő (receptor-expresszióval jellemezhető) ráksejtekre reagáló limfociták reakcióképességének fokozására, azzal jellemezve, hogy az eljárás során tioredoxin vagy valamely Cys-Gly-Pro-Cys aktív helyet tartalmazó analógjának adagolására kerül sor, tetszés szerint valamely, az 5. igénypont (a)-(l) pontjában felsorolt kofaktorral kombinált formában.
22. 22. A tioredoxin MP6/Trx variánsának a 10-14. igénypontoknak megfelelően történő felhasználása.
23. 23. A 15-18. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a tioredoxin-komponens az MP6/Trx.
24. 24. A tioredoxin MP6/Trx variánsának felhasználása a 19. és

    20. igénypontoknak megfelelően.