PT2054050E - Tratamento de patologias da cartilagem - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DE PATOLOGIAS DA CARTILAGEM"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção é no campo de medicina e diz respeito ao tratamento de patologias da cartilagem e de osteoartrite em particular. Mais especificamente, relaciona-se com a utilização de FGF-18 em regimes de tratamento e para o fabrico de um medicamento para o tratamento de pacientes possuindo uma patologia da cartilagem tal como a osteoartrite, tal como por exemplo a osteoartrite do joelho ou a osteoartrite da anca secundária. É especificamente providenciado um esquema de tratamento preferido que compreende a administração uma vez por semana de um composto FGF-18 por ciclo de tratamento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 FGF18 foi identificado como um membro da FGF família que estava relacionado mais proximamente com FGF8 e FGF17. As atividades associadas a FGF18 incluem a estimulação de células de linhagem mesenquimal, em particular de miócitos cardíacos, osteoblastos e condrócitos (Patente U.S. N°. 6, 352, 971) . 0 FGF18 liga-se e ativa FGFR4 e a variante de junção de IIIc de FGFR3 e FGFR2. A remodelação do osso é o processo dinâmico através do qual são mantidas a massa de tecido e a arquitetura esquelética. 0 processo é um balanço entre a reabsorção óssea e a formação óssea, pensando-se que existem dois tipos de células como os principais intervenientes. Estas células são os osteoblastos e os osteoclastos. Os osteoblastos sintetizam e depositam matriz para se tornar novo osso. As atividades de osteoblastos e osteoclastos são reguladas por 2 muitos fatores, sistémicos e locais, incluindo fatores de crescimento. A cartilagem é um tipo de tecido conectivo denso. É composta por células chamadas condrócitos, que são dispersas numa substância firme, moida de tipo gel, chamada a matriz. A cartilagem é avascular (não contém vasos sanguíneos) e os nutrientes estão difundidos ao longo da matriz. A cartilagem é encontrada nas articulações, na caixa torácica, na orelha, no nariz, na garganta e entre os discos intervertebrais. Existem três tipos principais de cartilagem: hialina, elástica e fibrocartilagem. 0 principal propósito da cartilagem é providenciar uma estrutura sobre a qual possa começar a deposição do osso. Outro propósito importante da cartilagem é providenciar superfícies macias e proteção mecânica para o movimento de ossos articulados. A substituição de cartilagem danificada, em particular cartilagem articular, provocada quer por lesão ou doença é um desafio principal para os clínicos, e os tratamentos disponíveis são considerados imprevisíveis e efetivos apenas durante um período limitado. Virtualmente todos os tratamentos atualmente disponíveis para a lesão de cartilagem focam no alívio da dor, com pouca ou sem eficácia na regeneração dos tecidos danificados. Consequentemente, a maioria dos pacientes mais jovens ou não procuram o tratamento ou são aconselhados a adiar o tratamento durante o maior tempo possível. Quando o tratamento é requerido, o procedimento comum é a substituição total da articulação ou microfractura, um procedimento que envolve a penetração do osso subcondral para estimular a deposição de fibrocartilagem pelos condrócitos. 3

Para os pacientes com osteoartrite, o tratamento não cirúrgico consiste em terapia fisica, modificação do estilo de vida (e.g. redução da atividade), tonificantes, dispositivos de apoio, fármacos orais e injetáveis (e.g. fármacos anti-inflamatórios não esteroides), e gestão médica. As opções cirúrgicas são muito especificas para a gravidade da osteoartrite e podem providenciar uma redução nos sintomas que é geralmente de curta duração. As osteotomias tibiais ou femorais (cortar o osso para reequilibrar o desgaste articular) poderão reduzir os sintomas, ajudar a manter um estilo de vida ativo, e retardar a necessidade de uma substituição total da articulação. A substituição total da articulação pode providenciar alivio para o sintoma de osteoartrite avançada, mas geralmente requer uma alteração do estilo de vida de um paciente e/ou nivel de atividade.

Consequentemente, seria desejável possuir um método para tratar, prevenir ou melhorar os sintomas de patologias da cartilagem que permitisse a regeneração do tecido danificado. Em adição, seria desejável que tal método fosse tão seguro e efetivo quanto possível. Além disso, as patologias da cartilagem poderão ser doenças crónicas, pelo que seria desejável que tal método permitisse retratamentos do paciente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção providencia uma utilização médica para tratar um paciente possuindo uma patologia da cartilagem que compreende a administração de um composto FGF-18 em que o composto FGF-18 é administrado pelo menos duas vezes, sendo as referidas administrações separadas por 6, 7, 8, 9 ou 10 dias. Em concretizações preferidas da invenção, a patologia da cartilagem a ser tratada é a osteoartrite, o 4 composto FGF-18 é o fragmento de FGF-18 designado aqui como FGF-18 (17 0AA) e o ciclo de posologia é 10 até 30 mcg por injeção intra-articular uma vez por semana durante 3 semanas consecutivas (um ciclo de tratamento). Numa concretização preferida tais ciclos de tratamento poderão ser repetidos após 4 ou 6 meses. Por exemplo, quando um ciclo de tratamento é repetido após 6 meses, se um primeiro ciclo tratamento for iniciado e.g. em Janeiro de um determinado ano, então um segundo ciclo de tratamento poderá ser iniciado em Julho do referido ano. É aqui adicionalmente providenciada a utilização de um composto FGF-18 no fabrico de um medicamento para o tratamento de um paciente possuindo uma patologia da cartilagem em que o composto FGF-18 é administrado pelo menos duas vezes, sendo as referidas administrações separadas por 6, 7, 8, 9 ou 10 dias. É também aqui providenciada a utilização de um composto FGF-18 para o tratamento de um paciente possuindo uma patologia da cartilagem em que o composto FGF-18 é administrado pelo menos duas vezes, sendo as referidas administrações separadas por 6, 7, 8, 9 ou 10 dias. É também aqui providenciada a utilização de um composto FGF-18 no fabrico de um medicamento para o tratamento de um paciente possuindo uma patologia da cartilagem, sendo o medicamento adaptado para ser administrado pelo menos duas vezes, sendo as referidas administrações separadas por 6, 7, 8, 9 ou 10 dias.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção providencia modalidades de tratamento adequadas, incluindo esquemas de administração adequados para o tratamento de várias patologias da cartilagem, tal como em particular a osteoartrite, com compostos FGF-18, 5 tal como por exemplo o fragmento proteico FGF-18(170AA). No contexto da presente invenção foi surpreendentemente descoberto que os compostos FGF-18 possuem efeitos ótimos de melhoramento da doença ou dos sintomas nas patologias da cartilagem quando administrados de acordo com os métodos e as utilizações revelados aqui. Foi descoberto que esquemas posológicos menos frequentes que os contemplados pela presente invenção poderão não ser completamente efetivos, enquanto que uma posologia mais frequente que a contemplada pela presente invenção poderá provocar inflamação e/ou outros efeitos contra produtivos na cartilagem ou ambiente da articulação quando são utilizadas as mesmas dosagens ou dosagens comparáveis àquelas contempladas pela presente invenção.

Concordantemente, num aspeto da presente invenção é providenciado um método para tratar um paciente possuindo uma patologia da cartilagem que compreende a administração de um composto FGF-18 em que o composto FGF-18 é administrado pelo menos duas vezes, sendo as referidas administrações separadas por 6, 7, 8, 9 ou 10 dias.

Numa concretização particularmente preferida as referidas administrações são separadas por cerca de 6, 7 ou 8 dias. Numa concretização preferida são separadas por 7 dias.

Noutro aspeto da presente invenção é providenciada a utilização de um composto FGF-18 no fabrico de um medicamento para o tratamento de um paciente possuindo uma patologia da cartilagem em que o composto FGF-18 é administrado pelo menos duas vezes, sendo as referidas administrações separadas por 6, 7, 8, 9 ou 10 dias. Numa concretização particularmente preferida as referidas administrações são separadas por 6, 7 ou 8 dias. Numa concretização preferida são separadas por 7 dias. 6

Numa concretização preferida as referidas administrações são separadas por 7 dias cada. Preferencialmente, o FGF-18 composto é administrado em intervalos regulares uma vez por semana.

Numa concretização da presente invenção é providenciada a utilização de um composto FGF-18 no fabrico de um medicamento para o tratamento de um paciente possuindo uma patologia da cartilagem sendo o medicamento adaptado para ser administrado pelo menos duas vezes, sendo as referidas administrações separadas por 6, 7, 8, 9 ou 10 dias. Numa concretização particularmente preferida as referidas administrações são separadas por 6, 7 ou 8 dias. Numa concretização preferida são separadas por 7 dias.

Numa concretização preferida as referidas administrações são separadas por cerca de 7 dias cada. Preferencialmente, o composto FGF-18 é administrado em intervalos regulares uma vez por semana. O composto FGF-18 é para ser administrado durante pelo menos 3 semanas consecutivas ou pelo menos 4 semanas consecutivas por ciclo de tratamento. Numa concretização preferida um ciclo de tratamento é um número de semanas consecutivas em que é dado um composto FGF-18 cada semana. Numa concretização adicionalmente preferida o composto FGF-18 é administrado durante 3 semanas consecutivas ou 4 semanas consecutivas por ciclo de tratamento, e tal tratamento poderá compreender 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ciclos de tratamento por ano. Numa concretização preferida o composto FGF-18 é administrado durante 3 semanas consecutivas por ciclo de tratamento. Numa concretização preferida tal tratamento compreende 2 ciclos de tratamento por ano. 7

Numa concretização preferida o tratamento compreende a administração intra-articular do composto FGF-18. Alternativamente, o tratamento poderá compreender a administração intravenosa do composto FGF-18.

Numa concretização adicional preferida o tratamento compreende a administração a uma dose de 1-100 mcg, ou preferencialmente 1-60 microgramas (mcg), ou preferencialmente 3-50 mcg, ou preferencialmente 5-40 mcg, ou preferencialmente 10-30 mcg por administração intra-articular única do composto FGF-18. Numa concretização preferida o tratamento compreende a administração a uma dose de cerca de 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 mcg por administração intra-articular única do composto FGF-18. As doses preferidas incluem 5, 10, 15, 20, 25 e 30 mcg por administração intra-articular única do composto FGF-18.

Numa concretização adicional preferida o tratamento compreende a administração a uma dose de 50-200 mcg/kg, preferencialmente 80-120 mcg/kg por administração intravenosa única do composto FGF-18. Numa concretização preferida o tratamento compreende a administração a uma dose de 80, 90, 100, 110 ou 120 mcg/kg administração intravenosa única do composto FGF-18.

Numa concretização preferida a patologia da cartilagem tratada por qualquer um dos métodos da invenção é a osteoartrite, tal como por exemplo a osteoartrite que é classificada como estágio II ou estágio III de acordo com OARSI. Num exemplo preferido a osteoartrite poderá ser a osteoartrite do joelho ou a osteoartrite da anca, tal como a osteoartrite da anca secundária. A pessoa perita está plenamente consciente das classificações de osteoartrite que são utilizadas na técnica. Em particular, a classificação OARSI é conhecida na técnica. A pessoa perita poderá referenciar o "Guidelines for the medicai management of osteoarthritis" (Marc C. Hochberg, Roy D. Altman, Kenneth D. Brandt, Bruce M. Clark, Paul A. Dieppe, Marie R. Griffin, Roland W. Moskowitz, Thomas J. Schnitzer, Artrite & Rheumatism, Volume 38, Issue 11, 1995. Pages 1535-1546.)

Os compostos FGF-18 preferidos da invenção são selecionados a partir do tipo selvagem humano FGF-18 ou FGF-18(170AA).

Compostos da invenção 0 FGF-18 nativo ou de tipo selvagem é uma proteina expressa por condrócitos de cartilagem articular. A presente invenção geralmente relaciona-se com a utilização de um composto de Fator de Crescimento de Fibroblasto 18 (FGF-18) no tratamento de osteoartrite. Um composto FGF-18 da invenção inclui por exemplo FGF-18 nativo ou de tipo selvagem, em particular FGF-18 humano, suas variantes bioativas, tais como variantes alélicas bioativas, e formas truncadas bioativas de FGF-18. A presente invenção poderá relacionar-se com qualquer variante ou forma modificada de FGF-18 que retenha a desejada bioatividade de FGF-18 como aqui descrito, tal como em particular o aumento na deposição de cartilagem. As bioatividades de FGF-18 incluem em particular aquelas descritas nos Exemplos aqui adiante, tais como em particular nos modelos de doença in vivo descritos aqui. A sequência de nucleótidos do cADN FGF-18 humano é descrita na SEQ ID NO. 1, e a sua sequência de aminoácidos deduzidos é descrita na SEQ ID NO. 2. 0 FGF18 foi originalmente designado por zFGF-5, e é totalmente descrito nas Patentes U. S. US6,352,971, US5,989,866 e na Publicação do Pedido de Patente US US2005/0043234, todas as quais são aqui incorporadas por citação. A análise do cADN que codifica um 9 polipéptido de FGF18 humano (SEQ ID NO: 1) revelou uma estrutura de leitura aberta que codifica 207 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) que compreende um polipéptido maduro de 180 aminoácidos (resíduo 28 até ao resíduo 207 da SEQ ID NO: 2) .

