CN1694726A - 用于液化粘液或痰液的产品和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于降低粘稠性或粘着性过高或异常的粘液或痰液的粘稠性和/或粘着性和/或增加其液化的组合物和方法。所述组合物含有包含还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽，并可选还包含还原系统。

Description

用于液化粘液或痰液的产品和方法

技术领域

本发明一般性涉及含有还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽在诱导，增强和/或增加粘液或痰液的液化中的用途。

背景技术

囊性纤维化(cystic fibrosis)(CF)是常见的致命遗传病，其为编码CF跨膜转导调节物即氯化通道蛋白(chloride channel protein)的基因突变的结果。由于该缺陷，体内的上皮对于氯离子转运而言是不可通透的(Boucher等，Lung161：1-17，1983；Welsh，Physiol Rev 67：11443-1184，1987)。尽管包括胰腺、肠和雄性生殖道在内的数个器官受影响，肺中的并发症导致的患病率和死亡率占95％(Means，M.Cystic Fibrosis：the first 50 years.In：Cystic Fibrosis-Current Topics Volume 1，edited by Dodge JA，Brock DJH，and Widdicombe JH.Chichester：Wiley and Sons，1992，p.217-250)。在该疾病影响的肺中，氯离子(chloride)转运进入气道腔导致Na+和液体的过量吸收，从而降低了气道表面液体的体积(Jiang等，Science 262：424-427，1993)。气道表面液体的干燥导致粘蛋白大分子的浓缩，所述粘蛋白大分子是粘液中的凝胶形成组分(Matsui等，Cell 95：1005-1015，1998)。正常粘液的粘弹性有赖于粘蛋白聚合物的浓度，分子量和相互缠结(entanglement)(Verdugo等，Biorheology 20：223-230，1983)。粘蛋白和从快死亡的炎性细胞释放的DNA(Potter等，Am J Dis Child100：493-495，1960；Lethem等，Am Rev Respir Dis 100：493-495，1990；Lethem等，Eur Respir J 3：19-23，1990)以及f-肌动蛋白聚合物(Sheils等，Am J Path148：919-927，1996；Tomkiewicz等，DNA and actin filament ultrastructure incystic firosis Sputum.In：Cilia，mucus，and mucociliary interactions，edited byBaum GL，Priel Z，Roth Y，Liron N，and Ostfeld EJ.New York，NY：MarcelDekker，1998)之间的进一步相互作用是CF痰液的稠密和粘稠性的原因。不能通过咳嗽和粘膜纤毛清除这种粘液促进了条件病原体在肺内的建群。

虽然CF肺疾病的病因可归为痰液流变学性质的改变，在出生时很少见到肺功能损害。而支气管扩张和气道阻塞随患者的年龄而进展。这种慢性肺损伤是由细菌感染和炎性反应的持续循环造成的。当中性粒细胞被募集到肺释放基质降解酶如弹性蛋白酶等和有害的活性氧种类时，导致气道损伤(参见Konstan and Berger，Pediatr Pulmonol 24：137-142，1997)。

尽管已有一些进展，通过基因治疗校正CF仍然不可实现。目前，与可促进脓性气道分泌物的清除的药物偶联的抗生素治疗方案仍然是治疗进行性气道疾病的主要方法。吸入纯化的rhDNase(Pulmozyme；Genentech，USA)广泛用作呼吸解充血剂，所述rhDNase可消化存在于CF气道中的细胞外DNA。这种治疗对于减少痰液粘稠性和稳定强迫的呼气量(FEV)在临床上是有效的(Fuchs等，N Engl J Med 331：637-642，1994)。其它研究性治疗的目标在于降解粘蛋白或肌动蛋白聚合物包括N-乙酰半胱氨酸，nacystelyn(N-乙酰-L-半胱氨酸衍生物)，和溶胶素(gelsolin)也可试验性降低痰液粘稠性，但仍需在美国获得专用于临床治疗CF的许可。

因此，本领域需要改良的治疗方法，用于治疗囊性纤维化以及与粘液或痰液的粘稠性或粘着性异常或过高相关的其它疾病。

发明概述

本发明的一个实施方案涉及增加患者粘液或痰液的液化的方法，所述患者有粘稠性(viscous)或粘着性(cohesive)过高的粘液或痰液。所述方法包括将患者的粘液或痰液与包含蛋白或肽的组合物接触，所述蛋白或肽含有还原态的硫氧还蛋白活性位点，所述组合物有效使粘液或痰液的液化比该接触步骤前增加。该实施方案的一方面，所述患者患有肺病，其中异常或过高的粘稠性或粘着性的粘液或痰液是该疾病的症状或病因，包括但不限于囊性纤维化。

一方面，将患者的粘液或痰液与所述组合物接触的步骤通过将该组合物由以下途径导入患者来进行：经鼻，经气管内，经支气管内，直接装入肺并吸入。一方面，将进行接触的粘液或痰液位于患者的呼吸道，胃肠道或生殖道。另一方面，所述组合物在可药用的载体中给药患者。优选，来自患者的粘液或痰液样品总体积的液相在给药所述组合物后在统计学上明显增加。

该实施方案的一方面，所述蛋白或肽以约1.5毫摩尔/kg患者体重-约150毫摩尔/kg患者体重的量给药患者。另一方面，所述蛋白在患者体内的半衰期为约5分钟-约24小时。一方面，所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列C-X-X-C，其中C残基为还原态，且其中X残基为任何氨基酸残基。另一方面，所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-X-X-C-X，其中C残基为还原态，且其中X残基为任何氨基酸残基。另一方面，所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-G-P-C-X(SEQ ID NO：2)，其中C残基为还原态，且其中X残基为任何氨基酸残基。另一方面，所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列W-C-G-P-C-K(SEQ ID NO：3)，其中C残基为还原态。另一方面，所述蛋白包含选自下组的硫氧还蛋白：原核生物硫氧还蛋白，酵母硫氧还蛋白，植物硫氧还蛋白，和哺乳动物硫氧还蛋白。在优选的方面，所述蛋白包含人硫氧还蛋白。

本发明的一方面，所述组合物还包含磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原形式)(NADPH)，用于还原所述蛋白的硫氧还蛋白活性位点。另一方面，所述组合物还包含硫氧还蛋白还原酶。

本发明另一实施方案涉及用于液化粘液或痰液的组合物，其包括含有还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽以及至少一种用于治疗粘稠性或粘着性过高的粘液或痰液的其它药剂。一方面，所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-X-X-C-X，其中C残基为还原态，且其中所述X残基为任何氨基酸残基。另一方面，所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-G-P-C-X(SEQ ID NO：2)，其中C残基为还原态，且其中所述X残基为任何氨基酸残基。另一方面，所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列W-C-G-P-C-K(SEQ ID NO：3)，其中C残基为还原态。另一方面，所述蛋白包含选自下组的硫氧还蛋白：原核生物硫氧还蛋白，酵母硫氧还蛋白，植物硫氧还蛋白，和哺乳动物硫氧还蛋白。一方面，所述蛋白包含人硫氧还蛋白。

另一方面，所述组合物还包含磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原形式)(NADPH)。另一方面，所述组合物还包含硫氧还蛋白还原酶。

本发明另一方面涉及增加患者的粘液或痰液的液化的方法，其中所述患者有粘稠性或粘着性过高的粘液或痰液，所述方法包括将该患者呼吸道中的粘液或痰液与组合物接触，所述组合物包含含有氨基酸序列X-C-X-X-C-X的蛋白，其中C残基为还原态，且与所述组合物的接触使得该患者粘液或痰液样品的液相体积比与该组合物接触前增加。

附图说明

图1A是线图，显示CF痰液通过暴露于Trx还原系统的液化是剂量依赖性的。

图1B是线图，显示CF痰液通过Trx的液化有赖于NADPH。

图2是线图，显示压缩(compaction)实验可重复性的评估。

图3A显示Trx还原系统(Trx+0.1μM TR+2mM NADPH)在痰液液化方面比谷胱甘肽还原系统(GSH+0.1μM Gr+2mM NADPH)更为有效。

图3B显示Trx还原系统(Trx+0.1μM TR+2mM NADPH)在痰液液化方面比N-乙酰半胱氨酸(NAC)更为有效。

图4A显示了Trx剂量对体外CF痰液的粘弹性(log G^*)的影响。

图4B显示NADPH剂量对体外CF痰液的粘弹性(log G^*)的影响。

图5是数码化图像，显示CF痰液在暴露于稀释剂或Trx以后的糖蛋白含量分布图。

图6显示Trx暴露增加存在于CF痰液中的DNA的溶解性。

发明内容

本发明一般性涉及含有还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽在诱导，增强和/或增加粘液或痰液的液化中的用途。更具体地，本发明人发现了硫氧还蛋白可降低痰液或粘液的粘稠性和/或粘着性，并因此是液化痰液或粘液的有效药剂。因此，天然硫氧还蛋白、含有还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽，或编码这种蛋白的核酸分子可单独使用或用于组合物中，以治疗多种与不良粘液或粘性较强且粘稠的痰液相关的疾病。例如，呼吸疾病诸如囊性纤维化特别适合利用本发明的产品和方法进行治疗。因此，本发明涉及包含还原态硫氧还蛋白的活性位点的蛋白在增加粘液或痰液，特别是粘稠性和/或粘着性异常或过高的粘液或痰液的液化中的用途。将所述蛋白给药遭受或受所述异常或过多粘液或痰液影响的患者，所述给药的方式和给药量有效增加了所述粘液或痰液的液化，并优选有效给该患者提供治疗好处。

硫氧还蛋白和含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白在治疗诸如囊性纤维化等的疾病方面优于其它还原剂。例如，和其它还原剂(例如，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，Nacystelyn(NAL)，二硫苏糖醇(DTT))不同，硫氧还蛋白可通过成环被还原成其有效(还原的)形式。此外，硫氧还蛋白的自身氧化(例如产生超氧化物，氢过氧化物，羟基自由基和其它毒性氧代谢物)与诸如NAC，NAL和DTT等的其它还原剂相比以低程度发生。此外，硫氧还蛋白是天然存在的化合物，其通常存在于细胞外空间，并因此将硫氧还蛋白导入气道不应诱导免疫反应并应该是非刺激性的。硫氧还蛋白也是非糖基化的，并因此给药天然和重组形式的所述蛋白不应诱导先天性免疫反应。很可能甚至更明显地，硫氧还蛋白与其它还原剂不同，其使得经它处理过的粘液或痰液保持在液态。例如NAC和DTT随时间而“被消耗(spent)”和氧化，并且在该阶段时，液化的痰液或粘液可变回更粘稠的“凝胶”状态。反之，由硫氧还蛋白产生的液化可保持数小时，很可能是由于通过其还原系统的环式再还原。最后，硫氧还蛋白比其它还原剂更有效，并因此为达到有益效果其使用剂量可明显低于其它试剂。

除了上述优点，硫氧还蛋白还有可增加其用于疾病治疗的有用性的其它优点。例如，已知硫氧还蛋白诱导MnSOD(例如，见美国专利5,985,261，授予White等，其全文内容包含在文中作为参考)，预期这可降低患者痰液(例如，囊性纤维化患者痰液)中的一些细菌毒素(包括但不限于，来自革兰氏阴性细菌的细胞壁的内毒素，来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的绿脓素(pyocyanin)等)。此外，硫氧还蛋白具有抗炎性质，其可增强呼吸疾病的总体治疗。。

硫氧还蛋白(Trx)是蛋白二硫化物还原酶，其可催化多种硫醇(thiol)依赖性细胞还原过程。硫氧还蛋白(Trx)含有在物种中高度保守的两种氧化还原活性半胱氨酸。在其氧化形式中，这些半胱氨酸形成从该蛋白三维结构中伸出的二硫化物桥(Holmgren，Annu Rev Biochem 54：237-271，1985)。该活性中心被NADPH-依赖性硫氧还蛋白还原酶(TR)酶还原可使得Trx用作具有二硫醇/二硫化物交换能力的电子载体(Oblong等，Biochemistry 32：7271-7277，1993)。蛋白二硫化物是Trx-介导的还原作用的优选底物。囊性纤维化疾病的气道分泌物的顽固且粘稠的性质导致气道阻塞，条件性感染和肺功能损害。认识到呼吸粘蛋白含有在聚合反应中起重要作用的数个半胱氨酸区(Bell等，Biochem J 357：203-209，2001；Asker等，Biochem J 333：381-387，1998)，本发明人试图确定Trx是否可通过还原粘蛋白二硫化物而作为有效的粘液溶解剂。

在本文所述实验中，本发明人研究了Trx还原系统(硫氧还蛋白，硫氧还蛋白还原酶，和NADPH)对体外CF痰液的物理和流变性质的影响。获自CF患者的痰液用TRX及其还原系统[0.1μM硫氧还蛋白还原酶(TR)+2mM NADPH]处理且液相：凝胶相比(百分比液相)通过压缩实验测定。暴露于低浓度(1μM)Trx导致痰液液相百分比明显增加。液相百分比的最大增加出现在Trx为30μM时。其它测定显示Trx还原系统对痰液的液化有赖于NADPH浓度。Trx还原系统的相对效力也与其它二硫化物还原剂进行了比较。与Trx不同，谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸在浓度低于1mM时对痰液的液化无效。在用3，10，和30μM Trx处理后20分钟，磁性微流变测定法(magnetic microrheometry)测定的痰液粘弹性也明显降低。类似地，粘弹性的这种降低也依赖于NADPH浓度。其它实验还显示Trx处理还增加了高分子量糖蛋白的溶解性，并导致细胞外DNA重新分布进入痰液的液相。本文实验显示在体外用催化量的Trx及其还原系统进行处理可液化并降低脓性CF痰液的粘弹性。Trx-处理的痰液中存在的高分子量糖蛋白的溶解性增加表明粘蛋白大分子可为粘液溶解过程中被Trx还原的底物。

