KR20210068606A - 점액 점도 정상화를 위한 생성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

과도하게 또는 비정상적으로 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래의 점도 및/또는 점착성을 감소시키거나 및/또는 액화를 증가시키기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 조성물은 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 함유하고, 그리고 임의선택적으로 환원 시스템을 더 함유한다.

Description

점액 점도 정상화를 위한 생성물 및 방법{PRODUCT AND PROCESS FOR MUCUS VISCOSITY NORMALIZATION}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제61/792,198호에 대한 35 U.S.C. 119(e) 하의 우선권의 유익을 주장한다. 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제61/792,198호의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 EFS-Web에 의한 텍스트 파일로서 전자 제출된 서열 목록을 함유한다. "7579-1-PCT_sequence_listing_ST25"로 명명된 텍스트 파일은 18KB 바이트의 크기를 가지며, 2014년 3월 17일에 기록되었다. 텍스트 파일에 함유된 정보는 본 명세서에 37 CFR § 1.52(e)(5)에 따라 전체적으로 참고로 포함된다.

기술분야

본 발명은 일반적으로 점액 또는 가래의 점도를 감소시키고 액화를 유도, 증강 및/또는 증가시키기 위해 사용되는, 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하고 있는 단백질 또는 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

낭포성 섬유증(CF), COPD/기종, 기관지 확장증, 심각한 천식 및 다른 심각한 폐쇄성 폐 질환을 가진 환자들의 치료를 위해 안전하고, 내성이 좋으며 효과적인 약물에 대해 아직 충족되지 않은 큰 의학적 요구가 존재한다. 이들 질환은 손상된 폐 기능을 초래하는 농축된 점액의 과잉생성을 특징으로 한다(Evans, C.M. and Koo, J.S., Pharmacology & Therapeutics 121:332-348, 2009에서 개관됨). 비정상적이고 끈적끈적한 점액의 불량한 제거(clearance)는 특히 CF에서 만성 감염 및 조기 사망과 관련된다. 항생 요법 및 다른 치료에서의 진전에도 불구하고, 개선된 점액 제거는 점액 수송성의 기저에 있는 메커니즘에 대한 우리의 이해가 여전히 제한되어 있는 상황에서도 중요한 임상 치료 목적으로 남아있다(Verdugo, P., Cold Spring Harb Perspect Med 2012;2:a009597).

점액은 상피 표면에 보호성 장벽을 형성하고 섬모 작용 및 기침을 통해 흡입된 잔해들과 박테리아를 폐 밖으로 수송하는 데 기여하는 지속적으로 분비되는 초거대분자(supramolecular) 중합체 겔이다(Knowles, M.R. and Boucher, R.C., J Clin Invest 109:571-577, 2002; Cone, R.A., Adv Drug Deliv Rev 61:75-85, 2009). 그러므로 효과적인 점액섬모 수송을 가능하게 하는, 점액층의 적절한 점탄성 및 수화(hydration)는 점액 기능과 감염 및 염증의 방지에 중요하다. 정상적인 점액은 대부분 물(97%)과 나머지 뮤신 단백질, 비-뮤신 단백질, 염, 지질 및 세포 잔해물을 포함하는 고체로 구성된다(Fahy, J.V. and Dickey, B.F., N Engl J Med 363:2233-47, 2010). 중합체 뮤신 당단백질 MUC5AC 및 MUC5B는 주로 호흡기 점액 겔의 점탄성 특성의 원인이 된다(Matsui et al., Cell 95:1005-1015, 1998; Kreda, et al., Cold Spring Harb Perspect Med 2012;2:a009589에서 개관됨). 뮤신에 부착된 O-연결된 글리칸 하이드록실기는 수-결합에 기여하는 한편, 뮤신 자체는 소화관 뮤신 MUC2의 상세한 연구(Ambort et al., Biochem J 436:61-70, 2011)로부터 시사된 것과 같이 공유 및 비-공유 사슬간 교차결합을 또한 포함할 수 있는 얼키설키 얽혀있는 네트워크를 형성한다(Verdugo et al., Biorheology 20:223-230, 1983). 뮤신은 보통 Cys 아미노산이 풍부하고, 총 5030개 아미노산 중에서 현저히 많은 295개의 Cys 잔기를 함유하는 인간 MUC5AC를 포함한다(www.uniprot.org/uniprot/P98088). N 및 C 말단 가까이에 위치한 뮤신 Cys 잔기들은 뮤신 하위유닛들 사이의 사슬간 이황화 연결의 형성에 연관되는 것으로 여겨지는 한편, 내부 Cys 잔기들의 역할에 대해서는 명확하게 알려진 것이 없다(Thornton et al., Annu Rev Physiol 70:459-486, 2008). 일부는 'Cys 매듭(Cys Knot)' 영역에 위치하고 점액 겔 메쉬 구조에 중요한 비-공유 얽힘을 촉진하는 역할을 할 수 있는 분자내 이황화 결합을 쉽게 형성할 것이다(Fahy, J.V. and Dickey, B.F., N Engl J Med 363:2233-47, 2010).

최근의 작업(Button et al., Science 337:937-941, 2012)은, 상피 세포상에 결합된 막인 것으로 여겨졌던 특정 뮤신이 실제로 섬모 자체의 막에 묶인다(tethered)는 발견을 토대로 하여 점막 표면의 새로운 구조 모델을 유도하였다. 이 모델의 함의는 이동성 점액층이 "겔-온-브러쉬(gel-on-brush)"로서 기술되는, 더 조밀한 섬모주변 층 위에 놓인다는 것이다. 상기 모델은 액체가 저장소로서 작용하는 점액을 가지는 두 개의 층들 사이에서 어떻게 움직이는지를 명쾌하게 설명해주며, 점막섬모 수송의 기능성과 점액층 수화를 측정하는 데 점액 삼투율의 역할을 이해하기 위한 새로운 패러다임을 수립한다. 상기 모델은 또한 점액 단백질 스캐폴드의 과잉 이황화 결합이 어떻게 기저 섬모층을 탈수시키고 정상적인 점액 수송을 심하게 제한하는 점액층 삼투율의 증가를 유발할 수 있는지 이해하기 위한 틀을 제공한다. 그런 시나리오는 CF의 질환 메커니즘의 상당한 부분을 뒷받침할 수 있다.

CF는 상염색체 열성 질환이다. CF의 증상들은 1가의 음전하 이온, 주로 클로라이드(Riordan, et al., Science 245:1066-1073), 그러나 또한 중탄산염 및 글루타티온에 대한 핵심적인 상피 막 수송자인 낭포성 섬유증 경막 전도 조절자, CFTR의 결핍으로부터 유발된다. 1700개 이상이 알려져 있는 CF를 유도하는 돌연변이(www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)는 CFTR의 완전한 손실(가장 공통적인 CF 유전형에 대한 경우)을 유발하는 것들뿐 아니라 음이온 수송 활성의 부분적인 또는 전체의 손실을 유발하는 점 돌연변이들을 포함한다. 또한, CFTR의 결핍의 결과로서, 체내에 있는 상피는 클로라이드 이온 수송에 대해서는 불투과성이다(Boucher eta l., Lung 161:1-17, 1983; Welsh, Physiol Rev 67:11443-1184, 1987). 비록 췌장, 소장 및 남성 생식관을 포함하여 여러 기관이 영향을 받지만, 폐 안의 합병증은 이환율과 사망률의 95%를 차지한다(Means, M. Cystic Fibrosis: the first 50 years. In: Cystic Fibrosis-Current Topics Volume 1, edited by Dodge JA, Brock DJH, and Widdicombe JH. Chichester: Wiley and Sons, 1992, p.217-250). 질환에 의해 손상된 폐에서, 기도 루멘(airway lumen) 안으로의 클로라이드 수송은 Na⁺ 및 유체의 과잉 흡수를 유발하여 기도 표면 액체의 부피를 감소시킨다(Jiang et al., Science 262:424-427, 1993). 그러나, 비-기능성 CFTR에 의해 유발된 영향을 보상하기 위해, 예컨대 퓨린 수용체의 P2Y₂ 하위유형의 아고니스트를 통해 클로라이드 채널 활성을 복원하기 위한 시도는 실패하였다(Ratjen, F. et al., J Cyst Fibros 11:539-49, 2012). 이것은 CFTR의 비-클로라이드 효과가 원래 생각되었던 것보다 더 중요할 수 있음을 시사한다.

폐와 같은 산화 환경에서, 이황화 결합은 뮤신 단백질 상에 매우 풍부하게 존재하는 것들과 같은, 인접한 산화된 Cys 잔기들 사이에서 쉽게 형성된다. 이들 결합은 매우 안정하며, 그것들의 유리 티올 형태로 Cys 잔기들을 복귀시키기 위해 그것들을 파괴하는 것(즉 환원시키는 것)은 강력한 화학적 또는 생물학적 환원제의 작용을 필요로 한다. 건강한 폐에서, 과잉 이황화 결합 형성은 점액층으로 대량 분비되는(Cantin et al., J Appl Physiol 63:152-157, 1987) Cys-함유 트라이펩타이드인 생물학적 환원제 글루타티온의 환원 형태(GSH)에 의해 주로 상쇄되고, 뮤신의 정상 이황화 결합 대 유리 Cys 티올 평형을 유지하는 데 핵심적인 역할을 할 수 있다. GSH의 기도 표면으로의 분비는 직접 및 간접적으로 GSH 유출을 용이하게 하는 CFTR에 매우 의존적이다(Ballatori et al., Biol Chem 390:191-214, 2009에 개관됨). 따라서, CF 환자에서 폐의 GSH의 수준은 정상인에서 발견되는 수준의 30% 이하일 수 있다(Roum et al., J Appl Physiol 75:2419-24, 2003; Wetmore D.R. et al., J Biol Chem 285:30516-22, 2010). CFTR은 또한 중탄산염 음이온의 분비의 원인이 되고, 그 결과 CF 폐의 중탄산염의 결핍이 질환에 기여하는 것으로 보인다. 중탄산염의 일차 화학적 효과는 pH를 상승시키는 것이다. 티올-함유 환원제에 의한 이황화 결합의 환원이 공격하는 탈수소화된 티올레이트의 형성을 필요로 하고, 수소화된 티올 형태가 선호되는 낮은 pH에서 억제되기 때문에(Singh and Whitesides, In: Sulphur-containing Functional Groups, 5: pp. 633-58, John Wiley & Sons, 1993), 중탄산염과 GSH(뿐만 아니라 기도 표면 환경에 존재하는 것으로 알려져 있는 다른 생물학적 환원제)의 활성들 사이의 상조작용이 일어날 공산이 크다. CF 기관 및 기관지의 분비물에서 측정된 pH는 비-질환에 대해 최대 0.6 유닛까지 더 낮은데(Song et al., Am J Physiol Cell Physiol 290:C741-C749), 그것은 환원제가 제한적으로 공급되어 존재할 뿐만 아니라, 이황화물-공격 티올레이트를 형성하는 능력의 손상으로 인해 덜 활동적인 장소인 CF 폐에서의 환경과 일관된다. 그러므로 뮤신에 존재하는 수많은 클러스터화된 Cys와 함께 취합하면, 호흡기 산화 환경의 점액은 만약 분비된 환원제 수준이 제한되거나, 또는 뮤신 단백질이 과잉으로 생성되고 분비되어 이황화-결합가능한 Cys의 과잉을 초래한다면, 보다 많은 이황화-결합된 상태로 존재할 준비가 되어 있다. 두 가지 상황 모두 CF 및 특정한 다른 폐쇄성 폐 질환에서 일어나는 것으로 알려져 있다: 점액 단백질은 폐 스트레스에 대한 반응으로 과잉-생성되고(Rogers, Resp Care 52:1134-1149), GSH 분비의 70% 이상이 CFTR의 결함의 결과로서 차단될 수 있다(Roum et al., J Appl Physiol 75:2419-24, 2003; Wetmore D.R. et al., J Biol Chem 285:30516-22, 2010).

이런 과잉 점액 이황화-결합뿐 아니라 일반적인 산화환원 불균형이 CF에서 기작적 역할을 담당한다는 가능성으로 인해 다양한 티올-함유 제제가 점액용해 약물로서 임상적으로 평가되기에 이르렀다. 이러한 약물은 N-아세틸시스테인(NAC) 및 나시스텔린(NAL; N-아세틸시스테인 + L-라이신)을 포함할 뿐 아니라(Hurst et al., Am Rev Respir Dis, 96:962-970, 1967; Dasgupta and King, Pediatr Pulmonol, 22:161-166, 1996; Nash, E.F., et al., Cochrane Database of Systematic Reviews, 2010(12):1-49, 2009) 환원된 글루타티온 자체도 포함한다(Bishop, C., et al., CHEST Journal, 127(1):308-317, 2005; Griese, M., et al., Am J Resp Crit Care Med 169(7):822-828, 2004; Griese, M., et al., Am J Resp Crit Care Med 188(1):83-89, 2013; Roum, J.H., et al., J Appl Physiol, 87:438-443, 1999). 대체로 안전한 반면, 지금까지 이러한 저-분자 제제들은 경구 또는 흡입 형태로 분명한 임상적 이점을 나타내지 않았다(Nash, E.F., et al., Cochrane Database of Systematic Reviews, 2010(12):1-49, 2009에서 개관됨). 이런 효능의 결핍의 대부분은 전달 중 자동산화 효과뿐 아니라 폐의 효소들에 의한 비활성화로 인한 낮은 효력 또는 활성 손실의 결과일 수 있다. GSH는 비활성 GSSG 형태로 빠르게 자동산화되고(Curello, S. et al., Clin Chem, 33:1448-49, 1987) 따라서 에어로졸화되고 흡입될 때 환원된 형태로 약리학적으로 불안정하며(Carl White M.D., pers comm.), 기도의 표적 부위에 도달한 시점에는 활성의 대부분을 잃어버린다. 또한, 폐의 공간에 고농도로 존재하는 γ-글루타밀트란스페라제는 GSH를 비활성 형태로 쉽게 분해하고(Corti et al., Am J Resp Crit Care Med 189:233-234, 2014), 그것의 풍부성은 GSH 흡입시에 현저하게 증가한다(Griese et al., Am J Resp Crit Care Med 188:83-89 Supplemental information, 2013). 그러므로 이황화-표적화를 우수한 약리학 및 생물학적 약물의 특이성과 조합함으로써 티올 제제를 개선하는 것이 아직 해결되지 않은 핵심적인 치료 목적이다.

CF 폐 질환의 병인학이 점액의 변경된 유동학적 특성에 기여할 수 있는 한편, 손상된 폐 기능은 출생시에는 거의 분명하지 않다. 대신, 기관지확장 및 기도 폐쇄가 환자의 나이와 함께 진행된다. 이런 만성 폐 손상은 박테리아 감염 및 염증 반응의 지속적인 순환의 결과이다. 기도 손상은 폐로 영입된 호중구가 매트릭스 분해 효소, 예컨대 엘라스타제 및 유해한 반응성 산소 종을 방출할 때 초래된다(Konstan and Berger, Pediatr Pulmonol 24:137-142, 1997에서 개관됨). 지속적인 감염에 이어서, 뮤신과 DNA와의 상호작용(Potter et al., Am J Dis Child 100:493-495, 1960; Lethem et al., Am Rev Respir Dis 100:493-495, 1990; Lethem et al., Eur Respir J 3:19-23, 1990) 및 죽어가는 염증 세포로부터 방출된 f-악틴 중합체(Sheils et al., Am J Path 148:919-927, 1996; Tomkiewicz et al., DNA and actin filament ultrastructure in cystic fibrosis sputum. In: Cilia, mucus, and mucociliary interactions, edited by Baum GL, Priel Z, Roth Y, Liron N, and Ostfeld EJ. New York, NY: Marcel Dekker, 1998)와의 상호작용이 또한 일어날 수 있고, 이것은 심각한 질환의 CF 가래의 농밀하고 점성인 성질의 일부의 원인이 될 수 있다. 그런 점액을 기침이나 점액섬모 제거에 의해 제거시키지 못하는 것은 기회감염 병원체로 인한 폐의 추가의 콜로니화, 기도 리모델링 및 궁극적으로 사망을 용이하게 한다.

그러므로 CFTR 결함의 결과를 직접적으로 완화시키기 위해 디자인된 중재적 시술은 질환 진전을 방지하거나 약화시킬 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 유전자 요법으로 CF를 직접 보정하는 것은 아직 실현 불가능하지만, CFTR 기능의 어느 정도를 결함 단백질 정도로 복귀시키기 위한 강화제 및 정정제 요법의 사용은 최근에 입증되었다(Sloane, PA and Rowe, SM, Current Opinion in Pulmonary Medicine　16: 591-7, 2010). 그런 치료법은 특별한 CFTR 결함, 예컨대 ivacaftor/Kalydeco(상표명)(Jones, AM and Helm, JM, 　Drugs　69:1903-10, 2009)에 의해 표적화된 G551D 돌연변이를 가지는 일부 CF 환자의 경우에 제한된다. 그러나, 이들 소수의 개인에서 극적인 결과들이 관찰되었고(Accurso, FJ; Rowe, SM; Clancy, JP; Boyle, MP; Dunitz, JM; Durie, PR; Sagel, SD; Hornick, DB et al., The New England Journal of Medicine　363: 1991-2003, 2010), CF에서 기작적 개입이 만성 감염 및 염증으로부터 유발되는 것들과 같은 후기-단계 결과를 완화시킬 수 있음을 증명하였다. 그러나 현재, 화농성 기도 분비물의 제거를 용이하게 하는 약물과 항생물질 처방 등의, 질환-조절보다는 증세관리에 가까운 접근법이 진행성 기도 질환에 대한 중심적인 치료법으로 유지되고 있다. CF 기도에 존재하는 세포외재성 DNA를 분해하는 정제된 rhDNase(Pulmozyme(상표명); Genentech, USA)의 흡입은 호흡기 충혈완화제로서 광범위하게 사용된다. 그런 치료는 가래 점도를 감소시키고 강제 호기량(forced expiratory volume: FEV)을 안정화하는 데 임상적으로 효과적이다(Fuchs et al., N Engl J Med 331:637-642, 1994). N-아세틸시스테인(NAC), 나시스텔린(N-아세틸-L-시스테인 유도체) 및 겔솔린을 포함하여, 뮤신 또는 악틴 중합체를 분해하는 것을 목적으로 하는 다른 임상 시험중인 치료법들 또한 가래 점도를 실험적으로 줄일 수 있지만, 아직 임상적인 효능을 증명하지 못하였고 미국에서 CF의 치료에 대해 승인을 얻지 못하였다(Nash, EF et al., Cochrane Database of Systematic Reviews, 2010(1):CD007168, 2009).

점액 제거를 개선시키기 위해 활용되고 있는 다른 접근법들은 점액작용제, 예컨대 흡입성 고장성(hypertonic) 식염수 및 흡입성 고용량 만니톨을 포함한다(Fahy, J.V. and Dickey, B.F., N Engl J Med 363:2233-47, 2010). 이들 제제는 점액층 안으로 물을 삼투적으로 밀어넣음으로써 수화를 증가시키거나, 또는 기침 반사를 유도하여 제거를 개선하는 작용을 하는 것으로 여겨진다. 이 두 가지 메커니즘을 뒷받침하는 몇몇 증거가 존재한다(Levin, M.H. et al., J Biol Chem 281:25803-12, 2006; Boucher, R.C., Trends Mol Med 13:231-240, 2007). 그러나, 점성 작용제는 대증적 치료이고(질환-변형이 아님), 효능은 일반적으로 중간 정도일 뿐인데, 이것은 많은 환자들이 최대의 임상 효과를 나타낼 수 있는 고용량을 견디지 못하기 때문이다(Aziz, I. and Kastelik, J.A., N Engl J Med 354:1848-1851, 2006).

White와 동료들에 의한 연구(Rancourt et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 286:L931-L938, 2004; Rancourt et al., Free Radical Biol & Med 42:1441-43, 2007)에 따르면, 환원된 상태의 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 사용이 CF를 가지는 환자를 포함하여, 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 액화를 증가시키는데 유용한 것을 발견하였고, 이때 점액 또는 가래는 단백질 또는 펩타이드와 접촉된다(미국 특허 제7,195,766호 및 제7,534,438호, 본 명세서에 전체 내용이 참조로 포함됨). 이런 시스템에서(도 3), 티오레독신 활성 부위의 N-말단 시스테인과 표적 단백질(점액이나 가래에서 발견된)의 시스테인 사이의 일시적인 혼합-이황화물이 형성되고, 이어서 즉시 분자내 혼합 이황화 연쇄상에서 친핵성 공격이 이어지고 산화된 티오레독신과 전체-환원된 표적이 방출되며(Wynn et al,. Biochemistry 34(37):11807-11813, 1995), 그로써 점액 또는 가래의 시스테인 이황화물의 재형성이 허용되고 동시에 환원 또는 산화된 티오레독신의 세포 안으로의 자유로운 접근이 허용되고 내인성 티오레독신 환원효소-NADPH 시스템에 의한 재-환원 후에 바람직하지 못한 표적-외 활성 또한 유도된다. 또한 White와 동료들은 시험관 내 및 생체 외 동물 이식 연구에서, 환원된 티오레독신이 인간 CF 점액의 비정상적인 점탄성을 완화시킬뿐 아니라(Rancourt et al., Free Radical Biol & Med 42:1441-43, 2007), 활성 부위 이황화 결합을 파괴함으로써 전-염증성 친핵성 엘라스타제의 활성을 억제하는 것을 보여주었다(Lee et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 289:L875-L882, 2005). GSH 및 티올 제제, 예컨대 NAC와 비교하면, 티오레독신은 보다 강력한 이황화 결합-환원 분자이고 자동산화에 의한 비활성화에 훨씬 덜 민감하다. 이것들을 함께 취하면, 약리학적으로 안정한 분자를 이용하여, 점액이 정상적인 이황화 상태로 회복될 수 있는 기회가 제공된다. 그런 치료법은 CF 환자를 조기 사망에 이르게 하는 만성 감염, 염증 및 폐 기능 약화의 연쇄과정을 방지 또는 지연시킬 수 있다. 그러나, 티오레독신의 잠재적인 전-염증성 및 다른 세포 내 조절 효과를 피하고(Arner, E.S. and A. Holmgren, Eur J Biochem 267: 6102-6109, 2000; Rancourt et al., Free Radical Biol & Med 42:1441-43, 2007), 뮤신 Cys 재산화를 방지함으로써 점액 점도-조절의 효능을 증가시킨다는 강력한 동기가 또한 존재한다. 이들 개선점이 본 발명의 주제이다.

본 발명의 한 실시형태는 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키기 위한 방법에 관련된다. 그 방법은 환자의 점액 또는 가래를, 접촉 단계 전과 비교하여 점액 또는 가래의 점도를 감소시키기에 효과적인 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 실시형태의 한 측면에서, 환자는 점액 또는 가래의 비정상적이거나 과도한 점성 또는 점착성이 질환의 증상이거나 원인인 폐 질환을 가진다. 한 측면에서, 환자는 낭포성 섬유증(CF), 만성 폐쇄성 폐 질환, 기관지 확장증 및 천식으로부터 선택된 폐 질환을 가진다. 바람직한 측면에서, 환자는 CF를 가진다. 이 실시형태의 다른 측면에서, 환자는 점액 또는 가래의 비정상적이거나 과도한 점성 또는 점착성이 생물학적 환원제 활성의 결핍과 결부된 폐 질환을 가진다. 이 실시형태의 또 다른 측면에서, 환자는 그것에 제한되는 것은 아니지만 콕시디아증(coccidiosis)을 포함하는, 농축되거나 비정상적인 점액과 결부된 소화관 질환을 가진다.

한 측면에서, 환자의 점액 또는 가래를 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 조성물을 코, 기관 내, 기관지, 폐 안으로의 직접 설치, 흡입 및 경구로부터 선택된 경로에 의해 환자에게 도입시킴으로써 수행된다. 한 측면에서, 접촉시키고자 하는 점액 또는 가래는 환자의 기도, 소화관(즉 위장관) 또는 생식관에 위치한다.

다른 측면에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체로 환자에 투여된다.

전술한 측면들 중 어느 한 측면에서, 환자의 점액 또는 가래를 조성물과 접촉시키는 단계는 조성물과의 접촉 전과 비교하여 환자로부터의 점액 또는 가래 샘플의 유리 티올의 백분율을 증가시킨다.

전술한 측면들 중 어느 한 측면에서, 환자의 점액 또는 가래를 조성물과 접촉시키는 단계 후에 환자의 강제 호기량(FEV)은 조성물과의 접촉 전과 비교하여 적어도 약 2.5%의 증가를 나타낸다.

전술한 측면들 중 어느 한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 또는 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 이때 C 잔기는 환원된 상태로 존재하고 X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이다. 바람직한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 상기에서 기술된 것과 같은 아미노산 서열 C-X-X-S(서열번호 24)를 포함한다.

상기 측면들 중 어느 한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 가지는 단백질은 원핵생물 티오레독신, 진균류 티오레독신, 식물 티오레독신 및 포유류 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택된 티오레독신을 포함한다. 바람직한 측면에서, 단백질은 인간 티오레독신을 포함한다.

발명의 상기 측면들 중 어느 한 측면에서, 조성물은 단백질의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 환원시키기 위한 환원제를 더 포함한다. 추가의 측면에서, 조성물은 티오레독신 환원효소 및 NADH 또는 NADPH를 포함한다.

발명의 다른 실시형태는 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 데 사용하기 위한 조성물에 관련되며, 그 조성물은 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래의 치료를 위한 적어도 하나의 부가 제제를 포함한다. 이 실시형태의 한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 또는 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 이때 C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이다. 바람직한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 상기에서 기술된 것과 같은 아미노산 서열 C-X-X-S(서열번호 24)를 포함한다. 이 실시형태에 대한 전술한 측면들 중 어느 한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 가지는 단백질은 원핵생물 티오레독신, 진균류 티오레독신, 식물 티오레독신 및 포유류 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택된 티오레독신을 가진다. 한 측면에서, 단백질은 인간 티오레독신을 포함한다.

