KR20120029472A - 중간엽 줄기 세포 분화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 관절염 또는 관절 손상을 치료 또는 예방하는 방법, 및 그러한 용도의 조성물을 제공한다.

Description

중간엽 줄기 세포 분화{MESENCHYMAL STEM CELL DIFFERENTIATION}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 35 U.S.C.§ 1.119(e)하에 2009년 7월 14일에 출원된 미국 가출원 제61/225,293호의 이점을 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

골관절염 (OA)은 가장 보편적인 근골격 질병이다. 현재 대략 4천만명의 미국인들이 상기 질병을 앓고 있으며, 노령화 인구 및 기대 수명 증가의 결과로서 상기 수치는 향후 20년 이내에 6천만명으로 증가할 것으로 예상되며, 이는 또한 장애의 주된 원인 4위를 차지하고 있다. OA는 (관절을 위해 윤활 및 완충 작용을 하는 세포 및 기질을 함유하는) 관절 연골 및 관절 연골의 기초가 되는 연골하 골, 이 둘 모두를 포함하는 관절의 느린 퇴행성 파괴를 특징으로 한다. 현 OA 치료법으로는 경구용 NSAID 또는 선택적 시클로옥시게나제 2 (COX-2) 억제제를 이용한 통증 완화법, 제제, 예를 들어, 코르티코스테로이드 및 히알루로난을 이용한 관절내 (IA) 주사법, 및 외과적 접근법을 포함한다.

중간엽 줄기 세포 (MSC)는 성인 관절 연골에 존재하며, 단리시 상기 세포는 시험관내에서 연골세포 및 다른 중간엽 세포 계열로의 분화가 일어날 수 있도록 프로그래밍될 수 있다. 이는 부분적으로는 성장 인자 (TGFβ, BMP), 혈청 조건, 및 세포-세포 접촉에 의해 조절된다.

발명의 간단한 개요

본 발명은 포유동물에서 관절염 또는 관절 손상을 완화시키거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 포유동물의 관절에 서열 1 또는 25와 적어도 95%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유효량으로 포함하는 조성물을 투여하여 포유동물에서 관절염 또는 관절 손상을 완화시키거나 예방하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 개체는 관절염 또는 관절 손상을 앓는 개체이다. 일부 실시양태에서, 개체는 관절염 또는 관절 손상을 앓고 있지는 않지만, 그러한 위험이 있는 개체이다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 1 또는 25를 포함한다.

일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28과 적어도 95%의 동일성을 가진다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28을 포함한다.

일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 5-24 중 임의의 것과 적어도 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 5-24 중 임의의 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 관절염은 골관절염, 외상 관절염, 및 자가면역 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 추가로 히알루론산을 포함한다.

본 발명은 또한 중간엽 줄기 세포의, 연골 기질을 형성하는 연골세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화를 유도하기에 충분한 양의, 서열 1 또는 25와 적어도 95%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 중간엽 줄기 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생체내에서 수행되고, 줄기 세포는 포유동물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 1 또는 25이다.

일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28과 적어도 95%의 동일성을 가진다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28을 포함한다.

일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 5-24 중 임의의 것과 적어도 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 5-24 중 임의의 것을 포함한다.

본 발명은 또한 관절내 전달 및 전신 전달용의 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 서열 1 또는 25와 적어도 95%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제약 유효량으로 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 조성물은 추가로 히알루론산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 1 또는 25를 포함한다.

일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28과 적어도 95%의 동일성을 가진다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28을 포함한다.

일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 5-24 중 임의의 것과 적어도 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 5-24 중 임의의 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 특징, 이점, 및 실시양태는 하기의 상세한 설명, 및 특허청구범위를 숙고함으로써 그를 통해 설명될 수 있거나, 그로부터 자명해질 것이다. 또한, 상기 본 발명의 요약과 하기의 상세한 설명, 둘 모두는 예시적인 것이며, 청구하는 본 발명의 범주를 제한하지는 않고, 추가로 설명하고자 하는 것임을 이해하여야 한다.

정의

"펩티도모방체" 및 "모방체"라는 용어는 천연적으로 또는 비-천연적으로 발생된 폴리펩티드 (예를 들어, ANGPTL3)와 구조상 또는 기능상의 특징이 실질적으로 동일한, 합성 화학적 화합물을 의미한다. 펩티드 유사체는 보통 제약 산업에서 주형 펩티드의 특성과 유사한 특정을 가진 비-펩티드 약물로서 사용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물이 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도모방체"라고 명명된다 (문헌 ([Fauchere, J. Adv . Drug Res. 15:29 (1986)]; [Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985)]; 및 [Evans et al., J. Med . Chem. 30:1229 (1987)]) (상기 문헌들이 본원에 참고로 포함된다)). 치료학상 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 등가의 또는 증진된 치료학상 또는 예방학상 효과를 일으키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 예를 들어, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드에서 발견되는, 패러다임 폴리펩티드 (즉, 생물학상 또는 약리학상 활성을 가진 폴리펩티드)와 구조적으로는 유사하지만, 임의로 예를 들어, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-로 이루어진 군으로부터 선택된 결합에 의해 치환된 하나 이상의 펩티드 결합을 가진다. 모방체는 전체적으로 합성의 비-천연 아미노산 유사체로 구성된 것일 수 있거나, 또는 부분적으로 천연 펩티드 아미노산이고, 또 부분적으로는 비-천연 아미노산 유사체인 키메라 분자이다. 모방체는 또한 치환이 모방체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 한, 그러한 천연 아미노산의 보존적 치환을 임의량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 모방체 조성물이 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 활성 중 적어도 하나를 수행할 수 있다면, 이 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.

"폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 천연적으로 발생된 아미노산 중합체 및 비-천연적으로 발생된 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연적으로 발생된 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다.

"아미노산"이라는 용어는 천연적으로 발생된 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체도 의미한다. 천연적으로 발생된 아미노산으로는 유전자 코드에 의해 코딩된 것 뿐만 아니라, 추후 변형된 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-세린이 있다. 아미노산 유사체란 천연적으로 발생된 아미노산과 기본 화학적 구조가 동일한 화합물, 즉, 수소, 카르복실 기, 아미노기, 및 R기에 결합한 α 탄소를 가진 화합물, 즉, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 의미한다. 상기 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 공통된 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린)과, 피롤리신 및 셀레노시스테인이다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열, 둘 모두에 적용된다. 특히 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나, 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않을 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 기능상 동일한 핵산 다수가 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU, 이들 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 구체화되는 모든 위치에서 상기 코돈은, 코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않는 것으로 기술된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이를 "침묵 변이"라고 하는데, 이는 보존적으로 변형된 변이 종들 중 하나이다. 본원에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열이 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산 중의 각 코돈 (단, 보통 메티오닌에 대한 유일의 코돈인 AUG, 및 보통 트립토판 대한 유일의 코돈인 TGG는 제외)의 변형을 통해 기능상 동일한 분자가 형성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각각의 기술된 서열에 포함된다.

아미노산 서열과 관련하여, 당업자는, 코딩된 서열 중에서 단일 아미노산을 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 부가, 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에의 개별 치환, 결실, 또는 부가는, 그러한 변경을 통해 아미노산이 화학상 유사한 아미노산으로 치환된 것인 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 이해할 것이다. 기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환에 관한 표는 당업계에 주지되어 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형태 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자 이외의 것이며, 이를 배제시키지는 않는다.

하기 8개의 군은 각각 서로 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌 (A), 글리신 (G);

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 리신 (K);

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);

6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);

7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및

8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)]).

