ES2225840T3 - Utilizacion de factores de crecimiento de fibroblasto para estimular el crecimiento oseo. - Google Patents
Utilizacion de factores de crecimiento de fibroblasto para estimular el crecimiento oseo.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE COMPOSICIONES TERAPEUTICAS PARA LA PREVENCION Y EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS PATOLOGICOS QUE IMPLICAN AL TEJIDO OSEO Y DENTAL. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA ESTIMULAR LA REPARACION Y/O EL CRECIMIENTO OSEOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS PATOLOGICOS QUE IMPLICAN AL TEJIDO OSEO, POR EJEMPLO LA OSTEOPOROSIS, LA ENFERMEDAD DE PAGET, LA OSTEOPETROSIS Y LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES Y LA REPARACION DE FRACTURAS, Y LA CURACION DE DEFECTOS OSEOS MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE FGF - 1 A UN ANIMAL O UN HUMANO QUE NECESITEN DICHO TRATAMIENTO.
Description
Utilización de factores de crecimiento de
fibroblasto para estimular el crecimiento óseo.
La presente invención se refiere a la utilización
de factores de crecimiento de fibroblasto como agentes terapéuticos
para estimular el crecimiento óseo periostal.
El tejido óseo vivo está en continua
reconstitución mediante los procesos de resorción y de depósito de
matriz ósea y de sales minerales. Este procedimiento acoplado en el
tiempo y en el espacio, denominado remodelado óseo, es realizado en
gran parte por dos poblaciones celulares, los osteoclastos y los
osteoblastos. El procedimiento de remodelado es iniciado cuando son
movilizados osteoclastos de la médula ósea o de la circulación hacia
la superficie ósea y eliminan un paquete de tejido óseo de forma
discoide. La matriz ósea y las sales minerales son reemplazadas a
continuación por un grupo de osteoblastos movilizados de la médula
ósea hacia la superficie ósea resorbida. Entre los estados
patológicos asociados con una función anormal de las células óseas,
se encuentra la osteoporosis, enfermedad caracterizada por una
reducción de la reserva ósea (osteopenia) y una mayor fragilidad del
hueso. Estas alteraciones pueden resultar en una movilización y una
actividad acrecentadas de los osteoclastos, frecuentemente en
asociación con una reducción de la movilización o de la actividad de
los osteoblastos. Se supone que el desarrollo de poblaciones
excesivas o deficientes de osteoclastos o de osteoblastos resultaría
en una insuficiencia o en un exceso correspondiente de factores
proteicos específicos denominados citoquinas.
Las citoquinas han sido identificadas por sus
características biológicas y sus secuencias únicas de aminoácidos.
Cada citoquina presenta un espectro exclusivo de características que
la distingue de las otras citoquinas. De manera general, las
citoquinas estimulan el crecimiento y/o la diferenciación de tipos
específicos de células. Algunas citoquinas pueden dirigirse,
igualmente, contra las células cancerosas para su destrucción. Como
ejemplos de citoquinas, se puede citar el factor de estimulación de
colonias de granulocitos (G-CSF), el factor de
estimulación de las colonias de granulocitos y de macrófagos
(GM-CSF), el factor de estimulación de las colonias
de macrófagos (M-CSF), la interleuquina
1-beta, la interleuquina-3, la
interleuquina-6, el interferon gamma
(IFN-\gamma), el factor necrosante de los tumores,
las linfotoxinas, el factor inhibidor de la leucemia, los factores
de crecimiento de los fibroblastos (FGF), el factor
transformante-alfa (TGF-\alpha) y
el factor transformante-beta
(TGF-\beta).
Numerosas citoquinas conocidas estimulan o
inhiben las células sanguíneas. Varias citoquinas reguladoras del
crecimiento, como la M-CSF, la
TGF-\alpha, la interleuquina-1 y
el factor necrosante de los tumores son capaces de estimular la
proliferación de los leucocitos mononucleares en la médula. Aún
cuando citoquinas como la interleuquina-1
(IL-1), el factor necrosante de los tumores (TNF), y
la interleuquina-6 (IL-6) puedan
influenciar sobre la formación y la diferenciación de los
osteoclastos, (Mundy (1990) Trends Endo. Metab. 1:
307-311), estos factores no son factores específicos
de regulación del crecimiento de los osteoclastos.
Aun cuando existe una abundante documentación
sobre los factores que influyen sobre la degradación y la resorción
óseas, la documentación sobre los factores capaces de estimular
efectivamente la formación de nuevo tejido óseo está más limitada.
El propio hueso contiene factores que son capaces de estimular el
crecimiento y/o la diferenciación de las células óseas. De este
modo, los extractos de tejido óseo contienen no solamente proteínas
estructurales que aseguran el mantenimiento de la integridad
estructural del hueso, sino también factores de crecimiento óseo
biológicamente activos, que estimulan la proliferación de las
células óseas. Entre los factores de crecimiento presentes en el
hueso y conocidos porque facilitan la proliferación de las células
óseas, se encuentran el TGF-\beta, los factores de
crecimiento insulinoides (factor de crecimiento insulinoide I y
factor de crecimiento insulinoide II), el factor de crecimiento de
fibroblasto básico (bFGF) y las proteínas morfogenéticas óseas
(BMP). Estos factores provocan igualmente la proliferación de
células no óseas.
La familia de los factores de crecimiento de
fibroblastos (FGF) se compone al menos de 9 proteínas
estructuralmente emparentadas (FGF-1 hasta
FGF-9), siendo las más conocidas entre ellas el FGF
ácido (aFGF; FGF-1) y el FGF básico (bFGF;
FGF-2). Los miembros de esta familia estimulan la
mitogenesis en la mayor parte de las células derivadas del mesoderma
y del neuro-ectoderma e influyen sobre otros
procesos biológicos, entre los cuales se encuentra la angiogenesis,
la extensión de los nutrientes, la supervivencia de las neuronas y
la diferenciación de los mioblastos. De manera general, los FGF
tienen una alta afinidad para la heparina (antes de resolverse su
nomenclatura, algunos FGF eran designados por el término de factores
de crecimiento enlazantes de la heparina-1, -2,
etc.) y un cierto número -pero no todos- son mitógenos para los
fibroblastos. El miembro de la familia de los FGF que presenta
aproximadamente desde un 25% hasta un 55% de identidad de secuencia
de aminoácidos con una secuencia de base, y algunos FGF que tienen
extensiones significativas en posición C-terminal
y/o N-terminal, fuera de esta secuencia de base.
