CN105188738A - 用于粘液粘稠度标准化的产品和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于降低过度或异常粘稠或粘着的粘液或痰液的粘稠度和/或粘着性和/或增加其液化的组合物和方法。所述组合物包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽并且任选地还含有还原体系。

Description

用于粘液粘稠度标准化的产品和方法

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.119(e)要求了2013年3月15日提交的美国临时申请序号61/792,198的优先权。2013年3月15日提交的美国临时申请序号61/792,198的全部公开内容以引用的方式并入本文中。

序列表的引用

本申请含有通过EFS-Web以文本文件形式通过电子方式提交的序列表。所述文本文件命名为“7579-1-PCT_sequence_listing_ST25”，具有18KB字节大小，并且记录于2014年3月17日。所述文本文件中所含的信息依照37CFR§1.52(e)(5)以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明大体上涉及含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽用于降低粘液或痰液的粘稠度以及诱导、增强和/或增加其液化的用途。

背景技术

对于用于治疗具有囊肿性纤维化(CF)、COPD/肺气肿、支气管扩张、重度哮喘和其他严重的阻塞性肺病的患者的安全、良好耐受和有效的药物存在巨大的未满足的医疗需求。这些疾病的特征在于增稠粘液的过度产生，从而导致肺功能受损(评论于Evans,C.M.和Koo,J.S.,《药理学和治疗学》(Pharmacology&Therapeutics)121:332-348,2009中)。异常、粘性粘液的清除不良与慢性感染和过早死亡相关，尤其是在CF中。尽管在抗生素疗法和其它治疗中存在进展，但改进的粘液清除仍然是重要的临床治疗目标，即使我们对粘液输送能力潜在机制的理解仍然有限(Verdugo,P.,《冷泉港实验室医学展望》(ColdSpringHarbPerspectMed)2012；2:a009597)。

粘液是连续分泌的超分子聚合物凝胶，其在上皮表面上形成保护屏障并且通过纤毛作用和咳嗽负责运送吸入的碎片和细菌离开肺部(Knowles,M.R.和Boucher,R.C.,《临床研究杂志》(JClinInvest)109:571-577,2002；Cone,R.A.,《先进药物递送评论》(AdvDrugDelivRev)61:75-85,2009)。因此能够有效实现粘液纤毛运输的适当粘弹性和粘液层水合对于粘液功能和预防感染和炎症是至关重要的。正常的粘液主要由水(97％)组成，其余固体包含粘蛋白蛋白质、非粘蛋白蛋白质、盐、脂质和细胞碎片(Fahy,J.V.和Dickey,B.F.,《新英格兰医学杂志》(NEnglJMed)363:2233-47,2010)。聚合物粘蛋白糖蛋白MUC5AC和MUC5B主要负责呼吸道粘液凝胶的粘弹性(Matsui等,《细胞》(Cell)95:1005-1015,1998；评论于Kreda等,《冷泉港实验室医学展望》(ColdSpringHarbPerspectMed)2012；2:a009589)。连接至粘蛋白的O-连接聚糖羟基促进水结合，而所述粘蛋白自身形成缠结网络(Verdugo等,《生物流变学》(Biorheology)20:223-230,1983)，这可能涉及共价和非共价链间交联，如根据消化道粘蛋白MUC2的详细研究所表明(Ambort等,《生物化学杂志》(BiochemJ)436:61-70,2011)。粘蛋白不同寻常地富含Cys氨基酸，其中人类MUC5AC在总共5030个氨基酸中含有显著的295个Cys残基(www.uniprot.org/uniprot/P98088)。位于N端和C端附近的粘蛋白Cys残基被认为是涉及形成粘蛋白亚基之间的链间二硫键，而内部Cys残基的作用尚不清楚(Thornton等,《年度生理学评论》(AnnuRevPhysiol)70:459-486,2008)。一些位于‘Cys结’区域中并且可能容易形成分子内二硫键，其在促进对粘液凝胶网状结构重要的非共价缠结中可发挥作用(Fahy,J.V.和Dickey,B.F.,《新英格兰医学杂志》(NEnglJMed)363:2233-47,2010)。

最近的研究(Button等,《科学》(Science)337:937-941,2012)已基于如下研究结果产生粘膜表面结构的新模型：某些粘蛋白一度被认为是膜结合在上皮细胞上，但实际上是栓系至纤毛自身上的膜。这种模型的意义在于，移动粘液层覆盖更密集的纤周层，描述为“刷上凝胶(gel-on-brush)”。所述模型优雅地解释了液体如何在两个层之间移动，其中粘液充当储集层，并且关于理解粘液渗透模量在确定粘液纤毛运输功能性和粘液层水合中的作用建立了新的范例。所述模型还提供了关于理解粘液蛋白质骨架中的过量二硫键可如何造成粘液层渗透模量增加的框架，这反过来又将下面的纤毛层脱水并严重地限制了正常的粘液运输。这样的情形可能会巩固CF的疾病机制的实质部分。

CF是常染色体隐性遗传病。CF的症状由囊肿性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR，CysticFibrosisTransmembraneConductanceRegulator)的缺陷产生，CFTR是一种单价负电荷离子的关键上皮膜转运体，所述离子主要是氯离子(Riordan等,《科学》(Science)245:1066-1073)，但也可能是碳酸氢根和谷胱甘肽。导致CF的突变，其中超过1700种是已知的(www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)，所述突变包括造成CFTR完全损失的那些(最常见CF基因型的情况)以及导致阴离子转运活性部分或完全损失的点突变。另外，由于CFTR的缺陷，体内的上皮细胞对于氯离子转运是不透的(Boucher等,《肺》(Lung)161:1-17,1983；Welsh,《生理学评论》(PhysiolRev)67:11443-1184,1987)。虽然若干器官都受到影响，包括胰腺、肠和男性生殖道，但肺内的并发症占发病率和死亡率的95％(Means,M.CysticFibrosis:thefirst50years.CysticFibrosis-CurrentTopics第1卷,由DodgeJA,BrockDJH和WiddicombeJH.Chichester编辑:WileyandSons,1992,第217-250页)。在因疾病受损的肺中，氯离子转运到气道管腔中导致Na⁺和流体的过多吸收，从而降低气道表面液体的体积(Jiang等,《科学》(Science)262:424-427,1993)。然而，恢复氯离子通道活性以补偿由非功能CFTR造成的作用(例如经由嘌呤能受体的P2Y₂亚型的激动剂)的尝试失败了(Ratjen,F.等,《囊肿性纤维化杂志》(JCystFibros)11:539-49,2012)。这表明CFTR的非氯离子作用可能比原来所想的更显著。

在氧化环境如肺中，容易在相邻的氧化Cys残基如以大丰度存在于粘蛋白蛋白质上的那些之间形成二硫键。这些键高度稳定，并且破坏(即减少)它们以将Cys残基恢复成其游离硫醇形式需要有效的化学或生物还原剂的作用。在健康的肺中，过量二硫键形成主要受到生物还原剂谷胱甘肽(GSH)的还原形式阻碍，所述还原形式是大量分泌到粘液层的含Cys三肽(Cantin等,《应用生理学杂志》(JApplPhysiol)63:152-157,1987)，并且在粘蛋白中维持正常二硫键与游离Cys硫醇平衡中可发挥关键作用。GSH在气道表面上的分泌高度取决于CFTR，这直接和间接地促进GSH输出(评论于Ballatori等,《生物化学》(BiolChem)390:191-214,2009中)。因此，CF患者中的肺GSH水平可能是正常个体中存在水平的30％或更少(Roum等,《应用生理学杂志》(JApplPhysiol)75:2419-24,2003；WetmoreD.R.等,《生物化学杂志》(JBiolChem)285:30516-22,2010)。CFTR也负责分泌碳酸氢根阴离子，并且所产生的CF肺中的碳酸氢根缺乏似乎促进疾病。碳酸氢根的主要化学作用是提高pH。因为二硫键被含硫醇还原剂还原需要形成攻击性去质子化硫醇盐，这在有利于质子化硫醇形式的低pH下受到抑制(Singh和Whitesides,Sulphur-containingFunctionalGroups,5:第633-58页,JohnWiley&Sons,1993)，所以碳酸氢根与GSH的活性之间的协同作用(以及已知存在于气道表面环境中的其他生物还原剂)是可能的。CF气管支气管分泌物中所测量的pH相比于非患病情形低最多0.6单位(Song等,《美国生理学杂志-细胞生理学》(AmJPhysiolCellPhysiol)290:C741-C749)，这与CF肺中的环境一致，其中还原剂以有限供应存在以及由于形成二硫键攻击硫醇盐的能力受损而活性较小。与粘蛋白中存在的巨大数目的丛集Cys综合考虑，如果分泌的还原剂水平变得有限，或如果过量产生和分泌粘蛋白蛋白质从而导致可二硫键键合的Cys过多，则氧化性呼吸环境中的粘液因此平衡在更高二硫键键合状态中。已知在CF和某些其他阻塞性肺病中出现这两种情形：回应于肺应力而过度产生粘液蛋白质(Rogers,《呼吸道护理》(RespCare)52:1134-1149)，并且由于CFTR不足而可能阻断70％或更多的GSH分泌(Roum等,《应用生理学杂志》(JApplPhysiol)75:2419-24,2003；WetmoreD.R.等,《生物化学杂志》(JBiolChem)285:30516-22,2010)。

这种过量粘液二硫键键合的可能性以及在CF中发挥机械作用的一般氧化还原失衡已导致关于各种含硫醇剂作为粘液溶解药物的临床评估。这些包括N-乙酰基半胱氨酸(NAC)和Nacystelyn(NAL；N-乙酰基半胱氨酸+L-赖氨酸)(Hurst等,《美国呼吸疾病评论》(AmRevRespirDis),96:962-970,1967；Dasgupta和King,《儿科肺病学》(PediatrPulmonol),22:161-166,1996；Nash,E.F.等,《Cochrane系统评价数据库》(CochraneDatabaseofSystematicReviews),2010(12):1-49,2009)以及其还原谷胱甘肽(Bishop,C.等,《胸科杂志》(CHESTJournal),127(1):308-317,2005；Griese,M.等,《美国呼吸与危重症监护医学杂志》(AmJRespCritCareMed)169(7):822-828,2004；Griese,M.等,《美国呼吸与危重症监护医学杂志》(AmJRespCritCareMed)188(1):83-89,2013；Roum,J.H.等,《应用生理学杂志》(JApplPhysiol),87:438-443,1999)。虽然在很大程度上是安全的，但迄今为止这些小分子药剂在口服或吸入形式中尚未展现明显的临床益处(评论于Nash,E.F.等,《Cochrane系统评价数据库》(CochraneDatabaseofSystematicReviews),2010(12):1-49,2009中)。这种功效缺乏在很大程度上可能是由于在递送期间由于自氧化作用而导致的低效能或活性损失，以及通过肺部酶灭活的可能性。GSH经受快速自氧化变成非活性GSSG形式(Curello,S.等,《临床化学》(ClinChem),33:1448-49,1987)并且因此当被气雾化和吸入时在还原形式中在药理学上不稳定(CarlWhiteM.D.,perscomm.)，从而直到到达气道中的目标位点时失去其活性的大部分。另外，在肺部空间中以高浓度存在的γ-谷氨酰基转移酶容易将GSH降解成非活性形式(Corti等,《美国呼吸与危重症监护医学杂志》(AmJRespCritCareMed)189:233-234,2014)，在GSH吸入后其丰度显著增加(Griese等,《美国呼吸与危重症监护医学杂志》(AmJRespCritCareMed)188:83-89补充信息,2013)。通过组合二硫键靶向与优异的药理学和生物药物特异性来改进硫醇剂因此是关键的未满足的治疗目标。

虽然CF肺病的病因可能归因于粘液的改变的流变学特性，但在出生时肺功能受损非常不明显。相反，支气管扩张和气道阻塞随着患者年龄增长而进展。这种慢性肺损伤由持续周期的细菌感染和炎症反应而产生。当嗜中性粒细胞募集到肺中时产生的气道损伤释放基质降解酶如弹性蛋白酶，和有害的活性氧物质(评论于Konstan和Berger,《儿科肺病学》(PediatrPulmonol)24:137-142,1997中)。在持续性感染后，也可能发生粘蛋白与从死亡的炎性细胞中释放的DNA(Potter等,《美国儿童疾病杂志》(AmJDisChild)100:493-495,1960；Lethem等,《美国呼吸疾病评论》(AmRevRespirDis)100:493-495,1990；Lethem等,《欧洲呼吸杂志》(EurRespirJ)3:19-23,1990)和f-肌动蛋白聚合物(Sheils等,《美国病理学杂志》(AmJPath)148:919-927,1996；Tomkiewicz等,DNAandactinfilamentultrastructureincysticfibrosissputum.纤毛、粘液和粘液纤毛相互作用(Cilia,mucus,andmucociliaryinteractions),由BaumGL,PrielZ,RothY,LironN和OstfeldEJ编辑.NewYork,NY:MarcelDekker,1998)的相互作用，并且可能造成严重疾病中的CF痰液的一些稠密和粘稠性。通过咳嗽或粘液纤毛清除无法清除这种粘液，这促进肺部被机会病原体进一步定殖，气道重塑，并最终死亡。

被设计成直接减轻CFTR缺陷后果的干预因此是特别理想的，因为它们可预防或减轻疾病进展。虽然尚未达到通过基因疗法对CF进行直接校正，但最近已证实使用增强剂和校正剂疗法来恢复缺陷性蛋白质的一定程度的CFTR功能(Sloane,PA和Rowe,SM,《肺医学新见》(CurrentOpinioninPulmonaryMedicine)16:591-7,2010)。这种疗法局限于具有特定CFTR缺陷的小百分比的CF患者，如被依伐卡托/Kalydeco^TM靶向的G551D突变(Jones,AM和Helm,JM,《药物》(Drugs)69:1903-10,2009)。然而，在这些少数个体中已经观察到戏剧性的结果(Accurso,FJ；Rowe,SM；Clancy,JP；Boyle,MP；Dunitz,JM；Durie,PR；Sagel,SD；Hornick,DB等,《新英格兰医学杂志》(TheNewEnglandJournalofMedicine)363:1991-2003,2010)，这表明CF中的机械干预能够减轻晚期后果，如由慢性感染和炎症所造成的那些。然而，目前，包括抗生素方案与促进化脓性气道分泌物清除的药物结合的症状性而非疾病改善方法仍是用于进行性气道疾病的主力疗法。消化CF气道中存在的胞外DNA的纯化rhDNA酶(Pulmozyme^TM；Genentech,USA)的吸入被广泛用作呼吸道减充血剂。这样的治疗在临床上可有效用于减小痰液粘稠度和稳定化用力呼气量(forcedexpiratoryvolume，FEV)(Fuchs等,《新英格兰医学杂志》(NEnglJMed)331:637-642,1994)。旨在分解粘蛋白或肌动蛋白聚合物包括N-乙酰基半胱氨酸(NAC)、nacystelyn(N-乙酰基-L-半胱氨酸衍生物)和凝溶胶蛋白的其他研究疗法也可在实验上降低痰液粘稠度，但还没有证实临床功效和在美国获得批准用于治疗CF(Nash,EF等,《Cochrane系统评价数据库》(CochraneDatabaseofSystematicReviews),2010(1):CD007168,2009)。

被利用来改善粘液清除的其他方法包括粘液活性剂如吸入型高渗盐水和吸入型高剂量甘露糖醇(Fahy,J.V.和Dickey,B.F.,《新英格兰医学杂志》(NEnglJMed)363:2233-47,2010)。这些药剂被认为是通过以渗透方式将水拉入粘液层中来起作用以增加水合，或者通过诱导咳嗽反射来改善清除。关于两种机制存在一些证据(Levin,M.H.等,《生物化学杂志》(JBiolChem)281:25803-12,2006；Boucher,R.C.,《分子医学趋势》(TrendsMolMed)13:231-240,2007)。然而，粘液活性剂是对症治疗(而不是疾病改善性)，并且功效通常只是温和的，因为许多患者不能耐受可具有最大临床作用的高剂量(Aziz,I.和Kastelik,J.A.,《新英格兰医学杂志》(NEnglJMed)354:1848-1851,2006)。

White和同事的研究结果(Rancourt等,《美国生理学杂志：肺细胞和分子生理学》(AmJPhysiolLungCellMolPhysiol)286:L931-L938,2004；Rancourt等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicalBiol&Med)42:1441-43,2007)已发现，使用含有呈还原状态的硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽可用于增加具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者(包括具有CF的患者)中的粘液或痰液的液化，其中使所述粘液或痰液与所述蛋白质或肽接触(美国专利No.7,195,766和美国专利No.7,534,438，其两者以全文引用的方式并入本文中)。在这种体系中(参见图3)，硫氧还蛋白活性位点的N端半胱氨酸与目标蛋白质(存在于粘液或痰液中)的半胱氨酸之间形成短暂的混合二硫键，接着立即对分子内混合二硫键进行亲核攻击并释放氧化的硫氧还蛋白和完全还原的靶标(Wynn等,《生物化学》(Biochemistry)34(37):11807-11813,1995)，因此允许粘液或痰液中再形成半胱氨酸二硫键，但同时也允许还原或氧化的硫氧还蛋白自由接近以进入细胞并诱导不希望的脱靶活性，接着由内源性硫氧还蛋白还原酶-NADPH体系进行再还原。另外，White和同事已经证实在体外和离体动物植入研究中还原的硫氧还蛋白减轻人类CF粘液的异常粘弹性(Rancourt等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicalBiol&Med)42:1441-43,2007)，以及通过活性位点二硫键的破坏来抑制促炎性嗜中性弹性蛋白酶的活性(Lee等,《美国生理学杂志：肺细胞和分子生理学》(AmJPhysiolLungCellMolPhysiol)289:L875-L882,2005)。相比于GSH和硫醇剂如NAC，硫氧还蛋白是一种更有效的二硫键还原分子并且不太容易通过自氧化失活。总之，这为利用药理学稳定的分子来恢复粘液的正常二硫键还原状态创造了机会。这种疗法可能会阻止或延迟慢性感染、炎症和导致CF患者过早死亡的肺功能下降的级联。然而，也存在强烈的动机来避免硫氧还蛋白的潜在促炎和其他细胞内调节作用(Arner,E.S.和A.Holmgren,《欧洲生物化学杂志》(EurJBiochem)267:6102-6109,2000；Rancourt等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicalBiol&Med)42:1441-43,2007)以及通过防止粘蛋白Cys再氧化来增加粘液粘稠度调节的效能。这些改进是本发明的主题。

