DE69232008T2 - Verwendung von insulinähnlichen Wachstumsfaktoren und Analogen zur BEHANDLUNG VON ERKRANKUNGEN DER SEHNERVEN - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Die Erfindung liegt auf dem Gebiet retinaler neuronaler Erkrankungen.
• Insulin-artige Wachstumsfaktoren (IGFs) sind in vielfältigen Tierspezies als Polypeptide mit der Wirkung identifiziert worden, das Wachstum von Zellen in einer Vielfalt von Geweben zu stimulieren (Baxter et al., 1988, Comp. Biochem. Physiol. 91 B: 229-235; Daughaday et al., 1989, Endocrine Rev. 10: 68-91), insbesondere während der Entwicklung (D'Ercole, 1987, J. Devel. Physiol. 9: 481-495). Die IGFs, von denen jedes ein Molekulargewicht von etwa 7500 Dalton aufweist, sind chemisch mit Human-Proinsulin verwandt: d. h., sie besitzen A- und B-Domänen, die (1) hoch homolog zu den entsprechenden Domänen von Proinsulin sind und (2) durch kleinere und damit nicht in Beziehung stehende C-Domänen verbunden sind. Eine Carboxy-terminale Verlängerung, die D-Domäne, liegt ebenfalls in IGFs vor, wird aber nicht im Proinsulin gefunden. Es gibt auch funktionelle Homologien zwischen den IGFs und Insulin. Wie Insulin stimulieren IGFs die Phosphorylierung von spezifischen Tyrosin-Resten innerhalb der zytoplasmischen Domäne der Rezeptoren, an welche sie sich binden.
• Unter Verwendung spezifischer Peptid-Antikörper als Sonden sind IGF-I und IGF-II (manchmal als "Sornatomedin C" bzw. "Somatomedin A" bezeichnet) in einer Vielfalt von Geweben gefunden worden, einschließlich des zentralen Nervensystems (ZNS) von Säugern; die Anwesenheit von mRNAs, die für diese Polypeptide im ZNS codieren, legt eine lokale Synthese im ZNS nahe (Baskin et al., 1988, TINS 11: 107-111). Zusätzlich wurde IGF-III [oder "Gehirn-IGF" oder IGF-I (4-70)], eine verkürzte Form von IGF-I, welcher die drei N-terminalen Aminosäurereste des letztgenannten Proteins fehlen, in fötalem und erwachsenem menschlichem Gehirn (Sara et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 4904-4907) sowie im Kolostrum (Francis et al., 1988, Biochem. J. 251: 95-103) gefunden.
• IGF-Rezeptoren sind aus peripheren Geweben sowie aus Gehirn-Gewebe isoliert worden (Waldbillig" R. J. et al., 1988, Esp. Eye Res. 47: 587-607; Masagure, J. und M. P. Czech, 1982, J. Biol. Chem. 257 : 5038-5045; Rechler, M. M. und S. P. Nissley, 1985, Ann. Rev. Physiol. 47 : 425-442). Die in der Zellmembran gefundeinen Rezeptoren sind entweder Dimere, die eine alpha- und eine beta- Untereinheit umfassen, oder Heterotetramere, die zwei alpha/beta-Untereinheitspaare umfassen. Obwohl sich IGFs an die dimere Form des Rezeptors binden, findet eine funktionelle Aktivierung nur beim Binden an die heterotetramere Spezies statt (Tollefsen, S. E. et al., 1991, Biochemistry 30: 48-54). IGF-Rezeptoren, die aus peripherem und Gehirn-Gewebe isoliert worden sind, unterscheiden sich in den Molekulargewichten ihrer alpha-Untereinheiten (Waldbillig, R. J. et al., 1988, Exp. Eye Res. 47: 587-607), und selbst innerhalb des Gehirngewebes sind IGF- Rezeptoren, die aus neuronalen Zellen isoliert werden, verschieden von denjenigen, die aus Gliazellen isoliert werden (Burgess, S. K. et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 1618-1622). Ob diese Unterschiede abgeänderte funktionelle oder Bindungsspezifitäten widerspiegeln, ist nicht bekannt. Schließlich beschreibt die europäische Patentanmeldung Nr. 86 850 417.6 einen Beleg für eine weitere Art von IGF-Rezeptor, der in menschlichen fötalen Membranen angeordnet ist.