나아가 이 실시형태의 전술한 측면들 중 어느 한 측면에서, 조성물은 환원제를 포함한다. 또 다른 추가의 측면에서, 조성물은 티오레독신 환원제 및 NADH 또는 NADPH를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관련된다. 한 측면에서, 조성물은 폐로 에어로졸 투여용으로 위해 제형된다. 또 다른 측면에서, 조성물은 경구 투여용으로 제형된다. 이 실시형태에 대한 전술한 측면들 중 어느 한 측면에서, 테오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 이때 C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이다. 또 다른 측면에서, 약제학적 조성물은 분무기 장치에 의해 폐에 에어로졸을 투여하기 위해 제형된다. 한 측면에서, 분무기 장치는 진동-메쉬 분무기이다. 다른 측면으로 약제학적 조성물은 환원제를 더 포함한다. 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 한 측면에서, 약제학적 조성물은 티오레독신 환원제 및 NADH 또는 NADPH를 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물에 관련되며, 이때 모노시스테인 활성 부위 중의 시스테인은 점액 단백질의 시스테인 잔기에 공유 결합된다. 한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 이때 C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이다. 상기 측면들의 어느 한 측면에서, 점액 단백질은 호흡기 점액 단백질이거나 소화관 점액 단백질이다. 다른 측면에서, 점액 단백질은 뮤신이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키기 위한 방법에 관련된다. 그 방법은 환자의 점액 또는 가래를 이황화 결합 환원제 및 시스테인-차단제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 이황화 결합 환원제 및 시스테인-차단제는 동일한 분자이다. 추가의 측면에서, 상기 동일한 분자는 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유한 단백질 또는 펩타이드이다. 또 다른 측면에서, 이황화 환원제 및 시스테인-차단제는 상이한 분자이다. 여전히 또 다른 측면에서, 이황화 결합 환원제는 다이티오트레이톨(DTT), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 글루타티온, 다이티오글리콕산, 2-머캅토에탄올, N-아세틸 시스테인 또는 트리스-(2-카복시에틸)포스펜일 수 있다. 추가의 측면에서, 시스테인-차단제는 요오도아세트아미드, 요오도아세트산 또는 다른 알킬화제일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 과도하게 점성이거나 점착성인 점액을 가지는 환자의 치료 방법에 관련된다. 상기 방법은 환자에게 세포를 통해 흡수할 수 없는 티오레독신 활성 부위를 가지는 화합물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 상기 화합물은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드, 티오레독신 부분과 세포 표면 수용체 리간드 부분을 포함하는 융합 단백질 또는 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 서열번호 12의 35 위치에 있는 시스테인에 해당하는 시스테인에 대한 차단 화합물의 조합일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환자에서 약물 물질에 대한 전신성 노출을 방지하는 방법에 관련된다. 그 방법은 그것에 한정되는 것은 아니지만 폐, 경구 또는 국소 전달 경로를 포함하는 전달 경로에 의해 약물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 약물은 일단 투여되면 그것의 표적 부위에 공유 결합을 형성한다. 또 다른 측면에서, 상기 약물 물질은 티올-함유 약물이고, 예를 들면 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 또 다른 측면에서, 약물 물질은 항생물질 또는 항-감염제이고 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위에 링커에 의해 융합되거나 부착된다. 또 다른 측면에서, 약물 물질은 항-염증제이고 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위에 링커에 의해 융합되거나 부착된다. 또 다른 측면에서, 약물 물질은 핵산-가수분해제이고 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위에 링커에 의해 융합되거나 부착된다. 또 다른 측면에서, 약물 물질은 화학요법제이고 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위에 링커에 의해 융합되거나 부착된다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하고 환원된 산화환원-활성 티올기를 안정화시킬 수 있는 적어도 하나의 당 또는 당 유도체를 더 포함하는 약제학적 조성물에 관련된다. 한 측면에서, 당 또는 당 유도체는 수크로스, 수트랄로스, 갈락토스, 라피노스, 만노스 또는 만니톨일 수 있다. 한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 이때 C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 동물성 사료 조성물에 관련된다. 한 측면에서, 티오레독신 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 이때 C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이다.

본 발명의 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 한 측면에서, 환자는 척추동물, 이를테면 하기로 한정되는 것은 아니지만 포유류 및 조류(bird)이다. 다른 측면에서, 환자는 인간이다. 또 다른 측면에서, 환자는 닭 또는 칠면조이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키기 위하여 사용되는, 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물의 용도에 관련되며, 이때 환자의 점액 또는 가래를 조성물과 접촉시키는 것은 접촉 단계 전과 비교하여 점액 또는 가래의 점도를 감소시킨다. 한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 이때 C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이다.

도 1a 및 도 1b는 야생형 티오레독신 활성 부위(WTrhTrx로 지칭됨)를 함유하는 단백질 또는 펩타이드와 비교한 티오레독신 모노시스테인 활성 부위(r(Cys)HTrx로 지칭됨)를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 효소 활성을 도시한다. 도 1a는 야생형에 비해 티오레독신 모노시스테인 활성 부위의 1 환원성 시스테인의 손실을 반영하는 비-특이적 5,5'-다이티오비스-(2-나이트로벤조산)(DNTB 또는 Ellman 시약) 환원을 도시한다. 도 1b는 12.5μM, 25μM 및 50μM의 농도량에서 수행된 인간 가래 압축 분석에서 티오레독신 모노시스테인 활성 부위(r(Cys)HTrx)를 함유하는 단백질 또는 펩타이드가 야생형 티오레독신 활성 부위(WTrhTrx)를 함유하는 단백질 또는 펩타이드에 비해 유사하거나 더 큰 효능을 가졌음을 보여준다.
도 2는 야생형 rhTrx, r(Cys)hTrx 및 두 가지 농도(0.58mM 및 1.5mM)의 다이티오트레이톨(DTT), N-아세틸 시스테인(NAC) 및 재조합 인간 DNase(rhDNase)를 포함한 다양한 대조군이 등몰 농도에서 가래-압축 분석에서 환자 가래 샘플(치료당 n=6)의 정상화에 미치는 효과를 도시한다.
도 3은 서열번호 12의 위치 35에서 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 가지는 단백질 또는 펩타이드를 사용한 이황화 결합 형성의 메커니즘을 도시한다. 천연 Trx 이황화물-환원의 메커니즘은 2-단계 반응을 포함한다. 도 3에 도시된 것과 같이, 단계 I 및 II는 Trx 활성 부위의 N-말단 Cys(인간 TRX-1 아미노산 서열의 위치 32에 위치함)와 표적 단백질 이황화물의 한 Cys 사이의 일시적인 혼합-이황화물이 형성되는 것을 보여주고, 이어서 단계 III이 이어진다. 단계 III은 인간 TRX-1 아미노산 서열의 위치 35에 위치한 Trx 활성 부위의 C-말단 Cys에 의한 분자내 혼합 이황화 결합에 대한 친핵성 공격을 보여준다. 이 두 번째 환원으로 혼합-이황화물 연결이 풀어지고 산화된 Trx 및 완전히-환원된 표적이 방출된다. Trx의 위치 35에 있는 C-말단 활성 부위 Cys 잔기를 비-시스테인 아미노산, 예컨대 세린 잔기(모노시스테인 변이체)로 변형시킴으로써, 또는 그렇지 않으면 단백질 서열을 위치 35에 있는 C-말단 활성 부위 Cys에 의한 친핵성 공격을 간섭하도록 변형시킴으로써, 티오레독신은 여전히 환원제로서 기능할 수는 있지만 야생형 효소와 달리 그런 모노시스테인 활성 부위 변이체는 풀어지지 않은 분자간 혼합-이황화 연결을 통해 환원된 표적 단백질에 공유 부착된 채로 유지된다.

본 발명은 일반적으로 점액 또는 가래의 액화를 유도, 증강 및/또는 증가시키기 위해 사용되는, 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명자는 모노시스테인 티오레독신 활성 부위를 가진 단백질 또는 펩타이드가 가래 또는 점액의 점도 및/또는 점착성을 감소시키고, 그로써 가래 또는 점액의 액화를 증강시키거나 증가시키기 위한 유효 제제인 것을 발견하였다. 따라서 환원된 상태의 모노시스테인 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드, 또는 그런 단백질을 코드화하는 핵산 분자들은 원하지 않는 점액 또는 오래되고 점성인 가래와 결부된 다양한 질환 또는 질환을 치료하기 위해 단독으로 또는 조성물로 사용될 수 있다. 예를 들어 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 기관지 확장증 및 천식과 같은 호흡기 질환은 특히 발명의 생성물 및 방법을 사용한 치료가 잘 듣는다. 또한 콕시디아증과 같은 농축되거나 끈적이는 점액과 관련된 소화관 질환 또한 특히 발명의 생성물 및 방법을 사용한 치료가 잘 듣는다. 그러므로 본 발명은 점액 또는 가래, 특히 비정상적으로 또는 과도하게 점성이거나 및/또는 점착성인 점액 또는 가래의 점도를 감소시키기 위해 사용되는, 환원된 상태의 티오레독신의 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질의 용도에 관련된다. 단백질은 그런 비정상적이거나 과잉의 점액 또는 가래로 고생하거나 그것에 의해 영향을 받은 환자에게 점액 또는 가래의 점도를 감소시키고, 바람직하게 환자에게 치료적 유익을 제공하기에 충분한 방식과 양으로 투여된다.

야생형(또는 천연) 티오레독신 활성 부위(본 명세서에서 "rhTxr"로도 지칭됨) 또는 티오레독신 모노시스테인 활성 부위(본 명세서에서 "r(Cys)hTrx"로도 지칭됨) 중 어느 하나를 함유하는 티오레독신 및 단백질은 낭포성 섬유증과 같은 질환의 치료에 사용되는 다른 환원제들을 능가하는 장점을 가진다. 예를 들어 N-아세틸시스테인(NAC), 나시스텔린(NAL), 다이티오트레이톨(DTT) 또는 환원된 글루타티온(GSH)과 같은 다른 환원제들과 달리, 티오레독신은 초산화물(superoxide), 과산화수소, 하이드록실 라디칼 및 다른 독성 산소 대사물을 생성하는 반응들을 포함하는 효소적 또는 자동산화성 메커니즘에 의한 비활성화에 덜 민감하다. 나아가, 천연 또는 야생형 티오레독신은 자연적으로 발생하고 정상적으로 기도 표면위에 세포외적으로 분비되는 화합물이고, 그러므로 기도 안으로의 티오레독신의 도입은 비자극적이고 면역반응을 유발할 가능성이 낮아야 한다. 티오레독신은 또한 글리코실화되지 않으며, 그러므로 보다 쉽게 제조되고, 천연 또는 재조합 형태의 단백질의 투여는 선천적인 면역반응을 유발하지 않아야 한다. 아마 보다 더 중요한 것은 환원된 티오레독신은 다른 환원제들과는 대조적으로, 보다 쉽고 강력하게 처리된 점액 또는 가래를 정상 점도 수준으로 회복시키고, 이런 정상화가 더 긴 기간 동안 지속되는 것이다. NAC, NAL, DTT 및 GSH는 예를 들면 시간의 경과에 따라 및 이 단계에서 "소모"되거나 산화되고, 이때 정상화된 가래 또는 점액은 비정상적인 점도 상태로 되돌아갈 수 있다. 대조적으로, 티오레독신에 의해 생성된 점도의 감소는 아마도 그것의 환원 시스템에 의한 주기적 환원으로 인해 더 길게 지속되는 것으로 나타난다. 나아가, 뮤신 Cys 잔기에 공유 결합된 상태를 유지함으로써 r(Cys)hTrx는 천연 rhTrx와 비교하여 보다 더 강력하고 더 길게 지속되는 점도의 감소를 유발할 수 있다. 마지막으로, 티오레독신은 이황화 결합-환원에 대해 다른 환원제들보다 더 강력하고 더 특이적이며, 따라서 그것은 유익한 효과를 내기 위해 다른 환원제들보다 상당히 적은 용량으로 사용될 수 있다.

상기 기술된 장점들 외에, 티오레독신은 질환 상태에서 그것의 유용성을 증가시키는 다른 유익한 점들을 가진다. 예를 들어 티오레독신은 MnSOD를 유도하는 것으로 알려져 있는데(예컨대 White 등의 미국 특허 제5,985,261호, 본 명세서에 전체 내용이 참조로 포함됨), MnSOD는 질환 가래(예컨대 낭포성 섬유증 가래)에서 특정 박테리아 독소(이를테면 그들로 한정되는 것은 아니지만 그람-네거티브 박테리아의 박테리아 세포벽으로부터의 내독소, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 피오시아닌 등)의 독성을 감소시키는 것으로 예측된다. 또한, 티오레독신은 호흡기 질환의 치료를 전반적으로 향상시킬 수 있는 세포외 항-염증 특성(Lee, R.L., et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 289(5):L875-82, 2005)을 가진다.

티오레독신(Trx)은 많은 티올-의존성 세포 환원 과정을 촉진시키는 단백질 이황화물 환원효소이다. 천연 티오레독신은 종을 가로지르는 고도로 보존된 두 개의 산화환원-활성 시스테인을 함유한다. 이들 시스테인은 산화된 형태에서, 단백질의 3차원 구조로부터 돌출되는 이황화 가교를 형성한다((Holmgren, Annu Rev Biochem 54:237-271, 1985). NADPH-의존성 티오레독신 환원효소(TR) 효소에 의한 이 활성중심의 환원은 Trx가 다이티올/이황화물 교환 능력을 가지는 전자 담체로서 기능하는 것을 허용한다(Oblong et al., Biochemistry 32:7271-7277, 1993). 단백질 이황화물은 Trx-중재된 환원 작용에 대한 바람직한 기질이다. Trx C-말단 활성 부위 시스테인의 변형은 모노시스테인 활성 부위를 생성하고, 그것은 아래에서 논의되는 것과 같이 천연 또는 야생형 활성 부위를 가지는 Trx를 능가하는 상당한 장점들을 가진다. 낭포성 섬유증 질환에서 기도 분비물의 지속되고 점성인 성질은 기도 폐쇄, 기회감염 및 폐 기능의 저하를 유발한다. 호흡기 뮤신이 중합반응에서 본질적인 역할을 담당하는 것으로 여겨지는 다중 시스테인 도메인을 함유하는 것을 인지하고(Bell et al., Biochem J 357:203-209, 2001; Asker et al., Biochem J 333:381-387, 1998) 또한 수많은 분자내 이황화 결합을 통해 뮤신의 얽힘을 증가시킴으로써, 본 발명자는 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 Trx가 뮤신 이황화물의 환원에 의해 효과적인 점액 점도 조절제로서 작용할 수 있는지를 측정하려고 하였다.

천연 또는 야생형 활성 부위를 함유하는 티오레독신에 비해 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 티오레독신은 여러 장점과 유익성이 있다. 모노시스테인 변형은 세포내 신호화 또는 전신성 노출과 관련된 티오레독신의 잠재적인 부작용, 예컨대 Rancourt 등에 의해 기술된 것과 같은 것들(Free Radical Biol & Med 42:1441-43, 2007)을 최소화하기 위해 디자인된다. 이런 변형은 티오레독신과 표적 단백질 이황화물 사이에 형성된 혼합 이황화물에 대한 N-말단 티오레독신 활성 부위 시스테인(인간 티오레독신, 서열번호 14의 위치 32에 위치함)에 의해 촉매되는 친핵성 공격을 방지한다. 놀랍게도, 본 발명자는 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 티오레독신이 야생형 티오레독신보다 질환에 걸린 인간 점액의 점도를 감소시키고(액화 경향) 정상화하는 데 더 큰 효능을 가지는 것을 밝혀냈다. 모노시스테인 활성 부위를 함유한 티오레독신이 이론적으로는 활성 부위 시스테인의 손실로 인해 유발된 총 난관통기법으로 인해 환원력이 감소될 것이므로 N-말단 티오레독신 활성 부위 시스테인에서 초기 촉매적 반응에 이어 점액 단백질에 공유 결합되어(예컨대 아주 많이 이황화-결합된 뮤신 MUC5AC 및 MUC5B) 환원되지 못하고 반복 촉매작용을 수행할 수 없을 것으로 예상되지만, 본 발명자는 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 티오레독신이 야생형 티오레독신과 비교하여 손상된 활성을 나타내지 않을 뿐 아니라, 유동학적 분석에서 인간 CF 점액 점도를 감소시키는데 더 큰 정량적 능력을 나타내는 것을 발견하였다. 이런 예상외의 결과를 토대로, 발명자는 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 티오레독신의 증강된 효능은 공유-연결된 티오레독신과 점액이, 뮤신에서의 시스테인 이황화물의 재형성을 차단하는 역할의 결과일 것이고, 그로써 뮤신 올리고머 겔 구조 및 기공 크기에서 매우 내구적이고 오래 지속되는 변화를 제공한다고 결론지었다. 동시에, 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 티오레독신의 뮤신 표적에 대한 공유 결합은 줄어들고, 그러므로 흡입된 티오레독신의 세포흡수 및 내재화를 방지하며, 그것은 세포 내에서 바람직하지 못한 티오레독신 활성으로 인한 표적-외 효과를 방지하는 한편, 동시에 신체로부터 점액-연결된 소비된 약물의 제거를 용이하게 하는 이중 효과를 가진다. 해당 기술분야에서 Cys-변형된 모노시스테인 티오레독신에 대해 구상된 이전의 치료 용도는 전신 순환계 안으로의 주사 후에 내피 세포에서 지질 뗏목(lipid raft)을 통해 비-환원 형태의 흡수를 용이하게 하는 것이 유일한 용도였고(Hara et al., Antiox Redox Sig 9:1427-37, 2007; Kondo et al., Antiox Redox Sig 9:1439-48, 2007; 미국 특허 출원 20080119398, 20090075871 및 20100184215), 그로써 전신적인 노출과 세포내 흡수를 방지하는 데 초점을 둔 본 발명으로부터 교시되는 것은 환원된 형태의 모노시스테인 활성 부위 티오레독신의 증강된 효능 및 안전성에 대한 세포외 메커니즘은 예상하지 못한 것이고 매우 신규한 것이다.

기도의 점액 폐쇄는 CF 환자에서 상당한 이환율 및 사망률을 유발할 수 있다. 본 발명자는 기도 내에서 이들 분비물의 존속을 용이하게 하는 점탄성 특성이 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 Trx에 의해 현저하게 줄어드는 것을 증명하였다. 이런 결론은 2 부류의 실험 증거에 의해 지지된다. 먼저, 압축 분석 결과는 모노시스테인 Trx와의 인큐베이션 중에 CF 가래의 겔 매트릭스로부터 다량의 액체가 방출되는 것을 보여준다. 이 방출과 동시에 고체 물질의 부피 감소가 일어나는데, 그것은 겔을 형성하는 가래의 구성성분들이 용해되었음을 가리킨다. 이런 CF 가래 점도의 정상화는 보통 인큐베이션 기간 중에 CF 가래 샘플에서 총체적으로 관찰될 수 있고, 그러므로 원심분리로 인한 파괴의 인위적 결과가 아니다. 모노시스테인 Trx에 의한 액체의 이탈은 기도 표면에서 물 부피의 복귀가 CF 상피의 점액섬모 수송 능력을 복귀시킬 수 있고(Jiang et al., Science 262:424-427, 1993), Button 등의 겔-온-브러쉬 모델을 토대로(Science, 2012), 과잉 점도의 완화가 기저의 섬모주변 층의 수화를 허용하고 점액섬모 수송을 회복시키며, 그것의 손실은 CF의 병리학의 일차적인 원인이기 때문에 중요한 치료적 함의를 가지는 것으로 기대된다. 두 번째로, 자기 마이크로유동계(magnetic microrheometry) 측정은 가래 점탄성이 모노시스테인 Trx에 의한 가래 성분들의 환원의 결과로서 약화하는 직접적인 증거를 제공한다.

CF 가래는 액체 및 고체 특성 두 가지를 모두 나타내는 비-뉴턴 유체이다. 중합체는 저농도로 용액에 존재할 때 자유롭게 회전할 수 있다. 중합체가 그것의 회전이 방해되는 정도로 회전되거나 교차결합될 때, 용액은 삼투 한계치로 불리는 전이 단계에 도달한 것이다(Forgacs, J Cell Sci 108:2131-2143, 1995). 삼투 한계치에서 용액은 고체 특성을 얻기 시작하고, 탄성률은 더 많은 교차-중합체 상호작용이 부가되면서 샘플 중의 각각의 필라멘트가 매트릭스 안에 통합될 때까지 계속 증가한다. 생화학적 분석은 호흡관을 라이닝하고 있는 세포들에 의해 분비된 뮤신 MUC5AC 및 MUC5B가 기도 점액의 주요 겔 형성 중합체 성분들인 것을 나타냈다(Hovenberg et al., Glycoconj J 13:839-847, 1996; Thornton et al., Biochem J 316:967-975, 1996; Thornton et al., J Biol Chem 272:9561-9566, 1997). 이들 뮤신에 존재하는 시스테인 도메인은 중합체 형성에 기여하고, 아마도 겔 메쉬 얽힘에 기여자일 분자내 이황화 결합 형성(Bell et al., Biochem J 357:203-209, 2001; Asker et al., Biochem J 333:381-387, 1998)에 의해 인근의 뮤신 사슬과의 상호작용에 기여한다. 단백질 상의 이황화 결합이 Trx 효소 활성에 대한 바람직한 기질이기 때문에, 뮤신 중합체는 Trx에 의한 가래의 액화 중에 환원에 대한 표적이다. 이것은 Trx-처리된 가래의 고분자량 당형태의 용해도의 변화를 나타내는 PAS 염색에 의해 지지된다. Trx-노출된 가래의 액상 중의 당단백질의 더 큰 농도의 검출은 나아가 더 강한 황색에 의해 표시되고 희석제-처리된 샘플로부터 유도된 액상보다 더 큰 불투명도를 가졌다. Trx-노출된 가래 중의 PAS-검출가능한 당단백질의 증강된 전기영동적 이동성은 또한 이들 거대분자가 효소적 환원 중에 크기가 감소할 수 있음을 시사한다. 이 전기영동 분석 결과는 액상으로의 당단백질 방출이 Trx에 대한 노출 중에 겔 매트릭스의 질량 감소와 일치하는 것을 입증함으로써 압축 분석 측정과 일치할 뿐만 아니라 Trx 처리 후에 가래의 유리 티올의 표지화의 증가의 관찰과도 일치한다(Rancourt, R. et al., Free Radic Biol Med, 42(9):1441-1453, 2007).

일단 염증 및 감염의 만성 효과가 CF 환자에서 수립되면, 질환에 걸린 CF 폐의 기도 내의 친핵 용해는 기도 분비물 안으로의 세포외 DNA의 축적(deposition)을 초래한다(Lethem et al., Eur Respir J 3:19-23, 1990). 이 DNA는 비-공유 상호작용에 의해 뮤신 당단백질 내에서 얽혀져서 점액 겔 점탄성을 증가시킨다(Sachdev et al., Chest 81:41S-43S, 1982). 가래에 존재하는 DNA는 Trx 처리 후에 점점 더 가용성이 된다. 그것에 대한 논리적인 설명은 Trx 활성이 DNA와 영향을 받은 거대분자 사이의 얽힘 상호작용을 완화시키기에 충분한 구조 변화를 겔 매트릭스 내에서 유발한다는 것이다. 이 증가된 DNA 용해성은 Trx에 대한 노출 중에 관찰된 CF 가래의 점탄성 변화에 대해 어떠한 상대적 기여를 하는지는 불확실하다. 그럼에도 불구하고, 임상적인 관점에서, 가래의 불용성 겔 상으로부터 DNA의 풀림 또는 제거는 CF에서 그런 처리 중에 DNase 활성에 대해 그것을 보다 민감하게 만들 수 있다. 또한, 점액 점도를 감소시키고 뮤신 시스테인 상의 이황화 결합의 신속한 재형성을 방지하는 모노시스테인 r(Cys)hTrx의 작용은, 보다 투과성과 접근가능성이 높은 점액층뿐 아니라 축적된 점액 플러그의 부피를 축소시키는(de-bulking) 기능을 할 것이다. 이들 작용은 다른 치료법들이 폐 깊숙이, 및 폐의 상피 표면에 접근하는 것을 용이하게 할 것으로 예상된다. 그러므로 발명의 기작적 방법은 CF 및 다른 폐쇄성 폐 질환에 대한 기존의 증상 치료법, 예컨대 흡입성 항생물질, 점액작용 물질 또는 점액용해성 DNA-가수분해제의 전달과의 강력한 상조작용 가능성을 가진다.

모노시스테인 활성 부위를 함유한 Trx는 환원된 글루타티온보다 더 높은 활성 및 더 큰 산화 안정성을 가지고 기도 점액에서 세포외적으로 작용하며 폐 세포 안으로 들어가지 않는다. 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 Trx는 점도를 감소시키고, 액체 분획을 증가시키며, 가래, 예를 들면 CF 가래의 점탄성을 약화시킨다. 액체의 방출을 자극하고, 기도 분비물의 점도를 감소시키는 점액-환원 시스템의 개발은 예컨대 CF와 같은 질환뿐만 아니라 다른 호흡기 질환(예컨대 만성 또는 급성 기관지염; 기관지 확장증; COPD/기종; 천식; 급성 기관염; 급성 또는 만성 부비강염; 기도의 급성 또는 만성 점액 막힘으로부터 유발되는 폐확장부전; 세기관지염) 또는 다양한 소화성 장애(즉 위장의), 예컨대 콕시디아증 또는 과잉의 또는 비정상적인 점액 점도 및/또는 점착성과 결부되거나 그것에 의해 악화된 생식성 장애(예컨대 점액 농화(inspissation)로 인한 급성, 아급성 또는 만성 장 폐색; 필수적인 생식 구조의 폐색으로 인한 불임)와 결부될 수 있는 과잉의 또는 비정상적인 점액 점도 및/또는 점착성에 대해 치료적 잠재력을 가지는 것으로 예상된다. 환원된 상태의 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 Trx는 일단 그것이 뮤신 이황화 결합과 반응한 후에는 뮤신에 공유 결합되기 때문에, 그런 작용 메커니즘은 또한 점액과 함께 사용한(산화된) 약물의 제거를 용이하게 할 것이고, 세포 흡수 및 티오레독신-중재된 산화환원 신호화를 방지하거나 약화시킬 수 있으며, 면역 세포에 대한 제공을 방지하거나 약화시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 실시형태는 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 점도를 정상화하고 감소시키기 위한 방법에 관련된다. 그 방법은 환자의 점액 또는 가래를 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 단백질은 접촉 단계 전과 비교하여 점액 또는 가래의 점도를 감소시키기에 효과적이다.