发明内容

本发明的一个实施方案涉及一种在具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者中降低粘液或痰液的粘稠度的方法。所述方法包括以下步骤：使所述患者的粘液或痰液与包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的组合物接触，所述蛋白质或肽可相比于所述接触步骤之前有效地降低所述粘液或痰液的粘稠度。在这个实施方案的一个方面，所述患者具有肺病，其中粘液或痰液的异常或过度的粘稠度或粘着性是所述疾病的症状或原因。在一个方面，所述患者具有选自囊肿性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺病、支气管扩张和哮喘的肺病。在一个优选方面，所述患者具有CF。在这个实施方案的另一个方面，所述患者具有肺病，其中粘液或痰液的异常或过度的粘稠度或粘着性与生物还原剂活性缺乏相关。在这个实施方案的另一个方面，所述患者具有与增稠或异常的粘液相关的消化道疾病，包括(但不限于)球虫病。

在一个方面，通过利用选自经鼻、气管内、支气管、直接安装到肺部、吸入和口服的途径将组合物引入到患者来进行使患者的粘液或痰液与组合物接触的步骤。在一个方面，待接触的粘液或痰液位于患者的呼吸道、消化道(即胃肠道)或生殖道中。

在另一个方面，将组合物于药学上可接受的载体中施用至患者。

在任何前述方面，使患者的粘液或痰液与组合物接触的步骤相比于与组合物接触之前增加了来自患者的粘液或痰液样品中的游离硫醇的百分比。

在任何前述方面，在使患者的粘液或痰液与组合物接触的步骤之后，相比于接触步骤之前，所述患者具有至少约2.5％的用力呼气量(FEV)增加。

在任何前述方面，所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)或W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。在一个优选方面，硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含如上所述的氨基酸序列C-X-X-S(SEQIDNO:24)。

在任何上述方面，具有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质包含选自原核硫氧还蛋白、真菌硫氧还蛋白、植物硫氧还蛋白和哺乳动物硫氧还蛋白的硫氧还蛋白。在一个优选方面，所述蛋白质包含人类硫氧还蛋白。

在本发明的任何上述方面，所述组合物还包含用于还原蛋白质的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的还原剂。在另一个方面，所述组合物包含硫氧还蛋白还原酶和NADH或NADPH。

本发明的另一个实施方案涉及用于降低粘液或痰液的粘稠度的组合物，所述组合物包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽和至少一种用于治疗过度粘稠或粘着的粘液或痰液的额外药剂。在这个实施方案的一个方面，所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)或W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。在一个优选方面，所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含如上所述的氨基酸序列C-X-X-S(SEQIDNO:24)。在这个实施方案的任何前述方面，具有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质包含选自原核硫氧还蛋白、真菌硫氧还蛋白、植物硫氧还蛋白和哺乳动物硫氧还蛋白的硫氧还蛋白。在一个方面，所述蛋白质包含人类硫氧还蛋白。

此外，在这个实施方案的任一个前述方面，所述组合物包含还原剂。在另一个方面，所述组合物还包含硫氧还蛋白还原酶和NADH或NADPH。

本发明的另一个实施方案涉及一种药物组合物，其包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。在一个方面，所述组合物被配制用于以气雾剂形式施用至肺部。在另一个方面，所述组合物被配制用于口服施用。在这个实施方案的任何前述方面，所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。在另一个方面，所述药物组合物被配制用于通过喷雾器装置以气雾剂形式施用至肺部。在一个方面，所述喷雾器装置是振动筛喷雾器。在另一个方面，所述药物组合物还包含还原剂。在本发明的任何前述方面，所述药物组合物还包含硫氧还蛋白还原酶和NADH或NADPH。

本发明的另一个实施方案涉及一种包含含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的组合物，其中所述单半胱氨酸活性位点中的半胱氨酸共价结合至粘液蛋白质中的半胱氨酸残基。在一个方面，所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。在任一种上述方面，所述粘液蛋白质是呼吸道粘液蛋白质或消化道粘液蛋白质。在另一个方面，所述粘液蛋白质是粘蛋白。

本发明的另一个实施方案涉及一种在具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者中降低粘液或痰液的粘稠度的方法。所述方法包括使所述患者的粘液或痰液与包含二硫键还原剂和半胱氨酸阻断剂的组合物接触的步骤。在一个方面，所述二硫键还原剂和半胱氨酸阻断剂是相同的分子。在另一个方面，所述相同的分子是含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。在另一个方面，所述二硫键还原剂和所述半胱氨酸阻断剂是不同的分子。在另一个方面，所述二硫键还原剂可能是二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、谷胱甘肽、二硫代乙醇酸、2-巯基乙醇、N-乙酰基半胱氨酸或三-(2-羧乙基)磷杂环戊二烯。在另一个方面，所述半胱氨酸阻断剂可以是碘乙酰胺、碘乙酸或其他烷基化剂。

本发明的另一个实施方案涉及一种治疗具有过度粘稠或粘着的粘液的患者的方法。所述方法包括向所述患者施用一种组合物的步骤，所述组合物包含不能细胞摄取的具有硫氧还蛋白活性位点的化合物。在一个方面，所述化合物可以是包含硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽、包含硫氧还蛋白部分和细胞表面受体配体部分的融合蛋白，或包含硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽与用于对应于SEQIDNO:12的第35位半胱氨酸的半胱氨酸的阻断化合物的组合。

本发明的另一个实施方案涉及一种预防患者中对药物物质的全身暴露的方法。所述方法包括以下步骤：通过包括但不限于经肺、口服或局部递送途径的递送途径将所述药物施用至所述患者。在另一个方面，所述药物一旦施用就与其靶位点形成共价键。在另一个方面，所述药物物质是含硫醇药物并且可以是例如含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。在另一个方面，所述药物物质是抗生素或抗感染剂并且通过连接子融合或连接至呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。在另一个方面，所述药物物质是抗炎剂并且通过连接子融合或连接至呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。在另一个方面，所述药物物质是核酸水解剂并且通过连接子融合或连接至呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。在另一个方面，所述药物物质是化学治疗剂并且通过连接子融合或连接至呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。

本发明的另一个实施方案涉及一种药物组合物，其包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽并且还包含能够稳定化所还原的氧化还原活性硫醇基团的至少一种糖或糖衍生物。在一个方面，所述糖或糖衍生物可以是蔗糖、三氯蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖、甘露糖或甘露糖醇。在一个方面，所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。

本发明的另一个实施方案涉及一种动物饲料组合物，其包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。在一个方面，所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。

在本发明的任何实施方案的一个方面，所述患者是脊椎动物，包括(但不限于)哺乳动物和鸟类。在另一个方面，所述患者是人类。在另一个方面，所述患者是鸡或火鸡。

本发明的另一个实施方案涉及一种包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的组合物在具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者中降低粘液或痰液的粘稠度的用途，其中相比于所述接触步骤之前，使所述患者的粘液或痰液与所述组合物接触降低了所述粘液或痰液的粘稠度。在一个方面，所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。

附图说明

图1a-1b示出含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽(称为r(Cys)hTrx)相比于含有野生型硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽(称为WTrhTrx)的酶活性。图1a示出非特异性5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB或Ellman试剂)还原反映了硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点相对于野生型中的可还原半胱氨酸的损失。图1b示出含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽(r(Cys)hTrx)相对于含有野生型硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽(WTrhTrx)在人类痰液压缩测定法中在12.5μM、25μM和50μM的浓度量下具有类似或更大的效能。

图2示出野生型rhTrx、r(Cys)hTrx和各种对照包括两种浓度(0.58mM和1.5mM)的二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰基半胱氨酸(NAC)和等摩尔浓度的重组人类DNA酶(rhDNase)在痰液压缩测定法中对于患者痰液样品(每次治疗n＝6)的标准化的影响。

图3示出用在SEQIDNO:12的第35位具有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽形成二硫键的机制。天然Trx二硫键还原的机制涉及两步反应。如图3中所示，步骤I和II示出Trx活性位点的N端Cys(位于人类TRX-1氨基酸序列中的第32位)与目标蛋白质二硫键的一个Cys之间形成短暂的混合二硫键，接着进行步骤III。步骤III示出位于人类TRX-1氨基酸序列中的第35位的Trx活性位点的C端Cys对分子间混合二硫键的亲核攻击。这种二次还原拆分了混合二硫键并释放出氧化Trx和完全还原的靶标。通过使Trx的第35位C端活性位点Cys残基突变为非半胱氨酸氨基酸如丝氨酸残基(单半胱氨酸变体)，或以其他方式修改蛋白质序列例如以干扰被第35位C端活性位点Cys亲核攻击，硫氧还蛋白仍能够充当还原剂，但不同于野生型酶，这种单半胱氨酸活性位点变体仍经由未拆分的分子间混合二硫键共价连接至还原的目标蛋白质。

具体实施方式

本发明大体上涉及含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽诱导、增强和/或增加粘液或痰液的液化的用途。更具体地，本发明人已发现，具有单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽降低痰液或粘液的粘稠度和/或粘着性并且因此是用于增强或增加痰液或粘液的液化的有效剂。因此，含有呈还原状态的单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽，或编码这些蛋白质的核酸分子，可以单独地或以组合物形式使用以治疗与不希望的粘液或粘滞和粘稠的痰液相关的多种病状或疾病。例如，呼吸道疾病如囊肿性纤维化、慢性阻塞性肺病、支气管扩张和哮喘特别适于使用本发明的产品和方法进行治疗。此外，与增稠或粘着的粘液相关的消化道疾病如球虫病也特别适于使用本发明的产品和方法进行治疗。因此，本发明涉及含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质用于降低粘液或痰液、特别是异常或过度粘稠和/或粘着的粘液或痰液的粘稠度的用途。将所述蛋白质以可有效减低粘液或痰液的粘稠度并且优选地向患者提供治疗益处的方式和量施用至遭受这种异常或过多的粘液或痰液或者受这种异常或过多的粘液或痰液影响的患者。

对于用于治疗病状如囊肿性纤维化，硫氧还蛋白和含有野生型(或天然)硫氧还蛋白活性位点(在本文也称为“rhTxr”)或含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点(在本文也称为“r(Cys)hTrx”)的蛋白质具有优于其他还原剂的优势。例如，不同于其他还原剂如N-乙酰基半胱氨酸(NAC)、Nacystelyn(NAL)、二硫苏糖醇(DTT)或还原型谷胱甘肽(GSH)，硫氧还蛋白不太易于通过酶促或自氧化机制失活，包括产生超氧化物、过氧化氢、羟基基团和其他毒性氧代谢物的反应。此外，天然或野生型硫氧还蛋白是一种天然存在的化合物，其通常是细胞外分泌到气道表面上，并且因此，将硫氧还蛋白引入气道应该是无刺激性的并且不可能诱导免疫应答。硫氧还蛋白也没有被糖基化，因而，它更容易制造，并且以天然或重组形式施用蛋白质不应诱导先天免疫应答。或许更显著地，还原的硫氧还蛋白相比于其他还原剂更迅速和有效地将所处理的粘液或痰液恢复至正常粘稠度水平，并且这种标准化持续较长时期。NAC、NAL、DTT和GSH例如随时间推移变得“被消耗”或被氧化，并且在这个阶段，标准化痰液或粘液可以恢复到异常粘稠度状态。相比之下，由硫氧还蛋白产生的粘稠度下降似乎持续更长时间，这很可能是由于它通过其还原体系进行的循环再还原。此外，通过保持共价结合至粘蛋白Cys残基r(Cys)hTrx，相对于天然rhTrx，产生更有效和更长持续时间的粘稠度降低。最后，硫氧还蛋白相比于其他还原剂对于二硫键还原更有效和更具特异性，并且因此，它可以相比于其他试剂以显著更低剂量使用以实现有益作用。

除了上述优点之外，硫氧还蛋白具有其他益处，这增加了其在疾病状况中的有效性。例如，已知硫氧还蛋白诱导MnSOD(例如参见White等的美国专利No.5,985,261，其以全文引用的方式并入本文中)，这被预测为降低某些细菌毒素(包括(但不限于)来自革兰氏阴性细菌的细菌细胞壁的内毒素、来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的绿脓素等)在疾病痰液(例如，囊肿性纤维化痰液)中的毒性。另外，硫氧还蛋白具有胞外抗炎特性(Lee,R.L.等,《美国生理学杂志：肺细胞和分子生理学》(AmJPhysiolLungCellMolPhysiol),289(5):L875-82,2005)，其可以增强呼吸道病状的整体治疗。

硫氧还蛋白(Trx)是一种蛋白质二硫键还原酶，其催化众多的硫醇依赖性细胞还原性过程。天然的硫氧还蛋白含有在不同物种之间高度保守的两种氧化还原活性半胱氨酸。在其氧化形式中，这些半胱氨酸形成从蛋白质的三维结构突出的二硫桥(Holmgren,《生物化学年评》(AnnuRevBiochem)54:237-271,1985)。这种活性中心被NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶(TR)还原，允许Trx充当具有二硫醇/二硫键交换能力的电子载体(Oblong等,《生物化学》(Biochemistry)32:7271-7277,1993)。蛋白质二硫键是Trx介导的还原作用的优选受质。TrxC端活性位点半胱氨酸的修饰产生单半胱氨酸活性位点，其如下文所讨论，相比于具有天然或野生型活性位点的Trx具有巨大优势。囊肿性纤维化疾病中的气道分泌物的持久性和粘稠性导致气道阻塞、机会性感染和肺功能恶化。认识到呼吸道粘蛋白含有多个半胱氨酸结构域，其被认为在聚合中起重要作用(Bell等,《生物化学杂志》(BiochemJ)357:203-209,2001；Asker等,《生物化学杂志》(BiochemJ)333:381-387,1998)以及经由众多分子内二硫键增加了粘蛋白的缠结，本发明人寻求确定含有单半胱氨酸活性位点的Trx是否可通过还原粘蛋白二硫键来充当有效的粘液粘稠度调节剂。

含有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白相对于含有天然或野生型活性位点的硫氧还蛋白存在若干优点和益处。单半胱氨酸修饰被设计以最小化与细胞内信号传导或全身暴露相关的硫氧还蛋白的潜在副作用，例如由Rancourt等(《自由基生物学和医学》(FreeRadicalBiol&Med)42:1441-43,2007)所述的那些。这种修饰防止对于通过N端硫氧还蛋白活性位点半胱氨酸(例如位于人类硫氧还蛋白的第32位，SEQIDNO:14)催化的在硫氧还蛋白与目标蛋白质二硫键之间形成的混合二硫键的亲核攻击。令人惊讶地，本发明人已确定含有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白相比于野生型硫氧还蛋白在降低(趋向于液化)和标准化患病人类粘液的粘稠度方面具有更大效能。即使含有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白在逻辑上将预期由于活性位点半胱氨酸损失造成的总扰动而具有较小还原电位，并且因此在N端硫氧还蛋白活性位点半胱氨酸处的初始催化反应后，共价结合至粘液蛋白质(例如严重二硫键合的粘蛋白MUC5AC和MUC5B)并且将不能被还原和进行重复催化，本发明人已发现，含有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白相比于野生型硫氧还蛋白不仅未显示受损的活性，而且它在流变学测定法中表现出更大的定量能力来降低人类CF粘液粘稠度。基于这种出乎意料的结果，本发明人得出如下结论：含有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白的增强的效能应该是由于阻断粘蛋白中的半胱氨酸二硫键再形成的共价连接的硫氧还蛋白和粘液作用，因此提供粘蛋白低聚物凝胶结构和孔径的非常持久和长期的改变。同时，含有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白与其粘蛋白靶标的共价连接隔绝并因此防止所吸入硫氧还蛋白的细胞摄取和内化，这具有双重益处：防止由于细胞内不希望的硫氧还蛋白活性造成的脱靶效应，而同时促进粘液连接的消耗药物从身体中的清除。因为先前在现有技术中关于Cys修饰的单半胱氨酸硫氧还蛋白所设想的唯一治疗用途是在注射至全身循环之后经由内皮细胞中的脂筏来促进非还原形式的摄取(Hara等,《抗氧化剂与氧化还原信号》(AntioxRedoxSig)9:1427-37,2007；Kondo等,《抗氧化剂与氧化还原信号》(AntioxRedoxSig)9:1439-48,2007；美国专利申请20080119398、20090075871和20100184215)，并且因此偏离本发明的教导聚焦于防止全身暴露和细胞内摄取，关于呈还原形式的单半胱氨酸活性位点硫氧还蛋白的增强效能和安全性的细胞外机制是意料之外和非常新颖的。

粘液阻塞气道可能造成CF患者中的显著发病率和死亡率。本发明人已证实，有利于气道内这些分泌物的持久性的粘弹特性被含有单半胱氨酸活性位点的Trx显著减小。这个结论得到两行实验证据的支持。首先，压缩测定法结果指示，在用单半胱氨酸Trx温育期间从CF痰液的凝胶基质中释放出大量的液体。与这种释放同时发生的是固体物质体积减小，这表明构成痰液成分的凝胶正被溶解。在温育时期内在CF痰液样品中通常可大概观察到CF痰液粘稠度的这种标准化，并且因此，不是离心破坏的人工因素。单半胱氨酸Trx造成的液体释放预期具有重要的治疗意义，因为气道表面处的水量恢复可以恢复CF上皮的粘液纤毛运输能力(Jiang等,《科学》(Science)262:424-427,1993)，并且基于Button等(《科学》(Science),2012)刷上凝胶模型，过多粘稠度的减轻将允许下面的纤周层的水合并恢复粘液纤毛运输，其损失是CF的病理学的主要原因。其次，磁性微流变学测量提供直接的证据表明，痰液粘弹性下降是由于单半胱氨酸Trx造成的痰液组分减少。

CF痰液是表现出液体和固体特性的非牛顿流体。在低浓度下以溶液形式存在的聚合物能够自由旋转。当聚合物在使其旋转受阻的程度上变得浓缩或交联时，溶液已达到过渡相，称为逾渗阈值(Forgacs,《细胞科学杂志》(JCellSci)108:2131-2143,1995)。在逾渗阈值下，溶液开始获得固体特性，并且因为增加了更多的交联聚合物相互作用，弹性模量继续增加，直至样品中的每个长丝并入基质中。生物化学分析已经揭示出，由呼吸道内衬的细胞分泌的粘蛋白MUC5AC和MUC5B是形成气道粘液的聚合物组分的主要凝胶(Hovenberg等,《糖结合物杂志》(GlycoconjJ)13:839-847,1996；Thornton等,《生物化学杂志》(BiochemJ)316:967-975,1996；Thornton等,《生物化学杂志》(JBiolChem)272:9561-9566,1997)。这些粘蛋白上存在的半胱氨酸结构域促进聚合物形成，和可能地通过分子内二硫键形成与邻近粘蛋白链相互作用(Bell等,《生物化学杂志》(BiochemJ)357:203-209,2001；Asker等,《生物化学杂志》(BiochemJ)333:381-387,1998)，这可能是凝胶网缠结的促进因素。因为蛋白质上的二硫键是Trx酶活性的优选底物，所以粘蛋白聚合物是在痰液液化期间被Trx还原的靶标。这通过PAS染色得到支持，其揭示出高分子量糖型在Trx处理痰液中的溶解度变化。在Trx暴露痰液的液相中检测到更大浓度的糖蛋白通过更强烈的黄色进一步指示并且相比于从稀释剂处理样品获得的液相具有更大透明度。PAS可检测糖蛋白在Trx暴露痰液中的增强的电泳迁移率也表明，这些大分子的尺寸在酶促还原期间可能减小。来自这种电泳分析的研究结果与压缩测定法测量结果一致是通过如下证实：释放到液相中的糖蛋白与暴露于Trx期间的凝胶基质质量降低相一致，以及在Trx处理后在痰液中的游离硫醇标记增加的观察结果(Rancourt,R.等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicBiolMed),42(9):1441-1453,2007)。