"서열 동일성(%)"은 비교 윈도우에 대해 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 측정되는데, 여기서, 비교 윈도우 중 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열이 최적으로 정렬될 수 있도록 하기 위해, 부가 또는 결실을 포함하지 않는 참조 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드)과 비교하였을 때 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 양쪽 두 서열 모두에서 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 동일한 위치의 개수를 측정하여 매치되는 위치의 개수를 얻고, 매치되는 위치의 개수를 비교 윈도우에 존재하는 전체 위치의 개수를 나누고, 이에 100을 곱하여 서열 동일성(%)을 얻음으로써 동일성(%)을 계산할 수 있다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한," 또는 "동일성(%)"이라는 용어는 동일 서열인 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 의미한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 비교하는 바, 두 서열을 비교 윈도우, 또는 지정된 영역에 대해 비교하여 최대로 일치하도록 정렬시켰을 때, 두 서열 간에 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 명시된 비율로 존재하는 (즉, 명시된 영역, 또는 명시되지 않는 경우, 전체 서열에 대해 60% 동일성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성) 두 서열은 "실질적으로 동일한" 것이다. 본 발명은 본원에서 예시된 각각의 폴리펩티드 (예를 들어, 서열 1-28 중 어느 서열)와 실질적으로 동일한 폴리펩티드 뿐만 아니라, 관절염 또는 관절 손상을 치료 또는 예방하기 위한 용도를 포함하나, 이에 한정되지 않는 그의 용도를 제공한다. 임의로, 동일성은 길이가 적어도 약 50개의 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는 길이가 100 내지 500개 또는 1,000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐, 또는 전체 길이의 참조 서열에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위해서는 전형적으로 하나의 서열이, 시험 서열의 비교 대상이 되는 참조 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 서브서열 좌표를 지정하고, 필요할 경우, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 대체 프로그램을 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열과 비교되는 시험 서열에 대한 서열 동일성(%)을 계산하게 된다.

본원에서 사용되는 바, "비교 윈도우"는 20 내지 600개, 보통 약 50 내지 약 200개, 더욱 보통 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접한 위치의 개수 중 임의의 하나의 세그먼트에 대한 참조를 포함하며, 여기서 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후, 한 서열을 동일한 개수의 인접한 위치를 가진 참조 서열과 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 널리 주지되어 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math . 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol . Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA (위스콘신 지네틱스 소프트웨어 패키지 (Wisconsin Genetics Software Package; 지네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group: 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)))), 또는 수동 정렬 및 시각적 검사 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.

서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 측정하기에 적합한 알고리즘의 2가지의 예로 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있으며, 이는 각각 문헌 ([Altschul et al., (1977) Nuc . Acids Res. 25:3389-3402], 및 [Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol . 215:403-410])에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 중 길이가 동일한 워드와 함께 정렬하였을 때, 일부 양의 값 역치 점수 T와 매칭하거나 이를 충족시키는, 의문 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써, 높은 점수의 서열쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 인접 워드 점수 역치를 나타낸다 (문헌 [Altschul et al., 상기 문헌 동일]). 이들 처음의 인접 워드 히트는 이를 함유하는 보다 긴 HSP를 찾는 연구를 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 상기 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M (매칭 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (매칭되지 않는 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 이용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 점수 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향으로 워드 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X 양만큼 벗어났을 때, 상기 누적 점수가 하나 이상의 음의 점수잔기 정렬의 축적으로 인해 0 또는 그 아래로 갔을 때, 또는 각 서열의 말단에 도달했을 때 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X가 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 워드 길이 (W) = 11, 예상치 (E) = 10, M = 5, N = -4 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 워드 길이 = 3, 및 예상치 (E) = 10, 및 BLOSUM62 점수 매트릭스 (문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 89:10915, 1989] 참조) 정렬 (B) = 50, 예상치 (E) = 10, M = 5, N = -4, 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.

BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 최소 합 확률 (P(N))이며, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 일어나는 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 시험 핵산과 참조 핵산의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 상기 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.

본원에서 사용되는 바, "히알루론산"이라는 용어는 히알루론산 에스테르, 히알루론산 염을 포함하는 히알루론산 유도체를 포함하고자 하며, 이는 또한 히알루로난이라는 용어 또한 포함한다. 상기 명칭은 또한 저분자량 및 고분자량 형태의 히알루로난, 두가지 모두와 가교결합된 히알루로난 또는 힐란도 포함한다. 그러한 히알루로난의 예로는 신비스크(Synvisc)™ (젠자임 코포레이션(Genzyme Corp.: 미국 매사추세츠주 캠브리지)), 오르토 비스크(ORTHO VISC)™ (아니카 테라퓨틱스(Anika Therapeutics: 미국 매사추세츠주 워번)), 및 히알간(HYALGAN)™ (사노피-신테라보 인코퍼레이티드(Sanofi-Synthelabo Inc.: 미국 펜실베니아주 맬번)이 있다.

도 1. 시험관내에서의 연골형성 동안 MSC -유도성 II 형 콜라겐 생산에 대한 정량적 평가. hMSC (10,000개/384 웰)를 hMSC 성장 배지 (밀리포어(Millipore)) 중에서 24시간 동안 플레이팅하였다. 추가의 72시간 동안 상기 단백질로 세포를 처리하였다. 배지를 무혈청 DMEM으로 교체하고, 임의의 추가 자극없이 추가로 14일 동안 배양하였다. 종결시, 세포를 포르말린으로 고정시키고, 세척하고, II형 콜라겐에 대한 항체로 염색하고, DAPI로 대비염색하였다. 하이 컨텐트 영상화 (오페라(Opera), 퍼킨엘머(Perkin Elmer))에 의해 II형 콜라겐의 염색량을 정량화하였다. 각 용량에 대해 이중으로 실시된 3개의 실험으로부터 얻은 데이터를 풀링하였다 (n=6).
도 2. ANGTPL3 -유도성 연골형성에 대한 특징 규명. (a) hMSC를 (명시된 바와 같이) 21일 동안 무혈청 DMEM, 1X ITS 및 ANGTPL3이 있는 펠릿 배양물 (1x10⁶개의 세포/펠릿)에서 성장시켰다. 매 3일마다 배지를 교체하였다. 인간 택맨(Taqman) 특이 프로브를 사용하면서 제조사의 설명서에 따라 아그레칸 mRNA 발현을 정량화하였다 (이중으로 실시된 3개의 실험으로부터 얻은 데이터를 풀링하였다 (n=6)). (b) 소 연골을 단리시키고, 대칭 원으로 펀칭하고, 기관 배양물 내로 넣었다. 48시간 동안 슬라이스를 20 ng/ml TNFa 및 10 ng/ml OSM (염증성 매개인자)으로 처리하여 ANGPTL3 존재 또는 부재하에서의 연골 기질 분해를 유도함으로써 기질 장애의 지표인 글리코사미노글리칸 유리의 억제율(%)을 확인하였다 (4명의 기증자로부터 얻은 데이터를 풀링하였다 (n=12)). (c) 정상적인 인간의 1차 연골세포 및 윤활막세포 (성장 배지 중 2,500개/384 웰)를 플레이팅하고, 37℃에서 24 hr 동안 배양하였다. 24 hr 동안의 기간에 걸쳐 ANGTPL3에 대한 반응으로 연골세포-특이 세포 성장이 중간 정도 증가한 것이 입증되었다 (용량당 이중으로 실시된 2개의 실험으로부터 얻은 데이터를 풀링하였다 (n=4)).
도 3. mANGPTL3 . (a) 1차 단백질 구조 및 확인된 글리코실화 부위. (b) mANGPTL3 C 말단 FLD (225-455)의 원자 구조 (1.8 Å).
도 4: ANGPTL3 서열에 대한 서열 정렬. (a) 인간, 마우스, 소, 및 개 천연 ANGPTL3 단백질에 대한 서열 정렬; (b) 인간, 마우스, 소, 개 및 말 천연 ANGPTL3 단백질에 대한 서열 정렬.
도 5. 골관절염에 대한 외과용 모델에서의 mANGPTL3 의 생체내 효능.
C57BL/6 마우스 (군당 n=12)로부터 유래된 오른쪽 무릎의 전십자인대 (ACL), 내측 반월상 경골 인대 (MMTL), 및 내측 측부 인대 (MCL)에 외과적 횡절단을 수행하여 무릎 관절의 불안정화를 유도하고, 이를 통해 OA 표현형이 나타나도록 하였다. 외과 수술 후 1주 경과하였을 때, 3-4주 동안 주 1회로 마우스에 명시되는 바와 같이 관절내로 투약하였다 (a). 외과 수술 후 28일째 말초 혈액을 수집하였다. ELISA (노르딕 바이오사이언시스(Nordic biosciences))에 의해 순환 II형 콜라겐 단편 (CTX-II)을 정량화하였다. mANGPTL3 용량 = 무릎당 200 ng씩 주 3회 주사 (b). 경골 고평부를 0-4 등급으로 정량적으로 평가하였는데, 0이 정상이고, 5가 중증 OA (연골의 전체 두께 파열)이다. 각 마우스로부터 얻은 2개의 절편을 2명의 관찰자가 맹검으로 등급화하였다. mANGPTL3 용량 = 무릎당 200 ng씩 주 3회 주사 (c). 행동불능 시험에 의해, 또는 외과 수술을 받은 다리로 서 있을 수 있는 시간 대 외과 수술을 받지 않은 다리로 서 있을 수 있는 시간의 비율을 모니터링 장치를 통해 측정함으로써 OA 통증을 측정하였다. 판독값은 수술 후 36일째의 통증 반응을 나타낸다 (명시된 농도의 ANGPTL3을 주 3회 용량으로 투약).