본 발명에 따르면, 용어 "점액"은 일반적으로 호흡관, 위장관 및 생식관을 포함하여, 다양한 신체 조직의 점막에 의해 분비된 대체로 투명한 점성 유체를 말한다. 점액은 그것이 분비되는 조직들을 촉촉하게 하고, 윤활시키며 보호한다. 점액은 점액의 겔-형성 구성성분인 뮤신 거대분자(점액 단백질, 핵산 및 탄수화물을 포함함)를 포함한다. 점액 단백질은 호흡기 점액 단백질과 소화관 점액 단백질을 포함하며, 그들로 한정되지 않는다. 정상 점액의 점탄성 특성은 뮤신 중합체의 농도, 분자량 및 뮤신 중합체들 간의 얽힘 정도에 좌우된다. 용어 "가래"는 일반적으로 점액을 포함하여, 침과 호흡기를 통과하는 배출물의 혼합물을 말한다. 가래는 전형적으로 침과 점액(및 호흡기 조직으로부터의 다른 배출물)의 뱉어내는 혼합물이다. 그러므로, 점액은 가래의 주요 성분이고, 그 자체로서 과도하게 점성인 점액의 존재는 역시 과도하게 점성인 가래를 초래한다. 본 발명은 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 것에 관련된다. 용어 "액화"는 더 많이 액체로 되어가는 작용을 말한다. 그러므로, 점액 또는 가래의 액화의 증가는 더 단단하거나 점성인 상과 비교하여 점액 또는 가래의 액상 또는 액체 상태의 증가를 말한다. 질환과 관련된 비정상적으로 점성이거나 과도한 점액의 경우에, 목적은 점액 점도의 정상 수준으로 복귀시키는 것이다. 그러므로 액화는 또한 점액 점도의 감소로서 생각될 수 있다.

정상적인 점액 기능은 생물학적 환원제의 산화가능한 시스테인에 대한 적절한 비율을 가짐으로써 이루어지는 것으로 인지된다. 그러므로, 생물학적 환원제 활성의 결핍은 과잉의 산화가능한 시스테인 또는 생물학적 환원제의 부족에 의해 유발된다.

신체에서 점액과 가래의 일반적인 기능은 점액(및 그로써 가래의 점액 성분)이 점탄성 특성을 가질 것을 필요로 한다. 정상적인 점액과 가래를 가지는 개인(즉 건강한 개인 또는 보다 구체적으로, 점액 또는 가래의 점도 또는 점착성에 의해 유발되거나 악화된 증상 또는 질환으로 고생하지 않는 개인)에서, 점탄성은 뮤신 중합체의 농도, 분자량 및 뮤신 중합체들 간의 얽힘에 좌우된다(Verdugo et al., Biorheology 20:223-230, 1983). 특히 CF에서, 점액 중의 뮤신이 DNA(Potter et al., Am J Dis Child 100:493-495, 1960; Lethem et al., Am Rev Respir Dis 100:493-495, 1990; Lethem et al., Eur Respir J 3:19-23, 1990) 및 죽어가는 염증 세포들로부터 방출된 f-악틴 중합체(Sheils et al., Am J Path 148:919-927, 1996; Tomkiewicz et al., DNA and actin filament ultrastructure in cystic fibrosis sputum. In: Cilia, mucus, and mucociliary interactions, edited by Baum GL, Priel Z, Roth Y, Liron N, and Ostfeld EJ. New York, NY: Marcel Dekker, 1998)와 반응할 때, 점액(및 그로써 가래)은 부가적으로 더 조밀해지고 점성이 될 수 있다. 기침 또는 점액섬모 제거에 의해 비정상적이고 농축된 점액을 제거할 수 없는 무능력은 폐가 기회감염 병원체로 콜로니화되는 것을 용이하게 한다. 그러므로, 비정상적으로 또는 과도하게 점성 및/또는 점착성 뮤신은 정상 또는 건강한 환자(바람직하게는 연령 및 성별-매치된 환자)로부터의 점액보다 측정가능하게 또는 검출가능하게 더 점성이거나 점착성인 점액으로서, 점도 및/또는 점착성의 수준에 의하여, 환자에게 불편함이나 고통을 유발하는, 또는 질환 또는 질환을 유발하거나 악화시키는 환자의 적어도 하나의 증상을 유발하거나 기여하는 점액으로서 특성화된다. 달리 표현하면, 비정상적으로 또는 과도하게 점성이거나 및/또는 점착성인 가래는 정상 점액 또는 가래로부터 벗어난 것이고, 이때 환자는 질환으로부터 어느 정도의 완화를 제공하기 위해 또는 다른 치료적 유익을 제공하기 위해 치료하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법 및 조성물은 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 것이 바람직한 임의의 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 특정 폐, 부비강, 코, 소화성 또는 위장, 또는 생식성 질환 또는 질환을 가진 환자들은 본 발명의 방법을 사용하여 치료로부터 유익을 취할 수 있다. 본 발명은 당연히 폐-관련 질환, 예컨대 낭포성 섬유증뿐 아니라 소화성 질환, 예컨대 콕시디아증을 포함하여 점액 또는 가래의 비정상적인 또는 과도한 점도 및/또는 점착성에 의해 유발되거나 악화된 질환 또는 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하거나 감소시키는 데 가장 유용하다. 다른 질환들은 점액 또는 가래의 비정상적인 또는 과도한 점도 및/또는 점착성과, 적어도 어느 시기에는 관련될 수 있고, 그런 증상이 발생할 때, 본 발명의 방법은 점액 또는 가래의 점도를 감소시키고 적어도 어느 정도의 완화 또는 치료적 유익을 환자에게 제공하기 위해 사용될 수 있다. 그런 질환의 예시로는, 그들로 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 낭포성 섬유증, 만성 또는 급성 기관지염; 기관지 확장증(비-CF 및 CF 기관지 확장증); COPD/기종; 급성 기관염(박테리아, 바이러스, 마이코플라스마성 또는 다른 유기체에 의해 유발된); 급성 또는 만성 부비강염; 기도의 급성 또는 만성 점액 막힘으로부터 유발되는 폐확장부전(폐 또는 대엽성 붕괴)(때로는 천식과 같은 다양한 질환에서 찾아볼 수 있음); 점액 농화로 인한 급성, 아급성 또는 만성 장 폐색, 이를테면 그들로 한정되는 것은 아니지만 태변 장폐색증 또는 CF 또는 유사한 장애에서 동등한 태변 장폐색증; 자궁 경관, 정관 또는 다른 필수적인 생식 구조의 폐색으로 인한 다른 소화성 질환 및 불임(이들로 제한되지 않음). 또한, 개선된 점액섬모 제거가 폐로부터 박테리아 및 다른 병원체의 제거와 관련되기 때문에, 본 발명의 조성물 및 방법은 다양한 호흡기 감염, 이를테면 바이러스 감염과 박테리아 감염이 있는 환자들이 보이는 점액 또는 가래의 과잉 점도 및/또는 점착성과 결부된 증상들을 감소시키는 데 유용할 수 있다.

그러므로 치료적 유익은 본질적으로 특정 질환 또는 질환에 대한 치유가 아니라, 오히려 바람직하게, 가장 전형적으로 질환 또는 질환의 경감, 질환 또는 질환의 제거, 질환 또는 질환과 관련된 증상의 감소 또는 제거, 일차 질환 또는 질환(예컨대 호흡관의 과도한 점성 점액의 장점을 취하는 기회감염 병원성 미생물에 의해 유발된 감염성 질환)의 발생으로부터 유발된 이차 질환 또는 질환의 방지 또는 경감 및/또는 기저 질환 또는 질환, 또는 질환 또는 질환과 관련된 증상의 방지를 포함하는 결과를 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같이, 구절 "질환으로부터 보호된"은 질환의 증상들을 감소시키는 것; 완화 치료법(치유를 시행하지 않고 질환의 증상을 완화시키거나 진정시키는 것); 질환의 발생을 감소시키거나 및/또는 질환의 심각성을 감소시키거나 질환 또는 질환의 적어도 하나의 증상, 신호 또는 원인을 경감시키는 것을 말한다. 방지는 환자에게 투여될 때 본 발명의 조성물이 질환이 발생하는 것을 방지하는 능력을 말한다. 치유(또는 질환-변형)는 환자에게 투여될 때 본 발명의 조성물이 질환을 치유하는 능력을 말한다. 질환으로부터 환자를 보호하는 것은 질환을 가진 환자를 치료하는 것을 포함한다(치료적 치료). 질환/질환을 방지하는 것은 질환 발생의 방지를 포함한다(예방적 치료). 특히, 질환으로부터 환자를 보호하는 것(또는 질환을 방지하는 것)은 유익한 효과가 얻어지도록 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 점액 또는 가래를 접촉시킴으로써 환자의 비정상적인 점성의 점액 또는 가래의 액화를 증가시킴(정상화)으로써 이루어진다. 유익한 효과는 해당 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 및/또는 환자를 치료하는 훈련된 의사에 의해 쉽게 평가될 수 있다. 용어 "질환"은 환자의 정상적인 건강으로부터의 모든 일탈을 말하고 질환 증상들이 존재할 때의 상태뿐 아니라 일탈(예컨대 감염, 유전자 돌연변이, 유전자 결함 등)이 발생했지만 증상이 아직 나타나지는 않은 상태를 포함한다.

환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드(또는 그런 단백질을 포함하는 조성물)과 환자의 점액 및/또는 가래의 접촉은 그 조성물과의 접촉 전과 비교하여 점액 또는 가래의 감소된 점도/증가된 액화를 초래하기 위해 의도된다. 본 발명에 따르면, 점액 또는 가래의 액화의 증가는 액화 이전 수준과 비교하여 점액 또는 가래의 액화 수준의 어떠한 측정가능하거나 검출가능한 증가일 수 있고, 바람직하게 통계학적으로 유의미한 증가이다(즉 환자 샘플과 기준 대조군 사이의 측정된 액화 수준의 차이가 신뢰도가 적어도 p<0.05로 통계학적으로 유의미하다). 전형적으로, "기준 대조군"은 정상적이고 건강한 개인은 일반적으로 대조군으로서 작용하기에 충분한 양의 가래를 생성할 수 없기 때문에 치료의 투여 전 환자 샘플이지만, 정상적인 건강한 개인으로부터의 가래가 기준 대조군으로서 배제되지는 않는다. 추가로, 감소는 폐기능의 개선을 초래하는 점도이다. 이 개선은 환자가 기록한 결과, 병원 입원을 위한 악화의 평균 시간 및/또는 강제 호기량(FEV)의 증가를 포함하여 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다. 발명의 한 측면에서, FEV의 증가는 본 발명의 조성물 또는 단백질과 접촉하기 전의 환자로부터의 샘플과 비교하여 적어도 약 2.5%, 약 3.0%, 약 3.5 %, 약 4.0%, 약 4.5%, 약 5.0%, 약 5.5%, 약 6.0%, 약 6.5%, 약 7.0%, 약 7.5%, 약 8.0%, 약 8.5%, 약 9.0% 및 9.5% and 약 10%의 증가로서 기술된다. 바람직하게, 본 발명의 단백질 또는 조성물과 환자 샘플의 점액 또는 가래와의 접촉은 본 발명의 조성물 또는 단백질과 접촉하기 전의 환자로부터의 샘플과 비교하여 약 2.5%의 증가를 초래한다. 점액 또는 가래의 액화 및/또는 점도의 감소는 해당 기술분야에 알려져 있는 임의의 적절한 기법, 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 실시예 단원에서 기술되는 것과 같은 압축 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 그런 분석에서, 수성 상태(액체)에 비해 고체 상태(겔)에서의 점액 또는 가래의 양이 측정된다. 발명의 다른 측면에서, 점액 또는 가래의 상대적인 점도 또는 점착성은 그들로 한정되는 것은 아니지만 점탄성(예를 들면 자기 마이크로유동계에 의해 측정됨), 당단백질 함량 또는 DNA 함량을 포함하여 다른 변수들 또는 인디케이터들을 사용하여 측정될 수 있다. 발명의 다른 측면에서, 점액 단백질 이황화 결합의 변화는 이황화 결합의 파괴에 의해 생성되는 미결합(유리) Cys 잔기 티올기와 우선적으로 반응하는 NEM(N-에틸말레이미드)와 같은 시약을 사용함으로써 추정될 수 있다(Rancourt, R. et al., Free Radic Biol Med, 42(9):1441-1453, 2007). 발명의 한 측면에서, 액화 수준은 점액 또는 가래 샘플의 총 부피의 백분율로서 수성(액체) 상에 존재하는 주어진 점액 또는 가래 샘플의 양으로서 기술된다. 예를 들어 낭포성 섬유증을 가진 환자에서, 점액 또는 가래의 액화 수준은 총 부피의 10% 미만 또는 심지어 5% 미만으로 낮을 수 있다. 바람직하게, 발명의 단백질 또는 조성물과 점액 또는 가래와의 접촉은 총 부피의 적어도 약 15%가 액상으로 존재하도록, 보다 바람직하게 총 부피의 적어도 약 20%가 액상으로 존재하도록, 보다 바람직하게 총 부피의 적어도 약 25%가 액상으로 존재하도록, 보다 바람직하게 총 부피의 적어도 약 30%가 액상으로 존재하도록, 보다 바람직하게 총 부피의 적어도 약 35%가 액상으로 존재하도록, 보다 바람직하게 총 부피의 적어도 약 40%가 액상으로 존재하도록, 보다 바람직하게 총 부피의 적어도 약 45%가 액상으로 존재하도록, 보다 바람직하게 총 부피의 적어도 약 50%가 액상으로 존재하도록, 또는 점액에 의해 유발된 기능의 차단 또는 억제가 사라질 때까지(예컨대 환자 기도가 유체를 뱉기 시작할 수 있을 정도로 충분하게 제거되기까지) 점액 또는 가래의 액화의 변화를 초래한다. 일반적으로, 점액 또는 가래의 액화는 기도 또는 다른 차단된 통로(예컨대 위장관 또는 생식관에 있는)가, 과잉으로 가래가 액화되는 일 없이 제거될 때까지 조금씩, 점진적인 증분으로 증가된다. 점액 또는 가래의 과잉 액화는 바람직하지 않은데, 그것이 환자에게 해로울 수 있기 때문이다(예컨대 액화된 가래는 역류할 수 있고 가래가 환자에 의해 제거되기 전에 또한 감염될 수 있는 희석된 액체로 작은 기도가 넘칠 수 있다). 바람직하게, 발명의 단백질, 펩타이드 또는 조성물의 점액 또는 가래와의 접촉은 치료 전과 비교하여 점액 또는 가래의 액화에서 환자 기도 또는 다른 막힌 통로가 정화될 때까지 1%의 증분으로, 적어도 약 1 부피%의 증가, 보다 바람직하게 적어도 약 2 부피%의 증가, 등을 유발한다. 작은 기도 및 폐포에 대한 약물의 접근을 개선하기 위해, 일단 그런 제거가 예컨대 소위 "점액 플러그"의 제거(removal)에 의해 얻어지면, 이황화 결합의 정상 상태에서 새롭게 분비된 뮤신 단백질을 유지하기 위해 저-용량 유지 치료법이 착수될 수 있다.

한 측면에서, 치료법은 환자의 영향을 받은 조직(호흡관, 소화관, 생식관)으로부터의 희석된 물질을 제거하기 위한 방법들과 함께 수행된다. 예를 들어 호흡계의 경우, 당업자는 체위 배액(postural drainage), 쌕쌕거리는 기침(huff couhging) 및 다른 호흡기 운동과 함께, 또는 액화된 점액 또는 가래를 뱉어내기 위한 임의의 다른 적절한 방법과 함께 본 발명의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 치료되어야 하는 환자의 점액 또는 가래는 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질(또는 그 단백질을 포함하는 조성물)과 접촉된다. 단백질은 접촉 단계 전과 비교하여 가래 또는 점액의 점도 및 점착성을 감소시키고 및/또는 가래 또는 점액의 액화를 증가시키기에 효과적이다. 앞에서 기술된 것과 같이, 티오레독신은 많은 티올-의존성 세포 환원 과정에 참여하는 대부분의 유기체에서 발견되는 단백질 이황화물 환원효소이다. 인간에서, 티오레독신은 또한 성인 T 세포 백혈병-유도 인자(ADF)로서 언급되기도 한다. 이 편재성 저분자량(11,700) 단백질의 대부분은 세포 내에서 환원된 상태로 유지된다. 환원되거나 산화된 티오레독신은 무상 세포에 유입되거나 세포막에 흡수될 수 있고, 거기에서 시간의 경과에 따라 소량이 점차적으로 내재화된다. 천연 티오레독신은 산화된 단백질 형태로 단백질의 3차원 구조로부터 돌출되어 위치한 이황화 가교를 형성하는 활성 부위에 2개의 인접한 시스테인 잔기를 가진다. 플라보단백질 티오레독신 환원효소는 이 이황화물의 NADPH-의존성 환원을 촉매한다. 또한 변경된 공동 인자 특이성을 위해 변형된 티오레독신 환원효소의 공학적으로 처리된 버전은 미국 특허 제7,071,307호(참조로 본 명세서에 포함됨)에서 기술된 것과 같이 NADPH 대신 또는 그것 외에 NADH를 활용할 수 있다. 티오레독신의 작은 증가는 단백질의 설프하이드릴-다이설파이드 산화환원 상태의 현저한 변화를 유발할 수 있다.

세포 단백질의 환원을 실시하는 능력 외에, 티오레독신은 직접 항산화제로서 작용할 수 있지만(예컨대 반응성 산소 종을 스캐빈징함으로써 산화가능한 기질의 산화를 방지함으로써), 다른 티올들과는 달리, 티오레독신은 일반적으로 자동산화함으로써(예컨대 자동산화를 통해 슈퍼옥사이드 라디칼을 생성함) 세포에서 산화 스트레스에 기여하지 않는 것으로 인지된다. White 등의 미국 특허 제5,985,261호(상기 동일)는 티오레독신이 MnSOD의 생성을 직접적으로 유도하고, 그런 유도는 환원된 상태의 티오레독신에 의해 실시되는 것을 보여주었다.

본 발명의 "티오레독신 모노시스테인 활성 부위"는 아미노산 서열 C-X-X-X(서열번호 17)을 포함한다(천연 또는 야생형 서열은 서열번호 16을 가지는 아미노산 서열 C-X-X-C를 포함한다). 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, "C"로 표시되는 아미노산 잔기는 시스테인 잔기이고 "X"로 표시되는 아미노산 잔기는 시스테인 잔기 이외의 임의의 아미노산 잔기일 수 있으며, 특히 나머지 표준 20개의 아미노산 잔기 중 임의의 것이다. 본 발명의 그런 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 바람직하게 아미노산 서열 C-G-P-X(서열번호 18)를 포함하고, 이때 천연 또는 야생형 서열은 아미노산 서열 C-G-P-C(서열번호 1)를 포함한다. 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 추가로 아미노산 서열 X-C-X-X-X-X(서열번호 19)를 포함하고, 이때 천연 또는 야생형 서열은 아미노산 서열 X-C-X-X-C-X(서열번호 20)를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 아미노산 서열 X-C-G-P-X-X(서열번호 21)를 포함하고, 이때 "G"로 표시된 아미노산 잔기는 글리신 잔기이며, "P"로 표시된 아미노산 잔기는 프롤린 잔기이고, 천연 또는 야생형 서열은 아미노산 서열 X-C-G-P-C-X(서열번호 22)를 포함한다. 보다 바람직하게, 본 발명의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 아미노산 서열 W-C-G-P-X-K(서열번호 23)를 포함하고, 이때 "W"로 표시된 아미노산 잔기는 트립토판 잔기이며, "K"로 표시된 아미노산 잔기는 라이신 잔기이고, 천연 서열은 아미노산 서열 W-C-G-P-C-K(서열번호 3)를 포함한다. 바람직하게, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 아미노산 서열 C-X-X-S(서열번호 24)를 포함한다. 본 발명의 그런 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 바람직하게 아미노산 서열 C-G-P-S(서열번호 1)를 포함한다. 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 추가로 아미노산 서열 X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 또는 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)를 포함하고, 이때 "X"로 표시된 아미노산 잔기는 시스테인 잔기 이외의 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. "티오레독신 활성 부위"에 대한 언급은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위 및 천연 또는 야생형 티오레독신 활성 부위를 포함한다.

발명의 한 측면에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질은 상기에서 구조적으로 및 기능적으로 기술된 것과 같은 전-길이 티오레독신 단백질이거나 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 그것의 임의의 단편이다. 모노시스테인 활성 부위를 가지는 바람직한 티오레독신 단백질은 원핵생물 티오레독신, 효모 티오레독신, 식물 티오레독신 및 포유류 티오레독신을 포함하고, 인간 티오레독신이 특히 바람직하다. 다양한 유기체로부터의 티오레독신의 핵산 및 아미노산 서열은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들어 서열번호 4 내지 15는 다음으로부터 유래된 티오레독신에 대한 아미노산 서열을 나타낸다: 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)(서열번호 4), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)(서열번호 5), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)(서열번호 6), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)(서열번호 7), 갈루스 갈루스(Gallus gallus)(서열번호 8), 무스 무스쿨루스(Mus musculus)(서열번호 9), 라투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus)(서열번호 10), 보스 타우루스(Bos taurus)(서열번호 11), 호모 사피엔스(Homo sapiens)(서열번호 12), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(서열번호 13), 제아 메이스(Zea mays)(서열번호 14) 및 오리자 사리바(Oryza sativa)(서열번호 15). 이들 서열의 각각을 참조하면, X-C-G-P-C-X(서열번호 22) 모티프(서열번호 1의 CGPC 모티프를 포함함)는 다음과 같이 발견될 수 있다: 서열번호 4(위치 33 내지 38), 서열번호 5(위치 28 내지 33), 서열번호 6(위치 27 내지 32), 서열번호 7(위치 29 내지 34), 서열번호 8(위치 31 내지 36), 서열번호 9(위치 31 내지 36), 서열번호 10(위치 31 내지 36), 서열번호 11(위치 31 내지 36), 서열번호 12(위치 31 내지 36), 서열번호 13(위치 59 내지 64), 서열번호 14(위치 88 내지 93) 및 서열번호 15(위치 94 내지 99). 더욱이 인간 및 박테리아 티오레독신을 포함하여, 여러 티오레독신 단백질의 3차원 구조가 해석되었다. 그러므로 다수의 유기체로부터의 티오레독신의 구조 및 활성 부위는 해당 기술분야에서 잘 알려져 있고 당업자는 본 발명에 사용될 수 있는 모노시스테인 활성 부위를 가지는 티오레독신을 포함하여, 전-길이 티오레독신의 단편들 또는 동족체를 쉽게 확인하고 생성할 수 있을 것이다.

구절 "환원된 상태의"는 구체적으로 본 발명의 단백질 또는 펩타이드의 활성 부위 중의 시스테인 잔기의 상태를 나타낸다. 환원된 상태에서, 인접한 시스테인 잔기들은 다이티올(즉 두 개의 유리 설프하이드릴기 -SH)를 형성한다. 대조적으로, 그런 시스테인 잔기들은 산화된 형태에서 분자내 이황화 가교를 형성한다; 그런 분자들은 시스틴으로서 언급될 수 있다. 환원된 상태에서, 모노시스테인 티오레독신 활성 부위는 활성 부위 티올의 이황화물로의 가역적인 산화를 통해 산화환원 반응에 참여할 수 있고, 하나의 표적 이황화물 Cys에 대한 공유 연결을 초래하는 티올-이황화물 교환 반응을 촉매한다. 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 본 발명의 단백질 또는 펩타이드에 대해, 활성 부위의 N-말단 시스테인은 모노티올과 같은 환원된 상태로 존재하고, 그러므로 표적 단백질 상의 시스테인과 안정된 혼합-이황화물을 형성할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 본 발명의 단백질은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위 자체이거나 글리코시드 연결에 의해 다른 아미노산들에 결합된 티오레독신 모노시스테인 활성 부위일 수 있다. 그로써, 본 발명의 단백질 또는 펩타이드의 최소 크기의 길이는 약 4 내지 약 6 아미노산이고, 바람직한 크기는 그런 단백질의 전-길이, 융합, 다가 또는 단지 기능성 부분 중 어느 것이 바람직한가에 좌우된다. 바람직하게, 본 발명의 단백질 또는 펩타이드의 길이는 약 4 내지 약 100 아미노산 잔기 또는 그 이상으로 연장되고, 전체 정수(즉 4, 5, 6, 7...99, 100, 101….) 중에서 임의의 중간 길이의 펩타이드가 구체적으로 구상된다. 또한 Bachnoff 등에 의해 기술된 것과 같이(Bachnoff et al., Free Radical Biol Med 50:1355-67, 2011), N 및 C 말단에서 차단된 짧은 티오레독신 모방 펩타이드가 있을 수 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 전-길이 단백질 또는 그런 단백질의 어떠한 동족체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 용어 "동족체"는 자연 발생 단백질 또는 펩타이드에 대한 변형에 의해 자연 발생 단백질 또는 펩타이드(즉 "원형" 또는 "야생형" 단백질)과 상이하지만, 자연 발생 형태의 기본 단백질 및 측쇄 구조를 유지하고, 및/또는 천연 단백질의 적어도 생물학적 활성 부분(예컨대 티오레독신 활성 부위)의 기본 3차원 구조를 유지하는 단백질 또는 펩타이드를 나타내기 위해 사용된다. 그런 변화는 그들로 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 하나 또는 소수의 아미노산 측쇄의 변화; 하나 또는 소수의 아미노산의 변화, 이를테면 결실(예컨대 단백질 또는 펩타이드의 절단된 버전(단편)), 삽입 및/또는 치환; 하나 또는 소수의 원자의 입체화학의 변화; 및/또는 약간의 유도체화, 이를테면 그들로 한정되는 것은 아니지만 메틸화, 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미토일화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜 이노시톨의 첨가. 본 발명에 따르면, 본 발명에 유용한 임의의 단백질 또는 펩타이드는 천연 티오레독신 단백질의 동족체를 포함하여, 환원된 상태에서 단백질 또는 펩타이드가 그것의 활성 부위 티올의 이황화물로의 산화를 통해 산화환원 반응에 참여하거나 및/또는 점액 또는 가래의 점도 또는 점착성을 감소시키거나 점액 또는 가래의 액화를 증가시킬 수 있도록 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 가진다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 티오레독신에 유사한 특성들을 가질 수 있고, 바람직하게 원핵생물 티오레독신, 진균류(효모를 포함함) 티오레독신, 식물 티오레독신 또는 포유류 티오레독신의 군으로부터 선택된 티오레독신이다. 특히 바람직한 실시형태에서 단백질은 인간 티오레독신이다.