一旦在CF患者中已经形成了炎症和感染的长期作用，在患病CF肺的气道内的嗜中性粒细胞溶解就导致胞外DNA沉积在气道分泌物中(Lethem等,《欧洲呼吸杂志》(EurRespirJ)3:19-23,1990)。通过非共价相互作用，这种DNA变得在粘蛋白糖蛋白内缠结，从而增加粘液凝胶粘弹性(Sachdev等,《胸科》(Chest)81:41S-43S,1982)。在Trx处理后，痰液中存在的DNA变得越来越可溶。一种合乎逻辑的解释是，Trx活性造成凝胶基质内的结构变化，其足以减轻DNA与受影响的大分子之间的缠结相互作用。不能确定的是这种增加的DNA溶解性对于在CF痰液暴露于Trx期间所观察到的粘弹性变化的相对贡献如何。然而，从临床观点来看，从痰液的不溶性凝胶相释放或除去DNA可使其在这种CF治疗期间更易于受DNA酶活性影响。另外，单半胱氨酸r(Cys)hTrx降低粘液粘稠度和防止粘蛋白半胱氨酸上二硫键的快速再形成的作用将用于产生更可渗透、可到达的粘液层以及去膨胀积聚的粘液栓塞。这些作用预期促进其他治疗剂进入深肺和肺上皮表面。因此，本发明的机械方法与现有的用于CF和其他阻塞性肺病的对症疗法如递送吸入型抗生素、粘液活性物质或粘液溶解DNA水解剂具有强烈的协同作用可能性。

含有单半胱氨酸活性位点的Trx相比于还原型谷胱甘肽具有更高的活性和更大的氧化稳定性并且在细胞外作用于气道粘液中并且不进入肺细胞。包含单半胱氨酸活性位点的Trx降低粘稠度，增加液体部分并减小痰液的粘弹性(例如在CF痰液中)。刺激液体释放并降低气道分泌物的粘稠度的粘液-还原体系的开发预期对于如下具有治疗潜力：疾病如CF，以及治疗可能与其他呼吸道病状(例如，慢性或急性支气管炎；支气管扩张；COPD/肺气肿；哮喘；急性气管炎；急性或慢性窦炎；由于气道的急性或慢性粘液堵塞产生的肺不张；细支气管炎)或与各种消化道病症(即胃肠道)如球虫病相关的过度或异常的粘液粘稠度和/或粘着性，或与过度或异常粘液粘稠度和/或粘着性相关或因其恶化的生殖道病症(例如，由于粘液稠化造成的急性、亚急性或慢性肠梗阻；由于重要的生殖结构阻塞造成的不孕不育)。因为含有呈还原状态的单半胱氨酸活性位点的Trx变得共价连接至粘蛋白，所以一旦它与粘蛋白二硫键反应，则这种作用机制也将促进消耗(氧化)药物以及粘液的清除，可防止或减轻细胞更新和硫氧还蛋白介导的氧化还原信号传导，并且可防止或减轻免疫细胞呈递。

因此，本发明的一个实施方案涉及一种在具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者中标准化和降低粘液或痰液的粘稠度的方法。所述方法包括以下步骤：使所述患者的粘液或痰液与包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的组合物接触。相比于所述接触步骤之前，所述蛋白质可有效降低所述粘液或痰液的粘稠度。

根据本发明，术语“粘液”一般是指由身体各种组织中的粘膜，包括由呼吸道、胃肠道和生殖道分泌的通常透明的粘稠流体。粘液湿润、润滑和保护分泌其的组织。它包含粘蛋白大分子(包括粘液蛋白质、核酸和碳水化合物)，其是粘液的凝胶形成成分。粘液蛋白质包括(但不限于)呼吸道粘液蛋白质和消化道粘液蛋白质。正常粘液的粘弹特性取决于粘蛋白聚合物的浓度、分子量和其间的缠结程度。术语“痰液”一般是指来自呼吸道的唾液和排出物(包括粘液)的混合物。痰液通常是唾液和粘液(和来自呼吸道组织的其他排出物)的咳出混合物。因此，粘液是痰液的主要组分，并且因而，过度粘稠粘液的存在产生本身过度粘稠的痰液。本发明涉及降低粘液或痰液的粘稠度。术语“液化”是指变得更具流动性的行为。因此，粘液或痰液的液化增加是指相比于更加固体或粘稠的相，粘液或痰液的液相或液态的增加。在与疾病相关的异常粘稠或过多粘液的情况下，目的是恢复粘液粘稠度的正常水平。因此，液化也可被视为粘液粘稠度降低。

应理解，通过具有生物还原剂与可氧化半胱氨酸的适当比率来实现正常的粘液功能。因此，生物还原剂活性不足因此是由过量的可氧化半胱氨酸或缺乏生物还原剂造成的。

身体中的粘液和痰液的一般功能需要所述粘液(和因此痰液的粘液组分)具有粘弹特性。在具有正常粘液和痰液的个体(即，健康个体，或更具体地，未遭受由粘液或痰液的粘稠度或粘着性造成或恶化的症状或病状的个体)中，所述粘弹性取决于粘蛋白聚合物的浓度、分子量和其间的缠结(Verdugo等,《生物流变学》(Biorheology)20:223-230,1983)。尤其是在CF中，当粘液中的粘蛋白与从死亡的炎性细胞中释放的DNA(Potter等,《美国儿童疾病杂志》(AmJDisChild)100:493-495,1960；Lethem等,《美国呼吸疾病评论》(AmRevRespirDis)100:493-495,1990；Lethem等,《欧洲呼吸杂志》(EurRespirJ)3:19-23,1990)和f-肌动蛋白聚合物(Sheils等,《美国病理学杂志》(AmJPath)148:919-927,1996；Tomkiewicz等,DNAandactinfilamentultrastructureincysticfibrosissputum，《纤毛、粘液和粘液纤毛相互作用》(Cilia,mucus,andmucociliaryinteractions)，由BaumGL,PrielZ,RothY,LironN和OstfeldEJ编辑.NewYork,NY:MarcelDekker,1998)相互作用时，粘液(和因此痰液)可以另外变得更稠密和粘稠。通过咳嗽或粘液纤毛清除无法清除异常、增稠的粘液，这促进肺部被机会病原体定殖。因此，异常或过度粘稠和/或粘着的粘液的特征在于粘液相比于来自正常或健康的患者(优选地年龄和性别匹配的患者)的粘液可测量地或可检测地更粘稠或粘着，和/或特征在于粘液由于其粘稠度和/或粘着性水平而造成或促进患者中的至少一种症状，所述症状造成患者不适或疼痛，或造成或恶化病状或疾病。换句话说，异常或过度粘稠和/或粘着的痰液偏离正常的粘液或痰液，其中理想的是治疗患者以提供病状的一些缓解或其他治疗益处。

本发明的方法和组合物可以用于治疗希望降低粘液或痰液的粘稠度的任何患者。特别地，具有特定肺、窦、鼻、消化道或胃肠道或生殖道疾病或病状的患者可以从使用本发明方法的治疗中受益。本发明最可用于改善或减少由粘液或痰液的异常或过度的粘稠度和/或粘着性造成或恶化的病状或疾病的至少一种症状，所述病状或疾病当然可包括肺相关疾病如囊肿性纤维化，以及消化道疾病如球虫病。其他疾病至少在某些时候可能与粘液或痰液的异常或过度的粘稠度和/或粘着性相关，并且当出现这种症状时，本发明的方法可用于降低粘液或痰液的粘稠度并向患者提供至少一些缓解或治疗益处。这些疾病的实例包括(但不限于)：囊肿性纤维化；慢性或急性支气管炎；支气管扩张(非CF和CF支气管扩张)；COPD/肺气肿；急性气管炎(细菌、病毒、支原体或由其他生物体造成)；急性或慢性窦炎；由于气道的急性或慢性粘液堵塞(有时见于多种疾病如哮喘中)产生的肺不张(肺或肺叶塌陷)；细支气管炎(病毒或其他)；由于粘液稠化造成的急性、亚急性或慢性肠梗阻，包括(但不限于)胎粪性肠梗阻或在CF或类似病症中相当的胎粪性肠梗阻；其他消化道疾病和由于(但不限于)子宫颈、输精管或其他重要的生殖结构的阻塞造成的不孕不育。另外，因为改进的粘液纤毛清除与来自肺的细菌和其他病原体的清除相关，所以本发明的组合物和方法可用于在具有多种呼吸道感染(包括病毒和细菌感染)的患者中减少与粘液或痰液的过度粘稠度和/或粘着性相关的症状。

因而，治疗益处未必是治愈特定疾病或病状，而是优选地涵盖最通常包括如下的结果：疾病或病状的减轻，疾病或病状的消除，与疾病或病状相关的症状的减少或消除，由原发性疾病或病状的出现产生的继发性疾病或病状(例如，由利用呼吸道中的过度粘稠粘液的机会性病原体微生物造成的感染性疾病)的预防或减轻，和/或潜在的疾病或病状或者与所述疾病或病状相关的症状的预防。如本文所用，短语“保护免于疾病”是指减少疾病的症状；减轻疗法(缓解或舒缓疾病的症状而不影响治愈)；减少疾病的发生，和/或降低疾病的严重程度或减轻疾病或病状的至少一种症状、征象或原因。预防是指本发明组合物当施用至患者时预防疾病发生的能力。治愈(或疾病调节)是指本发明组合物当施用至患者时治愈疾病的能力。为了保护患者免于疾病包括治疗具有疾病的患者(治疗性处理)。预防疾病/病状包括预防疾病发生(预防性处理)。特别地，保护患者免于疾病(或预防疾病)是通过使粘液或痰液与包含呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽接触来增加(标准化)患者中异常粘稠的粘液或痰液的液化以便获得有益的作用来实现的。本领域普通技术人员和/或治疗患者的受过训练的临床医生可容易地评估有益的作用。术语“疾病”是指相比于患者的正常健康的任何偏差并包括当存在疾病症状时的状态，以及其中已出现偏差(例如，感染、基因突变、基因缺陷等)，但尚未表现出症状的病状。

患者的粘液和/或痰液与包含呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽(或包含这种蛋白质的组合物)的接触，相比于与所述组合物接触之前，预期导致粘液或痰液的粘稠度降低/液化增加。根据本发明，粘液或痰液的液化增加可以是相比于先前液化水平的粘液或痰液液化水平的任何可测量或可检测增加，并且优选是统计学上显著的增加(即，患者样品与基线对照之间的测量液化水平差异是统计学上显著的，置信度至少为p<0.05)。通常，“基线对照”是在施用治疗之前的患者样品，因为正常、健康的个体通常不能产生足以充当对照的量的痰液，但来自正常、健康的个体的痰液不排除作为基线对照。另外，粘稠度降低导致肺功能改善。这种改善可通过各种方式确定，包括患者报告结果、平均加重入院时间和/或用力呼气量(FEV)增加。在本发明的一个方面，FEV增加被描述为相比于来自患者的样品在与本发明的组合物或蛋白质接触之前至少约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5.0％、约5.5％、约6.0％、约6.5％、约7.0％、约7.5％、约8.0％、约8.5％、约9.0％、和9.5％和约10％的增加。优选地，本发明的蛋白质或组合物与患者样品的粘液或痰液的接触导致相比于来自患者的样品在与本发明的组合物或蛋白质接触之前约2.5％的增加。粘液或痰液的液化和/或粘稠度降低可以使用本领域中已知的任何合适的技术来测量，包括(但不限于)如实施例部分中所述的压缩测定法。在这种测定法中，测量固相(凝胶)相对于水相(液体)中的粘液或痰液的量。在本发明的其他方面，可使用其他参数或指标来测量粘液或痰液的相对粘稠度或粘着性，包括(但不限于)粘弹性(例如通过磁性微流变学测量)、糖蛋白含量或DNA含量。在本发明的另一个方面，可以通过使用试剂如NEM(N-乙基马来酰亚胺)来评估粘液蛋白质二硫键合的变化，所述试剂优选与通过破坏二硫键产生的未结合(游离)Cys残基硫醇基团反应(Rancourt,R.等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicBiolMed),42(9):1441-1453,2007)。在本发明的一个方面，液化水平被描述为在水(液)相中的给定的粘液或痰液样品以粘液或痰液样品的总体积百分比形式的量。在具有囊肿性纤维化的患者中，例如，粘液或痰液的液化水平可能低至总体积的小于10％或甚至小于5％。优选地，使本发明的蛋白质或组合物与粘液或痰液接触导致粘液或痰液的液化变化以使得总体积的至少约15％呈液相，并且更优选地总体积的至少约20％呈液相，并且更优选地总体积的至少约25％呈液相，并且更优选地总体积的至少约30％呈液相，并且更优选地总体积的至少约35％呈液相，并且更优选地总体积的至少约40％呈液相，并且更优选地总体积的至少约45％呈液相，并且更优选地总体积的至少约50％呈液相，或直至由粘液造成的功能的阻断或抑制已清除(例如，直至患者气道被充分清空以开始咳痰)。一般来说，优选的是痰液或粘液的液化以小的逐步增量增加直至气道或其他阻塞通道(例如，在胃肠道或生殖道中)被清空，但痰液无过度液化。粘液或痰液的过度液化是不希望的，因为它可能对患者有害(例如，液化的痰液可向后流动并且稀薄液体淹没小的气道，其也可能被感染，然后痰液可以被患者清除)。优选地，本发明的蛋白质、肽或组合物与粘液或痰液接触，相比于治疗之前，产生粘液或痰液液化的至少约1％增加(以体积计)，更优选地至少约2％增加等(增量为1％)，直至患者气道或其他阻塞通道被清空。一旦实现这种清除，例如通过除去所谓的“粘液阻塞”以改进药物进入小的气道和肺泡，然后可进行较低剂量维持疗法以将新分泌的粘蛋白蛋白质保持在二硫键的正常状态。

在一个方面，结合所述方法进行疗法以从患者的受影响组织(呼吸道、消化道、生殖道)清除变稀的材料。例如，在呼吸道系统的情况下，可以结合体位引流、用力咳嗽和其他呼吸锻炼或用于咳出液化粘液或痰液的任何其他合适方法来使用本发明的方法。

根据本发明，使有待治疗的患者中的粘液或痰液与含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质(或包含所述蛋白质的组合物)接触。相比于所述接触步骤之前，所述蛋白质可有效降低痰液或粘液的粘稠度和粘着性和/或增加痰液或粘液的液化。如先前所述，硫氧还蛋白是可见于大多数生物体中的蛋白质二硫键还原酶，其参与许多硫醇依赖性细胞还原性过程。在人类中，硫氧还蛋白也被称为成人T细胞白血病衍生因子(ADF)。在细胞内，大多数这种普遍存在的低分子量(11,700)蛋白质保持被还原。还原或氧化的硫氧还蛋白可能能够进入完整细胞或吸收至细胞膜，其中少量随时间推移逐步内化。天然的硫氧还蛋白在活性位点具有两个邻位半胱氨酸残基，其在氧化蛋白质中形成位于来自蛋白质的三维结构的突起中的二硫桥。黄素蛋白硫氧还蛋白还原酶催化这种二硫键的NADPH依赖性还原。另外，关于改变的辅因子特异性而修饰的硫氧还蛋白还原酶的设计形式可代替NADH或除了NADPH之外利用，如特此以引用的方式并入的美国专利7,071,307中所述。硫氧还蛋白的少量增加可造成蛋白质中的巯基-二硫键氧化还原状态的深刻变化。

除了其实现细胞蛋白质的还原的能力之外，认识到硫氧还蛋白可以直接充当抗氧化剂(例如通过防止经由清除活性氧物质将可氧化底物氧化)，但不同于其他硫醇，硫氧还蛋白一般不会通过自氧化在细胞中产生氧化应激(例如通过自氧化产生超氧自由基)。White等的美国专利No.5,985,261(同上)表明，硫氧还蛋白直接诱导MnSOD的产生并且这种诱导是由呈还原状态的硫氧还蛋白实现的。

本发明的“硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点”包含氨基酸序列C-X-X-X(SEQIDNO:17)(天然或野生型序列包含氨基酸序列C-X-X-C，具有SEQIDNO:16)。如本文所用，表示为“C”的氨基酸残基是半胱氨酸残基并且表示为“X”的氨基酸残基可能是除半胱氨酸残基之外的任何氨基酸残基，并且特别是其余标准20种氨基酸残基中的任一种。本发明的这种硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点优选包含氨基酸序列C-G-P-X(SEQIDNO:18)，其中天然或野生型序列包含氨基酸序列C-G-P-C(SEQIDNO:1)。硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点还可包含氨基酸序列X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)，其中天然或野生型序列包含氨基酸序列X-C-X-X-C-X(SEQIDNO:20)。优选地，本发明的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含氨基酸序列X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)，其中表示为“G”的这种氨基酸残基是甘氨酸残基，并且其中表示为“P”的这种氨基酸残基是脯氨酸残基，其中天然或野生型序列包含氨基酸序列X-C-G-P-C-X(SEQIDNO:22)。更优选地，本发明的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含氨基酸序列W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)，其中表示为“W”的这种氨基酸残基是色氨酸残基，并且其中表示为“K”的这种氨基酸残基是赖氨酸残基并且其中天然序列包含氨基酸序列W-C-G-P-C-K(SEQIDNO:3)。优选地，硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点可包含氨基酸序列C-X-X-S(SEQIDNO:24)。本发明的这种硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点优选包含氨基酸序列C-G-P-S(SEQIDNO:1)。硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点还可包含氨基酸序列X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)或W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)，其中表示为“X”的氨基酸残基可以是除半胱氨酸残基之外的任何氨基酸残基。对于“硫氧还蛋白活性位点”的提及包括硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点和天然或野生型硫氧还蛋白活性位点。