气道的粘液阻塞可导致CF患者的患病率和死亡率明显增加。本发明人证实了促使这些分泌物在气道内持续存在的粘弹性性质被Trx明显减轻。这一结论可由两个实验证据系支持。首先，压缩实验结果表明在与Trx保温的过程中大量液体从CF痰液的凝胶基质中释放出来。与所述释放同时出现的是固体物质的体积降低，表明痰液的凝胶形成组分被溶解。CF痰液的液化可在保温期的CF痰液中明显观察到，因此不是离心破坏的人工结果。Trx使得液体释放预期具有重要的治疗指征，这是由于气道表面水体积的恢复可恢复CF上皮的粘膜纤毛转运能力(Jiang等，Science 262：424-427，1993)。其次，磁性微流变测定法提供了Trx减少痰液组分而导致痰液粘弹性降低的直接证据。

CF痰液是非牛顿流体(non-newtonian fluid)，其显示液体和固体的性质。当聚合物以较低的浓度存在于溶液中时，其可自由转动。当聚合物被浓缩或交联使得它们的转动受阻时，溶液就达到了称为渗滤阈值(percolationthreshold)的过渡相(Forgacs，J Cell Sci 108：2131-2143，1995)。在渗滤阈值时，所述溶液开始具有固体的性质，并且随着增加更多的交联聚合物相互作用，弹性系数继续增加，直到样品中的每个纤维丝(filament)都掺入基质中。生化分析显示粘蛋白MUCSAC和MUC5B(由呼吸道的内衬细胞分泌)是气道粘液的主要凝胶形成组合物组分(Hovenberg等，Glycoconj J 13：839-847，1996；Thornton等，Biochem J 316：967-975，1996；Thornton等，J BiolChem 272：9561-9566，1997)。这些粘蛋白上的半胱氨酸结构域有助于聚合物形成，并可能与相邻的粘蛋白链通过二硫键形成而发生相互作用(Bell等，Biochem J 357：203-209，2001；Asker等，Biochem J 333：381-387，1998)。由于蛋白上的二硫键是Trx酶活性的优选底物，本发明人推定粘蛋白聚合物是Trx液化痰液中的还原靶。该推定由PAS染色支持，所述染色显示Trx处理的痰液中的高分子量糖形式的溶解性改变。在Trx暴露的痰液的液相中检测到高浓度糖蛋白还可由更深的黄色和比来自稀释剂处理的样品的液相的更高的不透明性来显示。Trx暴露的痰液中PAS-可检测的糖蛋白的电泳活动性增强也提示这些大分子在酶还原过程中其体积可减小。来自该电泳分析的发现与压缩实验测定一致，其均显示在暴露于Trx的过程中糖蛋白释放进入液相与凝胶基质的质量降低相符。

患病CF肺中中性粒细胞在气道中的裂解导致细胞外DNA累积到气道分泌物中(Lethem等，Eur Respir J 3：19-23，1990)。通过非共价相互作用，所述DNA在粘蛋白糖蛋白内缠结在一起，从而增加粘液凝胶的粘弹性(Sachdev等，Chest 81：41S-43S，1982)。在本文所述的实验中，本发明人发现了痰液中存在的DNA在Trx处理后溶解性增加。合理的解释是Trx活性导致凝胶基质内的结构改变，其足以降低DNA和受影响的大分子之间的缠结反应。不确定在将CF痰液暴露于Trx的过程中这种增加的DNA溶解性对粘弹性改变具有什么样的相对贡献。然而，从临床角度来看，在CF的这种治疗过程中，从痰液的不溶凝胶相去除DNA可使其对DNase活性更敏感。因此，本发明的方法很有可能与现有的其它CF治疗协同。

在与其它硫醇还原剂的痰液液化能力进行比较的研究中，Trx的效力高于谷胱甘肽(GSH；还原的谷胱甘肽)还原系统。由于Trx具有两个氧化还原活性的半胱氨酸残基(二硫醇)，而GSH仅含有一个(单硫醇)，Trx在还原CF痰液的凝胶形成组分中的二硫键中更为有效。对于非循环性粘液溶解药物，DTT比等摩尔量的NAC(或Mucomyst)溶液更为有效(图2和3；数据未显示)。再一次地，这些化合物的效力可有赖于氧化还原活性半胱氨酸残基的数目，DTT有两个，NAC只有一个。根据这些压缩实验测定，利用蛋白，肽或其它具有双重氧化还原活性的半胱氨酸的化合物进行的二硫键酶促还原预期为有效的粘液溶解策略。

总之，Trx增加CF痰液的液体部分并减少其粘弹性。糖蛋白溶解性的增加出现在用Trx处理痰液的过程中，并且这可能是这些流变学改变的机制。促进液体释放并降低气道分泌物粘稠性的粘液还原系统的发展预期对CF以及粘液粘稠性和/或粘着性过高或异常有治疗效力，所述粘液粘稠性和/或粘着性过高或异常可与以下疾病相关：其它呼吸疾病(例如慢性或急性支气管炎(bronchitis)；支气管扩张(bronchiectasis)；急性气管炎(tracheitis)；急性或慢性鼻窦炎(sinusitis)；急性或慢性气道粘液栓导致的肺不张(atelectasis)；细支气管炎(bronchiolitis))，或与粘液粘稠性和/或粘着性过高或异常相关或由其加重的各种胃肠道或生殖疾病(例如由粘液浓缩造成的急性、亚急性或慢性肠梗阻(bowel obstruction)；由要害生殖结构堵塞导致的不育)。由于Trx是缺乏糖基化和翻译后(post-translational)修饰的天然蛋白，且其通常以低含量出现在细胞外空间，其长期给药能够很好地被免疫系统所容忍。

因此，本发明的一个实施方案涉及增加患者中粘液或痰液的液化的方法，所述患者具有粘稠性或粘着性过高的粘液或痰液。所述方法包括将该患者的粘液或痰液与组合物接触，所述组合物含有包含还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽。所述蛋白有效使粘液或痰液的液化比该接触步骤前增加。

根据本发明，术语“粘液”一般性指通常澄清的粘性流体，其由体内各组织的粘膜分泌，包括呼吸道，胃肠道和生殖道。粘液可湿润、润滑并保护分泌它的组织。其包含粘蛋白大分子，其为粘液的凝胶形成组分。正常粘液的粘弹性有赖于粘蛋白的浓度、分子量和相互缠结。术语“痰液”通常指唾液和呼吸道排出物包括粘液的混合物。痰液通常是唾液和粘液(以及来自呼吸组织的其它排出物)的咳出的混合物。因此，粘液是痰液的主要组分，并因此痰液中粘性过高的粘液的存在导致痰液本身的粘性过高。术语“液化”指变为液体的作用过程。因此，粘液或痰液的液化增加指与更加坚固或粘稠的相相比，粘液或痰液的液相或液态增加。

粘液和痰液在体内的常见作用需要粘液(以及从而痰液的粘液组分)具有粘弹性。在具有正常粘液和痰液的个体(即，健康个体，或更具体为不患有由于粘液或痰液的粘稠性或粘着性导致或加重的症状或疾病的个体)，所述粘弹性有赖于粘蛋白聚合物的浓度，分子量和相互缠结(Verdugo等，Biorheology 20：223-230，1983)。当粘液中的粘蛋白与和从快死亡的炎性细胞释放的DNA(Potter等，Am J Dis Child 100：493-495，1960；Lethem等，AmRev Respir Dis 100：493-495，1990；Lethem等，Eur Respir J 3：19-23，1990)以及f-肌动蛋白聚合物(Sheils等，Am J Path 148：919-927，1996；Tomkiewicz等，DNA and actin filament ultrastructure in cystic fibrosis Sputum.In：Cilia，mucus，and mucociliary interactions，edited by Baum GL，Priel Z，Roth Y，Liron N，andOstfeld EJ.New York，NY：Marcel Dekker，1998)之间发生相互作用时，粘液(和因此痰液)更加浓稠和粘稠，例如CF痰液中那样。不能通过咳嗽或粘膜纤毛清理所述粘液促进条件性病原菌在肺的建群。因此，粘液的粘稠性和/或粘着性异常或过高的特征在于所述粘液的粘稠性或粘着性可检测地高于来自正常或健康患者(优选年龄和性别匹配的患者)的粘液，和/或所述粘液的粘稠性和/或粘着性水平导致或因其患者产生至少一种症状，所述症状可导致患者不适或疼痛或导致或加重病症或疾病。换言之，粘稠性和/或粘着性异常或过高的痰液是正常粘液或痰液的偏移形式(deviation)，其中需要对所述患者进行治疗以缓解疾病或提供其它治疗益处。

本发明的方法和组合物可用于治疗任何患者，所述患者需要增加粘液或痰液的液化。具体地，患有具体的肺、鼻窦、鼻、胃肠或生殖疾病的患者可从利用本发明的方法的治疗中受益。本发明可用于缓解或减轻疾病的至少一种症状，所述疾病是由粘液或痰液的粘稠性和/或粘着性异常或过高导致或加重的，所述疾病当然可包括囊性纤维化这种肺相关疾病。至少有些情况下其它疾病可与粘液或痰液粘稠性和/或粘着性异常或过高相关，并且当出现这种症状时，本发明的方法可用于增加所述粘液或痰液的液化，并对该患者提供至少一些缓解或疗效。所述疾病的实例包括，但不限于：囊性纤维化；慢性或急性支气管炎；支气管扩张(非-CF和CF支气管扩张)；急性气管炎(由细菌，病毒，支原体或其它生物体导致的)；急性或慢性鼻窦炎；由气道急性或慢性粘液栓导致的肺不张(肺或肺叶塌陷)(有时见于各种疾病如哮喘)；细支气管炎(病毒性或其它)；由粘液浓缩导致的急性，亚急性或慢性肠梗阻，包括但不限于CF或类似疾病中的胎粪性肠梗阻(meconiumileus)或等同于胎粪性肠梗阻的疾病；由于宫颈、输精管或其它重要生殖结构堵塞(但不限于)造成的不育。此外，本发明的组合物和方法可用于减轻患有多种呼吸感染(包括病毒和细菌感染)的患者中与粘液或痰液粘稠性和/或粘着性过高相关的症状。

同样，治疗益处不必要是可治愈具体的疾病，而是优选最通常包括以下内容的结果：疾病减轻，疾病消除，与疾病相关的症状减轻或消除，预防或缓解由原发疾病造成的继发疾病(例如由条件性病原体微生物导致的感染性疾病，所述病原体微生物利用呼吸道中粘稠性过高的粘液)，和/或预防疾病，或与疾病相关的症状。本文术语“针对疾病的保护(protected fromdisease)”指减轻所述疾病的症状，姑息性治疗(缓解或减轻疾病的症状而不进行治愈)；减少疾病的发病率，和/或减轻疾病的严重程度。保护患者可指本发明的组合物在给药患者时防止疾病出现和/或治愈或缓解疾病的至少一个症状、指征或病因的能力。同样，保护患者免遭疾病包括防止疾病发生(预防性治疗)和治疗患有疾病的患者(治病性治疗)。具体地，保护患者免遭疾病通过使该患者体内的粘液或痰液与蛋白或肽接触而增加该患者体内的粘液或痰液液化来实现，所述蛋白或肽包含还原态的硫氧还蛋白活性位点，从而获得有益效果。本领域技术人员和/或治疗该患者的受过训练的临床医师可容易评估有益效果。术语“疾病”指与患者的正常健康的任何偏离，并包括存在疾病症状的状态，以及出现偏离(例如感染，基因突变，遗传缺陷等)但没有显示症状的情况。

将患者的粘液和/或痰液与包含还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽(或包含这种蛋白的组合物)接触意图导致所述粘液或痰液的液化与和所述组合物接触前相比而言增加。根据本发明，粘液或痰液的液化增加可以是粘液或痰液的液化水平与液化前水平相比的任何可测定或可检测增加，并优选是统计学显著的增加(即患者样品和基线对照的测定液化水平之间的差异在至少p＜0.05的置信度下具有统计学显著性)。通常，“基线对照”是给予所述治疗前的患者样品，这是由于正常健康个体通常不能产生足以作为对照的大量痰液，但来自正常健康个体的痰液没有排除在基线对照之外。粘液或痰液的液化可利用本领域任何已知的适宜技术测定，包括但不限于实施例部分所述的压缩实验。在所述实验中，测定固相(凝胶)的粘液或痰液相对于液相(液体)的量。本发明另一方面，粘液或痰液的相对粘稠性或粘着性可利用其它参数或指示物测定，所述参数或指示物包括但不限于，粘弹性(例如通过磁性微流变测定法测定)，糖蛋白含量或DNA含量。本发明一方面，液化水平描述为给定粘液或痰液样品中的含水(液)相的量作为粘液或痰液样品总体积的百分比。例如在患有囊性纤维化的患者中，粘液或痰液的液化水平可低至低于总体积的10％或甚至低于5％。优选，将本发明的蛋白或组合物与粘液或痰液接触导致所述粘液或痰液的液化改变使得液相总体积的至少约15％，更优选至少约20％，更优选至少约25％，更优选至少约30％，优选至少约35％，更优选至少约40％，更优选至少约45％，更优选至少约50％呈液相，或直到由粘液导致的功能堵塞或抑制被清理(例如，直到所述患者的气道被清理到足以开始咳出所述液体)。通常优选所述痰液或粘液的液化以较小的幅度逐渐增加，直到气道或其它被堵塞的通道(例如胃肠道或生殖道)被清理，但不会过度液化该痰液。过度液化粘液或痰液是不需要的，因为其对患者有害(例如液化的痰液可发生回流并使感染的稀薄液体充满(flood)小气道，直到所述痰液被患者清除出去)。优选本发明的蛋白，肽或组合物与粘液或痰液的接触可导致所述粘液或痰液的液化与处理前相比体积增加至少约1％，优选增加至少约2％等(以1％递增)，直到患者气道或其它阻塞的通道被清理。

一方面，所述治疗与从患者的受影响组织(呼吸道，胃肠道，生殖道)清除稀薄物质的方法联用。例如，对于呼吸系统，可利用本发明的方法与体位引流，喘息式咳嗽(huff coughing)和其它呼吸运动，或其它用于咳出液化的粘液或痰液的适宜方法联用。