Descobriu-se que a sequência de polinucleótidos de FGF-18 de murganho como se mostra na SEQ ID NO: 3 e a sequência de aminoácidos correspondente como se mostra na SEQ ID NO: 4 possuem um elevado grau de homologia com aquela do ortólogo humano. Ao nível dos aminoácidos, os polipéptidos de murganho e humano são aproximadamente 98% idênticos, com três variações de aminoácido. Aqueles peritos na técnica irão reconhecer que as sequências reveladas na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 representam um alelo único de polipéptido e gene FGF18 humano e de murganho, respetivamente, e que é esperado ocorrer variação alélica e excisão alternativa.

Como mencionado anteriormente, o composto FGF-18 da invenção inclui por exemplo FGF-18 nativo ou de tipo selvagem, em particular FGF-18 humano, suas variantes bioativas, tais como variantes alélicas bioativas, e formas bioativas truncadas de FGF-18. A presente invenção poderá relacionar-se com qualquer variante ou forma modificada de FGF-18 que retenha a bioatividade de FGF-18 desejada como aqui descrito, tal como em particular o aumento na deposição de cartilagem.

Numa concretização da presente invenção o composto FGF-18 é uma forma truncada de FGF-18 humano. Numa concretização particular a referida forma truncada de FGF-18 compreende ou consiste de resíduos 28 até 175 da SEQ ID NO: 2, ou um derivado funcional, ou uma variante ou uma muteína como definido aqui. Noutra concretização a referida forma 10 truncada de FGF-18 compreende ou consiste de resíduos 28 até 176, 28 até 177, 28 até 178, 28 até 179, 28 até 180, 28 até 181, 28 até 182, 28 até 183, 28 até 184, 28 até 185, 28 até 186, 28 até 187, 28 até 188, 28 até 189, 28 até 190, 28 até 191, 28 até 192, 28 até 193, 28 até 194 ou 28 até 195, 28 até 196, 28 até 197, 28 até 198, 28 até 199, 28 até 200, 28 até 201, 28 até 202, 28 até 203, 28 até 204, 28 até 205, 28 até 206 ou 28 até 207 da SEQ ID NO: 2, ou um derivado funcional, ou uma variante ou uma muteína como definido aqui. Estes polipéptidos, derivado funcional, ou variante ou muteína poderão compreender um resíduo de aminoácido N-terminal adicional, preferencialmente uma metionina. De facto, dependendo do sistema e das condições de expressão, os polipéptidos da invenção poderão ser expressos numa célula hospedeira recombinante com uma Metionina inicial.

Uma concretização preferida da presente invenção é uma forma truncada de FGF-18, contendo 170 aminoácidos (AA) , daqui em diante também designada como "FGF-18(170AA)". A forma de tipo selvagem ou de ocorrência natural é de 207 AA de comprimento dos quais os primeiros 27 AA são a sequência de sinal e os últimos 11 AA são eliminados em FGF-18(170AA) (como pode ser demonstrado também para FGF-18 de ocorrência natural in vivo). O FGF-18(170AA) poderá ser expresso em E.coli, uma vez que não existe sequência de sinal e a sequência de AA inicia-se com a metionina seguida por AA28 e termina com AA196. O peso molecular de FGF-18(170AA) é 19,83 kDa, pl ~ 10. O FGF-18 (170AA) é descrito adicionalmente na SEQ ID NO. 5 aqui adiante. O FGF-18 (170AA) aumenta a proliferação/diferenciação de condrócitos e a deposição de cartilagem conduzindo à reparação e reconstrução de uma variedade de tecidos cartilaginosos. 11

Os membros da família FGF são caracterizados por domínios de ligação a heparina. Um domínio de ligação a heparina putativa para FGF-18 foi identificado na região de resíduo de aminoácido 148 (Gly) até ao resíduo de aminoácido 169 (Gin) da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4. É postulado que a sinalização mediada por recetor seja iniciada por ligação do ligando FGF complexado com proteoglicano de sulfato de heparina de superfície celular.

Muitos membros da família FGF podem ser colocados numa de duas famílias relacionadas com base nas suas estruturas e funções. aFGF e bFGF consistem de três exões separados por dois intões de comprimento variável. FGF-18 consiste em cinco exões, os primeiros três dos quais correspondem ao primeiro exão de aFGF e bFGF. Todos os membros da família FGF conhecidos são excisados para formar polipéptidos únicos. A análise do complexo ligando-recetor de FGF-18 demonstrou que o FGF18 possui especificidade para FGFR4 e as variantes de excisão "IIIc" de FGFR3 e FGFR2. Os FGFR3-IIIC e FGFR2-IIIc são expressos por condrócitos de tecido de cartilagem, e em particular, foram descobertos ambos os recetores na cartilagem articular humana. 0 FGFR3 e o FGFR2 foram encontrados na placa de crescimento de mamíferos e desempenham papéis importantes na formação de osso endocondral e intramembranoso. 0 FGFR2 é primeiro expresso em mesenquima que condensa e a expressão de FGFR3 é iniciada à medida que os condrócitos se diferenciam e proliferam. Nos ossos cranianos em desenvolvimento, o FGFR3 é encontrado na dura mater e periósteo, enquanto que o FGFR2 é expresso em células osteoprogenitoras na frente osteogénica que separa as suturas. 0 FGFR2 é também expresso no osso trabecular. Previamente, foi demonstrado que o FGF18 é um agente proliferativo para condrócitos e 12 osteoblastos, dependendo de ambos o estado diferenciado destes tipos de células e do modo de administração. (Ver, Patentes U. S. 6, 352, 971 e 5, 989, 866; Ellsworth et al. Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320,2002; Shimoaka et al. , J. Bio. Chem. 277 (9) 7493-500,2002).

Preferencialmente, o composto FGF-18 da invenção aumenta a deposição de cartilagem. Tal aumento poderá ser medido quer in vivo e in vitro. A geração de cartilagem hialina, cartilagem elástica, e fibrocartilagem é valiosa quer como uma terapêutica e como componente para matrizes biológicas. Os compostos FGF-18, tais como FGF-18(170AA), e as composições contendo compostos FGF-18 ("composições de FGF-18") serão úteis para tratar defeitos de cartilagem articular em articulações sinoviais que são devidas a fibrilação superficial relacionada com a idade, degeneração da cartilagem devido a osteoartrite, e os defeitos condrais focais e osteocondrais devido a lesão ou doença.

Os compostos e as composições de FGF-18 poderão também ser úteis para tratar doenças articulares provocadas por osteochondritis dissecans e doença articular degenerativa. No campo da cirurgia reconstrutiva e plástica, as composições de FGF-18 serão úteis para a expansão e transferência de cartilagem autógena ou alogénica e para a reconstrução de defeitos em tecidos extensivos.

Os compostos e composições de FGF-18 poderão também ser úteis para expandir células e induzir a produção de cartilagem elástica. As expansões de células e a indução de produção de cartilagem elástica serão úteis para a geração e reparação de tecido de orelha e nariz. Os compostos e as composições de FGF-18 podem também ser utilizados para expandir populações de condrócitos em cultura para 13 transplantação autógena ou alogénica de condrócitos e em seguida serem administrados com ou sem tratamento concorrente que consiste na administração de composições de FGF-18. Nestes procedimentos, por exemplo, os condrócitos podem ser colhidos artroscopicamente a partir de uma área que contenha uma carga menor sem dano da articulação lesada, e pode ser cultivada na presença de composições de FGF18 para aumentar o número de células antes da transplantação. As culturas expandidas irão em seguida ser misturadas com composições de FGF-18, e colocadas no espaço da articulação ou diretamente no defeito. As composições FGF-18 podem ser utilizadas em combinação com enxertos periósteos ou pericondriais que contenham células que podem formar cartilagem e/ou ajudar a sustentar os condrócitos transplantados ou as suas células precursoras no lugar. As composições de FGF-18 podem ser utilizadas para reparar a lesão em cartilagem em conjunção com a lavagem da articulação, estimulação da medula óssea, artroplastia de abrasão, perfuração subcondral, ou microfratura do osso subcondral. Adicionalmente, após o crescimento de cartilagem devido à administração da composição de FGF-18, poderá ser necessário tratamento cirúrgico adicional para conter adequadamente a superfície de cartilagem recém-formada .

Um composto FGF-18 de acordo com a presente invenção poderá também ser um derivado funcional, variante ou muteina de uma proteína FGF-18 de tipo selvagem.

Os "derivados funcionais" como utilizado aqui abrangem os derivados de FGF-18, e suas variantes ou muteínas e proteínas fundidas, que podem ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos ou nos grupos terminais N ou C, através de meios conhecidos na técnica. Estes derivados funcionais são 14 incluídos na invenção desde que permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, i.e. não destroem a atividade da proteína, que é substancialmente semelhante a, ou melhor que, a atividade de FGF-18, e não conferem propriedades tóxicas em composições que as contenham.

Estes derivados poderão, por exemplo, incluir cadeias laterais de polietileno glicol, que poderão melhorar outras propriedades da proteína, tais como estabilidade, tempo de meia-vida, disponibilidade biológica, tolerância pelo corpo humano, ou imunogenicidade reduzida. Para se atingir este objetivo, o FGF-18 poderá estar ligado e.g. a Polietileno glicol (PEG). A PEGilação poderá ser levada a cabo através de métodos conhecidos, como por exemplo descritos em WO 92/13095. Em particular, PEG-IFN podem ser preparados de acordo com o ensinamento de WO 99/55377.

Consequentemente, numa concretização preferida, o derivado funcional de FGF-18 compreende pelo menos uma unidade ligada a um ou mais grupos funcionais, que ocorrem como uma ou mais cadeias nos resíduos de aminoácido. Uma concretização em que a unidade é uma unidade de polietileno glicol (PEG) é altamente preferida. De acordo com a presente invenção, várias unidades de PEG poderão também estar ligadas ao FGF-18.

Outros derivados incluem uma proteína de FGF-18 modificada, tal como uma forma de FGF-18 de ação prolongada. Em particular, o FGF-18 de ação prolongada poderá ser selecionado a partir de FGF-18 pegilado, proteínas de fusão de FGF-18-HAS, e proteínas de fusão FGF-18-Fc.

Outros derivados incluem ésteres alifáticos dos grupos carboxilo, amidas dos grupos carboxilo por reação com amoníaco ou com aminas primárias ou secundárias, derivados 15 N-acilo dos grupos amino livres dos resíduos de aminoácido formados com unidades acilo (e.g. alcanoílo ou grupos aroílo carbocíclicos) ou derivados O-acilo ou grupos hidroxilo livres (por exemplo aqueles de resíduos serilo ou treonilo) formados com unidades acilo. "Variantes" ou "muteínas", como utilizado no enquadramento da presente invenção, refere-se a análogos de FGF-18, em que um ou mais dos resíduos de aminoácido de FGF-18 natural são substituídos com resíduos de aminoácido diferentes, ou são eliminados, ou um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados à sequência natural de FGF-18, sem diminuir consideravelmente a atividade dos produtos resultantes como comparado com o FGF-18 de tipo selvagem. Estas muteínas são preparadas através de síntese conhecida e/ou através de técnicas de mutagénese direcionadas para o local, ou qualquer outra técnica conhecida adequada para tal. A "variante" ou "muteína" de acordo com a presente invenção inclui proteínas codificadas por um ácido nucleico, tal como ADN ou ARN, que hibridiza para ADN ou ARN que codifica FGF-18 como revelado e.g. em US 5,989,866 sob condições estritas. 0 termo "condições estritas" refere-se a hibridização e condições de lavagem subsequentes, que aqueles peritos comuns na técnica convencionalmente referem como "estritas". Ver Ausubel et ai., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, N.Y., §§6.3 e 6.4 (1987, 1992). Sem limitação, exemplos de condições estritas incluem condições de lavagem 12-20 °C inferior ao Tm calculado do híbrido sob estudo em, e.g., 2 x SSC e 0,5% SDS durante 5 minutos, 2 x SSC e 0,1% SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC e 0,5% SDS a 37 °C durante 30-60 minutos e em seguida, a 0,1 x SSC e 0,5% SDS a 68 °C durante 30-60 minutos. Aqueles peritos comuns nesta técnica percebem que 16 as condições de rigor também dependem do comprimento das sequências do ADN, sondas de oligonucleótido (tais como bases 10-40) ou sondas de oligonucleótido mistas. Se são utilizadas sondas mistas, é preferivel utilizar cloreto de tetrametilamónio (TMAC) em vez de SSC. Ver Ausubel, supra. A identidade reflete uma relação entre duas ou mais sequências de polipéptidos ou duas ou mais sequências de polinucleótidos, determinada por comparação das sequências. Em geral, a identidade refere-se a uma correspondência exata de nucleótido para nucleótido ou de aminoácido para aminoácido das sequências de dois polinucleótidos ou dois polipéptidos, respetivamente, em relação ao comprimento das sequências que estão a ser comparadas.