Esta homología estructural sugiere que los 9 genes diferentes, que
codifican los FGF conocidos, es posible que se deriven de un gen
ancestral común.
Además de los 9 miembros conocidos de la familia
de los FGF, resulta una complejidad suplementaria de la generación
de varias formas moleculares de FGF a partir de un solo gen. Por
ejemplo, el producto de traducción primario del aFGF
(FGF-1) se compone de 155 residuos. Sin embargo, la
forma más larga del FGF-1 extraída de una fuente
natural (por ejemplo del cerebro de bovino) se compone de 154
residuos. Esta forma de 154 residuos del FGF-1 está
desnudada de la metionina N-terminal de la forma con
155 residuos y presenta una extremidad NH2-terminal
acetilada. Una maduración proteolítica in vivo o durante la
purificación genera formas activas más pequeñas de
FGF-1 en las cuales los 15 (de 1-15)
o 21 (de 1-21) aminoácidos
N-terminales están suprimidos. Tal como se ha
definido aquí, FGF-1 se refiere a la forma de
FGF-1 con 154 residuos y menos, sus formas
biológicamente activas, tales como las formas descritas
anteriormente, en las que se han suprimido 15 (desde el
1-15) o 21 (del 1-21) aminoácidos
N-terminales. Históricamente, la forma de
FGF-1 con 154 residuos ha sido denominada factor de
crecimiento de las células endoteliales-\beta
(ECGF\beta), la forma de los 1-15 ha sido
denominada aFGF y la forma de los 1-21 ha sido
denominada ECGF\alpha. Antes de la normalización de la
terminología para este grupo de factores de crecimiento, se han
aplicado igualmente varios términos adicionales a la misma proteína,
con inclusión de la de factor de crecimiento ocular y la de factor
de crecimiento enlazante de la heparina-1. Formas
similares de bFGF (FGF-2) han sido descritas
igualmente. Además de las formas de escisión, se han descrito
también formas extendidas de bFGF, que resultan de la iniciación de
la traducción en varios codones GTG diferentes situados aguas arriba
del codón de iniciación de la traducción ATG, que genera la forma de
bFGF con 155 residuos. Todas estas formas alternativas de FGF
contienen la zona de base de homología estructural que define la
familia de los FGF.
Se ha sugerido un papel osteógeno para el bFGF,
basándose en estudios in vitro (Hauschka et al.,
J.Biol.Chem. 261: 12665-12674, 1986; Globus et
al., Endocrinology 123: 98-105, 1988; Canalis
et al., J. Clin. Invest. 81: 1572-1577, 1988;
McCarthy et al., Endocrinology 125:
2118-2126, 1989; Noff et al., FEBS Lett. 250;
619-621 Y 1989). Sin embargo, solamente ha habido
una publicación sobre la administración in vivo de bFGF
(Mayahara et al., Growth Factors 9: 73-80,
1993). La administración intravenosa de bFGF humano a ratas ha
demostrado únicamente la formación de tejido óseo endostal. No se ha
observado aumento del crecimiento óseo periostal. Un potencial
osteógeno sistémico similar ha sido observado tras la administración
intravenosa de aFGF humano.
La invención se refiere al uso de FGF para la
preparación de un medicamento para tratar a los pacientes que sufren
de patologías en las cuales la masa ósea es insuficiente o para
reparar los defectos de tejidos óseos o dentales. Las composiciones
farmacéuticas comprenden ciertos factores de crecimiento de
fibroblasto en cantidades que estimulan la proliferación y/o la
diferenciación de los osteoblastos y/o precursores para promover el
anabolismo óseo. Preferentemente, los FGF serán aplicados localmente
para estimular el crecimiento óseo periostal. Los factores de
crecimiento de fibroblasto preferidos en la practica de la invención
son el FGF-1 y el FGF-2, y de una
manera más preferente la secuencia completa de FGF-1
(ECGF\beta) y el FGF de los 1-21
(ECGF\alpha).
Los otros objetos, características y ventajas se
pondrán de manifiesto por la lectura de la descripción que sigue de
formas de realización preferidas de la invención, dados a título de
divulgación y que deben tomarse en unión con los dibujos
siguientes.
La figura 1 representa una microfotografía que
muestra el crecimiento del nuevo tejido óseo en las calotas
craneanas de ratón desnudo, adyacentes a células tumorales WISH.
La figura 2 representa una microfotografía que
muestra el crecimiento del nuevo tejido óseo periostal en las
calotas craneanas de ratón tras administración de FGF ácido (A) y de
FGF básico (B).
La figura 3 muestra los efectos de los FGF ácidos
y básicos sobre el crecimiento de las calotas craneanas.
Las figura 4 muestra la cronología del
crecimiento óseo en respuesta al aFGF.
La figura 5 muestra la cronología del aFGF sobre
la proliferación del periosto y de la diferenciación de los
osteoblastos en respuesta al aFGF.
La figura 6 muestra la curva
dosis-respuesta de los efectos del aFGF del bFGF
sobre el crecimiento óseo de las calotas craneanas.
La figura 7 muestra los efectos de la
administración diaria de aFGF sobre la pérdida ósea de la tibia en
el caso de ratas ovarioectomizadas.
La figura 8 muestra los efectos de la
administración diaria de aFGF sobre la densidad ósea vertebral en el
caso de las ratas ovarioectomizadas.
La figura 9 muestra el grado de flúor en el suero
tras la administración de metoxiflurano.
La figura 10 muestra los efectos de la
administración cíclica de aFGF sobre la densidad ósea en el caso de
la rata.
La figura 11 muestra los efectos del aFGF sobre
la masa ósea en el caso de ratas ovarioectomizadas.
Un aspecto preferido de la invención proporciona
la utilización de FGF que estimula el crecimiento óseo periostal,
útil para el tratamiento de estados patológicos en los cuales la
masa ósea es insuficiente o para la reparación de los defectos de
tejidos óseos o dentales. La invención es útil para estimular el
crecimiento óseo periostal después de la aplicación local para
promover un aumento claro de la cantidad de hueso cortical.
La invención engloba la utilización de factores
de crecimiento de fibroblasto natural en forma parcialmente
purificada así como en forma substancialmente homogénea, así como
factores de crecimiento de fibroblasto producido por síntesis o por
ingeniería genética, sus fragmentos biológicamente activos, y sus
sales y derivados farmacéuticamente aceptables.