在本发明的一个方面，含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质是全长硫氧还蛋白或其含有如上文在结构上和功能上所述的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的任何片段。优选的具有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白包括原核硫氧还蛋白、酵母硫氧还蛋白、植物硫氧还蛋白和哺乳动物硫氧还蛋白，其中人类硫氧还蛋白是特别优选的。来自多种生物体的硫氧还蛋白的核酸和氨基酸序列是本领域中众所周知的并且预期为本发明所涵盖。例如，SEQIDNO:4-15代表来自丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)(SEQIDNO:4)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)(SEQIDNO:5)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(SEQIDNO:6)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(SEQIDNO:7)、原鸡(Gallusgallus)(SEQIDNO:8)、小家鼠(Musmusculus)(SEQIDNO:9)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)(SEQIDNO:10)、普通牛(Bostaurus)(SEQIDNO:11)、智人(Homosapiens)(SEQIDNO:12)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)(SEQIDNO:13)、玉蜀黍(Zeamays)(SEQIDNO:14)和稻(Oryzasativa)(SEQIDNO:15)的硫氧还蛋白的氨基酸序列。提及这些序列中的每一个，X-C-G-P-C-X(SEQIDNO:22)基序(其包括SEQIDNO:1的CGPC基序)可见如下：SEQIDNO:4(位置33-38)、SEQIDNO:5(位置28-33)、SEQIDNO:6(位置27-32)、SEQIDNO:7(位置29-34)、SEQIDNO:8(位置31-36)、SEQIDNO:9(位置31-36)、SEQIDNO:10(位置31-36)、SEQIDNO:11(位置31-36)、SEQIDNO:12(位置31-36)、SEQIDNO:13(位置59-64)、SEQIDNO:14(位置88-93)和SEQIDNO:15(位置94-99)。此外，若干种硫氧还蛋白的三维结构已经被解析，包括人类和细菌硫氧还蛋白。因此，来自多种生物体的硫氧还蛋白的结构和活性位点是本领域中众所周知的并且本领域技术人员将能够容易地鉴定和产生全长硫氧还蛋白(包括可用于本发明中的具有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白)的片段或同源物。

短语“呈还原状态”特定地描述在本发明的蛋白质或肽的活性位点中的半胱氨酸残基的状态。在还原状态中，相邻的半胱氨酸残基形成二硫醇(即两个游离巯基，-SH)。相比之下，在氧化形式中，这些半胱氨酸残基形成分子内二硫桥；这种分子可被称为胱氨酸。在还原状态中，单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点能够通过其活性位点硫醇可逆氧化为二硫键而参与氧化还原反应，并且催化硫醇-二硫键交换反应，其导致共价连接至目标二硫键Cys中的一个。对于含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的本发明的蛋白质或肽，活性位点中的N端半胱氨酸在还原状态中作为单硫醇并且因此能够与目标蛋白质上的半胱氨酸形成稳定的混合二硫键。

如本文所用，含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的本发明蛋白质可以是硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点本身或通过糖苷键结合至其他氨基酸的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。因此，本发明的蛋白质或肽的最小尺寸的长度为约4至约6个氨基酸，其中优选的尺寸取决于是否需要这种蛋白质的全长、融合、多价或仅功能部分。优选地，本发明的蛋白质或肽的长度从约4个延伸至约100个氨基酸残基或更多，其中具体地设想以整数(即，4、5、6、7...99、100、101)计的任何中间长度的肽。它也可能是在N端和C端封端的短硫氧还蛋白模拟肽，如由Bachnoff等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicalBiolMed)50:1355-67,2011所述。在另一个优选的实施方案中，本发明的蛋白质可以是全长蛋白质或这种蛋白质的任何同源物。如本文所用，术语“同源物”用于指通过对天然存在的蛋白质或肽(即，“原型”或“野生型”蛋白质)进行修饰而不同于所述天然存在的蛋白质或肽的蛋白质或肽，但其保持天然存在形式的基本蛋白质和侧链结构，和/或其保持天然蛋白质的至少生物活性部分(例如，硫氧还蛋白活性位点)的基本三维结构。这些改变包括(但不限于)：一个或几个氨基酸侧链中的改变；个或几个氨基酸中的改变，包括缺失(例如，蛋白质或肽的截短形式(片段))、插入和/或取代；一个或几个原子的立体化学的改变；和/或轻微的衍生化，包括(但不限于)：甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。根据本发明，本发明中可用的任何蛋白质或肽(包括天然硫氧还蛋白的同源物)具有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，以使得在还原状态中，所述蛋白质或肽能够通过将其活性位点硫醇氧化为二硫键来参与氧化还原反应和/或能够降低粘液或痰液的粘稠度或粘着性或增加粘液或痰液的液化。如本文所用，含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽可具有与硫氧还蛋白类似的特性，并且优选地是选自原核硫氧还蛋白、真菌硫氧还蛋白(包括酵母)、植物硫氧还蛋白或哺乳动物硫氧还蛋白的硫氧还蛋白。在一个特别优选的实施方案中，所述蛋白质是人类硫氧还蛋白。

同源物可以是天然等位基因变异或天然突变的结果。编码蛋白质的核酸的天然存在的等位基因变体是在基因组中与编码这种蛋白质的基因基本上相同的基因座(或多个基因座)处存在的基因，但其由于例如突变或重组造成的天然变化而具有类似但不一致的序列。等位基因变体通常编码与由它们被比较的基因编码的蛋白质具有类似活性的蛋白质。一类等位基因变体可以编码相同蛋白质，但由于遗传密码的简并性而具有不同的核酸序列。等位基因变体还可以包含在基因的5'或3'非翻译区域中(例如，在调节控制区中)的变化。等位基因变体是本领域技术人员众所周知的。

可使用本领域中已知用于制造蛋白质的技术来产生同源物，包括(但不限于)对分离的天然存在蛋白质的直接修饰、直接蛋白质合成，或使用例如经典或重组DNA技术对编码蛋白质的核酸序列进行修饰以实现随机或靶向诱变。

相比于野生型蛋白质，在同源物中的修饰相比于天然存在蛋白质激动、拮抗或基本上不会改变同源物的基本生物活性。一般来说，蛋白质的生物活性或生物作用是指如在体内(即，在蛋白质的天然生理环境中)或在体外(即，在实验室条件下)所测量或观测，由于蛋白质的天然存在形式而由所述蛋白质表现或执行的任何功能。蛋白质的修饰，例如在同源物或模拟物中(下文讨论)，可产生相比于天然存在蛋白质具有相同生物活性的蛋白质，或产生相比于天然存在蛋白质具有降低或增加的生物活性的蛋白质。导致蛋白质表达降低或蛋白质活性降低的修饰可被称为蛋白质的失活(完全或部分)、下调或降低作用。类似地，导致蛋白质表达增加或蛋白质活性增加的修饰可被称为蛋白质的扩增、过度产生、激活、增强、上调或增加作用。

在一个实施方案中，含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽可以是药物设计或选择的产品并且可以使用本领域中已知的各种方法产生。这些蛋白质或肽可被称为模拟物。模拟物是指能够模拟天然存在肽的生物作用的任何肽或非肽化合物，通常是因为所述模拟物具有模拟天然存在肽的基本结构的基本结构和/或具有天然存在肽的显著生物特性。模拟物可以包括(但不限于)：相比于原型具有实质性修饰如与天然存在肽不具有侧链相似性的肽(这些修饰例如可降低其对降解的易感性)；抗独特型和/或催化抗体，或其片段；分离蛋白的非蛋白质部分(例如，碳水化合物结构)；或合成或天然有机分子，包括例如经由组合化学鉴定的核酸和药物。这些模拟物可以使用本领域中已知的多种方法设计、选择和/或以其他方式鉴定。可用于设计或选择可用于本发明中的模拟物或其他治疗化合物的各种药物设计方法公开于Maulik等,1997,《分子生物技术：治疗应用和策略》(MolecularBiotechnology:TherapeuticApplicationsandStrategies),Wiley-Liss,Inc.中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。能够实现有效和选择性氧化还原活性的硫氧还蛋白模拟肽由Bachnoff等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicalBiolMed)50:1355-67(2011)描述并以全文引用的方式并入本文中。

模拟物可以获自例如分子多样性策略(允许大的化学多样性分子文库的快速构建的相关策略的组合)，自然或合成化合物的文库，特别是来自化学或组合文库(即，序列或尺寸不同但具有类似结构单元的化合物的文库)或通过合理、定向或随机的药物设计。参见例如Maulik等,同上。

在分子多样性策略中，使用生物、酶和/或化学方法，例如从肽、低聚核苷酸、碳水化合物和/或合成有机分子合成大的化合物文库。开发分子多样性策略中的关键参数包括亚基多样性、分子尺寸和文库多样性。筛选这些文库的一般目标是利用组合选择的依序应用来获得针对所需靶标的高亲和力配体，然后通过随机或定向设计策略来优化前导分子。分子多样性的方法详细描述于Maulik等,同上中。

Maulik等也公开了例如定向设计方法，其中使用者指导从适当选择的片段的片段文库产生新颖分子的方法；随机设计，其中使用者使用遗传或其他算法来随机突变片段和其组合，同时应用选择标准来评估候选配体的适合度；和基于栅格的方法，其中使用者计算三维受体结构与小片段探针之间的相互作用能量，接着一起连接有利的探针位点。

多样性产生方法例如前述可以与被设计用于改进功能或药理学，尤其是对于尺寸减小的分子如活性位点模拟物的其他技术组合。例如，已在早期研究中显示有希望的一种方法是烃装订α螺旋肽，一类新颖的合成微型蛋白，其通过位点特异性引入化学支架(全烃装订)而锁定在其生物活性α-螺旋折叠中。装订可以极大地改进肽的药理学性能，增加其靶标亲和力和蛋白水解抗性，同时产生适于化学合成的较大蛋白质/酶的较小肽形式(Verdine,G.L.和Hilinsky,G.J.,《酶方法》(MethodsEnzymol),503:3-33,2012)。

在本发明的一个实施方案中，适用于本发明中的蛋白质具有包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的氨基酸序列：硫氧还蛋白的全长序列或其具有如本文所述的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的任何片段。例如，本发明涵盖SEQIDNO4-15的天然序列中的任一种或其含有如本文所述的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的片段或其他同源物。这些同源物可以包括与全长硫氧还蛋白的氨基酸序列具有至少约10％同一性，或与全长硫氧还蛋白的氨基酸序列具有至少20％同一性、或至少30％同一性、或至少40％同一性、或至少50％同一性、或至少60％同一性、或至少70％同一性、或至少80％同一性、或至少90％同一性、或大于95％同一性的氨基酸序列的蛋白质，包括介于10％与100％之间以整数计的任何百分比(10％、11％、12％、...98％、99％、100％)。

如本文所用，除非另外说明，否则对同一性百分比(％)的提及是指使用如下进行的同源性评估：(1)使用用于氨基酸搜索的blastp和用于核酸搜索的blastn在标准默认参数下进行BLAST2.0BasicBLAST同源性搜索，其中在默认情况下对于低复杂度区域过滤查询序列(描述于Altschul,S.F.,Madden,T.L.,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.和Lipman,D.J.(1997)"GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms."《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)25:3389-3402中，其以全文引用的方式并入本文中)；(2)BLAST2比对(使用下文描述的参数)；(3)和/或具有标准默认参数的PSI-BLAST(位置特异性迭代BLAST)。应注意到，由于BLAST2.0BasicBLAST与BLAST2之间的标准参数中的一些差异，两个特定序列可使用BLAST2程序识别为具有显著同源性，而使用所述序列之一作为查询序列在BLAST2.0BasicBLAST中进行的搜索可能无法鉴定顶部匹配中的第二序列。另外，PSI-BLAST提供“profile”搜索的自动化、容易使用形式，这是寻找序列同源物的一种敏感方式。所述程序首先进行空位BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序使用来自任何显著比对的信息返回以构建位置特异性得分矩阵，其取代查询序列用于下一回合的数据库搜索。因此，应理解，可使用这些程序中的任一种来测定同一性百分比。

如以全文引用的方式并入本文中的Tatusova和Madden,(1999),"Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences",FEMSMicrobiolLett.174:247-250中所述，可使用BLAST2序列对两种特定序列进行彼此比对。使用BLAST2.0算法以blastp或blastn进行BLAST2序列比对以在两个序列之间进行空位BLAST搜索(BLAST2.0)，从而允许在所得比对中引入空位(缺失和插入)。本文中为清晰起见，使用如下标准默认参数进行BLAST2序列比对。

关于blastn，使用0BLOSUM62矩阵：

匹配奖励＝1

错配罚分＝-2

开放空位(5)和延伸空位(2)罚分

空位x_dropoff(50)预期(10)字长(11)过滤器(打开)

关于blastp，使用0BLOSUM62矩阵：

开放空位(11)和延伸空位(1)罚分

空位x_dropoff(50)预期(10)字长(3)过滤器(打开)。

可用于本发明中的蛋白质还可包括具有如下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列包含含有单半胱氨酸活性位点的任何全长硫氧还蛋白的至少10个连续的氨基酸残基(由SEQIDNO:4-15表示的天然序列，即，与参考序列的10个连续氨基酸具有100％同一性的10个连续氨基酸残基)。在其他实施方案中，硫氧还蛋白的同源物包括包含天然存在的硫氧还蛋白的氨基酸序列的至少15个、或至少20个、或至少25个、或至少30个、或至少35个、或至少40个、或至少45个、或至少50个、或至少55个、或至少60个、或至少65个、或至少70个、或至少75个、或至少80个连续的氨基酸残基等直至蛋白质全长的氨基酸序列(包括以整数计的任何中间长度(10、11、12,..))，并且其包含单半胱氨酸活性位点。

根据本发明，关于本文所述的序列的术语“连续的”或“相邻的”是指以不间断序列连接。例如，对于包含第二序列的30个连续(或相邻)氨基酸的第一序列，意味着所述第一序列包括与第二序列中的30个氨基酸残基的不间断序列具有100％同一性的30个氨基酸残基的不间断序列。类似地，对于与第二序列具有“100％同一性”的第一序列，意味着所述第一序列精确匹配第二序列，其中在核苷酸或氨基酸之间无空位。

在另一个实施方案中，可用于本发明中的蛋白质包括具有与天然硫氧还蛋白氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的蛋白质，其中编码同源物的核酸序列能够在中等、高或非常高严格度条件(描述于下文)下与(即和)编码天然硫氧还蛋白的核酸分子(即与编码天然硫氧还蛋白氨基酸序列的核酸链的互补序列)杂交。这些杂交条件详细描述于下文。

编码本发明的硫氧还蛋白的核酸序列的核酸序列互补序列是指与编码硫氧还蛋白的链互补的核酸链的核酸序列。应理解，编码给定氨基酸序列的双链DNA包含单链DNA和其具有与所述单链DNA互补的序列的互补链。因而，本发明的核酸分子可以是双链的或单链的，并且包括在严格杂交条件下与编码硫氧还蛋白的氨基酸序列的核酸序列和/或与编码这种氨基酸序列的核酸序列的互补序列形成稳定杂交体的那些核酸分子。推断互补序列的方法是本领域技术人员已知的。

如本文所用，对于杂交条件的提及是指使用核酸分子来鉴定类似核酸分子的标准杂交条件。这些标准条件公开于例如Sambrook等,《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLabsPress,1989中。Sambrook等,同上是以全文引用的方式并入本文中(具体参见第9.31-9.62页)。另外，计算适当杂交和洗涤条件以实现允许不同程度的核苷酸错配的杂交的公式公开于例如Meinkoth等,1984,《分析生物化学》(Anal.Biochem.)138,267-284中；Meinkoth等,同上是以全文引用的方式并入本文中。

更具体地，如本文所提及的中等严格杂交和洗涤条件是指允许分离与用于探测杂交反应的核酸分子具有至少约70％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即，允许约30％或更少的核苷酸错配的条件)。如本文所提及的高严格杂交和洗涤条件是指允许分离与用于探测杂交反应的核酸分子具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即，允许约20％或更少的核苷酸错配的条件)。如本文所提及的非常高严格杂交和洗涤条件是指允许分离与用于探测杂交反应的核酸分子具有至少约90％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即，允许约10％或更少的核苷酸错配的条件)。如上文所讨论，本领域技术人员可以使用Meinkoth等,同上中的公式来计算适当的杂交和洗涤条件以实现这些特定水平的核苷酸错配。这些条件将根据是否形成DNA:RNA或DNA:DNA杂交体而改变。DNA:DNA杂交体的所计算熔融温度比DNA:RNA杂交体低10℃。在特定实施方案中，DNA:DNA杂交体的严格杂交条件包括在约20℃至约35℃(较低严格度)、更优选地约28℃至约40℃(更严格)和甚至更优选地约35℃至约45℃(甚至更严格)的温度下，在适当洗涤条件下，在6XSSC(0.9MNa⁺)的离子强度下的杂交。在特定实施方案中，DNA:RNA杂交体的严格杂交条件包括在约30℃至约45℃、更优选地约38℃至约50℃和甚至更优选地约45℃至约55℃的温度下，在类似严格的洗涤条件下，在6XSSC(0.9MNa⁺)的离子强度下的杂交。这些值是基于大于约100个核苷酸的分子的熔融温度、0％甲酰胺和约40％的G+C含量的计算。可选地，可以如Sambrook等,同上,第9.31至9.62页中所述，根据经验计算T_m。一般来说，洗涤条件应该尽可能地严格，并且应适于所选杂交条件。例如，杂交条件可包括盐与比特定杂交体的T_m计算值低约20-25℃的温度条件的组合，并且洗涤条件通常包括盐与比特定杂交体的T_m计算值低约12-20℃的温度条件的组合。适用于DNA:DNA杂交体的杂交条件的一个实例包括在约42℃下在6XSSC(50％甲酰胺)下杂交2-24小时，接着是包括在室温下在约2XSSC中一次或多次洗涤的洗涤步骤，接着是在较高温度和较低离子强度下额外洗涤(例如，在约37℃下在约0.1X-0.5XSSC中至少一次洗涤，接着在约68℃下在约0.1X-0.5XSSC中至少一次洗涤)。

本发明的蛋白质也可以是包括含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的区段和可具有多种功能的融合区段的融合蛋白。例如，这种融合区段可以充当简化本发明蛋白质的纯化的工具，例如能够使用亲和色谱法实现所得融合蛋白的纯化。合适的融合区段可以是具有所需功能(例如，赋予蛋白质以增加的稳定性，赋予蛋白质以增加的免疫原性，和/或简化蛋白质的纯化)的任何尺寸的结构域。使用一种或多种融合区段在本发明的范围内。融合区域可以结合至含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的区段的氨基和/或羧基末端。融合蛋白的融合区域与含硫氧还蛋白活性位点的结构域之间的连接可易于裂解以实现这些蛋白质的含硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点结构域的直接回收。优选通过培养用融合核酸分子转化的重组细胞来产生融合蛋白，所述融合核酸分子编码包括连接至含硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点结构域的羧基和/或氨基末端的融合区段的蛋白质。