• IGF-I und IGF-II scheinen eine stimulatorische Wirkung auf die Entwicklung oder Proliferation eines großen Bereichs von empfänglichen Zelltypen zu haben (Daughaday et al., oben). Eine Behandlung mit IGFs oder mit gewissen Polypeptid- Fragmenten derselben ist verschiedentlich als Knochenheilungs- und -ersatztherapie (europäische Patentanmeldung Nr. 88303855.6), als Mittel, um gewissen schädlichen Nebenwirkungen von karzinostatischen Arzneimitteln entgegenzuwirken (japanische Patentanmeldung Nr. 63196524), und als Weg, die Milch- und FleischproduktiEon in Vieh und anderen Zuchttieren zu steigern (Larsen et al., US-Patent Nr. 4,783,524), vorgeschlagen worden. Die Wirkung von IGF auf Zellen, die aus verschiedenen Teilen des ZNS und aus dem peripheren Nervensystem erhalten wurden, ist untersucht worden (Aizenman et al., 1987, Brain Res. 406: 32-42; Fellows et al., 1987, Soc. Neurosci. Abstr. 13: 1615; Onifer et al., 1987, Soc. Neurosci. Abstr. 13: 1615; europäische Patentanmeldung Nr. 868504117.6; Bothwell 1982, J. Neurosci. Res. 8: 225-231; Recio-Pinto et al., 1986, J. Neurosci. 6: 1211-1219). Zusätzlich ist gezeigt worden, dass die IGFs die Entwicklung von undifferenzierten Neuronen-ähnlichen Zellen beeinflussen: als IGFs dem Wachstumsmedium von humanen Neuroblastom-Tumorzellen zugesetzt wurden, beobachtete man, dass diese Zellen Neuriten entwickeln und eine Mitose eingehen (Recio-Pinto und Ishii, 1988, J. Neurosci. Res. 19: 312-320; Mattson et al., 1986, J. Cell Biol. 102 : 1949-1954).
• Es wurde gezeigt, dass IGFs innerhalb des Nervensystems Gliazellen-Enzymaktivitäten induzieren (McMorris et al., 1985, J. Neurochem. 44: 1242-1251), die Differenzierung und Entwicklung von Oligodentrozyten induzieren (McMorris und Dubois-Dalcq, 1988, Neurosci. Res. 21: 199-209) und die embryonische Gehirnzellen-Proliferation, -Entwicklung und den Neuritenauswachs unterstützen (Neilsen, F. und S. Gammeltoft, 1990, FEBS Letters 262 : 142-144; Svrzic und Schubert, 1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 172: 54-60; Torres-Alwman et al., 1990, Neuroscience 35: 601-608; Recio-Pinto et al., 1986, J. Neurosci. 6: 1211-1219).
• Man fand IGFs sowohl im sich entwickelnden als auch im erwachsenen Auge im Humor aquosus (Tripathi et al., 1991, Dev. Drug Res. 22: 1-23) und im Humor vitreus (Grant et al., 1991, Diabetes 35: 416-420). Autoradiographische Untersuchungen unter Verwendung von iodierten Peptiden enthüllten IGF- Bindungsstellen innerhalb des Uvea-Trakts, der Choroidea, der Linse, der Sklera und der Retina (Bassas et al., 1989, Endocrinology 125 : 1255-2320; Bassnett und Beebe, 1990, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31: 1637-1643; Waldbillig et al., 1990, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31: 1015-1022). In der erwachsenen Retina scheinen IGF-I-Bindungsstellen spezifisch an den nukleären Schichten und den Photorezeptor-Regionen, einschließlich der äußeren Stäbchensegmente, vorzulieglen (Ocrant et al., 1989, Endocrinology 125: 2407-2413; Waldbillig et al., 1988, Exp. Eye. Res. 47: 587-607; Zick et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 10259- 10264), wohingegen Proteine, die immunologisch mit IGF-II-Rezeptoren verwandt sind, im retinalen Pigmentepithel aufgezeigt worden sind (Ocrant et al., 1989, Endocrinology 125: 2407-2413). Die IGF-I- und IGF-II-mRNA-Konzentrationen sind innerhalb der Retina des Auges am höchsten (Danias und Stylianopoulou 1990, Curr. Eye Res. 9: 379-386). Jedoch ist die Funktion von IGFs im Auge unbekannt, und die IGF-Bindungsstellen in der Retina sind noch nicht voll charakterisiert worden. Deshalb ist es noch nicht bekannt, ob diese Stellen tatsächlich als IGF- Rezeptoren fungieren, d. h. ob sie eine biologische Antwort vermitteln.
• Es ist auf der Grundlage von Ergebnissen, welche zeigen, dass IGF-I die Permeabilität von Membranen für Kalium beeinflusst (Beebe et al., 1986, Prog. Dev. Biol. Teil A: 365-369; Parmelee und Beebe, 1988, J. Cell Phys. 134; 491-496) und dass äulßere und innere Stäbchensegmente IGF-Bindungsstellen enthalten (Waldbillig etal., 1988, Exp. Eye. Res. 47: 587-607; Zick et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 10259-10264), spekuliert worden, dass IGF-I bei der Lichttransduktion beteiligt sein könnte.
• Bezüglich der Diabetes-Retinopathie, bei welcher der pathologische Hauptbefund im Auge eine Neovaskularisation ist, führen King et al. (1985, J. Clin. Invest. 75: 1028-1036) an, dass "wir in der vorliegenden Studie die Rezeptoren und den wachstumsfördernden Effekt des Insulin-artigen Wachstumsfaktors (IGF-I) und die Multiplikations-stimulierende Aktivität (MSA und IGF-II) bei Endothelzellen und Perizyten aus Kälber-Retinakapillaren und bei Endothel- und glatten Muskelzellen aus der Kälberaorta charakterisiert haben" und "diese Daten zeigen, dass vaskuläre Zellen Insulin- und IGF-Rezeptoren aufweisen, aber eine unterschiedliche Antwort auf diese Hormone aufweisen. Diese Unterschiede in der biologischen Antwort zwischen Zellen aus Retinakapillaren und großen Arterien könnten einen Schlüssel bereitstellen, um die Pathogenese der diabetischen Mikro- und Makroangiopathie zu verstehen". Zusätzlich führen Grant et al. (1986, Diabetes 35: 416-420) an, dass "die Konzentrationen von IGF-I im Glaskörper der meisten diabetischen Subjekte mit schwerer Neovaskularisation demgemäss im Bereich liegen, von dem bekannt ist, dass er die zelluläre Differenzierung und das Wachstum in mehreren Systemen stimuliert. Ob sie das im Auge tun und so zu der Entwicklung von Retinopathie beitragen, bleibt festzustellen".