Para as sequências em que não existe uma correspondência exata, poderá ser determinada a "% de identidade". Em geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para originar uma correlação máxima entre as sequências. Isto poderá incluir a inserção de "lacunas" quer numa ou em ambas as sequências, para aumentar o grau de alinhamento. Uma % de identidade poderá ser determinada relativamente à totalidade do comprimento de cada uma das sequências que estão a ser comparadas (o chamado alinhamento global), que é particularmente adequada para sequências do mesmo ou de tamanhos muito semelhantes, ou com respeito a comprimentos menores e definidos (o chamado alinhamento local), que é mais adequada para sequências de comprimento desigual.

Os métodos para comparar a identidade e a homologia e/ou semelhança de duas ou mais sequências são bem conhecidos na técnica. Assim por exemplo, os programas disponíveis no Pacote de Análise de Sequência de Wisconsin, versão 9.1 (Devereux J et al., 1984), por exemplo os programas BESTFIT e GAP, poderão ser utilizados para determinar a % de 17 identidade entre dois polinucleótidos e a % de identidade e a % de homologia entre duas sequências de polipéptidos. 0 BESTFIT utiliza o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (1981) e encontra a melhor região simples de semelhança entre duas sequências. Outros programas para determinar a identidade e/ou semelhança entre sequências são também conhecidos na técnica, por exemplo a familia de programas BLAST (Altschul S F et ai, 1990, Altschul S F et ai, 1997, acessíveis a partir da página principal de NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson W R, 1990). A "variante" ou a "muteina" de acordo com a presente invenção incluem proteínas possuindo uma sequência de aminoácidos suficientemente duplicativa da de FGF-18, de modo a possuir atividade substancialmente semelhante a FGF-18.

Numa concretização preferida, qualquer tal variante ou muteina possui pelo menos 40% de identidade ou homologia com a sequência de FGF-18. Mais preferencialmente, possui pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou, o mais preferencialmente, pelo menos 90% de identidade ou homologia com a mesma.

As muteínas de FGF-18, que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, ou que codificam os seus ácidos nucleicos, incluem um conjunto finito de sequências substancialmente correspondentes como péptidos ou polinucleótidos de substituição que podem ser obtidos rotineiramente por um perito comum na técnica, sem experimentação indevida, com base nos ensinamentos e diretivas apresentadas aqui. como

As variações preferidas para muteínas de acordo com a presente invenção são as que são conhecidas 18 substituições "conservadoras". As substituições de aminoácido conservadoras de polipéptidos FGF-18 poderão incluir aminoácidos sinónimos num grupo que possuem propriedades fisico-quimicas suficientemente semelhantes que a substituição entre membros do grupo irá preservar a função biológica da molécula (Grantham, 1974). É claro que inserções e eliminações de aminoácidos poderão também ser efetuadas nas sequências definidas acima sem alterar a sua função, particularmente se as inserções ou eliminações envolverem apenas alguns aminoácidos, e.g., inferior a trinta, e preferencialmente inferior a dez, e não removerem ou substituírem aminoácidos que sejam críticos para uma conformação funcional, e.g., resíduos de cisteína. As proteínas e muteínas produzidas por tais eliminações e/ou inserções fazem parte da competência da presente invenção. Preferencialmente, os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos na Tabela A. Mais preferencialmente, os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos na Tabela B; e principalmente preferencialmente os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos na Tabela C.

TABELA A

Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

Aminoácido Grupe > Sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin Ala Gly, Thr, Pro, Ala Vai Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Vai Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Ile Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, Ile 19

Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Vai, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Vai, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Gin Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Asn Gin, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gin, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu Met Phe, Ile, Vai, Leu, Met Trp Trp

TABELA B

Grupos de Aminoácidos Sinónimos Mais Preferidos

Aminoácido Grupo Sinónimo Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, Ile, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Vai Vai, Met, Ile Gly Gly Ile Ile, Met, Phe, Vai, Leu Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gin, Arg Gin Glu, Gin, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gin Met Met, Phe, Ile, Vai, Leu 20

Trp Trp

TABELA C

Grupos de Aminoácidos Sinónimos Principalmente Preferidos

Aminoácido Grupo Sinónimo Ser Ser Arg Arg Leu Leu, Ile, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Vai Vai Gly Gly Ile Ile, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gin Gin Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, Ile, Leu Trp Met

Exemplos de produção de substituições de aminoácido em proteínas que podem ser utilizadas para se obter muteínas de FGF-18 para utilizar na presente invenção incluem passos de qualquer método conhecido, tal como apresentado nas patentes US 4,959,314, 4,588,585 e 4,737,462 de Mark et al; 5,116,943 de Koths et al., 4,965,195 de Namen et al; 4,879, 111 de Chong et al; e 5,017,691 de Lee et al; e 21 proteínas com lisina substituída apresentadas na patente US No. 4,904,584 (Shaw et al) .

Formulação de um composto FGFlõ e administração

Os compostos FGF-18 poderão ser formulados como uma composição farmacêutica, i.e. juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável, excipientes ou semelhantes. A definição de "farmaceuticamente aceitável" significa que compreende qualquer veículo, que não interfere com a eficácia da atividade biológica da substância ativa e que não é tóxico para o hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parentérica, a(s) proteína(s) ativas poderão ser formuladas numa forma de dosagem unitária para injeção em veículos tais como solução salina, solução de dextrose, albumina sérica e solução de Ringer. Tais formulações de compostos de FGF-18 incluindo pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável adicional, excipientes ou semelhantes são aqui também referidas como "composições FGF-18 ".

Os compostos e composições de FGF-18 podem ser aplicados por injeção direta no fluido sinovial da articulação ou diretamente no defeito, quer sozinho ou complexado com um veículo adequado para a libertação estendida de proteína (tal como por exemplo excipientes adequados para formulações de libertação retardada, tais como e.g. ciclodextrina) ou de libertação local restrita (tais como, por exemplo, administração através de esponjas bio compatíveis, bio matrizes semelhantes, células encapsuladas ou semelhantes).

As formulações para aplicação intra-articular (IA) cumprirão com a maioria dos requisitos que também se aplicam a outras formulações de injeção, i.e., necessitam 22 ser estéreis e compatíveis com as condições fisiológicas no local de aplicação (e.g., articulação do joelho, SF) . A esterilidade das formulações de solução pode ser conseguida através de autoclavagem (se todos os componentes da formulação forem suficientemente resistentes à sensibilidade térmica) ou filtração estéril, enquanto que para outras formulações, os processos de fabrico requeridos para assegurar um produto estéril poderão ser mais complexos. Por exemplo, a filtração estéril não é exequível para formulações contendo partículas (suspensões), formulações semissólidas ou sólidas. Para a compatibilidade da formulação com as condições fisiológicas no local da injeção, as características da SF têm que ser tomadas em consideração. Preferencialmente as formulações da invenção consequentemente são isotónicas. 0 pH das formulações está quer próximo do pH da SF (i.e., pH 7,4) ou ligeiramente inferior, mas preferencialmente não inferior a pH —5,5, para permitir uma estabilidade ótima da substância ativa, enquanto se minimizam possíveis efeitos secundários de valores de pH não fisiológico tais como a ativação de enzimas proteolíticas, e.g., catepsinas. Os excipientes utilizados para injeção IA poderão também estar presentes noutras formulações de injeção, e.g., para aplicação intramuscular ou subcutânea.

Numa concretização da presente invenção, o modo de administração do composto de FGF-18 descrito aqui é selecionado a partir do grupo consistindo de: administração intra-auricular, administração peri-auricular, administração intranasal, administração peri-nasal, administração endosinusial, administração intercostal, administração peri-costal, administração intratorácica, administração peri-torácica, administração epidural, administração peri-vertebral, administração peri-sinovial, 23 administração intrassinovial, administração endosinusial, administração peri-articular e administração intra-articular. Numa concretização preferida, o composto de FGF-18 descrito aqui é administrado peri-articularmente (administração à volta de uma articulação) ou intrarticularmente (administração dentro de uma articulação). Numa concretização da presente invenção, a administração peri-articular ou intra-articular é efetuada à volta de ou numa articulação selecionada a partir de uma articulação da anca, joelho, cotovelo, pulso, tornozelo, coluna, pé, dedo da mão, dedo do pé, mão, ombro, costelas, omoplatas, coxas, pernas, calcanhares, e ao longo dos pontos ósseos da coluna. Ainda noutra concretização preferida a administração peri-articular ou intra-articular é realizada à volta ou na articulação da anca ou do joelho.

Patologias da cartilagem A presente invenção relaciona-se com métodos de tratar, prevenir ou aliviar os sintomas de uma patologia de cartilagem num mamífero. Preferencialmente tal patologia de cartilagem resulta a partir de lesões devidas a lesão traumática ou condropatia. É entendido que preferencialmente os seres humanos são pacientes a serem tratados de acordo com a presente invenção; no entanto, é entendido que outros mamíferos, incluindo mas não limitado a cães, cavalos e semelhantes poderão ser tratados com métodos de acordo com a presente invenção.

Exemplos de patologias de cartilagem que poderão ser tratadas, prevenidas ou aliviadas através do tratamento descrito aqui incluem mas não são restritas a: artrite, osteocondrite, costocondrite (tais como síndroma de Tietze), osteomielite, policondrite, policondrite recidiva e Osteocondritis Dissecans. 24

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é artrite. Preferencialmente, a referida doença é selecionada a partir do grupo que consiste em: espondilite anguilosante, hiperosteose esguelética difusa idiopática (DISH), gota, pseudogota, artrite infecciosa, osteoartrite, artrite reumatoide, artrite psoriática, artrite reativa, escleroderma, síndroma de Sjogren e doença de Still. Numa concretização preferida, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é artrite Reumatoide ou osteoartrite. Numa concretização particularmente preferida, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é osteoartrite.

Artrite, refere-se a uma lesão de estruturas articulares (articulações) no corpo e processos inflamatórios relacionados. Artrite, incluindo osteoartrite, artrite reumatoide, articulações artríticas como um resultado de dano, e semelhantes, são estados inflamatórios comuns que poderão beneficiar da utilização terapêutica de FGF18 de acordo com a presente invenção.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é espondilite anquilosante. A espondilite anquilosante (AS) é a artrite envolvendo a coluna. Provoca dor e rigidez nas costas, e também uma postura curvada. Isto é um resultado de inchaço em curso e irritação das articulações espinais (vértebras). Em casos graves, a inflamação das vértebras pode eventualmente provocar a fusão entre elas conduzindo a mobilidade severamente limitada. A inflamação dos tendões e ligamentos que ligam e providenciam suporte às articulações pode conduzir a dor e sensibilidade nas costelas, omoplatas, ancas, coxas, pernas, calcanhares e ao longo dos pontos ósseos da coluna. 25 A espondilite anquilosante é uma forma inflamatória crónica de artrite que afeta as articulações da coluna. A caracteristica principal de AS é o envolvimento das articulações na base da coluna onde a coluna se liga à pélvis - as articulações sacriliacas (SI). O curso da doença é altamente variável, e enquanto que alguns indivíduos têm apenas episódios de dor de costas temporária, outros têm dor de costas crónica mais grave que conduz a diferentes graus de rigidez da coluna com o decorrer do tempo. Em quase todos os casos a doença é caracterizada por episódios dolorosos agudos e remissões (períodos em que o problema se soluciona).