"Substancialmente purificado" se utiliza en
este caso en el sentido de "substancialmente homogéneo", que se
aplican, por definición, a un material de naturaleza proteica
sensiblemente exento, en substancia, de compuestos normalmente
asociados con el mismo en su estado natural (por ejemplo otras
proteínas o péptidos, glúcidos, lípidos). De una manera más
preferente, esto significa un polipéptido, que puede estar
glicosilado o no glicosilado, caracterizado por un peso molecular
único y/o un conjunto múltiple de pesos moleculares, de respuestas
cromatográficas y de perfiles de elución, su composición en
aminoácidos, su secuencia y su actividad biológica. El hecho de que
esté "substancialmente purificado" no excluye que pueda existir
en forma de mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos.
El término no excluye tampoco la presencia de impurezas que no
alteren la actividad biológica y que puedan estar presentes por
ejemplo debido a una purificación incompleta o a una mezcla con una
preparación farmacéuticamente aceptable.
El término "animal" comprende los mamíferos,
tales como el perro, el gato, el caballo, la vaca, el puerco, la
rata, el ratón, el mono y los seres humanos.
El término "polipéptido biológicamente
activo" significa un polipéptido natural per se, así como
sus análogos biológicamente activos, entre los cuales se cuentan los
polipéptidos de síntesis y sus análogos, así como las sales
naturales y farmacéuticamente aceptables de estos compuestos y sus
derivados farmacéuticamente aceptables.
El término "polipéptido biológicamente
activo" engloba, igualmente, los fragmentos biológicamente
activos de estos compuestos, así como sus análogos de secuencia
biológicamente activos. En la naturaleza pueden existir diferentes
formas. Estas variaciones pueden estar caracterizadas por
diferencias de secuencia nucleotídica del gen estructural que
codifica proteínas de función biológica idéntica.
El término "análogo de secuencia biológicamente
activo" comprende los análogos naturales y no naturales que
presenten substituciones, eliminaciones, adiciones o
reemplazamientos -únicos o múltiples- de aminoácidos. Todas estas
variaciones, modificaciones y análogos alélicos, conducen a
derivados que conservan una o varias de las propiedades biológicas
nativas, entran en el ámbito de la invención.
El término "FGF-1" engloba
la forma con 154 residuos de los factores de crecimiento
FGF-1 ácidos (denominado igualmente ECGF\beta), la
forma de los 1-15 y la forma de los
1-21 (denominada igualmente ECGF\alpha). El
FGF-1 puede prepararse mediante procedimientos
conocidos en la técnica. Preferentemente, el FGF-1
utilizado en la invención se prepara por ingeniería genética, como
se ha divulgado en la patente US No 4 868 113.
Para purificar los polipéptidos útiles en la
práctica de la invención, bien de fuente naturales, o bien
producidos por ingeniería genética, pueden ser empleados
procedimientos cromatográficos, por ejemplo en una columna de
pequeño diámetro que contenga una resina con granulometría fina bajo
presión elevada, para estimular la eficacia de la separación, es
decir por cromatografía líquida de alta presión.
La concentración y la eliminación de las sales
son etapas corrientes en ciertas técnicas de cromatografía o de
separación empleadas en la invención.
La eliminación de las sales es necesaria,
generalmente, si se emplea la cromatografía de intercambio de iones
u otras técnicas que dependan de la fuerza iónica. Las sales pueden
ser eliminadas, por ejemplo, mediante diálisis o filtración sobre
gel, o por cromatografía sobre vidrio de porosidad controlada
(CVPC).
Igualmente se ha utilizado un cierto número de
técnicas de filtración sobre gel y de concentración. Algunos
productos del comercio son particularmente útiles. El Sephacryl, el
Sephadex y el bio-gel son ejemplos de resinas para
filtración sobre gel corrientemente utilizadas para aislar y
purificar las proteínas y caracterizar sus propiedades físicas.
La invención comprende la utilización de factores
de crecimiento de fibroblastos, preferentemente el
FGF-1, el bFGF y nuevas formas de FGF básico
aisladas de células WISH, para el tratamiento de las enfermedades
óseas asociadas con una reducción de la masa ósea o con un
crecimiento óseo deficiente o defectuoso. El FGF ácido y el FGF
básico estimulan el crecimiento de las células humanas que tengan el
fenotipo de osteoblastos y de sus precursores. En una forma de
realización, la invención proporciona un uso para el tratamiento de
patologías humanas y animales caracterizadas por un nivel
anormalmente bajo de proliferación de las células
osteoblásticas.
La administración de los factores de crecimiento
de fibroblasto para alcanzar los objetivos terapéuticos de la
invención puede hacerse por vía local, parenteral, intravenosa,
intramuscular, subcutánea, rectal o por cualquier otro medio
apropiado. La posología puede depender de la edad, del peso, del
tipo de tratamiento asociado, en caso dado, y de la naturaleza de la
patología ósea tratada.
Las composiciones de la invención pueden
emplearse por administración de los factores de crecimiento de
fibroblastos bajo formas tales como soluciones líquidas,
suspensiones, elixires o formas líquidas estériles. Los vectores
apropiados son diluyentes o agentes de carga, medios acuosos
estériles y diferentes disolventes orgánicos no tóxicos. Las
composiciones pueden formularse en forma de polvos, soluciones o
suspensiones acuosas, soluciones inyectables, elixires, jarabes u
otros compuestos de este tipo y pueden contener uno o varios agentes
estabilizantes tales como la seroalbúmina humana, sucrosas (con
inclusión, sin carácter limitativo, de los glicosaminoglicanos tales
como la heparina o fragmentos de heparina) o aminoácidos, agentes
antibacterianos y conservantes, con el fin de dar una preparación
farmacéuticamente aceptable. Se utiliza preferentemente cualquier
portador de carga inerte, por ejemplo una solución salina isotónica,
una solución salina en tampón fosfato, o cualquier otro portador de
carga en el que los factores utilizados en la invención tengan
propiedades de solubilidad adecuadas. Portadores de carga tales como
el polvo de hueso desvitalizado, la hidroxiapatita o una cola a base
de fibrina pueden utilizarse igualmente en la práctica de la
invención.
El portador de carga particular y la relación
entre compuesto activo/portador de carga se determinan mediante la
solubilidad y las propiedades químicas de los factores proteicos, el
modo de administración elegido y la práctica farmacéutica usual.
Para la administración parenteral, se pueden emplear soluciones o
suspensiones de estos factores en soluciones
hidro-alcohólicas o en aceite de sésamo o de
cacahuete o soluciones acuosas de sales solubles farmacéuticamente
aceptables.