在一个实施方案中，适用于本发明方法的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽包含源自与施用蛋白质者基本上类似动物物种的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。在另一个实施方案中，包括来自不同来源如微生物、植物和真菌的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的任何蛋白质或肽可用于给定患者中。

在本发明的一个实施方案中，可以产生本文所述的任何氨基酸序列，例如含有单半胱氨酸活性位点的天然存在的硫氧还蛋白或硫氧还蛋白的氨基酸序列，其中至少一个和至多约20个另外的异源氨基酸侧接指定氨基酸序列的每个C端和/或N端。所得蛋白质或多肽可以被称为“基本上由指定氨基酸序列组成”。根据本发明，所述异源氨基酸是如下氨基酸序列：其天然地未发现(即，自然界中未发现，在体内)侧接指定氨基酸序列，或其与指定氨基酸序列的功能无关，或当其存在于基因中时不会由侧接编码指定氨基酸序列的天然存在的核酸序列的核苷酸编码，在天然存在序列中的这些核苷酸是使用对于获得给定氨基酸序列的生物体的标准密码子使用来翻译时。类似地，短语“基本上由……组成”当关于本文中的核酸序列使用时是指在编码指定氨基酸序列的核酸序列的5'和/或3'端的每一个可被至少一个和至多多达约60个额外异源核苷酸侧接的编码所述指定氨基酸序列的核酸序列。异源核苷酸在天然基因中存在时天然地未发现(即，自然界中未发现，在体内)侧接编码指定氨基酸序列的核酸序列，或不编码赋予蛋白质以任何额外功能的蛋白质，或改变具有指定氨基酸序列的蛋白质的功能。

在另一个实施方案中，适用于本发明方法的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽包含分离的或生物纯的蛋白质。因而，“分离的”和“生物纯的”未必反映蛋白质已经纯化的程度。本发明的分离蛋白可能例如获自其天然来源，使用重组DNA技术(例如，聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)产生，或化学合成。

在另一个实施方案中，本发明的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的化学合成蛋白质或肽也可能是指稳定化形式，例如含有在结构上通过装订肽技术、通过环化制约，或通过在N端或C端制约的活性位点的蛋白质或肽。优选地，有待用于本发明方法中的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质具有足以造成患者中可测量或可检测的粘液或痰液液化增加(或粘稠度或粘着性降低)，和或造成与患者中的粘液和痰液相关的可测量、可检测或感知的患者治疗益处的体内半衰期。这种半衰期可以通过递送这种蛋白质的方法来实现。本发明的蛋白质优选地具有在动物中大于约5分钟、和更优选地在动物中大于约4小时并且甚至更优选地在动物中大于约16小时的半衰期。在一个优选的实施方案中，本发明的蛋白质具有在动物中约5分钟至约24小时、和优选地在动物中约2小时至约16小时和更优选地在动物中约4小时至约12小时的半衰期。

本发明的其他实施方案包括编码含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的核酸分子。这些核酸分子可用于产生可在体外或体内用于本发明方法中的蛋白质。本发明的核酸分子包括包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的核酸分子：编码本文先前所述的任何蛋白质的核酸序列。根据本发明，分离核酸分子是已经从其天然环境中除去(即已经进行人类操纵)的核酸分子(聚核苷酸)并且可以包括DNA、RNA，或DNA或RNA的衍生物，包括cDNA。因而，“分离”不反映核酸分子已经纯化的程度。虽然短语“核酸分子”主要是指物理核酸分子并且短语“核酸序列”主要是指核酸分子上的核苷酸序列，所述两个短语可以互换使用，尤其是关于核酸分子或能够编码蛋白质的核酸序列。本发明的分离核酸分子可以从其天然来源分离或使用重组DNA技术(例如，聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成产生。分离核酸分子可以包括例如基因、基因的天然等位基因变体、其编码区域或部分，和以使得修饰基本上不干扰核酸分子编码本发明的所需蛋白质或在严格条件下与天然基因分离体形成稳定杂交体的能力的方式通过核苷酸插入、缺失、取代和/或倒置修饰的编码和/或调节区域。分离核酸分子可包括简并性。如本文所用，核苷酸简并性是指一个氨基酸可以被不同核苷酸密码子编码的现象。因此，编码可用于本发明中的给定蛋白质的核酸分子的核酸序列可由于简并性而改变。

根据本发明，对于基因的提及包括与天然(即野生型)基因有关的所有核酸序列以及与硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点有关的那些，例如控制由所述基因编码的蛋白质的产生的调节区域(例如(但不限于)转录、翻译或翻译后控制区域)以及其编码区域。在另一个实施方案中，基因可以是天然存在的等位基因变体，其包括与编码给定蛋白质的核酸序列类似但不相同的序列。上文先前已描述了等位基因变体。当核酸分子包含如上所述的基因时，短语“核酸分子”和“基因”可以互换使用。

优选地，本发明的分离核酸分子是使用重组DNA技术(例如，聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成产生的。分离核酸分子包括天然核酸分子和其同源物，包括(但不限于)天然等位基因变体和修饰的核酸分子，其中核苷酸已经以使得这些修饰对蛋白质生物活性提供所需作用的方式插入、缺失、取代和/或倒置。上文已经详细讨论了等位基因变体和蛋白质同源物(例如，通过核酸同源物编码的蛋白质)。

核酸分子同源物可以使用本领域技术人员已知的多种方法(例如，如Sambrook等,同上中所述)产生。例如，可使用多种技术来修饰核酸分子，包括(但不限于)通过经典诱变和重组DNA技术(包括但不限于定点诱变、化学处理、限制酶裂解、核酸片段连接和/或PCR扩增)，或低聚核苷酸混合物的合成和化学连接，或分子基团的混合物的体外或体内重组以通过基因改组方法“建造”包含其多种组合的核酸分子的再分类文库(即，分子育种；参见例如Stemmer的美国专利No.5,605,793；Minshull和Stemmer,《化学生物学当前观点》(Curr.Opin.Chem.Biol.)3:284-290,1999；Stemmer,P.N.A.S.USA91:10747-10751,1994，其全部都是以全文引用的方式并入本文中)。本领域技术人员已知的这些和其他类似技术可用于在蛋白质中有效地引入多种同时变化。核酸分子同源物随后可以通过与给定基团杂交来选择，或通过直接表达针对由这些核酸分子编码的蛋白质的功能和生物活性进行筛选。

本发明的一个实施方案涉及一种重组核酸分子，其包含可操作地连接到至少一个转录控制序列的上述分离核酸分子。更具体地，根据本发明，重组核酸分子通常包含重组载体和如上所述的分离核酸分子。根据本发明，重组载体是工程改造的(即人工产生的)核酸分子，其用作用于操纵所选核酸序列和/或用于将这种核酸序列引入宿主细胞中的工具。因此所述重组载体适用于克隆、测序和/或以其他方式操纵所选核酸序列，例如通过将所选核酸序列表达和/或递送至宿主细胞中以形成重组细胞。这种载体通常含有异源核酸序列，即，天然地未发现与有待克隆或递送的核酸序列相邻的核酸序列，但所述载体也可含有调节核酸序列(例如，启动子、非翻译区)，其被天然地发现与本发明的核酸序列相邻或者其可用于表达本发明的核酸分子(下文详细讨论)。所述载体可以是RNA或DNA，原核或真核的，并且通常是质粒。所述载体可保持为染色体外元件(例如，复制质粒)，或者它可以整合到重组宿主细胞的染色体中，但优选的是所述载体与用于本发明的大部分应用的基因组保持分开。整个载体可保持在宿主细胞内的适当位置，或在某些条件下，质粒DNA可以缺失，留下本发明的核酸分子。整合的核酸分子可以在染色体启动子控制下，在天然或质粒启动子控制下，或在若干启动子控制的组合下。可将核酸分子的单个或多个拷贝整合至染色体中。本发明的重组载体可含有至少一个可选择标记。

在一个实施方案中，本发明的重组核酸分子中使用的重组载体是表达载体。如本文所用，短语“表达载体”用于指适于产生编码产物(例如，目标蛋白质)的载体。在这个实施方案中，将编码有待产生的产物(例如，含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质)的核酸序列插入重组载体中以产生重组核酸分子。以将核酸序列可操作地连接至载体中能够实现核酸序列在重组宿主细胞内转录和翻译的调节序列的方式将编码有待产生的蛋白质的核酸序列插入载体中。

在本发明的另一个实施方案中，重组核酸分子包含病毒载体。病毒载体包括整合至病毒基因组或其部分中的本发明的分离核酸分子，其中所述核酸分子包装在允许DNA进入细胞中的病毒包膜中。可以使用多种病毒载体，包括(但不限于)基于α病毒、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、慢病毒、腺相关病毒和反转录病毒的那些。

通常，重组核酸分子包括可操作地连接至一个或多个表达控制序列的至少一个本发明核酸分子。如本文所用，短语“重组分子”或“重组核酸分子”主要是指可操作地连接至表达控制序列的核酸分子或核酸序列，但当这种核酸分子是如本文所讨论的重组分子时，可以与短语“核酸分子”互换使用。根据本发明，短语“可操作地连接”是指以使得分子当转染(即，转化、转导、转染、结合或传导)至宿主细胞中时能够被表达的方式将核酸分子连接至表达控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、延伸或终止的表达控制序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的序列，例如启动子、增强子、操纵子和阻遏子序列。合适的转录控制序列包括可以在待引入重组核酸分子的宿主细胞或生物体中起作用的任何转录控制序列。本发明的重组核酸分子也可以含有其他的调节序列，例如翻译调节序列、复制起点，和可与重组细胞相容的其他调节序列。在一个实施方案中，本发明的重组分子(包括整合至宿主细胞染色体中的那些)也含有分泌信号(即，信号区段或信号序列核酸序列)以实现所表达蛋白质从产生所述蛋白质的细胞中分泌。合适的信号区段包括与待表达蛋白质天然缔合的信号区段或能够引导根据本发明的蛋白质的分泌的任何异源信号区段。在另一个实施方案中，本发明的重组分子包含前导序列以实现所表达蛋白质被递送至并插入宿主细胞膜中。其他信号序列包括能够引导周质或胞外分泌或者保留在所需隔室内的那些。合适的前导序列包括与蛋白质天然缔合的前导序列，或能够引导蛋白质递送和插入细胞膜中的任何异源前导序列。

根据本发明，术语“转染”用于指可用于将外源核酸分子(即，重组核酸分子)插入细胞中的任何方法。术语“转化”与术语“转染”当用于指将核酸分子引入微生物细胞或植物中时，这些术语可以互换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于通过微生物获得外源核酸所致的遗传变化并且基本上与术语“转染”同义。然而，在动物细胞中，转化已获得第二种含义，其可能是指培养中的细胞(如上所述)例如在其变得癌性后的生长特性的变化。因此，为避免混淆，术语“转染”优选关于将外源核酸引入动物细胞中使用，并且在本文中通常用于涵盖动物细胞的转染和植物细胞和微生物细胞的转化，其程度为所述术语涉及将外源核酸引入细胞中。因此，转染技术包括(但不限于)转化、粒子轰击、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附、感染和原生质体融合。

在一个实施方案中，将包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的组合物用于降低过度粘稠的粘液或痰液的粘稠度。所述组合物包含含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质，并且可包括一种或多种额外的药剂或化合物，例如可以用于减少/降低过度粘稠或粘着的粘液或痰液或者增加这种粘液或痰液的液化的其他药剂或化合物。例如其他药剂或化合物的实例是本领域中已知的并且包括(但不限于)纯化的rhDNA酶、N-乙酰基半胱氨酸、nacystelyn(N-乙酰基-L-半胱氨酸衍生物)、GSH和凝溶胶。另外，粘液活性剂如甘露糖醇或高渗盐水可与单半胱氨酸活性位点硫氧还蛋白组合使用。

在一个实施方案中，包括药物组合物的组合物可以用于将编码含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的核酸分子递送有待治疗的患者中的细胞(例如，肺或气道中的上皮细胞)，以使得所述细胞可变得被所述蛋白质转染并表达所述蛋白质，并且因此所述蛋白质可以接触所述细胞的微环境中的粘液或痰液。

组合物(包括药物组合物)也可以包括例如药学上可接受的载体，其包括药学上可接受的赋形剂和/或用于将蛋白质或核酸分子或其他调节化合物递送至患者的递送媒介物。另外，可以将组合物(包括本发明的药物组合物)在药学上可接受的载体中施用至患者。如本文所用，药学上可接受的载体是指适于将治疗蛋白质、核酸或本发明方法中可用的其他化合物递送至合适的体内或离体位点的任何物质。优选的药学上可接受的载体能够将蛋白质、核酸分子或化合物保持为在所述蛋白质、核酸分子或化合物到达所需位点(例如，分泌或排出有待治疗的粘液或痰液的位点)后的形式，能够接触粘液或痰液(在蛋白质或化合物的情况下)或能够进入细胞并被细胞表达和分泌(在核酸分子的情况下)，以使得呈还原状态的所表达蛋白质可以接触粘液或痰液。本发明的合适的赋形剂包括输送或帮助输送，但不会将治疗剂(蛋白质、核酸或化合物)特异性靶向细胞、组织或流体(粘液或痰液)的赋形剂或制剂(本文也称为非靶向载体)。药学上可接受的赋形剂的实例包括(但不限于)水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、含血清溶液、汉克溶液、其他水性生理平衡溶液、油、酯和二醇。水性载体可以含有例如通过增强化学稳定性和等渗性而接近接受者的生理条件所需的合适的辅助物质。用于治疗剂吸入的制剂也可包括表面活性剂分子。

合适的辅助物质包括例如乙酸钠、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙，和用于产生磷酸盐缓冲液的其他物质、Tris缓冲液和碳酸氢盐缓冲液。辅助物质还可以包括防腐剂，例如硫柳汞、间甲酚或邻甲酚、福尔马林和苯甲醇。本发明的组合物可以通过常规方法灭菌和/或冻干。

一种类型的药学上可接受的载体包括能够使本发明组合物缓慢释放至患者中的控释制剂。如本文所用，控释制剂包含在控释媒介物中的一种或多种本发明治疗剂。合适的控释媒介物包括(但不限于)生物相容性聚合物、其他聚合基质、胶囊、微胶囊、大丸制剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球和透皮递送系统。这些控释媒介物还可并入还原剂以在储存和递送期间将硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点维持在还原状态。适于核酸的递送媒介物包括(但不限于)脂质体、病毒载体或其他递送媒介物，包括核酶。

施用至患者的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的合适或有效量是能够实现以下的量：通过将其活性位点硫醇可逆氧化为二硫键而参与氧化还原反应，催化硫醇-二硫键交换反应，和特别是在患者中降低粘液或痰液的粘稠度或粘着性和/或增加粘液或痰液的液化，足以向患者提供治疗益处。可以如本文先前所述或通过本领域技术人员已知的任何合适方法来测量、检测或测定粘稠度或粘着性的降低或粘液或痰液液化的增加。如上文所讨论，这些测量包括测定和比较在与合适或有效量的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽接触之前和之后的来自患者的粘液或痰液样品中的游离硫醇百分比，以及测定和比较在与合适或有效量的含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽接触之前和之后的患者的FEV水平。

在一个实施方案中，有待施用至患者的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的合适或有效量包含以患者体重计约10微摩尔/千克、15微摩尔/千克、20微摩尔/千克、25微摩尔/千克、30微摩尔/千克、35微摩尔/千克、40微摩尔/千克、45微摩尔/千克、50微摩尔/千克、55微摩尔/千克、60微摩尔/千克、65微摩尔/千克、70微摩尔/千克、75微摩尔/千克、80微摩尔/千克、85微摩尔/千克、90微摩尔/千克、95微摩尔/千克、100微摩尔/千克、105微摩尔/千克、110微摩尔/千克、115微摩尔/千克、120微摩尔/千克、125微摩尔/千克、130微摩尔/千克、135微摩尔/千克、140微摩尔/千克、145微摩尔/千克、150微摩尔/千克、175微摩尔/千克、200微摩尔/千克、225微摩尔/千克、250微摩尔/千克、275微摩尔/千克、300微摩尔/千克、325微摩尔/千克、350微摩尔/千克、375微摩尔/千克、400微摩尔/千克、425微摩尔/千克、450微摩尔/千克、475微摩尔/千克、500微摩尔/千克、525微摩尔/千克、550微摩尔/千克、575微摩尔/千克、600微摩尔/千克、625微摩尔/千克、650微摩尔/千克、675微摩尔/千克、700微摩尔/千克、725微摩尔/千克、750微摩尔/千克、775微摩尔/千克、800微摩尔/千克、825微摩尔/千克、850微摩尔/千克、875微摩尔/千克、900微摩尔/千克、925微摩尔/千克、950微摩尔/千克、975微摩尔/千克、1000微摩尔/千克、1100微摩尔/千克、1200微摩尔/千克、1300微摩尔/千克、1400微摩尔/千克、1500微摩尔/千克、1600微摩尔/千克、1700微摩尔/千克、1800微摩尔/千克、1900微摩尔/千克、2000微摩尔/千克、2100微摩尔/千克、2200微摩尔/千克、2300微摩尔/千克、2400微摩尔/千克或约2500微摩尔/千克。

在另一个实施方案中，如果递送途径是气雾剂递送至肺或类似途径，则有待施用至患者的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的量包含约0.25毫克/剂量单位(例如，对于人类的剂量单位通常是约2-3ml)至约100毫克/剂量单位。优选地，有待施用至患者的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的量包含每剂量单位约0.25mg、0.50mg、1.0mg、5.0mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或约100mg。取决于用于气雾剂递送的装置，一些气雾剂递送装置仅允许气雾剂中约10％的体积实际递送至肺。然而，当所述递送装置是振动筛喷雾器时，可以递送气雾剂中约90％的体积。电子振动筛喷雾器能够更为迅速地递送药物并且是CF患者非常优选的更小更便携的装置(Geller,D.E.,《儿科肺病学》(PediatricPulmonology),43(S9):S5-S17,2008)。振动筛喷雾器此外相比于空气喷射喷雾器以较小残余剂量更有效地递送药物。因为实现治疗益处需要较小的剂量，所以这对于降低治疗成本是特别显著的。诸如这些装置也不会导致蛋白质生物活性降低(Kesser,K.C.等,《呼吸道护理》(RespCare),54(6):754-768,2009；Scherer,T.等,《药物科学杂志》(JPharmSci),100(1):98-109,2011)。因此，对于其他施用途径，当将递送至位点的组合物体积较大时，将很容易看出，可使用较低剂量的包含硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽。