Com o decorrer dos anos a AS tem sido conhecida por muitos nomes diferentes incluindo espondilite deformante, espondilite reumatoide, e espondilite de Marie-Strumpells. Desde o início dos anos 7 0 com o aumento do conhecimento acerca da doença, existe uma utilização quase universal do termo espondilite anquilosante. A AS é um membro da família de doenças que atacam a coluna.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é hiperosteose esquelética idiopática difusa. A hiperosteose esquelética idiopática difusa (DISH) é caracterizada por crescimento excessivo do osso ao longo dos lados das vértebras da coluna. Envolve também inflamação e crescimento de osso onde os tendões e ligamentos se ligam ao osso, tais como o cotovelo, joelho e o calcanhar do pé. Os osteófitos são comuns entre as pessoas com DISH. A DISH (por vezes chamada doença de Forestier) é considerada uma forma de artrite degenerativa e é caracterizada por crescimento excessivo do osso ao longo 26 dos lados das vértebras da coluna. É também associada a inflamação e calcificação (crescimento do osso) noutras áreas do corpo onde os tendões e ligamentos se ligam ao osso, tais como o cotovelo, joelho e o calcanhar do pé. Estas podem conduzir a osteófitos. Os osteófitos do calcanhar, por exemplo, são comuns entre as pessoas com DISH.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a gota. A gota é um tipo de artrite em que o ácido úrico, um produto residual que se produz naturalmente no interior do organismo, aumenta para valores acima dos niveis normais. Em vez de ser depurada pelos rins e através da urina, como é normalmente, forma cristais e depósitos nas articulações. Estes depósitos dão origem à inflamação das articulações, provocam dor, inchaço, vermelhidão e rigidez da área. Muito tipicamente a articulação afetada é aquela do dedo grande do pé, mas a gota pode também afetar o tornozelo, joelho, pé, mão, pulso e cotovelo. Os cristais de ácido úrico poderão também formar depósitos noutras áreas tais como sob a pelo ou noutros tecidos moles, e no rim ou no trato urinário. A gota afeta tipicamente a articulação na base do dedo grande do pé. Em mais de metade dos ataques iniciais, esta é a primeira articulação afetada. Quase todas as outras articulações podem ser afetadas, mas as articulações os membros inferiores são mais comummente do que aquelas dos membros superiores. A maioria dos ataques iniciais de gota envolve apenas uma articulação, e, com tratamento, retrocede em três a dez dias. Mais de 50% das pessoas que tiveram um ataque agudo de gota irão possuir recorrência no mesmo ano. Com o 27 decorrer do tempo os ataques poderão tornar-se mais frequentes, com maior duração e muitas vezes afetam mais articulações.

Para algumas pessoas os ataques persistem, e a doença torna-se crónica. Os cristais de ácido úrico depositados no interior da articulação e nos tecidos moles circundantes conduzem a variações destrutivas na articulação e provocam inflamação persistente.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a pseudogota. A pseudogota é um tipo de artrite que é provocada pela acumulação de cálcio no organismo. A pseudogota resulta de uma acumulação de cristais de cálcio (pirofosfato de cálcio dihidrato) numa articulação. 0 cálcio forma cristais que se depositam nas articulações entre os ossos. Isto provoca inchaço e dor na área. 0 cálcio deposita-se e a inflamação crónica pode provocar que partes da estrutura da articulação enfraqueçam e se quebrem.

Com a pseudogota a cartilagem pode começar a fraturar-se e a possuir orifícios nela própria e provocar mais dor e inchaço na articulação. Com o decorrer do tempo a cartilagem poderá desgastar-se inteiramente, e os ossos entram em fricção.

Muita da dor da pseudogota é um resultado dos músculos e de outros tecidos que ajudam as articulações a se moverem (tais como tendões e ligamentos) que são forçados a trabalhar de modos para os quais não foram concebidos, como um resultado de lesão para a cartilagem. A própria cartilagem não possui células nervosas, e consequentemente não pode sentir dor, mas os músculos, tendões, ligamentos e ossos podem. Após muitos anos de erosão de cartilagem, os 28 ossos podem realmente roçar-se uns nos outros. Esta fricção de ossos contra osso aumenta adicionalmente a dor. Os ossos podem também engrossar e formar crescimentos, chamados esporos ou osteófitos, que se roçam conjuntamente.

Tal como a doença gota, a pseudogota pode aparecer de uma forma repentina, com ataques recorrentes de dor e inchaço numa única articulação.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a artrite infecciosa. A artrite infecciosa provoca dor e inchaço nas articulações. A inflamação é provocada por um germe. 0 germe pode ser uma bactéria, um virus, ou um fungo. Usualmente existe apenas uma articulação envolvida, embora por vezes duas ou três articulações podem tornar-se infetadas. Não dura usualmente um longo período de tempo se for tratada no início.

Na maior parte das vezes, a artrite infecciosa afeta as articulações grandes (ombros, ancas, joelhos), mas as articulações mais pequenas (dedos, tornozelos) podem também ser envolvidas.

Numa concretização preferida da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a osteoartrite. A osteoartrite é a forma mais comum de artrite. Poderá ser provocada pela quebra da cartilagem. Os pedaços de cartilagem podem quebrar-se e provocar dor e inchaço na articulação entre os ossos. Com o decorrer do tempo a cartilagem poderá desgastar-se inteiramente, e os ossos irão roçar-se uns nos outros. 29 A osteoartrite pode afetar qualquer articulação mas usualmente diz respeito a mãos e articulações que suportam peso tais como ancas, joelhos, pés, e coluna. 0 estado de doença de osteoartrite (OA) é uma doença progressiva multi-fatorial, complexa que é de natureza não inflamatória e que é caracterizada por uma degradação geral relacionada com a idade da cartilagem articular nas articulações. A OA é também caracterizada por ativação de condrócitos conduzindo a proliferação e apoptose celular, expressão de protéase e produção de matriz anormal, falha na reparação da cartilagem conduzindo à perda de matriz extracelular, calcificação da matriz e formação de osteófito. A degradação da cartilagem e das estruturas extracelulares da matriz conduz a fricção aumentada entre os ossos e nervos da articulações afetadas. A OA provoca niveis variáveis de dor e debilitação progressiva naqueles afetados pela doença. As terapias atuais para a OA são paliativas ou cirúrgicas.

Em articulações saudáveis a cartilagem atua como um absorvedor de choque quando é colocado peso sobre a articulação. A superfície deslizante da cartilagem permite que os ossos se movam suavemente. Quando a articulação desenvolve osteoartrite a cartilagem torna-se gradualmente áspera e fina, e o osso subjacente engrossa.

Embora usualmente não exista inchaço no estágio inicial da doença, à medida que a artrite progride pode existir inflamação. Os pedaços de cartilagem poderão fraturar-se e flutuar ao redor dentro da articulação. Isto perturba outros tecidos moles no interior da articulação e pode provocar dor e inchaço entre os ossos. 30

Com o decorrer do tempo à medida que a cartilagem se desgasta, os ossos poderão formar protuberâncias nas suas extremidades. Estas protuberâncias são chamadas esporos. Ou, a cartilagem poderá desgastar-se completamente, e os ossos poderão ficar diretamente em contacto um com o outro. A OA poderá conduzir a outros problemas tais como: os músculos que suportam a articulação no lugar enfraquecem devido a não estarem a ser utilizados, com o decorrer do tempo a articulação perde a sua forma e deixa de funcionar. A OA afeta comummente as articulações que suportam o peso tais como ancas, joelhos, pés e coluna. No entanto, as articulações que não suportam peso tais como as articulações dos dedos e a articulação na base do polegar poderão também ser afetadas. Usualmente não afetam outras articulações, exceto quando foram danificadas ou colocadas sob tensão não usual.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a artrite reumatoide. A artrite reumatoide (RA) é uma doença inflamatória autoimune sistémica crónica que envolve principalmente a membrana sinovial de articulações múltiplas com lesão resultante para a cartilagem articular. A patogénese está dependente do linfócito T e está associada à produção de fatores reumatoides, auto-anticorpos dirigidos contra o próprio IgG, com a formação resultante de complexos imunes que atingem elevados niveis em fluidos e sangue da articulação. Estes complexos na articulação poderão induzir o infiltrado marcado de linfócitos e monócitos no interior da membrana sinovial e subsequentes alterações sinoviais marcadas; o espaço/fluido da articulação é infiltrado por células semelhantes com a adição de numerosos neutrófilos. Os tecidos afetados são 31 primariamente as articulações, muitas vezes em padrão simétrico. As células inflamatórias libertam enzimas que poderão digerir osso e cartilagem. Como um resultado de artrite reumatoide, o revestimento da articulação inflamada, a membrana sinovial, pode invadir e danificar o osso e cartilagem conduzindo à deterioração da articulação e dor severa entre outros efeitos fisiológicos. A articulação envolvida pode perder a sua forma e alinhamento, resultando em dor e perda de movimento. Consequentemente a RA poderá conduzir a deficiência grave e aumento da mortalidade. A lesão da articulação pode ocorrer mesmo em casos em que a dor não é grave. Pode acontecer mesmo em estágios iniciais da doença. Para muitas pessoas com RA, a lesão foi exibida em raios-X das mãos e dos pés durante os dois anos do inicio da doença. Mas poderá ser demasiado tarde para se tratar na altura em que os raios-X revelam o problema. A lesão grave pode conduzir a deformidade da articulação e incapacidade. A dor e o inchaço poderão provocar dificuldade a andar.

Uma variedade de citoquinas é produzida localmente nas articulações reumatoides. Numerosos estudos demonstraram que IL-1 e TNF-alfa, duas citoquinas prototípicas pro-inflamatórias, desempenham um papel importante nos mecanismos envolvidos na inflamação sinovial e na destruição progressiva da articulação. De facto, a administração de TNF-alfa e inibidores de IL-1 em pacientes com RA conduziu a um melhoramento dramático dos sinais clínicos e biológicos de inflamação e uma redução de sinais radiológicos de erosão óssea e destruição de cartilagem. No entanto, apesar destes resultados encorajantes, uma percentagem significativa de pacientes não respondem a 32 estes agentes, sugerindo que outros mediadores estão também envolvidos na patofisiologia da artrite. Uma forma importante de distinguir a RA de outras formas de artrite é através do padrão de envolvimento da articulação. Por exemplo, a RA afeta o pulso e muitas das articulações da mão mas usualmente não as articulações que são articulações mais distais.

Em RA, as articulações tendem a estar envolvidas num padrão simétrico. Isto é, se os nódulos na mão direita estão inflamados, provavelmente os nódulos na mão esquerda estão também inflamados.

Outras articulações comummente afetadas por RA incluem os cotovelos, ombros, pescoço, mandíbula, pés, tornozelos, joelhos, e ancas. Com exceção do pescoço, a coluna usualmente não é diretamente afetada por RA.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a artrite psoriática. A artrite psoriática é um estado que provoca inchaço e dor nas e à volta das articulações. Também provoca uma erupção escamosa na pele.

Pode afetar um número de articulações incluindo as articulações dos dedos, pulsos, dedos dos pés, joelhos, tornozelos, cotovelos e ombro, a coluna e as articulações na parte inferior das costas (chamadas articulações sacriliacas).