La posología a retener para la puesta en práctica
de la invención es la que asegura una respuesta terapéutica máxima
hasta que se obtenga una mejoría y, como consecuencia, el nivel
mínimo de eficacia que aporta una mejoría. Las dosis pueden variar
en función de la edad, de la severidad del ataque, del peso corporal
y de otras condiciones del paciente, pero en general son del orden
de 0,1 mg/kg hasta 500 mg/kg aproximadamente, preferentemente desde
1 mg/kg hasta 250 mg/kg aproximadamente, y de una manera más
preferente desde 5 mg/kg hasta 100 mg/kg aproximadamente en forma
inyectable; las dosis pueden fraccionarse, evidentemente. Con otras
formas de administración, se administrarán dosis equivalentes o
ajustadas en función de la vía de administración.
Los ejemplos siguientes describen el aislamiento,
la purificación y la medida de la actividad biológica de los
factores de crecimiento de fibroblasto y su utilización como agentes
terapéuticos para la prevención y el tratamiento de las patologías
óseas y lesiones óseas.
Los efectos proliferantes de los factores de
crecimiento de fibroblasto sobre células de osteosarcoma humano
MG-63 y células óseas MC3T3 se han evaluado mediante
la medición de la incorporación de timidina tratada con el ADN
celular.
Células de osteosarcoma humano
MG-63, obtenidas de la American Type Culture
Collection (Rockville, MD), se cultivan en un medio mínimo de Eagle
(EMEM) suplementado con un 10% de suero de ternera fetal (SBF). Se
cultivan osteoblastos murinos MC-3T3EI,
proporcionados por el Dr. T. Suda (Universidad Showa, Tokyo), en un
medio de Eagle modificado alfa (MEM\alpha) suplementado con un 10%
de SBF. Todos los cultivos se mantienen a 37ºC, en atmósfera
humidificada al 5% de CO_{2} en aire.
Las células MG-63 y MC3T3 se
siembran a una densidad de 5x10^{3} células/ 100 \mul/pocillo en
placas de 96 pocillos en medio EMEM o MEM\alpha, respectivamente,
suplementado con un 10% de SBF. Tras la incubación durante 18 hasta
24 horas aproximadamente, las células se lavan con 200
\mul/pocillo de solución salina de tampón fosfato (PBS), antes de
añadir 50 \mul/pocillo de una solución al 0,1% de SAP en EMEM o en
MEM\alpha, sin suero, y 50 \mul/pocillo de una muestra que
contiene él o los factores de crecimiento diluidos en 0,1% de SAP en
DMEM/F12. Se añaden testigos basales (50 \mul/pocillo de 0,1% de
SAP en DMEM/F12 50/50) así como testigos positivos (50
\mul/pocillo de 20% de SBF en DMEM/F12 50/50) a cada placa,
paralelamente a la muestra de ensayo. Aproximadamente 44 horas
después de la adición de la muestra y de los testigos, las células
son marcadas con 1 \muCi/pocillo de
[metil-^{3}H]-timidina durante 4
horas. Al cabo de 4 horas, las células son recolectadas y enjuagadas
sobre discos de papel de filtro por medio de un recolector de
células PHD (Cambridge Technology, Watertown, MA). Se mide la
radioactividad retenida sobre los filtros (cpm) con un contador de
escintilación líquido (Beckman, Fullerton, CA).
La actividad proliferante de cada muestra
(tratada en doble ejemplar) se expresa en porcentaje de la
estimulación de la incorporación de ^{3}H-timidina
causada por el testigo positivo, según la fórmula:
\frac{\text{cpm de muestra - cpm
de testigo basal}}{\text{cpm de muestra positiva - cpm de testigo
basal}} x
100
Se han inyectado células amióticas tumorales
humanas (2x10^{7}) en la pata trasera derecha, en la zona de la
diáfisis femoral, de catorce ratones desnudos macho con una edad de
4 semanas. Los tumores sólidos son aislados de los animales al cabo
de 3 a 5 semanas. En este momento, es visible un nuevo crecimiento
óseo, en el plano radiológico e histológico. En el caso de 10
ratones, el tumor está adherido fuertemente a la superficie ósea y
todos presentan un nuevo crecimiento óseo. El nuevo crecimiento óseo
puede reconocerse fácilmente por la estructura "en forma de azúcar
mojada" (y no laminar) del tejido óseo e importante sobre las
superficies óseas periostales adyacentes a la masa tumoral. El tumor
sólido es resecado del hueso y congelado inmediatamente en nitrógeno
líquido, para una purificación ulterior de las proteínas. Mediante
la histomorfometría cuantitativa, las células (1x10^{7} células en
0,2 ml de PBS) son inyectadas por vía subcutánea sobre las calotas
craneanas de los ratones desnudos (n=8). Los animales son
sacrificados al cabo de 2 semanas. En el caso de seis animales, el
tumor está fuertemente adherido a la superficie ósea. Los
procedimientos histológicos de preparación de las muestras óseas se
han descrito en el ejemplo 3 siguiente. Se ha observado un nuevo
crecimiento óseo importante sobre las calotas craneanas de estos
animales (figura 1) y la superficie de la sección transversal de las
calotas craneanas se ve aumentada en 96 \pm 37 (ET)%.
Se han pulverizado veinticinco gramos de tumor
sólido aislado de los fémures de ratones portadores de tumor, en
nitrógeno líquido y el triturado se ha extraído por agitación a 4ºC
durante 72 horas en 125 ml de tampón de extracción que contiene 10
mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 7,0, 1,5 M de NaCl,
25 mM de benzamidina, 1 \mug/ml (cada uno) de leupeptina y de
aprotinina y 1 mM de PMSF (disueltos en 100% de isopropanol),
ajustado a un pH final de 7,0. Al cabo de 72 horas, el extracto ha
sido centrifugado a 6.000 revoluciones por minuto durante 20 minutos
a 4ºC. El sobrenadante ha sido tomado y congelado a -70ºC.
Se ha efectuado una segunda extracción del
precipitado insoluble de la extracción inicial en el mismo tampón
añadiéndose 250 ml de tampón de extracción fresco al culote y
agitándose la mezcla a 4ºC durante 24 horas más. Al cabo de este
período, el extracto ha sido centrifugado a 6.000 revoluciones por
minuto durante 20 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes de la primera y
de la segunda extracción se reúnen y se centrifugan a elevada
velocidad a 15.000 g durante 1 hora a 4ºC. El sobrenadante se
elimina y se dializa contra un tampón Tris-HCl 10
mM, NaCl 0,1 M, pH 7,0. La concentración de proteínas se ha
determinado mediante la absorbancia a 280 y 260 nm.