• Die WO-A-90114838 offenbart Verfahren zur Erhöhung des Überlebens von Nervenzellen in Säugern unter Verwendung von IGF-I oder IGF-II.
• Retina-Nervenzellen sind Nervenzellen des Gehirns; vgl. Histologie, F. Geneser, Köln, 1990, Deutscher Ärzteverlag, Seite 692, Kapitel 25.4.
• Park & Hollenberg, Development Biology, 148, November 1991, 322-333, offenbart, dass IGF eine Nervenregeneration induzieren kann.
Zusammenfassung der Erfindung
• Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird IGF-I, IGF-II oder IGF-III für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Retinadegeneration verwendet.
• Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung enthält ein Implantat, das zur Implantation in das Auge geeignet ist, IGF-I, IGF-II oder IGF-III.
• Es wurde entdeckt, dass IGFs die Wirkung aufweisen, das Überleben von Zellen zu fördern, die aus dissoziierter Retina präpariert worden sind, welche aus pränatalem und postnatalem Retina-Nervengewebe erhalten wurden. Dieser Befund ist signifikant und unerwartet, insoweit als von anderen Wachstumsfaktoren nicht gezeigt worden ist, dass sie das Überleben von breiten Klassen von Retina-Nervenzellen sowohl prä- als auch postnatal fördern.
Beschreibung der Erfindung
• Die Retinadegeneration, die behandelt wird, kann das Ergebnis einer Verletzung, von Altern und/oder Krankheit sein. Der Ausdruck Verletzung ist ein breiter Ausdruck, der, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Verletzung einschließt, welche eine Retinadegeneration zur Folge hat, wie Photodegeneration, Trauma, Axotomie, neurotoxisch-exzitatorische Degeneration oder ischämische neuronale Degeneration. Der Ausdruck Erkrankung ist ein breiter Ausdruck, der, ohne darauf beschränkt zu sein, irgendwelche infektiösen oder nicht-infektiösen Erkrankungen, wie vererbte Retinadystrophie, diabetische Retinopathie, Alzheimer-Erkrankung, infantile maligne Osteopetrosis, Ceroidlipofuskose oder Cholestase einschließt.
• Die Retinadegeneration kann eine Degeneration von Photorezeptorzellen, amakrinen Zellen, horizontalen Zellen, bipolaren Zellen oder Ganglionzellen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Degeneration eine Degeneration von Photorezeptorzellen.
• Das Überleben von behandelten Retina-Nervenzellen bezeichnet die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zelle zu einem Ausmaß, das größer ist als dasjenige der unbehandelten Kontrollen. Da allgemein geglaubt wird, dass die Mehrheit der Retina-Nervenzellen nicht zur Zellteilung in der Lage ist, kann die Fähigkeit eines Mittels, das Überleben derartiger Zellen zu fördern, durch Assays gemessen werden, welche reproduzierbar die relative Zahl von Zellen anzeigen, wie das direkte Zählen der Zellen, die sich als lebensfähige Zellen anfärben lassen oder die andere Eigenschaften von lebensfähigen Neuronen besitzen. Die Erfindung ist für die therapeutische Behandlung einer Störung eines Menschen oder anderen Säugers nützlich, welche durch Tod und/oder Dysfunktion von Retina-Nervenzellen gekennzeichnet ist, einschließlich Störungen, die einer Erkrankung, dem Altern oder einer Verletzung von derartigen Retina-Nervenzellen zuzuschreiben sind.
• Das IGF, das in der Erfindung verwendet wird, kann chemisch auf solche Weise modifiziert sein, dass seine Wirksamkeit gesteigert wird, z. B. durch Steigerung des. Transports dieser Polypeptide durch die Blut-Retina-Schranke, z. B. durch Modifikationen des Polypeptids, welche die Lipophilie steigern, die Glycosylierung ändern oder die positive Nettoladung erhöhen.
• Eine Zusammensetzung zur Verwendung in der Erfindung kann eine Lösung, die das IGF enthält, mit Trägern für eine ophthalmische Verabreichung umfassen, die in einem chemisch inerten Gefäß enthalten ist, das an einem Ende mit einer Tropfeinirichtung oder anderen Einrichtung für die Überführung von Tropfen der Lösung aus dem Gefäß zum Auge des Empfängers der Lösung verschlossen ist. Die Zusammensetzung kann in einem chemisch inerten Gefäß enthalten sein, z. B. einem Implantat oder einer implantierten Scheibe, das bzw. die einem Empfänger für die Überführung der Lösung aus dem Implantat zum Auge des Empfängers implantiert worden ist.