根据本发明，待治疗患者中的粘液或痰液可与含有还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白(或含有该蛋白的组合物)接触。与接触步骤前相比，所述蛋白可有效降低痰液或粘液的粘稠性和粘着性和/或增加痰液或粘液的液化。如上所述，硫氧还蛋白是见于大多数生物体的蛋白二硫化物还原酶，其参与许多硫醇依赖性细胞还原过程。在人中，硫氧还蛋白也称为成人T细胞白血病来源的因子(ADF)。在细胞内，大多数这种遍在的低分子量(11,700)蛋白保持还原状态。还原或氧化的硫氧还蛋白可进入完整细胞并吸附于细胞膜，从而少量所述蛋白将随时间被内在化(internalized)。其在活性位点具有两个相邻半胱氨酸残基，其在氧化的蛋白中形成位于该蛋白三维结构突出部分中的二硫化物桥。所述黄素蛋白硫氧还蛋白还原酶催化该二硫化物的NADPH-依赖性还原。硫氧还蛋白的少量增加可导致该蛋白中的巯基-二硫化物氧化还原状态发生很大改变。

除了进行细胞蛋白的还原能力以外，还认识到硫氧还蛋白可直接作为抗氧化剂(例如通过清除反应性氧种类从而防止可氧化底物的氧化)，但和其它硫醇不同，硫氧还蛋白通常不由于自身氧化而导致细胞内的氧化应激(例如，通过自身氧化产生超氧化物自由基)。美国专利5,985,261，授予White等，见上文，显示硫氧还蛋白直接诱导MnSOD的产生，且所述诱导可通过还原态硫氧还蛋白实现。

本发明的“硫氧还蛋白活性位点”包含氨基酸序列C-X-X-C。本文“C”表示的氨基酸残基为半胱氨酸残基，而“X”表示的氨基酸残基可以为任何氨基酸残基，并具体地为标准20氨基酸残基中的任意氨基酸。本发明这种硫氧还蛋白活性位点优选包含氨基酸序列C-G-P-C(SEQ ID NO：1)。硫氧还蛋白活性位点还可包含氨基酸序列X-C-X-X-C-X。优选本发明的硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-G-P-C-X(SEQ ID NO：2)，其中“G”代表的氨基酸残基为甘氨酸残基，且其中“P”代表的这类氨基酸残基为脯氨酸残基。更优选，本发明的硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列W-C-G-P-C-K(SEQ ID NO：3)，其中“W”代表的这类氨基酸残基为色氨酸残基，且其中“K”代表的这类氨基酸残基为赖氨酸残基。

本发明一方面，含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白为全长硫氧还蛋白蛋白，或其含有硫氧还蛋白的上述结构和功能活性位点的任何片段。优选的硫氧还蛋白蛋白包括原核生物硫氧还蛋白，酵母硫氧还蛋白，植物硫氧还蛋白，和哺乳动物硫氧还蛋白，其中人硫氧还蛋白是特别优选的。各种生物体来源的硫氧还蛋白的核酸和氨基酸序列是本领域已知的并意图包含在本发明内。例如，SEQ ID NO：4-15表示来自以下物种的硫氧还蛋白的氨基酸序列：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(SEQ ID NO：4)，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)(SEQ ID NO：5)，单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(SEQ ID NO：6)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(SEQ ID NO：7)，鸡(Gallus gallus)(SEQ ID NO：8)，小家鼠(Musmusculus)(SEQ ID NO：9)，大家鼠(Rattus norvegicus)(SEQ ID NO：10)，牛(Bos Taurus)(SEQ ID NO：11)，人(Homo sapiens)(SEQ ID NO：12)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)(SEQ ID NO：13)，玉米(Zea mays)(SEQ ID NO：14)，和稻(Oryza sativa)(SEQ ID NO：15)。根据这些序列的每一个，X-C-G-P-C-X(SEQ ID NO：2)基序(包括SEQ ID NO：1的CGPC基序)可表示为：SEQ IDNO：4(位置33-38)，SEQ ID NO：5(位置28-33)，SEQ ID NO：6(位置27-32)，SEQ ID NO：7(位置29-34)，SEQ ID NO：8(位置31-36)，SEQ ID NO：9(位置31-36)，SEQ ID NO：10(位置31-36)，SEQ ID NO：11(位置31-36)，SEQ ID NO：12(位置31-36)，SEQ ID NO：13(位置59-64)，SEQ ID NO：14(位置88-93)和SEQ ID NO：15(位置94-99)。此外，数种硫氧还蛋白包括人和细菌的硫氧还蛋白的三维结构已经确定。因此，来自多种生物体的硫氧还蛋白的结构和活性位点是本领域已知的，且本领域技术人员能轻易鉴定并制备可用于本发明的全长硫氧还蛋白的片段或类似物。

术语“还原态”具体描述了本发明的蛋白或肽的活性位点中半胱氨酸残基的状态。还原态的这类半胱氨酸残基形成二硫醇(即两个游离的巯基基团，-SH)。反之，氧化形式的这类半胱氨酸残基形成分子内二硫化物桥；这样的分子可称为半胱氨酸。还原态的硫氧还蛋白活性位点能够通过将其活性位点二硫醇可逆性氧化成二硫化物而参与氧化还原反应，并催化二硫醇-二硫化物交换反应。

含有硫氧还蛋白活性位点的本发明的蛋白本身可以是硫氧还蛋白活性位点或为通过糖苷键连接于其它氨基酸的硫氧还蛋白活性位点。因此本发明的蛋白或肽的最小长度可为约4-6个氨基酸，优选大小有赖于需要的是所述蛋白的全长，融合，多价或仅仅其功能部分。优选，本发明的蛋白或肽的长度为约4-约100或更多个氨基酸残基，特别考虑任何中间长度的整数的肽(即，4，5，6，7...99，100，101...)。本发明一个优选实施方案中，本发明的蛋白可以是全长蛋白或其任何同源物。本文术语“类似物”用于指与天然蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白)不同的蛋白或肽，其通过对天然蛋白或肽进行修饰得到，但仍保持天然形式的基本蛋白和侧链结构，和/或保持天然蛋白的至少生物活性部分(例如硫氧还蛋白活性位点)的基本三维结构。这种改变包括，但不限于：一或数个氨基酸侧链改变；一或数个氨基酸改变，包括缺失(例如该蛋白或肽的截短形式(片段))，插入和/或取代；一或数个原子的立体化学(stereochemistry)改变；和/或较低程度的衍生，包括但不限于：甲基化，糖基化，磷酸化，乙酰化，肉豆蔻酰化，异戊二烯基化，棕榈酰化，酰胺化和/或加入糖基磷脂酰肌醇。根据本发明，本发明所用的任何蛋白或肽(包括天然硫氧还蛋白的同源物)具有硫氧还蛋白活性位点，使得还原态的所述蛋白或肽能够通过其活性位点二硫醇可逆性氧化成二硫化物而参与氧化还原反应，能够催化二硫醇-二硫化物交换反应，和/或能够降低粘液或痰液的粘稠性或粘着性，或能够增加粘液或痰液的液化。如本文所述，含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽具有类似于硫氧还蛋白的性质，优选所述硫氧还蛋白选自：原核生物硫氧还蛋白，酵母硫氧还蛋白，植物硫氧还蛋白，或哺乳动物硫氧还蛋白。在特别优选的实施方案中，所述蛋白是人硫氧还蛋白。

同源物可以是天然等位基因变异或天然突变的结果。编码蛋白的核酸的天然等位基因变体是基本上出现在基因组中与编码所述蛋白的基因基本相同基因座(或位点)的基因，但由于例如突变或重组导致的天然变异而具有类似但不是相同的序列。等位基因变体通常编码具有与所比较基因所编码的蛋白活性类似的蛋白。一种类型的等位基因变体可编码相同的蛋白但由于遗传密码的简并性而具有不同的核酸序列。等位基因变体也可包含位于基因5’或3’未翻译区(例如调节控制区)中的变异。等位基因变体是本领域技术人员已知的。

利用本领域已知的用于产生蛋白的技术可制备同源物，所述技术包括但不限于，直接对分离的天然蛋白进行修饰，直接蛋白合成，或利用例如传统或重组DNA技术对编码所述蛋白的核酸序列进行修饰以实现随机或靶向的诱变。

与野生型蛋白相比，同源物的修饰可激动或拮抗或基本上不改变天然存在的蛋白的同源物的基本生物活性。通常，蛋白的生物活性或生物作用指在体内(即该蛋白的天然生理环境)或体外(即在实验室条件下)测定或观察到的该蛋白天然形式所显示或执行的任何功能。蛋白的修饰，诸如同源物或类似物(下文将讨论)可产生具有与天然蛋白相同的生物活性的蛋白，或与天然蛋白相比具有降低或增强的生物活性的蛋白。导致蛋白表达降低或蛋白活性降低的修饰可称为失活(完全或部分)，下调或蛋白作用降低。类似地，导致蛋白表达增加或蛋白活性增加的修饰可称为扩增(amplification)，超量产生，活化，增强，上调或蛋白作用增加。

一个实施方案中，硫氧还蛋白的同源物包括其肽和非肽同源物，可为药物设计或选择的产物，并可利用本领域已知的各种方法制备。所述同源物可称为类似物。类似物指任何能够模拟天然肽的生物作用的肽或非肽化合物，通常是由于所述类似物具有与天然肽的基本结构相似的基本结构和/或具有天然肽的主要(salient)生物活性。类似物可包括但不限于，来自原型的具有实质修饰的肽诸如与天然肽没有侧链相似性(所述修饰，例如可降低其对降解的敏感性)；抗-独特性和/或催化性抗体，或其片段；分离蛋白的非-蛋白源性部分(例如碳水化合物结构)；或合成或天然有机分子，包括通过例如组合化学(combinatory chemistry)鉴定的核酸和药物。这种类似物可用本领域已知的多种方法设计、选择和/或鉴定。可用于设计或选择可用于本发明的类似物或其它治疗性化合物的各种药物设计方法公开于Maulik等，1997，Molecular Biotechnology：Therapeutic Applications and Strategies，Wiley-Liss，Inc.，其全文内容包含在本文中作为参考。

类似物可利用以下方法获得：例如分子多样性策略(允许快速构建大的化学多样性分子文库的相关策略的组合)，天然或合成化合物的文库，具体是化学或组合文库(即序列或大小不同但具有相似的构建单元的化合物的文库)，或通过合理的定向的或随机的药物设计。见例如Maulik等，上文所述。

在分子量多样性策略中，可利用生物、酶和/或化学方法从例如肽，寡核苷酸，碳水化合物和/或合成有机分子合成大化合物文库。开发分子多样性策略的重要参数包括亚单元多样性、分子大小和文库多样性。筛选这类文库的一般目的是利用序贯应用组合选择以获得所需靶的高亲和力配体，并随后通过随机(random)或定向设计(directed design)的策略优化前导分子。分子多样性的方法详见Maulik，等，同上。

Maulik等还公开了例如定向设计的方法，其中使用者指导从适当选出的片段的片段文库产生新的分子的过程；随机设计的方法，其中使用者利用遗传或其它算法来随机突变片段及其组合，并同时利用选择标准来评估候选配体的适合性；和基于构架(grid)的方法，其中使用者计算三维受体结构和小片段探针之间的反应能量，然后将有利的探针位点连接在一起。

本发明的一个实施方案中，适宜用于本发明的蛋白具有这样的氨基酸序列，其包含硫氧还蛋白的全长序列或基本上由或由其组成，或包含具有本文所述的硫氧还蛋白活性位点的任何片段或基本上由或由其组成。例如SEQ ID NO：4-12之一或其含有本文所述硫氧还蛋白活性位点的片段或其它同源物包含在本发明中。这种同源物可包括蛋白，其具有与全长硫氧还蛋白的氨基酸序列至少约10％相同，或至少20％相同，或至少30％相同，或至少40％相同，或至少50％相同，或至少60％相同，或至少70％相同，或至少80％相同，或至少90％相同，或大于95％相同的氨基酸序列，所述相同性包括10％-100％之间的任何整数百分比(10％，11％，12％，...98％，99％，100％)。

除非另有说明，本文涉及的百分比(％)同一性指的是使用以下方法进行的同源性评价：(1)使用标准默认参数，使用氨基酸检索所用的blastp和核酸检索所用的blastn进行BLAST 2.0 Basic BLAST同源性检索，其中通过默认(default)过滤查询序列的低复杂区(描述在下列文献中：Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)“缺口BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库检索程序”(“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database searchprograms.”)-《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)25：3389-3402，将该文献的全部内容引入本文作为参考)；(2)BLAST 2序列比对(使用下述参数)；(3)和/或使用标准默认参数的PSI-BLAST(Position-Specific Iterated BLAST)。注意由于在BLAST 2.0 Basic BLAST与BLAST 2之间的标准参数存在一定的差异，所以使用BLAST 2程序可能将两种具体序列视为具有显著同源性，而使用上述序列之一作为查询序列的BLAST 2.0 Basic BLAST中进行的检索可能不会将另一序列鉴定为最高匹配。此外，PSI-BLAST提供了自动易用的“轮廓(profile)”检索版本，它是查询序列同源物的灵敏方式。该程序首先进行有缺口的(gapped)BLAST数据库检索。PSI-BLAST程序应用来自返回的任意重要比对的信息以构建位置特异性得分矩阵，用它取代用于下一个循环的数据库检索的查询序列。因此，应理解可以通过使用这些程序中的任意一种测定百分比同一性。

使用如Tatusova和Madden，(1999)在“Blast 2序列-比较蛋白质和核苷酸序列的新工具”(“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”)-FEMS Microbiol Lett.174：247-250中所述的BLAST 2序列可以对两种具体序列进行序列比对，将该文献的全部内容引入本文作为参考。使用BLAST 2.0算法在blastp或blastn中进行BLAST 2序列比对，以便在两种序列之间进行缺口BLAST检索(BLAST 2.0)，从而允许在所得比对中导入缺口(缺失和插入)。本文为清楚起见，如下使用标准默认参数进行BLAST 2序列对比。