상세한 설명

I. 도입

본 발명은 부분적으로는, 안지오포이에틴-유사 3 (ANGPTL3)이 중간엽 줄기 세포에서 연골세포 분화를 자극시킨다는 발견 사실을 기초로 한다. 따라서, 본 발명은 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 ANGPTL3 단백질을 관절, 척추, 척추판 또는 전신에 투여하여 관절염 또는 관절 손상을 예방하거나 또는 완화시키는 ANGPTL3 단백질 투여 방법을 제공한다.

II . 안지오포이에틴 -유사 3

안지오포이에틴-유사 3은 분비된 인자들 중 안지오포이에틴-유사 패밀리의 구성원이다. 이는 간에서 지배적으로 발현되며, 신호 펩티드, N 말단 꼬인-코일 도메인 (CCD) 및 C 말단 피브리노겐 (FBN)-유사 도메인으로 구성된 특징적인 안지오포이에틴 구조를 가진다. 안지오포이에틴-유사 3 중 FBN-유사 도메인이 αV/β3 인테그린에 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 결합이 내피 세포 부착 및 유주를 유도한다.

본 발명에 따라 다양한 ANGPTL3 단백질이 사용될 수 있다. 본원에서 설명되는 바, 천연 ANGPTL3은 일반적으로 생체내에서 아미노 말단 및 카르복실 말단 단편으로 절단된다. 본 발명은 연골발생 활성을 가진 각종 ANGPTL3 단백질의 용도에 주시한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 전장의 천연 (또는 그의 변이체) ANGPTL3 단백질 아미노산 서열의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 천연 단백질의 아미노 말단 단부가 아닌, 연골발생 활성을 보유하는 (전장의 천연 서열이 아닌) ANGPTL3 서열의 일부를 포함하는 ANGPTL3 단백질, 또는 그의 변이체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 CCD 도메인을 가지지 않고/거나, 유의적인 CCD을 가지지 않는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 천연 마우스 (예를 들어, 서열 12), 인간 (예를 들어, 서열 8), 소 (예를 들어, 서열 16), 개 (예를 들어, 서열 20), 또는 말 (예를 들어 서열 24) ANGPTL3 단백질 서열의 적어도 한 단편 (예를 들어, 적어도 50, 100, 150, 200, 250개의 인접한 아미노산) 또는 실질적으로 동일한 서열을 포함하지만, 천연 ANGPTL3 단백질의 적어도 200개의 인접한 아미노 말단 아미노산은 포함하지 않는다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 피브리노겐-유사 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 천연 마우스 (예를 들어, 서열 12), 인간 (예를 들어, 서열 8), 소 (예를 들어, 서열 16), 개 (예를 들어, 서열 20), 또는 말 (예를 들어 서열 24) ANGPTL3 단백질 서열의 아미노산 207-455, 207-400, 207-350, 225-455, 225-400, 225-350, 241-455, 241-400, 241-350에 상응하는 인접한 아미노산을 포함하거나, 상기 서열과 실질적으로 동일하지만, 측면에 위치하는 천연 ANGPTL3 단백질 아미노산 서열은 포함하지 않는다. 그러나, 일부 실시양태에서, (서열 1-28 중 어느 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는) 본 발명의 ANGPTL3 단백질에는 C 말단 서열 중 적어도 일부가 존재하지 않고, 예를 들어, C 말단으로부터의 10, 20, 30, 40, 50개의 아미노산이 존재하지 않는다.

상기 기술된 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 상기 기술된 영역 측면에 위치하는 천연 ANGPTL3 단백질 서열을 포함하지 않을 수 있지만, 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 비-천연 ANGPTL3 단백질 측면 서열은 포함할 수 있다. 예를 들어, ANGPTL3 단백질의 연골발생의 활성을 띤 일부는 하나 이상의 이종성 아미노산에 융합됨으로써 융합 단백질을 형성할 수 있다. 융합 파트너 서열로는 생체내 반감기 및/또는 프로테아제 내성을 연장시킬 수 있는 아미노산 태그, 비-L (예를 들어, D-) 아미노산 또는 다른 아미노산 모방체, 표적 서열 또는 다른 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 ANGPTL3 단백질은 천연 ANGPTL3 단백질의 변이체 및 절단부 뿐만 아니라, 상기 기술된 활성 단편의 변이체 및 절단부를 포함한다. 활성 변이체는 당업자에게 공지된 다수의 방법으로 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 위치가 비변이체인지 여부, 또는 보존적 아미노산 변화를 포함하는지 여부를 확인하기 위해 활성 단백질의 아미노산 정렬을 확립할 수 있다. 서열 1, 2, 3, 또는 4는 인간, 마우스, 소, 및 개 천연 ANGPTL3 단백질의 특정 영역 사이에 비변이체를 포함하는 컨센서스 서열 (각각 위치 241-455, 225-455 및 207-455, 천연 전장의 것)을 나타낸다. 서열 25, 26, 27, 또는 28은 인간, 마우스, 소, 개, 및 말 천연 ANGPTL3 단백질의 특정 영역 사이에 비변이체를 포함하는 컨센서스 서열 (각각 위치 241-455, 225-455 및 207-455 및 천연 전장의 것)을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 연골발생 ANGPTL3 단백질은 서열 1, 2, 3, 4, 25, 26, 27, 또는 28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 연골발생 ANGPTL3 단백질은 (서열 길이 전역을 따라 측정한 바) 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 중 어느 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 ANGPTL3 단백질은 연골발생 활성을 가진다. 본원에서 정의되는 바, 연골형성 또는 연골발생 활성이란 MSC로부터 연골세포가 발생되는 것을 의미한다. 연골발생 활성에 대한 지표로는 연골 기질 생산을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 연골 기질 생산은 각종 마커, 예를 들어, Sox9, II형 콜라겐, 또는 글리코사미노글리칸 (GAG) 생산에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, GAG 생산은 연골 기질 생산에 대한 마커로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 연골 특이 단백질 발현과 함께 GAG 생산이 3배 증가하였다면, 이는 양성의 연골 기질 생산을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 폴리펩티드는 적어도 하나의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함할 것이다. 비-천연적으로-발생된 아미노산을 제조하고, 이를 단백질 내로 도입하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,083,970호; 및 제7,524,647호를 참조한다. 하나 이상의 원하는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 제조하는 데 적합한 오르소고날 번역 시스템을 생산하는 일반 원리는, 오르소고날 번역 시스템을 생산하는 일반적인 방법과 같이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, (국제 공개 공보 번호 WO 2002/086075 (발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); WO 2002/085923 (발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)": WO 2004/094593 (발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); WO 2005/019415 (2004년 7월 7일 출원); WO 2005/007870 2004년 7월 7일 출원); WO 2005/007624 (2004년 7월 7일 출원); WO 2006/110182 (2005년 10월 27일 출원, 발명의 명칭: "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); 및 WO 2007/103490 (2007년 3월 7일 출원, 발명의 명칭: "SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS"))을 참조한다. 이들 각각의 출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 비천연 아미노산을 포함하는 오르소고날 번역 시스템, 및 그의 생산 방법 및 용도에 관한 논의에 대해서는 또한 문헌 ([Wang and Schultz, (2005) "Expanding the Genetic Code." Angewandte Chemie Int Ed 44: 34-66]; [Xie and Schultz, (2005) "An Expanding Genetic Code." Methods 36: 227-238]; [Xie and Schultz, (2005) "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire." Curr Opinion in Chemical Biology 9: 548-554]; 및 [Wang, et al., (2006) "Expanding the Genetic Code." Annu Rev Biophys Biomol Struct 35: 225-249]; [Deiters, et al., (2005) "In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli." Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15: 1521-1524]; [Chin, et al., (2002) "Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli." J Am Chem Soc 124: 9026-9027]; 및 국제 공개 공보 번호 WO 2006/034332 (2005년 9월 20일 출원)) (상기 출원 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)를 조한다. 추가의 상세한 설명은 미국 특허 번호 제7,045,337호; 제7,083,970호; 제7,238,510호; 제7,129,333호; 제7,262,040호; 제7,183,082호; 제7,199,222호; 및 제7,217,809호에서 살펴볼 수 있다.