• Eine weitere geeignete Zusammensetzung umfasst eine Salbe, welche das IGF mit Trägern für die ophthalmische Verabreichung enthält.
• Die IGFs können in Kombination mit anderen Substanzen verwendet werden, welche zusätzliche oder synergistische Wirkungen als Mittel für die Behandlung von Erkrankungen oder Störungen bereitstellen können, welche durch ein erhöhtes Risiko von Retina-Nervenzellen-Tod gekennzeichnet sind. Die Bioaktivität jedes Polypeptids (oder jeder Kombination von Polypeptiden) der Erfindung kann bequem durch einen Retinazellen-Kulturassay überprüft werden, der in Einzelheit nachstehend beschrieben ist. Dieser Assay offenbart eine zuvor unbekannte Bioaktivität von IGF-I und eines funktionellen Derivats von IGF-II. Die Routineanwendung dieses Assays durch einen Fachmann kann verwendet werden, um andere Moleküle, die eine Aktivität aufweisen, welche zu derjenigen von IGF-I additiv oder synergistisch ist, sowie therapeutisch nützliche funktionelle Derivate von IGF-I oder IGF-II zu entdecken. Demgemäß sollten die Peptide dieser Erfindung zur Verabreichung an Menschen und andere Säuger nützlich sein, die an Retina- Erkrankungen oder -Störungen leiden, welche durch ein erhöhtes Risiko von Retina- Nervenzellen-Tod gekennzeichnet sind.
• Die Formulierungen dieser Erfindung sind für eine parenterale Verabreichung, z. B. intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraorbitale, intraokulare, ophthalmische, topische, intranasale und Aerosol-Verabreichung nützlich. Die Zusammensetzungen können für eine parenterale Verabreichung an Menschen oder andere Säuger in therapeutisch wirksamen Mengen (z. B. Mengen, welche den pathologischen Zustand des Patienten beseitigen oder verringern) verabreicht werden, um eine Therapie für die oben beschriebenen Retina-Erkrankungen bereitzustellen.
• Die hierin bereitgestellten Verbindungen können durch Mischen mit pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Hilfsmitteln und Trägern zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden. Wie oben bemerkt, können derartige Zusammensetzungen zur Verwendung bei einer parenteralen Verabreichung, insbesondere in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen; für eine ophthalmische Verabreichung, insbesondere in Form von Tropfen oder Salben, hergestellt werden.
• Die Zusammensetzungen können bequem in Einheitsdosierungsform verabreicht werden und können durch irgendeines der auf dem pharmazeutischen Gebiet wohlbekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise wie in Reminoton's F'harmaceutical Sciences beschrieben. Formulierungen zur Verabreichung können als übliche Träger steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Cyclodextrane, Polyalkylenglycole, wie Polyethylenglycol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrierte Naphthäline und dergleichen, enthalten. Insbesondere können biokompatibles, bioabbaubares Lactid-Polyrner, Lactid-Glycolid-Copolymer oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere nützliche Träger sein, um die Freisetzung der Peptide zu steuern. Andere potenziell nützliche Zufuhrsysteme für diese Peptide schließen Ethylen-Vinylacetat-Copolymerteilchen, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen ein. Formulierungen zur Verabreichung können ein stabilisierendes Mittel, wie humanes Serumalbumin, sowie einen Permeationsverstärker, wie Glycocholat, einschließen. Zusätzlich können die Verbindungen für die ophthalmische Verabreichung in Form von Salben bereitgestellt werden, welche die aktive Verbindung zusammen mit üblichen Hilfsstoffen, wie Propylparaben, wasserfreiem flüssigem Lanolin, Mineralöl und weißem Petrolatum, enthalten.
• Die Konzentration der hierin beschriebenen Verbindungen in einer therapeutischen Zusammensetzung variiert abhängig von einer Anzahl von Faktoren, einschließlich der Dosierung des zu verabreichenden Arzneistoffes, der chemischen Eigenschaften (z. B. Hydrophobie) der verwendeten Verbindungen und des Verabreichungswegs. Allgemein ausgedrückt können die Verbindungen dieser Erfindung in einer wässrigen physiologischen Puffer-Lösung oder Salbe bereitgestellt werden, welche etwa 0,1 bis 10% Gew./Vol. Verbindung für die parenterale oder ophthalmische Verabreichung enthält. Typische Dosierungsbereiche liegen bei etwa 1 ug/kg bis etwa 1 g/kg Körpergewicht pro Tag. Ein bevorzugter Dosisbereich beträgt etwa 0,01 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die bevorzugte Dosis des zu verabreichenden Arzneistoffs hängt mit Wahrscheinlichkeit von solchen Variablen wie der Art und dem Progressionsausmaß der Retina-Erkrankung, dem Gesamt-Gesundheitszustand des speziellen Patienten, der relativen biologischen Wirksamkeit der gewählten Verbindung, der Formulierung der Verbindungs-Hilfsstoffe und seinem Verabreichungsweg ab.
• Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Diese Beispiele sollten nicht als Beschränkung des Bereichs der Erfindung angesehen werden, welcher allein durch die beigefügten Ansprüche zu bestimmen ist.
Beispiele
• Rekombinantes humanes IGF-I und IGF-II sowie mehrere chemisch synthetisierte Peptide, die aus Teilsequenzen von IGF-I und IGF-II bestehen, können aus kommerziellen Quellen oder durch direkte chemische Synthese erhalten werden.
• Beispiel 1: Um festzustellen, ob IGF-I die Wirkung einer Förderung des Überlebens von Retina-Nervenzellen aufweist, wurden dissoziierte Kulturen von Vogel-Fletina aus Tieren bei verschiedenen Entwicklungsaltern hergestellt, und die Zahl der Zellen, die in den Kulturen nach Inkubation über 48 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von IGF-I anwesend war, wurde gemessen.
• DiEa Retinae wurden aus embryonischen Hühnchen präpariert, durch enzymatische Verdauung dissoziiert und in vitro in definiertem Insulin/Serum-freiem Medium gemäß Sato et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 514-517) kultiviert. Die Zahl der Zellen in der Kultur wurde unter Verwendung der Vitalanfärbung Calcein-AM gemessen. Alle Zellen sind für Calcein-AM durchlässig, aber nur lebende Zellen können diese Verbindung in ein fluoreszierendes Derivat umwandeln, das durch gewöhnliche Verfahren nachweisbar ist. Im ersten Experiment wurde Calcein-AM (6 uM) zu verschiedenen Kulturen von Retinazellen gegeben, und die Beziehung zwischen dem Grad der Flluoreszenz und der Zahl der Zellen wurde bestimmt. Man fand, dass diese Beziehung linear war, wie in Fig. 1 gezeigt, was demonstrierte, dass dieser Assay für die Prüfung der Wirkung von Verbindungen auf das Überleben von Zellen in Kultur nützlich ist.
• Im nächsten Experiment wurde IGF-I mit einer Endkonzentration von 100 nM zur Hälfte der Kulturen gegeben, und die Zahl der Zellen, die bei einer 48-stündigen Nachbehandlung verblieben, wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Calcein-AM-Assays gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 wiedergegeben. IGF-I erhöhte im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen gleichmäßig das Überleben von Zellen (um 20-60%) in Retina-Neuronen-Kulturen, die aus Embryonen im Alter von 8, 10, 12 und 14 Tagen erhalten wurden.
• Beispiel 2: Um die Konzentration an IGF-I zu bestimmen, die erforderlich ist, um das Überleben von prä- oder postnatalen Retina-Neuronen in Kultur zu fördern, wurden die folgenden Experimente durchgeführt: Retina-Neuronen wurden aus dissozüerter Retina präpariert, die von 10 Tage alten Hühnerembryos oder aus postnatalen erwachsenen 6 Tage-Ratten, wie oben beschrieben, erhalten wurde. Die Kulturen wurden in Anwesenheit von zunehmenden Konzentrationen an IGF-I inkubiert, und die Zahl der Zellen, die bei 48-stündiger Nachbehandlung überlebten, wurde mit dem Calcein-AM-Assay gemessen. Die Daten sind in den Fig. 3 und 4 wiedergegeben und demonstrieren, dass IGF-I sowohl prä- als auch postnatal die Wirkung aufweist, das Überleben von Retina-Neuronen in Kultur auf Dosisabhängide Weise zu fördern. Auf der Grundlage der früher veröffentlichten Daten sind die Konzentrationen von IGF-I, welche das Nervenzellen-Überleben in unseren Experimenten fördern, mit der Tatsache im Einklang, dass IGF-I über seinen eigenen Rezeptor wirkt (Karey et al., 1988, In Vitro Cell. Dev. Biol. 24: 1107-1113; Ballard et al., 1988, Biochem. J. 249: 721-726).
• Beispiel 3: Um zu bestimmen, ob IGF-I die Retina-Neuritenregeneration beeinflusst, wurde eine Population von Neuronen, die aus dissozüerter Retina präpariert worden war, in einem definierten Insulin/Serumfreien Medium in Anwesenheit oder Abwesenheit von 100 nM IGF-I kultiviert. Die Kulturen wurden durch Phasenkontrast-Mikroskopie an den Tagen 2-4 nach der IGF-I-Behandlung überprüft. Fig. 5 veranschaulicht, dass mit IGF-I behandelte Kulturen mehr Zellen mit Neuriten enthielten als unbehandelte Kontrollkulturen, was anzeigt, dass IGF-I die Axon-Regeneration in Retina-Neuronen beeinflusst.
• Beispiel 4: Um zu bestimmen, ob ein Retina-Überleben erhöht werden kann, wenn sie in Anwesenheit funktioneller Derivate von IGF-I und IGF-II inkubiert wird, wurde ein lineares Fragment von IGF-II, das sowohl in IGF-I als auch in IGF-II relativ konserviert ist, mit unserem Assay getestet. Das Fragment enthielt eine Sequenz von 14 Aminosäuren aus IGF-II (Aminosäuren 54-67, wobei die aminoterminale Aminosäure von IGF-II Nr. 1 ist). Dieses Fragment, nachstehend als IGF-II (54-67) bezeichnet, wurde mit einer Endkonzentration von 100 uM zu einer Population von Neuronen gegeben, die aus dissoziierter Ratten-Retina präpariert worden waren, und man fand, dass es das Retina-Nervenzellen-Überleben fördert, wie in Fig. 6 demonstriert.
