PT95284A - Novo metodo de tratamento de doencas malignas com tioredoxina - Google Patents

Description

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AKTIEBOLAGET ASTRA " NOVO MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇAS MALIGNAS COM TIOREDOXINA "

Campo da invenção A presente invenção refere-se a uma nova estratégia para o tratamento das leucemias de linfócitos B e de certas outras doenças malignas, incluindo um método para a potenciação da reactividade da resposta dos linfócitos às células cancerosas que exprimem estruturas de superfície reconhecidas pelas próprias células citotóxicas dos doentes. Exemplos destes cancros são os melanomas malignos e o cancro do cólon.

Sabe-se a partir da patente de invenção W088/06891 que os factores de crescimento das células B e anticorpos que as mimetizam podem ser utilizadas para a indução da diferenciação em certas doenças malignas. Descreve-se o uso de uma enzima pertencendo à família da tio-redoxina, tal como a tio-redoxina derivada da linha de células MP6 (MP6/Trx) para essa indução de diferenciação. A referida enzima deve ser utilizada isoladamente ou em associação com co-factores.

Descrição geral da invenção e introdução

As células cancerosas são caracterizadas pelo crescimento descontrolado. Durante um certo tempo existiu um con- -2- •Ui ί ceito de que o crescimento devia ser suprimido por indução destas células para se diferenciarem para um estado não pro-liferativo. Realizaram-se ensaios clínicos em diferentes leu-cémias com agentes indutores de diferenciação como por exemplo as vitaminas e os interferons. Contudo, não se realizaram nenhum destes ensaios com factores de diferenciação e de crescimento mais específicos ou com anticorpos, que apenas reagem com estruturas de receptores definidas. A presente invenção propõe a utilização destes factores específicos para o tratamento do cancro, quer isoladamente quer em associação com agentes auxiliares. 0 desenvolvimento de células normais para células cancerosas é um processo de múltiplas fases. Dhrante a transformação maligna alguns tipos de células, por exemplo alguns lin-fócitos B (referência 1), adquirem a capacidade para exprimir receptores para factores de crescimento definidos e responderem a estes por proliferação ou maturação. As células tumorais, portanto, " congelam " num estádio de diferenciação específico caracterizado por um conjunto de receptores de superfície. Contudo, este bloqueio não é irreversível. Apresenta-se um método para o uso de uma enzima percentente à família da tio^-redoxina e análogos à tio-redoxina que contêm o mesmo sítio activo Cys-Gly-Pro-Cys incluindo anticorpos monoclonais de ligação a estrura alvo, para se utilizar isolada ou em conjunto com co--factores, para a indução de diferenciação terminal de células ("células terminais") que não se dividem posteriormente. Descreve-se a referida enzima e os co-factores. A estratégia de tratamento clínico é exemplificada com leucémias linfocíticas -3 * .¾ crónicas de células B (B-CCL), que foram induzidas para posterior diferenciação (para um estádio de maior maturação), definida como uma capacidade diminuída de proliferação e de expressão de uma morfologia plasmocitóide, como avaliado pelos marcadores superficiais, pela imunoglobulina citoplasmática e pelo retículo endoplasmático.

Para uma célula B em repouso, o sinal de activação inicial, provocado pela interacção antigénio-imunoglobulina deve ser seguido por uma série de sinais receptor/ligante subtilmente harmonizados e interacções célula-célula com outras células imunocompetentes (1) para permitir a maturação das células plasmáticas terminal. Tem sido definidos e clonados os genes de vários ligandos para receptores envolvidos na transmissão dos sinais de crescimento e que controlam a diferenciação de células B humanas. Estes incluem a interleucina I (IL-1) para interleucina 6 (IL-6), factor de crescimento de células B de peso molecular baixo (LMW-BCGF), sCD23, linfotoxina (LT), factor de necrose tumoral (TNF), interferon- íT(IFN-y) (1,2).