"비-천연적으로 코딩된 아미노산"이란 공통된 아미노산, 또는 피로리신 또는 셀레노시스테인 중 하나가 아닌 아미노산을 지칭한다. "비-천연적으로 코딩된 아미노산"이라는 용어와 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어로는 "비-천연 아미노산," "비천연 아미노산," "비-천연적으로-발생된 아미노산," 및 그의 여러가지 방식으로 하이픈으로 연결된 형태 및 하이픈이 붙지 않은 형태의 버전이 있다. "비-천연적으로 코딩된 아미노산"이라는 용어는 또한 (20종의 공통된 아미노산, 또는 피롤리신 및 셀레노시스테인을 포함하나, 이에 한정되지 않는) 천연적으로 코딩된 아미노산의 변형 (예를 들어, 번역 후 변형)에 의해 발생되지만, 천연적으로는 그 자체가 번역 복합체에 의해 성장 폴리펩티드 내로 도입되지는 않는 것인 아미노산도 포함한다. 그러한 비-천연적으로-발생된 아미노산의 예로는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌, 및 O-포스포티로신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

비-천연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로는 20종의 천연 아미노산에서 사용되는 것 이외의 다른 임의의 치환기 측쇄를 가진 임의의 구조체이다. 본 발명의 아미노산은 전형적으로 단지 측쇄 구조에 있어서만 천연 아미노산과 차이를 보이는데, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 이들이 천연적으로 발생된 폴리펩티드에서 형성되는 방식과 동일한 방식으로 천연 또는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 천연 아미노산과는 구별되는 측쇄 기를 가진다. 예를 들어, R은 임의로 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 술포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노기 등, 또는 그의 임의 조합을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는, 관심의 대상이 되는 다른 비-천연적으로 발생된 아미노산으로는 광활성화가 가능한 가교제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지된 아미노산, 형광성 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속-함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규한 관능기를 가진 아미노산, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이지형(photocaged) 및/또는 광이성질화가 가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예를 들어, 당 치환된, 다른 당질 변형된 아미노산, 케토-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자 치환형 아미노산, 화학적으로 절단이 가능한 및/또는 광절단이 가능한 아미노산, 천연 아미노산과 비교하여 신장된 측쇄 (폴리에테르를 포함하나, 이에 한정되지 않음) 또는 장쇄 탄화수소 (약 5개 초과 또는 약 10개 초과의 탄소를 가진 탄화수소를 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 가진 아미노산, 탄소-연결형 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있고, 수용성 중합체와의 반응에 유용한 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 예로는 카르보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카르바지드, 아지드 및 알킨 반응기를 가진 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 당류 부분을 포함한다. 상기 아미노산의 예로는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 상기 아미노산의 예로는 또한 아미노산과 당류 사이의 천연적으로-발생된 N- 또는 O-결합이 자연 상태에서는 통상 발견되지 않는 공유 결합 (알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 의해 대체된 일례를 포함한다. 상기 아미노산의 예로는 또한 천연적으로-발생된 단백질에서는 통상 발견되지 않는 당류, 예를 들어, 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.

예를 들어, 생체내 반감기를 연장시키기 위해 임의로 본 발명의 ANGPTL3 단백질 내로 (예를 들어, 폴리펩티드 쇄내, 또는 N- 또는 C 말단 중 어느 것에) 도입될 수 있는 또 다른 유형의 변형으로는 PEG화 또는 장쇄 폴리에틸렌 글리콜 중합체 (PEG)의 도입이 있다. PEG 또는 PEG의 장쇄 중합체를 도입하면 본 발명의 폴리펩티드의 유효 분자량은 증가하게 되고, 이를 통해 예를 들면, 뇨로 빠르게 여과되지 못한다. 일부 실시양태에서, ANGPTL3 서열 중의 리신 잔기는 직접 또는 링커를 통해 PEG에 접합된다. 그러한 링커는 예를 들어, 적절히 변형된 PEG 쇄에의 결합을 위해 티올 관능기를 함유하는 Glu 잔기 또는 아실 잔기일 수 있다. PEG 쇄를 도입하는 대체 방법은 먼저 C 말단에, 또는 용매에 노출된 잔기에 Cys 잔기를 도입하는 것, 예를 들어, Arg 또는 Lys 잔기를 대신하여 Cys 잔기로 대체하는 것이다. 이어서, 상기 Cys 잔기를, 예를 들어, 말레이미드 기능을 함유하는 PEG 쇄에 부위-특이적으로 부착시킨다. PEG 또는 PEG의 장쇄 중합체를 도입하는 방법은 당업계에 주지되어 있고 (예를 들어, 문헌 ([Veronese, F. M., et al., Drug Disc . Today 10: 1451-8 (2005)]; [Greenwald, R. B., et al., Adv . DrugDeliv . Rev. 55: 217-50 (2003)]; [Roberts, M. J., et al., Adv . DrugDeliv . Rev., 54: 459-76 (2002)])), 그러한 내용은 본원에 참고로 포함된다. 당업계에 공지된 다른 중합체 접합 방법 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린) (PMPC)이 본 발명의 ANGPTL3 단백질과의 중합체 접합체로서 도입된다 (예를 들어, 문헌 (WO2008/098930; [Lewis, et al., Bioconjug Chem ., 19: 2144-55 (2008)]) 참조). 일부 실시양태에서, 포스포릴콜린을 함유하는, ANGPTL3 단백질과의 중합체 접합체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 다른 생체적합성 중합체 접합체가 사용될 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

보다 최근에 보고된 방법으로서, (상기 기술된 바와 같은) 비-천연 아미노산의 도입을 통해 PEG 또는 PEG 중합체를 도입시키는 대체 접근법은 본 발명의 폴리펩티드를 이용함으로써 수행될 수 있다. 상기 접근법은 진화된 tRNA/tRNA 신테타제 쌍을 이용하고, 이는 발현 플라스미드 중에서 앰버 서프레서 코돈에 의해 코딩된다 (문헌 [Deiters, A, et al., (2004). Bio - org . Med . Chem . Lett . 14, 5743-5]). 예를 들어, p-아지도페닐알라닌을 본 발명의 폴리펩티드 내로 도입한 후, "후이스겐(Huisgen) [3+2] 환화 첨가(cycloaddition)"로서 공지된 유기 반응을 촉진시키기 위해 환원제 및 구리 이온의 존재하에서 아세틸렌 부위를 가진 PEG 중합체와 반응시킬 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시키기 위한 ANGPTL3 단백질의 특이적인 돌연변이를 주시한다. 그러한 돌연변이는 O-연결된 또는 N-연결된 글리코실화 부위를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입하거나, 제거하기 위해 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 천연적으로-발생된 ANGPTL3 단백질과 비교하여 변경되지 않은 글리코실화 부위 및 패턴을 가진다. 특정 실시양태에서, ANGPTL3 단백질의 변이체로는 천연적으로-발생된 ANGPTL3 단백질과 비교하여 글리코실화 부위의 개수 및/또는 유형이 변경된 글리코실화 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 변이체는 천연 폴리펩티드와 비교하여 더 많거나, 더 적은 개수의 N-연결된 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결된 글리코실화 부위는 서열: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr (여기서, X로 지정된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다)을 특징으로 한다. 상기 서열을 형성하기 위해 아미노산 잔기를 치환하면, N-연결된 당질 쇄의 부가를 위한 잠재적인 신규 부위가 제공된다. 별법으로, 상기 서열을 제거하는 치환은 현존 N-연결된 당질 쇄를 제거하게 될 것이다. 특정 실시양태에서, N-연결된 당질 쇄의 재정렬을 통해 하나 이상의 N-연결된 글리코실화 부위 (전형적으로 천연적으로 발생된 부위)는 제거되고, 하나 이상의 새로운 N-연결된 부위가 형성된다.

예시적인 ANGPTL3 단백질 변이체로는, 천연적으로-발생된 ANGPTL3 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 시스테인 잔기가 상기 아미노산 서열로부터 결실되거나, 또는 또 다른 아미노산 (예를 들어, 세린)을 대신하여 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 시스테인 변이체는 예를 들어, 불용성 봉입체의 단리 이후, ANGPTL3 단백질이 생물학상 활성인 구조로 리폴딩되어야 하는 경우에 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 시스테인 변이체는 천연 폴리펩티드와 비교하여 보다 적은 시스테인 잔기를 가진다. 특정 실시양태에서, 시스테인 변이체는 쌍을 이루지 못한 시스테인으로부터 형성되는 상호작용을 최소화시키기 위해 짝수 개수의 시스테인 잔기를 가진다.