Se rellena una columna de 4,8 x 30 cm con
Sepharose CL-6B heparina y se ha equilibrado con
tampón de NaCl, 0,1 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7. El
extracto final (aproximadamente 200 ml) se ha depositado sobre la
columna. La columna se ha lavado con el mismo tampón y se ha eluído
con un gradiente lineal desde 0,4 M hasta 3,0 M de NaCl. Se han
recogido fracciones de 12 ml. Se han sometido alícuotas de cada
fracción a los ensayos de proliferación de células
MG-63 y MC3T3 descritos en el ejemplo 1. Las
fracciones que contienen la actividad que estimula la proliferación
de MG-63 eluyen a 1,5 M de NaCl y son
cromatografiadas de nuevo sobre Sepharose-heparina
en las mismas condiciones. Las fracciones que contienen la actividad
que estimula la proliferación de MG-63 eluyen a 1,8
M de NaCl. Estas fracciones (34-44) se reúnen, se
combinan con 0,05% de CHAPS
((3-[(3-cloroamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato;
detergente anfótero ligero) y se han dializado contra fosfato de
sodio 50 mM, pH 6,0, 0,05% de CHAPS. El dializado se ha
cromatografiado sobre una columna de MonoS FPLC con un gradiente que
va desde 0 hasta 1,0 M de NaCl en 50 mM de fosfato de sodio a pH
6,0, 0,05% de CHAPS. Se han recogido fracciones de 0,8 ml. Las
fracciones positivas para la actividad MG-63
(26-32) se han reunido y se han inyectado en una
columna de HPLC C4 o C18 y se han cromatografiado con un gradiente
desde 7% hasta 63% de acetonitrilo en 0,1% de TFA. Para las medidas
de la actividad biológica, se ha hecho pasar un 10% del producto a
través de una columna de HPLC en fase inversa C18 y las fracciones
se han recogido en una solución neutralizante (bicarbonato de amonio
24 mM a pH 8, SAB 0,1%, heparina 2 \mug/ml y CHAPS 0,01%). La
proteína que eluye al 37% de acetonitrilo se somete a un análisis
mediante SDS-PAGE (gel al 15%) y se ha transferido
sobre una membrana de nitrocelulosa (0,45 \mum, Schleicher &
Schuell, Keene, NH). La secuencia de aminoácidos se obtiene por el
método de Edman automatizado, por medio de un secuenciador de
proteínas Applied Biosystems modelo 477A equipado con un analizador
PTH modelo 120A.
La secuencia de aminoácidos del polipéptido
aislado y purificado de las células WISH es similar, pero no
idéntica, a la del bFGF. La nueva secuencia parece que define una
forma extendida de FGF básico hasta ahora desconocida, que tiene la
secuencia suplementaria de aminoácidos GSRPGAGT (SEQ. ID Nº: 1) que
prolonga la extremidad N-terminal MAAGSIT (SEQ. ID
Nº: 2) de la forma de 18 kD conocida del bFGF.
Los efectos de los factores polipeptídicos sobre
el crecimiento óseo han sido ensayados en el caso de ratones blancos
Swiss ICR machos, con una edad de 4 a 6 semanas y que pesan de 13 a
26 g, por grupos de 4-5 animales. El polipéptido o
un excipiente testigo ha sido inyectado en el tejido subcutáneo que
recubre la cara derecha de la calota craneana de ratones normales.
Entre los polipéptidos ensayados figuran el extracto bruto de
tumores WISH que contiene el bFGF de secuencia extendida, aislado
como se ha descrito en el ejemplo 2, el FGF básico y el
FGF-1, que comprende el FGF ácido. Estas proteínas
de ensayo han sido inyectadas solas o con heparina.
Salvo indicación en contra, el excipiente testigo
es PBS suplementado con un 1% de SAB. La heparina ha sido
administrada a la dosis de 50 unidades/ml. Los animales se han
sacrificado el decimocuarto día (J14) y se ha medido en crecimiento
óseo por histomorfometría.
Las muestras óseas para cuantificación son
desembarazadas de los tejidos adyacentes y fijadas en una solución
al 10% de formol tamponado durante 24 hasta 48 horas, se han
descalcificado en una solución al 14% de EDTA durante 1 a 3 semanas,
se han tratado con alcoholes de diferentes grados e incluso con
parafina. Se han preparado cortes de 3 \mum de las calotas
craneanas y de los fémures. Los cortes representativos han sido
seleccionados para evaluación histomorfométrica de los efectos de
los tumores, extractos tumorales o factores de crecimiento de
fibroblastos, entre los que se encuentran el FGF ácido o básico,
sobre la formación ósea y la resorción ósea. Los cortes se han
medido con ayuda de una cámara clara para trazar directamente la
imagen microscópica sobre una tabla de numeración. Los cambios óseos
han sido medidos sobre cortes a intervalos de 200 \mum, sobre
cuatro campos adyacentes de 1x1 mm sobre los lados inyectados y no
inyectados de las calotas craneanas. El hueso neoformado está
señalado por su estructura "en forma de azúcar mojada", y no
laminar, y los osteoclastos y los osteoblastos están definidos por
su morfologías distintiva. Un programa lógico de histomorfometría
(Osteomeasure, Osteometrix Inc., Atlanta) ha sido utilizado para
tratar las entradas del numerizador con el fin de determinar el
número de células y los perímetros o zonas características.
Con el fin de identificar si la mineralización
del tejido óseo formado de nuevo se ha llevado a cabo normalmente,
se han tomado también muestras óseas de calota craneana tras
administración de dos dosis de tetraciclina (25 mg/kg i.p.) a los
animales. La tetraciclina se deposita en los puntos de crecimiento
óseo activo y actúa como un marcador hístico cronológico para
calcular las velocidades de crecimiento óseo y evaluar la
mineralización. Estas muestras óseas han sido fijadas como se ha
descrito precedentemente, se han tratado con alcoholes de diferentes
grados y se han incrustado, no descalcificados, en una materia
plástica a base de metacrilato para preservar los marcadores de
tetraciclina. Se han efectuado cortes a intervalos regulares de 5
\mum y se han evaluado para determinar el grado de mineralización
y la captura de la tetraciclina. Los resultados de estas
experiencias están descritos en el ejemplo 4.