• Beispiel 5: Um zu bestimmen, ob IGF-I oder IGF-II (54-67) spezifisch das Überleben der Photorezeptor-Zellensubpopulation in Ratten-Retina-Neuronen-Kulturen fördern kann, wurden die folgenden Experimente durchgeführt: Der monoklonale Antikörper Rho42, der sich an ein antigenes Epitop innerhalb der extrazellulären Domäne von Rhodopsin bindet, welches auf der Oberfläche der Stäbchen- Photorezeptorzellen exprimiert wird (Molday und MacKenzie, 1983, Biochemistry 22: 653), wurde in diesem Assay verwendet. Retina-Neuronen-Kulturen von postnatalen Ratten wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von 100 nM IGF-I 48 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und mit Rho42 umgesetzt, an welches ein fluoreszierender Marker addiert worden war. Objektträger wurden präpariert, und das Maß der Fluoreszenz in den Kulturen wurde qualitativ unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops abgeschätzt. Es ist aus Fig. 7 klar, dass mit IGF-I behandelte Kulturen einen erhöhten Grad an Fluoreszenz zeigten, verglichen mit unbehandelten Kulturen, was demonstriert, dass IGF-I das Überleben der Photorezeptor-Zellensubpopulation in Retina-Neuronen-Kulturen von postnatalen Ratten fördert.
• Um diesen Assay quantitativ zu machen, entwickelten wir einen Rho42-ELISA- Test auf Zellen-Basis wie folgt: Mehrere Retina-Kulturen von postnatalen Ratten, die eine unterschiedliche Anzahl von Zellen enthielten, wurden 2-4 Tage inkubiert, wonach die Kulturen fixiert und entweder mit dem monoklonalen Rho42-Antikörper oder dem nicht-spezifischen monoklonalen Antikörper P3, der von der Myeloma- Zelllinie P3X6Ag8 sekretiert wird, immunmarkiert. Die Antikörper-Bindung wurde unter Verwendung eines sekundären Antikörpers, der mit Meerrettichperoxidase markiert war, und eines chromogenen Substrats O-Phenylendiamin (OPD) mit einer Maximum-Absorptionswellenlänge von 490 nm nachgewiesen. Der Grad der Absorption von Licht bei 490 nm, der in den Kulturen gemessen wird, steht demgemäss direkt mit der Menge des primären Antikörpers in Beziehung, der sich ursprünglich an die Zellen gebunden hatte. In Fig. 8 kann gesehen werden, dass es eine lineare Beziehung zwischen dem Grad der Absorption bei 490 nm und der Zahl der Zellen in jeder Kultur gibt. Zusätzlich ist der Assay für Photorezeptorzellen spezifisch, da nur Rho42 mit den Zellen reagierte, verglichen mit P3, bei dem dies nicht der Fall war.
• Als nächstes wurden die Ratten-Retina-Neuronen-Kulturen in Anwesenheit von IGF-I oder IGF-II (54-67) 48 Stunden inkubiert, wonach sie dem ELISA-Test auf Zellen-Basis, wie oben beschrieben, unterzogen wurden. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 wiedergegeben. Sowohl IGF-I als auch IGF-II (54-67) förderten das Überleben von Photorezeptorzellen um 20-30%, verglichen mit unbehandelten Kontrollkulturen.
• Beispiel 6: Kationisierung ist ein Verfahren, durch welches freie Carboxylgruppen von sauren Aminosäureresten an einem Polypeptid (d. h. Asparaginsäure- und Glutaminsäurereste) modifiziert werden, um die positive Nettoladung auf dem Polypeptid zu erhöhen. Das Verfahren der Kationisierung ist verwendet worden, um die zelluläre Aufnahme von großen Molekülen, wie Albumin und Meerrettichperoxidase, in Maus-Fibroblastenzellen zu steigern (Shen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. USA 75: 1872-1876). Kumagai et al. (1987, J. Biol. Chem. 262: 15214-15219) verwendeten intakte Mikrogefäße aus Rinderhirn, welche, wie mitgeteilt, ein Modellsystem zum Messen des Transports durch die Blut-Hirn-Schranke sind, und demonstrierten, dass die Aufnahme von kationisiertem Albumin durch isolierte Rinderhirn-Mikrogefäße im Vergleich zur Aufnahme von nativem Albumin erhöht war.
• Für eine globale Modifikation der freien Carboxylgruppen kann das Polypeptid (z. B. IGI-I, IGF-II oder ein funktionelles Derivat) mit überschüssigem Hexamethylendiamin (HMD) (15,5 g/g Gesamt-Protein) 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt werden, gefolgt vom kovalenten Kuppeln von HMD mit 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid (EDAC) (1,0 g/g Gesamt-Protein) über 3 Stunden bei Raumtemperatur. Unumgesetzte Spezies kann durch Filtration unter Verwendung von Centricon-3 MPS-1-Abtrennungsvorrichtungen (Amicon, Danvers, MA) oder Ionenaustausch-Chromatographie entfernt werden. Das gereinigte Polypeptid kann unter Verwendung von isoelektrischer Fokussierung analysiert werden, um die Menge der Kationisierung zu bestimmen.