일부 실시양태에서, ANGPTL3 단백질의 기능성 변이체 또는 변형된 형태는 본 발명의 ANGPTL3 단백질과 하나 이상의 융합 도메인으로 구성된 융합 단백질을 포함한다. 융합 도메인의 주지된 예로는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 말토스 결합 단백질 (MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 특성을 부여할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의해 융합 단백질을 단리시키는 데 특히 유용하다. 친화성 정제를 위한 목적으로 친화성 크로마토그래피용의 관련된 매트릭스, 예를 들어, 글루타티온-, 아밀라제-, 및 니켈- 또는 코발트-접합된 수지가 사용된다. 그러한 매트릭스 다수는 "키트" 형태, 예를 들어, (HIS₆) 융합 파트너로서 유용한 파마시아(Pharmacia) GST 정제 시스템 및 QLA익스프레스(QLAexpress)™ 시스템 (퀴아젠(Qiagen))으로 이용가능하다. 또 다른 일례로서, 융합 도메인은 ANGPTL3 단백질의 검출을 촉진시킬 수 있도록 선택될 수 있다. 그러한 검출 도메인의 예로는 각종 형광성 단백질 (예를 들어, GFP) 뿐만 아니라, 보통은 그에 대해 특이적인 항체가 이용가능한, 단쇄 펩티드 서열인 "에피토프 태그"를 포함한다. 그에 대해 특이적인 모노클로날 항체가 쉽게 이용할 수 있는 것인, 주지의 에피토프 태그로는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우, 융합 도메인은 예를 들어, 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 절단 부위를 가지며, 이를 통해 관련 프로테아제는 융합 단백질을 부분적으로 분해시킴으로써 그로부터 재조합 단백질을 유리시킬 수 있다. 이어서, 유리된 단백질은 추후의 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다. 특정 실시양태에서, ANGPTL3 단백질은 생체내에서 ANGPTL3 단백질을 안정화시키는 도메인 ("안정화제" 도메인)과 융합된다. "안정화"라는 것은 그러한 결과가 파괴 감소에 기인하는 것인지, 신장에 의한 제거 감소에 기인하는 것인지, 또는 다른 약동학적 효과에 기인하는 것인지에는 상관없이 혈청 반감기를 증가시킨다는 것을 의미한다. 면역글로불린의 Fc 부위와 융합되면 매우 광범위한 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에 융합되면 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인으로는 다량체화 (예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인, 및 (원하는 경우, 추가의 생물학적 기능을 부여하는) 기능성 도메인을 포함한다.

III . 안지오포이에틴 -유사 3 단백질 질환 징후

본 발명의 폴리펩티드, 조성물, 및 방법이 임의 유형의 관절염 또는 관절 손상을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다는 것이 주시된다. 추가로, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물, 및 방법이 각종 연골 질병을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다는 것도 주시된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은, 예를 들어, 관절염 또는 관절 손상에 대한 유전적 이력 또는 가족력이 있거나, 이전에 관절 수술을 받은 경험이 있거나 또는 관절 수술 중에 있는 경우, 관절염 또는 관절 손상의 예방을 위해 투여된다. 본 발명의 폴리펩티드, 조성물, 및 방법을 사용하여 치료 또는 예방하고자 하는 병태 또는 질병의 예로는 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 연소성 만성 관절염, 골관절염, 퇴행성 디스트 질환, 척추관절병증, 전신 경화증 (공피증), 특발성 염증성 근병증 (피부근육염, 다발근육염), 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 사코이드증, 자가면역 용혈 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간 헤모글로빈뇨), 자가면역 혈소판감소증 (특발성 혈소판 감소성 자반병, 면역-매개성 혈소판감소증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 연소 림프성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 당뇨병, 면역-매개성 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질 신염), 중추 및 말초 신경계 탈수초병, 예를 들어, 다발 경화증, 특발성 탈수초성 다발성 신경병 또는 길랭-바레 증후군(Guillain-Barr syndrome), 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병, 간담즙성 질환, 예를 들어, 감염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염 및 다른 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 육아종 간염, 및 경화 담관염, 염증성 장 질환 (궤양성 대장염: 크론병), 글루텐 민감 소장병, 및 휘플병(Whipple's disease), 자가면역 또는 면역-매개성 피부 질환 (수포성 피부 질환, 다형 홍반 및 접촉 피부염 포함), 건성, 알레르기성 질환, 예를 들어, 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 음식 과민증 및 두드러기, 면역성 폐 질환, 예를 들어, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴, 이식 관련 질환 (이식편 거부 및 이식편 대 숙주 질환)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물, 및 방법은 골관절염을 치료하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물, 및 방법은 외상 손상 또는 연골병증에 기인하여 장애를 입은 연골 조직에서의 연골세포 증식 및 연골 생산을 자극하는 방법을 제공한다. 관절형 표면을 보이는 조직, 예를 들어, 척추, 어깨, 팔꿈치, 손목, 손가락 관절, 엉덩이, 무릎, 발목, 및 발 관절 치료에는 특히 중요하다. 본 치료법이 이익이 될 수 있는 질환의 예로는 골관절염, 류마티스 관절염, 다른 자가면역 질환, 또는 박리성 골연골염을 포함한다. 추가로, 연골 기형은 인간에서 왜소증 형태에서 자주 관찰되며, 이는 폴리펩티드, 조성물, 및 방법이 이러한 환자에서 유용할 것이라는 것을 제안한다.

본 발명의 폴리펩티드, 조성물, 및 방법이 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것이 주시된다. 본원에서 사용되는 바, "포유동물"이란 포유동물로서 분류된 임의의 포유동물을 의미하며, 그 예로는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠용 동물 또는 애완동물, 예를 들어, 소 (예를 들어, 젖소), 말, 개, 양, 돼지, 토끼, 염소, 고양이 등을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 치료하고자 하는 포유동물과 이종성일 수 있다. 예를 들어, 소 ANGPTL3 단백질 또는 그의 단편, 소 ANGPTL3 단백질로부터 유래된 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 변형된 소 ANGPTL3 단백질, 소 ANGPTL3 단백질의 보존적 변이체, 소 ANGPTL3 단백질로부터 유래된 펩티도모방체)가 인간 환자를 치료하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 이종성 ANGPTL3 단백질은 이식을 위한 배양물 중에서 연골세포 군집을 확장시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이어서 확장된 배양물을 치료하고자 하는 포유동물과 동종성인 폴리펩티드 및 조성물과 혼합하고, 이를 관절 간극에 위치시키거나, 또는 연골 결함부에 직접 위치시킬 수 있다. 별법으로, 본 발명의 폴리펩티드는 같은 종으로부터 유래된 것이며, 즉, 인간 ANGPTL3 단백질 또는 그의 단편, 인간 ANGPTL3 단백질로부터 유래된 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 변형된 인간 ANGPTL3 단백질, 인간 ANGPTL3 단백질의 보존적 변이체, 인간 ANGPTL3 단백질로부터 유래된 펩티도모방체)가 인간 환자를 치료하는 데 사용된다. 치료를 받는 동물과 같은 종의 포유동물로부터 유래된 단백질을 사용함으로써 우발성 면역 반응은 피할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 단독으로, 또는 단백질의 장기간 방출을 위해 적합한 담체와 함께 복합체를 형성함으로써 관절의 윤활액 내로 직접 주사하거나, 전신 투여하거나 (경구적으로 또는 정맥내로 투여), 또는 연골 결함부 내로 직접 투여함으로써 적용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 조성물, 및 방법은 또한 자가 또는 동종이형 연골세포 이식을 위한 배양물 중에서 연골세포 군집을 확장시키는 데에도 사용될 수 있다. 이식은 임의로는 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물 투여로 구성된 치료와 함께 동시에 수행될 수 있다. 이러한 시술에서는, 예를 들어, 장애를 입은 관절의 손상되지 않은 최소의 하중-지지 영역으로부터 연골세포를 관절경검사법으로 수거하고, 이를 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물의 존재하에서 배양함으로써 이식 이전에 세포의 개수를 증가시킬 수 있다. 이어서, 확장된 배양물을 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물과 혼합한 후, 이를 관절 간극에 위치시키거나, 또는 결함부에 직접 위치시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은, 연골을 형성할 수 있는 세포, 및/또는 이식된 연골세포 또는 그의 전구체 세포가 제 위치에 고정되어 있을 수 있도록 도움을 주는 세포를 함유하는 골막 또는 연골막 이식편과 함께 병용하여 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 관절 세척, 골수 자극, 연마 관절성형술, 연골하 천공, 또는 연골하 골 미세골절술과 함께 연골 장애를 수복시키는 데 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물의 투여에 기인하여 연골의 성장이 일어난 후, 새롭게 형성된 연골 표면의 윤곽을 적절히 형성하는 데 추가의 외과 치료가 필요할 수 있다.