동족체는 천연 대립유전자 변이 또는 천연 돌연변이의 결과일 수 있다. 단백질을 코드화하는 핵산의 자연 발생 대립유전자 변이체는 그런 단백질을 코드화하지만, 예를 들면 돌연변이 또는 재조합에 의해 유발된 천연 변이로 인해 유사하지만 동일하지는 않은 서열을 가지는 유전자와 본질적으로 동일한 게놈의 유전자좌(또는 유전자좌들)에서 일어나는 유전자이다. 대립유전자 변이체들은 전형적으로 그것들과 비교되는 유전자에 의해 코드화된 단백질의 활성과 유사한 활성을 가지는 단백질들을 코드화한다. 대립유전자 변이체들의 한 부류는 동일한 단백질이지만 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 상이한 핵산 서열을 가지는 단백질을 코드화할 수 있다. 대립유전자 변이체는 또한 유전자의 5' 또는 3' 미번역 영역(예컨대 조절성 제어 영역)에 있는 변경을 포함할 수 있다. 대립유전자 변이체들은 해당 기술분야에 숙련된 당업자들에게 잘 알려져 있다.

동족체는 그들로 한정되는 것은 아니지만, 분리된 자연 발생 단백질에 대한 직접 변형, 직접 단백질 합성 또는 예를 들면 무작위 또는 표적화된 돌연변이생성을 실시하기 위해 고전적이거나 재조합 DNA 기법을 사용하는, 단백질을 코드화하는 핵산 서열에 대한 변형을 포함하여 단백질의 제조를 위해 해당 기술분야에 알려져 있는 기법들을 사용하여 생성될 수 있다.

야생형 단백질과 비교하여 동족체의 변형은 자연 발생 단백질과 비교하여 동족체의 기본적인 생물학적 활성에 작용하거나, 길항하거나 또는 실질적으로 변화시키지 않는다. 일반적으로, 단백질의 생물학적 활성 또는 생물학적 작용은 생체 내에서(즉 단백질의 천연 생리적 환경에서) 또는 시험관 내에서(즉 실험실 조건하에서) 측정되거나 관찰되는 바, 단백질의 자연 발생 형태로 인한 단백질에 의해 나타나거나 수행된 임의의 기능(들)을 말한다. 예컨대 동족체 또는 모방물(아래에서 논의됨)에서와 같은 단백질의 변형은 자연 발생 단백질과 동일한 생물학적 활성을 가지는 단백질, 또는 자연 발생 단백질과 비교하여 감소되거나 증가된 생물학적 활성을 가지는 단백질을 초래할 수 있다. 단백질 발현의 감소 또는 단백질의 활성의 감소를 초래하는 변형들은 단백질의 비활성화(완전하거나 부분적인), 하향 조절 또는 감소된 작용으로서 언급될 수 있다. 유사하게, 단백질 발현의 증가 또는 단백질의 활성의 증가를 초래하는 변형들은 단백질의 증폭, 과잉생성, 활성화, 증강, 상향 조절 또는 증가된 작용으로서 언급될 수 있다.

한 실시형태에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 약물 디자인 또는 선택의 산물일 수 있고 해당 기술분야에 알려져 있는 다양한 방법들을 사용하여 생성될 수 있다. 그런 단백질 또는 펩타이드는 모방물로서 언급될 수 있다. 모방물은 보통 자연 발생 펩타이드의 기본 구조를 모방하고 및/또는 자연 발생 펩타이드의 두드러진 생물학적 특성을 가지는 기본 구조를 가지기 때문에, 모방물은 자연 발생 펩타이드의 생물학적 작용을 모방할 수 있는 임의의 펩타이드 또는 비-펩타이드 화합물을 말한다. 모방물은 그들로 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함할 수 있다: 원형으로부터 상당한 변형을 가지는 펩타이드, 예컨대 자연 발생 펩타이드와의 측쇄 유사성이 없는 펩타이드(그런 변형은 예를 들면 펩타이드의 분해에 대한 민감성을 감소시킬 수 있다); 항-이디오타입 및/또는 촉매 작용 항체, 또는 그것들의 단편; 분리된 단백질의 비-단백질성 부분(예컨대 탄수화물 구조); 또는 합성 또는 자연적 유기 분자, 이를테면 예를 들어 조합 화학을 통해 확인된 핵산 및 약물. 그런 모방물들은 해당 기술분야에 알려져 있는 다양한 방법을 사용하여 디자인되고, 선택되며 및/또는 그렇지 않으면 확인될 수 있다. 본 발명에서 유용한 모방물 또는 다른 치료적 화합물을 디자인하거나 선택하기에 유용한 약물 디자인의 다양한 방법들은 문헌에서 개시된다(Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다). 강력하고 선택적인 산화환원 활성을 가질 수 있는 티오레독신 모방 펩타이드는 문헌에서 기술된다(Bachnoff et al., Free Radical Biol Med 50:1355-67(2011), 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다).

모방물은 예를 들면 분자 다양성 전략(크고, 화학적으로 다양한 분자 라이브러리의 신속한 구성을 허용하는 관련된 전략들의 조합), 자연적이거나 합성에 의한 화합물의 라이브러리, 특히 화학적 또는 조합 라이브러리(즉 서열 또는 크기는 상이하지만 유사한 구성 블록을 가지는 화합물들의 라이브러리)로부터 또는 합리적이거나, 특정되었거나 또는 무작위 약물 디자인에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들면 Maulik 등(상기 동일) 참조.

분자 다양성 전략에서, 큰 화합물 라이브러리는 예를 들면 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 탄수화물 및/또는 합성 유기 분자로부터, 생물학적, 효소적 및/또는 화학적 접근법을 사용하여 합성된다. 분자 다양성 전략을 개발하는 데 있어 결정적인 변수들은 하위유닛 다양성, 분자 크기 및 라이브러리 다양성을 포함한다. 그런 라이브러리의 스크리닝의 일반적 목표는 바람직한 표적에 대한 고친화성 리간드를 얻고, 그런 다음에는 무작위 또는 직접 디자인 전략 중 어느 하나에 의해 리드 분자(lead molecule)를 최적화하기 위해 선택된 조합을 순차적으로 적용하여 활용하는 것이다. 분자 다양성의 방법들은 Maulik 등에 의해(상기 동일) 상세하게 기술된다.

Maulik 등은 또한, 예를 들면, 사용자가 적절하게 선택된 단편들의 단편 라이브러리로부터 신규한 분자를 생성하는 방법을 특정하는 특정된 디자인 방법; 사용자가 무작위로 단편들 및 그것들의 조합을 돌연변이시키기 위해 유전자 또는 다른 알고리즘을 사용하는 한편 동시에 후보 리간드의 적합성을 평가하는 선택 기준을 적용하는 무작위 디자인 방법; 및 사용자가 3차원 수용체 구조와 작은 단편 프로브 사이의 상호작용 에너지를 계산하고, 선호하는 프로브 부위들을 함께 연결하는 격자-기초 접근법을 개시한다.

전술한 것과 같은 다양성-생성 방법들은, 특히 활성-부위 모방물과 같이 크기가 감소된 분자에 대해 기능 또는 약리학을 개선하기 위해 디자인된 다른 기법들과 조합될 수 있다. 예를 들어 초기-단계 연구들에서 전망이 있는 것으로 보였던 한 가지 접근법은 화학적 버팀대(brace)인 모든 탄화수소 스테이플의 부위-특이적 도입을 통해 생체 내에서 작용하는 α-나선 접힘 형태에 끼워져 있는(locked in) 합성 미니단백질의 신규한 부류인 탄화수소-스테이플된 α-나선 펩타이드이다. 스테이플링은 펩타이드의 약리학적 성능을 크게 개선시키고, 표적 친화성 및 단백질 가수분해 내성을 증가시키는 한편 화학적 합성에 적절한 더 큰 단백질/효소의 더 작은 펩타이드 버전을 생성한다(Verdine, G. L. and Hilinsky, G. J., Methods Enzymol, 503:3-33, 2012).

본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명에 사용하기에 적절한 단백질은 티오레독신 단백질의 전 길이 서열 또는 본 명세서에 기술된 것과 같이 그것의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 가지는 임의의 단편을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 구성되거나, 구성되는 아미노산 서열을 가진다. 예를 들어 서열번호 4 내지 15의 천연 서열들 중 임의의 하나 또는 본 명세서에 기술된 것과 같은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 다른 동족체들이 발명에 포함된다. 그런 동족체들은 10% 내지 100%의 전체 범위 내의 정수 백분율(10%, 11%, 12%,...98%, 99%, 100%)을 포함하는, 전-길이 티오레독신 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 10% 동일한, 또는 전-길이 티오레독신 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 20% 동일한, 또는 적어도 30% 동일한, 또는 적어도 40% 동일한, 또는 적어도 50% 동일한, 또는 적어도 60% 동일한, 또는 적어도 70% 동일한, 또는 적어도 80% 동일한, 또는 적어도 90% 동일한 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 다르게 명시되지 않는 한, 퍼센트(%) 동일성에 대한 언급은 다음을 사용하여 수행된 상동성의 평가를 말한다: (1) 표준 결함 변수들을 사용한 핵산 검색에 대한 아미노산 검색 및 blastn에 대한 blastp을 사용하는 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 검색, 이때 의문의 서열은 결함에 의해 복합도가 낮은 영역에 대해 여과되는 검색(Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에서 기술됨, 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함됨); (2) BLAST 2 배열(아래에서 기술되는 변수들을 사용함); (3) 및/또는 표준 결함 변수들을 사용하는 PSI-BLAST(위치-특이적 Iterated BLAST). BLAST 2.0 Basic BLAST와 BLAST 2 사이의 표준 변수들의 일부 차이로 인해, 2개의 특이적 서열은 BLAST 2 프로그램을 사용하여 상당한 상동성을 가지는 것으로서 인지되는 것이 당연한 반면, 의문의 서열로서 서열들 중 하나를 사용하여 BLAST 2.0 Basic BLAST에서 수행된 검색은 두 번째 서열을 상부 매치들에서 확인할 수 없었다는 것이 주지된다. 또한, PSI-BLAST는 자동화된 사용이 손쉬운 버전의 "프로파일" 검색을 제공하는데, 그것은 서열 동족체를 찾기 위한 민감한 방법이다. 그 프로그램은 먼저 갭이 있는 BLAST 데이터베이스 검색을 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 위치-특이적 스코어 매트릭스를 구성하기 위해 반송된 임의의 중요한 배열로부터의 정보를 사용하고, 그것은 의문의 서열을 다음 회전의 데이터베이스 검색을 위해 대체한다. 그러므로 퍼센트 동일성은 이들 프로그램 중 어떠한 한 가지를 사용하여 측정될 수 있는 것으로 인지된다.

2개의 특이적 서열은 Tatusova와 Madden에 의해 기술된 것과 같이 서로에 대해 BLAST 2 서열을 사용하여 일렬배열된다(Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 본 명세서에 전체 내용이 참조로 포함됨). BLAST 2 서열 배열은 그 결과의 배열에 갭(결실 및 삽입)의 도입을 허용하는 두 서열 사이의 Gapped BLAST 검색(BLAST 2.0)을 수행하기 위한 BLAST 2.0 알고리즘을 사용하여 blastp 또는 blastn으로 수행된다. 본 명세서에서 명료하게 할 목적으로, BLAST 2 서열 배열은 다음과 같이 표준 결함 변수들을 사용하여 수행된다.

blastn에 대해서는 0 BLOSUM62 매트릭스를 사용한다:

매치에 대한 보상 = 1

미스매치에 대한 페널티 = -2

개방 갭 (5) 및 연장 갭 (2) 페널티

갭 x_드롭오프(dropoff) (50) 기대 (10) 워드 크기 (11) 필터 (온)

blastp에 대해서는 0 BLOSUM62 매트릭스를 사용한다:

개방 갭 (11) 및 연장 갭 (1) 페널티

갭 x_드롭오프 (50) 기대 (10) 워드 크기 (3) 필터 (온).

본 발명에 유용한 단백질은 또한 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 임의의 전-길이 티오레독신 단백질의 적어도 10개의 인접한 아미노산 잔기(서열번호 4 내지 15로 표시되는 천연 서열, 즉 참조 서열의 10개의 인접한 아미노산과 100% 동일성을 가지는 10개의 인접한 아미노산 잔기)를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 티오레독신 단백질의 동족체는 전체 범위 내에 속하는 임의의 길이(10, 11, 12....)를 포함한, 자연 발생 티오레독신 단백질의 아미노산 서열의 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 45개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 55개, 또는 적어도 60개, 또는 적어도 65개, 또는 적어도 70개, 또는 적어도 75개, 또는 적어도 80개 등등, 최대 전-길이 단백질까지를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고 모노시스테인 활성 부위를 포함한다.

본 발명에 따르면, 용어 "인접한" 또는 "연속적인"은, 본 명세서에서 기술된 서열과 관련하여, 깨지지 않은 서열로 연결되는 것을 의미한다. 예를 들어 제2 서열의 30개의 인접한(또는 연속적인) 아미노산을 포함하는 제1 서열이란, 제1 서열이 제2 서열의 30 아미노산 잔기의 깨지지 않은 서열에 대해 100% 동일한 30 아미노산 잔기의 깨지지 않은 서열을 포함하는 것을 의미한다. 유사하게, 제2 서열과 "100% 동일성"을 가지는 제1 서열은 제1 서열이 정확하게 제2 서열에 매치되고 뉴클레오타이드 또는 아미노산들 사이에 갭이 없는 것을 의미한다.

다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 단백질은 중간, 높은 또는 매우 높은 엄격성 조건(아래에서 기술됨) 하에서 천연 티오레독신 단백질을 코드화하는 핵산 분자에(즉, 분자와)(즉 천연 티오레독신 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 가닥의 상보물에) 혼성화할 수 있는 동족체를 코드화하는 핵산 서열인 천연 티오레독신 아미노산 서열에 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함한다. 그런 혼성화 조건은 아래에서 상세하게 기술된다.

본 발명의 티오레독신 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 핵산 서열 상보물은 티오레독신을 코드화하는 가닥에 상보하는 핵산 가닥의 핵산 서열을 말한다. 주어진 아미노산 서열을 코드화하는 이중-가닥 DNA는 단일 가닥 DNA와 그 단일 가닥 DNA에 상보하는 서열을 가지는 그것의 상보 가닥을 포함하는 것이 인지될 것이다. 그러므로, 본 발명의 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 티오레독신 단백질의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 서열과, 및/또는 그런 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 서열의 상보물과 엄격한 혼성화 조건하에서 안정한 하이브리드를 형성하는 그런 핵산 분자들을 포함한다. 상보 서열을 추론하는 방법들은 해당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있다.

본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 혼성화 조건에 대한 참조는 핵산 분자가 유사한 핵산 분자들을 확인하기 위해 사용되는 표준 혼성화 조건을 말한다. 그런 표준 조건은 예를 들면 Sambrook 등의 문헌에 개시되어 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook et al., 상기 동일(구체적으로 p9.31 내지 9.62 참조)(전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된다). 또한, 적절한 혼성화 정도를 계산하기 위한 식 및 다른 정도의 뉴클레오타이드의 미스매치를 허용하는 혼성화를 이루기 위한 세척 조건들은 예를 들면 Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth et al., (상기 동일)(전체 내용이 본 명세서에서 참조로 포함됨)에서 개시된다.

보다 구체적으로, 본 명세서에서 언급된 것과 같은 중간 엄격성 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브하기 위해 사용되는 핵산 분자와 적어도 약 70%의 핵산 서열 동일성을 가지는 핵산 분자의 분리를 허용하는 조건(즉 약 30% 이하의 뉴클레오타이드의 미스매치를 허용하는 조건)을 말한다. 본 명세서에서 언급되는 것과 같은 높은 엄격성 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브하기 위해 사용되는 핵산 분자와 적어도 약 80%의 핵산 서열 동일성을 가지는 핵산 분자의 분리를 허용하는 조건(즉 약 20% 이하의 뉴클레오타이드의 미스매치를 허용하는 조건)을 말한다. 본 명세서에서 언급되는 것과 같은 매우 높은 엄격성 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브하기 위해 사용되는 핵산 분자와 적어도 약 90%의 핵산 서열 동일성을 가지는 핵산 분자의 분리를 허용하는 조건(즉 약 10% 이하의 뉴클레오타이드의 미스매치를 허용하는 조건)을 말한다. 상기에서 논의된 것과 같이, 해당 기술분야의 숙련자는 특정 수준의 뉴클레오타이드 미스매치를 이루기 위한 적절한 혼성화 및 세척 조건을 계산하기 위해 Meinkoth 등의 식(상기 동일)을 사용할 수 있다. 그런 조건은 DNA:RNA 또는 DNA:DNA 하이브리드 중 어느 것이 형성되는 지에 따라 달라질 것이다. DNA:DNA 하이브리드에 대해 계산된 용융 온도는 DNA:RNA 하이브리드에 대한 것보다 10℃ 아래이다. 특별한 실시형태에서, DNA:DNA 하이브리드에 대한 엄격한 혼성화 조건은 약 20℃ 내지 약 35℃(낮은 엄격성), 보다 바람직하게 약 28℃ 내지 약 40℃(보다 엄격함), 보다 더 바람직하게 약 35℃ 내지 약 45℃(보다 더 엄격함)의 온도에서, 적절한 세척 조건하에 6X SSC(0.9M Na⁺)에서 혼성화하는 것을 포함한다. 특별한 실시형태에서, DNA:RNA 하이브리드에 대한 엄격한 혼성화 조건은 약 30℃ 내지 약 45℃, 보다 바람직하게 약 38℃ 내지 약 50℃, 보다 더 바람직하게 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서, 유사하게 엄격한 세척 조건하에 6X SSC(0.9M Na⁺)에서 혼성화하는 것을 포함한다. 이들 값은 약 100 뉴클레오타이드보다 큰 분자에 대한 용융 온도, 0% 폼아마이드 및 약 40%의 G+C 함량의 계산들을 토대로 한다. 다르게는, T_m은 Sambrook et al., 상기 동일, 페이지 9.31 내지 9.62에 설명된 것과 같이 실험적으로 계산될 수 있다. 일반적으로, 세척 조건은 가능한 한 엄격해야 하고, 선택된 혼성화 조건에 대해 적절해야 한다. 예를 들어 혼성화 조건은 특정 하이브리드의 계산된 T_m보다 대략 20 내지 25℃ 아래인 온도 조건과 염의 조합을 포함할 수 있고, 세척 조건은 전형적으로 특정 하이브리드의 계산된 T_m보다 대략 12 내지 20℃ 아래인 온도 조건과 염의 조합을 포함한다. DNA:DNA 하이브리드에 사용하기에 적절한 혼성화 조건의 한 예시는, 약 42℃에서 6X SSC(50% 폼아마이드) 중에서 2 내지 24시간 동안 혼성화한 후, 실온에서 약 2X SSC 중에서 1회 또는 그 이상 세척하는 세척 단계가 이어진 후, 추가로 더 높은 온도 및 더 낮은 이온 강도에서 추가 세척(예컨대 적어도 1회 세척은 약 37℃에서 약 0.1X 내지 0.5X SSC에서 수행되고, 약 68℃에서 약 0.1X 내지 0.5X SSC에서 적어도 1회 세척이 이어짐)을 포함한다.

본 발명의 단백질은 또한 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 절편과 다양한 기능을 가질 수 있는 융합 절편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어 그런 융합 절편은 본 발명의 단백질의 정제를 단순화하기 위한 도구로서, 예컨대 친화성 크로마토그래피를 사용하여 그 결과의 융합 단백질의 정제를 가능하게 하기 위해 기능할 수 있다. 적절한 융합 절편은 바람직한 기능(예컨대 단백질에 증가된 안정성을 부여하거나, 단백질에 증가된 면역원성을 부여하거나, 및/또는 단백질의 정제를 단순화함)을 가지는 임의의 크기의 도메인일 수 있다. 하나 또는 그 이상의 융합 절편을 사용하는 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 융합 절편은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 절편의 아미노 및/또는 카복실 말단에 결합될 수 있다. 융합 절편들과 융합 단백질의 티오레독신 활성 부위-함유 도메인들 사이의 결합은 그런 단백질들의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위-함유 도메인의 직설적인 회수를 가능하게 하기 위해 절단에 민감할 수 있다. 융합 단백질들은 바람직하게 티오레독신 모노시스테인 활성 부위-함유 도메인의 카복실 및/또는 아미노 말단부 중 어느 하나에 부착된 융합 절편을 포함하는 단백질을 코드화하는 융합 핵산 분자로 형질전환된 재조합 세포를 배양함으로써 제조된다.

한 실시형태에서, 본 발명의 방법과 사용하기에 적절한 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 단백질이 투여되는 동물과 상당히 유사한 동물의 종으로부터 유도된 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 미생물, 식물 및 진균류와 같은 다양한 공급원으로부터 유래되는 것을 포함하는, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드가 제시된 환자에 사용될 수 있다.

본 발명의 한 실시형태에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 아미노산 서열, 예컨대 명시된 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단부의 각 양옆에 적어도 하나 내지 약 20개까지의 추가의 이종성 아미노산이 포함된 자연 발생 티오레독신 단백질 또는 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 티오레독신의 아미노산 서열이 제조될 수 있다. 그 결과의 단백질 또는 폴리펩타이드는 명시된 아미노산 서열"로 본질적으로 구성되는"으로서 언급될 수 있다. 본 발명에 따르면, 이종성 아미노산은 명시된 아미노산 서열의 측면에 있는 자연적으로 발견되지 않는(즉 생체 내에서 자연적으로 발견되지 않는), 또는 명시된 아미노산 서열의 기능에 관련이 없거나, 또는 만약 자연 발생 서열의 그런 뉴클레오타이드가 주어진 아미노산 서열이 유도되는 유기체에 대해 표준 코돈 용법을 사용하여 번역되었다면, 그것이 유전자에서 발생하기 때문에 명시된 아미노산 서열을 코드화하는 자연 발생 핵산 서열의 측면에 있는 뉴클레오타이드에 의해 코드화되지 않을 아미노산의 서열이다. 유사하게, 구절 "으로 본질적으로 구성되는"은 본 명세서의 핵산 서열과 관련하여 사용될 때, 명시된 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 서열의 5' 및/또는 3' 단부 각각의 측면에 적어도 하나 내지 최대 약 60개의 많은 추가의 이종성 뉴클레오타이드가 있을 수 있는 명시된 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 서열을 말한다. 이종성 뉴클레오타이드는 그것이 천연 유전자에서 발생하거나 단백질에 임의의 추가 기능을 부여하거나 명시된 아미노산 서열을 가지는 단백질의 기능을 변화시키는 단백질을 코드화하지 않기 때문에 명시된 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 서열 측면에서 자연적으로 발견되지 않는다(즉 생체 내에서 자연적으로 발견되지 않는다).

다른 실시형태에서, 본 발명의 방법과 사용하기에 적절한 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 분리되거나, 생물학적으로 순수한 단백질을 포함한다. 그러므로 "분리된" 및 "생물학적으로 순수한"은 반드시 단백질이 정제된 정도를 반영하지는 않는다. 본 발명의 분리된 단백질은 예를 들면 그것의 천연 공급원으로부터 얻어지거나, 재조합 DNA 기술(예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 클로닝)을 사용하여 제조되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 화학적-합성 단백질 또는 펩타이드는 또한 안정화된 버전, 예컨대 스테이플된 펩타이드 기술에 의해, 고리화에 의해 또는 N 또는 C 말단에서의 제약(constraint)에 의해 구조적으로 제한된 활성 부위를 함유하는 것을 말할 수 있다. 바람직하게, 발명의 방법에 사용될 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질은 환자의 점액 또는 가래의 액화의 측정가능하거나 검출가능한 증가(또는 점도 또는 점착성의 감소)를 유발하고 및/또는 환자의 점액 및 가래와 관련된 환자에서 측정가능하거나, 검출가능하거나 또는 감지된 치료적 유익을 유발하기에 충분한 생체 내 반감기를 가진다. 그런 반감기는 단백질의 전달 방법에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 단백질은 동물에서 바람직하게 약 5분보다 큰 반감기를 가지고, 보다 바람직하게 동물에서 약 4시간보다 큰, 보다 더 바람직하게 동물에서 약 16시간보다 큰 반감기를 가진다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 동물에서 약 5분 내지 약 24시간의 반감기, 바람직하게 동물에서 약 2시간 내지 약 16시간, 보다 더 바람직하게 동물에서 약 4시간 내지 약 12시간의 반감기를 가진다.

본 발명의 추가의 구체예는 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 코드화하는 핵산 분자를 포함한다. 그런 핵산 분자는 시험관 내 또는 생체 내에서 본 발명의 방법에 유용한 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 본 명세서의 앞에서 기술된 단백질들 중 어느 것을 코드화하는 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 구성되거나, 그것으로 이루어지는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 분리된 핵산 분자는 그것의 천연 환경으로부터 제거된(즉 인간 조작된) 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드)이고 DNA, RNA 또는 cDNA를 포함하여 DNA나 RNA의 어느 것의 유도체를 포함할 수 있다. "분리된"은 그 자체로서 핵산 분자가 정제된 정도를 반영하지 않는다. 비록 구절 "핵산 분자"가 주로 물리적 핵산 분자를 나타내지만, 구절 "핵산 서열"은 주로 핵산 분자 상의 뉴클레오타이드의 서열을 말하고, 두 구절은 특히 단백질을 코드화할 수 있는 핵산 분자, 또는 핵산 서열과 관련하여 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산 분자는 그것의 천연 공급원으로부터 분리되거나 재조합 DNA 기법(예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 클로닝)을 사용하여 또는 화학적 합성에 의하여 제조될 수 있다. 분리된 핵산 분자는 예를 들면 유전자, 유전자의 천연 대립유전자 변이체, 코딩 영역 또는 그것의 일부 및 뉴클레오타이드 삽입, 결실, 치환 및/또는 도치(inversion)에 의해 변형된 조절 영역을, 그 변형이 실질적으로 핵산 분자의 본 발명의 바람직한 단백질을 코드화하는 능력 또는 천연 유전자 분리물과 엄격한 조건하에서 안정한 하이브리드를 형성하는 능력을 간섭하지 않는 방식으로 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 축퇴성을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 뉴클레오타이드 축퇴성은 한 아미노산이 상이한 뉴클레오타이드 코돈에 의해 코드화될 수 있는 현상을 말한다. 그로써 본 발명에 유용한 주어진 단백질을 코드화하는 핵산 분자의 핵산 서열은 축퇴성으로 인해 달라질 수 있다.