• Wenn die globale Modifikation bei einem Polypeptid verwendet wird, das ein Ligand ist, der sich an einen Zelloberflächenrezeptor bindet, und die Modifikation ein Molekül erzeugt, dem eine biologische Aktivität fehlt, kann das Kationisierungsverfahren, wie oben beschrieben, wiederholt werden, außer dass das Polypeptid vor der Kationisierung an einen geeigneten Rezeptor vorgebunden würde, um die Rezeptor-Bindungsstelle des Polypeptids zu schützen. Dieses Schutzverfahren kann wie folgt durchgeführt werden:
• Als erstes wird Gewebe, z. B. Gehirn, das Rezeptoren für das interessierende Polypeptid (z. B. IGF-I) enthält, präpariert. [Alternativ kann ein rekombinanter Reeptor anstelle des von Gewebe abstammenden Rezeptors verwendet werden.] Gehirngewebe, das den zerebralen Kortex enthält, wird aus erwachsenen Ratten präpariert und 5 Minuten bei niedriger Leistung in einem Homogenisator (z. B. einem Brinkmann Polytron-Homogenisator) homogenisiert, der 50 Volumina eiskalten Puffer enthält, welcher aus 10 mM HEPES, 0,5% BSA, 0,0125% NEM, 9,025% Bacitracin und 100 KlE/ml Aprotinin, pH 7,6 besteht (Bohannon et al., 1986, Endocrinology 119: 943-945). Nach der Homogenisierung wird das Gewebe durch 20-minütige Zentrifugation bei 7800 · g gesammelt und in 10 Volumina Assay-Puffer resuspendiert.
• Als nächstes wird das Gewebe mit dem Polypeptid-Liganden zwei Stunden bei 4ºC inkubiert, um eine Rezeptorbindung zu ermöglichen. Die Reaktionsmischung wird auf Raumtemperatur gebracht, und das Kationisierungsverfahren wird unter Verwendung von HMD und EDAC, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird dann bei 4ºC 30 Sekunden in einem SS34-Rotor in einer Sorvall RCSB-Zentrifuge bei 16000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und das Pellet wird dreimal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Rinderserum-Albumin (1 mg/ml) gewaschen. Das Pellet wird in 100 mM Essigsäure resuspendiert und 10 Minuten bei 4ºC inkubiert, um das kationisierte Polypeptid aus seinem Rezeptor freizusetzen. Nach Zentrifugation wieder bei 16000 U/min wird der Überstand, der das freigesetzte kationisierte Polypeptid enthält, mit NaOH pH-neutralisiert. Es kann durch isoelektrische Fokussierung oder irgendeinen geeigneten Assay bezüglich der biologischen Aktivität analysiert werden.
• Beispiel 7: Eine Alternative zu dem globalen Modifikationsverfahren besteht darin, Polylysin an mindestens eine freie Carboxylgruppe an dem Polypeptid (wie IGF-I, IGF-II oder einem funktionellen Derivat von einem der beiden) mit oder ohne Rezeptorschutz, wie oben in Beispiel 6 beschrieben, zu kuppeln. Die Vorgehensweise folgt dem Verfahren von Shen et al. (1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1872-1876). Beispielsweise werden Polylysin, IGF-I und Carbodümid in einem 1 : 1 : 1-Verhältnis 3 Stunden bei Raumtemperatur in Wasser oder Puffer zueinandergegeben. Das modifizierte Protein kann, wie oben in Beispiel 6 beschrieben, abgetrennt und analysiert werden.
• Beispiel 8: Ein drittes Verfahren zur Modifikation von Protein-Carboxylgruppen, um den Blut-Gehirn-Schrankentransport zu erhöhen, besteht darin, Ester mit Diazomethan oder N,N-Dimethylformamid-R-Acetalen (DMF-Acetalen), worin R Dimethyl, Diethyl, Dibutyl, Dibenzyl usw. ist, zu bilden. Diese Art von Modifikation bildet rasch Ester aus negativ geladenen Carbonsäuregruppen, was so die positive Gesamtladung erhöht. Ein zusätzlicher Vorteil bei dieser Modifikation besteht darin, dass diese addierten Estergruppen derart sein können, dass sie die Gesamt-Lipophilie des Pollypeptids erhöhen und durch intrinsische Esterase in vivo entfernt werden können, um intakten Wachstumsfaktor zu liefern. Das Verfahren für diese Modifikation, mit oder ohne Rezeptorschutz, wie oben in Beispiel 6 beschrieben, besteht darin, Diazomethan oder DMF-Acetale in einem 1 : 1-Verhältnis 30 Minuten in Lösung bei Raumtemperatur mit dem Polypeptid umzusetzen, gefolgt von der Reinigung und Charakterisierung, wie oben in Beispiel 6 beschrieben.