IV . 제약 조성물

상기 언급된 질환 또는 질병을 치료하는 데 필요한 본 발명의 화합물의 용량은 투여 방식, 대상체의 연령 및 체중, 및 치료받는 피험체의 병태에 따라 달라지며, 이는 궁극적으로 주치의 또는 수의사에 의해 결정될 것이다. 주치의 또는 수의사에 의해 결정되는 상기와 같은 양을 본원에서는 "유효량"이라 지칭한다.

투여에 적합한 제제는 부형제를 포함하는데, 이러한 부형제로는 수성 및 비-수성 용액, 등장성 멸균액 (항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제를 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있다), 및 수성 및 비-수성 멸균 현탁액 (현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있다)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명과 관련하여 환자에게 투여되는 투여량은 시간 경과에 따라 대상체에서 유익한 반응을 일으키는 데 충분한 양이어야 한다. 상기 용량은 사용되는 특정 단백질의 효능 및 대상체의 병태 뿐만 아니라, 치료하고자 하는 부위의 체질량 또는 표면적에 의해 결정될 것이다. 용량 크기는 또한 특정 대상체에서 특정 단백질 또는 벡터의 투여를 동반하는 임의의 유해한 부작용의 존재 여부, 성질, 및 정도에 의해 결정될 것이다. 단일 용량 또는 분할된 용량으로 투여될 수 있다.

V. 투여 방법

본 발명의 단백질을 이환된 관절로 전달하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서, 조성물은 예를 들어, 관절내로 (즉, 관절 내부로), 경구적으로, 정맥내로 투여될 수 있다. 화합물 제제는 단일 용량 또는 다중 용량의 실링된 용기, 예를 들어, 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있다. 액제 및 현탁제는 앞서 기술된 종류의 멸균 분제, 과립제, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 단백질은 또한 원하는 요법 또는 효과에 따라 하나 이상의 추가의 활성제 (예를 들어, 히알루론산 또는 그의 염)와 함께 효과적으로 사용될 수 있다.

실시예

하기 실시예는 청구하는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니라, 이를 예시하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 연골형성 유도제에 대한 고속 대량 스크린

OA 관절 수복을 위한 비-침윤성의 신규한 전략법을 확인하고 정의하기 위해 본 발명자들은 인간 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 연골세포로의 분화를 선택적으로 유도할 수 있는 단백질에 대한 비-편재성 고속 대량 스크린을 개발하였다. 본 분석 시스템은 연골 중의 정주 MSC를 모델로 하며, 천연 수복능을 자극하고, 통합된 연골 재생을 증진시키는 매개인자를 확인시켜 준다. 본 발명자들은 인간 및 마우스 MSC에 대한 세포 기반의 고속 대량 스크린에 의해 독특한 분비형 단백질 라이브러리를 시험하는 것을 선택하였다. 이러한 접근법은 연골형성에 영향을 주는, 특징이 미규명된 리간드 및 천연 단백질 리간드를 신속하게 확인시켜 주는 전략법을 제공한다.

이러한 분비형 단백질을 연구하기 위해, 포유동물 생산자 세포주 (HEK293T)로부터 조절된 배지 (CM)의 생산 및 자유형의 HEK-F 세포로부터의 정제된 단백질 생성이라는 2가지 접근법을 취하였다. 이러한 상호 보완적인 접근법을 함께 취함으로써 여러 적용 분야에서 신규한 표적을 확인할 수 있었다.

MSC 분석법으로 단백질을 스크리닝하여 선두 후보물질인 안지오포이에틴-유사 3 (ANGPTL3으로 약칭된다)을 확인하였다. ANGPTL3은, CM 및 정제된 단백질, 둘 모두의 유사하지만 오르소고날인 2개의 1차 스크린에서 확인되었다. 개념 CM 스크린의 증거로서, CM 전달 후 7일 동안 C3H10t1/2 세포를 인큐베이션시켰다. 연골 기질 생산 검출을 위한 알시안 블루(Alcian Blue) 염색에 의해 분석된 바, ANGPTL3-75를 함유하는 웰에서는 연골형성이 일어난 것이 관찰되었다. 531개의 정제된 단백질을 인간 MSC의 연골세포 분화에 대해 스크리닝함으로써 ANGPTL3-75를 독립적으로 확인하였다.

1차 스크리닝 분석법을 수행한 후, 이어서, 6개의 2차 분석법을 통해 ANGPTL3의 특징을 규명하였다. 이러한 분석법은 (1) 마우스 중간엽 C3H10t1/2 세포의 단층 배양: 오스테오칼신 (골형성 마커) 유도를 제외한, II형 콜라겐 및 Sox9 단백질 발현 (연골형성 마커) 유도; (2) 소 연골세포에서의 TNFα/온코스타틴 M (OSM)-유도성 산화질소 (NO) 유리 억제; (3) 소 연골 기관 배양물 중에서의 TNFα/OSM-유도성 글리코사미노글리칸 (GAG) 유리 억제; (4) 인간 MSC 펠릿 배양 시스템 중에서의 연골 기질 유전자 발현 (아그레칸) 유도; (5) 1차 인간 연골세포, 인간 윤활 섬유아세포, 및 인간 MSC에서의 독성 결여; (6) 인간 연골세포 증식 자극을 포함한다.

마우스 ANGPTL3 단백질이 마우스, 인간 및 소 세포 유형에서 작용을 하며, 이에, 비록 그의 인간 동족체가 정량적 영상 기반 콜라겐 분석법에서 다른 종래 공지된 연골형성 유도제와 비교하였을 때, 연골형성에 있어 유사한 효능을 보유하기는 하였지만, 마우스 ANGPTL3 단백질이 연골발생 분화를 강력하게 유도하였는 바 (0.5-5 nM) (도 1), 추가의 특징 규명을 위해서 마우스 ANGPTL3 단백질을 선택하였다. 마우스 및 인간 MSC, 둘 모두를 (각각) 단층 및 펠릿 배양물 중에서 18 내지 21일 동안 분화시키고, 0.5-5 nM ANGPTL3으로 처리하였을 때, 이들은 3가지 연골 특이 단백질: II형 콜라겐, Sox9 및 아그레칸을 발현하였다. 면역조직화학적 염색, 및 택맨에 의한 mRNA 정량화, 이 둘 모두에 의해 상기 MSC들을 평가하였다 (도 2a). 추가로, 마우스 MSC를 18일 동안 배양한 후, 데이터를 분석한 결과, 이는 ANGPTL3이 알칼리성 포스파타제의 발현 감소를 통해 섬유증 수복 반응을 지향하는 자발적인 성향을 억제시킨다고 제안되었다. 조직 손상을 예방할 수 있는 잠재적인 능력을 평가하기 위해, TNFα 및 온코스타틴 M (OSM)으로 소 연골 기관 배양물을 자극하였다. 기질 퇴행에 대한 지표인, 자극받은 글리코사미노글리칸 유리는 ANGPTL3 처리를 통해 유의적으로 억제되었다 (도 2b). 추가로, 인간 윤활막세포를 제외한 1차 인간 연골세포를 처리한 결과, 24 hr 이내에 세포 성장이 2배 증가하였으며 (도 2c), 이는 그의 연골에의 작용 특이성을 제안한다. 상기 단백질은 또한 1차 인간 연골세포, 윤활 섬유아세포 및 MSC의 생육성에 대해서는 어떤 뚜렷한 시험관내 독성 효과 (<100 μM)도 나타내지 않았다 (데이터는 나타내지 않았다).

현재 임상 시험 중에 있는 2가지 후보물질 사이의 직접적인 비교에서 100 ng/ml의 FGF 18 또는 100 ng/ml의 BMP7 처리가 연골발생 결절을 유도할 수는 있었지만, ANGPTL3과 비교하였을 때 전반적인 기질 생산량은 더 적었다. FGF 18은 알시안 블루, Sox9 또는 II형 콜라겐 염색을 증가시킬 수 있는 능력은 없는데, 이는 순 연골 기질에 대한 특이성이 부족하다는 것을 시사한다. 100 ng/ml의 BMP7은 알시안 블루, Sox9 및 II형 콜라겐 염색을 증가시켰지만, 그 유의성은 유사 농도에서 그리 크지는 않았다.