본 발명에 따르면, 유전자에 대한 언급은 천연(즉 야생형) 유전자에 관련된 모든 핵산 서열뿐 아니라 티오레독신 모노시스테인 활성 부위에 관련된 것들, 예컨대 그 유전자에 의해 코드화된 단백질의 생성을 제어하는 조절 영역(예컨대 그들로 한정되는 것은 아니지만 전사, 번역 또는 번역후 제어 영역) 및 코딩 영역 자체까지도 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자는 주어진 단백질을 코드화하는 핵산 서열에 유사하지만 동일한 서열은 아닌 자연 발생 대립유전자 변이체일 수 있다. 대립유전자 변이체는 상기에서 이미 기술되었다. 구절 "핵산 분자" 및 "유전자"는 핵산 분자가 상기에서 기술된 것과 같은 유전자를 포함할 때 상호교환적으로 사용될 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술(예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성을 사용하여 제조된다. 분리된 핵산 분자는 천연 핵산 분자 및 그것의 동족체, 이를테면 그들로 한정되는 것은 아니지만 천연 대립유전자 변이체 및 변형이 단백질 생물학적 활성에 바람직한 영향을 제공하는 방식으로 뉴클레오타이드들이 삽입, 결실, 치환 및/또는 도치되어 있는 변형된 핵산 분자들을 포함한다. 대립유전자 변이체 및 단백질 동족체(예컨대 핵산 동족체에 의해 코드화된 단백질)는 상기에서 상세하게 논의되었다.

핵산 분자 동족체는 해당 기술분야에 공지되어 있는 많은 방법을 사용하여 제조될 수 있다(예컨대 Sambrook et al., 상기 동일). 예를 들어 핵산 분자는 다양한 기법들, 이를테면 그들로 한정되는 것은 아니지만 고전적인 돌연변이생성 및 재조합 DNA 기법들(제한 없이 부위-특정 돌연변이생성, 화학적 처리, 제한 효소 절단, 핵산 단편의 결찰 및/또는 PCR 증폭) 또는 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 합성 및 화학적 결찰, 또는 유전자 셔플링 과정에 의해 다수의 조합을 포함하는 핵산 분자의 재분류된 라이브러리를 "구성"하기 위한 분자 기 혼합물의 시험관 내 또는 생체 내 재조합(즉 분자단계 브리딩(breeding); 예를 들어 Stemmer의 미국 특허 제5,605,793호; Minshull and Stemmer, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-290, 1999; Stemmer, P.N.A.S. USA 91:10747-10751, 1994, 모두 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함됨)에 의해 변형될 수 있다. 해당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 이들 및 다른 유사한 기법들은 다중 변화를 동시에 효과적으로 단백질에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자 동족체들은 계속해서 주어진 유전자와의 혼성화에 의해 선택되거나, 또는 그런 핵산 분자들에 의해 코드화된 단백질의 기능 및 생물학적 활성에 대한 직접적인 발현에 의해 스크리닝될 수 있다.

본 발명의 한 실시형태는 적어도 하나의 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 상기에서 기술된 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자에 관련된다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따르면, 재조합 핵산 분자는 전형적으로 재조합 벡터 및 본 명세서에 기술된 것과 같은 분리된 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 조작하기 위한 및/또는 숙주 세포 안으로 그런 핵산 서열을 도입시키기 위한 도구로서 사용되는 공학처리된(즉 인공적으로 제조된)핵산 분자이다. 그러므로 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 클로닝하고, 서열화하는 데에, 및/또는 그렇지 않으면 조작하는 데에, 예컨대 선택된 핵산 서열을 숙주 세포 안으로 발현 및/또는 전달하여 재조합 세포를 형성하는데에 사용하기 적절하다. 그런 벡터는 전형적으로 이종성 핵산 서열, 즉 클론되거나 전달될 핵산 서열에 인접하여 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열을 함유하지만, 벡터는 또한 본 발명의 핵산 서열에 인접하여 자연적으로 발견되거나 본 발명의 핵산 분자의 발현에 유용한 조절 핵산 서열(예컨대 프로모터, 미번역 영역)을 함유할 수 있다(아래에서 상세하게 논의됨). 벡터는 RNA 또는 DNA일 수 있고, 원핵생물 또는 진핵생물의 것이며, 전형적으로 플라스미드이다. 벡터는 염색체 외재성 요소(예컨대 복제 플라스미드)로서 유지될 수 있거나 또는 재조합 숙주 세포의 염색체 안에 통합될 수 있지만, 벡터는 발명의 대부분의 적용에 대해 게놈과 별도로 유지되는 것이 바람직하다. 전체 벡터는 숙주 세포 내에서 제자리에 유지되거나, 또는 특정 조건하에서는 플라스미드 DNA는 결실되고 본 발명의 핵산 분자를 남길 수 있다. 통합된 핵산 분자는 염색체의 프로모터 제어 하에, 천연 또는 플라스미드 프로모터 제어 하에 또는 조합된 여러 프로모터 제어 하에 있을 수 있다. 단일 또는 다수의 핵산 분자 복사물이 염색체 안에 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 적어도 하나의 선택가능한 마커를 함유할 수 있다.

한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에 사용된 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 구절 "발현 벡터"는 코드화된 생성물(예컨대 관심의 단백질)의 제조에 적절한 벡터를 언급하기 위해 사용된다. 이 실시형태에서, 제조될 생성물을 코드화하는 핵산 서열(예컨대 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질)은 재조합 핵산 분자를 생성하기 위해 재조합 벡터 안에 삽입된다. 제조하고자 하는 단백질을 코드화하는 핵산 서열은 재조합 숙주 세포 내에서 핵산 서열의 전사와 번역을 가능하게 하는 벡터의 조절 서열에 핵산 서열을 작동가능하게 연결시키는 방식으로 벡터 안에 삽입된다.

발명의 다른 실시형태에서, 재조합 핵산 분자는 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 바이러스 게놈 또는 그것의 부분에 통합된 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하며, 이때 핵산 분자는 DNA의 세포 안으로의 유입을 허용하는 바이러스 코트에 패키징된다. 많은 바이러스 벡터가 사용될 수 있는데, 이를테면 그들로 한정되는 것은 아니지만, 알파 바이러스, 수두 바이러스, 아데노 바이러스, 허피스 바이러스, 렌티 바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 레트로바이러스를 기초로 한 것들이 사용될 수 있다.

전형적으로, 재조합 핵산 분자는 하나 또는 그 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 구절 "재조합 분자" 또는 "재조합 핵산 분자"는 주로 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자 또는 핵산 서열을 말하지만, 그런 핵산 분자가 본 명세서에서 논의된 것과 같이 재조합 분자일 때 구절 "핵산 분자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 구절 "작동가능하게 연결된"은 숙주 세포 안에서 형질전환될 때(즉 형질전환, 형질도입, 트랜스펙션(transfection), 포합 또는 콘듀스(conduced)될 때) 분자가 발현될 수 있는 방식으로 발현 제어 서열에 핵산 분자를 연결시키는 것을 말한다. 전사 제어 서열은 전사의 개시, 연장 또는 종결을 제어하는 발현 제어 서열이다. 특히 중요한 전사 제어 서열은 전사 개시를 제어하는 것들, 예컨대 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열이다. 적절한 전사 제어 서열은 그 안에 재조합 핵산 분자가 도입될 숙주 세포 또는 유기체에서 기능할 수 있는 임의의 전사 제어 서열을 포함한다. 본 발명의 재조합 핵산 분자는 또한 추가의 조절 서열, 예컨대 번역 조절 서열, 복제 기원 및 재조합 세포와 부합하는 다른 조절 서열을 함유할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 분자는 숙주 세포 염색체 안으로 통합되는 것들을 포함하여, 또한 발현된 단백질이 단백질을 생성하는 세포로부터 분비될 것을 가능하게 하기 위해 분비 신호(즉 신호-절편 또는 신호-서열 핵산 서열)를 함유한다. 적절한 신호 절편은 본 발명에 따르는 단백질의 분비를 지시할 수 있는 임의의 이종성 신호 절편과 자연적으로 결합된 신호 절편을 포함한다. 적절한 신호 절편은 발현될 단백질과 자연적으로 결합되는 신호 절편 또는 본 발명에 따르는 단백질의 분비를 지시할 수 있는 임의의 이종성 신호 절편을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 재조합 분자는 발현된 단백질이 숙주 세포에 전달되고 숙주 세포의 막 안으로 삽입되는 것을 가능하게 하기 위한 리더 서열을 포함한다. 다른 신호 서열은 주변세포질 또는 세포외 분비, 또는 바람직한 구획 내에서의 보유를 지시할 수 있는 것들을 포함한다. 적절한 리더 서열은 단백질과 자연적으로 결합하는 리더 서열, 또는 세포막으로의 단백질의 전달 및 삽입을 지시할 수 있는 임의의 이종성 리더 서열을 포함한다.

본 발명에 따르면, 용어 "형질전환"은 그것에 의해 외인성 핵산 분자(즉 재조합 핵산 분자)가 세포 안에 삽입될 수 있는 임의의 방법을 나타내기 위해 사용된다. 용어 "형질전환"은 그 용어가 미생물 세포 또는 식물 안으로의 핵산 분자의 도입을 언급하기 위해 사용될 때 용어 "트랜스펙션"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 미생물 시스템에서, 용어 "형질전환"은 미생물에 의한 외인성 핵산의 획득으로 인한 유전된 변화를 기술하기 위해 사용되고 본질적으로 용어 "트랜스펙션"과 동의어이다. 그러나 동물 세포에서 형질전환은 예를 들어 세포들이 암이 된 후에 배양 중에 세포의 성장 특성의 변화(상기 기술됨)를 나타낼 수 있는 두 번째 의미를 가진다. 그러므로 혼란을 피하기 위하여, 용어 "트랜스펙션"은 바람직하게는 동물 세포 안에 외인성 핵산이 도입된 것에 대해 사용되고, 본 명세서에서는 일반적으로 그 용어가 세포 안으로의 외인성 핵산의 도입에 관련되는 정도로, 동물세포의 형질전환 및 식물세포와 미생물 세포의 형질전환을 포함하는 것으로 사용된다. 그러므로 트랜스펙션 기법은 그들로 한정되는 것은 아니지만, 형질전환, 입자 폭발, 일렉트로포레이션, 마이크로주입, 리포펙션, 흡착, 감염 및 원형질 융합을 포함한다.

한 실시형태에서, 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물은 과도하게 점성인 점액 또는 가래의 점도를 감소시키기 위해 사용된다. 조성물은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질을 함유하고, 하나 또는 그 이상의 추가 제제 또는 화합물, 예컨대 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 환원/감소시키기 위해 또는 그런 점액 또는 가래의 액화를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 다른 제제들 또는 화합물들을 포함할 수 있다. 그런 다른 제제 또는 화합물들의 예시는 해당 기술분야에 알려져 있고, 그들로 한정되는 것은 아니지만, 정제된 rhDNase, N-아세틸시스테인, 나시스텔린(N-아세틸-L-시스테인 유도체), GSH 및 겔솔린을 포함한다. 또한 만니톨 또는 고장성 식염수와 같은 점액작용제가 모노시스테인 활성 부위 티오레독신과의 조합에 사용될 수 있다.

한 실시형태에서, 약제학적 조성물을 포함하여, 조성물은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 코드화하는 핵산 분자를 치료하고자 하는 환자의 세포(예컨대 폐 또는 기도의 상피 세포)에 전달하여, 그 세포가 그 단백질로 트랜스펙션되고 발현될 수 있고, 그로써 그 단백질이 세포의 미세환경에서 점액 또는 가래와 접촉할 수 있도록 하기 위해 사용될 수 있다.

약제학적 조성물을 포함하여, 조성물은 또한 환자에게 단백질 또는 핵산 분자 또는 다를 조절 화합물을 전달하기 위하여, 예를 들면 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하여, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체로 환자에게 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 적절한 생체 내 또는 생체 외 부위에 본 발명의 방법에 유용한 치료적 단백질, 핵산 또는 다른 화합물을 전달하기에 적절한 임의의 물질을 말한다. 바람직한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 단배질, 핵산 분자 또는 화합물을, 단백질, 핵산 분자 또는 화합물이 바람직한 부위(예컨대 치료하고자 하는 점액 또는 가래가 분비되거나 누출되는 부위)에 도달했을 때, 점액 또는 가래와 접촉할 수 있거나(단백질 또는 화합물의 경우) 또는 세포 안으로 유입되어 세포에 의해 발현되고 분비될 수 있어서(핵산 분자의 경우) 발현된 단백질이 환원된 상태로 점액 또는 가래와 접촉할 수 있게 하는 형태로 유지될 수 있다. 본 발명의 적절한 부형제는 치료제(단백질, 핵산 분자 또는 화합물)를 특이적으로 표적화하지 않으면서 그것을 세포, 조직 또는 유체(점액 또는 가래)에 수송하거나 수송을 보조하는 부형제 또는 처방을 포함한다(본 명세서에서는 비-표적화 담체로도 언급된다). 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 예시로는, 그들로 한정되는 것은 아니지만 물, 인산염 완충 식염수, 링거액, 덱스토로스 용액, 혈청-함유 용액, 행크 용액, 다른 생리학적 평형 수용액, 오일, 에스테르 및 글리콜을 포함한다. 수성 담체는, 예를 들면 화학적 안정성 및 등장성을 증강시킴으로써 수용체의 생리적 조건에 가깝게 만들기 위해 필요한 적절한 보조 물질을 함유할 수 있다. 치료제의 흡입을 위한 제제는 또한 계면활성 분자를 포함할 수 있다.

적당한 보조 물질로는, 예를 들면 아세트산 나트륨, 염화 나트륨, 락트산 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 및 인산염 완충액을 제조하기 위해 사용된 다른 물질들, 트리스 완충액 및 중탄산염 완충액이 있다. 보조 물질은 또한 보존제, 예컨대 티메로살, m- 또는 o-크레졸, 포르말린 및 벤졸 알코올을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 종래 방법에 의해 멸균되거나 및/또는 동결건조될 수 있다.

약제학적으로 허용 가능한 담체의 한 가지 유형은 본 발명의 조성물을 환자에게 서서히 방출할 수 있는 조절-방출성 제형을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 조절-방출성 제형은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 치료제를 조절-방출 비히클에 포함한다. 적절한 조절-방출 비히클은, 그들로 한정되는 것은 아니지만 생체부합성 중합체, 다른 중합체 매트릭스, 캡슐, 마이크로캡슐, 마이크로입자, 볼루스 제제, 삼투성 펌프, 확산 장치, 리포좀, 리포스피어 및 경피 전달 시스템을 포함한다. 그런 조절-방출 비히클은 또한 보관 및 전달 중에 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 환원된 상태로 유지하기 위한 환원제를 포함할 수 있다. 핵산에 대해 적절한 전달 비히클은, 그들로 한정되는 것은 아니지만 리포좀, 바이러스 벡터 또는 리보자임을 포함하여 다른 전달 비히클들을 포함한다.

환자에게 투여하기 위한 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 적절한 양 또는 유효량은 환자에게 치료적 유익을 제공하기에 충분하게, 모노시스테인 활성 부위의 이황화물로의 가역성 산화를 통해 산화환원 반응에 참여할 수 있고, 티올-이황화물 교환 반응을 촉매할 수 있으며, 특히 점액 또는 가래의 점도 또는 점착성을 감소시킬 수 있고 및/또는 환자의 점액 또는 가래의 액화를 증가시킬 수 있는 양이다. 점도 또는 점착성의 감소 또는 점액 또는 가래의 액화의 증가는 본 명세서에서 앞서 기술된 것과 같이 또는 해당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 임의의 적절한 방법에 의해 측정, 검출 또는 결정될 수 있다. 상기에서 논의된 것과 같이, 그런 측정은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 적절한 양 또는 유효량과 접촉하기 전과 후의 환자로부터의 점액 또는 가래의 샘플 중의 유리 티올의 백분율을 측정하고 비교하는 것뿐만 아니라, 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 적절한 양 또는 유효량과 접촉하기 전과 후의 환자의 FEV 수준을 측정하고 비교하는 것을 포함한다.

한 실시형태에서, 환자에게 투여될 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 적절한 양 또는 유효량은 약 10μ㏖/㎏, 15μ㏖/㎏, 20 moles/kg, 25μ㏖/㎏, 30μ㏖/㎏, 35μ㏖/㎏, 40μ㏖/㎏, 45μ㏖/㎏, 50μ㏖/㎏, 55μ㏖/㎏, 60μ㏖/㎏, 65μ㏖/㎏, 70μ㏖/㎏, 75μ㏖/㎏, 80μ㏖/㎏, 85μ㏖/㎏, 90μ㏖/㎏, 95μ㏖/㎏, 100μ㏖/㎏, 105μ㏖/㎏, 110μ㏖/㎏, 115μ㏖/㎏, 120μ㏖/㎏, 125μ㏖/㎏, 130μ㏖/㎏, 135μ㏖/㎏, 140μ㏖/㎏, 145μ㏖/㎏, 150μ㏖/㎏, 175μ㏖/㎏, 200μ㏖/㎏, 225μ㏖/㎏, 250μ㏖/㎏, 275μ㏖/㎏, 300μ㏖/㎏, 325μ㏖/㎏, 350μ㏖/㎏, 375μ㏖/㎏, 400μ㏖/㎏, 425μ㏖/㎏, 450μ㏖/㎏, 475μ㏖/㎏, 500μ㏖/㎏, 525μ㏖/㎏, 550μ㏖/㎏, 575μ㏖/㎏, 600μ㏖/㎏, 625μ㏖/㎏, 650μ㏖/㎏, 675μ㏖/㎏, 700μ㏖/㎏, 725μ㏖/㎏, 750μ㏖/㎏, 775μ㏖/㎏, 800μ㏖/㎏, 825μ㏖/㎏, 850μ㏖/㎏, 875μ㏖/㎏, 900μ㏖/㎏, 925μ㏖/㎏, 950μ㏖/㎏, 975μ㏖/㎏, 1000μ㏖/㎏, 1100μ㏖/㎏, 1200μ㏖/㎏, 1300μ㏖/㎏, 1400μ㏖/㎏, 1500μ㏖/㎏, 1600μ㏖/㎏, 1700μ㏖/㎏, 1800μ㏖/㎏, 1900μ㏖/㎏, 2000μ㏖/㎏, 2100μ㏖/㎏, 2200μ㏖/㎏, 2300μ㏖/㎏, 2400μ㏖/㎏ 또는 2500μ㏖/㎏ 환자 체중을 포함한다.

다른 실시형태에서, 만약 전달 경로가 폐로의 에어로졸 전달이거나 유사한 경로라면, 환자에게 투여될 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 양은 투약 유닛당 약 0.25mg(예컨대 인간에 대한 투약 유닛은 전형적으로 약 2 내지 3㎖임) 내지 투약 유닛당 약 100mg을 포함한다. 바람직하게, 환자에게 투여될 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 양은 투약 유닛당 약 0.25mg, 0.50mg, 1.0mg, 5.0mg, 10mg, 15mg, 20mg, 25mg, 30mg, 35mg, 40mg, 45mg, 50mg, 55mg, 60mg, 65mg, 70mg, 75mg, 80mg, 85mg, 90mg, 95mg 또는 약 100mg을 포함한다. 에어로졸 전달에 사용된 장치에 따라, 일부 에어로졸 전달 장치는 실제로 폐에 전달될 에어로졸의 부피의 약 10%만을 허용한다. 그러나 전달 장치가 진동 메쉬 분무기일 때, 에어로졸의 부피의 약 90%가 전달될 수 있다. 전자 진동-메쉬 분무기는 보다 빠르게 약물을 전달할 수 있고, CF 환자들에 의해 대단히 바람직하게 사용되는 더 작고, 더 휴대하기 간편한 장치이다(Geller, D.E., Pediatric Pulmonology, 43(S9):S5-S17, 2008). 진동-메쉬 분무기는 또한 공기-분사 분무기에 비하여 잔류 용량이 더 적으면서 약물 전달에 있어 더 효과적이다. 이것은 특히 치료적 유익을 나타내는 데 더 적은 용량이 필요하기 때문에 치료 비용을 절감하는 데 중요하다. 이것들과 같은 장치는 또한 단백질의 생물학적 활성의 감소를 초래하지 않는다(Kesser, K.C., et al. Resp Care, 54(6):754-768, 2009; Scherer, T., et al. J Pharm Sci, 100(1):98-109, 2011). 그러므로, 부위에 전달될 조성물의 부피가 더 클 때의 다른 투여 경로에 대해서, 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 더 적은 양이 사용될 수 있는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다.

동물에게 투여될 본 발명의 단백질의 최적의 양은 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어 단백질이 흡입(에어로졸) 경로에 의해 투여된다면, 투여될 최적의 양은 기관지 내 마이크로분무에 의해 투여되는 최적의 양과 다를 수 있다. 그런 투여 경로에 따라 양을 다르게 하는 것은 해당 기술분야의 숙련자의 능력 내에 있다. 본 발명의 단백질의 적절한 양은 동물에 독성을 나타내지 않으면서 바람직한 기능을 하는 양인 것을 주지하는 것이 중요하다. 다른 투여 경로는 그들로 한정되는 것은 아니지만, 특히 소화기 점액의 치료를 위한 경구 투여 또는 생식기 점액의 치료를 위한 국소 투여를 포함한다.

본 발명의 한 실시형태에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 단백질을 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하여, 조성물은 나아가 환원제를 사용한 초기 환원 후에 환원된 상태의 티오레독신 활성 부위를 유지하는 하나 또는 그 이상의 제제로 제형된다. 본 발명에 사용된 그런 환원제는, 그들로 한정되는 것은 아니지만, 다이티오트레이톨(DTT), 리포산, NADH 또는 NADPH-의존성 티오레독신 환원효소, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 환원된 글루타티온, 다이티오글리콜산, 2-머캅토에탄올, 트리스-(2-카복실에틸)포스펜, N-아세틸 시스테인, NADPH, NADH 및 다른 생물학적 또는 화학적 환원제를 포함한다.

상기에서 논의된 것과 같이, 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하여 조성물은, 그 조성물 및 특히 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 단백질 및/또는 조성물 중의 임의의 다른 화합물들을 표적 부위(예컨대 단백질 및 화합물에 대해 치료될 점액 또는 가래, 재조합 핵산 분자에 대해 치료될 점액 또는 가래의 환경에 있을 것이거나 있는 표적 숙주 세포)에 전달하기에 효과적인 방식으로 환자에게 투여된다. 적절한 투여 프로토콜은 임의의 생체 내 또는 생체 외 투여 프로토콜을 포함한다.

본 발명에 따르면, 효과적인 투여 프로토콜(즉 효과적인 방식으로 본 발명의 조성물을 투여하는 것)은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 단백질 및/또는 조성물 중의 다른 화합물이 치료하고자 하는 점액 또는 가래와 접촉되는 것을 초래하는 적절한 용량 변수 및 투여 방식을 포함하고, 그로써 바람직하게 환자는 그런 투여로부터 어떤 측정가능하고, 관찰가능하며 또는 감지된 유익을 얻게 된다. 일부 상황에서, 환자로부터 점액 또는 가래를 샘플화함으로써 유효한 용량 변수들은 본 명세서에서 점액 또는 가래 점도 또는 액화를 평가하기 위해 기술된 방법들을 사용하여 측정될 수 있다. 다르게는, 유효 용량 변수들은 시험관 내 샘플, 생체 내 동물 모델, 및 궁극적으로는 환자가 인간인 경우 임상 실험을 사용한 실험에 의해 측정될 수 있다. 유효 용량 변수들은 특정 질환 또는 질환에 대해 해당 기술분야의 표준 방법들을 사용하여 측정될 수 있다. 그런 방법들은 예를 들면 생존률, 부작용(즉 독성) 및 질환의 진행 또는 퇴행과, 뿐만 아니라 1초 강제 호기량(FEV1)과 같은 관련된 생리적 변수의 측정을 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하기에 적절한 방법은 환자의 원하는 부위로 조성물을 전달하기에 적절한 임의의 생체 내 투여 경로를 포함한다. 바람직한 투여 경로는 화합물이 단백질 또는 다른 화합물(예컨대 약물)인지, 신체의 어느 부분에 조성물이 투여되어야 하는지, 그리고 환자가 경험하는 질환 또는 질환에 따라 해당 기술분야의 숙련자들에게 명백해질 것이다. 일반적으로, 모노시스테인 활성 부위 티오레독신의 생체 내 투여의 적절한 방법은, 그들로 한정되는 것은 아니지만 피부 전달, 기관 내 투여, 흡입(예컨대 에어로졸), 비강, 경구, 폐 투여 및 카테테르의 이식을 포함한다. 귀를 통한 전달은 점이액(ear drop)을 포함할 수 있고, 비강 내 전달은 비점액(nose drop) 또는 비강 내 주입을 포함할 수 있으며, 눈 안으로의 전달은 점안액 또는 공막을 가로질러 약물을 통과시키기 위한 적절한 장치의 사용을 포함할 수 있다. 에어로졸(흡입) 전달은 또한 해당 기술분야의 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어 Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992 참조, 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함된다). 경구 전달은 구강을 통해 취할 수 있는 고체 및 액체, 예를 들면 정제 또는 캡슐뿐 아니라, 식품 및 음료 제품 또는 동물 사료 또는 사료 펠릿으로 제형될 수 있다. 점막 조직에 유용한 다른 투여 경로는 기관지, 비강 내, 다른 흡입기, 직장, 국소, 경피, 질, 경부를 통한, 자궁주변 및 요도 경로를 포함한다. 또한, 투여 프로토콜은 사전처리 장치, 예컨대 불임과 같은 용도에 사용하기 위한 횡경막(예컨대 자궁 경관)으로의 단백질, 펩타이드 또는 조성물의 적용을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 발명의 단백질 또는 조성물이 호흡관(기도)의 과도하게 또는 비정상적으로 점성이거나 점착성인 가래 또는 점액을 치료하기 위해 투여될 때, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드(또는 조성물) 또는 다른 화합물은, 그들로 한정되는 것은 아니지만, 흡입(즉, 예컨대 계면활성제에 담아 또는 그것과 함께 에어로졸을 흡입함으로써); 기관내경, 기관 내 관을 통해 및/또는 임의의 인공 통풍 장치를 통한 폐 안으로의 직접 설치; 코 투여(비강 내 또는 코를 통과하여), 기관지 또는 기관 내(즉 기관 내에 직접 주사함으로써 또는 기관절개술에 의해)를 포함하는 경로에 의해, 직접 또는 지질-캡슐화 또는 계면활성제를 통해 투여된다. 조성물 또는 단백질을 기도 안에 도입시킴으로써 그것이 그 안의 점액 또는 가래와 접촉될 수 있는 생각할 수 있는 임의의 방법도 발명에 포함된다.