Para se entender o conceito de terapêutica de diferenciação é importante entender a forma normal como se desenvolvem as células. Na medula óssea, tipos de células especializados funcionalmente diferentes desenvolvem-se, como resultado desta diferenciação (commitment) de células indiferenciadas multipoten-tes. Esta diferenciação dá origem a precurssores de linhas de células várias (linha de células B, linha de células T, linha mieloide). As alterações fenotípicas subsequentes destas células unipotentes para as células finais é designada por maturação ou diferenciação terminal. A activação das células B humanas de um -4- estádio de repouso, conduz a uma maior diferenciação e maturação e o estádio terminal prossegue pelo menos por mais duas fases. 1) Fase da activação, em que as células estão expostas aos factores de activação. Para as séries de células B estes factores são: antigénios, antimunoglobulinas (anti-idióti-pos), interleucina 1, 2 e 3 e seus subcomponentes, interleucina 4 (IL4) e anticorpos para os receptores IL4, reagentes que actu-am nos receptores C3d (CDllc), tais como complemento polimeriza-do 3d ou anticorpos para o receptor C3d (anti-gpl40); anti-gp35 (CD20). Experimentalmente in vitro utilizam-se ésteres de forbol como por exemplo TPA ou PMA como agentes que induzem competência potente mas estes podem no entanto servir apenas como modelos dado que são tóxicos e incompatíveis com o uso clínico. Os ésteres de forbol actuam sobre a proteína quinase C (PKC) e mimeti-zam os agentes biologicamente activos. Outros agentes que induzem competência experimental importantes são: proteína A da fase sólida; estafilococus Aureus Cowan I inactivados (SAC); Mitogeno de Chytolacca americana (Poke-weed), vírus de Epstein-Barr inac-tivado ou não transformante (EBV) proveniente da estirpe não transformante P3HR1 ou inactivado por ultra violeta, lipopoli-sacáridos (LPS). 2) Fase de progressão. A fase de activação induz receptores para vários sinais de progressão como por exemplo: IL-2; factor II de crescimento de células B ou TRF, presentemente designado por IL5; BCGF de peso molecular baixo (BCGF 12K); BCGF de 60K derivado de-Namalwa; anticorpos para CD23 (uma proteína p45 expressa na superfície de células B de células IgM+, célu- -5- las IgD+, receptor 2 para (FcER2) anticorpos para CD40, um anti-génio p50 presente principalmente nas células B e nas células de carcinoma da bexiga, mas também nas células cervicais e nas células de carcinoma do pulmão, além de IL-6 (préviamente designado por factor de diferenciação de células B) (BCDF). A lista seguinte é uma breve enumeração das abreviaturas utilizadas na presente memória descritiva. BCDF: factor de diferenciação de células B BCGF: factor de crescimento de células B B-CLL: leucémia linfocítica crónica de células B BSF: factor de estimulação de células B C3d: subcomponente do factor de componente C3 CD23: uma proteína p45 expressa nas células da linhagem de lin focitos B CD40: uma proteína p50 expressa nas células B e nas células de carcinoma da bexiga EBV: vírus de Epstein-Barr gP35: glicoproteína de peso molecular de 35K, pertencente ao grupo CD20 (grupo de diferenciação cluster) gpl40s glicoproteína de peso molecular de 140K, com função de

receptor C3d IgD: imunoglobulina classe D IgM: imunoglobulina classe M IL-1: IL-2, IL-3, IL-4, IL-5: interleucina 1,2,3,4,5 LPS: lipopolissacáridos Molt4: uma linha de células derivada de linfoma-T p45: proteína de membrana de peso molecular de 45K PMA: 12-miristato 13-acetato de 4-forbol PWM: mitogénio de Chytolacca americana (Poke-weed) SAC: estafilococcus aureus Cowan I -6<-

íP

Proteína A de fase sólida: matriz (por exemplo sefarose)-pro-teína A ligada. TPA: agente de promoção do tumor

TRF: faetor de substituição de células T T-T hibridoma: um híbrido celular somático entre duas células T diferentes TNF: faetor de necrose do tumor ΜΡβ/Trx: enzima produzida pela linha de células de hibridoma T-T MP6 da família da tio-redoxina.

Descrição detalhada da presente invenção

Anteriormente, o faetor estimulador de células B de 12 KDa segregado por um hibridoma de células T CD4+ humanas mostrou facilitar o desenvolvimento de linfócitos B humanos, normais e malignos. Purificou-se esta linfocina e identificou--se como um membro da família da tio-redoxina humana e designou--se por ΜΡβ/Trx. A tio-redoxina é uma enzima bem caracterizada que catalisa as reacções de intercâmbio tiol-dissulfureto e reduções de proteína dissulfureto pura via um sítio activo Cys--Gly-Pro-Cys. Usou-se sangue periférico normal ou linfócitos B i tonsilares como células alvo para controlar a actividade biológica. Mas as células B monoclonais, as linhas de células linfoblastóides B ou as células B derivadas de tipo B de leu-cémia linfocítica crónica (B-CCL) foram as células alvo por excelência dado que requeriam MP6/Trx para proliferação e diferenciação in vitro induzida por citoquina, quando testada sob condições sub-óptimas de cultura celular.

As células pré-activadas proliferam em resposta aos ligandos naturais ou recombinantes: interleucina 2 (IL-2), in- -7- terleucina 4 (IL-4), BCGF de peso molecular baixo (LMW-BCGF), factor de necrose de tumor (TNF-<?(), ou anti-CD40, apenas se foi adicionado MP6/Trx. Os anticorpos para a tiorredoxina bloquearam o efeito. Estes resultados assinalam um importante desempenho para tiorredoxina extracelular nos eventos reguladores envolvidos nas interacções receptor-ligando e subsequente transducção do sinal na activação de células B normais e no desenvolvimento de leucemia linfocítica crónica de tipo B (B--CLL). A presente invenção refere-se a um novo método para o tratamento destas células de transformação maligna em animais e nos seres humanos, que são sensíveis aos co-factores mensio-nados anteriormente e à tiorredoxina. 0 método é caracterizado pela administração de uma quantidade terapéuticamente apropriada de tio-redoxina. Se necessário, a enzima referida administrada após um periodo de pré-tratamento com um co-factor capaz de induzir as células de transformação maligna a se tornarem sensíveis à enzima referida. Exemplos destes c-factores são apresentados no quadro I seguinte. Previu-se que a administração da enzima tiorredoxina possa realizar-se simultaneamente com a do co-factor. 0 termo "tiorredoxina” como se utiliza na presente memória descritiva entende-se que abrange a família de enzimas tio-redoxina e análogos de tio-redoxina que contêm o sítio activo Cys-Gly-Pro-Cys, específicamente a tio-redoxina derivada da linha de células MP6.