有待施用至动物的本发明蛋白质的最佳量将根据施用途径而改变。例如，如果蛋白质是通过吸入(气雾剂)途径施用的，则有待施用的最佳量可能不同于有待通过气管内微量喷雾施用的最佳量。根据所述施用途径来改变用量在本领域技术人员的能力范围内。重要的是注意到，本发明蛋白质的合适量是具有所需作用而对动物无毒的量。其他施用途径包括(但不限于)口服施用，特别是对于消化道粘液的治疗；或局部施用，对于生殖道粘液的治疗。

在本发明的一个实施方案中，含有包含硫氧还蛋白单半胱氨酸反应性位点的蛋白质的组合物(包括本发明的药物组合物)进一步用在使用还原剂初始还原后将所述硫氧还蛋白活性位点维持在还原状态的一种或多种试剂配制。本发明中使用的这些还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、硫辛酸、NADH或NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、还原型谷胱甘肽、二硫代乙醇酸、2-巯基乙醇、三-(2-羧乙基)磷杂环戊二烯、N-乙酰基半胱氨酸、NADPH、NADH和其他生物或化学还原剂。

如上文所讨论，以将组合物和特别是包含硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质和/或组合物中的任何其他化合物有效递送至靶位点(例如，有待用蛋白质和化合物治疗的粘液或痰液，将是或是在有待用重组核酸分子治疗的粘液或痰液的环境中的靶标宿主细胞)的方式将组合物(包括本发明的药物组合物)施用至患者。合适的施用方案包括任何体内或离体施用方案。

根据本发明，有效施用方案(即以有效方式施用本发明的组合物)包括导致含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质和/或组合物中的其他化合物与有待治疗的粘液或痰液接触的合适剂量参数和施用模式，优选地使得患者从这种施用获得一些可测量、可观测或感知的益处。在一些情况下，通过从患者对粘液或痰液取样，可使用如本文所述的方法来确定有效剂量参数来评估粘液或痰液粘稠度或液化。可选地，如果患者是人类，则可使用体外样品、体内动物模型和最终临床试验通过实验来确定有效剂量参数。可以使用本领域中用于特定疾病或病状的标准方法来确定有效剂量参数。这些方法包括例如测定存活率、副作用(即毒性)和疾病的进展或消退，以及相关生理参数如每秒用力呼气量(FEV1)。

根据本发明，向患者施用本发明组合物的合适方法包括适于将组合物递送至患者中的所需位点的任何体内施用途径。优选的施用途径将是本领域技术人员显而易见的，取决于化合物是蛋白质或其他化合物(例如，药物)，组合物将施用至身体什么部分，和患者所经历的疾病或病状。一般来说，单半胱氨酸活性位点硫氧还蛋白的体内施用的合适方法包括(但不限于)真皮递送、气管内施用、吸入(例如，气雾剂)、经鼻、口服、肺部施用，和导管注入。耳部递送可以包括滴耳剂，鼻内递送可以包括滴鼻剂或鼻内注射，并且眼内递送可以包括滴眼剂或使用适于使药物通过巩膜的装置。气雾剂(吸入)递送也可以使用本领域中的标准方法来进行(参见例如Stribling等,《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)189:11277-11281,1992，其以全文引用的方式并入本文中)。口服递送可以包括可经口服用的固体和液体，例如以片剂或胶囊形式，以及被配制成食品和饮料产品或动物饲料或饲料颗粒。可用于粘膜组织的其他施用途径包括支气管、鼻内、其他吸入、直肠、局部、透皮、阴道、经子宫颈、子宫颈周围和尿道途径。另外，施用方案可包括预处理装置，例如在隔膜中施用蛋白质、肽或组合物(例如向子宫颈)以用于诸如不孕不育等应用中。在本发明的一个优选实施方案中，当施用本发明的蛋白质或组合物以治疗呼吸道(气道)中的过度或异常粘稠或粘着的痰液或粘液时，通过如下途径施用含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽(或组合物)或其他化合物，所述途径包括(但不限于)吸入(即通过例如在表面活性剂中或利用表面活性剂吸入气雾剂)；经由支气管镜、气管内插管和/或经由任何人工换气装置直接安装到肺；鼻施用(鼻内或经鼻)、支气管或气管内(即通过直接注射至气管或气管切开术)，直接地或经由脂质包封或表面活性剂。本发明涵盖将组合物或蛋白质引入气道中以使得它可以接触其中的粘液或痰液的任何可能的方法。

在本发明的方法中，组合物(包括药物组合物)可以施用至脊椎动物纲的任何成员，包括(但不限于)灵长类动物、啮齿动物、家畜、鸡、火鸡和家养宠物。优选保护的患者是人类。

本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，其包含含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽，其中所述单半胱氨酸活性位点中的半胱氨酸共价结合至粘液蛋白质中的半胱氨酸残基。粘液蛋白质包括(但不限于)呼吸道粘液蛋白质和消化道粘液蛋白质。粘液蛋白质包括粘蛋白，如高度二硫键键合的粘蛋白MUC5AC和MUC5B。例如，在N端硫氧还蛋白活性位点半胱氨酸与粘液蛋白质的二硫键进行硫醇交换反应的初始催化反应后，含有硫氧还蛋白单半胱氨酸的蛋白质或肽可以经由N端半胱氨酸共价结合至粘液蛋白质并且因此难以反复还原和催化。含有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白与其粘蛋白靶标的共价连接通过多价螯合在粘液上而防止硫氧还蛋白的细胞摄取和内化，这具有双重益处：防止由于细胞内不希望的硫氧还蛋白活性而造成的上皮摄取和脱靶效应，同时促进粘液连接的耗尽药物从身体清除。

本发明的另一个实施方案涉及一种在具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者中降低粘液或痰液的粘稠度的方法，其通过施用包含含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的组合物，其中所述蛋白质共价结合至粘液蛋白质中的半胱氨酸残基。在一个方面，所述粘液蛋白质是粘蛋白。在另一个方面，所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点呈还原状态。在另一个方面，所述粘液蛋白质可以是呼吸道粘液蛋白质或消化道粘液蛋白质，或生殖道粘液蛋白质。

本发明的另一个实施方案涉及一种在具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者中降低粘液或痰液的粘稠度的方法，其通过使所述患者的粘液或痰液与包含二硫键还原剂和半胱氨酸阻断剂的组合物接触。所述二硫键还原剂和半胱氨酸阻断剂可以是相同的分子，包括(但不限于)含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽，或者他们可以是不同的分子。所述二硫键还原剂可以是二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、GSH、二硫代乙醇酸、2-巯基乙醇、N-乙酰基半胱氨酸、三-(2-羧乙基)磷杂环戊二烯，或本领域已知的其他药学上相容的还原剂。所述半胱氨酸阻断剂可以是碘乙酰胺、碘乙酸、或其他烷基化剂、或半胱氨酸特异性抗体或其他亲和力编码蛋白质或肽组合物或抗体模拟物。所述半胱氨酸阻断剂结合至在键被还原之前在粘液蛋白质中的二硫键中的半胱氨酸。所述半胱氨酸阻断剂防止粘液中的半胱氨酸的硫醇基团再形成二硫键。

本发明的另一个实施方案涉及一种治疗具有过度粘稠或粘着的粘液的患者的方法，其通过向所述患者施用包含不能细胞摄取的具有硫氧还蛋白活性位点的至少一种化合物的组合物。所述化合物可以是包含硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。所述化合物也可以是包含硫氧还蛋白部分和细胞表面受体配体部分的融合蛋白。在这个实施方案中，细胞表面受体配体部分结合至细胞表面受体，从而防止融合蛋白的细胞摄取。所述化合物可以是包含硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽与用于对应于SEQIDNO:12的第35位半胱氨酸的半胱氨酸的阻断化合物的组合。在一个优选的实施方案中，所述阻断化合物可以是结合至硫氧还蛋白分子并因此阻断SEQIDNO:12的第35位半胱氨酸的抗体或抗体模拟物。在这方面，术语“阻断”是指干扰SEQIDNO:12的第35位半胱氨酸例如以与SEQIDNO:12的第32位半胱氨酸形成分子内二硫键的能力。

本发明的另一个实施方案涉及一种在患者中防止全身暴露于药物物质的方法。所述方法包括通过包括(但不限于)经肺、口服或局部递送途径的递送途径将药物施用至患者的步骤。所述药物一旦施用就可以与其靶位点形成共价键。这种作用机制不同于已知的药物作用机制，因为许多药物通过分子相互作用起作用，其中配体在分子与受体可逆结合下结合于所述受体。在一个优选的实施方案中，所述药物物质是含硫醇药物，其中所述硫醇基团与另一个硫醇基团在其靶位点形成共价键。例如，所述药物可包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。在另一个优选的实施方案中，所述靶位点是胞外并且所述药物是通过胞外递送途径施用的。

本发明的另一个实施方案涉及一种药物组合物，其包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽并且还包含能够稳定化氧化还原活性硫醇基团的至少一种糖或糖衍生物。所述糖或糖衍生物可以是蔗糖、三氯蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖、甘露糖或甘露糖醇。氧化还原活性硫醇基团是指可以还原状态(-SH)或氧化状态(-S-S-)存在的硫醇基团。术语“稳定化”包括例如当多肽与糖或糖衍生物一起存在于药物组合物中时，相对于省去糖或糖衍生物的组合物，降低呈还原状态的氧化还原活性硫醇基团的氧化速率。“糖”是指任何单糖、二糖、低聚糖或多糖。糖的实例是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖、菊糖、葡聚糖、海藻糖、三氯蔗糖、甘露糖和甘露糖醇。糖衍生物是指结构上类似于衍生其的糖的化合物。例如，三氯蔗糖是一种氯化蔗糖，其被认为是蔗糖的糖衍生物。其他衍生物包括例如糖醇衍生物，例如甘露糖醇和木糖醇。本发明的优选组合物包含非还原糖，例如棉子糖、海藻糖、水苏糖和特别是蔗糖。

本发明的另一个实施方案涉及一种动物饲料组合物，其包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。动物饲料的实例包括(但不限于)甘草、青贮料、压缩和颗粒饲料、油和混合口粮、发芽谷物、豆类、作物秸秆、粮食、谷类作物和玉米。

以下实施例是出于说明目的提供，而不打算限制本发明的范围。

实施例

实施例1

本实施例说明了野生型Trx(本文也称为“rhTxr”)和单半胱氨酸活性位点rhTrx(本文也称为“r(Cys)hTrx”)蛋白质的表达和纯化。通过如以全文引用的方式并入本文中的Harris等,BiotechnolBiogen109:1987-97(2012)所述对人类Trx-1DNA序列进行密码子优化来最大化rhTrx和r(Cys)hTrx的蛋白质表达水平和转录后表达保真度。将合成构建体克隆到合适的载体中用于在大肠杆菌中产生，这允许在μg规模上产生野生型和单半胱氨酸活性位点r(Cys)hTrx突变蛋白。在实验室规模下评估若干表达标签和纯化策略，以及亲和力裂解来促进从内毒素和内源性宿主硫氧还蛋白中纯化。

在大肠杆菌中制备rhTrx和r(Cys)hTrx。将编码105氨基酸成熟rhTrx蛋白(包括起始子甲硫氨酸)的rhTrx基因优化用于大肠杆菌表达并合成(DNA2.0,Inc.)。将所述基因亚克隆到pEV载体中，所述载体含有诱导型T7启动子、卡那霉素抗性标记、对于Ni亲和纯化的6-组氨酸标签和烟草蚀刻病毒蛋白酶裂解位点(TEV)。为了表达rhTrx，将rhTrxpEV质粒(通过测序验证)转化到C43大肠杆菌(Lucigen)中生长至光密度为约0.6(600nm)并用异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导。使用均质化和去污剂裂解接着离心从大肠杆菌细胞中提取蛋白质。使用Ni亲和色谱法从大肠杆菌裂解物中纯化rhTrx。将Ni亲和纯化的rhTrx进行蛋白酶裂解(TEV)以除去镍亲和标签并且使用离子交换色谱法和反相高压液相色谱法(HPLC)进一步纯化。通过SDS-PAGE和离子喷雾质谱(LC/MS/MS)评估蛋白质的纯度并且通过rhTrx的胰蛋白酶裂解和接着离子阱质谱来验证蛋白质的序列。分别通过二辛可宁酸测定法(Pierce)和鲎血细胞测定法(CharlesRiverLab.)来测定蛋白质浓度和内毒素浓度。遵循类似方法来制备r(Cys)hTrx蛋白，但其中将r(Cys)hTrx基因优化并通过DNA2.0合成。使用DTT在体外将这些rhTrx和r(Cys)hTrx蛋白还原，随后通过透析和脱盐柱处理来除去DTT。

实施例2

本实施例中描述利用成熟蛋白质的直接表达而非亲和结合方法对于天然rhTrx和单半胱氨酸活性位点rhTrx(r(Cys)hTrx)蛋白的优选表达、纯化和还原(激活)策略。使用细菌发酵标准技术利用多种常见组成型或诱导型启动子系统在大肠杆菌BL21和K12衍生宿主的摇瓶分批培养和补料分批发酵中产生r(Cys)hTrx和天然Trx对照蛋白，但是糖诱导型或IPTG诱导型系统是优选的，因为这些产生最高表达菌株。在通过微流化仪进行细胞破坏后，通过离心收集含有可溶性Trx的上清液并用硫酸铵(AS)处理以优先沉淀宿主细胞蛋白质。使用超滤/渗滤(UF/DF)来过滤所得Trx富集上清液以使得缓冲液交换为15mMHepes、10mMβ巯基乙醇(b-ME)、250mMNaCl。在这种缓冲液中，Trx不结合于Q-SepharoseHP阴离子交换色谱(AEC)树脂，而DNA和其他杂质以高亲和力结合。在高盐AEC后，对于第二AEC步骤在Hi-TrapQ-HP柱(GEHealthcare)上在还原条件(10mMDTT)下将富集Trx的流过物交换为低盐缓冲液，接着缓冲液交换为制剂缓冲液(下文描述)。可选地，在AS沉淀后，在30kD截止下过滤可溶性级分并装载至疏水性相互作用色谱(HIC)柱上。将洗脱的物质浓缩并使用1KD的UF/DF盒进行缓冲液交换并装载至SourceQ(阴离子交换)柱上。使用盐梯度从离子交换柱洗脱硫氧还蛋白并且然后进行另一个UF/DF步骤以交换为储存缓冲液。

使用鲎血细胞裂解物试剂盒(LAL,Pierce)对内毒素进行定量并且使用0.2微米MustangE过滤器(Pall)除去任何残余内毒素。通过SDS-PAGE和免疫印迹法/ELISA在适当步骤下确定蛋白质身份和产率，并且通过MALDI和电喷质谱法验证总质量和最终序列同一性。使用DTNB(Ellman试剂)还原测定法来定量Trx制剂的还原活性。将50微升的2.5mMrhTrx或r(Cys)hTrx添加至96孔板，接着添加175微升样品缓冲液和25微升6mMDTNB(5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸))。通过添加DTNB起始反应后，在15分钟后在30℃下通过分光光度法测量由于DTNB还原造成的412nm下吸光度变化。

将例如下文所讨论的多种储存缓冲液条件用于与冻干的相容性和其稳定化r(Cys)hTrx的还原状态的能力。缓冲液条件包括低pH与还原糖、含10mMb-ME的乙酸铵pH5.5，以及先前鉴定为增强还原的天然Trx的储存稳定性的缓冲液制剂(40mM乙酸钠pH5.5、0.05％EDTA、9.25％蔗糖)。每种缓冲液条件下将Trx冻干并以干燥形式储存不同时间，并且使用如上所述的DTNB和蛋白质活性测定法来评估储存蛋白质的氧化还原稳定性。对于气雾剂稳定性评估，可使用Penn-Century气雾器或喷雾器。在不同温育时间点将气雾剂化合物采集到0.1MTris缓冲液pH8.0、含有DTNB的1mMEDTA中，以确定r(Cys)hTrx和天然rhTrx的气雾剂稳定性。聚集体预期不会与DTNB反应，因此仅将检测到还原形式。使用DTNB的消光系数(在412nm下为14150)来计算随回收蛋白质浓度而变化的游离硫醇(SH)基团。关于天然rhTrx的气管内(IT)递送的先前研究(Rancourt,R.等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicBiolMed),42(9):1441-1453,2007)使用生理盐水。还可包括添加已知与吸入递送相容的氧化还原稳定化剂如甲硫氨酸。

实施例3

本实施例说明了用于表达r(Cys)hTrx和天然rhTrx的构建和大肠杆菌菌株。利用不同的载体系统和大肠杆菌的实验室BL21或K12菌株，r(Cys)hTrx和天然rhTrx对照容易以成熟的可溶性蛋白质形式表达。为了产生更高产率(>1g/L)的表达Trx的大肠杆菌菌株，使用不同的胞内启动子系统合成密码子优化的r(Cys)hTrx和天然rhTrxDNA序列并克隆到多种表达载体中，所述启动子系统包括基于营养素耗尽的可诱导系统、糖可诱导系统(例如，鼠李糖、木糖、蜜二糖或本领域中已知的其他可诱导启动子，例如美国专利7871815)，或基于来自噬菌体T3、T5或T7的启动子的IPTG可诱导系统。在DNA序列证实后，将表达构建体转化成不同的常用BL21/K12大肠杆菌宿主菌株，包括被工程改造以缺乏用于诱导的分子利用的菌株，或其还可能已包括过度表达的甲硫氨酸氨基肽酶以改进在高滴度下表达的保真度(Liu,M.等,《蛋白质表达和纯化》(ProteinExprPurif)84(1):130-139,2012)。使所得生产宿主/载体组合在培养基中生长至高通量形式深孔微量滴定板，在基本培养基中在30-37℃下振荡并使用本领域中常用的方法如凝胶或毛细管电泳针对表达进行筛选。通过SDS-PAGE和免疫印迹法和/或ELISA/ELISPOT证实阳性克隆。进行菌株的补料分批发酵并且通过SDS-PAGE和免疫印迹法和/或ELISA/ELISPOT评估蛋白质(r(Cys)hTrx)的产率。使用上文实施例1和2中所述的方法将蛋白质纯化和还原，并且通过DTNB测定法评估活化蛋白的还原状态和通过胰岛素还原测定法评估特定二硫键还原活性。通过质谱法(MALDI或电喷雾)分析序列同一性以确定翻译保真度和适当的分子量。