본 발명의 방법에서, 약제학적 조성물을 포함하여, 조성물은 척추동물 부류의 임의 구성원, 이를테면 제한 없이 영장류, 설치류, 가축, 닭, 칠면조 및 애완동물에 투여될 수 있다. 보호해야 할 바람직한 환자는 인간이다.

본 발명의 다른 실시형태는 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물에 관련되고, 이때 모노시스테인 활성 부위 중의 시스테인은 점액 단백질의 시스테인 잔기에 공유 결합된다. 점액 단백질은, 그들로 한정되는 것은 아니지만 호흡기 점액 단백질 및 소화관 점액 단백질을 포함한다. 점액 단백질은 뮤신, 예컨대 아주 많이 이황화-결합된 뮤신, MUC5AC 및 MUC5B를 포함한다. 예를 들어 점액 단백질의 이황화 결합과의 티올-교환 반응에서 N-말단 티오레독신 활성 부위 시스테인에서의 초기 촉매 반응 후에, 티오레독신 모노시스테인 산을 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 점액 단백질에 N-말단 시스테인을 통해 공유 결합될 수 있고, 그로써 반복된 환원 및 촉매에 대해 내성이 된다. 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 티오레독신의 그것의 뮤신 표적에 대한 공유 결합은 점액 상에서의 격리에 의해 세포 흡수 및 내재화를 방지하고, 그것은 세포 내부에서 바람직하지 못한 티오레독신 활성으로 인한 상피 흡수 및 표적-외 효과를 방지하는 이중 유익을 제공하는 한편, 동시에 신체로부터 점액-결합된 소비된 약물의 제거를 용이하게 한다.

본 발명의 추가의 실시형태는 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 점도를, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물을 투여함으로써 감소시키기 위한 방법에 관련되며, 이때 단백질은 점액 단백질의 시스테인 잔기에 공유 결합한다. 한 측면에서, 점액 단백질은 뮤신이다. 다른 실시형태에서, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 환원된 상태로 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 점액 단백질은 호흡기 점액 단백질 또는 소화관 점액 단백질 또는 생식관 점액 단백질일 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태는 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 점도를, 환자의 점액 또는 가래를 이황화 결합 환원제와 시스테인-차단제를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 감소시키는 방법에 관련된다. 이황화 결합 환원제 및 시스테인-차단제는 그것에 한정되는 것은 아니지만 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하여, 동일한 분자일 수 있고, 또는 그것들은 상이한 분자일 수 있다. 이황화 결합 환원제는 다이티오트레이톨(DTT), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), GSH, 다이티오글리콜산, 2-머캅토에탄올, N-아세틸 시스테인, 트리스-(2-카복실에틸)포스핀 또는 해당 기술분야에 알려져 있는 다른 약학적으로 부합하는 환원제일 수 있다. 시스테인-차단제는 요오도아세트아미드, 요오도아세트산 또는 다른 알킬화제, 또는 시스테인-특이적 항체 또는 다른 친화성-코드화 단백질 또는 펩타이드 조성물 똔느 항체 모방물일 수 있다. 시스테인-차단제는 결합이 환원되기 전에 점액 단백질의 이황화 결합에 있었던 시스테인에 결합한다. 시스테인-차단제는 점액의 시스테인의 티올기가 이황화 결합을 재형성하는 것을 방지한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 과도하게 점성이거나 점착성인 점액을 가지는 환자를, 그 환자에게 세포 흡수를 할 수 없는 티오레독신 활성 부위를 가지는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물을 투여함으로써 치료하는 방법에 관련된다. 화합물은 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 화합물은 또한 티오레독신 부분 및 세포 표면 수용체 리간드 부분을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 이 실시형태에서, 세포 표면 수용체 리간드 부분은 세포 표면 수용체에 결합하고 그로써 융합 단백질의 세포 흡수를 방지한다. 화합물은 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 서열번호 12의 위치 35에 있는 시스테인에 상당하는 시스테인에 대한 차단 화합물의 조합일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 차단 화합물은 티오레독신 분자에 결합하고 그로써 서열번호 12의 위치 35에 있는 시스테인을 차단하는 항체 또는 항체 모방물일 수 있다. 이런 견지에서, 용어 "차단"은 서열번호 12의 위치 35에 있는 시스테인의, 예를 들면, 서열번호 12의 위치 32에 있는 시스테인과 분자내 이황화 결합을 형성하는 능력을 간섭하는 것을 말한다.

본 발명의 추가의 실시형태는 환자에서 약물 물질에 전신적으로 노출되는 것을 방지하는 방법에 관련된다. 그 방법은 그들로 한정되는 것은 아니지만 폐, 경구 또는 국소 전달 경로를 포함하는 전달 경로에 의해 환자에게 약물을 투여하는 단계를 포함한다. 약물은 일단 투여되면 표적 부위에 공유 결합을 형성한다. 많은 약물이 수용체에 대한 분자의 가역적인 결합으로 리간드가 수용체에 결합하게 되는 분자 상호작용에 의해 작용하기 때문에, 이 작용 메커니즘은 공지된 약물 작용 메커니즘과는 구별된다. 바람직한 실시형태에서, 약물 물질은 티올기가 표적 부위에서 또 다른 티올기와 공유 결합을 형성하는 티올-함유 약물이다. 예를 들어 약물은 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 표적 부위는 세포 외에 존재하고 약물은 세포외 전달 경로에 의해 투여된다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하고 추가로 산화환원-활성 티올기를 안정화시킬 수 있는 적어도 하나의 당 또는 당 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관련된다. 당 또는 당 유도체는 수크로스, 수크랄로스, 락토스, 트레할로스, 말토스, 갈락토스, 라피노스, 만노스 또는 만니톨일 수 있다. 산화환원-활성 티올기는 환원된 상태(-SH) 또는 산화된 상태(-S-S-) 중 어느 하나로 존재할 수 있는 티올기를 의미한다. 용어 "안정화시키는"은 예를 들면 폴리펩타이드가 당 또는 당 유도체가 생략된 조성물과 비교하여 당 또는 당 유도체를 가지는 약제학적 조성물에 존재할 때 환원 상태에서 산화환원-활성 티올기의 산화 속도를 감소시키는 것을 의미한다. "당"은 단일-, 2-, 올리고- 또는 다-당을 의미한다. 당의 예를 들면 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 락토스, 말토스, 갈락토스, 라피노스, 이눌린, 덱스트란 트레할로스, 수크랄로스, 만노스 및 만니톨이다. 당 유도체는 그것이 유도되는 당을 구조적으로 닮은 화합물을 의미한다. 예를 들면 염소처리된 수크로스인 수크랄로스는 수크로스의 당 유도체로 간주될 것이다. 추가의 유도체는 예를 들면 알디톨 유도체, 예컨대 만니톨 및 자일리톨을 포함한다. 본 발명의 바람직한 조성물은 비-환원당, 예를 들면 라피노스, 트레할로스, 스타키오스 및 특히 수크로스를 포함한다.

본 발명의 다른 실시형태는 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 동물 사료 조성물에 관련된다. 동물 사료의 예시로는, 그들로 한정되는 것은 아니지만 건초, 밀짚, 사일리지, 압축 및 펠릿화된 사료, 오일 및 혼합 식량, 발아 곡물, 콩류, 작물 잔해, 곡물, 곡류 작물 및 옥수수를 포함한다.

다음의 실시예는 예시를 목적으로 제공되며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1

이 실시예는 야생형 Trx(본 명세서에서 "rhTxr"로도 지칭됨) 및 모노시스테인 활성 부위 rhTrx(본 명세서에서 "r(Cys)hTrx"로도 지칭됨) 단백질들의 발현 및 정제를 보여준다. rhTrx 및 r(Cys)hTrx의 단백질 발현 수준 및 전사후 발현 정확도를 Harris 등에 의해 기술된 것과 같이(Harris et al., Biotechnol Biogen 109:1987-97 (2012), 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함됨), 인간 Trx-1 DNA 서열의 코돈 최적화에 의해 최대화하였다. 대장균에서의 생성을 위해 합성 구성물의 적절한 벡터 안으로의 클로닝을, 야생형 및 모노시스테인 활성 부위 r(Cys)hTrx 돌연변이 단백질이 ㎍ 규모에서 생성되는 것을 허용하면서 수행하였다. 내독소 및 내인성 숙주 티오레독신으로부터의 정제를 용이하게 하기 위해 여러 발현 태그 및 정제 전략들을 실험실 규모에서 평가하였고, 또한 친화성에 의해 절단하였다.

대장균에서 rhTrx 및 r(Cys)hTrx의 제조. 개시제 메티오닌을 포함하여, 105개의 아미노산 성숙 rhTrx 단백질을 코드화하는 rhTrx 유전자를 대장균 발현에 대해 최적화하고 합성하였다(DNA2.0, Inc.). 유전자를 pEV 벡터에 하위클로닝하였는데, 그것은 유도성 T7 프로모터, 카나마이신 내성 마커, Ni-친화성 정제를 위한 6-히스티딘 태그 및 담배 etch 바이러스 프로테아제 절단 부위(TEV)를 함유하였다. rhTrx를 발현하기 위하여, rhTrx pEV 플라스미드(서열화에 의해 확인됨)를 ~0.6(600nm)의 광학 밀도로 성장된 C43 대장균(Lucigen) 안에 형질전환하고 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도하였다. 단백질을 대장균 세포로부터 균등화 및 계면활성제 용해 및 원심분리를 사용하여 추출하였다. rhTrx를 대장균 용해물로부터 Ni-친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. Ni-친화성 정제된 rhTrx를 프로테아제로 절단하여(TEV) 니켈 친화성 태그를 제거하고 이온 교환 크로마토그래피 및 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 추가로 정제하였다. 단백질의 순도를 SDS-PAGE 및 이온 분무 질량 분광학(LC/MS/MS)에 의해 평가하고, 단백질의 서열을 rhTrx의 트립신 절단과 이어서 이온 포획 질량 분광학에 의해 확인하였다. 단백질 농도 및 내독소 농도를 각각 바이신코닌산 분석(Pierce) 및 Limulus 변형세포 분석(Charles River Lab.)에 의해 측정하였다. r(Cys)hTrx 단백질을 유사한 방법에 따라, 단 DNA2.0에 의해 r(Cys)hTrx 유전자를 최적화하고 합성하면서 제조하였다. 이들 rhTrx 및 r(Cys)hTrx 단백질을 시험관 내에서 DTT를 사용하여 환원시켰고, 계속해서 DDT를 투석 및 탈염 칼럼 처리에 의해 제거하였다.

실시예 2

친화성 결합 접근법보다는 성숙한 단백질의 직접적인 발현을 활용하는 천연 rhTrx 및 모노시스테인 활성 부위 rhTrx(r(Cys)hTrx)에 대한 바람직한 발현, 정제 및 환원(활성화)을 이 실시예에서 기술한다. r(Cys)hTrx 및 천연 Trx 대조 단백질을 광범위한 구성적 또는 유도성 공통 프로모터 시스템을 포함하는 표준 박테리아 발효 기법들을 사용하여 대장균 BL21, 및 K12-유도된 숙주의 진동-플라스크 배치식 배양물 및 공급-배치식 발효로 제조하였고, 이때 당-유도성 또는 IPTG-유도성 시스템이 바람직하였는데, 이것들이 가장 높은 발현 균주를 초래하였기 때문이다. 미세유동화기에 의해 세포를 파괴한 후, 가용성 Trx를 함유한 상층액을 원심분리에 의해 수집하고 암모늄 설페이트(AS)로 처리하여 우선적으로 숙주 세포 단백질을 침전시켰다. 그 결과의 Trx-풍부해진 상층액을 15mM Hepes, 10 mM 베타 머캅토에탄올(b-ME), 250 mM NaCl로의 완충액 교환을 위해 한외여과/투석여과(UF/DF)를 사용하여 여과하였다. 이 완충액에서 Trx는 Q-세파로스 HP 음이온-교환 크로마토그래피(AEC) 수지에 결합하지 않은 반면, DNA 및 다른 불순물들은 고친화성으로 결합한다. 고-염 AEC에 이어서 Trx-풍부해진 통과액을 Hi-Trap Q-HP 칼럼(GE Healthcare) 상에서 환원 조건(10mM DTT)하에 제2 AEC 단계를 위해 저-염 완충액으로 교환하였고, 이어서 완충액을 제형 완충액(아래에서 기술함)으로 바꾸었다. 다르게는, AS 침전 후에 가용성 분획을 30kD 컷오프에서 여과하고 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼 상에서 로딩하였다. 용출된 물질을 농축하고 완충액을 1KD의 UF/DF 카세트를 사용하여 교환하였으며 Source Q(음이온 교환) 칼럼 상에 로딩하였다. 티오레독신 단백질을 이온 교환 칼럼으로부터 염 구배를 사용하고 그런 다음에는 보관 완충액으로의 교환을 위해 추가의 UF/DF 단계를 사용하여 용출하였다.

내독소를 Limulus 변형세포 용해물 키트(LAL, Pierce)를 사용하여 정량하고 임의의 잔류하는 내독소를 0.2 마이크론 Mustang E-필터(Pall)를 사용하여 제거하였다. 단백질 동일성 및 수율을 적절한 단계에서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯/ELISA에 의해 측정하고, 총 질량 및 최종 서열 동일성을 MALDI 및 전기분무 질량 분광계에 의해 확인하였다. Trx 제형의 환원 활성을 DTNB(Ellman 시약) 환원 분석을 사용하여 정량하였다. 50 마이크로리터의 2.5mM rhTrx 또는 r(Cys)hTrx를 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 175 마이크로리터의 샘플 완충액 및 25 마이크로리터의 6mM DTNB(5,5'-다이티오비스-(2-나이트로벤조산))을 첨가하였다. 반응이 DTNB의 첨가에 의해 시작된 후, DTNB 환원에 의한 412nm에서의 흡광도의 변화를 분광광도계를 사용하여 30℃에서 15분 후에 측정하였다.

광범위한 보관 완충액 조건, 예컨대 아래에서 논의되는 것과 같은 조건을 동결건조 및 환원된 상태의 r(Cys)hTrx를 안정화시키는 능력과의 부합성을 위해 사용한다. 완충액 조건은 환원 당을 사용한 낮은 pH, 10mM b-ME를 사용한 암모늄 아세테이트 pH 5.5뿐만 아니라 환원된 천연 Trx의 보관 안정성을 증강시키는 것으로 앞서 확인된 완충액 제형(40mM Na 아세테이트 pH 5.5, 0.05% EDTA, 9.25% 수크로스)을 포함한다. Trx를 포함한 각각의 완충액 조건을 동결건조시키고 건조된 형태로 다른 시간 동안 보관하며, 보관된 단백질의 산화환원 안정성을 DTNB 및 상기에서 기술된 것과 같은 단백질 활성 분석을 사용하여 평가하였다. 에어로졸 안정성 평가를 위하여, Penn-Century 분무기 또는 네뷸라이저를 사용할 수 있다. 에어로졸 화합물들을 상이한 인큐베이션 시점에 0.1M Tris 완충액 pH 8.0, DNTB를 함유하는 1mM EDTA 안에 수집하여 r(Cys)hTrx 및 천연 rhTrx의 에어로졸 안정성을 측정하였다. 응집체는 DTNB와 반응할 것으로 예상되지 않았고, 따라서 환원된 형태만이 검출될 것이다. DTNB의 흡광 계수(412nm에서 14150)를 회수된 단백질 농도의 함수로서 유리 티올(SH)기를 계산하는 데 사용하였다. 천연 rhTrx의 기관 내(IT) 전달에 대한 이전 연구들(Rancourt, R. et al., Free Radic Biol Med, 42(9):1441-1453, 2007)은 정상 식염수를 사용하였다. 흡입 전달과 부합하는 것으로 알려져 있는 산화환원-안정화제, 예컨대 메티오닌의 첨가가 또한 포함될 수 있다.

실시예 3

이 실시예는 r(Cys)hTrx 및 천연 rhTrx의 발현을 위한 구성 및 대장균 균주를 보여준다. r(Cys)hTrx 및 천연 rhTrx 콘트롤은 다양한 벡터 시스템 및 대장균의 실험실 BL21 또는 K12 균주를 사용하여 성숙한 가용성 단백질로서 쉽게 발현될 수 있다. 더 높은 수율(>1g/L)의 대장균의 Trx-발현 균주를 제조하기 위하여, 코돈-최적화된 r(Cys)hTrx 및 천연 rhTrx DNA 서열을 합성하고 영양소-고갈 기초 유도성 시스템, 당-유도성 시스템(예컨대 람노스, 자일로스, 멜리비오스 또는 해당 기술분야, 예컨대 미국 특허 제7871815호에 공지되어 있는 다른 유도성 프로모터), 또는 박테리오파지 T3, T5 또는 T7으로부터의 프로모터를 토대로 한 IPTG-유도성 시스템을 포함하여, 상이한 세포내 프로모터 시스템을 사용하여 광범위한 발현 벡터 안에 클론하였다. DNA 서열 확인 후, 유도를 위해 사용된 분자들을 사용하지 않도록 공학처리되었거나 또한 고역가에서 발현 정확도를 개선하기 위하여 과잉-발현된 메티오닌 아미노펩티다제를 포함할 수 있는 균주를 포함하여, 발현 구성물을 통상적으로 사용되는 상이한 BL21/K12 대장균 숙주 균주 안으로 형질전환시켰다(Liu, M. et al., Protein Expr Purif 84(1):130-139, 2012). 그 결과의 생성 숙주/벡터 조합을 고-배출 방식 심층 미세역가 플레이트에 대한 배지 중에서 30 내지 37℃에서 최소 배지 중에서 진동시키면서 성장시키고, 해당 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법들, 예컨대 겔 또는 모세관 전기영동을 사용하여 발현에 대해 스크리닝하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 및/또는 ELISA/ELISPOT를 통해 포지티브 클론들을 확인하였다. 균주의 공급-배치식 발효를 수행하였고, 단백질(r(Cys)hTrx)의 수율을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 및/또는 ELISA/ELISPOT에 의해 평가하였다. 상기 실시예 1 및 2에서 기술한 방법들을 사용하여 단백질들을 정제하고 환원시켰으며, 활성화된 단백질의 환원 상태를 DTNB 분석 및 인슐린 환원 분석에 의한 특이한 이황화 결합 환원 활성에 의해 평가하였다. 서열 동일성을 번역 정확도 및 적절한 분자량을 확인하기 위한 질량 분광학에 의해 분석하였다(MALDI 또는 전기분무).

실시예 4

이 실시예는 야생형 및 모노시스테인 활성 부위 rhTrx의 시험관 내 활성 및 기능을 보여준다. rhTrx의 활성을 표준 비색 DTNB 분석으로 그것의 환원 활성을 측정함으로써, 및 호중성 엘라스타제 활성을 억제하는 그것의 능력을 측정함으로써 평가하였다. 또한, r(Cys)hTrx의 인간 CF 점액을 액화시키는 능력을, rhTrx와 비교하여 가래 압축 분석을 사용함으로써, 그리고 임의로 특수한 유량계를 사용하여 CF 가래의 점탄성의 감소를 조사함으로써 측정하였다. rhTrx 및 r(Cys)hTrx를 CF 점액분해성 Pulmozyme(rhDNase I; dornase alfa)의 표준과 비교하였다.

rhTrx의 초기 특성확인: 환원 활성. 사전-환원된 Trx 제형의 일반적인 환원 활성을 앞서 보고된 것과 같이(Rancourt, R. et al., Free Radic Biol Med, 42(9):1441-1453, 2007) DTNB 환원 분석을 사용하여 정량하였다. rhTrx 및 r(Cys)hTrx의 효소적 환원을 위해, 5 또는 50mM의 rhTrx 및 0.5mM의 정제 TrxR을 함유하고 있는 50 마이크로리터의 분석 완충액(100mM의 칼륨 포스페이트, pH 7.0, 10mM의 EDTA 및 0.05 mg/㎖의 소혈청 알부민)을 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 다음에 720mM의 NADPH를 함유한 175 마이크로리터의 샘플 완충액을 첨가하고, 이어서 6mM DTNB를 함유한 25 마이크로리터의 샘플 완충액을 첨가하였다. 화학적으로 사전-환원된 rhTrx의 환원 활성을 측정하기 위하여, 50 마이크로리터의 2.5mM rhTrx를 96-웰 플레이트에 첨가하고, 이어서 175 마이크로리터의 샘플 완충액 및 25 마이크로리터의 6mM DTNB를 첨가하였다. DTNB의 첨가에 의해 반응이 시작된 후에, DTNB 환원으로 인한 412nm에서의 동역학적 흡광도의 변화를 30℃에서 분광광도계를 사용하여 모니터링하였다. 동일한 프로토콜을 따라 r(Cys)hTrx에 대해 이 분석을 아래에서 기술되는 것과 같이 수행하였다. r(Cys)hTrx의 총 환원 활성은 rhTrx보다 적었는데, 그것은 r(Cys)hTrx에 존재하는 더 적은 수의 환원된 Cys를 반영한다. 그러나 두 가지 단백질 모두 그것의 잠재적인 환원 상태의 90 내지 95% 이상으로 환원되었고, 그것은 전체 활성화를 반영한다.

호중성 엘라스타제(NE) 활성의 억제. NE 활성에 미치는 rhTrx의 효과를 측정하기 위한 인큐베이션 시스템은 이미 기술되었다(Lee, R., et al. (2005) Am J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 289(5):L875-882). 간단히 설명하면, Trx를 인산염-완충 식염수(PBS, pH 7.2)중에서 원하는 농도로 희석하였다. 그 혼합물을 정제된 인간 NE(PBS, pH 7.2, 0.01% 트리톤 X-100 중에 ㎖당 100 마이크로그램)에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 중의 최종 부피는 210 마이크로리터였고, NE의 농도는 ㎖당 1.6 마이크로그램이었다. 인큐베이션 후에 60 마이크로리터의 분취액을 탄성조직분해(elastolytic) 활성에 대해 3중으로 측정하였다. 엘라스타제 활성을 PBS(pH 7.2) 중의 120 마이크로리터의 0.8mM N-메톡시석시닐-Ala-Ala-Pro-Val 4-나이트로아닐리드를 실험 샘플에 첨가함으로써 측정하였고, 동역학적 흡광도를 37℃에서 405nm에서 4분 동안 모니터링하였다. 이들 실험에 사용한 엘라스타제의 농도는 분석의 선형 범위 내에 있는 것으로 측정되었다. 퍼센트 NE 활성 억제를 다음과 같이 측정하였다: 퍼센트 억제 = (1-실험 그룹에 대한 흡광도 변화/PBS 대조 그룹에 대한 흡광도 변화). r(Cys)hTrx의 엘라스타제 활성은 rhTrx에 거의 비교할 수 없는 것으로 발견되었다.

인간 CF 가래의 액화를 평가하기 위한 압축 분석. 모든 조작에 대해, CF 가래를 미생물 후드하에서 취급하였다. 관련 농도의 rhTrx, r(Cys)hTrx 또는 희석제 단독(25 마이크로리터)을 1.5㎖의 에펜도르프 원추형 튜브 중의 CF 가래(275 마이크로리터)에 첨가하고 아주 짧은 와동에 의해 혼합하였다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후에 샘플을 다시 간단하게 혼합하고 헤마토크릿 튜브 안에 로딩하고 양 끝을 밀봉하였다. 5분 동안 헤마토크릿 원심분리로 원심분리한 후, 퍼센트 고체(겔) 및 퍼센트 액체를 직접 선형 측정에 의해 측정하고 다음과 같이 퍼센트 액체로서 표시하였다: 100x액체/(액체+고체). 각 조건에 대해, 적어도 5명의 다른 CF 환자들로부터의 가래를 삼중으로 측정하였다. r(Cys)hTrx의 액화 능력은, 훨씬 더 큰 것이 아니라면, 적어도 rhTrx와 비교할 수 있었고, 그것은 예상외의 r(Cys)hTrx 작용 메커니즘의 효능을 반영한다.

가래 점탄성 측정. 이들 측정을 티오레독신으로 처리한 후 원뿔평판 유량계의 사용뿐만 아니라 가래 유체의 직접 관찰을 통해 정량적으로 시행하였다. 상기에서 기술된 것과 동일한 가래 취급 프로토콜을 사용하여 인큐베이션을 수행한다. 점탄성을 AR-1000 유량계(TA Instruments, New Castle, DE)를 사용하여 37℃에서 1 rad/초의 각 속도(angular rate)의 진동 방식으로 평가한다. 각각의 Trx 제제에 대해, 가래 점탄성을 감소시키는 능력은 적어도 5명의 상이한 CF 환자들로부터 얻어진 가래에서 삼중으로 평가한다. r(Cys)hTrx의 가래 점탄성을 감소시키는 능력은, 훨씬 더 크지 않다면, 적어도 rhTrx와 비교할만한 것으로 예상되고, 그것은 예상하지 않았던 r(Cys)hTrx 작용 메커니즘의 효능을 반영한다. 도립된 에펜도르프 튜브 중의 rhTrx 또는 r(Cys)hTrx와 혼합된 가래의 유속을 관찰함으로써 가래 점탄성을 측정하였고, 이 분석으로 r(Cys)hTrx의 흐름이 rhTrx, DTT 및 Pulmozyme보다 더 많았고, 본질적으로 가래의 흐름을 나타내지 않은 네거티브(비히클) 대조군의 그것보다 훨씬 더 큰 것으로 밝혀졌다.