Mais precisamente, o novo método de tratamento da presente invenção, pode ser aplicado a alterações das células -8 f r * indiferenciadas, a malignâncias hematopoéticas, por exemplo leucemias, leucemias de células B e leucemias linfocíticas crónicas de células B, e outros tumores que expressam recep-tores de co-factores e que respondem à tio-redoxina. Por exemplo, os carcinomas da bexiga que expressam o antigénio CD40 podem ser tratados, potencialmente, de um modo descrito. A tio--redoxina assim como os co-factores apresentados no quadro 1, são substâncias que são conhecidas como tal. Contudo, nem em todas as condições são conhecidas como tendo utilidade terapêutica. A escolha de um co-factor apropriado não constitui um parâmetro crítico da presente invenção. Existem métodos experimentais que permitem a um técnico estabelecer se um co--factor específico, como listado no quadro 1, actua sinérgi-camente com a tio-redoxina. Contudo, é preferível utilizar como co-factor IL-2. Também se podem mencionar como co-factores preferidos IL-4 e TNF- Oi . A presente invenção, numa outra realização, refere--se à tio-redoxina para utilizar no tratamento de células de transformação maligna em animais e nos seres humanos, em particular nas células de transformação maligna que são sensíveis à tio-redoxina. Também neste aspecto, se apropriado, a tio-redoxina é administrada após um período de pré-tratamento com um co-factor, como referido, que seja capaz de induzir as células de transformação maligna a desenvolverem-se com sensibilidade à tio-redoxina. Num outro aspecto da presente invenção, refere-se a utilização da tio-redoxina na preparação de um medica- mento para o tratamento de malignâncias. Um medicamento destes pode incluir um co-factor, como referido anteriormente. Embora considerando a tio-redoxina assim como os co-factores, exemplificados no quadro 1, que são conhecidos na técnica, as preparações que contém tio-redoxina ou uma associação da tio-re-doxina com os co-factores de acordo com o quadro 1, são novas e representam, como tal, mais um aspecto da presente invenção.

Está previsto que as malignâncias que são sensíveis ao tratamento com IL-2, como por exemplo os melanomas malignos, são alvos apropriados para o tratamento com tio-redoxina, de um modo adequado em associação com um co-factor.

Também está previsto que a imunidade celular (células T e células NK) pode ser reforçada pelo tratamento com tio-redoxina, eventualmente em associação com um co-factor, como citado .

Na prática clínica, a tio-redoxina, os co-factores ou as suas associações, são administradas analogamente aos métodos conhecidos que utilizam a administração de medicamentos para o tratamento do cancro. Assim, a administração preferida será por perfusão ou por deposição intramuscular. A quantidade de tio-redoxina e/ou de co-factores administrada varia grandemente e dependerá de diversas circunstâncias tais como a gravidade da doença, a idade e o estado do doente. Como um exemplo de um intervalo de dosagem apropriado pode mencionar-se uma dosagem que proporcionará um nível sérico ou plás-mático de tio-redoxina compreendido entre cerca de 2 e cerca de 100 vezes o valor da tio-redoxina sérica ou plasmática que natu- -10- ralmente ocorre. 0 quadro 1 seguinte apresenta uma lista que exemplifica os co-factores que se podeoa utilizar. A designação E indica que o co-factor é principalmente experimental e que é possível utilizar-se com fins de diagnóstico. A designação C indica que o co-factor tem utilidade clínica.