Los efectos de los factores polipeptídicos sobre
el crecimiento óseo se han ensayado en el caso de ratones blancos
Swiss ICR machos, con una edad de 4 a 6 semanas y que pesan de 13 a
26 gramos, por grupos de 4 - 5 animales. El polipéptido o un
excipiente testigo se han inyectado en el tejido subcutáneo que
recubre la calota craneana de ratones normales. Entre los
polipéptidos ensayados figuran el bFGF con secuencia extendida,
aislado de células WISH como se ha descrito en el ejemplo 2, el
FGF-1 de secuencia completa (155 residuos) y el FGF
básico. Estas proteínas de ensayo han sido inyectadas solas o con
heparina.
En una experiencia, el excipiente testigo es PBS
suplementado con un 1% de SAB. La heparina ha sido administrada a la
dosis de 50 unidades/ml. La tabla I resume los resultados de cuatro
inyecciones (cuando estén incluidas) por día, durante 3 días, de
excipiente solo, de excipiente suplementado con heparina, de 5
\mug de IGF-1 o de IGF-2, de 1
\mug de aFGF^{1} con heparina, y extracto bruto de las
extracciones primera ("WISH bruto") y segunda ("WISH
parcialmente purificado") de células WISH. Los animales han sido
sacrificados el día decimocuarto y se ha medido el crecimiento óseo
por histomorfometría.
^{1}Todas las experiencias que recurren al aFGF
o al FGF-1 utilizan la forma con 154 aminoácidos de
la proteína, igualmente denominada ECGF\beta. Los términos aFGF y
FGF-1 se han utilizado de manera intercambiable en
toda esta solicitud y en las figuras que la acompañan.
Como muestra la tabla I, el
FGF-1 inyectado con la heparina en las calotas
craneanas de ratones ha podido inducir un nuevo crecimiento óseo
periostatal. En este experimento, ningún otro tratamiento ha
producido un nuevo crecimiento óseo significativo con relación al
testigo. La actividad proliferante de los extractos WISH inyectados,
administrados en ausencia de heparina, es equivalente,
probablemente, a solo 10-100 ng de FGF. No se ha
observado ningún signo de aumento de la resorción ósea en los grupos
tratados.
Con el fin de examinar de manera profunda el
efecto de los FGF sobre el crecimiento óseo y el efecto de la
heparina sobre la estimulación del crecimiento óseo, se ha
administrado 1 \mug de FGF-1 o de bFGF en
presencia o en ausencia de heparina, en un volumen de 10 \mul, a
ratones blancos Swiss ICR machos, con una edad de 4 a 6 semanas (5
para cada grupo de tratamiento) por inyección en la calota craneana
4 veces por día durante 3 días. El excipiente testigo es SAB al 0,1%
en PBS. La heparina ha sido administrada a la dosis de 50
unidades/ml. Se ha administrado demeclociclina (25 mg/kg) por vía IP
los días cuarto, octavo y decimosegundo para calcular las
velocidades de crecimiento óseo y evaluar la mineralización.
Los animales han sido sacrificados el día
decimocuarto y se ha descalcificado la mitad posterior de la calota
craneana y se ha incrustado en parafina. La mitad anterior de la
calota craneana, las metafisis de las tibias y de los fémures y las
vértebras lumbares son incrustadas, no descalcificadas, en plástico.
Los ratones que reciben el aFGF y el bFGF muestran un nuevo
crecimiento óseo importante en la superficie de la calota craneana
(figura 2). No se ha detectado ningún efecto en las metafisis
femorales ni en las vértebras. El nuevo tejido óseo se forma en las
capas superficiales formadas más recientemente. Este está bien
mineralizado y muestra una captura difusa de marcadores de
democlociclina, típica del hueso "en forma de azúcar
mojada".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La tabla II y la figura 3 muestran que el aFGF y
el bFGF estimulan, ambos, el crecimiento del nuevo tejido óseo,
aumentan la superficie de los osteoblastos, la superficie ósea
pereoesteral y la superficie ósea total, tanto en presencia como en
ausencia de heparina. Sin embargo, el aumento del nuevo tejido óseo
bajo la calota craneana (% de nuevo tejido óseo endostal) inducido
por el bFGF queda inhibido por la heparina (figura 3).
Se ha estudiado la evolución cronológica de los
cambios óseos tras estimulación mediante inyección de 1 \mug de
FGR ácido con heparina. El esquema experimental es el mismo que el
que ha sido descrito anteriormente, con excepción de que 8 animales
reciben la inyección cada vez. Cuatro reciben el excipiente solo y
cuatro el FGF-1 y la heparina. Los animales son
sacrificados los días tercero, séptimo, decimocuarto, vigésimo
primero y trigésimo sexto y se han medido los cambios a dos niveles,
distanciados al menos en 200 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Como muestra la tabla III, el
FGF-1 entraña una estimulación sostenida del
crecimiento óseo durante 21 días tras un período de tratamiento
inicial de 3 días (figura 4). La respuesta inicial es una
proliferación celular, sin que se produzcan la diferenciación de los
osteoblastos ni la formación de matriz más que al cabo de los 3 días
de tratamiento (figura 5). No se ha observado ningún signo de
estimulación de la formación de osteoclastos, independientemente del
período considerado.
La relación dosis-respuesta de
los cambios óseos al cabo de cuatro días de estimulación diaria
mediante inyección de 0,5, de 5, de 50 y de 500 ng/inyección de
FGF-1 o de FGF básico, con o sin heparina (50 U/ml),
ha sido igualmente determinada. Cada grupo de tratamiento comprende
4 ratones blancos Swiss ICR machos, con una edad de 4 a 6 semanas.
Como testigos sirven catorce animales, 7 reciben el excipiente solo
(PBS + 0,1% de SAB) y 7 reciben el excipiente con la heparina.
Los animales son sacrificados el decimocuarto día
y las calotas craneanas se han preparado como se ha descrito
anteriormente. La figura 6 muestra que el FGF ácido y el FGF básico
son, ambos, activos in vivo, a cantidades del orden del nanogramo.
Aún cuando las respuestas óseas permanezcan inalteradas para la
heparina administrada sola, la heparina refuerza los efectos del
aFGF y del bFGF, en particular en el lado no inyectado de la calota
craneana.