A artrite psoriática também afeta os tecidos circundantes das articulações incluindo tendões e ligamentos. Poderá provocar inchaço de um digito inteiro chamado dedo ou dedo do pé "salsicha". Existe também inflamação da pele, particularmente nos cotovelos, joelhos e couro cabeludo. A 33 artrite psoriática está ligada a psoriase, uma patologia que provoca que as áreas da pele se tornem inflamadas e sejam cobertas com escamas prateadas ou cinzentas.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a artrite reativa. A artrite reativa refere-se a dor, rigidez, vermelhidão ou inchaço numa articulação resultante a partir de uma infeção prévia. Muito frequentemente ocorre nas articulações dos membros inferiores (joelhos, tornozelos, dedos dos pés), mas pode também ocorrer nos membros superiores. Os problemas poderão ser nas articulações apenas ou envolver outros sistemas corporais tais como os olhos, músculos da pele ou tendões. Quando afeta as áreas para além das articulações, a artrite reativa é em seguida chamada síndroma de Reiter.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a escleroderma. A escleroderma é um estado em que a pele se torna espessa e dura. Existem dois tipos principais de escleroderma. Um tipo é a escleroderma localizada, que afeta principalmente a pele. Pode também envolver os músculos e as articulações. 0 outro tipo, a escleroderma generalizada, afeta a pele assim como os órgãos internos, tais como o coração, pulmões e rins. A característica mais marcante da escleroderma é a acumulação de tecido fibroso do tipo escara áspero na pele. As variações menos visíveis incluem lesão às células que revestem as paredes de vasos sanguíneos pequenos. Isto poderá por sua vez danificar órgãos principais.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é o síndroma de 34

Sjogren. 0 síndroma de Sjogren é uma patologia crónica que provoca lesão nas glândulas salivares resultando em boca seca, e nas glândulas lacrimais, resultando em olhos secos. Também pode afetar outras partes do corpo incluindo articulações, músculos e nervos, órgãos tais como os pulmões, rins, fígado, pâncreas, estômago e cérebro, ou glândulas tais como a glândula da tiroide. 0 síndroma de Sjogren pode provocar a destruição completa de qualquer destas áreas. Uma vez que o síndroma de Sjogren pode afetar o fígado e o pâncreas, existe uma maior probabilidade de desenvolver cancro do tecido linfático. No entanto, isto é resultado invulgar e raro. 0 síndroma de Sjogren pode ocorrer de dois modos. É o síndroma de Sjogren 'secundário' quando ocorre em pessoas que possuem um estado reumático ou doença do tecido conectivo tal como lúpus, escleroderma ou polimiosite. Foi designado síndroma de Sjogren 'primário' quando a boca e os olhos secos não estão associados a um estado reumático.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a doença de Still. A doença de Still é uma forma de artrite caracterizada por febres elevadas, erupções cutâneas cor de salmão e inflamação das articulações. A doença é mais comum entre as crianças, para as quais é comummente referida como artrite idiopática juvenil sistémica. A doença de Still pode também ocorrer entre adultos, embora muito menos comummente do que para crianças. Neste caso é referida como doença de Still de início adulto ou AOSD.

Como revelado aqui acima, as patologias de cartilagem que poderão ser tratadas, prevenidas ou aliviadas pelo tratamento descrito aqui incluem: Osteocondritis Dissecans, 35 costocondrite (tal como síndroma de Tietze), osteomielite, e policondrite recidiva.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a Osteocondritis Dissecans. A osteocondritis dissecans (OCD) é um termo para a fratura osteocondral. Um fragmento osteocondral poderá estar presente in situ, incompletamente separado, ou completamente separado. A OCD é uma forma de osteocondrose limitada à epífise articular. As epífises articulares falham como um resultado de compressão. Ambos o trauma e a isquemia estão provavelmente envolvidos na patologia. 0 trauma é muito provavelmente o ataque primário, com isquemia como um dano secundário. 0 trauma poderá ser provocado por trauma direto, tal como fratura por impacto, ou microtrauma repetitivo, tal como tensão compressiva normal excessiva. A articulação do joelho é o local mais comummente envolvido. No entanto, a articulação do cotovelo, a articulação do tornozelo, navicular do tarso, articulação da anca, articulação do ombro, Glenoide, articulação do pulso poderão também ser afetadas. A OCD tende a afetar pacientes jovens. Na OCD do cotovelo, a média da idade dos pacientes é 23 anos e varia desde 4-47 anos. No tornozelo, a média da idade dos pacientes é 20 anos e varia desde 8-50 anos. Na anca, a média da idade dos pacientes é 24 anos e varia desde 14-39 anos.

Pacientes usualmente queixam-se de dor nos extremos da amplitude de movimento. O edema peri-articular está frequentemente presente com ligeiro calor ao togue. Quando está envolvida uma extremidade inferior, os pacientes 36 muitas vezes coxeiam. Os sintomas usualmente melhoram com a imobilização protegida da articulação.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a costocondrite. A costocondrite é uma inflamação das junções onde a articulação das costelas se une à cartilagem que as suporta e ao osso do peito ou esterno. A causa é usualmente desconhecida. Quando a dor de costocondrite é acompanhada por inchaço é referida como sindroma de Tietze.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é a osteomielite. A osteomielite é um processo inflamatório agudo ou crónico do osso e as suas estruturas secundárias à infeção com organismos piogénicos. A infeção associada á osteomielite poderá ser localizada ou poderá estar espalhada ao longo do periósteo, córtex, medula, e tecido esponjoso. 0 patógeno bacteriano varia com base na idade do paciente e no mecanismo de infeção. A osteomielite hematogenosa é uma infeção provocada por propagação bacteriana a partir do sangue. A osteomielite hematogenosa aguda é caracterizada por uma infeção aguda do osso provocada pela propagação das bactérias no interior do osso a partir de uma fonte remota. Este estado ocorre primariamente nas crianças. 0 local mais comum é a metáfise altamente vascular e de crescimento rápido e dos ossos em crescimento. 0 aparente retardamento ou espessamento do fluxo sanguíneo à medida que os vasos fazem ângulos agudos na metáfise distai predispõe os vasos a trombose e o próprio osso a necrose localizada e propagação bacteriana. A osteomielite hematogenosa aguda, apesar do seu nome, 37 poderá ter um desenvolvimento clínico lento e um início insidioso. A osteomielite de inoculação direta ou contígua é provocada por contacto direto do tecido com as bactérias durante o trauma ou a cirurgia. A osteomielite de inoculação direta (foco contíguo) é uma infeção no osso secundária à inoculação de organismos a partir de trauma direto, espalhada a partir de um foco contíguo de infeção, ou sepsia após um procedimento cirúrgico. As manifestações clínicas de osteomielite de inoculação direta são mais localizadas que aquelas da osteomielite hematogenosa e tendem a envolver organismos múltiplos.

As categorias adicionais incluem osteomielite crónica e osteomielite secundária à doença vascular periférica. A osteomielite crónica persiste ou recorre, independentemente da sua causa inicial e/ou mecanismo e apesar de intervenção agressiva. Embora listada como uma etiologia, a doença vascular periférica é mais um fator de predisposição do que uma verdadeira causa de infeção.

Os estados de doença conhecidos que predispõem os pacientes para a osteomielite incluem diabetes mellitus, doença de células falciformes, síndroma de deficiência imunológica adquirida (SIDA), abuso de fármaco IV, alcoolismo, utilização de esteroides crónica, imunossupressão, e doença de articulação crónica. Em adição a presença de um dispositivo prostético ortopédico é um fator de risco independente como em qualquer cirurgia ortopédica recente ou fratura aberta.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é policondrite recidiva. A policondrite recidiva (RP) é um estado 38 inflamatório episódico invulgar e grave envolvendo estruturas cartilaginosas, predominantemente aquelas da orelha, nariz, e árvore laringotraqueobrônquica. Outras estruturas afetadas poderão incluir o olho, sistema cardiovascular, articulações periféricas, ouvido médio, e ouvido interno. A etiologia desta doença é desconhecida; no entanto, a patogénese é muito provavelmente autoimune na sua natureza. A evidência para uma etiologia autoimune inclui a sua associação clinica a outras patologias autoimunes, a sua associação ao haplotipo HLA-DR4, descobertas em patologia de células CD4 T infiltrantes e complexos antigeno-anticorpo na cartilagem afetada, respostas celulares e humorais contra colagénio de tipo II e outros antigenos de colagénio, e a observação de que esses regimes imunossupressores muito frequentemente suprimem a doença.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é lesão de cartilagem resultante de um trauma. As lesões de cartilagem podem ocorrer como um resultado de destruição mecânica traumática. Um golpe direto ou outro trauma pode danificar a cartilagem. A cartilagem não possui fornecimento de sangue direto, pelo que tem pouca capacidade de se reparar a si própria. Os métodos da presente invenção melhoram a reparação da cartilagem. Consequentemente numa concretização da presente invenção, a lesão da cartilagem resultante de um trauma é resultante de um acidente ou de uma cirurgia. Numa concretização particular da presente invenção, a lesão da cartilagem resultante de um trauma é resultante de uma cirurgia, em particular de cirurgia ortopédica ou cirurgia plástica. Também considerado pela presente invenção é o tratamento de lesão relacionada com o 39 desporto ou desgaste relacionado com o desporto dos tecidos da articulação.

Numa concretização da presente invenção, a patologia de cartilagem tratada, prevenida ou aliviada é uma patologia de aparência estética. Numa tal concretização, o método e a utilização da presente invenção poderão ser usados em associação com a cirurgia plástica.

Tendo agora descrito completamente esta invenção, será entendido por aqueles peritos na técnica que o mesmo pode ser realizado numa vasta gama de parâmetros equivalentes, concentrações e condições sem se afastar do espirito e âmbito da invenção e sem experimentação indevida.

Enquanto que esta invenção foi descrita em conexão com as suas concretizações especificas, entender-se-á que será capaz de sofrer modificações adicionais. Este pedido pretende cobrir quaisquer variações, utilizações ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente revelação à medida que se incluam na prática conhecida ou comum da técnica à qual a invenção pertence e segundo a qual poderão ser aplicadas as características essenciais estabelecidas aqui anteriormente como se segue no âmbito das reivindicações anexas. A referência a passos de métodos conhecidos, passos de métodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é de modo algum uma admissão de que qualquer aspeto, descrição ou concretização da presente invenção esteja revelado, ensinado ou sugerido na técnica relevante. 40 A descrição que se segue das concretizações especificas irá assim revelar completamente a natureza geral da invenção que outros podem, através da aplicação do conhecimento de um perito na técnica (incluindo os conteúdos das referências citadas aqui), modificar prontamente e/ou adaptar para várias aplicações tais como concretizações especificas, sem realizar experimentação indevida, sem se afastar do conceito geral da presente invenção. Consequentemente, tais adaptações e modificações pretendem estar incluídas no significado e na gama de equivalentes das concretizações reveladas, com base no ensinamento e nas orientações apresentadas aqui. É para ser entendido que a fraseologia ou terminologia aqui é para o propósito de descrição e não de limitação, tal como a terminologia ou fraseologia da presente especificação é para ser interpretada pelo perito na técnica à luz dos ensinamentos e orientações apresentados aqui, em combinação com o conhecimento de um perito comum na técnica. EXEMPLO 1: Modelos de doença em animais e farmacologia prolongada

In vivo, o FGF-18(170AA) foi testado em diferentes modelos de doença de OA e cartilagem danificada, com eficácia terapêutica significativa utilizando uma dosagem intra-articular (i.a.). Em geral foi demonstrável uma dose terapeuticamente eficaz de 3-40 yg i.a. por animal/semana em diferentes espécies (rato, cão) . Os resultados dos modelos de doença animal mencionados anteriormente (OA assim como defeitos de cartilagem) são resumidos adiante. 41

42

Discutido em mais detalhe adiante 43 EXEMPLO 1.1: Modelo de OA para o desprendimento de menisco em ratos Método

Ratos Lewis machos (5-10/grupo) foram submetidos a cirurgia para induzir um desprendimento de menisco medial na articulação do joelho direito. A dosagem através da via i.a. foi iniciada 19-21 dias após cirurgia a doses de 0,3, 1, 3 ou 10 yg (formulada em solução salina) para determinar os efeitos farmacodinâmicos relacionados com o regime de dosagem. Estas doses totais foram administradas quer como (i) dose única, (ii) uma vez por semana (1/3 da dose total por injeção) durante 3 semanas, ou (iii) três vezes por semana durante 3 semanas (1/9 da dose total por injeção).

Na conclusão do tratamento ou após 3 semanas após tratamento, os joelhos direitos foram recolhidos para avaliação histopatológica de efeitos potenciais. A avaliação das lesões foi realizada em 3 zonas diferentes: diferenças regionais através da prato tibial medial foram tomadas em consideração através da divisão de cada secção em 3 zonas (1-exterior, 2-média, 3-interior) . No modelo de OA cirúrgico, os terços exterior (zl) e médio (z2) são usualmente os mais gravemente afetados, e as alterações mais moderadas estão presentes no terço interior (z3). T λ λ · > Cirurgia tratas 1 o aa . « . . .. .. . óú Terminação Terminação sdiss® de- Tr<s*.-mesi«<> 1 (vj>oí-ík«í-í I f ▼ ▼ |§|j§3 semanas f§||||§§ i ^ Opções de tratamento: ·· 1 tratamento 1Λ semana apenas - 3 tratamentos 1 por semana - $ tratamentos 3 por semana (doses semanaismantldes constantes)

Descrição do programa de tráfcamen to: 44

Conceção Experimental

Os animais (5-10/grupo), alojados 2-3/gaiola, são anestesiados com Isoflurano e a área do joelho direito é preparada para cirurgia. É feita uma incisão na pele sobre o aspeto medial do joelho e o ligamento colateral medial é exposto através de dissecção de corte, e em seguida seccionado. 0 menisco medial é cortado através de toda a sua espessura para simular um desprendimento completo. A pele e a subderme são fechadas com uma sutura 4-0 Vicryl utilizando um padrão subcuticular. A dosagem através da via intra-articular é iniciada 19-21 dias após a cirurgia e é descontinuada após uma dose única ou continuada durante 3 semanas com injeções intra-articulares uma vez por semana ou 3 vezes por semana. Os ratos são em seguida terminados (gl-16) ou deixados recuperar durante umas 3 semanas adicionais antes da terminação (gl7-32). Quatro horas antes da necropsia, todos os ratos são administrados com 50 mg/kg de BRDU para rotular ativamente as células proliferantes. O sangue é recolhido para o soro imediatamente antes da necropsia e é efetuada a lavagem sinovial no joelho direito. Na necropsia, a articulação do joelho direito (operado) foi aparada de músculo e tecido conectivo e recolhida em formalina tamponada neutral a 10%. A rótula é removida para permitir a fixação adequada das articulações. As amostras de traqueia, esterno, e orelha são também colocadas em formalina.