Quadro 1. Co-factores E Ésteres de forbol como TPA E Antigénios C Anti-imunoglobulinas (anti-idiotipos) C Interleucina 1 e seus subcomponentes C Interleucina 2 e seus subcomponentes C Interleucina 3 e seus subcomponentes C Interleucina 4 (BSF1) C Anticorpos anti-receptor IL4 E Mitogénio de Chytolacca americana (Poke weed) E Lipopolissacáridos E Vírus de Epstein Barr, não transformador ou inactivado C Receptor C3d (CDllc) agentes reactivos C' e anticorpos anti--receptores gp 140 C Anti-gp35 (CD20) E SAC, estafilococus aureus Cowan I inactivado E Proteína A de fase sólida C Interferons (alfa, beta e gamma) C Vitaminas (em particular a vitamina A, D e derivados biológicamente activos C Leucotrieno B4 C TMF- A enzima tio-redoxina, tal como utilizada na presente invenção, tem de preferência origem humana. É uma enzima que catalisa as reacções de permuta tiol-dissulfureto e reduções de dissulfureto de proteína pura através do sítio activo Cys--Gly-Pro-Cys. A tio-redoxina humana é de preferência, de origem linfocítica humana embora se possam utilizar de outras origens. Contudo, também a utilização de tio-redoxina de animais incluindo os mamíferos, tio-redoxina procariótica obtida por exemplo a partir de E. Colis e tio-^redoxinas produzidas por recombina-ção genética de vectores de expressão estão incluídas no âmbito da presente invenção. A tio-redoxina, também conhecida como tiol-oxidqre-ductase, é uma proteína ubíqua de 12Kda, um dissulfureto redox--activo (3); é habitualmente reduzida por NADPH e pela flavo-proteína tio-redoxina redutase. A tio-redoxina reduzida é um dador de hidrogénio para o ribonucleótido redutase, uma enzima essencial para a obtenção de desoxitribonucleótidos destinados à síntese de DNA. A tio-redoxina está também relacionada com os eventos reguladores (3)? como a activação dependente da luz das enzimas fotossintéticas nos cloroplastos das células vegetais (4) e a activação dos receptores de glucocorticóides para um estádio de ligação esteróide (5)· A tio-redoxina regula a actividade enzimá-tica pelo controlo tiol-redox que envolve a redução de dissulfu-retos de proteína com uma velocidade que e cerca de 10 vezes mais rápida do que a de ditiotreitol. (DTT) (3)· Têm sido isoladas e caracterizadas tio-redoxinas de mamíferos (3,6). Tem sido -12- estudada a distribuição por métodos imuno-histoquímicos tendo as tio-redoxinas demonstrado o relacionamento com a secreção de proteína e como associadas parcialmente à membrana (6). Recentemente, Wollman et al., clonaram um gene de tio-redoxina (7). Descobriu-se que o gene pode ser expresso em linfócitos activados mas não em linfócitos em repouso. Originalmente, a tio-redoxina foi referida como um factor semelhante a IL-1 derivado de um vírus de Epstein Barr contendo uma linha de células B. (7). Tagaya e colaboradores (8) demonstraram que o receptor IL-2/factor que induz Tac também designado por factor derivado de leucemia de células T adultas (HTLV-1) (ADF) era homólogo ou idêntico à tio-redoxina proveniente da análise de um clone de DNA. A presente invenção especifica novas funções biológicas para a família de enzimas de tio-redoxina e amplia o seu papel na activação dos linfócitos. Células alvo em situações clínicas:

As células alvo em situações clínicas são todas as células de transformação maligna que podem responder à tio-redoxina, especialmente a ΜΡβ/Trx, por diferenciação, incluindo todas as células malignas que podem ser induzidas a exprimir sítios de ligação com tio-redoxina e responder a estas. Esta indução pode ser exercida pelos co-factores citados no quadro 1 ou por outros meios.

Experiências A MP6 é um hibridoma de células auxiliares T CD4+, que se isolou e clonou préviamente (9)- A clone MP6 segrega cons- titutivamente um factor estimulador de células B de 12 a 14 KDa (BSF-ΜΡβ) que induz a proliferação e a secreção de IgM/IgG em células B normais (9,10) assim como em células B-pré-activa-das por malignidade de leucemia linfocítica crónica do tipo B (B-CLL, 11). A expressão do receptor de IL-2 foi também reforçada por BSF-MP6 (12): Kishimoto e Honjo et al. demonstraram que o mRNA das células MP6 não hibrida com sondas de cDNA para IL-1 U, IL-1 β, IL-4, IL-5 ou IL-6 (12). Aplicando ensaios celulares vários verificou-se que o sobrenadante de MP-6 evidencia ausência de actividades de LMW-BCGF, TNF- oí e -β , INF-cK -β, -γ> factores clonadores de colónias de monócitos-granulócitos (GM-CSF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6 (9).

Nas experiências representadas nas figuras 1A e 1B, utilizaram-se células monoclonais provenientes de doentes com B-CLL. Este clone (183), representa células B sequestradas GQ induzidas para a diferenciação ou acompanhadas de diferenciação por proliferação dependente dos sinais pós-simuladores (11), quando activas por 13-acetato de 12-0-tetradecanoílo-forbol (TPA) ou por estafilococus aureus Cowan I (SAC). As células 183 foram pré-activadas por SAC durante dois dias para simularem os sinais que desafiam os antigénios ou por uma dose sub-ópti- —7 ma de TPA (1,6x10“ M) durante uma hora. As células foram refrac-tárias para qualquer das linfocinas linfotrópicas B naturais rIL-1 rIL-2, rIL-4, rIL-6, rTNF o<, LMW-BCGF, rIFN-y>, anti- -CD40 ou suas combinações. As células activadas por SAC, contudo, responderam às linfocinas rIL-2, rTNF^, LMW-BCGF, quando se adicionou BSF-MP6 (figura 1A). A via de sinal para SAC e TPA são diferentes dado que o TPA proporciona directamente um sinal não fisiológico que activa a proteínoquinase C, deslocando as células para o ciclo celular. A figura 1B ilustra o facto de as células activadas por TPA responderem a BSF-MP6 e de as combinações de BSF-MP6 com várias linfocinas B diferentes não aumentar a síntese de DNA. As excepções são IL-4 e TNF-o<, que exibiram aumentos significativos. Este facto está na linha dos achados recentes relativamente a TNF- o( ser um factor de crescimento autócrino para células B humanas (14) e demonstrou-se préviamente numa série de experiências que a IL-4 é fortemente sinérgica com BSF-MP6 para a indução da síntese de DNA e para a secreção de IgM em células activadas por TPA. (11).