케어 점액분해제(rhDNase)의 표준과 효능의 비교. 이들 연구를 위하여, 관련 농도의 rhTrx, r(Cys)hTrx 및 rhDNase를 상기에서 기술한 것과 같이 인큐베이션에 의해 비교하였다. 30분 후에 샘플을 가래의 액화의 변화(압축 분석) 및 점탄성의 변경에 대해 평가하였다. 또한, 시너지 효과 연구를 수행하였다. 이들 연구에서, 가래 샘플을 rhTrx에 30분 동안 노출한 후 rhDNase에 30분 동안 노출하거나, 다르게는 rhDNase에 30분 동안 노출한 후에 rhTrx에 30분 동안 노출하였다. 이들 결과를 단독의 어느 하나의 제제의 효과와 비교하였다. 각 조건에 대해, 적어도 5명의 상이한 CF 환자들로부터의 가래를 삼중으로 측정하였다. 주어진 날에 야생형 및 돌연변이 rhTrx 변이체에 대해 각각 12개의 샘플을 시험하기 위해 개인 공여자로부터의 충분한 가래가 필요하였다(rhTrx x 3, rhDNase x 3, rhTrx + rhDNase x3, rhDNase + rhTrx x3). 즉, 실제로, 최소한 4.5 내지 5.0㎖의 잘-혼합된 가래를 단일 공여자/1일로부터 얻는다. r(Cys)hTrx의 액화 활성은, 훨씬 더 큰 것이 아니라면, 적어도 rhDNase와 비교할만하였다. rhDNase, rhTrx, 또는 DTT 양성 대조군.

인간 CF 가래 수집. 의료인에 의해 측정된 성인 및 소아 CF 환자들로부터 가래를 얻었다. 환자들이 임상적 증상들을 보이고 2개의 별도의 필로카르핀 이온도입치료 땀 유발 시험에서 60 밀리몰을 초과하는 땀 염화물 값을 나타내고 이어지는 유전자 분석에서 두 개의 대립유전자 CF-생성 돌연변이를 나타낸다면 그들을 CF로 진단하였다. 모든 샘플을 자발적인 객담(expectoration) 또는 고장성 식염수 유도에 의해 기증받았다. 육안으로 확인할 수 있는 타액을 함유한 가래는 버렸다. 가래를 실험실에 전달할 때까지 얼음 위에 유지하였고, 사용할 때까지 O-링-밀봉 바이알에 담아 -80℃에서 유지하여 건조되는 것을 방지하였다.

실시예 5

이 실시예는 야생형 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드와 비교한 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 효소적(도 1b) 및 비-효소적(도 1a) 활성을 보여준다. 도 1a에 도시된 것과 같이, 비-특이적 5,5'-다이티오비스-(2-나이트로벤조산)(DTNB 또는 엘만 시약) 환원은 야생형과 비교하여 티오레독신 모노시스테인 활성 부위에서 하나의 환원성 시스테인의 손실을 반영한다. 도 1b 및 도 2에 도시된 것과 같이, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 놀랍게도 야생형 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드와 비교하여 인간 가래 압축 분석에서 더 큰 효능을 나타냈을 뿐 아니라 등몰량의 DNase 또는 NAC에 비해 더 큰 효능을 나타냈다(도 2). 이 결과는 Vys35의 돌연변이로 인한 활성 부위에서의 상당한 변형과, 총 환원력이 선행 DTNB 분석에서 하나의 환원성 Cys 잔기의 손실에 의해 천연 티오레독신의 환원력의 4/5라는 관찰을 고려해볼 때, 예상하지 못했던 것이다. 티오레독신 모노시스테인 활성 부위의 효능의 놀랄만한 증가는 뮤신 단백질 Cys 잔기에 대한 공유 연결로 인해 이루어진 것이고, 그것은 이들 Cys가 새로운 이황화 결합을 재형성하는 것을 방지한다는 예상하지 못했던 결과를 나타냈다.

실시예 6

이 실시예는 천연 rhTrx와 비교하여 배양된 일차 인간 기관지 상피세포(HBE)에 의한 전-염증성 사이토킨의 방출을 자극하는 r(Cys)hTrx(환원된 활성 상태)의 경향성의 감소를 입증한다. 공여 조직 및 세포는 인간 대상의 권리 보호에 대한 승인 프로토콜의 후원 하에 제공된다. 정상(즉 질환에 걸리지 않은) 폐로부터의 HBE 세포를 앞서 기술된 것과 같이 효소적 소화에 의해 수득한다(Fulcher, M.L., Methods Mol Med 107:183-206, 2005). 분해된 HBE 세포를 12mm 직경의 Transwell Clear 지지체(Corning) 상에 2.5 x 10⁵/cm²의 밀도로 정확하게-규정된 기도 세포 배지(Fulcher, M.L., 2005 상기 동일)에 시딩하였다. 배양물을 사용 전 충분히 분화될 때까지(약 4 내지 6주) 공기-액체 계면에서 유지하였다.

티오레독신 전달 프로토콜: 이 연구를 위해, 나노리터 부피의 시험 제제(또는 대조군)를 HBE 배양물의 표면에 전달할 수 있는 장치를 활용한다. 이 시스템은 시험관 내 모델 시스템이 기도 상피 세포의 표면에 분무된 약물의 초미세 미스트의 생체 내 전달을 모방하도록 디자인되고, r(Cys)hTrx와 같은 치료제를 첨가하는 효과를 연구하기 위한 이상적인 방법을 대표한다. 기도의 처음 20 제너레이션에 걸친 Pari LC Star 네뷸라이저의 평균 축적 속도(deposition rate)를 증명하는 다중-경로 입자 약량 측정 모델링(Anjilvel, S., et al. Fundam Appl Toxicol 28(2):41-50, 1995)의 결과를 토대로, 대부분의 입자가 전달된 것으로 예상되는, 기도의 처음 6 제너레이션에 걸친 평균 축적을 15분의 과정에 걸쳐 ~50 nl/분/cm²인 것으로 추정한다. 이들 연구에서, 총 5개의 상이한 실험 그룹에 대해 총 750nl의 분무(15분에 걸쳐)를 수행한다. 이것들은 다음을 포함한다: 1) 비히클 대조군(등장성 식염수), 2) 천연 재조합 Trx(500㎛) 및 3) 3가지 용량의 r(Cys)hTrx(10㎛, 250㎛ 및 1000㎛). 이들 농도는 "최종" 기도 표면 농도를 나타낸다. 각 시험 제제(또는 비히클 대조군)의 분무 후에, 배양물들을 조직 배양 인큐베이터에 복귀시키고 24시간 동안 인큐베이션한 후에 사이토킨 분석을 하였다.

사이토킨 면역분석: 이 연구에서, IL-6, IL-8, TNF-α 및 IL-1β를 포함하여, HBE 세포에 의해 방출된 4가지의 주요 사이토킨의 자극에 미치는 천연 및 r(Cys)hTrx의 효과를 평가한다. 세포가 없는, 비-농축 배양 상층액 중의 사이토킨을 상업적으로 입수가능한 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트(R&D systems)를 사용하여 측정한다. 기저측 ALI 배지(Fulcher, M.L., 2005, 상기 동일)의 샘플을 5개 모든 그룹의 분무 후 24시간에 얻고, 분석 전에 냉동한다. 바탕값 대조군으로서, 깨끗한(미사용) ALI 배지를 모든 값으로부터 뺀다. 각 사이토킨 분석에 대해, 적절한 표준 곡선을 만들기 위하여 농도의 30을 넘는 양성 대조군을 사용한다. 추가로, 각 "미지" 샘플을 이중으로 분석한다. 측정된 사이토킨은 다음과 같다: TNF-α(낮은 검출 한계 0.3pg/㎖), IL-6(낮은 검출 한계 0.35pg/㎖), IL-8(낮은 검출 한계 2.4pg/㎖) 및 IL-1β(낮은 검출 한계 1.5pg/㎖). 이들 분석의 상호 및 다른 재조합 인간 사이토킨들(IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, 종양 괴사 인자-S, 과립구 콜로니-자극 인자 및 형질전환 성장 인자-III)과의 교차-반응성은 앞서 모두 검출 한계 아래에 있는 것으로 나타났다.

샘플 크기 및 통계학적 분석: 5개의 조건 각각을 총 9개의 개별 HBE 배양물에 대해 평가한다. 이것은 3명의 상이한 환자들(n=3)로부터의 3개의 배양물(n=3)을 나타낸다. 그런 접근법은 각 조건의 샘플 내- 및 샘플-간 변화의 이해를 제공하기 위해 통계학적으로 충분히 힘을 받는다. 데이터 분석을 위해, 개별 샘플/그룹 간 비교를 양측 학생 t-시험을 사용하여 시행한다. 다중 그룹 비교를 위해, 일원 변량분석(ANOVA)을 사용한다. 모든 분석에 대해 유의미성을 p<0.05로 설정한다.

CF 환자 공여자로부터의 HBE 배양물에서 r(Cys)hTrx의 전-염증성 평가. 인간 CF 일차 기도 상피 세포 배양물: 점액섬모 분화와의 공기-액체 계면에서 인간 일차 기도 상피 세포를 증식하고 배양하기 위한 최근 기법을 Schlegel과 동료들이 보고한 방법들을 토대로 사용한다(Liu, M. et al., Protein Expr Purif. 84(1):130-139, 2012; Suprynowicz, F.A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 109(49):20035-20040, 2012). 이들 방법은 유전자 조작 없이 ALI에서 여전히 말단 분화를 할 수 있는 일차 기도 상피 세포의 실제로 무제한적인 공급을 허용한다. F508del에 대해 동형접합성인 3개의 독특한 CF 공여체의 각각으로부터, 30 웰을 배양하여 30일에 걸쳐 ALI에서 분화시킨다. 배양액을 3가지 농도(10μM, 250μM 및 1000μM)의 rhTrx(야생형) 및 r(Cys)hTrx에 대해 선단 표면에서 노출시키고, 노출 도전 후 4 및 24시간에 선단 및 기저측 배지 샘플을 둘 다 수집하였다(표 1 참조). 사용한 배지는 혈청이 없었고, 잔해를 제거하기 위해 원심분리하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다. 인간 염증성 사이토킨에 대한 ELISA 분석을 선단 및 기저층 배지 둘 다로부터 취한 모든 샘플에 대해 수행한다. 선단 수집은 200μL의 멸균 PBS를 선단 표면에 놓고 15분 동안 인큐베이션한 후에 회수함으로써 이루어진다. IL-8 및 IL-6에 대한 ELISA를 각 샘플에 대해 이중으로 수행한다(Becker, M.N. et al., Am J Resp Crit Care Med 169(5):645-653, 2004). 30개의 ALI 배양물을 포함하는 상기 계획을 3개의 CF 공여체의 각각에 대해 반복한다. 천연 rhTrx 및 r(Cys)hTrx의 비교 결과는 시험된 농도들에서 CF 환자들의 분화된 기도 상피 세포로부터의 전염증성 사이토킨 방출을 유도하는 티오레독신의 경향성이 천연 Trx에 비해 모노시스테인 Trx에서 약화되는 것을 입증한다.

노출후 시간	희석제 대조군	rhTrx (500μM)	r(Cys)hTrx (10μM)	r(Cys)hTrx (250μM)	r(Cys)hTrx (1000μM)
4 시간	3	3	3	3	3
24 시간	3	3	3	3	3

실시예 7

이 실시예는 시험관 내 HBE 세포 배양물로부터 수득한 균일한 점액에 대해 천연 rhTrx에 비해 r(Cys)hTrx가 미치는 효과의 생물물리학적 및 생화학적 특성확인을 입증한다.

세포 배양 점액의 제조: 인간 기관지 상피 세포를 문헌에 기술된 것과 같이 성장시키고 유지하였다(Matsui, H., et al., J Clin Invest 102(6):1125-1131, 1998). 간단히 설명하면, 배양물로부터 수득한 점액을 모아 4℃에서 보관한다. 샘플을 투석 튜브(MWCO=3,500)에 로딩하고, 중합체 흡수제(Spectra/Gel)를 사용하여 1 내지 5일 동안 4℃에서 농축한다. 그런 다음 농축된 점액을 500μM의 MgCl₂ 및 800μM의 CaCl₂를 함유하는 PBS에 대해 4℃에서 투석하여 적절한 염 평형을 수립한다(Matsui, H. et al., Proc Natl Acad Sci USA 103(48):18131-18136, 2006).

거시적 유동학: 원뿔평판 및 평행 구조 두 가지의 Bohlin Gemini 유량계를 사용하여 농축 및 시간 경과 분석을 수행하여 시험관 내 HBE 점액 특성에 미치는 환원된 r(Cys)hTrx 및 천연 티오레독신의 크고, 거시적인 생물물리학적 효과를 평가한다. 공지의 응력(0.05 내지 ~100Pa)을 처리된 또는 대조군 점액에 10초 동안 부과하고, 유체의 유동학적 회복을 추가의 50초에 대해 기록하는 크리프(creep) 회복 실험을 수행한다. 계속되는 작동에서, 부과된 응력을 유체의 항복 응력에 도달될 때까지(즉 유체의 점도가 갑자기 및 극적으로 감소하는 시점의 응력) 로그 방식으로 증가시킨다. 측정된 변수들로부터 유체의 점도 및 탄성을 부과된 응력의 함수로서 측정한다. 두 가지 일정한 응력 및 스트레인에서 빈도수 스위프를 수행하고 점액의 기준 물리적 특성(각각 G' 및 G")을 측정하기 위해, 뿐만 아니라 유체의 점도 및 전단 담화 행동을 측정하는데 사용한다. 모든 실험을 23℃에서 수행한다.

고압 액체 크로마토그래피: 처리 및 대조군 점액의 뮤신의 농도 및 분자량을, 천연 티오레독신과 r(Cys)hTrx가 뮤신 구조에 미치는 효과를 측정하기 위해, 차등 굴절측정에 의해 평가한다. 샘플(500㎕)을 세파로스 S1000 칼럼(Amersham Pharmacia) 위에 로딩하고, 200mM 염화나트륨/10mM EDTA를 사용하여 0.5㎖/분의 유속에서 용출하였다. Wyatt/Optilab DSP 간섭 굴절계에 결합된 인-라인 Dawn EOS 레이저 광도계를 사용하여 광산란 및 샘플 농도를 각각 측정한다(Wyatt Technology Corporation). 뮤신의 농도를 칼럼의 보이드 부피에서 용출된 물질과 관련된 굴절 지수 피크를 통합하고, 사전에 650nm에서 측정하였고 5% 내에서 재생가능한 것으로 밝혀진 0.165㎖/g의 굴절-지수 증분(dn/dc)에 대한 값을 사용하여 계산한다. 주어진 뮤신 샘플의 총 단백질 함량(뮤신 및 작은 단백질)을 유사한 방법에 의해 측정하되, G-25 칼럼(dn/dc=0.170)을 사용하였다. 샘플의 비-뮤신(또는 작은 단백질) 함량을 뮤신과 단백질 함량(샘플을 G-25 칼럼을 통해 용출시킴으로써 검출됨)의 총 질량으로부터 뮤신 함량(샘플을 S-1000 칼럼을 통해 용출시킴으로써 측정됨)의 질량을 뺌으로써 측정한다. 겔-기초 방법들, 예컨대 환원 또는 비-환원 PAGE와 비교하면, 차등 굴절측정은 정확한 분자량 및 분자량 분포가 정성적 비교보다 접근가능하다는 점에서 유익하다. 이들 기법의 정량적 장점은 크기 표준이 존재하지 않고 분자량이 보통 1MDa를 초과하는, 뮤신과 같은 큰 당단백질의 연구에 특히 중요하다(Gillis, R.B., et al., Carbohydr Polym 93(1):178-183, 2013).

탄수화물 및 단백질 블롯팅: 뮤신 미세 구조에 미치는 티오레독신 처리의 잠재적 효과를 무상 HBE 점액에 대한 단백질 블롯팅 분석을 수행함으로써 평가한다. 50 내지 200㎕ 분취액의 샘플을 나이트로셀룰로스 막 위에 로딩하고 5분 동안 진공을 적용하여 로딩된 샘플 전체를 막 안으로 밀어넣는다. 샘플을 증류수로 2회 세척한다. 탄수화물 함량의 과요오드산 쉬트(PAS) 분석에 대해, 로딩하고 세척한 샘플을 물 중의 0.25% 과요오드산 + 3% 아세트산에서 30분 동안 인큐베이션한다. 증류수를 이용한 2회의 세척 후에, 샘플을 NaMBS(0.1% 나트륨 메타바이설페이트, 1% HCl) 중에서 2회 5분씩 인큐베이션한다. 다음에, 샘플을 쉬프 시약과 함께 5 내지 15분 동안 인큐베이션하고 NaMBS로 2회 세척한 후, 증류수로 1회 세척하고 재빨리 진공 건조하였다. 로딩 후에 단백질-특이적 항체 블롯을 TBST 완충액(1.21% Tris HCl, 8.76% NaCl 및 0.5% Tween, pH 8) 중의 1% 우유로 차단하고 첫 번째 증류수 세척을 한다. 5분씩 TBST로 2회 세척한 후에, 샘플을 일차 항체(MUC5AC, MUC5BIII에 대해 MAN-5ACI 및 MUC5B에 대해 K5B)에서 30분 동안 인큐베이션한다. TBST 중에서 추가로 5분씩 2회의 세척 후에, 샘플을 이차 항체에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 막 블롯을 Li-Cor Odyssey 적외선 검출기를 사용하여 전개시킨다. 추가로, 항-티오레독신 항체를 뮤신에 결합된 천연 티오레독신에 비해 모노시스테인을 검출하는 데 사용할 수 있다. 표준 웨스턴 면역블롯팅과 비교하여, PAGE 겔 상에서의 분리 후에 이 직접적인 블롯팅 접근법은 뮤신 함량의 보다 신속하고 정확한 측정을 허용하고 모노시스테인 활성 부위 티오레독신(r(Cys)hTrx)과 뮤신 이황화 결합 사이의 공유 상호작용을 가시화하고 정량하는 것을 허용한다.

실시예 8

이 실시예는 쥐 및 마우스에 기관 내 전달 후에, 폐에서 천연 rhTrx의 전염증성 및 병리생리학적 효과를 유도하는 경향성을 약화시키는 모노시스테인 활성 부위 Trx(r(Cys)hTrx)의 능력을 입증한다.

기관 내로 r(Cys)hTrx 및 천연 rhTrx로 투약된 정상 쥐에서 전-염증성 사이토킨 방출과 세포 이동의 평가. 전-염증성 신호화를 유도하는 r(Cys)hTrx의 능력을 천연 rhTrx와 비교하여 측정하기 위하여, 기관 내(IT) 전달되는 티오레독신 단백질의 농도를 증가시켜가며 비히클 대조군과 비교한 생체 내 비교 연구를 쥐에서 수행한다. 2가지 연구 성분은 1) 정제된 천연 rhTrx를 사용하여 얻어진 이전의 발견(Rancourt, R. et al., Free Radic Biol Med, 42(9):1441-1453, 2007)을 복제하기 위해 디자인된 초기 연구 및 2) rhTrx에 대한 r(Cys)hTrx의 전-염증성 효과를 비교하기 위한 주요 연구이다. 모든 연구는 Trx 활성 부위 Cys 잔기들을 환원(활성화)하기 위해 DTT 또는 다른 적절한 환원제로 처리되어 있는 정제된, 내독소-유리 단백질을 사용한다. 환원에 이어서, DTT 또는 환원제를 크기-축출 크로마토그래피에 의해 제거한다. Trx Cys 잔기들의 완전한 환원을 시험관 내 분석(DTNB 환원)에 의해 확인하고, r(Cys)hTrx의 촉매적 이황화-결합 환원 활성을 인슐린-환원 또는 HPLC 표적-결합 분석을 사용하여 분석한다.

초기 연구: 24마리의 쥐를 무작위로 그룹당 6마리씩 4개의 실험 그룹으로 나누고 다음과 같이 투약하였다: 그룹 1, 비히클 대조군; 그룹 2, 산화된(비활성) rhTrx; 그룹 3, 환원된(활성) rhTrx; 그룹 4, 인간 혈청 알부민(HSA; 네거티브 대조군). 모든 시험 물품을 한번에 IT 경로에 의해 전달한다. 이 연구의 종점은 1) TNF의 사이토킨 분석, 사이토킨은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 호중구 화학주성인자-2(CINC2) 및 마크로파지 염증성 단백질-3(MIP3)을 유도함; 및 2) 염증성 세포의 백분율(호중구 대 마크로파지)을 설명하기 위하여 Wright 염색을 사용한 기관지폐포 세척(BAL)으로부터의 세포 계수를 포함한다. 그룹 2(산화된 rhTrx로 처리됨)는 비히클 대조군, 그룹 1 및 HSA, 그룹 4와 비교하여 유사한 BAL의 사이토킨 활성 및 세포 계수를 나타낸다. 환원된 rhTrx로 처리된 그룹 3은 그룹 1 및 그룹 2와 비교하여 증가된 수준의 사이토킨 활성 및 세포 계수를 나타낸다.

주요 연구: r(Cys)hTRX에 비해 천연 티오레독신으로 투여될 때 쥐에서의 사이토킨 방출의 비교. 이 비교 연구에서, r(Cys)hTrx에 비해 rhTrx에 대한 IT 투여 후에 생체 내 사이토킨 방출과 세포 이동의 상대적인 정도를 측정한다. 환원된 rhTrx 및 환원된 r(Cys)hTrx의 3가지 용량 수준(50μM, 200μM 및 1000μM)을 시험한다. 종점들은 파일럿 연구와 동일하고, 여기에 폐 조직의 면역조직화학(IHC) 분석이 부가된다. C-말단 활성 부위의 r(Cys)hTrx 변형에서, 시스테인 모티프(CXXC에서 CXXX로의 변화)는 티오레독신의 제2 티올-이황화물 교환 능력을 제거하는 것으로 밝혀졌고, 따라서 이황화-결합 표적에의 공유 결합을 초래한다. IT-전달된 TRX가 첫 번째로 만나게 되는, 폐에 있는 가장 우세한 세포외재성 이황화-결합 표적은 점액층 및 상피 세포-표면 단백질에 위치한다. 따라서, 천연 rhTrx와 비교하여, r(Cys)hTrx의 폐 상피 세포 및 관련된 점액에의 결합이 증가되고, 이 결합은 항-인간 티오레독신 항체를 사용하여 IHC에 의해 검출할 수 있다. 폐 조직을 BAL하지 않은 IHC 분석을 위해 각 그룹으로부터 2마리의 동물로부터 수집하고, 동일한 그룹의 각각으로부터의 2마리의 BAL-후 동물과 비교하였다. 이와 같이 각 그룹에 대해 8마리의 동물을 세척하고, 2마리의 동물을 처리하되, 폐 수집 및 IHC 전에 BAL을 수행하지 않는다. r(Cys)hTrx는 rhTrx의 동일한 용량 수준과 비교하여 사이토킨 활성과 세포 수를 증가시키는 용량-의존성 능력의 약화를 나타낸다.

기관 내로 r(Cys)hTrx로 투약된 정상 쥐에서의 독성 및 폐 병리학의 평가. 과장된 투약 조건하에서 폐에 미치는 r(Cys)hTrx의 효과를 평가하기 위하여, 0.5 내지 20mg/㎏의 광범위한 단일 용량의 r(Cys)hTrx를 IT 경로에 의하여 투여하고, 투약 후 2 및 14일에 병리학적 변화가 일어났는지에 대해 평가를 수행한다. 수컷 및 암컷 스프라그-도울리 쥐를 그룹 당 20마리(10/성별)씩의 3개의 실험 그룹으로 무작위로 나누었다. 모든 동물을 연구-전 신체검사를 수행한다. 비히클(식염수 제형)을 네거티브 대조군으로서 사용한다. 이 연구의 종점은 1) 해로운 총 변화를 찾기 위한 임상적 및 조직병리학적 조사; 및 2) 시험 물품의 존재 및 시험 물품에 대한 항체를 검출하기 위한 혈청의 특성확인을 포함한다. 모노시스테인 r(Cys)hTrx는 비교 단위용량에서 천연 rhTrx에 비해 덜 심각한 효과를 초래한다.

기관 내로 r(Cys)hTrx 및 천연 rhTrx로 투약된 정상 및 bENac 마우스에서 전-염증성 사이토킨 방출 및 세포 이동의 평가. 마우스를 아이소플루란으로 마취시키고 경사진 설치류 작업대 위에 놓았다. 확대경이 갖춰진 설치류 후두경을 사용하여, 후두를 직접 가시화하고 미세분무기(PennCentury)를 말단 기관 안으로 통과시킨다. 고정된 부피(25 내지 50μL)의 시험 물품 용액을 기도에 투여하고 마우스가 회복되도록 허용하였다. 기도 설치시 및 안락사시킬 때의 중량을 기록한다. 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)가 승인한 프로토콜에 따라, 조건당 5마리의 마우스를 IT 점적 주입 후 6시간째에 안락사시키고 다른 5마리 마우스를 24시간 후에 안락사시켰다. 프로테아제 억제제(Pierce)가 포함된 총 1.5mL의 저온 멸균 식염수로 기도를 세척한다. 전체 폐를 수집하고 모든 견본을 나중에 처리할 때까지 얼음 위에서 보관한다. 기관지폐포 세척 유체(BALF)를 원심분리하여 백혈구 및 다른 세포 파편을 펠릿화한다. 세포가 없는 BALF를 ELISA 시험을 수행할 때까지 -80℃에서 냉동시킨다. BAL 세포 펠릿을 1mL의 멸균 식염수에 재현탁하고 총 백혈구 감별 계수를 염색된 시토스핀 제제로부터 Coulter 카운터와 300개 세포의 수동 계수를 사용하여 수행한다. 모든 샘플을 수집했을 때, BAL 유체를 얼음 상에서 해동시키고 ELISA를 KC(IL-8의 유사체), TNF 알파, IL-6 및 IL-1베타(ElisaTech, 콜로나도주의 덴버시에 소재)에 대하여 수행한다. BALF 세포질을 %와 총 백혈구(호중구, 마크로파지, 림프구) 두 가지에 의해 특성 규명된다.

야생형 및 돌연변이 TRX 두 가지를 모두 2가지 농도 및 2개의 시점에서, 대조 동물과 함께 시험하여 희석제 대조군과비교한 돌연변이체 및 야생형 TRX 두 가지에 대한 급성 기도 염증 반응을 측정한다(표 2). 반응을 체중, BALF의 총 백혈구 수, 호중구, 마크로파지 및 림프구, 및 상기 열거된 염증성 사이토킨의 상대적인 수 및 총 수의 변화에 의해 특성 규명한다. r(Cys)hTrx는 동일한 용량 수준의 rhTrx와 비교하여 사이토킨 활성 및 세포 수를 증가시키는 용량-의존성 능력의 약화뿐만 아니라 부작용의 약화를 나타낸다.