La figura 2 muestra que el FGF-1
y el bFGF producen, ambos, un crecimiento importante del nuevo
tejido óseo "en forma de azúcar mojada" en la superficie
periostal superior que se mineraliza rápidamente. El bFGF produce un
aumento máximo de más del 100% del espesor de la calota craneana del
lado inyectado e induce, igualmente, un nuevo crecimiento óseo bajo
la calota craneana. La heparina aumenta el efecto del aFGF. Ni el
aFGF ni el bFGF aumentan la resorción ósea ni el número de
osteoclastos. En un estudio cinético y de
dosis-respuesta, el aFGF y la heparina han producido
una respuesta fibroblástica inicial vigorosa, pero transitoria. Una
proliferación de los fibroblastos es visible desde los días tercero
hasta vigésimo primero. El día trigésimo sexto, la superficie
periostal superior recubierta con osteoblastos había retornado a la
normal y el tejido óseo más recientemente formado era claramente
laminar. Los efectos dependían de la dosis, con una respuesta máxima
a 50 ng/inyección.
La rata ovarioectomizada es un modelo animal
reconocido para estudiar la osteoporosis humana relacionada con la
menopausia. Con el fin de evaluar los efectos de la administración
sistémica de aFGF sobre los tejidos óseos en un modelo animal de
pérdida ósea aguda relacionada con una deficiencia estrogénica
comparable a la que se observa en el caso de la mujer menopáusica,
se seudo-operan ratas Sprague-Dawley
(250 g) o son ovarioectomizadas quirúrgicamente. Al cabo de siete
días desde la intervención, las ratas reciben el excipiente (PBS),
el aFGF (0,2 mg/kg i.v. por la vena caudal) o estrógenos (160
\mug/kg s.c.) durante 28 días. Todas las inyecciones son
efectuadas bajo anestesia con metoxiflurano. Antes de la
finalización, todos los animales reciben dosis única de tetraciclina
y de demeclociclina para evaluar la formación y la mineralización
óseas. Se toman las tibias y las vértebras lumbares, se fijan y se
tratan (descalcificadas y no descalcificadas) para la evaluación
histomorfométrica.
La superficie del hueso esponjoso (expresada en %
de la superficie hística) se cuantifica sobre cortes descalcificados
de metafisis de las tibias y de las vértebras lumbares. Con relación
a las ratas ovarioectomizadas que han recibido el excipiente, la
superficie ósea en la zona de la espongiosis secundaria de la tibia
está significativamente aumentada en el caso de las ratas
seudo-operadas que habían recibido el excipiente o
el aFGF y en el caso de las ratas ovarioectomizadas que habían
recibido el FGF-1 o los estrógenos (figura 7).
Cambios similares, pero no significativos, se han observado en la
vértebras lumbares (figura 8). Estos datos muestran que el
FGF-1 bloquea, en la espongiosis secundaria, la
pérdida de hueso esponjoso asociada con la deficiencia de
estrógenos. Además, el crecimiento óseo periostático está aumentado
en el caso de los animales seudo-operados que habían
recibido el FGF-1.
La evaluación cuantitativa de los cortes de tibia
y de vértebras revela que la inyección diaria de aFGF induce el
crecimiento de hueso "en forma de azúcar mojado", en las
vértebras, la diáfisis de la tibia y la epífisis de la tibia. La
evaluación de los cortes no descalcificados revela que el aFGF
produce tejido óseo nuevo que está poco mineralizado. Este defecto
de mineralización resulta probablemente de la acumulación de flúor
debido a la exposición diaria a un gas anestésico que contiene
flúor. Esto ha sido confirmado por el aumento de los grados séricos
de flúor observado en el caso de estos animales (figura 9).
Con el fin de determinar la respuesta del
esqueleto a la administración sistémica cíclica de
FGF-1, se han seudo-operado o se
han ovarioectomizado quirúrgicamente ratas
Sprague-Dawley de 250 g y reciben el excipiente o el
FGF-1, comenzándose 2 meses después de la
intervención. El tratamiento se inicia 2 meses después de la
intervención puesto que al final de este período, aproximadamente se
ha perdido el 50% del hueso esponjoso en las metafisis de la tibia
como respuesta a la deficiencia de estrógenos. Las ratas reciben
inyecciones diarias de excipiente o de FGF-1 (0,5
mg/kg/día i.v.) durante 3 días, seguidos de 6 días sin tratamiento.
Este régimen se repite tres veces. Los animales son sacrificados el
vigésimo octavo día. Antes de la eutanasia, les son administradas
dosis únicas de tetraciclina y de demeclociclina. Las tibias, los
fémures y las vértebras lumbares son tomados para análisis
histomorfométrico y análisis por absortiometría de los rayos X con
doble energía (DEXA).
La densidad mineral ósea (DMO), criterio para la
evaluación de la masa ósea, se mide con un aparato DEXA Lunar. Se
aumenta la DMO en las metafisis de las tibias, las vértebras
lumbares y los fémures de las ratas tratadas con aFGF, en
comparación con el grupo tratado con el excipiente (figura 10).
Estos datos están corroborados por los aumentos de superficie del
hueso esponjoso, determinados por histomorfometría en las metafisis
de las tibias y de los fémures en el caso de las ratas que habían
recibido el FGF-1 (figura 11). La evaluación
cualitativa revela que la administración sistémica cíclica de
FGF-1 induce un cierto crecimiento de hueso "en
forma de azúcar mojado" en las metafisis de los huesos largos,
pero no en las vértebras ni en las epífisis de las tibias. La
evaluación del marcado mediante la tetraciclina revela que el nuevo
tejido óseo formado como respuesta al aFGF está normalmente
mineralizado. Los grados séricos de flúor no están aumentados en el
caso de estos animales. Estos datos muestran que el aFGF puede
mantener y aumentar la masa ósea en un modelo de osteopenia estable
y evolutivo.
La osteoporosis post-menopáusica
estable es una enfermedad caracterizada por una reducción de la masa
ósea esponjosa y del hueso cortical, una baja renovación ósea y una
reducción de la conectividad del hueso esponjoso de las vértebras.
Para evaluar los efectos potenciales del FGF-1 sobre
estas alteraciones, se ha administrado FGF-1 por vía
general durante 28 días a ratas ovarioectomizadas de edad avanzada,
modelo animal de osteofenia cortical y esponjosa estable, de baja
renovación ósea y de conectividad reducida del hueso esponjoso de
las vértebras. Ocho ratas Sprague-Dawley con una
edad de 10 meses, exrreproductoras, han sido
seudo-operadas u ovarioectomizadas quirúrgicamente.