Um radio-imuno-ensaio de grande especificidade para tio-redoxina humana (13, figura 2), revela que o factor BSF-MP6 é homólogo com a tio-redoxina ou com um análogo desta, como anteriormente descrito.

Meio isento de soro de meio MPó condicionado de 24 horas continha 34 jxg/ml de tio-redoxina. Controlou-se a activi-dade biológica utilizando-se o clone B-CLL 183 ou células B ton-silares normais, e confinou-se à região de 12 KDa, em experiência de filtração por gel. As tio-redoxinas de mamífero, após oxidação ao ar, formam ligações dissulfureto intramoleculares estruturais extra, conduzindo à inactivação e à agregação (6). Durante os processos de purificação e de armazenagem, as preparações de BSF-MP6 foram também oxidadas facilmente pelo oxigénio atmosférico, com consequente perda de actividade. Quando se ve- ζ

rificou este facto começou-se a realizar as experiências de

activação de B-CLL com uma dose sub-óptima -mercaptoetanol presente durante o período de cultura. Contudo, concentrações mais altas de β -mercaptoetanol (50-200 JAH) promoveram o aumento da própria síntese de DM. A estimulação do crescimento de células leucémias pelos tióis e dissulfuretos in vitro é um fenómeno bem conhecido (22). A figura 3 representa a reconstituição da actividade biológica completa numa preparação de BSF-MP6 de oito meses inactiva, após incubação com DTT. A observação da reactivação do BSF-MP6 por redução, constitui uma característica típica das tio-redoxinas (6). A amostra (soro isento, estéril, de meio condicionado de 24 horas de MP6 conservado à temperatura de +4°C) foi reduzida durante 30 minutos à temperatura de 37°C com 2 mM de DTT antes da HPLC-filtração por gel. Foi recuperada a maior parte da actividade biológica total na região de 12 KDa. A demonstração pelo radio-imuno-ensaio e as experiin- cias de reconstituição da homologia de BSF-MP6 com a tio-redo-xina ou com um análogo da tio-redoxina, como citado anterior-mente, permitiu demonstrar se a tio-redoxina proveniente de outras fontes poderá substituir o BSF-MP6 no ensaio biológico.

Testou-se a tio-redoxina humana homogénea proveniente de placen- -7 _ 1 ii ta (13)> numa concentração de 0,5x10 M a 0,5x10 M que demons-

, _Q trou a descida da actividade biologica para 0,5x10 M.

Os resultados do teste estão apresentados no quadro 2 seguinte.

As células B-CLL foram pré-tratadas com SAC a 1:100 000 e 210 Unidades/ml de IL. Adicionou-se 3H-timidina nas últimas

18 horas de um período de incubação de 72 horas. Como se apresenta no quadro 2, a tio-redoxina teve grande actividade.

Quadro 2. Estimulação de células B por tio-redoxina de placenta humana.

Tio-redoxina Síntese de DNA (M) Incorporação 3H-Timidina (cpm) 0,5 x 10-7 6327 Meio de controlo 1240

Realizou-se a caracterização bioquímica destas células auxiliares T derivadas de tio-redoxina por cromatografia de afinidade de imuno-absorção, com Sefarose-anticorpos de carneiro anti-tio-redoxina, associada com HPLC-filtração por gel. 0 processo forneceu uma tio-redoxina de grande pureza, como se mostra na figura 4. 0 material inicial foi meio isento de soro MP6. A fotografia do gel de SDS-PAGE confirma a pureza e o peso molecular do material purificado por afinidade.

Para a compreenção da diferenciação de células B, a doença donal de células B provou ser um exemplo muito útil (11). A capacidade de proliferação baixa de B-CLL in vivo em parte, deve ser o resultado de uma deficiência dos factores de crescimento produzido por células não B. 0 BSF-MP6/tio-redoxina está de acordo cora a prova apresentada aqui na ausência de ligações. A demonstração de que o BSF-MP6, com a sua actividade de tio--redoxina, facilita uma resposta adequada à IL-2, I'L-4·, e TNF-^ derivados de células B proporciona pela primeira vez uma explicação possível para a paragem de crescimento de células B-CLL. A des-regulação dos linfócitos auxiliares T nos doentes de B-CLL (15) podem provocar uma perda na produção de tio-redo-xina necessária para a activação das células de B-CLL como demonstram os presentes resultados. Alternativamente, as células de B-CLL devem ser deficientes para tio-redoxina autócrina ou requerem uma dose inicial de tio-redoxina proveniente do exterior para iniciarem a sua produção autócrina. A presente descoberta da identificação entre a tio-redoxina e o factor estimulador de células B, sugere de um modo acentuado um desempenho imunológico fulcral para esta enzima. Este facilita o sinal adequado de transdução e a função bem conhecida da enzima para catalisar as reacções de intercâmbio tiol-dissulfureto pode (3), presumivelmente, permitir a eventual penetração, no receptor, correcta, tridimensional, dinâmica, embora se necessitem estudos posteriores para adquirir o conhecimento exacto do mecanismo.