就blastn而言，使用0 BLOSUM62矩阵：

匹配得分＝1

错配罚分＝-2

开放缺口(5)和延长缺口(2)罚分

缺口x_递减(drop offf)(50) 期望值(expect)(10)字符大小(11)过滤(启动)

就blastp而言，使用0 BLOSUM62矩阵：

开放缺口(11)和延长缺口(1)罚分

缺口x_递减(50) 期望值(10)字符大小(3)过滤(启动)。

本发明中使用的蛋白质还可以包括含有这样的氨基酸序列的蛋白质，所述的氨基酸序列包括任何全长硫氧还蛋白(例如SEQ ID NO：4-12)的至少10个连续氨基酸残基(即，与参比序列的10个连续氨基酸具有100％同一性的10个连续氨基酸残基)。在其它实施方案中，硫氧还蛋白包括这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有天然硫氧还蛋白的氨基酸序列的至少15个，且至少20，且至少25，且至少30，且至少35，且至少40，且至少45，且至少50，且至少55，且至少60，或至少65，或至少70，或至少75，或至少80个连续氨基酸残基，等等，直至蛋白质的全长，包括任何整数的介于其间的长度(10，11，12，....)。在一个实施方案中，这类蛋白质具有参比蛋白的生物活性。

本发明术语“连续”或“相邻”在涉及本文所述的序列时，指的是连接在不间断的序列中。例如，对含有第二种序列的30个连续(或相邻)氨基酸的第一种序列而言，指的是第一种序列包括30个氨基酸残基的不间断序列，该序列与第二种序列中的30个氨基酸残基的不间断序列100％相同。类似地，第一种序列与第二种序列具有“100％同一性”，指的是第一种序列完全与第一种序列匹配，其中在核苷酸或氨基酸之间无缺口。

在另一个实施方案中，本发明中使用的蛋白质、包括含有这样的氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与天然存在的硫氧还蛋白的氨基酸序列足够相似，从而编码同源物的核酸序列能够在中等、高或极高严格条件(下述)下和(即，与)编码天然存在硫氧还蛋白的核酸分子杂交(即，与编码天然存在硫氧还蛋白氨基酸序列的核酸链的互补序列杂交)。下文将详细描述这种杂交条件。

编码本发明硫氧还蛋白的核酸序列的互补核酸序列指的是与编码硫氧还蛋白的链互补的核酸链的核酸序列。可以理解编码指定氨基酸序列的双链DNA包括单链DNA及其含有为该单链DNA互补序列的序列的互补链。因此，本发明的核酸分子可以为双链或单链且包括那些在严格杂交条件下与编码硫氧还蛋白的氨基酸序列的核酸序列和/或与编码这类氨基酸序列的核酸序列的互补序列形成稳定杂合体的核酸分子。推定互补序列的方法是本领域技术人员公知的。

作为本文所用的杂交条件指的是标准杂交条件，在此条件下使用核酸分子鉴定相似的核酸分子。这类标准条件例如公开在Sambrook等的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989中。将Sambrook等的上述文献的全部内容引入本文作为参考(特别是参见9.31-9.62页)。此外，例如，在Meinkoth等1984 Anal.Biochem.138，267-284中公开了计算适宜杂交和洗涤条件的公式以获得允许各种程度的核苷酸错配的杂交；将Meinkoth等的上述文献的全部内容引入本文作为参考。

更具体地说，本文涉及的中等的严格杂交和洗涤条件指的是允许分离与杂交反应中用作探针的核酸分子具有至少约70％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即，允许约30％或以下核苷酸错配的条件)。本文涉及的高严格杂交和洗涤条件指的是允许分离与杂交反应中用作探针的核酸分子具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即，允许约20％或以下核苷酸错配的条件)。本文涉及的极高严格杂交和洗涤条件指的是允许分离与杂交反应中用作探针的核酸分子具有至少约90％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即，允许约10％或以下核苷酸错配的条件)。如上所述，本领域技术人员可以使用Meinkoth等的上述文献中的公式计算适宜的杂交和洗涤条件以获得这些具体的核苷酸错配水平。这类条件是可变的，这取决于是形成DNA：RNA还是DNA：DNA杂合体。对DNA：DNA杂合体计算出的解链温度低于DNA：RNA杂合体的解链温度10℃。在特定的实施方案中，DNA：DNA杂合体的严格杂交条件包括在6X SSC(0.9M Na⁺)离子强度和约20℃-约35℃(低严格)、更优选约28℃-约40℃(更严格)且甚至更优选约35℃-约45℃(甚至更严格)的温度及适宜洗涤条件下杂交。在具体的实施方案中，DNA：RNA杂合体的严格杂交条件包括在6X SSC(0.9M Na⁺)离子强度和约30℃-约45℃、更优选约38℃-约50℃且甚至更优选约45℃-约55℃的温度与类似的严格洗涤条件下杂交。这些值基于对大于约100个核苷酸、0％甲酰胺和约40％的G+C含量的分子的解链温度的计算。可供选择的是，可以如Sambrook等(出处同上)9.31-9.62页中所述根据经验计算T_m。一般来说，洗涤条件应尽可能严格且应适合于所选杂交条件。例如，杂交条件可以包括盐与比具体杂合体的计算T_m低约20-25℃的温度条件的组合，且洗涤条件一般包括盐与约比具体杂合体的计算T_m低约12-20℃的温度条件的组合。适用于DNA：DNA杂合体的杂交条件的一个实例包括在42℃、6X SSC(50％甲酰胺)中杂交2-24小时、随后是包括在室温和约2X SSC中洗涤一次或多次、随后在更高温度和低离子强度下进行额外的洗涤(例如在约37℃和约0.1X-0.5X SSC中至少洗涤一次、随后在约68℃、约0.1X-0.5XSSC中至少洗涤一次)。

本发明的蛋白可以是融合蛋白，其包含含有硫氧还蛋白活性位点的片段和可具有多种功能的融合片段。例如，这种融合片段可以作为工具而简化本发明蛋白的纯化，诸如能利用亲和层析纯化产生的融合蛋白。适宜的融合片段可以是具有所需功能的任何大小的区(例如，赋予蛋白增加的稳定性、赋予蛋白增加的免疫原性和/或简化蛋白的纯化)。本发明包括利用一或多种融合片段。融合片段可以与含有硫氧还蛋白活性位点的片段的氨基和/或羧基末端连接。融合片段与融合蛋白的含硫氧还蛋白活性位点之间的连接可对裂解敏感，以便可直接回收这种蛋白的含硫氧还蛋白活性位点的区。融合蛋白优选通过培养用融合核酸分子转化的重组细胞来制备，所述融合核酸分子编码蛋白，所述蛋白包含附着于含硫氧还蛋白活性位点区的羧基和/或氨基末端的融合片段。

一个实施方案中，适用于本发明方法中的含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽包括这样的含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽，其来自与所述蛋白给药的动物基本相似的物种。另一实施方案中，任何含有硫氧还蛋白的蛋白或肽，包括来自各种来源诸如微生物和植物的所述蛋白或肽可用于给定的患者。

本发明一个实施方案中，本文所述的任何氨基酸序列(如天然硫氧还蛋白的氨基酸序列)可利用至少1到多至约20种其它异源氨基酸制备，所述异源氨基酸序列侧接于特定的氨基酸序列的C-和/或N-末端。所得蛋白质或多肽可以称作“基本由”特定氨基酸序列组成。本发明的异源氨基酸为如下氨基酸序列：与所述特定氨基酸序列侧接的未天然发现(即在自然和体内没有发现)的序列，或与特定氨基酸序列功能不相关，或当其在基因中存在时不由与编码该特定氨基酸序列的天然存在的核酸序列侧接的核苷酸编码，条件是使用用于指定氨基酸序列所来源的生物体的标准密码子翻译天然存在序列中的这类核苷酸。类似地，当用于指本文的核酸序列时，术语“基本由...组成”指的是编码特定氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列可在其5′和/或3′端分别侧接至少1到多至约60个其它异源核苷酸。异源核苷酸是侧接编码特定氨基酸序列的核酸序列(正如其出现在天然基因中一样)的未天然发现的(即在自然，体内没有发现)，或不编码可将任意其它功能赋予具有所述特定氨基酸序列的蛋白质或改变所述蛋白质功能的蛋白质。

另一实施方案中，适用于本发明的方法的含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽包含分离的或在生物学上纯的蛋白，其已经从其天然环境中取出。由此，“分离的”和“生物学上纯的”不一定反映蛋白已被纯化的程度。本发明分离的蛋白可例如获自其天然来源，利用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增，克隆)制备，或通过化学方法合成。

优选，本发明方法所用的含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白的体内半衰期足以使患者的粘液或痰液的液化的可测定或可检测的增加(或粘稠性或粘着性降低)，或对具有所述粘液或痰液的患者产生可检测、可测定或可发觉的治疗益处。所述半衰期可通过递送所述蛋白的方法实现。本发明的蛋白在动物体内的半衰期优选大于约5分钟，更优选大于约4小时，更优选大于约16小时。在优选的实施方案中，本发明蛋白在动物体内的半衰期为约5分钟到约24小时，优选约2小时到约16小时，更优选约4小时到约12小时。

本发明其它实施方案包括编码含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽的核酸分子。所述核酸分子可用于产生在体外或体内用于本发明方法的蛋白。本发明的核酸分子包括这样的核酸分子，其包含编码本文所述任何蛋白的核酸序列，基本上由所述核酸序列组成或由所述核酸序列组成。本发明分离的核酸分子为已经从其天然环境中取出(即，已经接受人工操作)的核酸分子(多核苷酸)，并可包括可以包括DNA、RNA，或DNA或RNA的衍生物(包括cDNA)。因此，“分离的”并非反映核酸分子已被纯化的程度。尽管术语“核酸分子”主要指物理的核酸分子且术语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，但是两种术语可以互换使用，尤其是对于能够编码蛋白质的核酸分子或核酸序列而言可以互换使用。本发明分离的核酸分子可例如获自其天然来源，利用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增，克隆)制备，或通过化学合成而制备。分离的核酸分子可包括例如，基因，基因的天然等位基因变体，其编码区或部分，以及通过核苷酸插入、缺失、取代和/或翻转进行修饰的编码和/或调节区，所述修饰方式应基本上不影响所述核酸分子编码本发明所需蛋白的能力或在严格条件下与天然基因分离物形成稳定杂合子的能力。分离的核酸分子可包括简并性。本文的核苷酸简并性指一种氨基酸可由不同核苷酸密码子编码的现象。因此，编码本发明所用给定蛋白的核酸分子的核酸序列可由于简并性而变化。

本发明的参比基因包括与天然(即野生型)基因相关的所有核酸序列，诸如控制该基因所编码蛋白的产生的调节区(诸如但不限于，转录，翻译或翻译后控制区)，以及其自身的编码区。在另一实施方案中，基因可以是天然存在的等位基因变体，其包括与编码给定蛋白的核酸序列类似但不相同的序列。上文已描述过等位基因变体。术语“核酸分子”和“基因”在所述核酸分子包含上述基因时可互换使用。

优选使用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成制备本发明分离的核酸分子。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括、但不限于天然等位基因变体和其中的核苷酸已经被插入、缺失、取代和/或翻转的修饰核酸分子，所述方式应使得这类修饰对蛋白质的生物活性提供所需的影响。上文已经详细描述了等位基因变体和蛋白质同源物(例如由核酸同源物编码的蛋白质)。

可以使用本领域技术人员公知的许多方法生产核酸分子的同源物(例如，参见Sambrook等，文献同上)。例如，可以使用各种技术修饰核酸分子，所述技术包括但不限于传统诱变技术和重组DNA技术(如定点诱变、化学处理、限制酶切、核酸片段的连接和/或PCR扩增)，或寡核苷酸混合物的合成以及将混合物组连接以“构建”核酸分子的混合物及其组合。修饰编码给定蛋白的重组核酸分子的另一方法为基因改组(即分子繁殖(molecularbreeding)(见，例如美国专利5,605,793，授予Stemmer；Minshull and Stemmer；1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3：284-290；Stemmer，1994，P.N.A.S.USA 91：10747-10751，其内容包含在本文作为参考)。可利用该技术以将多种改变同时有效导入所述蛋白。核酸分子同源物可通过与给定基因杂交或筛选核酸分子所编码的蛋白的功能(即，生物活性)来选择。

本发明的一个实施方案涉及重组核酸分子，它包括与至少一种转录控制序列可操作地连接的上述分离的核酸分子。更具体地，本发明的重组核酸分子通常包含重组载体和本文所述的分离的核酸分子。本发明的重组载体为改造(即人工生产的)的核酸分子，它用作操作被选择的核酸序列和/或将这类核酸序列导入宿主细胞的工具。该重组载体由此适用于克隆、测序和/或操作所选择的核酸序列，诸如通过表达所选择的核酸序列和/或将其递送入宿主细胞以形成重组细胞来进行。这类载体一般含有异源核酸序列，所述异源核酸序列是并非天然发现与待克隆或递送的核酸序列相邻的核酸序列，但是所述载体还可以含有天然发现的与本发明核酸分子相邻或用于表达本发明核酸分子的调节核酸序列(例如启动子、未翻译区)(下文详细讨论)。该载体可以为原核生物或真核生物RNA或DNA，且一般为质粒。可以将该载体保持为染色体外元件(例如质粒)或可以将其整合入重组宿主细胞的染色体中，但是在本发明的大多数应用中如果载体保持与基因组分离是优选的。这种完整的载体可以适当保留在宿主细胞中，或在一些条件下，所述质粒DNA可以缺失，从而留下本发明的核酸分子。整合的核酸分子可以受染色体启动子控制、受天然或质粒启动子控制或数种启动子控制的组合。可以将核酸分子的单或多个拷贝整合入染色体。本发明的重组载体可以含有至少一种选择标记。