Resultados avaliados a 6 semanas após a cirurgia

Controlos não tratados (avaliados a 6 semanas após a cirurgia)

Os animais não tratados com desprendimento de menisco medial que foram terminados a 6 semanas após a cirurgia possuíam uma degeneração da cartilagem tibial que foi mais 45 grave nos 2/3 exteriores do prato tibial e menos graves no l/3interior. Os osteófitos foram maiores (média 468 ym). A degeneração da cartilagem femoral foi mais moderada e mais variável que a degeneração tibial. Os animais tratados com solução salina uma vez por semana possuiam uma zona 3 significativamente inferior de total de valores de degeneração de cartilagem tibial (16%), uma razão de profundidade significativamente inferior (16%) , e uma área significativamente maior de cartilagem viável na tibia lateral quando comparada com os animais não tratados (13%). Os animais tratados com solução salina 3 vezes por semana possuiam valores de degeneração de cartilagem significativamente inferiores na zona 2 da tibia (24%), uma razão de profundidade significativamente inferior (13%), e uma área significativamente maior de cartilagem viável em ambas a tibia lateral e medial (15 e 14%). Estas diferenças nos grupos de controlo são provavelmente um resultado de episódios de anestesia repetida que influenciam a atividade total dos animais, embora a possibilidade de injeções de solução salina repetidas influenciarem a gravidade da lesão através de facilitar a remoção de mediadores e residuos não possa ser descartada.

Tratamento de dose única (avaliado a 6 semanas após cirurgia)

Os animais que receberam uma dose única de 10 yg FGF-18(170AA) possuiam uma amplitude significativamente maior de degeneração de cartilagem total (16%) devido a um aumento de perda de proteoglicano na zona 3. Os valores de osteófito e medidas foram aumentados significativamente (19 e 25%, respetivamente) em animais administrados com uma dose única de 10 yg FGF-18 (170AA) . A área de matriz de cartilagem viável na tibia medial foi significativamente aumentada em 27% em animais tratados com 10 yg. A 46 imunocoloração revelou bromodesoxiuridina (BRDU) immunopositividade em medula fibrótica subjacente a lesões na cartilagem e em células de medula óssea, fibroblastos, e cartilagem de osteófito, com padrões de manchamento semelhantes em solução salina e articulações tratadas com FGF-18(170AA). Estes resultados indicam que uma injeção única de 10 pg de FGF-18 (170AA) teve um efeito anabólico definitivo, como evidenciado através do maior tamanho de osteófito e da maior área de cartilagem tibial medial. Estas variações não foram, no entanto, suficientes para melhorar os valores de degeneração de cartilagem geral. É provável que o aumento na área de cartilagem medial seja um resultado de espessura de cartilagem aumentada na superfície que suporta a carga adjacente ao osteófito.

Uma vez por semana durante 3 semanas (avaliado a 6 semanas após a cirurgia)

Os animais tratados com 3 pg FGF-18 (170AA) uma vez por semana possuíam valores de degeneração de cartilagem significativamente inferiores comparados com o controlo de uma solução salina uma vez por semana na zona 2 da tíbia medial. Os animais administrados com 10 pg de FGF-18(17OAA) possuíam uma amplitude de degeneração significativamente inferior (37%) , e aqueles administrados com 3 pg (28%) ou 1 pg (15%) também possuíram alguma inibição. Os valores de osteófito e medidas foram aumentados significativamente e em reposta à dose através do tratamento com 10 (32 e 53%) ou 3 (21 e 32%) pg de FGF-18 (170AA) . A área de matriz de cartilagem viável na tíbia medial foi significativamente aumentada por tratamento com 10 pg de FGF-18(170AA) (27%). Foi evidente que uma sinovite ativa moderada a marcadamente crónica com fibrose em articulações injetadas com 10 ou 3 pg e aquelas injetadas com 1 pg possuíam sinovite mínima. A reabsorção de osso subcondral foi aumentada minimamente em 47 algumas articulações tratadas com 10 yg. Os animais tratados com 3 ou 10 yg de FGF-18 (170AA) possuíram maior marcação BRDU na medula fibrótica, membrana sinovial, e em áreas de condrogénese ou osteófitos, quando comparados com controlos de solução salina. Estes resultados demonstraram um benefício de resposta à dose no tratamento utilizando o paradigma uma vez por semana na amplitude de degeneração de cartilagem significativa. Este parâmetro é o mais indicativo da presença de uma matriz viável de algum tipo na área de defeito, juntamente com áreas de cartilagem tibial medial, demonstra a resposta anabólica. Os resultados de marcação de BRDU indicam respostas proliferativas continuadas após cessação de dosagem.

Três vezes por semana durante 3 semanas (avaliado a 6 semanas após a cirurgia) O tratamento com 1, 3 ou 10 yg de FGF-18 (17OAA) administrado como 3 injeções por semana resultou num decréscimo significativo nos valores de degeneração de cartilagem tibial comparado com o controlo de solução salina 3 vezes por semana na zona 1 (animais tratados com 10 yg), zona 2 (1 ou 3 yg), e a zona 3 total (1 ou 3 yg). O tratamento com 10 yg aumentou significativamente a amplitude de degeneração de cartilagem tibial total em 24%. O tratamento com 1 ou 3 yg não diminuiu significativamente a amplitude de degeneração de cartilagem em 24% e 21% respetivamente, indicando algum efeito benéfico. Os animais tratados com 1 ou 3 yg de FGF-18 (170AA) também possuíram razões de profundidade significativamente inferiores (17% e 18% respetivamente) aos dos controlos de solução salina. O valor de osteófito tibial medial foi aumentado após tratamento com 0,3, 1, 3 ou 10 yg de FGF-18 (170AA) (13 %, 7%, 13% e 15% respetivamente) , enquanto que todas as 4 48 doses (0,3, 1, 3 ou 10 μg de FGF-18 (170AÁ) ) aumentaram significativamente a medida de osteófito (12, 18, 60 e 62. %, respetivamente. O tratamento com 10 μg aumentou significativamente o valor de degeneração cartilagem de femoral em 114%. Os valores de osso foram aumentados significativamente por tratamento com 3 (60%) ou 10 (88%) yg de FGF-18(170AA). O valor de articulação total sem fémur diminuiu significativamente por tratamento com 3 yg de FGF-18 (170AA) (13%), mas a adição do fémur ao valor da articulação total eliminou essa variação. O tratamento com 1, 3 ou 10 yg de FGF-18(170AA) aumentou significativamente a área de cartilagem viável na tibia medial (13%, 29% e 29%), e o tratamento com 3 ou 10 yg aumentou significativamente a área na tibia lateral (22% e 13%). As articulações injetadas com 3 ou 10 yg possuiam sinovite marcada a grave com reabsorção óssea subcondral aumentada e semelhante mas foram observadas variações ligeiras a moderadas em articulações tratadas com 1 yg. Os animais tratados com 1, 30 ou 10 yg de FGF-18 (170AA) possuíram marcação BRDU em numerosas áreas incluindo medula, osteófitos, meniscos, membrana sinovial, e áreas de condrogénese. Estes resultados demonstraram os efeitos anabólicos mais pronunciados de qualquer paradigma de tratamento, mas foram acompanhados de inflamação sinovial severa e reabsorção óssea subcondral aumentada.

Resultados avaliados a 9 semanas após cirurgia

Controlos não tratados (avaliados a 9 semanas após a cirurgia)

Os animais não tratados com desprendimento do menisco medial que foram terminados a 9 semanas possuíam degeneração da cartilagem tibial que foi principalmente 49 grave nos 2/3 exteriores do prato tibial e menos grave no 1/3 interior. A degeneração de cartilagem femoral foi menos grave e mais variável. Os valores foram, em geral, superiores aos em animais não tratados terminados na semana 6. Os controlos de dose única de solução salina possuíam valores de degeneração de cartilagem significativamente inferiores na zona 2 da tibia (12%) do que aqueles dos controlos de solução salina uma vez por semana (18%) . Os controlos de dose única de solução salina também possuíram uma amplitude significativamente maior de degeneração de colagénio moderada (92%). Os animais administrados com solução salina uma vez por semana possuíram uma soma significativamente inferior de degeneração de colagénio grave, marcada, moderada, e ligeira (15%), que aqueles animais de controlo de solução salina de 3 vezes por semana (22%). Estas diferenças foram relativamente menores uma vez que existiam apenas 5 ratos em cada um destes grupos e foram um resultado de variação na progressão da doença em indivíduos.

Dose única (avaliada a 9 semanas após a cirurgia, incl. 3 semanas de pós-tratamento) Não existe efeito significativo de tratamento em muitos animais administrados com uma dose única de FGF18(170AA) e terminados a 9 semanas após a cirurgia, embora algumas articulações injetadas com 10 yg possuíssem evidência de resposta anabólica na tíbia lateral.

Uma vez por semana durante 3 semanas (avaliada a 9 semanas após a cirurgia, incl. 3 semanas de pós-tratamento)

Após tratamento com 10 yg de FGF-18 (170AA) uma vez por semana, foram observados decréscimos significativos nos valores de degeneração de cartilagem na zona 1 e zone 3 total da tíbia medial em 38 e 31%. O tratamento com 0,3 yg 50 de FGF-18(170AA) reduziu significativamente os valores na zona 2 comparados com o controlo com solução salina de uma vez semanalmente. Os animais tratados com 10 μg de FGF-18 (170AA) possuiram uma amplitude de degeneração de cartilagem significativamente inferior (38%). As razões de profundidade foram reduzidas significativamente por tratamento com 10 pg de FGF-18 (170AA) (22%) . O tratamento com 3 ou 10 pg de FGF18 (170AA) aumentou significativamente e de modo idêntico os valores de osteófito (25%) , mas apenas os animais administrados com 10 pg possuiram aumentos significativos nas medidas de osteófito (53%). Existe um decréscimo significativo de 23% no valor de articulação total com fémur em animais administrados com 10 pg de FGF-18(170AA). A área de cartilagem viável foi aumentada significativamente em animais administrados com 10 pg de FGF-18 (170AA) em ambos o medial (40%) e lateral (81%) da tibia. O tratamento com 10 pg de FGF-18 (170AA) reduziu significativamente a amplitude de degeneração de colagénio grave e minima, assim como a amplitude de degeneração grave, marcada, e moderada combinada e a amplitude de grave e marcada combinada. A inflamação sinovial foi minima em articulações injetadas com 3 ou 10 pg e ausente a doses inferiores. As respostas anabólicas foram evidentes em algumas ou em todas as articulações injetadas com qualquer dose. A marcação com BRDU foi observada principalmente na medula óssea e fibroblastos dos controlos com solução salina e foi observada marcação aumentada (cartilagem e osteófitos) em articulações injetadas com 10 pg. Estes resultados indicaram que a reparação de cartilagem/respostas anabólicas continuaram para além do periodo de tratamento e que a sinovite diminuiu, embora as medidas de osteófito tenham sido comparáveis a 6 ou 9 semanas em articulações tratadas com esta dose. O beneficio de resposta à dose foi observado 51 utilizando o parâmetro de degeneração de cartilagem significativa e foi melhorada a perda de matriz grave, como medido através da degeneração de colagénio.