Tem sido um modelo experimental útil in vitro para os estudos do crescimento de células B e dos sinais que controlam a diferenciação o herpes vírus linfotrópico B humano, vírus de Epstein-Barr (EBV), dado que este induz a proliferação e a diferenciação (16), por tomar obrigatoriamente dependente dos genes o crescimento de células B (17)· As células de B-CLL têm, -18- contudo, sido refractárias às tentativas de transformação por EBV e uma explicação possível para esta resistência pode ser o facto de as células B-CLL, além da sua baixa expressão de receptores para EBV C CD21), deverem ser deficientes na própria expressão do gene de tio-redoxina como indicado no presente relatório e pelas nossas análises de imunofluorescência preliminares . A tio-redoxina celular, foi recentemente indicada como um dador de hidrogénio fundamental para a ribonucleótido reduc-tase codificada do vírus de herpes simplex tipo 1 (18). Portanto, a ausência de tio-redoxina nas células de B-CLL pode efec-tivamente bloquear a multiplicação de herpes vírus naquelas células .

Estratégia para a terapêutica 1) A tio-redoxina por si, especialmente, a MP6/Trx deve administrar-se quando células malignas já exprimem qualquer dos sítios de ligação para a tio-redoxina. 2) Deve administrar-se em associação a tio-redoxina mais os compostos que constam do quadro 1 quando células malignas não exprimem qualquer dos sítios de ligação para a tio-redoxina.

Esta inclui qualquer dos compostos específicos listados.

Legendas das figuras

Figura A e B 0 MP6 induz sinais para a síntese de DNA. Células derivadas do clone 183 de B-CLL, conservadas em congelação em azoto líquido foram reanimadas e induzidas para a síntese de DNA (figura 1A e 1B) e secreção de imunoglobulina (dados não representados) com SAC (figura 1A) ou com TPA (figura 1B) como sinais de activaçâo. Para a indução da poliferação e da diferenciação com SAC, incubaram-se as células com bactérias fixas durante dois dias e em seguida expuseram-se a 100 Unidades/ml de interleucinas recombinantes ou citoquina de células B naturais eventualmente na presença de 255¾ de BSF-MP6 (v/v). Cultivaram-se as células em placas de 96 cavidades de fundo plano com culturas de 0,2 ml (4x103 células por cavidade) ou culturas de 2ml (4x10° por cavidade) (Costar, Cambridge, MA) em meio RPMI 1640 (Flow Laboratories, Ayshire, Grãbretanha), complementado com soro de vitela fetal a 105¾ (Gibco, Glasgow, G.B.), 2mM de L-glutamina, 50 JKg/ml de gentamicina, 100 UI/ /ml de penicilina e 100 yug/ml de estreptomicina. Cultivaram--se as células durante seis dias à temperatura de 37°C sob atmosfera de ar a 55¾ de dióxido de carbono.

Avaliaram-se as sínteses de DNA, analisando a incorpo-

O ração de 1^iCi( = 37 KBq) por cavidade de timidina tritiada (( H) dThd; spec. act. 6,7 Ci/mmol; Dupont Scandinavia, Stockholm, Sweden), durante as últimas 20-24 horas do período de cultura.

Utilizaram-se as partículas SAC fixadas por formalina e inactivadas pelo calor numa concentração final de 0,1%; utilizou-se TPA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a uma concentração de 1,6x10“^M; obteve-se BSF-MP6 de cultura de 24 horas isentas de soro de hibridoma de células T MP6 desenvolvido em meio de Iscoves suplementado com 400 ^g/ml de BSA (Boerhinger--Mannheim, Mannheim, Alemanha), com 12,5 jig/ml de transferrina humana (Kabi, Estocolmo, Suécia), 50 ^im de β-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina, penicilina/estreptomicina concentrada num dispositivo Amicon com um filtro YM2. Adquiriu-se a rIL-2 de Amgen (Amersham, Amersham G.B.). A rIL-1 β (Genzyme, Boston, MA) tinha uma actividade específica de 10^ U/mg e utilizou-se na concentração de 10 U/ml. A rIL-4 adquiriu-se a Genzyme (Boston MA) e utilizou-se uma concentração final de 100 U/ml. A rIL-6 foi uma oferta do Dr. Kishimoto, Osaka, Japão e foi utilizada na concentração de 100 U/ml. Utilizou-se TNF-£<recombinan-te com uma actividade específica de 6x10^ U/mg, na concentração de 100 ng/ml e este foi uma oferta do Dr. G.R. Adolf, Ehrnst Roehringer Institute, (Viena, Áustria). A Cellular Products (Buffalo, Nova Iorque) forneceu LMW-BCGF que se utilizou numa concentração de 10$ v/v. 0 anti--CD40 monoclonal (G28-5 Mab), utilizou-se numa concentração de ljig/ml, tendo sido uma oferta do Dr. E. Clark (Seattle, WA). Obteve-se rIFN-)^do Genentech (São Francisco, CA). Este tinha 7 uma especificidade de 3x10 U/mg e foi utilizado na concentração de 500 U/ml.