在一个实施方案中，用于本发明重组核酸分子的重组载体为表达载体。本文所用的术语“表达载体”用以指适合于产生编码的产物(例如目的蛋白质)的载体。在该实施方案中，将编码待产生产物(例如含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白)的核酸序列插入所述重组载体中，以产生重组核酸分子。将编码待产生蛋白质的核酸序列插入所述载体，使得该核酸序列与载体的调控序列可操作地连接，使得所述核酸序列能够在重组宿主细胞中转录和翻译。

在本发明另一个实施方案中，所述重组核酸分子包含病毒载体。病毒载体包含整合在病毒基因组中的本发明的分离的核酸分子或其一部分，其中所述核酸分子包装在使得DNA进入细胞的病毒外壳中。可使用多种病毒载体，包括但不限于，基于甲病毒(alphaviruse)，痘病毒(poxvirus)，腺病毒(adenovirus)，疱疹病毒(herpesvirus)，慢病毒(lentivirus)，腺伴随病毒(adeno-associated virus)以及逆转录病毒(retrovirus)。

一般来说，重组核酸分子包括可操作地与一种或多种表达控制序列连接的本发明的至少一种核酸分子。本文所用的术语“重组分子”或“重组核酸分子”主要指的是与表达控制序列可操作地连接的核酸分子或核酸序列，而当这类核酸分子为如本文所述的重组分子时，可以与术语“核酸分子”互换使用。本发明的术语“可操作地连接”指的是将核酸分子与表达控制序列按照使得该分子能够在转染(即转化、转导、转染、偶联(conjugated)或导入(conduced))到宿主细胞时被表达的方式进行连接。转录控制序列是控制转录起始、延伸或终止的表达控制序列。特别重要的转录控制序列为那些控制转录起始的序列，诸如启动子、增强子、操纵子和阻抑子(repressor)序列。合适的转录控制序列包括可以在待导入所述重组核酸分子的宿主细胞或生物体中起作用的任意转录控制序列。本发明的重组核酸分子还可以含有其它调节序列，诸如翻译调节序列、复制起点和其它与重组细胞相容的调节序列。在一个实施方案中，本发明的重组分子(包括整合入宿主细胞染色体的那些重组分子)还含有分泌信号(即信号片段核酸序列)以使表达的蛋白质能够从产生该蛋白质的细胞中分泌。合适的信号片段包括与待表达的蛋白质天然相关联的信号片段或能够指导本发明蛋白质分泌的任意异源信号片段。在另一个实施方案中，本发明的重组分子包括能够将表达的蛋白质递送并插入至宿主细胞膜中的前导序列。合适的前导序列包括与蛋白质天然相关的前导序列，或能够指导所述蛋白递送并插入细胞膜的任意异源前导序列。

本发明的术语“转染”用于指可以将外源性核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞的任意方法。当用以指将核酸分子导入微生物细胞或导入植物细胞时，术语“转化”可以与术语“转染”互换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述因微生物获得外源性核酸而导致的遗传改变，且基本上与术语“转染”同义。然而，在动物细胞中，转化还有另一含义，例如指细胞变为癌细胞后，在培养物中的细胞生长性质改变(上述)。因此，为避免混淆，术语“转染”优选用于将外源核酸引入动物细胞，且用于本文中通常包括动物细胞的转染以及植物细胞和微生物细胞的转化，使得该术语涉及将异源核酸导入细胞。因此，转染技术包括但不限于转化、粒子轰击、电穿孔、微注射、脂转染、吸附、感染和原生质体融合。

本发明的一种或多种重组分子可以用于生产本发明的编码产物(例如，含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白)。在一个实施方案中，通过在有效产生蛋白质的条件下表达本文所述的核酸分子来生产编码的产物。生产编码蛋白的优选方法是通过用一种或多种重组分子转染宿主细胞以形成重组细胞。

在一个优选实施方案中，使含有还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽与待处理的粘液或痰液在组合物中接触。所述组合物包含含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白，并可包含一或多种其它化合物，诸如可用于降低粘液或痰液的过高粘稠性或粘着性或增加所述粘液或痰液的液化的其它化合物。一个实施方案中，可利用组合物以将编码含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽的核酸分子递送到待治疗患者的细胞(例如肺或气道中的上皮细胞)，使得所述细胞能够被蛋白转染并表达所述蛋白，并且使得所述蛋白可在该细胞的微环境下与粘液或痰液接触。

组合物可包括，例如可药用的载体，所述载体包含可药用的赋型剂和/或递送载体，用于将蛋白或核酸分子或其它调节化合物递送到患者。本文中，可药用的载体指任何适合将治疗性蛋白，核酸或其它可用于本发明方法中的化合物递送到适宜的体内或体外位点的物质。优选的可药用的载体能够将蛋白，核酸分子或化合物保持在所需的位点(如待治疗的粘液或痰液被分泌或引流的位点)，能够与所述粘液或痰液接触(在蛋白或化合物的情况下)或能够进入所述细胞并由所述细胞表达(在核酸分子的情况下)，使得所表达的蛋白可已和粘液或痰液接触。本发明的适宜赋型剂包括这样的赋型剂或制剂，其可将治疗剂(蛋白，核酸或化合物)转运到细胞、组织或体液(粘液或痰液)或辅助所述转运，但不是特异性靶向(本文也称为非靶向性载体)。可药用赋型剂的实例包括，但不限于水，磷酸盐缓冲的盐水，林格氏(Ringer’s溶液，右旋糖溶液，含血清溶液，Hank’s液，其它含水生理平衡的溶液，油，酯或甘油。含水载体可含有适宜的辅助物质，所述辅助物质是通过例如增加化学稳定性和等张性来模拟(approximate)赋型剂的生理条件所需的。

适宜的辅助物质包括，例如乙酸钠，氯化钠，乳酸钠，氯化钾，氯化钙，以及其它用于产生磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液，以及碳酸氢盐缓冲液的物质。辅助物质还可包括防腐剂，诸如硫柳汞(thimerosal)，m-或o-甲酚，福尔马林和苯基醇(benzol alcohol)。本发明的组合物还可通过传统方法灭菌和/或冻干。

一种可药用的载体包括控释型制剂，其能够将本发明的组合物缓慢释放到患者体内。本文的控释制剂包括控释载体中的一或多种本发明的治疗剂。适宜的控释载体包括，但不限于，生物相容的聚合物，其它聚合物基质，胶囊，微胶囊，微颗粒(microparticle)，丸剂，渗透泵，扩散装置，脂质体，脂质球(liposphere)，和透皮递送系统。适宜的核酸递送载体包括，但不限于，脂质体，病毒载体或其它递送载体，包括核酶。

脂质体递送载体包含能够将蛋白、化合物或核酸分子递送到患者中适宜的细胞和/或组织的脂质组合物。脂质体递送载体可包含能够与细胞浆膜融合以将所述组合物递送到细胞中的的脂质组合物。脂质体递送载体优选能够在患者中保持稳定的时间足够长，以将组合物递送到患者体内的优选位点。本发明所用的适宜脂质体包括任何脂质体。

含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽的适宜或有效给药量指这样的量：能够通过将其活性位点二硫醇可逆性氧化成二硫化物参与氧化还原反应，能够催化二硫醇-二硫化物交换反应，并特别地能够降低粘液或痰液的粘稠性或粘着性和/或增加患者的粘液或痰液的液化，以及更特别地能够增加患者的粘液或痰液的液化以对该患者提供足够的治疗益处。粘液或痰液的粘稠性或粘着性降低或液化增加可通过上文所述或本领域技术人员已知的任何适宜方法来测定、检测或确定。

一个实施方案中，将给药患者的含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽的优选量包含约0.1微摩尔x千克^-1到约150微摩尔x千克^-1患者体重。另一实施方案中，将给药患者的含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽的优选量为约1.5微摩尔x千克^-1到约150微摩尔x千克^-1患者体重。将给药患者的含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽的更优选量为约2微摩尔x千克^-1到约25微摩尔x千克^-1患者体重。将给药患者的含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽的进一步优选的量为约3微摩尔x千克^-1到约10微摩尔x千克^-1患者体重。

另一实施方案中，如果所述递送途径是气溶胶或类似途径，将给药患者的含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽量为至少约0.25mg每剂量单位(例如，人的剂量单位通常为约2-3ml)和约25mg每剂量单位。优选，将给药患者的含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽量为至少约0.25mg每剂量单位，更优选至少约0.3mg每剂量单位，更优选至少约0.35mg每剂量单位，依此类推，以0.05mg递增，直到超过25mg每剂量单位。对于气溶胶递送，通常仅约10％的气溶凝胶积真正递送到气道中。因此，对于其它给药途径，当将递送到所述位点的组合物体积较大时，很容易看出可使用较低剂量的包含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽。

给药动物的本发明蛋白的最佳量根据给药途径而不同。例如，如果所述蛋白通过吸入(气溶胶)途径给药，将给药的最佳量可不同于其经气管内注射给药的最佳量。本领域技术人员能够根据所述给药途径改变所述量。注意到本发明的蛋白的适宜量为具有所需功能而对动物无毒的量。

本发明优选实施方案中，含有包含硫氧还蛋白反应性位点的蛋白的本发明组合物进一步和一或多种制剂配制在一起，所述制剂包含将所述蛋白中的硫氧还蛋白活性位点保持为或还原为还原状态的还原系统。优选，这种制剂包括磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原形式)(NADPH)和/或硫氧还蛋白还原酶，其中含NADPH的制剂是尤其优选的。本发明人发现具有含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽的还原系统的存在可明显增加含硫氧还蛋白活性位点的蛋白在本发明的方法中发挥功能的能力(例如，增加粘液或痰液的液化)。此外，本发明人发现包含NADPH作为还原系统是足够的，并因此，硫氧还蛋白还原酶不是所述还原系统的必要组分，但如需要可包含在内。其它还原系统可用于本发明中且包括但不限于NADH依赖性硫氧还蛋白还原酶、硫锌酸(lipoic acid)和其他生物还原剂。通常，本发明人考虑还原性相当物的最初来源(很可能是NADPH或NADH)是实现本发明组合物最佳疗效的重要组分。然而，也可使用起将所述还原性相当物(H+，来自NADPH或NADH)转移到硫氧还蛋白或含硫氧还蛋白活性位点的分子的介导作用的其它组分。

当NADPH包含在本发明的组合物中时，所述组合物优选用约0.5μM到约20mM、更优选为约5μM到约2mM，更优选约50μm到约200μM的获得的(achieved)NADPH表面浓度配制。在另一实施方案中，该组合物可用任何合适量的NADPH配制，优选约0.5μM到约20mM以0.1μM递增的获得的(achieved)NADPH表面浓度(即，0.5μM，0.6μM，...19.9μM，20μM)。“获得的表面浓度”是具体化学物质例如NADPH在细胞或组织表面的获得的或存在的浓度，例如在肺上皮衬细胞表面。因此，需要实际给药更大浓度的具体化学物质以获得特定的表面浓度。本领域技术人员可确定所述浓度。当硫氧还蛋白还原酶包含在本发明的组合物中时，优选将其配制成使硫氧还蛋白还原酶的获得的表面浓度为约0.001μM到约1μM，更优选为约0.001μM到约0.1μM，包括约0.0001μM到1μM之间以0.001μM递增的任何量。一个实施方案中，无需将任何硫氧还蛋白还原酶包含在本发明的组合物中。在本发明的范围内，本领域技术人员可根据含有所述活性位点的蛋白或肽的量或递送模式改变硫氧还蛋白还原酶和/或NADPH的量，以保持或增强硫氧还蛋白活性位点的还原态。

如上述，本发明的组合物可包含一或多种其它化合物，诸如可用于降低粘稠性或粘着性过高的粘液或痰液或增加所述粘液或痰液的液化的其它化合物。这类化合物的实例是本领域已知的，并包括但不限于纯化的rhDNase，N-乙酰半胱氨酸，nacystelyn(N-乙酰-L-半胱氨酸衍生物)和溶胶素。

如上所述，将本发明的组合物以将所述组合物有效递送到靶位点(例如待用蛋白和化合物处理的粘液或痰液，将位于或存在于待用重组核酸分子治疗的粘液或痰液环境中的靶宿主细胞)的方式给药患者，所述组合物特别为包含硫氧还蛋白活性位点的蛋白，包含编码含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽的核酸序列的重组核酸分子，和/或所述组合物中的任何其它化合物。适宜的给药方案包括任何体内或离体给药方案。

根据本发明，有效给药方案(即，有效给药本发明所述组合物的方式)包含适宜的剂量参数以及给药方式，其导致含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白和/或组合物中的其它化合物与待处理的粘液或痰液接触或编码含硫氧还蛋白活性位点的蛋白的重组核酸分子在患者所需宿主细胞中转染或表达，优选使得所述患者从所述给药中获得一些可测定的、可观察的或可察觉的益处。一些情况下，通过从患者取粘液或痰液样品，可利用本文所述用于评估粘液或痰液粘稠性或液化的方法确定有效剂量参数。可选，可通过利用体外样品，体内动物模型进行实验，且如果所述患者是人最后还包括临床试验来确定有效剂量参数。有效剂量参数可利用本领域治疗具体疾病的标准方法确定。所述方法包括，例如确定存活率，副作用(即毒性)和疾病的进展或回落(regression)。