	희석제 대조군	rhTrx (500 μM)	r(Cys)hTrx (10 μM)	r(Cys)hTrx (250 μM)	r(Cys)hTrx (1000 μM)
6시간	5	5	5	5	5
24시간	5	5	5	5	5

기관 내로 r(Cys)hTrx 및 천연 rhTrx로 투약된 정상 및 βENaC 마우스에서 병리생리학적 및 염증성 효과의 평가. Rancourt와 동료들에 의한 이전의 연구들(Rancourt, R. et al., Free Radic Biol Med, 42(9):1441-1453, 2007)은 기도상의 추가의(외인성) 점액의 존재가 천연 Trx에 의한 사이토킨 방출의 자극을 상당히 감소시킨다는 것을 증명하였다. 이것은 더 큰 점액 덩어리를 가지는 CF 환자들이 Trx의 세포외재성 감소로 인하여 감소된 염증 반응을 나타낼 것이라는 것을 시사하는 한편, 현재 1) 증가된 내인성 점액 생성 및 2) 기존의 염증성 반응(CF에서처럼)을 포함한 기도 모델에서 티오레독신의 효과와 관련된 정보는 없다. 이들 연구의 목표는 천연 Trx 및 r(Cys)hTrx의 효과를 조사하기 위하여 만성 점액 폐쇄/염증의 마우스 모델을 사용하는 것이다. 이들 연구를 위해서, ENaC 채널의 베타 하위유닛을 과잉발현하고 폐에서 물 과흡수를 나타내는 βENaC 마우스 모델을 사용한다(Mall, M., et al., Nat Med. 10(5):487-493, 2004). βENaC 마우스는 과도한 점액을 생성하고 점액 기도 막힘과 염증을 포함한 CF/COPD-유사 폐 표현형을 나타낸다. 이들 마우스는 이전에 많은 임상전 연구에서 CF 폐 질환의 모델로서 사용되었다(예컨대 Graeber, S.Y., et al., Am J Respir Cell Mol Biol 49(3):410-417, 2013). 본 연구에서는 천연 및 모노시스테인 Trx(r(Cys)hTrx)의 상대적인 효과를 조사하고, 만성 점액 과잉생성과 기존의 염증이 이들 화합물의 잠재적인 폐 독성을 어떻게 조절하는지를 이해하기 위하여 광범위한 전달 용량에 걸쳐 1) 기도/폐 조직병리학 및 염증 상태에 미치는 천연 Trx 대 r(Cys)hTrx의 영향; 및 2) βENaC 마우스(아래 참조)에서 이들 제제가 점액 덩어리에 미치는 영향을 측정한다.

WT 및 βENaC 마우스를 사용하여 생체 내에서 3가지 농도(100μM, 500μM 및 1000μM)의 천연 티오레독신의 효과 및 독성 및 약물 효력을 동일한 농도에서 r(Cys)hTrx 화합물과 비교 측정한다. 조건당 최소 7마리의 마우스를 시험한다. 모든 화합물을 주어진 농도에서 기관 내 점적 주입(10 내지 25㎕)을 통해 투여한다. 단일 용량 치료를 사용하고 독성 및 약물 효력을 4개의 시점(투약 후 4h, 24h, 72h 및 7일)에서 모니터링한다. 초기 시점(4h 내지 24h)에서는 주의깊게 모니터링한다. 후기 시점(72h 내지 7일)은 약물 독성이 24h에 유지되는 경우 모니터링한다. 저농도(100μM, 500μM)의 효과는 각각 24h 또는 3일 후에도 지속되지 않을 것으로 예상된다. 사용된 프로토콜에서는 10㎕ 정도로 적은 부피의 점적 주입이 마우스 폐 안으로 확실하게 주입되는 것이 가능하다. 간단히 설명하면, 동물을 아이소플루란으로 마취시키고, 작은 후두경을 사용하여 마우스 후인두부를 가시화하는 삽관 플랫폼 위에 놓는다. 약물을 직접 기관 내에(기관 내 점액 주입, IT) 점적 주입하거나, 보다 균질하고 심층적인 축적을 위해서 Penn Century 장치를 사용하여 25㎕를 미세 분무에 의해 전달한다. 치료 후에, 동물들을 적절한 시점에 안락사시킨다. 조직학 측정을 위해 무상 폐를 수집하고 다양한 척도, 즉 세포 수, 뮤신 함량 및 환원 상태 측정을 위해 기관지폐포 세척 유체 및 사이토킨들을 수집한다. 보다 상세하게 설명하자면, 결찰용 실을 통해 좌측 폐의 주요 줄기 기관지 주변을 묶고 조직학 측정을 위해 수술로 분리한다. 반대쪽 폐(또는 우측 폐엽)의 기관지폐포 세척을 기관절개술 및 500㎕의 멸균 PBS를 사용한 캐뉼라를 통해 수행한다. 전체 폐를 고정시킨 후에, 종단면을 H&E 및 AB-PAS 염색에 의해 분석하여 염증 및 보유된 점액을 평가한다. BAL을 세포 수/격차, 뮤신 함량 및 환원 상태(아가로스 겔 분리 방법 및 웨스턴 블롯팅) 및 사이토킨에 대해 분석한다.

샘플 크기 및 통계학적 분석: 각각의 화합물을 다양한 농도(100μ㏖, 500μ㏖, 1000μ㏖)에서 조건당 총 7마리 마우스에 대해 평가한다. 2 그룹, 즉 야생형(WT)과 βENaC 마우스들을 시험한다(표 3). 다음의 표에서 "X"로 표시되는 것과 같이, 총 36 조건 x 7 마우스(총 252 마우스)가 각 조건의 샘플-내 및 샘플-간 변이의 충분한 이해를 제공하기 위해 처리되고 분석된다. 데이터 분석을 위해, 개별 샘플/그룹 사이의 비교를 양측 학생 t-시험을 사용하여 수행한다. 다중 그룹 비교를 위해, 일원 변량분석(ANOVA)을 사용한다. 모든 분석에 대해 유의미성을 p<0.05로 설정한다. 모노시스테인 r(Cys)hTrx는 비교 단위용량에서 천연 rhTrx에 비해 덜 심각한 효과를 초래하고, 이 효과는 추가로 βENaC 마우스에서 내인성 점액의 존재에 의해 약화된다.

모델	화합물	농도(μ㏖)	4시간	24시간	72시간	7일
WT	티오레독신	100	X	X
		500	X	X	X
		1000	X	X	X	X
	r(Cys)hTrx	100	X	X
		500	X	X	X
		1000	X	X	X	X
βENaC	티오레독신	100	X	X
		500	X	X	X
		1000	X	X	X	X
	r(Cys)hTrx	100	X	X
		500	X	X	X
		1000	X	X	X	X
"X"는 시간 x 시험된 농도를 나타낸다

실시예 9

이 실시예는 r(Cys)hTrx가 야생형 rhTrx에 비해 점액-정상화 활성을 개선하는 것을 보여준다. 야생형 rhTrx, r(Cys)hTrx 및 2가지 농도의 다이티오트레이톨(DTT), 등몰 농도의 N-아세틸 시스테인(NAC) 및 재조합 인간 DNase(rhDNase)를 포함한 다양한 대조군이 가래-압축 분석에서 환자 가래 샘플(치료당 n=6)의 정상화에 미치는 효과를 측정하였다. 가래 연구를 각 실험에 대해 각각 3명까지의 개별 CF 환자로부터의 4 내지 6개의 자발적 객담(비-유도) 샘플을 사용하여 수행하였다. 각 샘플로부터 가래의 "우세한" 부분(즉, 점액)을 수집하여 조합하고 총 샘플을 교반 또는 경미한 와동에 의해 부드럽게 균질화한 후 튜브에 분리하고 각각 다음에 노출시켰다: 희석제(즉 Tris 완충액), 희석제 중의 DTT(0.58mM 및 1.5mM), 희석제 중의 NAC(0.58mM), 희석제 중의 rhDNase(0.58mM), 희석제 중의 rhTrx(0.58mM) 또는 희석제 중의 r(Cys)hTrx(0.58mM). DTT를 각 실험에 대해 양성 대조군으로서 새롭게 만들었다. 도 2는 r(Cys)hTrx가 야생형 티오레독신(도 2에서 "rhTrx"로 지칭됨)과 비교하여 환자 가래의 액화를 현저하게 증가시킬 수 있었음을 보여주고, 그로써 천연 Trx 및 케어 재조합 인간 DNase의 표준, Pulmozyme(상표명)("rhDNase")에 비해 개선된 점액-정상화 활성을 보여준다. 계속해서 티오레독신과 DNase는 둘 다 미국 외에서 점액 분해제로서 통상적으로 사용되는 등몰량의 NAC보다 강력하였다. 인간 CF 환자 가래를 사용하는 이들 결과는 모노시스테인 r(Cys)hTrx가 뮤신 Cys에의 예상된 공유 결합에도 불구하고, CF 가래 점탄성 정상화에 대해 완전한 경합 상태를 유지하는(미변형 천연 rhTrx보다 훨씬 더 강력하다) 것을 입증한다. 그러나, 작은 12 kD r(Cys)hTrx가 폐 상피를 가로지르는 가능성은 뮤신에의 결합에 의해 크게 최소화되어야 한다. 그런 다음 계속해서 세포 핵 안으로 들어가고 NFkB와 같은 산화환원 조절 표적 단백질과 상호작용하는 활성 r(Cys)hTrx의 능력은, CD30 TNF 수용체의 Trx-중재된 활성화에 대해 이론화되어 있는 것과 같이(Schwertassek, U., et al., EMBO J 26(13):3086-3097, 2007), 면역세포 상의 세포외재성 경막 도메인과의 상호작용으로 인한 임의의 신호화처럼 한층 더 약화된다. r(Cys)hTrx에 대해 관찰된 증가된 효능(도 1a, 1b 및 2)은, 결합된 Cys가 천연 rhTrx(또는 실제로, 임의의 작은-분자 티올제)를 사용한 치료와는 달리 이황화-결합의 재형성을 차단할 것이기 때문에, 분자에 의한 뮤신 Cys 공유 결합과 일관된다.

본 명세서에서 논의되거나 인용된 공보물 및 다른 참고문헌들은 각각 그것의 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 다양한 실시형태들이 상세하게 설명된 한편으로, 그런 실시형태들의 변형 및 응용은 해당 기술분야에 숙련된 사람들에게 드러날 것이다. 그러나 그런 변형 및 응용은 이어지는 청구범위에 나타난 것과 같이 본 발명의 범주 내에 있는 것이 분명하게 인지되어야 한다.

<110> ORPRO THERAPEUTICS, INC. <120> PRODUCT AND PROCESS FOR MUCUS VISCOSITY NORMALIZATION <130> IPC154313US <150> US 61/792198 <151> 2013-03-15 <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_01 <400> 1 Cys Gly Pro Cys 1 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_02(Xaa = any amino acid) <400> 2 Xaa Cys Gly Pro Cys Xaa 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_03 <400> 3 Trp Cys Gly Pro Cys Lys 1 5 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 4 Met Ser Asn Asp Leu Ile Lys His Val Thr Asp Ala Ser Phe Glu Ala 1 5 10 15 Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Val Leu Val Asp Tyr Trp Ala Glu 20 25 30 Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Val Leu Asp Glu Ile Ala 35 40 45 Thr Thr Tyr Ala Gly Lys Leu Thr Ile Ala Lys Leu Asn Ile Asp Glu 50 55 60 Asn Gln Glu Thr Pro Ala Lys His Gly Val Arg Gly Ile Pro Thr Leu 65 70 75 80 Met Leu Phe Lys Asn Gly Asn Val Glu Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu 85 90 95 Ser Lys Ser Gln Leu Ala Ala Phe Leu Asp Ala Asn Ile 100 105 <210> 5 <211> 104 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 5 Met Ala Leu Gln Ile Thr Asp Ala Thr Phe Asp Gly Leu Val Ala Glu 1 5 10 15 Gly Lys Pro Met Val Val Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys 20 25 30 Arg Met Val Gly Pro Ile Ile Asp Glu Leu Ala Ala Glu Tyr Glu Gly 35 40 45 Arg Ala Ile Ile Gly Lys Val Asp Val Asp Ala Asn Thr Glu Leu Pro 50 55 60 Met Lys Tyr Gly Val Arg Asn Ile Pro Thr Ile Leu Phe Ile Lys Asn 65 70 75 80 Gly Glu Val Val Lys Lys Leu Val Gly Ala Gln Ser Lys Asp Val Phe 85 90 95 Lys Lys Glu Leu Asp Ala Leu Phe 100 <210> 6 <211> 103 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 6 Met Val Lys Glu Ile Thr Asp Ala Thr Phe Glu Gln Glu Thr Ser Glu 1 5 10 15 Gly Leu Val Leu Thr Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Arg 20 25 30 Met Val Ala Pro Val Leu Glu Glu Ile Gln Glu Glu Arg Gly Glu Ala 35 40 45 Leu Lys Ile Val Lys Met Asp Val Asp Glu Asn Pro Glu Thr Pro Gly 50 55 60 Ser Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Ile Lys Lys Asp Gly 65 70 75 80 Glu Val Val Glu Thr Ile Ile Gly Tyr Arg Pro Lys Glu Glu Leu Asp 85 90 95 Glu Val Ile Asn Lys Tyr Val 100 <210> 7 <211> 103 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Val Thr Gln Phe Lys Thr Ala Ser Glu Phe Asp Ser Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gln Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Tyr Ala Thr Trp Cys Gly Pro 20 25 30 Cys Lys Met Ile Ala Pro Met Ile Glu Lys Phe Ser Glu Gln Tyr Pro 35 40 45 Gln Ala Asp Phe Tyr Lys Leu Asp Val Asp Glu Leu Gly Asp Val Ala 50 55 60 Gln Lys Asn Glu Val Ser Ala Met Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn 65 70 75 80 Gly Lys Glu Val Ala Lys Val Val Gly Ala Asn Pro Ala Ala Ile Lys 85 90 95 Gln Ala Ile Ala Ala Asn Ala 100 <210> 8 <211> 105 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 8 Met Val Lys Ser Val Gly Asn Leu Ala Asp Phe Glu Ala Glu Leu Lys 1 5 10 15 Ala Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys 35 40 45 Phe Gly Asp Val Val Phe Ile Glu Ile Asp Val Asp Asp Ala Gln Asp 50 55 60 Val Ala Thr His Cys Asp Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Lys Asn Gly Lys Lys Val Gln Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Glu Thr Ile Lys Ser Leu Val 100 105 <210> 9 <211> 105 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Met Val Lys Leu Ile Glu Ser Lys Glu Ala Phe Gln Glu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 50 55 60 Val Ala Ala Asp Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Ala Ser Ile Thr Glu Tyr Ala 100 105 <210> 10 <211> 105 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Met Val Lys Leu Ile Glu Ser Lys Glu Ala Phe Gln Glu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 50 55 60 Val Ala Ala Asp Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Ala Thr Ile Thr Glu Phe Ala 100 105 <210> 11 <211> 105 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 11 Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Tyr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asn 1 5 10 15 Ser Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys 35 40 45 Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 50 55 60 Val Ala Ala Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Ile 100 105 <210> 12 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp 1 5 10 15 Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys 35 40 45 Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 50 55 60 Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val 100 105 <210> 13 <211> 134 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 13 Met Gly Gly Ala Leu Ser Thr Val Phe Gly Ser Gly Glu Asp Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gly Thr Glu Ser Ser Glu Pro Ser Arg Val Leu Lys Phe Ser 20 25 30 Ser Ser Ala Arg Trp Gln Leu His Phe Asn Glu Ile Lys Glu Ser Asn 35 40 45 Lys Leu Leu Val Val Asp Phe Ser Ala Ser Trp Cys Gly Pro Cys Arg 50 55 60 Met Ile Glu Pro Ala Ile His Ala Met Ala Asp Lys Phe Asn Asp Val 65 70 75 80 Asp Phe Val Lys Leu Asp Val Asp Glu Leu Pro Asp Val Ala Lys Glu 85 90 95 Phe Asn Val Thr Ala Met Pro Thr Phe Val Leu Val Lys Arg Gly Lys 100 105 110 Glu Ile Glu Arg Ile Ile Gly Ala Lys Lys Asp Glu Leu Glu Lys Lys 115 120 125 Val Ser Lys Leu Arg Ala 130 <210> 14 <211> 167 <212> PRT <213> Zea mays <400> 14 Met Ala Met Glu Thr Cys Phe Arg Ala Trp Ala Leu His Ala Pro Ala 1 5 10 15 Gly Ser Lys Asp Arg Leu Leu Val Gly Asn Leu Val Leu Pro Ser Lys 20 25 30 Arg Ala Leu Ala Pro Leu Ser Val Gly Arg Val Ala Thr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg His Val Cys Gln Ser Lys Asn Ala Val Asp Glu Val Val Val Ala 50 55 60 Asp Glu Lys Asn Trp Asp Gly Leu Val Met Ala Cys Glu Thr Pro Val 65 70 75 80 Leu Val Glu Phe Trp Ala Pro Trp Cys Gly Pro Cys Arg Met Ile Ala 85 90 95 Pro Val Ile Asp Glu Leu Ala Lys Asp Tyr Ala Gly Lys Ile Thr Cys 100 105 110 Cys Lys Val Asn Thr Asp Asp Ser Pro Asn Val Ala Ser Thr Tyr Gly 115 120 125 Ile Arg Ser Ile Pro Thr Val Leu Ile Phe Lys Gly Gly Glu Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Val Ile Gly Ala Val Pro Lys Ser Thr Leu Thr Thr Leu Ile 145 150 155 160 Asp Lys Tyr Ile Gly Ser Ser 165 <210> 15 <211> 172 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 15 Met Ala Leu Glu Thr Cys Phe Arg Ala Trp Ala Thr Leu His Ala Pro 1 5 10 15 Gln Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ser Arg Asp Arg Leu Leu Leu Ser Gly 20 25 30 Ala Gly Ser Ser Gln Ser Lys Pro Arg Leu Ser Val Ala Ser Pro Ser 35 40 45 Pro Leu Arg Pro Ala Ser Arg Phe Ala Cys Gln Cys Ser Asn Val Val 50 55 60 Asp Glu Val Val Val Ala Asp Glu Lys Asn Trp Asp Ser Met Val Leu 65 70 75 80 Gly Ser Glu Ala Pro Val Leu Val Glu Phe Trp Ala Pro Trp Cys Gly 85 90 95 Pro Cys Arg Met Ile Ala Pro Val Ile Asp Glu Leu Ala Lys Glu Tyr 100 105 110 Val Gly Lys Ile Lys Cys Cys Lys Val Asn Thr Asp Asp Ser Pro Asn 115 120 125 Ile Ala Thr Asn Tyr Gly Ile Arg Ser Ile Pro Thr Val Leu Met Phe 130 135 140 Lys Asn Gly Glu Lys Lys Glu Ser Val Ile Gly Ala Val Pro Lys Thr 145 150 155 160 Thr Leu Ala Thr Ile Ile Asp Lys Tyr Val Ser Ser 165 170 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_16(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 16 Cys Xaa Xaa Cys 1 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_17(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 17 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_18(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 18 Cys Gly Pro Xaa 1 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_19(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 19 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_20(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 20 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_21(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 21 Xaa Cys Gly Pro Xaa Xaa 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_22(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 22 Xaa Cys Gly Pro Cys Xaa 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_23(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 23 Trp Cys Gly Pro Xaa Lys 1 5 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_24(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 24 Cys Xaa Xaa Ser 1 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_25(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 25 Xaa Cys Xaa Xaa Ser Xaa 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_26(Xaa = any amino acid other than cysteine) <400> 26 Xaa Cys Gly Pro Ser Xaa 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide motif_27 <400> 27 Trp Cys Gly Pro Ser Lys 1 5

Claims (54)

1. 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법으로서, 상기 환자의 상기 점액 또는 가래를, 접촉시키기 전과 비교하여 상기 점액 또는 가래의 점도를 감소시키기에 효과적인 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 환자는 점액 또는 가래의 비정상적이거나 과도한 점도 또는 점착성이 질환의 증상이거나 원인인 폐 질환을 가지는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 환자는 점액 또는 가래의 비정상적이거나 과도한 점도 또는 점착성이 생물학적 환원제 활성의 결핍과 관련된 폐 질환을 가지는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 환자는 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 기관지 확장증, 천식 및 소화관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 가지는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 환자는 낭포성 섬유증을 가지는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 소화관 질환은 콕시디아증(coccidiosis)인, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 환자의 상기 점액 또는 가래를 상기 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 조성물을 비강, 기관 내, 기관지, 폐 안으로의 직접 설치, 흡입 및 구강으로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 상기 환자에게 도입시킴으로써 수행되는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
8. 제1항에 있어서, 접촉시킬 상기 점액 또는 가래는 상기 환자의 호흡관, 소화관 또는 생식관에 위치하는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 중에서 상기 환자에게 투여되는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자의 상기 점액 또는 가래를 상기 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 조성물과의 접촉 전과 비교하여 상기 환자로부터의 점액 또는 가래의 샘플 중의 유리 티올의 백분율을 증가시키는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자의 상기 점액 또는 가래를 상기 조성물과 접촉시키는 단계 후에 상기 환자는 상기 접촉시키는 단계 전과 비교하여 적어도 약 2.5%의 강제 호기량(forced expiratory volume: FEV) 증가를 나타내는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되, C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기인, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 아미노산 서열 C-X-X-S(서열번호 24)를 포함하되, C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기인, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 점액 단백질의 시스테인 잔기에 공유 결합되는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 점액 단백질은 뮤신인, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 점액 단백질은 호흡기 점액 단백질 및 소화관 점액 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 원핵생물 티오레독신, 진균 티오레독신, 식물 티오레독신 및 포유류 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 티오레독신을 포함하는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
18. 제1항 내지 제9항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 인간 티오레독신을 포함하는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 단백질의 상기 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 환원시키기 위한 환원제를 더 포함하는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
20. 제19항에 있어서, 조성물은 티오레독신 환원효소를 더 포함하는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
21. 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 데 사용하기 위한 조성물로서, 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드 및 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래의 치료를 위한 적어도 하나의 추가 제제를 포함하는, 조성물.
22. 제21항에 있어서, 상기 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되, C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기인, 조성물.
23. 제21항에 있어서, 상기 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 아미노산 서열 C-X-X-S(서열번호 24)를 포함하되, C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기인, 조성물.
24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 원핵생물 티오레독신, 진균 티오레독신, 식물 티오레독신 및 포유류 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 티오레독신을 포함하는, 조성물.
25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 인간 티오레독신을 포함하는, 조성물.
26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 티오레독신 환원제를 더 포함하는, 조성물.
27. 제26항에 있어서, 상기 조성물은 티오레독신 환원효소를 더 포함하는, 조성물.
28. 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 경구 투여 또는 폐로의 에어로졸 투여를 위해 제형화되는, 약제학적 조성물.
29. 제28항에 있어서, 상기 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되, C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기인, 약제학적 조성물.
30. 제28항에 있어서, 상기 폐로의 에어로졸 투여는 네뷸라이저 장치에 의한, 약제학적 조성물.
31. 제30항에 있어서, 상기 네뷸라이저 장치는 진동-메쉬 네뷸라이저인, 약제학적 조성물.
32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 환원제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
33. 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물로서, 상기 모노시스테인 활성 부위 중의 시스테인은 점액 단백질의 시스테인 잔기에 공유 결합되는 조성물.
34. 제33항에 있어서, 상기 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되, C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기인, 조성물.
35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 점액 단백질은 호흡기 점액 단백질 및 소화관 점액 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
36. 제33항에 있어서, 상기 점액 단백질은 뮤신인, 조성물.
37. 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법으로서, 상기 환자의 상기 점액 또는 가래를 이황화 결합 환원제 및 시스테인 차단제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 이황화 결합 환원제 및 상기 시스테인 차단제는 동일한 분자인, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 분자는 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드인, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
40. 제37항에 있어서, 상기 이황화 결합 환원제 및 상기 시스테인 차단제는 상이한 분자인, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
41. 제37항에 있어서, 상기 이황화 결합 환원제는 다이티오트레이톨(DTT), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 글루타티온, 다이티오글리콜산, 2-머캅토에탄올, N-아세틸 시스테인 및 트리스-(2-카복시에틸)포스펜으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
42. 제37항에 있어서, 상기 시스테인 차단제는 요오도아세트아미드, 요오도아세트산 및 다른 알킬화제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는 방법.
43. 자에게 세포 흡수를 할 수 없는 티오레독신 활성 부위를 가지는 화합물을 포함하는 조성물을 투여함으로써, 과도하게 점성이거나 점착성인 점액을 가지는 상기 환자를 치료하는 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 화합물은, 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드; 티오레독신 부분과 세포 표면 수용체 리간드 부분을 포함하는 융합 단백질; 및 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 서열번호 12의 위치 35에 있는 시스테인에 해당하는 시스테인에 대한 차단 화합물의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
45. 폐, 경구 및 국소 전달로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 전달 후에, 표적 부위에 대해서 공유 결합을 형성하는 약물을 투여함으로써 환자에서의 약물 물질에 대한 전신성 노출을 방지하는 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 약물 물질은 티올-함유 약물 물질인, 방법.
47. 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하고, 그리고 산화환원-활성 티올기를 안정화시킬 수 있는 적어도 하나의 당 또는 당 유도체를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
48. 제47항에 있어서, 상기 당 또는 당 유도체는 수크로스, 수크랄로스, 락토스, 트레할로스, 말토스, 갈락토스, 라피노스, 만노스 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
49. 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 동물 사료 조성물.
50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 포유류 및 조류(bird)로 이루어진 군으로부터 선택된 척추동물인, 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 환자는 인간인, 방법.
52. 제50항에 있어서, 상기 환자는 닭 또는 칠면조인, 방법.
53. 과도하게 점성이거나 점착성인 점액 또는 가래를 가지는 환자의 점액 또는 가래의 점도를 감소시키기 위한 환원된 상태의 티오레독신 모노시스테인 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 환자의 상기 점액 또는 가래를 상기 조성물과 접촉시키는 것은 해당 접촉시키기 전과 비교하여 상기 점액 또는 가래의 점도를 감소시키는, 조성물의 용도.
54. 제54항에 있어서, 상기 티오레독신 모노시스테인 활성 부위는 C-X-X-S(서열번호 24), C-X-X-X(서열번호 17), X-C-X-X-X-X(서열번호 19), X-C-G-P-X-X(서열번호 21), W-C-G-P-X-K(서열번호 23), X-C-X-X-S-X(서열번호 25), X-C-G-P-S-X(서열번호 26) 및 W-C-G-P-S-K(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되, C 잔기는 환원된 상태로 존재하고, X 잔기는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기인, 조성물의 용도.
    

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