Figura 2

Radio-imuno-ensaio de tio-redoxina que mostra a identidade entre BSF-MP6 e a tio-redoxina. A linha a cheio representa a tio-redoxina de placenta humana pura. A linha a tracejado representa BSF-MP6.

Realizou-se o radio-imuno-ensaio de acordo com a descrição anterior, (13) resumidamente: incubou-se 0,1 ml (0,2 / /-21- j pmol) de tio-redoxina de placenta humana marcada com ^2^I, com 0,1 ml de tio-redoxina humana padrão, ou a amostra desconhecida (sobrenadante de MP6 concentrado 50 vezes por precipitação com sulfato de amónio), diluída em série e 0,1 ml (5 jxg) da fracção de IgG de um anti-soro d® coelho em função de tio-redoxina humana, à temperatura de 37°C, sob agitação, durante 4 horas. No fim do período de incubação, adicionou-se 0,1 ml de um anti-soro de caprino IgG anti-coelho diluído a 1:5 e continuou-se a incubação durante 16 horas à temperatura de 4°C.

Separou-se a radioactividade ligada (B) da livre (F) por centrifugação durante 30 minutos a 10 OOOxg, seguida de uma remoção cuidadosa do sobrenadante. Determinou-se a radioactividade simultaneamente no grão e nas fracções sobrenadantes utilizando-se um contador gammaLKB (Bromma, Suécia). Calculou-se a relação B/F e confrontou-se com concentr-ações várias de tio-redoxina padrão. Utilizaram-se como controlos negativos as reacções na ausência de tio-redoxina humana de competição e de anti-anticorpo de coelho de tio-redoxina humana. Realizou--se a incorporação de iodo na tio-redoxina de acordo com o método da cloramina T (13). Realizaram-se todas as diluições e incubações em solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS) contendo 1 mg/ml de BSA.

Figura 3

Reconstituição da actividade de BSF-MP6 por redução com DTT.

Pode recuperar-se a actividade biológica de BSF-MP6 / 22- como se demonstrou anteriormente. Cultivou-se tio-redoxina expressando MP6 do clone de T-hibridoma durante 24 horas em meio de Iscoves contendo 400 μg/ml de BSA, 12,5 pg de transfer-rina humana, 50 μ¥ί de β -mercaptoetanol, 100 jig/ml de estrep-tavidina, e 100 U/ml de penicilina e 2 mM de L-glutamina, mas decorridas duas semanas de conservação à temperatura de +4°C, o sobrenadante perdeu a actividade biológica. 0 croma-tograma mostra o perfil de proteína avaliado na densidade óp-tica de 205 nm (escala total: A=0,5), de 200 Jil de sobrenadante MP6, com pré-tratamento de mM de DTT, e em seguida separação em coluna de filtração por gel de Superose-12 FPLC (Pharmacia, Uppsala, Suécia), equilibrada com solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato de pH 7,2. 0 débito foi de 0,4 ml/minuto. Recolheram-se fracções de 2 ml e monitorizou-se a actividade biológica em células B-CLL ou em células B tonsilares normais, mediante a medição da incorporação de •5 ^H-timidina, como indicado pelas barras verticais do croma-tograma, Os marcadores de peso molecular indicados foram albumina de soro bovino (68K) e ribonuclease A (13,7K).

Figura 4

Cromatograma de BSF-ΜΡβ purificado em coluna de afinidade anti-tio-redoxina mais HPLC de filtração por gel.

Realizou-se a cromatografia por HPLC em material que foi ligado e eluido a pH de 3,0 proveniente de uma coluna de Sefarose-proteína A (1,5x6cm), anti-tio-redoxina de carneiro, ligada de acordo com o método descrito anteriormente (21). /23-

Recolheram-se fracçSes de 1 ml. Como tampão de equilíbrio utilizou-se PBS desarejado por He^. 0 primeiro pico a 12 KDa contém a actividade biológica. 0 segundo pico é um sal.