根据本发明，将本发明组合物给药患者的适宜方法包括适于将组合物递送到患者体内所需位点的任何体内给药途径。给药的优选途径对本领域技术人员是明显的，并有赖于所述化合物是蛋白，核酸或其它化合物(例如药物)，所述组合物将给药机体(body)的哪个部位，或患者所患的疾病或病症。通常，体内给药的方法包括，但不限于静脉内给药，腹腔内给药，肌肉内给药，冠脉内给药(intracoronary administration)，动脉内给药(例如给予颈动脉)，皮下给药，经皮递送，气管内给药，皮下给药，关节内给药，心室内给药，吸入(例如气溶胶)，脑内，经鼻，口服，肺内给药(pulmonaryadministration)，植入导管或直接注射到组织内。耳递送(Aural delivery)可包括滴耳剂，鼻内递送可包括滴鼻剂和鼻内注射，以及眼内递送可包括滴眼剂。气溶胶(吸入)递送也可利用本领域标准方法进行(见例如Stribling等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189：11277-11281，1992，其全文内容包含在本文中作为参考。)口服递送可包括可通过口例如作为片剂或胶囊或配制在食物或饮料产品中而被服用的固体和液体。其它可用于粘膜组织的给药途径包括经气管，皮内，肌肉内，鼻内，其它吸入型，经直肠，皮下，局部，经皮，经阴道，经宫颈，经宫颈和尿道(pericervical and urethral)途径。此外，给药方案可包括预处理机构(device)，将隔膜(diaphragm)中的蛋白、肽或组合物用于例如宫颈，以用于治疗诸如不育。本发明优选实施方案中，当给药将本发明的蛋白或组合物以治疗呼吸道(气道)中粘稠性或粘着性过高或异常的痰液或粘液时，含硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽(或组合物)或其它化合物通过以下途径给药，所述途径包括但不限于：吸入(即通过吸入气溶胶，例如在表面活性剂中或与表面活性剂一起)；通过支气管镜直接装入肺中，气管内管(endotracheal tube)和/或通过任何人工通气装置；经鼻给药(鼻内或经鼻)，经支气管，或气管内(即通过直接注入气管或气管切开术)，或直接或借助脂质-包囊化(lipid-encapsulation)或表面活性剂。任何可想到的将组合物或蛋白导入气道使得其与气道中的粘液或痰液接触的方法均包含在本发明内。

本发明公开的各种给药和递送载体的方法已经显示对于将核酸分子递送到靶细胞有效，使得所述核酸分子转染该细胞并被表达。在许多研究中，将异源基因成功递送并表达可在优选的细胞类型中和/或利用本发明优选的递送载体和给药途径来实现。

例如，利用脂质体递送，美国专利5,705,151(1998年1月6日公开，授予Dow等)证实了阳离子脂质递送载体中编码超抗原的核酸分子和编码细胞因子的核酸分子可成功进行体内经静脉内递送，而所编码的蛋白在动物组织具体是肺组织中表达。此外，Liu等，Nature Biotechnology 15：167，1997证明含基因的含胆固醇阳离子脂质体的静脉内递送优选靶向肺组织的基因并有效介导所述基因在体内的转移和表达。Dzau和同事的许多公开出版物证实了可成功将基因递送入心脏细胞，并使所述基因表达，所述心脏细胞包括心肌细胞和纤维母细胞，以及血管平滑肌细胞，其利用裸DNA和用于日本(Japan)-脂质体递送的凝血病毒(hemagglutinating virus)，并通过与心包共同保温并输注入冠状动脉(冠脉内递送)中来进行(见例如，Aoki等，1997，J Mol.Cell，Cardiol.29：949-959；Kaneda等，1997，Ann N.Y. Acad Sci.811：299-308；和vonder Leyen等，1995，Proc Natl Acad Sci USA 92：1137-1141)。

多种核酸序列的递送可通过给药编码核酸序列的病毒载体来实现。利用所述载体，可用离体递送实现成功递送和表达(见例如，逆转录病毒载体；Blaese等，1995，Science 270：475-480；Bordignon等，1995，Science 270：470-475)，经鼻给药(CFTR-腺病毒伴随载体)，冠脉内给药(腺病毒载体和日本凝血病毒载体，见上文)，静脉内给药(腺伴随病毒载体；Koeberl等，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94：1426-1431)。Maurice等(1999，J.Clin.Invest.104：21-29)的公开物证实了通过冠脉内递送给药的编码β2-肾上腺能受体的腺病毒载体导致该基因在体内的弥漫多室型(diffuse multichamber)心肌表达，以及随后的血流动力学功能明显改善以及其它生理参数改善。Levine等描述了通过利用腺病毒载体并直接将所述构建体注射到脂肪组织中，将基因在体外，离体和体内递送到人脂肪细胞和兔脂肪细胞并在其中表达所述基因(Levine等，1998，J.Nutr.Sci.Vitaminol.44：569-572)。

在神经元基因递送的领域，报道了许多成功的体内基因转移。Millecamps等报道了利用位于转基因启动子(磷酸甘油酯启动子)上游的神经元限制性增强元件(neuron restrictive enhancer element)将腺病毒载体靶向神经元。所述载体可分别经肌肉内和脑内给药小鼠和大鼠，导致神经元特异性转染以及所述转基因在体内表达的成功(Millecamps等，1999，Nat.Biotechnol.17：865-869)。如上所述，Bennett等报道了腺伴随病毒载体在通过在体内在视网膜神经层(neural retina)经视网膜下注射递送并表达基因一年以上中的用途(Bennett，1999，同上)。

将基因递送到滑膜和关节接合处(articular joints)也取得了成功。Oligino及同事报道了立即早期基因ICP4，22和27缺陷的单纯疱疹病毒载体在体内在滑膜衬(synovial lining)细胞中递送并表达两种不同受体中的用途(Oligino等，1999，Gene Ther.6：1713-1720)。所述疱疹病毒载体通过关节内注射给药。Kuboki等利用腺病毒介导的基因转移和关节内注射成功并特异性地在豚鼠体内的颞下颌关节中表达了基因(Kuboki等，1999，Arch.Oral.Biol.44：701-709)。Apparailly和同事将编码IL-10的腺病毒载体系统给药小鼠，并证实了所述基因产物的成功表达以及对于治疗实验诱导的关节炎的明显治疗效果(Apparailly等，1998，J.Immunol.160：5213-5220)。在另一项研究中，基于小鼠白血病病毒的逆转录病毒载体可离体和在体内用于递送(通过关节内注射)并表达人生长激素基因(Ghivizzani等，1997，Gene Ther.4：977-982)。这项研究显示，通过体内基因转移导致的表达至少相当于离体基因转移。如上所述，Sawchuk等报道了腺病毒载体通过关节内注射在体内成功递送基因，并通过用抗T细胞受体单克隆抗体预处理所述关节延长所述基因在滑膜内的表达(Sawchuk等，1996，出处同上)。最后，利用逆转录病毒对人白介素-1受体拮抗剂进行离体基因转移可产生高水平关节内表达并对治疗关节炎有疗效，且所述实验已进入FDA批准的人基因治疗实验(Evans andRobbins，1996，Curr.Opin.Rheumatol.8：230-234)。因此，基因治疗的现状导致FDA将人基因治疗作为治疗至少关节炎的适宜策略。总而言之，所有上述基因治疗中的研究表明，本发明的重组核酸分子的递送和表达是可行的。

另一种递送重组分子的方法是非靶向型载体(例如，作为“裸露”的DNA分子，如Wolff等，1990，Science 247，1465-1468中的教导)。这种重组核酸分子通常通过直接或肌肉内给药注射。通过裸露的DNA给药来给药的重组核酸分子包括本发明的分离的核酸分子，并优选包含本发明的重组分子，所述重组分子优选具有复制或扩增能力。本发明的裸露的核酸试剂可包含一或多种本发明的核酸分子，包括双顺反子重组分子。裸露的核酸递送包括肌肉内，皮下，皮内，经皮，鼻内和口服给药途径，其中直接注射到靶组织中是最优选的。裸露的核酸疫苗的优选单剂量的范围为约1纳克(ng)到约100μg，根据给药途径和/或递送方法而不同，这可由本领域技术人员确定。适宜递送方法包括，例如通过注射、作为液滴、气溶胶化和/或经局部。一个实施方案中，纯DNA构建体覆盖金颗粒(直径1-3μm)表面，并利用“基因枪”推入皮肤细胞或肌肉内。

本发明的方法中，治疗组合物可给药任何脊椎动物种类，哺乳动物，包括但不限于，灵长类，啮齿类，家畜和家养宠物。优选要保护的患者是人。

以下实施例是为了显示而非限制本发明的范围。

实施例

以下物质和方法用于以下实施例1-6。

试剂和物质冻干的重组大肠杆菌(E.coli)Trx得自Promega(Madison，WI)。大肠杆菌TR来自American Diagnostica，(Greenwich，CT)。β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原形式(NADPH)，还原的GSH，谷胱甘肽还原酶，二硫苏糖醇(dithiothreitol)，二异丙基氟代磷酸酯(disopropylflurophosphate)，抑肽酶(aprotinin)，N-乙基马来酰亚胺，schiff试剂，鲑精(salmon testes)DNA，和Hoechst染料均得自Sigma Chemical(St.Louis，MO)。N-乙酰半胱氨酸得自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)。所有其它化学物质均为最高可能的级别。

痰液收集 痰液得自患有CF的成人和儿童患者，所述患者来自NationalJewish Medical and Research Center(Denver，CO)以及the Children’s Hospital(Denver，CO)。如果患者在两次独立的毛果芸香碱离子电渗疗法(iontophoresis)出汗实验(sweat test)的汗液氯离子值均超过60mM并在随后的基因分析中显示两处产生CF的等位基因突变，则所述患者被诊断为患有CF。所有样品通过自发咳出或高渗盐水诱导获得。含有明显可检测唾液的痰液样品被弃去。咳出后，将样品保存在-80℃备用。痰液收集方案，数据采集，以及同意(consent)/赞同(assent)表格均为the Institutional Review Boardof the University of Colorado Health Science Center(COMIRB)及其附属医院所批准的。

压缩实验 保存在-80℃的CF痰液在室温融化并利用容积式移液管(positive displacement pipette)(Rainin，Emeryville，CA)将其体积为275μl的等分试样加入1.5ml的Eppendorf离心管。向痰液样品中加入25μl含适当摩尔浓度的以下试剂的H₂O，将痰液样品进行所述试剂处理，所述试剂为：稀释剂(H₂O)，Trx+TR+NADPH，GSH+谷胱甘肽还原酶+NADPH，二硫苏糖醇(DTT)或N-乙酰半胱氨酸。简单涡旋搅拌后(约1秒)，将样品管置于微量滴定管热轮转加热器(microtube rotisserie)(Barnstead，Dubuque，IA)上，并在37℃保温20分钟。随后将所述样品进行加工用于根据Daugherty等教导的方法(Daugherty等，Biomaterials 16：553-558，1995)进行压缩实验。为进行所述实验，将各样品加入100μl玻璃微毛细管(Fisher Scientific)中，所述微毛细管已经焊接在200μl移液管上以获得紧密配合。利用三种改进的毛细管吸出＞90％的各痰液样品。随后将毛细管从其吸液管尖端(pipette tip)去除，用粘土密封，并在血沉离心机(IEC，Needham Heights，MA)中离心10分钟，然后测定各管中凝胶(固体)和含水(液体)相的长度(以毫米表示)。每个毛细管中的液体部分(fraction)百分比通过用含水相长度除以总长度(凝胶+含水)×100来计算。对来自各个样品的液体部分(％)的三组测定值进行平均以产生对应每种处理条件的单一值。

磁性微流变测定法 对应于处理的粘弹性改变通过King(King M.，Magnetic microrheometer.In：Methods in Bronchial Mucology，edited by BragaPC，and Allegra L.New York：Raven Press，1988，p.73-83)研发的磁性微流变测定法测定。将80-120μM的钢球置于10mg痰液样品中。利用电磁石使得所述球体震荡，其在显微镜下的图像为突出到一对光电池上。粘液阻碍所述球体的运动，该效应可通过用所述球体的运动对示波镜(oscilloscope)上的磁铁的驱动力作图来显示，并由该图测定G^*。G^*是粘稠性和弹性的机械阻力或载体总和。对于Trx和NADPH剂量反应曲试验线，在任何处理前测定10rad/s的log G^*(基线)，然后在以下条件保温20分钟后测定：无处理，稀释剂(H₂O)，或具有还原系统的Trx。将所有处理给予样品，所述处理在体积为总样品体积10％的水中。每一种测定都针对每份等分试样进行。

从痰液提取糖蛋白 从痰液提取可溶糖蛋白根据Davies等(Davies andCarlstedt，Methods Mol Biol 125：3-13，2000)所述方法进行。275μl的CF痰液在37℃仅用25μl H₂O或含Trx(10或30，μM)+NADPH(2mM)和TR(0.1μM)的H₂O处理20分钟。处理后，将含有1mM二异丙基氟代磷酸酯和10μg/ml抑肽酶的100μl H₂O加入各个样品中，然后在4℃以22,000g离心15分钟。将每种样品所得的上清液(水相)转移到新的微量离心管中并保存在-20℃。在250μl胍盐提取物缓冲液(6M氯化胍；5mM EDTA；10mM磷酸钠缓冲液，pH6.5；1mM N-乙基马来酰亚胺；100μM二异丙基氟代磷酸酯；和1μg/ml抑肽酶)存在的条件下，利用移液管尖端将各个样品剩余的固体凝胶部分小心地从试管底部取出，并在4℃旋转14小时。离心后，来自该凝胶相提取物的所得上清液被转移到干净的试管中并在-20℃中冷冻保存直到用于电泳。

糖蛋白含量分析 液相和凝胶相样品的糖蛋白含量通过用高碘酸Schiff试剂(PAS)根据Thornton等(Thornton等，Methods Mol Biol 125：77-85，2000)所述的方法进行染色来评估。解冻含水和凝胶样品，并将各样品的80μl等分试样加在装在Biomax水平电泳仪(Kodak，Rochester，NY)中的1.0％琼脂糖凝胶(150mm×125mm)上。电泳试剂如下：电泳缓冲液：40mM Tris-乙酸盐，1mM EDTA，pH8.0，0.1％ SDS；加样缓冲液：60％电泳缓冲液，40％甘油(v/v)和0.005％(w/v)溴酚蓝。通过真空点样器(vacuum blotter(BoeckelScientific，Feasterville，PA))将凝胶成分转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，利用0.6MNaCl，60mM柠檬酸钠作为转移溶液。转移后，将所述膜在换水的条件下洗涤三次，将该膜转移到200ml 1％高碘酸(v/v)3％乙酸(v/v)溶液中并在室温保持30分钟。用1mM HCl中的0.1％焦亚硫酸钠漂洗所述膜两次，并置于Schiff试剂6分钟。