• Beispiel 9: Ein viertes Verfahren der Kationisierung mit oder ohne Rezeptorschutz, wie oben in Beispiel 6 beschrieben, vereinigt die Vorteile der Polylysen-Kationisierung mit der Bildung von spaltbaren Estern, um den Blut-Gehirn- Schranlkentransport zu erhöhen sowie nach dem Transport intakten Wachstumsfaktor zu liefern. Polylysin kann durch Reaktion mit Benzyloxyacetylchlorid, gefolgt von Hydrierung und milden Veresterungsverfahren, reaktiv gemacht werden (Hassner et al., 1978, Tet. Let. 46: 4475-4478; Mihara et al., 1986, Int. J. Peptide Protein Res. 28: 141-145). Alternativ könnten DMF-Acetal-Derivate, die mit Polylysin reagieren können, verwendet werden, um Polylysin unter Verwendung von Esterverknüpfungen an freie Carboxylgruppen zu knüpfen.
• Beispiel 10: Eine weitere Art von Polypeptid-Modifikation ist die Glycosylierung: die Einführung von Glucose oder ähnlichen Resten durch reduktive Aminierung unter Verwendung von beispielsweise Glucose und Natriumcyanborhydrid (NaCNBH3). Es ist gezeigt worden, dass die Glycosylierung von Proteinen die zelluläre Aufnahme dieser Proteine erhöht und sich bei der Verbesserung des Blut-Gehirn-Schrankentransports als nützlich eruveisen könnte. Das Verfahren für die Glycosylierung mit oder ohne Rezeptorschutz, wie in Beispiel 6 beschrieben, beruht auf der Methode von Schwartz et al. (1977...), in der ein Polypeptid, wie IGF-I, IGF-II oder ein Funktionsderivat von einem der beiden in 200 mM Phosphatpuffer bei pH 7,0 mit Glucose und NaCNBH&sub3; in einem Molverhältnis von 1 : 300 : 1600 über mindestens 24 Stunden bei 37ºC vereinigt wird. Unumgesetzte Einheiten können, wie in Beispiel 6 beschrieben, oder mit Lectin-Affinitätschromatographie entfernt werden. In früheren Versuchen unter Verwendung von glycolysiertem Albumin wurde das modifizierte Albumin durch Ratten-Epididymis-Mikrogefäße mit einer größeren Geschwindigkeit aufgenommen als natives Albumin (Williams et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2393-2397).
• Beispiel 11: Um zu bestimmen, ob IGF-I, IGF-II und IGF-III das Überleben von Retina-Nervenzellen fördern können, wurden dissoziierte Kulturen von postnataler Ratten-Retina präpariert und bezüglich der Gesamtzahl von Zellen getestet, die nach Inkubation in Anwesenheit oder Abwesenheit von IGFs vorlagen. Die Retinae wurden aus postnatalen Tag 6-Ratten präpariert, durch enzymatische Verdauung dissoziiert und bei einer Dichte von 6,25 · 104 Zellen/cm² in definiertem Insulin/- Serum-freiem Medium (Bottenstein et al., 1979, PNAS 76: 514-517) ausgesät. Diese Kulturen sind heterogen und umfassen mindestens 5 unabhängige Retina-Nervenzellen-Subpopulationen, d.h. amakrine, bipolare, horizontale, Photorezeptor- und Ganglionzellen. Die Kulturen wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von 100 mM von jedem der IGFs inkubiert. Die Gesamtzahl an Zellen, die nach 4 Tagen verblieb, wurde durch Inkubation mit der Vitalanfärbung Calcein-AM zu 6 uM gemessen. Diese Verbindung wird von allen Zellen aufgenommen, kann aber nur von lebenden Zellen in ein fluoreszierendes Derivat umgewandelt werden. Die Beziehung zwischen Zellenzahl und relativer Fluoreszenz ist linear, was anzeigt, dass dieser Assay verwendet werden kann, um relative Unterschiede in Zellzahlen abzuschätzen. Fig. 10 ist eine Grafik, die veranschaulicht, dass in mit IGF-I, IGF-II und IGF-III behandelten Kulturen die erhaltenen relativen Fluoreszenzeinheiten höher waren als diejenige, die man bei unbehandelten Kontrollkulturen fand. Diese Daten zeigen an, dass IGF-I, IGF-II und IGF-III die Gesamtzahl an überlebenden postnatalen Ratten-Retina-Nervenzellen gegenüber unbehandelten Kulturen erhöhte.

Claims (4)

1. Verwendung von IGF-I, IGF-II oder IGF-III für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Retina-Degeneration.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Retina- Degeneration eine Photodegeneration, ein Trauma, eine Axotomie, eine neurotoxisch-exzitatorische Degeneration, eine vererbte Retina-Dystrophie, eine diabetische Retinopathie, mit Alzheimer-Krankheit in Beziehung stehend, eine infantile maligne Osteopetrosis, eine Cereoidlipofuscosis oder eine Cholestase ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Retina- Degeneration eine Degeneration von Photorezeptorzellen ist.

4. Implantat, geeignet für eine Implantation in das Auge, welches IGF-I, IGF-II oder IGF-III enthält.