Gel de SDS-poliacrilamida:

Para a análise da pureza utilizou-se um minigel SDS-poliacrilamida de gradiente a 8-25$ (Pharmacia Phast gel system). As amostras são, da esquerda para a direita: sobre-nadante isento de soro de MP6, antes da coluna de actividade; BSF-MP6/tio-redoxina purificada por afinidade; tio-redoxina de placenta humana; marcadores de peso molecular (Pharmacia); de cima para baixo: 92,5 KDa, 67 KDa, 45 KDa, 30,1 KDa, 20,1 KDa, 14,7 KDa. /-24- • -n#

Referências e notas 1. E.A. Clark e J.A. Ledbetter, Adv. Câncer Res. 52, 1989; M.F. Greaves, ibid. 234, 697 (1986). 2. A. 0'Garra, S. Umland, T. DeFrance, e J. Christianzen, Immunol. Today 9, 45 (1988); J.G. Gordon e G.R. Guy. Immu-nol. Today, 8, 339 (1987) for review; IL-1: C.J. March et al., Nature 315, 641 (1985); IL-2: T. Taniguchi et al., Nature 302, 305 (1983); IL-4: T. Yakota et al., Proc Natl Acad Sei USA 83, 5894, (1986); IL-5: C. Azuma et al., Nucleic Acid Res. 14, 9149 (1986); IL-6: T.Hirano et al., Nature 234, 73 (1986); LMW-BCGF: S.Sharma, S. Mehta, J. Morgan, and A. Maizel, ibid. 235, 1489 (1987); IFN-^0: D.V. Goeddel et al., Nature 287, 411, (1980); Lymphotoxin (TNF-oO*. P.W. Gray. Nature 312, 721, (1984); TNF: T. Shirai, H. Yamaguchi, H. Ito, C.W. Todd, e B. Walla-ce, Nature 313, 803 (1985); TGF-β: R.D. Derynok et al., 316, 701 (1985). 3. A. Homlgren, Ann Rev. Biochem. 54, 237 (1985); F. K. Gleason e A. Holmgren, FEMS Microbiol, Rev. 54, 271 (1988); A. Holm-gren, In: Thioredoxin e glutaredoxin systems: Structure e function. Proceedings of the Ninth Karolinska Institute Nobel Conference 1985. (Ed. A. Holmgren) Raven Press p.1 (1986); A. Holmgren, J.

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Klein, Nature 308, 189, (1983); 17· J. Gordon et al., Immunol. Today 10, 153 (1989). 18. A. J. Darling, J. Gen. Virol. 89, 515, 1988.

Claims (11)

1. NOVAS REIVINDICAÇÕES 1.- Método para o tratamento de virulências bema-topoiéticas tais como leucemias de células B e leucemia linfo-cítica crõnica de células B no homem e em outros animais, carac terizado pelo facto de se administrar uma quantidade adequada sob o ponto de vista terapêutico de tioredoxina ou de um seu análogo comportando o sítio activo Cys-Gly-Pro-Cys, especialmen te MP6/Trx, tal que proporcione um nível sérico ou plasmático de tioredoxina compreendido entre cerca de 2 e cerca de 100 vezes o valor da tioredoxina sérica ou plasmática de ocorrência natural.
2. 2.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se utilizar tioredoxina de origem animal, quer humana quer de outros mamíferos, procariótica ou recombinan te.
3. 3. - Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se utilizar tioredoxina proveniente de linfõcitos humanos ou de outra fonte humana.
4. 4. - Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, ca racterizado pelo facto de se realizar o pré-tratamento, com um co-factor capaz de induzir os sítios de ligação da tioredoxina.
5. 5. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado pelo facto de se utilizar um co-factor escolhido entre: (a) anti-imoglubinas (anti-idiotipos); (b) interleucina 1 e seus sub-componentes; (c) interleucina 2 e seus sub-componentes; (d) interleucina 3 e seus sub-componentes; (e) interleucina 4 (BSF1); (f) anticorpos dos receptores anti-IL4; (g) anticorpos anti-receptores (gpl40) e agentes reacticos C nos receptores C3d; (h) anti - gp35 (CD20); (i) interferões (alfa, beta e gama); (j) vitaminas; (k) leucotraieno B4 (l) TNF-0<r. ,-29- j^“*
6. 6.- Método de acordo com a reivindicação 5/ caracte rizado pelo facto de se utilizar como co-factor a interleucina--2.
7. 7.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se misturar tioredoxi-na ou seus análogos comportando o sitio activo Cys-Gly-Pro-Cys como ingrediente activo, com agentes auxiliares de formulação adequados.
8. 8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, carac terizado pelo facto de se incluir também um co-factor escolhido entre os apresentados de (a) a (1) na reivindicação 5.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, carac terizado pelo facto de o referido co-factor ser a interleucina--2.
10. 10.- Processo para potenciar a reactividade dos lin-fõcitos que reagem contra as células cancerosas exprimindo estru turas superficiais reconhecidas pelas células citotõxicas do doente, caracterizado pelo facto de se administrar tioredoxina ou um seu análogo comportando o sítio activo Cys-Gly-Pro-Cys, eventualmente em associação com um co-factor escolhido entre os apresentados de (a) a (1) na reivindicação 5. -30- /
11. 11.- Processo de acordo com as reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo facto de se utilizar como tioredoxina a variante MP6/Trx. Lisboa, 31 de Dezembro de 1991 O Agsite Oháíii do ProprisíJcdc ir;c!·