실시예 2: 재조합 전장의 ANGPTL3 및 돌연변이체 단백질의 발현 및 기능 분석

마우스 ANGPTL3은 51 kDa 단백질인 것으로 예측된다. 이는 안지오포이에틴과 구조상 유사하지만, Tie2에의 결합능은 없고, 상이한 기능을 가진, 확인된 안지오포이에틴-유사 (ANGPTL) 단백질 7개로 구성된 패밀리에 속한다. N 말단 꼬인-코일 도메인 (CCD) 및 C 말단 피브리노겐-유사 도메인 (FLD)을 포함한다. ANGPTL 단백질은 그의 미세환경 및 세포외 기질 (ECM)과의 상호작용에 의해 엄격하게 조절되지만, 정확한 상호작용 부위 또는 파트너에 대해서는 아직 상세히 밝혀진 바 없다. ANGPTL3은 간에 의해 분비되며, 전신 순환을 한다. 이는 간 X 수용체 (LXR)를 통해 조절되며, LXR-유도성 고중성지질혈증은 ANGPTL3 방출에 기인하는 것으로 입증되었다. 추정 헤파린 결합 모티프를 통한 CCD와 ECM 사이의 상호작용을 통해, ANGPTL4에 대해 보고된 것과 유사한, 프로단백질 전환효소 인식 서열 (R221-R224)에서의 절단이 억제될 수 있다. 절단되면 지질단백질 리파제 활성 (LPL)을 억제시킬 수 있는 CCD의 능력이 유의적으로 증가하게 되고, 이로써 혈중 트리글리세리드 (TG)가 증가하게 된다. 이는 본 발명 이전에 확인된 ANGPTL3의 주된 생물학적 기능을 나타낸다. C 말단 FLD는 생체내에서 래트의 각막에의 직접적인 이식 후 내피 세포 부착을 유도하고, 혈관형성을 매개하는 데 충분하다. 또한 재조합 ANGPTL3은 내피 세포에서 정제된 αVβ3 인테그린에 결합할 수 있으며, 이를 통해 FAK, MAPK 및 AKT 신호전달을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 데이터는 FLD의 인테그린과의 상호작용이 혈관형성을 매개한다는 것을 제안한다.

인간 연골세포, hMSC 또는 인간 윤활 섬유아세포에서의 ANGPTL3의 발현에 대해서는 보고된 바도 없으며, 웨스턴 블롯을 사용한 본 발명자들의 연구에서도 관찰된 바 없고, 마우스 무릎 관절에서도 그의 발현은 관찰되지 않았다. 추가로, 본 발명자들의 스크린에서 확인된 상기의 신규한 연골발생 기능과 관련이 있는, 관절 세포 중의 어느 단편의 활성에 대해서도 보고된 바 없다.

본 발명자들의 데이터는 전장의 ANGPTL3이 연골형성 및 연골 생산의 신규한 매개인자라는 것을 시사한다. 본 발명자들은 ANGPTL3의 어떤 도메인이 상기와 같은 신규한 연골발생 기능에 중요한지를 조사하였다. 상세한 생물리학적 특징 규명을 위해 제한되고 동종성인 글리코실화를 제공하는 조작된 HEK-S 세포주에서 ANGPTL3의 일련의 절단부와 전장의 단백질을 발현시키고, 정제하였다. 질량 분석 접근법을 통해 4개의 예측 N-연결된 글리코실화 점유 위치 모두를 확인하였다 (N115, N232, N296, 및 N357, 도 3a). HEK의 내인성 작용에 의해 프로세싱된 단편으로부터 CCD와 FLD 도메인 사이의 단백질분해성 절단 부위는 R224인 것으로 확인되었다. 이종성 글리코실화를 가진 삼량체를 나타내는 질량 >400 kDa을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 함으로써 전장의 ANGPTL3을 용리시켰다. 크기 배제 크로마토그래피 및 정적 광산란법에 의해 단량체인 것으로 밝혀진 FLD (241-455)를 결정화시켰다. FLD의 원자 구조는 1.8Å 해상도로 측정하였다. FLD 구조는 다른 FLD 동족체를 표상하는, C 말단쪽을 지향하도록 3개의 루프를 맞추고 있는 나선형 스트레치를 포함한 코어 베타 쉬트 구조를 가진 것으로 밝혀졌다 (도 3b). 상기 도메인의 C 말단부의 온도 인자는 구조의 나머지 부분보다 더 높으며, 이는 상기 영역의 가요성 정도가 높다는 것을 제안한다. ANGPTL2/Tie2 구조 (PDB 코드: 2GY7)와의 중첩을 통해 FLD의 C 말단부가 단백질-단백질 상호작용에 관여할 수 있다는 것이 제안되었다.

생성된 5개의 절단부 생성물을 다중 연골발생 분석법으로 평가하였다. 그 결과, CCD 단독으로는 활성이 보유되지 않지만, FLD에는 활성이 남아있다는 것이 제안되었다. 추가로, 전장의, 또는 돌연변이체 G 또는 H만을 사용하여 3일 동안 자극시켰을 때, SMAD1 인산화는 증가하였는데, 이는 연골발생 신호전달 캐스캐이드의 활성화를 제안한다.

활액 림프 배출로 인해 관절내로 주사된 단백질의 전신 노출이 제한되기는 하지만, 전신 노출을 최소화시키는 것이 때로는 바람직할 수 있다. 전신 노출되는 경우, ANGPTL3을 절단하면 CCD 도메인이 유리될 수 있다. CCD에 의해 이루어지는 LPL 활성에 대한 억제 증가는 환자의 TG 수준을 변경시킬 수 있다. 본 발명자들의 결과는 ANGPTL3의 잠재적인 임상적 이점을 시사한다. 예를 들어, ANGPTL3 중 연골발생 활성이 위치하는 부위를 해부함으로써 지질 대사 또는 혈관형성 특성에 대해 원치않는 전신 효과를 최소화시키거나, 배제시킬 수 있을 것이다. 연골발생 활성은 C 말단에 주로 위치하는 바, 이로써 상기 도메인을 특이적으로 사용하면 전장의 분자 또는 N 말단의 TG 조절에 대한 우려는 완화될 것이다. 전장의 ANGPTL3은 보통 혈청에 존재하는 바, 면역원성은 없는 것으로 예상된다. C 말단을 사용하였을 때의 추가의 이점은, 삼량체화된 전장의 단백질과 비교하여 이는 절단된 것이고, 단량체 (~29 kDa)이며, 이를 통해 가능하게는 순환 중에 존재할 수 있는 임의의 소수의 전심 반감기를 단축시킬 수 있고, 혈관형성으로부터의 임의의 잠재적인 효과를 제한할 수 있다는 점이다.

실시예 3: ANGPTL3 의 생체내 분석

본 발명자들은 잠재적 유해 이벤트 및 관절내 잔류를 처리하는 것에 관해 전장의 ANGPTL3에 대한 여러 생체내 평가를 수행하였다. 3.6 ㎍의 전장의 ANGPTL3을 8주령된 C57BL/10 마우스의 왼쪽 무릎 관절에 관절내 (IA) 주사한 후, 본 발명자들은 24시간 동안의 노출 존재 및 부재하에서 발현에 대해 면역조직화학적 방법으로 평가하였다. 단백질 및 수분 공급을 위한 윤활 림프관 내로 유입되는 윤활 유체 교환에 의한 전형적인 교체는 대략 2시간이 소요되는 바, 24시간째까지는 윤활액 중에 ANGPTL3이 검출가능한 수준으로는 거의 남아있지 않거나, 전혀 남아있지 않아야 한다. 그러한 결과를 통해 비처리 관절에서는 ANGPTL3의 어떤 내인성 발현도 없었지만, 심지어 24시간째의 시점에서는 관절 연골 및 반월상 연골 중 세포 주위 세포에서 상기 단백질이 유의적인 수준으로 검출되었다는 것이 밝혀졌다. 추가로, 연골세포 또는 연골 장애에의 어떤 광범위한 세포독성도 검출되지 않았다. 래트의 무릎 관절 내로의 3회에 걸친 일련의 IA 주사 이후 (3주 동안 주당 1회), 임상적으로는 어떤 독성도 없거나 (관절 팽윤이나 보행상의 변경도 없었다), 래트의 관절에서 어떤 급성 염증성 반응에 대한 증거도 없었다. 조직학상, 주사를 맞은 5마리의 래트의 관절에서는 윤활막염의 어떤 증가도, 비조절형 증식도 없었다. 마우스에서와 같이, ANGPTL3은 연골 기질 및 연골세포 주변에서 검출될 수 있었다. 이러한 결과는 ANGPTL3이 연골 그 자체에 대해서는 원치않는 어떤 효과도 유발하지 않으며, ANGPTL3은 생체내에서 연골 및 반월상 연골 내로 유입되고, 그 부위에서 유지된다는 것을 시사한다.