实施例4

本实施例说明了野生型和单半胱氨酸活性位点rhTrx的体外活性和功能。通过在标准显色DTNB测定法中测量rhTrx的还原活性并且通过测定其抑制嗜中性弹性蛋白酶活性的能力来评估rhTrx的活性。另外，通过使用痰液压缩测定法，和任选地通过使用专用流变仪检查CF痰液的粘弹性降低来测定r(Cys)hTrx相比于rhTrx将人类CF粘液液化的能力。将rhTrx和r(Cys)hTrx与护理标准CF粘液溶解Pulmozyme(rhDNA酶I；阿法链道酶)进行比较。

rhTrx的初始表征：还原活性。使用如先前所报道(Rancourt,R.等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicBiolMed),42(9):1441-1453,2007)的DTNB还原测定法来定量预还原的Trx制剂的一般还原活性。对于rhTrx和r(Cys)hTrx的酶促还原，将含有5或50mMrhTrx和0.5mM纯化TrxR的50微升测定缓冲液(100mM磷酸钾pH7.0、10mMEDTA和0.05mg/ml牛血清白蛋白)添加至96孔板。接着添加175微升含有720mMNADPH的样品缓冲液，接着25微升的含6mMDTNB的样品缓冲液。为了测量化学上预还原的rhTrx的还原活性，将50微升的2.5mMrhTrx添加至96孔板，接着添加175微升的样品缓冲液和25微升的6mMDTNB。通过添加DTNB起始反应后，在30℃下通过分光光度法监测由于DTNB还原造成的412nm下动态吸光度变化。遵循相同的方案，对r(Cys)hTrx进行这种测定法以及下文所述的那些。r(Cys)hTrx的总还原活性小于rhTrx，这反映出r(Cys)hTrx中存在一种较少还原的Cys。然而，两种蛋白质都被还原至其潜在还原状态的90-95％以上，这反映出完全激活。

嗜中性弹性蛋白酶(NE)活性的抑制。先前已经描述了用于测定rhTrx对NE活性的影响的温育系统(Lee,R.等,(2005)《美国生理学杂志：肺细胞和分子生理学》(AmJ.Physiol.LungCell.Mol.Physiol.)289(5):L875-882)。简言之，将Trx在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.2)中稀释至所需浓度。将混合物添加至纯化的人类NE(100毫克/毫升，在PBS中，pH7.2，0.01％TritonX-100)并在37℃下温育1小时。温育期间的最终体积为210微升，并且NE的浓度为1.6微克/毫升。在温育后，对60微升等分试样一式三份地测试弹性水解活性。通过向实验样品中添加120微升的含0.8mMN-甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val4-硝基酰苯胺的PBS(pH7.2)来测定弹性蛋白酶活性并且在37℃下在405nm下监测动态吸光度，持续4分钟。这些实验中所用的弹性蛋白酶的浓度测定为在测定法的线性范围内。NE活性抑制百分比被测定为：抑制百分比＝(1-实验组的吸光度变化/PBS对照组的吸光度变化)。发现r(Cys)hTrx的弹性蛋白酶活性至少与rhTrx相当。

评估人类CF痰液的液化的压缩测定法。对于所有操纵，在微生物学护罩下处理CF痰液。将相关浓度的rhTrx、r(Cys)hTrx或单独地稀释剂(25微升)添加至1.5mlEppendorf锥形管中的CF痰液(275微升)并通过非常短暂的涡旋混合。在37℃下温育30分钟后，再次短暂地混合样品并装载到血细胞比容管中并在两端密封。在血细胞比容离心机中离心5分钟后，通过直接线性测量来确定固体(凝胶)百分比和液体百分比并且以液体百分比表示如下：100×液体/(液体+固体)。对于每种条件，一式三份地测量来自至少五个不同CF患者的痰液。r(Cys)hTrx的液化能力与rhTrx至少相当或更大，这反映出r(Cys)hTrx作用机制的出乎意料的效能。

痰液粘弹性测定。这些测量是使用锥板式流变仪进行的以及在用硫氧还蛋白处理后直接观测痰液流动来定性测量。使用与上述相同的痰液处理方案来进行温育。在37℃下使用AR-1000流变仪(TAInstruments,NewCastle,DE)在振荡模式中在1弧度/秒的角速度下评估粘弹性。对于Trx的每种制剂，在获自至少5个不同CF患者的痰液中一式三份地评估降低痰液粘弹性的能力。预期降低r(Cys)hTrx的痰液粘弹性的能力与rhTrx至少相当或更大，这反映出r(Cys)hTrx作用机制的出乎意料的效能。通过观察与rhTrx或r(Cys)hTrx混合的痰液在倒置Eppendorf管中的流动速率来进行痰液粘弹性测量，并且在这种测定法中发现r(Cys)hTrx的流动相比于rhTrx、DTT和Pulmozyme规模更大，并且远远大于阴性(媒介物)对照，所述阴性对照基本上不展现痰液流动。

与护理标准粘液溶解剂(rhDNA酶)的功效比较。对于这些研究，通过如上所述温育来比较rhTrx、r(Cys)hTrx和rhDNA酶的相关浓度。30分钟后，对样品评估痰液液化改变(压缩测定法)和粘弹性改变。另外，进行协同作用研究。其中，使痰液样品暴露于rhTrx30分钟并且然后暴露于rhDNA酶30分钟，并且可选地暴露于rhDNA酶30分钟，接着暴露于rhTrx30分钟。将这些结果与单独任一试剂的作用进行比较。对于每种条件，一式三份地测量来着至少五个不同CF患者的痰液。在给定天从单独的供体获得足够痰液以测试野生型和突变rhTrx变体的各12个样品(rhTrx×3、rhDNase×3、rhTrx+rhDNA酶×3、rhDNA酶+rhTrx×3)。实际上，这最低限度地是来自单一供体/天的4.5-5.0ml充分混合的痰液。r(Cys)hTrx的液化能力与rhDNA酶、rhDNA酶、rhTrx或DTT阳性对照至少相当或更大。

人类CF痰液采集。痰液获自如通过健康护理提供者所确定的成人和儿科CF患者。如果患者显示出临床症状并且在两个独立的毛果芸香碱离子电渗汗液测试中具有超过60毫摩尔的汗液氯化物值并且在后续遗传分析中展现出两种产生等位基因CF的突变，则所述患者被诊断患有CF。通过自发排痰或高渗盐水诱导提供所有样品。弃去含有明显的可检测唾液的痰液样品。痰液在递送至实验室前都保持在冰上，然后保持在-80℃直至用于O形环密封小瓶中以防止干燥。

实施例5

本实施例说明了含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽相比于含有野生型硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽的酶活性(图1b)和非酶活性(图1a)。如图1a中所示，非特异性5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB或Ellman试剂)还原反映了相比于野生型，在硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点中损失一个可还原半胱氨酸。如图1b和图2中所示，在人类痰液压缩测定法中含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽相比于含有野生型硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽令人惊讶地显示更大的效能，以及在等摩尔基础上相对于DNA酶或NAC更大的效能(图2)。这种结果是出乎意料的，考虑到由于Cys35突变造成的在活性位点处的大量修饰，并且在现有DTNB测定法中观测到由于损失一个可还原Cys残基，总还原能力是天然硫氧还蛋白的4/5。硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点效能实现令人惊讶的增加是由于与粘蛋白蛋白质Cys残基的共价连接，其具有意料之外的后果：防止这些Cys再形成新的二硫键。

实施例6

本实施例说明了r(Cys)hTrx(呈还原的活性状态)相比于天然rhTrx刺激培养的原代人类支气管上皮细胞(HBE)释放促炎细胞因子的倾向性降低。在关于保护人类受试者权益的批准方案的赞助下，提供供体组织和细胞。通过如先前所述(Fulcher,M.L.,《分子医学方法》(MethodsMolMed)107:183-206,2005)的酶消化采集来自正常(即，非患病)肺的HBE细胞。将解聚的HBE细胞在明确定义的气道细胞培养基(Fulcher,M.L.,2005同上)中以2.5×10⁵/cm²的密度接种在12mm直径Transwell透明支架(Corning)上。在空气-液体界面保持培养直至在使用前完全分化(约4-6周)。

硫氧还蛋白递送方案：对于这项研究，利用能够向HBE培养物表面递送纳升体积的测试剂(或对照)的装置。这个系统被设计成体外模型系统以模拟雾化药物的超细雾向气道上皮细胞表面的体内递送，并且呈现研究添加治疗剂如r(Cys)hTrx的作用的理想方式。基于多路径粒子剂量学建模的结果(Anjilvel,S.等,FundamApplToxicol28(2):41-50,1995)，其展示出PariLCStar喷雾器在前20代气道上的平均沉积速率，在15分钟的过程内，前6代气道上的平均沉积预计为约50nl/min/cm²，其中大多数粒子预期被递送。在这些研究中，以750nl的总体积(经15分钟)喷雾至总共五个不同的实验组。这些包括：1)媒介物对照(等渗盐水)、2)天然重组Trx(500μm)，和3)三个剂量的r(Cys)hTrx(10μm、250μm和1000μm)。这些浓度代表“最终”气道表面浓度。在每种测试试剂(或媒介物对照)喷雾后，使培养物返回到组织培养箱并在细胞因子分析之前温育24小时。

细胞因子免疫测定法：在这些研究中，评估天然和r(Cys)hTrx)对于由HBE细胞释放的四种主要细胞因子(包括IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β)的刺激的影响。使用市售酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&Dsystems)测量不含细胞、未浓缩的培养上清液中的细胞因子。在所有五组喷雾后24小时获得基底侧ALI培养基(Fulcher,M.L.,2005，同上)的样品，并且在分析前冷冻。作为背景对照，从所有值减去洁净的(未使用的)ALI培养基。对于每个细胞因子分析，使用三组十个一组的浓度的阳性对照来生成适当标准曲线。另外，一式两份地分析每个“未知”样品。所测量的细胞因子是：TNF-α(检测下限为0.3pg/ml)、IL-6(检测下限为0.35pg/ml)、IL-8(检测下限为2.4pg/ml)和IL-1β(检测下限为1.5pg/ml)。这些测定法彼此和与其他重组人类细胞因子(IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、肿瘤坏死因子-S、粒细胞集落刺激因子和转化生长因子-Ill)的交叉反应性先前已显示都低于检测限。

样品大小和统计学分析：对总共九个单独的HBE培养物评估各五种条件。这表示来自三个不同患者(n＝3)的三个培养物(n＝3)。这种方法在统计学上充分有效以提供对于每种条件的样品间和样品内变化的理解。对于数据分析，使用双尾Studentt检验进行单独的样品/组之间的比较。对于多个组比较，使用单向方差分析(ANOVA)。所有分析的显著性被设定为p<0.05。

在来自CF患者供体的HBE培养物中的r(Cys)hTrx的促炎性评估。人类CF原代气道上皮细胞培养：基于由Schlegel和同事(Liu,M.等,《蛋白质表达和纯化》(ProteinExprPurif.)84(1):130-139,2012；Suprynowicz,F.A.等,《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.).109(49):20035-20040,2012)报道的方法，使人类原代气道上皮细胞在具有粘液纤毛分化的空气-液体界面处增殖和培养的最新技术。这些方法允许原代气道上皮细胞的几乎无限供应，所述细胞仍能够在ALI终末分化，而没有遗传操纵。经30天将来自三个独特CF供体中的每个的30个孔培养至ALI分化，对于F508del是纯合型。将培养物的顶端表面暴露于三种浓度(10μM、250μM和1000μM)的rhTrx(野生型)和r(Cys)hTrx，接着在暴露激发后4小时和24小时采集顶端和基底侧样品(参见表1)。所用的培养基是不含血清的，离心以除去碎片并储存在-80℃下直至使用。对从顶端和基底侧培养基获得的所有样品进行关于人类炎性细胞因子的ELISA测定法。通过将200μL无菌PBS放置在顶端表面上并且在15分钟温育后将此回收来采集顶端。对于每个样品一式两份地进行关于IL-8和IL-6的ELISA(Becker,M.N.等,《美国呼吸与危重症监护医学杂志》(AmJRespCritCareMed)169(5):645-653,2004)。对于三个CF供体中的每个重复上述涉及30个ALI培养物的计划。天然rhTrx和r(Cys)hTrx的结果比较表明，硫氧还蛋白诱导促炎性细胞因子从CF患者的分化的气道上皮细胞释放的倾向性在所测试浓度下在单半胱氨酸Trx中相对于天然是衰减的。

表1

暴露后的

稀释剂

rhTrx

r(Cys)hTrx

r(Cys)hTrx

r(Cys)hTrx

时间	对照	(500μM)	(10μM)	(250μM)	(1000μM)
						4小时	3	3	3	3	3
24小时	3	3	3	3	3

实施例7

本实施例说明了r(Cys)hTrx相对于天然rhTrx对于从体外HBE细胞培养物采集的均匀粘液的作用的生物物理和生物化学表征。

细胞培养物粘液的制备：如所述使人类支气管上皮细胞生长并维持(Matsui,H.等,《临床研究杂志》(JClinInvest)102(6):1125-1131,1998)。简言之，将从培养物采集的粘液汇集并储存在4℃。将样品装载到透析管(MWCO＝3,500)中并用聚合物吸收剂(Spectra/Gel)在4℃下浓缩1-5天。然后在4℃下将浓缩的粘液针对含有500μMMgCl₂和800μMCaCl₂的PBS进行透析以建立适当的盐平衡(Matsui,H.等,《美国科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA)103(48):18131-18136,2006)。

宏观流变学：使用锥板式和平行式几何结构的BohlinGemini流变仪进行浓度和时间过程测定法来评估还原的r(Cys)hTrx和天然硫氧还蛋白对体外HBE粘液特性的整体、宏观生物物理学影响。进行蠕变恢复实验，其中向处理粘液或控制粘液施加已知的应力(0.05至约100Pa)持续10秒，并且再记录流体的流变学恢复持续50秒。在连续操作中，所施加的应力以对数方式增加，直至达到流体的屈服应力(即流体的粘度突然和急剧下降时的应力)。根据所测量的参数，测定流体的粘度和弹性随所施加应力的变化。频率扫描在两个恒定应力和应变下进行并用于确定粘液的基线物理特性(分别是G'和G”)，以及流体的粘度和剪切变薄行为。所有实验都在23℃下进行。

高压液相色谱法：通过差示折射法评估处理粘液和对照粘液中的粘蛋白的浓度和分子质量以确定天然硫氧还蛋白和r(Cys)hTrx对粘蛋白结构的影响。将样品(500μl)装载到SepharoseS1000柱(AmershamPharmacia)上，并用流速为0.5ml/min的200mM氯化钠/10mMEDTA洗脱。使用与Wyatt/OptilabDSP干涉折射计耦合的在线DawnEOS激光光度计来分别测量光散射和样品浓度(WyattTechnologyCorporation)。通过将与柱的空隙体积中洗脱的材料相关的折射率峰积分并使用0.165ml/g的折射率增量(dn/dc)值(其先前已经在650nm下测量并发现可再现率在5％内)来计算粘蛋白的浓度。通过类似方法但利用G-25柱(dn/dc＝0.170)来测定给定粘液样品的总蛋白质含量(粘蛋白和小蛋白质)。通过从粘蛋白和蛋白质含量的总质量(通过经G-25柱洗脱样品来检测)中减去粘蛋白含量质量(通过经S-1000柱洗脱样品来测定)来确定样品的非粘蛋白(或小蛋白质)含量。相比于基于凝胶的方法，例如还原或非还原PAGE，差示折射法的优点在于可获得精确的分子量和分子量分布，而非定性比较。这些技术的定量优势对于大糖蛋白如粘蛋白的研究是特别重要的，其中不存在尺寸标准并且分子量通常超过1MDa(Gillis,R.B.等,《碳水化合物聚合物》(CarbohydrPolym)93(1):178-183,2013)。

碳水化合物和蛋白质印迹法：通过对完整HBE粘液进行蛋白质印迹分析来评估硫氧还蛋白处理对粘蛋白精细结构的潜在影响。将样品的50-200μL等分试样装载至硝基纤维素膜上并且施加真空五分钟以将整个装载样品牵引至膜中。将样品在蒸馏水中洗涤2次。对于碳水化合物含量的过碘酸雪夫氏(PAS)测定法，将装载并洗涤的样品在中含有0.25％过碘酸+3％乙酸的水中温育30分钟。在两次蒸馏水洗涤后，将样品在NaMBS溶液(0.1％偏硫酸氢钠、1％HCl)中温育两次，每次持续五分钟。接着，将样品用Schiff试剂温育5-15分钟并用NaMBS洗涤两次，用蒸馏水洗涤一次，和快速真空干燥。在装载和第一次蒸馏水洗涤后，用含1％牛奶的TBST缓冲液(1.21％TrisHCl、8.76％NaCl和0.5％Tween，pH8)阻断蛋白质特异性抗体印迹。在两次五分钟TBST洗涤后，将样品在一次抗体(对于MUC5AC是MAN-5ACI，对于MUC5B是MUC5BIII和K5B)中温育30分钟。在TBST中两次额外五分钟洗涤后，将样品在二次抗体中温育两小时。使用Li-CorOdyssey红外探测器使膜印迹显色。另外，可使用抗硫氧还蛋白抗体来检测单半胱氨酸对结合于粘蛋白的天然硫氧还蛋白。相比于标准的Western免疫印迹法，在PAGE凝胶上分离后，这种直接的印迹方法允许更快速和精确地测定粘蛋白含量并且可视化和定量单半胱氨酸活性位点硫氧还蛋白(r(Cys)hTrx)与粘蛋白二硫键之间的共价相互作用。

实施例8

本实施例说明了单半胱氨酸活性位点Trx(r(Cys)hTrx)使天然rhTrx在气管内递送至大鼠和小鼠之后在肺中诱导促炎和病理生理作用的倾向性衰减的能力。

在经气管内给与r(Cys)hTrx和天然rhTrx的正常大鼠中评估促炎细胞因子释放和细胞迁移。为了测定r(Cys)hTrx相比于天然rhTrx诱导促炎性信号传导的能力，在利用气管内(IT)递送递增浓度的硫氧还蛋白的大鼠中，相比于媒介物对照进行比较性体内研究。两种研究组分为：1)初步研究，被设计以重复利用纯化的天然rhTrx获得的先前研究结果(Rancourt,R.等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicBiolMed),42(9):1441-1453,2007)，和2)主要研究，比较r(Cys)hTrx与天然rhTrx的促炎作用。所有研究都利用经过纯化的不含内毒素的蛋白质，其已经用DTT或其他合适的还原剂处理以还原(激活)Trx活性位点Cys残基。在还原后，通过尺寸排阻色谱法除去DTT或还原剂。通过体外测定法(DTNB还原)验证TrxCys残基的完全还原并且使用胰岛素还原或HPLC靶标结合测定法来测定r(Cys)hTrx的催化二硫键还原活性。