测定总DNA含量 将275μl CF痰液在不作任何处理、与25μl H₂O一起，或与25μl含Trx(30μM)+TR(0.1μM)以及NADPH(2mM)的H₂O一起的条件下进行保温。在37℃保温20分钟后，将100μl H₂O加入各样品，然后离心(22,000xg)10分钟。分离产生的凝胶和液体相并与相同体积的消化液在50℃一同保温4小时，所述消化液含有100mM Tris Cl，5mM EDTA，200mM NaCl，0.5％ Tween 20和1mg/ml蛋白酶K。通过苯酚/氯仿提取从液体和凝胶相纯化DNA，并重悬于100μl TE缓冲液，pH8.0中。DNA浓度通过Hoechst实验(Labarca和Paigen，Anal Biochem 102：344-352，1980)利用F-2000荧光计(Hitachi，Schaumburg，IL)在575nM的激发波长和555nm的发射波长下进行测定。溶于TE缓冲液的鲑精DNA用于建立标准曲线。

统计学 图中的数据表示为平均值±标准偏差，但图4A和4B显示标准误差。利用线性混合效应模型(linear mixed-effects modeling)法分析所述处理对液化，粘弹性，和痰液样品的DNA溶解性的影响。当将多种处理与单个对照进行比较时，采用Dunnet’s校正。压缩实验的重现性通过在线性模型中计算组内相关系数来评估。所有分析利用SAS version 8.2(SAS InstituteInc，Cary，NC)进行。显著性定义为p＜0.05。

实施例1

以下实施例描述了Trx还原系统对液体从CF痰液中释放的影响。

由于CFTR基因缺陷造成的异常离子转运，CF患者中的气道分泌物通常是干燥的。结果，脓性CF痰液主要由僵硬且非流动性的生物聚合物基质组成，通常称为凝胶相，并且含有较少量的可溶性液体相。为评估Trx对痰液中这两种相的比例的影响，进行压缩实验测定。在第一次实验中，用含0，1，10或30μM Trx；0.1μM TR；和2mM NADPH(终浓度)的25μl H₂O处理等体积痰液样品。保温20分钟后，每种样品的液体部分用压缩实验确定。

在暴露于Trx以前，存在于液相中的CF痰液的平均(+SD)百分比为3.5±2.9％(图1A；数值来自5次独立实验。相对于暴露于H₂O的样品的^*P＜0.05)。用等于痰液的10％的稀释剂(H₂O)处理的等分试样显示出液相中存在的痰液比例有较小的、不明显的增加(6.2±6.6％)。反之，在用Trx还原系统(Trx+0.1μM TR，和2mM NADPH)处理后，CF痰液的液相明显增加。用Trx(1μM)处理痰液使得痰液的液体部分增加到37.8±15.4％。液体部分的最大增加出现在与较高的Trx(30μM)浓度一同保温的样品下(74.5±15.6％)。

为检验NADPH的影响，来自不同供体的其它样品用30μM Trx，0.1μMTR和0，0.2，0.6，1.0或2mM NADPH处理20分钟。用Trx和TR而没有NADPH处理的样品在液相中存在的痰液百分比低(2.9％±1.3％)。用NADPH处理的等分试样的液相部分显示剂量依赖性增加，最大的增加出现在2mM(70.55±18.13％)(图1B)。在用NADPH而无Trx的条件下处理的痰液的液体部分中存在的痰液比例没有任何增加(未显示)。

实施例2

以下实施例显示实施例1的压缩实验测定的可重复性。

为评估压缩实验测定的可重复性，将来自三种不同CF供体的痰液样品分成等分试样并进行冷冻。具体地，将从三种不同供体(A，B，C)新鲜分离的CF痰液分成275μl的等分试样并进行冷冻。解冻后，将在不进行处理、或与H₂O，10μM Trx(+0.1μM TR和2mM NADPH)一起，或与二硫苏糖醇(DTT，1或5mM)一起保温所述等分试样20分钟，并通过压缩实验测定液体百分比。从对每份供体样品进行的三次独立实验获得的结果用于评估实验可重复性。在连续三天中，对等分试样进行解冻，并用水、Trx及其还原系统、二硫苏糖醇(DTT)进行处理，或不进行处理。

如图2所示，来自没有加入物质或加入稀释剂(H₂O)处理的供体A的等分试样的液相部分低于其总体积的10％。用DTT(1mM或5mM)，或Trx(30μM)及还原系统处理的来自供体A的痰液等分试样中的液体部分增加到总样品体积的90％以上。来自供体A的痰液样品的这些液体部分百分比值在随后的独立实验中进行的第二次和第三次测定时对相同处理的波动不明显。供体B和C样品响应Trx或DTT暴露而出现的改变程度小于供体A的痰液样品中出现的改变，但仍与对照有明显差异。对于来自供体B的样品，药物处理后存在于液态中的痰液的百分比变化在3天中的范围为：1mMDTT-24～31％；5mM DTT-42～57％，30μM Trx-46～51％。对来自供体C的痰液，液体百分比范围为：1mM DTT-57～61％；5mM DTT-77～79％，30μMTrx-62～81％。这些结果显示压缩实验具有足够的样品间可重复性，从而证实了其可有效作为测定痰液样品异源组的药物诱导的液化的方法。

实施例3

以下实施例显示Trx是比谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸更有效的痰液液化试剂。

将Trx在液化痰液中的有效性与其它单硫醇和二硫醇还原剂进行比较。将痰液样品等分，并用Trx或GSH处理20分钟，通过压缩实验测定液体百分比。首次压缩试验比较了Trx和GSH还原系统在等摩尔浓度的NADPH存在下液化痰液中的效力。与对照相比(没有添加物)，用10，30，或60μM Trx处理的痰液中的液体部分百分比有逐步的明显增加(图3A)。反之，暴露于相等浓度或高达1mM的浓度的GSH以后，没有观察到痰液的液体部分的明显增加。在独立的研究中，观察到利用整个浓度范围的N-乙酰半胱氨酸(图3B)对于引起痰液液化的有效性也低于Trx。根据图3A和3B，示出的实际百分比为：无处理＝2.7±2.3％；H₂O＝4.5±2.7％；10μM Trx＝34.8±6.6％；30μM Trx＝54.6±10.4％；60μM Trx＝67.0±8.0％；30μM GSH＝7.8±5.7％；100μM GSH＝15.9±9.3％；1mM GSH＝27.6±3.9％。Trx和NAC功效的分析也在保温20分钟后、但对不同的痰液样品组测定。所示值为5(GSH)或4(NAC)次实验的平均值(相对于无处理的^*P＜0.05)。

实施例4

以下实施例显示了Trx还原系统对痰液粘弹性的影响。

进行磁性微流变测定法以测定Trx及其还原系统对痰液粘稠性的影响。

在与Trx还原系统(表1)一同保温前后的痰液样品上进行测量以确定log G^*(粘弹性)的变化。

                              表1

无处理、H₂O，或硫氧还蛋白-暴露的CF痰液的粘弹性数据(log G^*)

处理	无	H2O	3μM Trx	10μM Trx	30μM Trx
						前	3.31±0.05	3.30±0.06	3.37±0.06	3.33±0.06	3.28±0.04
后	3.22±0.04	3.20±0.03	3.11±0.04	2.94±0.05	2.63±0.04

CF痰液的等分试样在无处理、与H₂O一起，或与Trx+还原系统(0.1μMTR和2μM NADPH)一起，在37℃保温20分钟。4个样品的所有数据均显示为log G^*(平均值±标准误差)。

在图4A所示的实验中，痰液样品与H₂O、或3，10或30μM Trx+0.1μM TR以及2mM NADPH一同保温20分，并通过磁性微流变测定法测定log G^*。数据显示为暴露前后log G^*的测定值差异(在Y-轴上显示)。每栏均表示4个样品的平均值±标准误差(◆与H₂O稀释剂值有统计学上的显著性)。痰液与稀释剂(H₂O)一同保温20分钟，导致logG^*与预处理值相比稍有降低(0.11 log单位)。暴露于Trx(3μM)，TR(0.1μM)和NADPH(2mM)导致log G^*与单独使用稀释剂处理相比明显降低(图4A)(0.26 log单位)。暴露于较高浓度的Trx的样品出现更明显的降低(分别为在10μM Trx时降低0.39log单位，在30μM Trx时降低0.65 log单位)。

还检测了不同NADPH浓度的影响(图4B；与H₂O或10μM Trx，0.1μM TR，以及0.2，0.6或2mM NADPH一同保温后log G^*的变化)。暴露于Trx(30μM)，TR(0.1μM)和低浓度NADPH(0.2mM)的痰液的粘弹性降低较小(0.16 log单位)。暴露于较高浓度的NADPH(0.6mM和2mM)时出现粘弹性的进一步降低(分别为0.26 log单位和0.39 log单位)，表明还原性相当物(reducing equivalent)对于Trx-介导的痰液粘弹性降低很重要。

实施例5

以下实施例描述了Trx对痰液糖蛋白溶解性的影响。

粘蛋白糖蛋白聚合物的二硫键是通过Trx还原的有效靶。为检测Trx对痰液中存在的糖蛋白的影响，将痰液等分试样与H₂O，10或30μM Trx及其还原系统一同保温20分钟，并通过离心分成含水部分(Aq)和凝胶部分。每种不溶的凝胶部分进一步用胍盐(G)处理14小时。处理后，对每份样品的所得可溶相和不溶相进行分离并用高碘酸/Schiff试剂(PAS)染色分析其糖蛋白含量。具体地，将各个部分上样于1％琼脂糖(w/v)凝胶并进行电泳，转移到PVDF膜，并用高碘酸/Schiff试剂如材料和方法部分所述进行染色。根据图5，最右侧的泳道显示的是分子量标物。结果表示三次独立实验。

如图5所示，在来自用稀释剂处理的痰液的可溶和凝胶部分中检测到高分子量糖蛋白的离散群。反之，在来自用10或30μM Trx处理的痰液的所述两相中明显看出更大量的PAS-反应性糖蛋白。在这些样品的加工过程中，观察到来自稀释剂处理的样品的凝胶相基质保持较高程度的不溶性，即使用胍盐过夜处理也如此。所述不溶性很可能是来自稀释剂以及Trx-处理的痰液的凝胶相泳道中观察到的糖蛋白量的定量差异的原因。除了量较大以外，Trx暴露的样品中显著比例的糖化形式(glycoform)的电泳移动性高于稀释剂处理的样品中存在的糖化形式部分。这些发现表明，Trx增加了溶解性，并减小了痰液中糖蛋白聚合物的大小。

实施例6

以下实施例显示Trx对痰液中DNA溶解性的影响。

CF气道分泌物中较高量的细胞外DNA的存在有助于CF痰液的过高粘弹性。为评价Trx对痰液中DNA溶解性的影响，将痰液样品(275μl)与无加入物、稀释剂(H₂O)，或Trx(30μM)+还原系统一起保温20分钟，然后分成凝胶(不溶)和液体(可溶)相。通过Hoechst实验测定DNA含量显示存在于未处理的样品中的大部分DNA保持在凝胶相(凝胶＝0.94±0.26mg；液体＝0.05±0.03mg)(图6)。稀释剂-处理的样品的液相中的平均DNA含量增加最少(凝胶＝0.80±0.24mg；液体＝0.21±0.23mg)。观察到Trx处理导致DNA进一步从凝胶变为液体相(凝胶＝0.55±0.31mg；液体＝0.57±0.37mg)。图6显示了各个部分(n＝5次实验)的平均DNA含量±S.D.(相对于无处理的可溶相^*P＜0.05)。

实施例7

以下实施例描述了用本发明的治疗组合物处理具有过高粘稠性或粘着性的粘液或痰液的患者。

4月大的女性患者体重较低；频繁出现大量恶臭油性大便；腹部突出，反复咳嗽和喘息。所述患者接受了定量毛果芸香碱.离子电渗疗法出汗实验，并诊断为囊性纤维化。肺功能实验和胸X线片证实了所述诊断。所述患者接受了高碘酸(periodic)评估和治疗，包括预防和在肺疾病出现时的治疗、良好的营养和体育运动。到13岁时，所述患者显示生长迟缓，青春期延迟，耐力降低，以及频繁出现肺感染，呼吸困难和胃肠不适。所述患者因严重的咳嗽，喘息和肺功能障碍而就诊。

对从该患者气道收集的痰液样品进行压缩实验，并基于该实验和以前的囊性纤维化诊断确定该患者患有由气道中粘稠性和粘着性过高的粘液造成的呼吸功能障碍。为治疗肺内的所述症状，对该患者给药一种组合物，所述组合物包含约2.5mg每剂量单位的人硫氧还蛋白以及通过气溶胶递送足以在表面活性剂中达到5μM获得的NAPDH表面浓度。随后通过其它压缩实验检测患者的痰液液化的增加，并通过肺功能试验检测其气道的清理。随后通过气溶胶每日给药上述组合物，直到所述患者的气道被明显清理且所述患者的症状和整体健康改善。

本文所引用所有公开出版物和其它文献的内容均包含在本文作为参考。

本申请要求2002年9月10日提交的美国临时申请60/409,960和2003年4月11日提交的美国临时申请60/462,082的优先权。美国临时申请60/409,960和60/462,082的内容包含在本文作为参考。

虽已具体描述了本发明各种实施方案，很明显本领域技术人员可进行各种修饰和改进。应理解这些修饰和改进包含在本发明的权利要求范围内。

                               序列表

<110>卡尔.W.怀特(White，Carl W.)