Três vezes por semana durante 3 semanas (avaliado a 9 semanas após a cirurgia, incl. 3 semanas de pós-tratamento) 0 valor de degeneração de cartilagem tibial total da zona 3 foi reduzido significativamente em 38% em animais administrados com 10 μg de FGF-18(170AA) como 3 injeções por semana, como comparado com o controlo com solução salina 3 vezes por semana. O tratamento com 10 yg de FGF-18 (170AA) também reduziu significativamente a amplitude de degeneração de cartilagem (48%). A razão de profundidade foi reduzida significativamente em 27% em animais tratados com 10 yg de FGF-18 (170AA) . As medidas de osteófito foram aumentadas significativamente em animais tratados com 3 (57%) ou 10 (103%) yg de FGF-18(170AA). O tratamento com 1, 3, ou 10 yg de FGF-18(170AA) aumentou significativamente a área de cartilagem viável na tibia medial (34%, 37% e 71% respetivamente), enquanto que o tratamento com 0,3 ou 10 yg de FGF-18(170AA) aumentou significativamente as áreas na tibia lateral (46% e 67%) . A amplitude de degeneração de colagénio moderada foi aumentada significativamente em animais tratados com 3 ou 10 yg de FGF-18 (170AA) , assim como foi a amplitude de degeneração ligeira e minima combinada em animais administrados com 10 yg. A sinovite moderada esteve presente em todas as articulações injetadas com 10 yg (divididas) e a sinovite minima a ligeira esteve presente naqueles administrados com 1 ou 3 yg. As respostas anabólicas foram evidentes a partir de 1 yg e mais. A marcação com BRDU foi observada principalmente em medula óssea e fibroblastos de controlos com solução salina a marcação aumentada (cartilagem e osteófitos) foi observada em articulações injetadas com 10 yg. Estes resultados 52 indicaram que a reparação de cartilagem / respostas anabólicas continuaram para além do periodo de tratamento e que a sinovite diminuiu, embora as medidas de osteófito tenham sido comparáveis como comparada com o ponto de tempo de 6 semanas. Os efeitos benéficos na perda de colagénio foram menos claros, embora existisse uma tendência definitiva para medidas menores para as áreas de perda marcada a grave. EXEMPLO 1.2: Modelo de OA em menisectomia de cão

Cadelas beagle (n=3/grupo) que possuiam menisectomia medial parcial unilateral no joelho esquerdo um mês antes do inicio do tratamento foram tratados com solução salina ou 3, 10, ou 30 μρ de FGF18(170AA) uma vez, uma vez por semana, ou três vezes por semana (divididas em doses de 1/3) durante 3 semanas para determinar os efeitos benéficos na OA estabelecida.

Após 3 semanas de tratamento, os joelhos esquerdos foram avaliados relativamente a efeitos em variações em bruto (n=3/grupo) e microscópicas (n=3/grupo) induzidas através de menisectomia e relativamente a evidência de efeitos anabólicos. Todos os cães exceto um exibiram apetite e atividade normal durante todo o estudo. Um cão (YLI8) do grupo 12 morreu antes da terminação (dia 17) devido à pneumonia de aspiração associada a anestesia repetida para injeções de articulação. As variações degenerativas típicas caracterizadas pela presença de lesões focais, bem circunscritas de degeneração de cartilagem estiveram presentes no medial da tíbia de todos os cães operados em todos os grupos. As lesões femorais foram observadas esporadicamente. 53

Todos os cães apresentaram um espessamento da cápsula de articulação medial mínimo. 0 dano do menisco (aproximadamente 1/2 ausente em necropsia com geralmente reparação ausente a moderada) foi semelhante em todos os grupos. A avaliação microscópica revelou que joelhos não tratados e tratados com veículo frequentemente tiveram hipertrofia da cartilagem com clonagem na zona 1 de níveis 1 e 2. Os efeitos anabólicos definitivos (clonagem aumentada, celularidade, e manchamento com proteoglicano em áreas de lesão) foram observados em joelhos tratados com 30 μg de FGF-18 (170AA) (10 μg três vezes por semana), e estas variações foram principalmente identificáveis nos côndilos femorais. Foram observados efeitos anabólicos menores, mas ainda convincentes em some joelhos tratados 3 vezes por semana com as doses menores de FGF-18(170AA), ou em joelhos tratados com 30 ou 10 μg uma vez por semana. Quando presentes, estes FGF-18(170AA) induziram variações que foram geralmente no 1/3 a 1/2 superior da cartilagem ou em matriz adjacente a fissuras profundas.

Os resultados deste estudo demonstraram efeitos anabólicos definitivos de tratamento i.a. com 10 yg de FGF18(170AA) 3 vezes por semana (30 yg total/semana) em todos os joelhos e efeitos menores em alguns joelhos tratados com doses inferiores 3 vezes por semana ou com 30 ou 10 yg uma vez por semana. As variações consistiram em clonagem, síntese de proteoglicano aumentada no 1/3 a 1/2 superior da cartilagem ou na matriz adjacente às fissuras. Foram observadas variações proliferativas moderadas na zona marginal em some articulações mas não existiram variações excessivas semelhantes àquelas que ocorreram em ratos. As variações anabólicas na cartilagem articular foram maiores do que as variações anabólicas em zonas marginais em todos 54 os casos. As medidas de dano de colagénio também sugeriram alguma proteção da integridade da matriz. EXEMPLO 1.3: Modelo de ligamento cruciforme anterior de cão (ACL)

Para as investigações em osteoartrite progressiva grave, o modelo de ligamento cruciforme anterior de cão (ACL) é utilizado para investigações farmacológicas pré-clinicas, incluindo a avaliação de MRI no final do tratamento e em acompanhamento. Este modelo providencia dados de eficácia (histopatológica e MRI com o tempo e em acompanhamento) juntamente com dados em função através de análise do modo de caminhar.

Utilizando um MRI de leitura não-invasiva já no final do tratamento foi demonstrável um decréscimo nas lesões de cartilagem comparado com a linha de base saudável (-13,3, -7,5, -9,3 e —8,8 para veiculo, 3 μg/ articulação, 10 μg/articulação e 30 μg/articulação, respetivamente). Também é demonstrável uma melhoria funcional medida através da análise do modo de caminhar em placa de força no final da terapia: A análise do modo de andar foi realizada utilizando uma medida de pressão/força na base de plataforma (Sistema Matscan®, Tekscan Inc, Boston, MA, USA).

Procedimentos de aquisição de marcha O Sistema Matscan® compreende 4 disposições de piso para caminhar, cada um possuindo 2,288 elementos sensíveis incluindo uma área sensível de 432 mm X 368 mm, produzindo uma resolução espacial de 1,4 elementos sensor/cm2. Este dispositivo foi calibrado com um peso predefinido no início do estudo e foi utilizada a mesma calibração para todos os cães ao longo do estudo. 55

Para o membro traseiro induzido com osteoartrite, a força vertical de pico e a área de contacto foram adquiridas a uma velocidade de marcha de trote variando desde 1,9 até 2,2 metros/segundo. A velocidade foi assegurada utilizando um cronómetro. A janela de aquisição de marcha foi de 3 segundos com uma velocidade de amostragem fixada a 44 hertz, produzindo um total de 132 imagens. Foram obtidos os 5 primeiros ensaios válidos para cada cão e em seguida foi calculada a média para caracterizar o perfil do cão a um dado ponto no tempo. A força vertical de pico foi expressa em percentagem de peso corporal (%PC) e a área de contacto foi expressa em centímetros quadrados (cm2) .

Com respeito à força vertical de pico do membro posterior induzido com adquirido no trote, o modelo de osteoartrite canina produziu um modo de caminhar anormal (semana 4) discernível relativamente aos valores pré-operatórios (linha de base) . A força vertical de pico e a área de contacto foram reduzidas em 4 e 8 semanas após a cirurgia à medida que foram observadas variações negativas em todos os grupos (Tabelas 3 & 4) . Houve, no entanto, uma tendência para os cães no Grupo IV a 8 semanas após a cirurgia possuirem uma redução menos severa comparada com a linha de base vis-à-vis com outros grupos. 56 TABELA 3

Força Vertical de Pico Adquirida No Trote (Evento Dinâmico) Para 0 Membro Posterior Induzido Com Osteoartrite

Grupo Animais Força vertical picoA (n)

Semana 4 Semana 8 (%PC)b (%PC)b OA: placebo 8 -37,34 ± 5,68 -27,45 ± 3,90 controlo

II FGF-18: 3 8 -34,84 ± 3,65 -22,08 ± 2,87 μg/articulação

III FGF-18:10 8 -36,59 ± 3,14 -25,11 ± 3,03 yg/articulação

IV FGF-18:30 8 -32,28 ± 3,05 -15,71 ± 1,85 μg/articulação a. Os valores apresentados são Média ± SEM. Os valores são as variações sobre a linha de base. b. Os valores são expressos em percentagem de peso corporal (%PC). TABELA 4 Área de Contacto Adquirida No Trote (Evento Dinâmico) Para 0 Membro Posterior Induzido Com Osteoartrite

Grupo Animais (n) Área de Semana (cm2)b : ( 4 0ontactoA Semana (cm2) b 8 I OA: placebo de controlo 8 -11,17 ± 2,61 -7,11 ± 1,55 II FGF-18:3 yg/articulação 8 -11,50 ± 1,41 -4,95 ± 0,78 III FGF-18:10 yg/articulação 8 -10,45 ± 1,63 -4,92 ± 1,47 IV FGF-18:30 yg/articulação 8 -10,22 ± 1,52 -3,90 ± 0,93 a. b.

Os valores apresentados são Média ± SEM. Os valores são as variações sobre a linha de base.

Os valores são expressos em centímetros quadrados (cm2) . 57

Os resultados da farmacologia in vitro demonstraram atividade específica em condrócitos (proliferação e regeneração de cartilagem/síntese de colagénio) e a ausência de efeitos adversos tais como a proliferação de leucócitos ou libertação de citoquina por diferentes tipos de células após exposição a FGF-18(170AA). EXEMPLO 1.4: Investigações utilizando FGF18 radiomarcado com [3H]-FGF18

Os níveis de radioatividade encontrados na articulação do joelho após a administração intra-articular de [3H]-FGF18 são apresentados na tabela 5 (como concentrações de radioatividade total, expressas como ng equivalentes/g) e na tabela 6 (expressas as percentagens de dose administrada); nas tabelas são apresentados os níveis de radioatividade determinados nas articulações tratadas analisadas quer com articulação intacta do joelho e após a recolha doe fluido sinovial. Os parâmetros farmacocinéticos correspondentes na articulação joelho, quer com ou sem o fluido sinovial, são apresentados na tabela 7. TABELA 5

As concentrações de radioatividade total na articulação do joelho após uma única administração intra-articular de [3H]-AS902330 a um nivel de dose objetivo de 0,24 mg/kg para ratos machos. Os resultados são expressos como ng equivalentes/g.

Amostra Tempo Grupo 4 articulação completa Grupo 3 sem fluido sinovial Razão sem fluido sinovial/ articulação completa ARTICULAÇÃO DO JOELHO 15 m 26037 11740 0,45 1 h 13320 9086,7 0,68 4 h 15270 9664,1 0,63 24 h 6167,9 4054,3 0,66 48 h 3376,3 1450,8 0,43 58 TABELA 6

Recuperação de radioatividade total da articulação do após uma administração única intra-articular de [3H]-AS902330 a um nivel de dose objetivo de 0,24 mg/kg para ratos machos. Os resultados são expressos % de dose administrada.

Amostra Tempo Grupo 4 articulação completa Grupo 3 sem fluido sinovial Razão Sem fluido sinovial/ articulação completa ARTICULAÇÃO DO JOELHO 15 m 87,87 66, 23 0,75 1 h 78,43 67,39 0,86 4 h 70,94 40,92 0,58 24 h 28,62 14,09 0,49 48 h 21,61 8,29 0,38 TABELA 7

Parâmetros de exposição sistémica de radioatividade total na articulação do joelho após uma administração única intra-articular de [3H]-AS902330 nível de dose objetivo de 0,24 mg/kg para ratos machos.