Seis meses después de la intervención, se ha administrado el
excipiente o el FGF-1 (0,2 mg/kg/día i.v.) a las
ratas ovarioectomizadas. Los animales seudo-operados
reciben solo el excipiente. Todas las inyecciones son efectuadas
bajo anestesia con isofluorano. La mitad de los animales, en cada
grupo de tratamiento, es sacrificado al cabo de 28 días de
tratamiento. La otra mitad se guarda durante otros 28 días, sin
tratamiento, con el fin de determinar las consecuencias a largo
plazo de la administración del FGF-1. Antes de la
eutanasia, todos los animales reciben 2 inyecciones de verde de
calceína como marcador hístico cronológico para calcular las
velocidades de crecimiento óseo. Los fémures, las tibias y las
vértebras lumbares se toman para DEXA y para el análisis
histomorfométrico, como se ha descrito ya anteriormente en el
ejemplo 5. Para efectuar los análisis biomecánicos, las vértebras
lumbares aisladas son comprimidas en una máquina para el ensayo de
materiales, con una fuerza de compresión constante, hasta la rotura.
Se produce la rotura en el momento en que la curva de deformación en
función de la carga cae tras haber alcanzado la fuerza de compresión
máxima.
El análisis por DEXA muestra que la
administración de FGF-1 entraña un aumento pequeño,
pero no significativo, de la densidad mineral ósea en el fémur, la
tibia y las vértebras el vigésimo octavo día. En los huesos largos,
este aumento es evidente al nivel de las diáfisis y de las
metafisis, lo que indica un aumento de la masa de hueso esponjoso y
de hueso cortical. La conectividad del hueso esponjoso de las
vértebras tiene todas las posibilidades de aumentar, en el caso de
las ratas tratadas con el FGF-1, el vigésimo octavo
y el quincuagésimo sexto días. Estos cambios se traducen en un
aumento de la fuerza de compresión vertebral en las vértebras de las
ratas tratadas con el FGF-1. Estos datos indican que
la administración sistémica de FGF-1 aumenta la masa
ósea cortical y esponjosa y aumenta la conectividad y la solidez del
hueso esponjoso de las vértebras en un modelo animal de osteoporosis
establecido relacionado con la menopausia.
El experto en la técnica verá fácilmente que la
invención está adaptada perfectamente para realizar los objetos y
obtener los resultados y ventajas mencionados, así como los que le
son inherentes. Los péptidos, anticuerpos, procedimientos, métodos y
técnicas descritos aquí se han indicado como representativos de las
formas de realización preferidas.
(1) Información general:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
- Nombre: Osteosa, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- Calle: 2040 Babcock Road, Suite 201
\vskip0.500000\baselineskip
- Ciudad: San Antonio
\vskip0.500000\baselineskip
- Estado: Tejas
\vskip0.500000\baselineskip
- País: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- Código Postal: 78229
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
- Nombre: Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- Calle: 500 Arcola Road
\vskip0.500000\baselineskip
- Ciudad: Collegeville
\vskip0.500000\baselineskip
- Estado: Pensilvania
\vskip0.500000\baselineskip
- País: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- Código Postal: 19426
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
- Nombre: Dunstan, Colin R.
\vskip0.500000\baselineskip
- Calle: 6359 Tally Gate
\vskip0.500000\baselineskip
- Ciudad: San Antonio
\vskip0.500000\baselineskip
- Estado: Tejas
\vskip0.500000\baselineskip
- País: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- Código Postal: 78240
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
- Nombre: Izbicka, Elzbieta
\vskip0.500000\baselineskip
- Calle: 7738 Apple Green
\vskip0.500000\baselineskip
- Ciudad: San Antonio
\vskip0.500000\baselineskip
- Estado: Tejas
\vskip0.500000\baselineskip
- País: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- Código Postal: 78240
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
- Nombre: Mundy, Gregory R.
\vskip0.500000\baselineskip
- Calle: 3719 Morgan's Creek
\vskip0.500000\baselineskip
- Ciudad: San Antonio
\vskip0.500000\baselineskip
- Estado: Tejas
\vskip0.500000\baselineskip
- País: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- Código Postal: 78230
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
- Nombre: Burgess, Wilson
\vskip0.500000\baselineskip
- Calle: 13 Cedar Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- Ciudad: Gaithersburg
\vskip0.500000\baselineskip
- Estado: Mariland
\vskip0.500000\baselineskip
- País: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- Código Postal: 20877
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
- Nombre: Jaye, Michael C.
\vskip0.500000\baselineskip
- Calle: 142 North Lynwood Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- Ciudad: Glenside
\vskip0.500000\baselineskip
- Estado: Pensilvania
\vskip0.500000\baselineskip
- País: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- Código Postal: 19038
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Título de la invención: Utilización de factores de crecimiento de fibroblastos para estimular el crecimiento óseo
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Número de secuencias: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Dirección para correspondencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Destinatario: Rhone-Poulenc Rorer Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Calle: 500 Arcola Road, 3c43
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Ciudad: Collegeville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Estado: Pensilvania
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- País: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- Código postal: 19426
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- Formulario legible por ordenador:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Tipo de soporte: floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Ordenador: Mmacintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Sistema de explotación: Sistema 7.1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Programa: Word 5.0 (PatentIn)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- Datos de la presente solicitud:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Número de solicitud: PCT
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Fecha de depósito:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Clasificación:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- Datos relativos a la prioridad de la presente solicitud:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Número de solicitud: U.S. 08/207,985
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Fecha de presentación: 08 marzo 1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- Informaciones relativas al mandatario/agente:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Nombre: Goodman, Rosanne
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Número de registro: 32,534
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Referencia/expediente: A1325-WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Informaciones para telecomunicación:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Teléfono: (610) 454-3817
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Telefax: (610) 454-3808
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Informaciones relativas a la SEQ ID NO 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Hipotético: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- Tipo de fragmento: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEQ ID NO1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Arg Pro Gly Ala Gly Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Informaciones relativas a la SEQ ID NO2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Hipotético: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- Tipo de fragmento: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEQ ID NO2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr}
Claims (6)
1. Utilización de un factor de crecimiento de los
fibroblastos humanos para la fabricación de un medicamento destinado
a mejorar la osificación periostática.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque el factor de crecimiento de los
fibroblastos humanos es el FGF-1.
3. Utilización según la reivindicación 2,
caracterizada porque dicho FGF-1 se elige
entre el ECGF\alpha, el aFGF y el ECGF\beta.
4. Utilización según la reivindicación 3,
caracterizada porque dicho FGF-1 es el
ECGF\alpha.
5. Utilización según la reivindicación 3,
caracterizada porque el FGF-1 es el
FGF-1 de longitud total.
6. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el medicamento
comprende heparina o fragmentos de heparina.
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