初步研究：将24只大鼠随机分配至四个实验组，每组六只动物，给药如下：第1组，媒介物对照；第2组，氧化的(非活性)rhTrx；第3组，还原的(活性)rhTrx；第4组，人类血清白蛋白(HSA；阴性对照)。通过IT途径一次性递送所有测试物品。这项研究的终点包括：1)通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行TNF、细胞因子诱导的嗜中性化学吸引剂-2(CINC2)和巨噬细胞炎性蛋白-3(MIP3)的细胞因子分析；和2)利用瑞氏染色(Wright’sstaining)从支气管肺泡灌洗(BAL)进行细胞计数以阐明炎性细胞的百分比(嗜中性粒细胞对巨噬细胞)。第2组(用氧化rhTrx处理)相比于第1组媒介物对照和第4组HSA具有类似的细胞因子活性水平和BAL中的细胞计数。用还原rhTrx处理的第3组相比于第1组和第2组具有增加水平的细胞因子活性和细胞计数。

主要研究：当施用天然硫氧还蛋白rhTRX对r(Cys)hTRX时，大鼠中细胞因子释放的比较。在这项比较性研究中，测定在IT施用rhTrx对r(Cys)hTrx后的体内细胞因子释放和细胞迁移的相对程度。测试三个剂量水平的还原rhTrx和还原r(Cys)hTrx(50μM、200μM和1000μM)。终点与中试研究相同，其中添加了肺组织的免疫组织化学(IHC)分析。在r(Cys)hTrx中，C端活性位点半胱氨酸基序的突变(CXXC变为CXXX)已显示消除了硫氧还蛋白的第二硫醇-二硫键交换能力并导致共价连接至二硫键靶标。肺中的最突出的胞外二硫键靶标(其首先遭遇IT递送的TRX)位于粘液层中以及上皮细胞-表面蛋白质上。因此，与天然rhTrx相比，r(Cys)hTrx与肺上皮细胞和相关粘液的结合增加，并且这种结合可使用抗人类硫氧还蛋白抗体通过IHC检测。从每个组中的两只动物采集肺组织用于在无BAL下进行IHC分析并且与来自每个相同组的两个BAL后动物进行比较。因此，对于每个组关系八只动物，并且两只动物被治疗但在肺采集和IHC之前未经受BAL。r(Cys)hTrx相比于相同剂量水平的rhTrx展现增加细胞因子活性和细胞计数的剂量依赖性能力衰减。

在经气管内给与r(Cys)hTrx的正常大鼠中评估毒性和肺病理学。为了评估r(Cys)hTrx在夸张的给药条件下的肺影响，通过IT途径施用0.5至20mg/kg的多种单一剂量的r(Cys)hTrx，并且评估在给药后第2天和第14天是否已经发生了病理变化。将雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠随机分配至三个实验组，其中每组20只动物(每种性别10只)。对所有动物给与研究前的身体检查。使用媒介物(盐水制剂)作为阴性对照。这些研究的终点包括：1)寻找总不利变化的临床和组织病理学检查；和2)血清的表征以检测测试物品和抗体对测试物品的存在。单半胱氨酸r(Cys)hTrx相比于天然rhTrx在类似剂量下产生不太严重的作用。

在经气管内给与r(Cys)hTrx和天然rhTrx的正常和bENaC小鼠中评估促炎细胞因子释放和细胞迁移。将小鼠用异氟烷短暂麻醉并放置在倾斜的啮齿动物工作台上。使用装配有放大镜的啮齿动物喉镜，使喉直接可视化并且将微型喷雾器(PennCentury)通入气管远端中。将固体体积(25-50μL)的测试物品溶液施用于气道中并且使小鼠恢复。记录气道滴注和安乐死时的体重。遵循机构动物管理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee，IACUC)批准的方案，对每种条件五只小鼠在IT滴注后第6小时进行安乐死并且另一组五只小鼠在IT滴注后第24小时安乐死。用总共1.5mL的具有蛋白酶抑制剂(Pierce)的冷的无菌盐水灌洗气道。采集整个肺并且所有标本被储存在冰上直至进一步处理。将支气管肺泡灌洗液(BALF)离心以使白细胞和其他细胞碎片沉淀。将不含细胞的BALF冷冻在-80℃直至进行ELISA测试。将BAL细胞沉淀物重新悬浮在1mL无菌盐水中并且使用Coulter计数器进行具有差别的总白细胞计数并且对来自染色的cytospin制剂的300个细胞进行手动计数。当已经收集到所有样品时，将BAL流体解冻在冰上并且对KC(IL-8的类似物)、TNFα、IL-6和IL-1β(ElisaTech,Denver,CO)进行ELISA。BALF细胞含量通过％和总白细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞)来表征。

在两种浓度和两个时间点下测试野生型和突变TRX，以及对照动物，来确定对突变和野生型TRX相对于稀释剂对照的急性气道炎性反应(表2)。所述反应表征为：体重变化、BALF中的总白细胞计数、相对和总嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞计数，和上文列出的炎性细胞因子。相比于相同剂量水平的rhTrx，r(Cys)hTrx表现出增加细胞因子活性和细胞计数的剂量依赖性能力衰减，以及副作用。

表2

在经气管内给与r(Cys)hTrx和天然rhTrx的正常和βENaC小鼠中评估病理生理学和炎性作用。Rancourt和同事的先前研究(Rancourt,R.等,《自由基生物学和医学》(FreeRadicBiolMed),42(9):1441-1453,2007)表明，额外(外源)粘度在气道上的存在可显著降低天然Trx对细胞因子释放的刺激。而这可能表明具有较高粘液负担的CF患者可能由于Trx的胞外还原而表现出减少的炎症反应，目前没有关于硫氧还蛋白在具有1)增加的内源粘液产生和2)预先存在的炎症反应(如在CF中)的气道模型中的作用的信息。这些研究的目标是使用慢性粘液阻塞/炎症的小鼠模型来研究天然Trx和r(Cys)hTrx的作用。对于这些研究，使用过度表达ENaC通道的β亚基并在肺中表现出水高吸收的βENaC小鼠模型(Mall,M.等,《自然医学》(NatMed.)10(5):487-493,2004)。所述βENaC小鼠产生过多粘液并形成具有粘液气道堵塞和炎症的CF/COPD样肺表型。这些小鼠先前已在多种临床前研究中用作CF肺病模型(例如，Graeber,S.Y.等,《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志》(AmJRespirCellMolBiol)49(3):410-417,2013)。在本研究中确定1)天然Trx相对于r(Cys)hTrx对气道/肺组织病理学和炎症状态的影响；和2)这些试剂对βENaC小鼠中的粘液负担的影响(参见下文)以研究天然和单半胱氨酸Trx(r(Cys)hTrx)在多种递送剂量下的相对作用并理解慢性粘液过度产生和预先存在的炎症如何调节这些化合物的潜在肺毒性。

测定WT和βENaC小鼠在体内使用三种浓度(100μM、500μM和1000μM)的天然硫氧还蛋白的作用以及与相同浓度下的r(Cys)hTrx化合物的毒性和药物功效的比较。每种条件测试最少七只小鼠。所有化合物都是在给定浓度下经由气管内滴注(10-25μl)施用的。使用单次剂量处理并且在四个时间点(给药后第4小时、第24小时、第72小时和第7天)监测毒性和药物功效。仔细地监测早期时间点(第4小时-第24小时)。如果药物毒性在24小时维持，则监测后期时间点(第72小时至第7天)。预期较低浓度(100μM、500μM)的作用未持续分别超过24小时或第3天。所用的方案允许将小到10μl的体积可靠地滴注至小鼠肺部。简言之，将动物用异氟烷麻醉，放置在小鼠插管平台上，其中使用小的喉镜使咽后可视化。将药物直接滴注至气管(气管内滴注，IT)，或者对于更均匀和更深入的沉积，使用PennCentury装置通过微型喷雾递送25μl。处理后，在适当时间点对动物进行安乐死。采集完整肺用于组织学和支气管肺泡灌洗液用于各种测量，即，细胞计数、粘蛋白含量和还原状态和细胞因子。更详细地说，将左肺通过围绕主支气管的连接线扎紧并以手术方式隔离以用于组织学检查。经由气管切开术和插管使用500μl无菌PBS进行相对的肺(或右叶)的支气管肺泡灌洗。在全肺固定后，通过H&E和AB-PAS染色分析纵向截面以评估炎症和保留的粘液。对BAL分析细胞计数/差异、粘蛋白含量和还原状态(琼脂糖凝胶分离方法和免疫印迹法)，和细胞因子。

样品大小和统计学分析：对于每种条件总共7只小鼠，在各种浓度(100μmol、500μmol、1000μmol)下评估每种化合物。测试两个组，野生型(WT)和βENaC小鼠(表3)。如由下表中的“X”所示，对于总共36种条件×7只小鼠(总共252只小鼠)进行处理和分析以提供对于每种条件的样品间和样品内变化的充分理解。对于数据分析，使用双尾Studentt检验进行单独的样品/组之间的比较。对于多个组比较，使用单向方差分析(ANOVA)。所有分析的显著性被设定为p<0.05。单半胱氨酸r(Cys)hTrx相比于天然rhTrx在类似剂量下产生不太严重的作用，并且这种作用由于βENaC小鼠中存在内源粘液而进一步衰减。

表3

“X”表示时间×所测试的浓度

实施例9

本实施例说明了r(Cys)hTrx相对于野生型rhTrx改进了粘液标准化活性。测定在痰液压缩测定法中等摩尔浓度的野生型rhTrx、r(Cys)hTrx和多种对照包括两种浓度下的二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰基半胱氨酸(NAC)和重组人类DNA酶(rhDNA酶)对于患者痰液样品(每个处理n＝6)的标准化的影响。使用4至6个自发咳出(非诱导)样品进行痰液研究，对于每个实验各自来自至多三个单独的CF患者。从每个样品采集痰液(即粘液)的“有利”部分并组合，并且通过搅拌或轻度涡旋将总样品轻轻地均质化，然后分到各管中并暴露于以下任一种：稀释剂(即Tris缓冲液)、含DTT的稀释剂(在0.58mM和1.5mM下)、含NAC的稀释剂(0.58mM)、含rhDNA酶的稀释剂(0.58mM)、含rhTrx的稀释剂(0.58mM)或含r(Cys)hTrx的稀释剂(0.58mM)。对于每个实验新鲜制备DTT作为阳性对照。图2示出r(Cys)hTrx相比于野生型硫氧还蛋白(在图2中称为“rhTrx”)能够显著增加患者痰液的液化，因此相对于天然Trx和护理标准重组人类DNA酶Pulmozyme^TM(“rhDNA酶”)显示出改进的粘液标准化活性。硫氧还蛋白和DNA酶相比于等摩尔量的NAC又都更有效，通常用作US的粘液溶解外部。使用人类CF患者痰液的这些结果表明，单半胱氨酸r(Cys)hTrx仍然完全胜任CF痰液粘弹性标准化(并且相比于未修饰的天然rhTrx甚至更有效)，但预期共价结合于粘蛋白Cys。然而，小的12kDr(Cys)hTrx穿过肺上皮的可能性通过结合于粘蛋白应该极大地最小化。因而活性r(Cys)hTrx随后进入细胞核并与氧化还原调节靶蛋白如NFkB相互作用的能力甚至进一步衰减，正如由于与免疫细胞上的胞外跨膜结构域相互作用造成的任何信号传导已经关于Trx介导的CD30TNF受体活化被理论化一样(Schwertassek,U.等,EMBOJ26(13):3086-3097,2007)。关于r(Cys)hTrx观察到的增加的效能(图1a、图1b和图2)与分子对粘蛋白Cys的共价结合一致，因为结合的Cys将不同于用天然rhTrx(或实际上，任何小分子硫醇剂)处理而阻止再次形成二硫键。

本文所讨论或引用的每个出版物和其他参考文献都以全文引用的方式并入本文中。

虽然本发明的各种实施方案已经详细描述，但显而易见的是，本领域技术人员将想到那些实施方案的修改和改变。然而，应当明确理解，这些修改和改变在如以下权利要求书中所阐述的本发明的范围内。

Claims (54)

1.一种在具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者中降低粘液或痰液的粘稠度的方法，其包括使所述患者的所述粘液或痰液与包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的组合物接触，相比于所述接触步骤之前，所述蛋白质或肽可有效降低所述粘液或痰液的粘稠度。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述患者具有肺病，其中粘液或痰液的异常或过度粘稠度或粘着性是所述疾病的症状或原因。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述患者具有肺病，其中粘液或痰液的异常或过度粘稠度或粘着性与生物还原剂活性不足相关。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述患者具有选自囊肿性纤维化、慢性阻塞性肺病、支气管扩张、哮喘和消化道疾病的疾病。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述患者具有囊肿性纤维化。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述消化道疾病是球虫病。

7.如权利要求1所述的方法，其中使所述患者的所述粘液或痰液与所述组合物接触的步骤是通过选自经鼻、气管内、支气管、直接安装到肺部、吸入和口服的途径将所述组合物引入到所述患者来进行的。

8.如权利要求1所述的方法，其中有待接触的所述粘液或痰液位于所述患者的呼吸道、消化道或生殖道中。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物于药学上可接受的载体中施用至所述患者。

10.如权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中相比于与所述组合物接触之前，使所述患者的所述粘液或痰液与所述组合物接触的步骤增加了来自所述患者的粘液或痰液样品中的游离硫醇的百分比。

11.如权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中在使所述患者的所述粘液或痰液与所述组合物接触的步骤之后，相比于所述接触步骤之前，所述患者具有至少约2.5％的用力呼气量(FEV)增加。

12.如权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。

13.如权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含氨基酸序列C-X-X-S(SEQIDNO:24)，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。

14.如权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中所述含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽共价结合至粘液蛋白质中的半胱氨酸残基。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述粘液蛋白质是粘蛋白。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述粘液蛋白质选自呼吸道粘液蛋白质和消化道粘液蛋白质。

17.如权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含选自原核硫氧还蛋白、真菌硫氧还蛋白、植物硫氧还蛋白和哺乳动物硫氧还蛋白的硫氧还蛋白。

18.如权利要求1至9和17中的任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含人类硫氧还蛋白。

19.如权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中所述组合物还包含用于还原所述蛋白质的所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的还原剂。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述组合物还包含硫氧还蛋白还原酶。

21.一种用于降低粘液或痰液的粘稠度的组合物，其包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽和至少一种用于治疗过度粘稠或粘着的粘液或痰液的额外药剂。

22.如权利要求21所述的组合物，其中所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。

23.如权利要求21所述的组合物，其中所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含氨基酸序列C-X-X-S(SEQIDNO:24)，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。

24.如权利要求21至23中的任一项所述的组合物，其中所述蛋白质包含选自原核硫氧还蛋白、真菌硫氧还蛋白、植物硫氧还蛋白和哺乳动物硫氧还蛋白的硫氧还蛋白。

25.如权利要求21至24中的任一项所述的组合物，其中所述蛋白质包含人类硫氧还蛋白。

26.如权利要求21至25中的任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含还原剂。

27.如权利要求26所述的组合物，其中所述组合物还包含硫氧还蛋白还原酶。

28.一种药物组合物，其包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽，其中所述组合物被配制用于口服施用，或以气雾剂形式施用至肺部。

29.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。

30.如权利要求28所述的方法，其中所述向肺部的气雾剂施用是通过喷雾器装置。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述喷雾器装置是振动筛喷雾器。

32.如权利要求28至31中的任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含还原剂。

33.一种组合物，其包含含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽，其中所述单半胱氨酸活性位点中的半胱氨酸共价结合至粘液蛋白质中的半胱氨酸残基。

34.如权利要求33所述的组合物，其中所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。

35.如权利要求33至34中的任一项所述的组合物，其中所述粘液蛋白质选自呼吸道粘液蛋白质和消化道粘液蛋白质。

36.如权利要求33所述的组合物，其中所述粘液蛋白质是粘蛋白。

37.一种在具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者中降低粘液或痰液的粘稠度的方法，其包括使所述患者的所述粘液或痰液与包含二硫键还原剂和半胱氨酸阻断剂的组合物接触。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述二硫键还原剂和所述半胱氨酸阻断剂是相同的分子。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述分子是含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。

40.如权利要求37所述的方法，其中所述二硫键还原剂和所述半胱氨酸阻断剂是不同的分子。

41.如权利要求37所述的方法，其中所述二硫键还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、谷胱甘肽、二硫代乙醇酸、2-巯基乙醇、N-乙酰基半胱氨酸和三-(2-羧乙基)磷杂环戊二烯。

42.如权利要求37所述的方法，其中所述半胱氨酸阻断剂选自碘乙酰胺、碘乙酸和其他烷基化剂。

43.一种治疗具有过度粘稠或粘着的粘液的患者的方法，其是通过向所述患者施用包含不能细胞摄取的具有硫氧还蛋白活性位点的化合物的组合物。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述化合物选自包含硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽、包含硫氧还蛋白部分和细胞表面受体配体部分的融合蛋白，和包含硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽与用于对应于SEQIDNO:12的第35位半胱氨酸的半胱氨酸的阻断化合物的组合。

45.一种预防患者中对药物物质的全身暴露的方法，其是在通过选自经肺、口服和局部递送的途径递送后，通过施用与其靶位点形成共价键的药物。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述药物物质是含硫醇药物物质。

47.一种药物组合物，其包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽并且还包含能够稳定化氧化还原活性硫醇基团的至少一种糖或糖衍生物。

48.如权利要求47所述的药物组合物，其中所述糖或糖衍生物选自蔗糖、三氯蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖、甘露糖和甘露糖醇。

49.一种动物饲料组合物，其包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。

50.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述患者是选自哺乳动物和鸟类的脊椎动物。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述患者是人类。

52.如权利要求50所述的方法，其中所述患者是鸡或火鸡。

53.一种包含含有呈还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽的组合物在具有过度粘稠或粘着的粘液或痰液的患者中降低粘液或痰液的粘稠度的用途，其中相比于所述接触步骤之前，使所述患者的所述粘液或痰液与所述组合物接触降低了所述粘液或痰液的粘稠度。

54.如权利要求54所述的用途，其中所述硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自C-X-X-S(SEQIDNO:24)、C-X-X-X(SEQIDNO:17)、X-C-X-X-X-X(SEQIDNO:19)、X-C-G-P-X-X(SEQIDNO:21)、W-C-G-P-X-K(SEQIDNO:23)、X-C-X-X-S-X(SEQIDNO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQIDNO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，其中所述C残基呈还原状态，并且其中所述X残基是除半胱氨酸之外的任何氨基酸残基。