Grupo 3 Sem fluido Grupo 4 articulação completa Razão Sem fluido sinovial/ articulação completa Cmax (ngeq/g) 11740 26037 0,45 Intervalo da regressão 4-48 4-48 tl/2,z (h) 16 20 AUC(0-tlast) (ngeq.h/g) 242116 393063 0,62 AUC (0-“Ú (ngeq.h/g) 275787 492380 0,56

Os niveis de radioatividade total na articulação tratada declinou de modo bifásico, com um tempo de meia-vida terminal de 20 horas. Foi obtido um valor comparável tomando em consideração toda a articulação sem fluido sinovial (16 horas). Em geral, os resultados indicaram que a radioatividade total distribuída fora do fluido sinovial nos tecidos da articulação do joelho. Os resultados obtidos após análise de autoradioluminografia das articulações do joelho tratadas mostraram que a maioria da radioatividade estava localizada em estreita proximidade com a articulação. 59

Os resultados das análises de autoradioluminografia de corpo completo após administração intravenosa e administração intra-articular de [3HJ-FGF18 são apresentados na tabela 8 e na tabela 9, respetivamente. As concentrações de radioatividade total em tecidos e órgãos são expressos como ng equivalentes/g (Média ± SD). TABELA 8

Concentrações de radioatividade total após uma administração intravenosa única de [3H]-AS902330 a um nivel de dose nivel de dose objetivo de 0,24 mg/kg para ratos machos. (Grupo 1). Os resultados são expressos como ng equivalentes/g (Média ± DP). 0,25 h 1 h 4 h 24 h 48 h TECIDO média D.P média D.P média D.P média D.P média D.P Glândulas Suprarrenais 3890 2410 480 20 180 Sangue 110 50 Medula óssea 460 120 790 210 420 90 Rim 1170 400 770 180 440 220 Fígado 1210 260 560 110 310 150 Pulmão 200 90 150 40 Pâncreas 210 40 220 60 80 20 Glândulas salivares 220 111 270 50 111 30 Baço 690 260 440 30 260 40 Testículo 90 20 Timo 280 50 170 * NQ: Não quantificável (abaixo do limite de quantificação) TABELA 9

Concentrações de radioatividade total após uma administração intra-articular única de [3H]-AS902330 a um nivel de dose objetivo de 0,24 mg/kg para ratos machos. (Grupo 2). Os resultados são expressos como ng equivalentes/g (Média ± DP). 60 60 0,25 h 1 h 4 h 24 h 48 h TECIDO Média D.P Média D.P Média D.P Média D.P Média D.P Glândula suprarrenal Msdula óssea 170 190 20 Rim 120 20 90 20 90 30 Fígado 60 0, .0 70 10 70 20 Pâncreas Glândulas salivares Eaço 90 20 Timo Articulação do joelho 10720 57940 4128 2448 1184 4230 NQ: Não quantificáve (abaixo do limite de quantificação)

Após a administração intravenosa a radioatividade total no sangue e no soro atingiu o valor mais elevado a 4 horas e 24 horas após a administração, no soro e no sangue, respetivamente. O tempo de meia vida medido no soro foi de cerca de 55 horas. Após a administração intra-articular as médias de radioatividade total aumentaram lentamente atingindo a concentração mais elevada a 24 e 48 horas após a administração, no soro e no sangue, respetivamente. A exposição sistemática foi de aproximadamente 20% daquela encontrada após a administração intravenosa. circulante estava A radioatividade total no soro foi em média superior que no sangue, sugerindo que o composto precursor e/ou os seus metabolitos possuiam uma afinidade pequena para as células do sangue e a radioatividade principalmente distribuída no soro. 61

Os níveis de radioatividade total na articulação tratada diminuíram de forma bifásica com um tempo de meia vida terminal de 20 horas. Em geral, os resultados indicaram que a radioatividade total se distribuiu no exterior do sinovial fluido na articulação do joelho.

Em geral, com base nos modelos de farmacologia não-clínica de rato e cão, foi descoberto que um regime de dosagem particularmente adequado é uma vez por semana durante três semanas. A dose efetiva observada varia desde 3-30 yg/articulação. EXEMPLO 2: Exemplos dos compostos FGF-18 da invenção

As sequências dos compostos FGF-18 preferidos da invenção são dadas numa listagem de sequências aqui adiante.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> <120> TRATAMENTO DE PATOLOGIAS DA CARTILAGEM <130>1134 <160> 5 <170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211> 624 <212> ADN <213> Homo sapiens 62 <400> 1 atgtattcaq cgccctccgc ctgcacttge ctgtgtttac acttcctgct gctgtgcttc 60 caggtacagg tgctggttgc cgaggagaac gtggacttcc gcatccacgt ggagaaccag 120 acgcgggctc gggacgatgt gagccgtaag cagctgcggc tgtaccagct ctacagecgg 180 accagtggga aacacatcca ggtcctgggc cgcaggatca gtgcccgcgg cgaggatggg 240 gacaagtatg cccagctcct agtggagaca gacaecttcg gtagtcaagt ccggatcaag 300 ggcaaggaga cggaattcta cctgtgcatg aaccgcaaag gcaagctcgt ggggaagccc 360 gatggcacca gcaaggagtg tgtgttcatc gagaaggttc tggagaacaa ctacacggcc 420 ctgatgtcgg ctaagtactc cggctggtac gtgggcttca ccaagaaggg gcggccgcgg 480 aagggcccca agacccggga gaaccagcag gaegtgcatt tcatgaagcg ctaccccaag 540 gggcagccgg agettcagaa gcccttcaag tacacgacgg tgaccaagag gtcccgtcgg 600 atccggccca cacaccctgc ctag 624

<210> 2 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 mt Tyr Set Ala Fro S«r Ala Cys thz Cys Leu Cyg Leu ma Hw* Leu 1 5 10 15

Leu Im Cys Fhe Gin Vai Gin vai leu vai Ma Gi« Glu Aan Vai Asp 20 25 30

Phe Arg Xle His vai Glu km Gin %x kxq Ala Arg Asp· Asp Vai ser 35 40 45 ktq 1*· Gla Arg Léa Tyr Gin Leu Ty* Ser Arg Thx Sèr Gly Lys 50 SS S0

Hia 11® ei» Vai Leu Gly Arg Axg Ile Ser Ala. htq Gly glu Asp Gly 55 70 75 8Ô 63

Asp Lys Tyr Ala Gin Lee Leu Vai Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gin 85 90 95 vai Arg lie Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys «et Asa Arg 100 105 H0 Lys Gly Lys Leu Vai i Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cy® Vai 1X5 130 12:5 Phe Ile Glu Lys Vai Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala 130 135 140 Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Vai Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 145 150 155 ISO Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gin Gin Asp Vai HÍ3 Phe Met Lys 155 170 175 Arg Tyr Pro Lys Gly Gin Pro Glu Leu Gin Lys Pro Phe Lys Tyr Thr 180 185 190 Thr Vai Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr HiS Pro Ala 135 200 205

<210> 3 <211> 624 <212> ADN <213> Mus musculus <4Ο0> 3 atgtafctueg cgccetccgc ctgeaottge ctgtgtttac aottfectact gctgtgcttc €0 eaggiiuagg tgttggoagc egaggagaat gtggacfctcc gcãtccaegt ggagaaccag 120 actjegggcfcc gágáfcgaLgt gágteggasg eâgetgegct tgfcaeeaget etatageagg 180 «ceagtggga âgcacatftc^ agfcçefcggge cgteggatce gtgçèègtgg çgaggàçggg 24Ô g&caagfcafcg eccagctcct agtggagaua gatacctteg ggagtéáagt ecggatcôag 300 ggeaaggsga «ag&attçta cètgtgtstg aaeegaaaag Gcàagefccgt gçggaagcct 380 gâtggtscts fcesggâgtg egfegttcâtfc gagaaggttc tggâãsacas etecaeggce .420 etgâtgtefcg ccââgtácfcc fcggfctegtet gtgggctfcca eeaagaaggg gcggcctegc 480 aagggtccca agacccgcga gaaceagcaa gatgtacacfc fce&tgaagcg tfcaceccaag S40 64 ggacaggccg agetgcagaa gcccttcaaa tacaccacag tcaccaagcg atcccggcgg 600 atccgcccca ctcaccccgg ctag 624 <210> 4 <211> 207 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 4

Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu 15 10 15

Leu Leu Cys Phe Gin Vai Gin Vai Leu Ala Ala Glu Glu Asn Vai Asp 20 25 30

Phe Arg Ile His Vai Glu Asn Gin Thr Arg Ala Arg Asp Asp Vai Ser 35 40 45

Arg Lys Gin Leu Arg Leu Tyr Gin Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys 50 55 60

His Ile Gin Vai Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly 65 70 75 80 155

Asp Lys Tyr Ala Gin Leu Leu Vai 85

Vai Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr 100

Lys Gly Lys Leu Vai Gly Lys Pro 115 120

Phe Ile Glu Lys Vai Leu Glu Asn 130 135

Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Vai Gly 145 150

Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gin 90 95

Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg 105 110

Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Vai 125

Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala 140

Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 160 65

Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gin Gin Asp Vai His Phe Met Lys 165 170 175

Arg Tyr Pro Lys Gly Gin Ala Glu Leu Gin Lys Pro Phe Lys Tyr Thr 180 185 190

Thr Vai Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Gly 195 200 205 <210> 5 <211> 170 <212> PRT <213> Artifici al <220> <223> FGF18 (17 0AA) <4 0 0> 5 Met Glu Glu Asn Val Asp Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gin Thr Arg 1 5 10 15

Ala Arg Asp Asp Vai Ser Arg Lys Gin Leu Arg Leu Tyr Gin Leu Tyr 20 25 30

Ser Arg Thr Ser Gly Lys His Ile Gin Vai Leu Gly Arg Arg Ile Ser 35 40 45

Ala Arg Gly Glu Asp Gly Asp Lys Tyr Ala Gin Leu Leu Vai Glu Thr 50 55 60

Asp Thr Phe Gly Ser Gin Vai Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe 65 70 75 80

Tyr Leu Cys Met Asn Arg Lys Gly Lys Leu Vai Gly Lys Pro Asp Gly 85 90 95

Thr Ser Lys Glu Cys Vai Phe Ile Glu Lys Vai Leu Glu Asn Asn Tyr 100 105 110 6 6

Thr Ala Leu Met Ser Ala Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Vai Gly Phe Thr 115 120 125 Lys Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gin Gin 130 135 140 Asp Vai His Phe Met Lys Arg Tyr Pro Lys Gly Gin Pro Glu Leu Gin 145 150 155 160 Lys Pro Phe.Lys Tyr Thr Thr Vai Thr Lys 165 170

Lisboa, 10 de Setembro de 2012

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto FGF-18 para utilizar no tratamento de uma patologia cartilagem em que o composto FGF-18 é para ser administrado durante pelo menos 3 semanas consecutivas por ciclo de tratamento, sendo as referidas administrações separadas por cerca de pelo menos 6, 7 ou 8 dias.

2. 0 composto FGF-18 para utilizar de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas administrações são separadas por cerca de 7 dias cada.

3. 0 composto FGF-18 para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o composto FGF-18 é para ser administrado durante 3 semanas consecutivas ou 4 semanas consecutivas por ciclo de tratamento.

4. 0 composto FGF-18 para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que os ciclos de tratamento são repetidos após 2, 4, 6 ou 8 meses.

5. 0 composto FGF-18 para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ciclos de tratamento por ano.

6. 0 composto FGF-18 para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o composto FGF-18 é para ser administrado intra-articularmente.

7. 0 composto FGF-18 para utilizar de acordo com reivindicação 6, em que o composto FGF-18 é para ser administrado numa dose de 1-100 mcg, preferencialmente 5-40 mcg, preferencialmente 10-30 mcg por administração intra-articular única.

8. O composto FGF-18 para utilizar de acordo com a reivindicação 7, em que o composto FGF-18 é para ser 2 administrado numa dose de cerca de 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 mcg por administração intra-articular única do composto FGF-18.

9. 0 composto FGF-18 para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o composto FGF-18 é para ser administrado intravenosamente numa dose de 50-200 mcg/kg, preferencialmente 80-120 meg/kg por administração intravenosa única do composto FGF-18.

10. 0 composto FGF-18 para utilizar de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que a patologia da cartilagem é a osteoartrite.

11. O composto FGF-18 para utilizar de acordo com a reivindicação 10, em que a osteoartrite é classificada quer como osteoartrite ligeira a moderada, fase II ou fase III OARSI, osteoartrite progressiva grave ou e/ou fase IV OARSI.

12. O composto FGF-18 para utilizar de acordo com reivindicação 10 ou 11, em que a osteoartrite é osteoartrite do joelho ou osteoartrite da anca, tal como a osteoartrite da anca secundária.

13. O composto FGF-18 para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, em que a patologia da cartilagem é trauma da cartilagem.

14. O composto FGF-18 para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o composto GF-18 é selecionado a partir da forma madura FGF-18 humana que compreende resíduos 28-207 da SEQ ID NO:2 ou FGF-18(170AA).

15. O composto FGF-18 para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o composto GF-18 3 é para ser administrado uma vez por semana durante três semanas. Lisboa, 10 de Setembro de 2012