<120>液化粘液或痰液的产品和方法

<130>2879-98-PCT

<150>60/409,960

<151>2002-09-10

<150>60/462,082

<151>2003-04-11

<160>15

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>1

Cys Gly Pro Cys

1

<210>2

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(6)

<223>Xaa＝任意氨基酸

<400>2

Xaa Cys Gly Pro Cys Xaa

1               5

<210>3

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>3

Trp Cys Gly Pro Cys Lys

1                        5

<210>4

<211>109

<212>PRT

<213>丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)

<400>4

Met Ser Asn Asp Leu Ile Lys His Val Thr Asp Ala Ser Phe Glu Ala

1               5                   10                  15

Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Val Leu Val Asp Tyr Trp Ala Glu

            20                  25                  30

Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Val Leu Asp Glu Ile Ala

        35                  40                  45

Thr Thr Tyr Ala Gly Lys Leu Thr Ile Ala Lys Leu Asn Ile Asp Glu

    50                  55                  60

Asn Gln Glu Thr Pro Ala Lys His Gly Val Arg Gly Ile Pro Thr Leu

65                  70                   75                  80

Met Leu Phe Lys Asn Gly Asn Val Glu Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu

                85                  90                  95

Ser Lys Ser Gln Leu Ala Ala Phe Leu Asp Ala Asn Ile

            100                 105

<210>5

<211>104

<212>PRT

<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)

<400>5

Met Ala Leu Gln Ile Thr Asp Ala Thr Phe Asp Gly Leu Val Ala Glu

1               5                   10                  15

Gly Lys Pro Met Val Val Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys

            20                  25                  30

Arg Met Val Gly Pro Ile Ile Asp Glu Leu Ala Ala Glu Tyr Glu Gly

        35                  40                  45

Arg Ala Ile Ile Gly Lys Val Asp Val Asp Ala Asn Thr Glu Leu Pro

    50                  55                  60

Met Lys Tyr Gly Val Arg Asn Ile Pro Thr Ile Leu Phe Ile Lys Asn

65                  70                  75                  80

Gly Glu Val Val Lys Lys Leu Val Gly Ala Gln Ser Lys Asp Val Phe

                85                  90                  95

Lys Lys Glu Leu Asp Ala Leu Phe

            100

<210>6

<211>103

<212>PRT

<213>单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)

<400>6

Met Val Lys Glu Ile Thr Asp Ala Thr Phe Glu Gln Glu Thr Ser Glu

1               5                   10                  15

Gly Leu Val Leu Thr Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Arg

            20                  25                  30

Met Val Ala Pro Val Leu Glu Glu Ile Gln Glu Glu Arg Gly Glu Ala

        35                  40                  45

Leu Lys Ile Val Lys Met Asp Val Asp Glu Ash Pro Glu Thr Pro Gly

    50                  55                  60

Ser Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Ile Lys Lys Asp Gly

65                  70              75                      80

Glu Val Val Glu Thr Ile Ile Gly Tyr Arg Pro Lys Glu Glu Leu Asp

                85                  90                  95

Glu Val Ile Asn Lys Tyr Val

            100

<210>7

<211>103

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>7

Met Val Thr Gln Phe Lys Thr Ala Ser Glu Phe Asp Ser Ala Ile Ala

1               5                   10                  15

Gln Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Tyr Ala Thr Trp Cys Gly Pro

            20                  25                  30

Cys Lys Met Ile Ala Pro Met Ile Glu Lys Phe Ser Glu Gln Tyr Pro

        35                  40                  45

Gln Ala Asp Phe Tyr Lys Leu Asp Val Asp Glu Leu Gly Asp Val Ala

    50                  55                  60

Gln Lys Asn Glu Val Ser Ala Met Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn

65                  70                  75                  80

Gly Lys Glu Val Ala Lys Val Val Gly Ala Asn Pro Ala Ala Ile Lys

                85                  90                  95

Gln Ala Ile Ala Ala Asn Ala

            100

<210>8

<211>105

<212>PRT

<213>鸡(Gallus gallus)

<400>8

Met Val Lys Ser Val Gly Asn Leu Ala Asp Phe Glu Ala Glu Leu Lys

1               5                   10                  15

Ala Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys

            20                  25                  30

Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys

        35                  40                  45

Phe Gly Asp Val Val Phe Ile Glu Ile Asp Val Asp Asp Ala Gln Asp

    50                  55                  60

Val Ala Thr His Cys Asp Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr

65                  70                  75                  80

Lys Asn Gly Lys Lys Val Gln Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys

                85                  90                  95

Leu Glu Glu Thr Ile Lys Ser Leu Val

            100                 105

<210>9

<211>105

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>9

Met Val Lys Leu Ile Glu Ser Lys Glu Ala Phe Gln Glu Ala Leu Ala

1               5                   10                  15

Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys

            20                  25                  30

Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys

        35                  40                  45

Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp

    50                  55                  60

Val Ala Ala Asp Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr

65                  70                  75                  80

Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys

                85                  90                  95

Leu Glu Ala Ser Ile Thr Glu Tyr Ala

            100                 105

<210>10

<211>105

<212>PRT

<213>大家鼠(Rattus norvegicus)

<400>10

Met Val Lys Leu Ile Glu Ser Lys Glu Ala Phe Gln Glu Ala Leu Ala

1               5                   10                  15

Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys

            20                  25                  30

Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys

        35                  40                  45

Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp

    50                  55                  60

Val Ala Ala Asp Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr

65                  70                  75                  80

Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys

                85                  90                  95

Leu Glu Ala Thr Ile Thr Glu Phe Ala

            100                 105

<210>11

<211>105

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<400>11

Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Tyr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asn

1               5                   10                  15

Ser Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys

            20                  25                  30

Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys

        35                  40                  45

Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp

    50                  55                  60

Val Ala Ala Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe

65                  70                  75                  80

Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys

                85                  90                  95

Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Ile

            100                 105

<210>12

<211>105

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>12

Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp

1               5                   10                  15

Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys

            20                  25                  30

Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys

        35                  40                  45

Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp

    50                  55                  60

Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe

65                  70                  75                  80

Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys

                85                  90                  95

Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val

            100                 105

<210>13

<211>134

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>13

Met Gly Gly Ala Leu Ser Thr Val Phe Gly Ser Gly Glu Asp Ala Ala

1               5                   10                  15

Ala Ala Gly Thr Glu Ser Ser Glu Pro Ser Arg Val Leu Lys Phe Ser

            20                 25                   30

Ser Ser Ala Arg Trp Gln Leu His Phe Asn Glu Ile Lys Glu Ser Asn

        35                  40                  45

Lys Leu Leu Val Val Asp Phe Ser Ala Ser Trp Cys Gly Pro Cys Arg

    50                  55                  60

Met Ile Glu Pro Ala Ile His Ala Met Ala Asp Lys Phe Asn Asp Val

65                  70                  75                  80

Asp Phe Val Lys Leu Asp Val Asp Glu Leu Pro Asp Val Ala Lys Glu

                85                  90                  95

Phe Asn Val Thr Ala Met Pro Thr Phe Val Leu Val Lys Arg Gly Lys

            100                 105                 110

Glu Ile Glu Arg Ile Ile Gly Ala Lys Lys Asp Glu Leu Glu Lys Lys

        115                 120                 125

Val Ser Lys Leu Arg Ala

    130

<210>14

<211>167

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>14

Met Ala Met Glu Thr Cys Phe Arg Ala Trp Ala Leu His Ala Pro Ala

1               5                   10                  15

Gly Ser Lys Asp Arg Leu Leu Val Gly Asn Leu Val Leu Pro Ser Lys

            20                  25                  30

Arg Ala Leu Ala Pro Leu Ser Val Gly Arg Val Ala Thr Arg Arg Pro

        35                  40                  45

Arg His Val Cys Gln Ser Lys Asn Ala Val Asp Glu Val Val Val Ala

    50                  55                  60

Asp Glu Lys Asn Trp Asp Gly Leu Val Met Ala Cys Glu Thr Pro Val

65                  70                  75                  80

Leu Val Glu Phe Trp Ala Pro Trp Cys Gly Pro Cys Arg Met Ile Ala

                85                  90                  95

Pro Val Ile Asp Glu Leu Ala Lys Asp Tyr Ala Gly Lys Ile Thr Cys

            100                 105                 110

Cys Lys Val Asn Thr Asp Asp Ser Pro Ash Val Ala Ser Thr Tyr Gly

        115                 120                 125

Ile Arg Ser Ile Pro Thr Val Leu Ile Phe Lys Gly Gly Glu Lys Lys

    130                 135                 140

Glu Ser Val Ile Gly Ala Val Pro Lys Ser Thr Leu Thr Thr Leu Ile

145                 150                 155                 160

Asp Lys Tyr lle Gly Ser Ser

                165

<210>15

<211>172

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>15

Met Ala Leu Glu Thr Cys Phe Arg Ala Trp Ala Thr Leu His Ala Pro

1               5                   10                  15

Gln Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ser Arg Asp Arg Leu Leu Leu Ser Gly

            20                  25                  30

Ala Gly Ser Ser Gln Ser Lys Pro Arg Leu Ser Val Ala Ser Pro Ser

        35                  40                  45

Pro Leu Arg Pro Ala Ser Arg Phe Ala Cys Gln Cys Ser Asn Val Val

    50                  55                  60

Asp Glu Val Val Val Ala Asp Glu Lys Asn Trp Asp Ser Met Val Leu

65                  70                  75                  80

Gly Ser Glu Ala Pro Val  Leu Val Glu Phe Trp Ala Pro Trp Cys Gly

                85                   90                  95

Pro Cys Arg Met Ile Ala Pro Val Ile Asp Glu Leu Ala Lys Glu Tyr

            100                 105                 110

Val Gly Lys Ile Lys Cys Cys Lys Val Asn Thr Asp Asp Ser Pro Asn

        115                 120                 125

Ile Ala Thr Asn Tyr Gly Ile Arg Ser Ile Pro Thr Val Leu Met Phe

    130                 135                 140

Lys Asn Gly Glu Lys Lys Glu Ser Val Ile Gly Ala Val Pro Lys Thr

145             150                     155                 160

Thr Leu Ala Thr Ile Ile Asp Lys Tyr Val Ser Ser

                165                 170

Claims (26)

1.增加患者粘液或痰液的液化的方法，所述患者有粘稠性或粘着性过高的粘液或痰液，所述方法包括将该患者的粘液或痰液与包含蛋白或肽的组合物接触，所述蛋白或肽含有还原态的硫氧还蛋白活性位点，与该接触步骤前相比，所述组合物有效使所述粘液或痰液的液化增加。

2.权利要求1的方法，其中所述患者患有肺病，其中粘液或痰液的粘稠性或粘着性异常或过高是该疾病的症状或病因。

3.权利要求1的方法，其中所述患者患有囊性纤维化。

4.权利要求1的方法，其中将患者的粘液或痰液与所述组合物接触的步骤是通过将该组合物由以下途径导入该患者来进行的：经鼻，经气管内，经支气管，或直接装入肺并吸入。

5.权利要求1的方法，其中将进行接触的粘液或痰液位于患者的呼吸道，胃肠道或生殖道中。

6.权利要求1的方法，其中所述组合物在可药用的载体中给药患者。

7.权利要求1的方法，其中所述蛋白或肽以约1.5毫摩尔/kg患者体重-约150毫摩尔/kg患者体重的量给药患者。

8.权利要求1的方法，其中所述蛋白在患者体内的半衰期为约5分-约24小时。

9.权利要求1的方法，其中患者粘液或痰液样品总体积中的液相在给药所述组合物后在统计学上明显增加。

10.权利要求1的方法，其中所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列C-X-X-C，其中C残基为还原态，且其中X残基为任何氨基酸残基。

11.权利要求1的方法，其中所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-X-X-C-X，其中C残基为还原态，且其中X残基为任何氨基酸残基。

12.权利要求1的方法，其中所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-G-P-C-X(SEQ ID NO：2)，其中C残基为还原态，且其中X残基为任何氨基酸残基。

13.权利要求1的方法，其中所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列W-C-G-P-C-K(SEQ ID NO：3)，其中C残基为还原态。

14.权利要求1的方法，其中所述蛋白包含选自下组的硫氧还蛋白：原核生物硫氧还蛋白，酵母硫氧还蛋白，植物硫氧还蛋白和哺乳动物硫氧还蛋白。

15.权利要求1的方法，其中所述蛋白包含人硫氧还蛋白。

16.权利要求1的方法，其中所述组合物还包含磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原形式)(NADPH)，用于还原所述蛋白的硫氧还蛋白活性位点。

17.权利要求16的方法，其中所述组合物还包含硫氧还蛋白还原酶。

18.用于液化粘液或痰液的组合物，其包括含有还原态硫氧还蛋白活性位点的蛋白或肽以及至少一种用于治疗粘稠性或粘着性过高的粘液或痰液的其它药剂。

19.权利要求18的组合物，其中所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-X-X-C-X，其中C残基为还原态，且其中所述X残基为任何氨基酸残基。

20.权利要求18的组合物，其中所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-G-P-C-X(SEQ ID NO：2)，其中C残基为还原态，且其中所述X残基为任何氨基酸残基。

21.权利要求18的组合物，其中所述硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列W-C-G-P-C-K(SEQ ID NO：3)，其中C残基为还原态。

22.权利要求1 8的组合物，其中所述蛋白包含选自下组的硫氧还蛋白：原核生物硫氧还蛋白，酵母硫氧还蛋白，植物硫氧还蛋白和哺乳动物硫氧还蛋白。

23.权利要求18的组合物，其中所述蛋白包含人硫氧还蛋白。

24.权利要求18的组合物，其中所述组合物还包含磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原形式)(NADPH)。

25.权利要求24的组合物，其中所述组合物还包含硫氧还蛋白还原酶。

26.增加患者的粘液或痰液的液化的方法，其中所述患者有粘稠性或粘着性过高的粘液或痰液，所述方法包括将该患者呼吸道中的粘液或痰液与组合物接触，所述组合物包含含有氨基酸序列X-C-X-X-C-X的蛋白，其中C残基为还原态，且与所述组合物的接触使得该患者粘液或痰液样品的液相体积比与该组合物接触前增加。

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