OA는 단일의 질병 단위가 아니며, 이는 다양한 병인 인자의 결과로서 간주될 수 있다. 인간에서는 대개 관절 연골 또는 골의 비정상적인 생물역학적 스트레스 또는 유전적 또는 후천적 이상에 의해 유발된다. 그러므로, "최적"의 OA 동물 모델을 소수 선택하는 것은 어려운 일이며, 임의 치료제의 보호 특성을 측정하기 위해서는 다수의 모델을 탐구하여야 한다. 본 발명자들은 (반 데르 크란(van der Kraan)과 동료들에 의해 기술된 연구에 기초한 콜라게나제 VII-유도성 모델인) 만성 OA 모델, 및 글래슨(Glasson) 등의 실험에 기초한, 관절 중의 주요 인대 3가지 (ACL, MCL 및 MMTL)의 횡절단을 포함한 급성 외과용 모델에서의 효능 연구를 마쳤다. 두 모델들 모두 통상적으로 OA와 관련이 있는 병적 변화를 유도하였다: OA 개시 후 4-8주째 윤활막 및 인대에서 프로테오글리칸 염색 손실, 연골 및 골 침식, 골증식체 형성 및 화생성 변경이 뚜렷이 나타날 수 있다. 도 5에는 OA에 대한 외과용 모델에서의 ANGPTL3의 재생능이 도시되어 있다. 우선 OA의 잠재적인 바이오마커에 대한 조사를 개시하기 위해 외과용 모델인 기간 동안 말초 혈액을 수집하여 연골 장애에 기인하여 유리된 II형 콜라겐 단편을 측정하였다 (도 5a). 조직학적 분석 및 이어 진행된 내면 경골 고평부의 등급화를 통해, 3주 동안 주당 1회에 걸쳐 무릎당 200 ng의 ANGTPL3으로 처리한 후 연골 기질의 재생이 이루어졌다는 것이 밝혀졌다 (도 5b).

8주 경과된 OA에 대한 외과용 마우스의 서브세트에서 행동불능 측정을 통해서 OA-유도성 통증 완화를 위한 3가지 용량의 ANGPTL3을 조사하였다. 이러한 방법은 외과 수술을 받은 다리와 받지 않은 다리 사이의 중량 분포를 측정한다. 외과 수술 및 무릎당 100 ng 정도의 소량으로 PRO1을 투약하여 매주 3회에 걸쳐 처리한 결과, 수술 후 36일 경과시, 비히클 처리군의 외과 수술을 받은 다리와 비교하였을 때 유의적으로 개선된 것이 입증되었다 (도 5c). 상기와 같은 조합형 데이터를 통해 2가지 OA 모델에서의 ANGTPL3의 생체내 효능 (병적 상태 교정 및 통증 완화, 둘 모두)이 구체적으로 입증되었으며, ANGTPL3이 신규한 OA 치료제로 개발될 수 있다는 발전 가능성이 뒷받침되었다.

본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 단지 설명을 목적으로 한 것이며, 그를 고려하여 다양한 수정 또는 변형이 당업자에게 제안될 수 있고, 이를 본 출원의 정신 및 범위 및 첨부되는 특허청구범위의 범주 내에 포함시키고자 함을 이해하여야 한다. 본원에서 인용된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

서열 목록

X = 임의의 아미노산

괄호 안의 기재된 아미노산은 상기 아미노산이 존재하지 않을 수 있거나, 또는 존재할 수 있다는 것을 나타낸다.

서열 1

241-455 컨센서스

서열 2

225-455 컨센서스

서열 3

207-455 컨센서스

서열 4

전장의 컨센서스

서열 5

인간 ANGPTL3 241-455

서열 6

인간 ANGPTL3 225-455

서열 7

인간 ANGPTL3 207-455

서열 8

전장의 인간 ANGPTL3 gi|7656888|ref|NP_055310.1|[호모 사피엔스(Homo sapiens)]

서열 9

마우스 ANGPTL3 241-455

서열 10

마우스 ANGPTL3 225-455

서열 11

마우스 ANGPTL3 207-455

서열 12

전장의 마우스 ANGPTL3 gi|33469117|ref|NP_038941.1|[무스 무스쿨루스(Mus musculus)]

서열 13

소 ANGPTL3 241-454

서열 14

소 ANGPTL3 225-454

서열 15

소 ANGPTL3 207-454

서열 16

전장의 소 ANGPTL3 gi|122692391|ref|NP_001073814.1|[보스 타우루스(Bos taurus)]

서열 17

개 ANGPTL3 240-454

서열 18

개 ANGPTL3 224-454

서열 19

개 ANGPTL3 206-454

서열 20

전장의 개 ANGPTL3 gi|57086505|ref|XP_536686.1|[카니스 파밀리아리스(Canis familiaris)]

서열 21

말 ANGPTL3 241-455

서열 22

말 ANGPTL3 225-455

서열 23

말 ANGPTL3 207-455

서열 24

전장의 말 ANGPTL3 [에쿠우스 카발루스(equus caballus)]

서열 25

241-455 컨센서스

서열 26

225-455 컨센서스

서열 27

207-455 컨센서스

서열 28

전장의 컨센서스

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Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Ser Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ser Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Lys Leu Ile Lys Asn Gln Pro Glu Ile Gln Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Met Glu Glu Gln Tyr Arg Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Gly Ile 195 200 205 Gln Glu Ser Thr Glu Asn Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Ser Phe His Leu Asn Glu Thr Lys Asp Val Glu His Asp 225 230 235 240 Asp Phe Pro Ala Asp Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Ile Tyr Ser Ile Lys Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe Asn Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Ser Trp Ile Leu Ile Gln Arg Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Gln Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Phe Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Lys Arg Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Thr Ile Glu Tyr Ser Phe His Leu Gly 340 345 350 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Glu Ile Thr Gly Asn 355 360 365 Val Pro Asn Ala Leu Pro Glu His Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asp His Lys Ala Lys Gly Gln Leu Asn Cys Leu Glu Ser Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp His Asp Val Cys Gly Gly Asp Asn Pro Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Ser Lys Thr Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Ile 420 425 430 Cys Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Thr Ile Lys Ser Thr Lys 435 440 445 Met Leu Ile His Pro Ile Asp Ser Glu Ser Phe Glu Leu Arg Gln Ile 450 455 460 Lys Lys Pro Met Asn 465 <210> 25 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of invariant amino acids between positions 241-455 of human, mouse, bovine, canine and equine native ANGPTL3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(215) <223> "X" = any amino acid <400> 25 Xaa Xaa Pro Ala Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Xaa Gly Xaa His Thr 1 5 10 15 Ser Gly Xaa Tyr Xaa Ile Xaa Pro Xaa Asn Ser Gln Xaa Phe Xaa Val 20 25 30 Tyr Cys Asp Xaa Xaa Ser Gly Ser Xaa Trp Xaa Leu Ile Gln Xaa Arg 35 40 45 Xaa Asp Gly Ser Gln Xaa Phe Asn Glu Thr Trp Xaa Asn Tyr Xaa Xaa 50 55 60 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Xaa Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Xaa Ile Val Xaa Xaa Ser Asn Tyr Xaa Leu Glu Xaa Glu Leu Xaa 85 90 95 Asp Trp Xaa Asp Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Glu Tyr Xaa Phe Xaa Leu Gly 100 105 110 Xaa His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Gly Asn 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Pro Glu Xaa Xaa Asp Leu Xaa Phe Ser Thr Trp 130 135 140 Xaa His Xaa Ala Lys Gly Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Glu Xaa Xaa Ser Gly 145 150 155 160 Gly Trp Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Xaa Xaa Asn Xaa Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asn Lys Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Pro Glu Arg Xaa Xaa Gly Xaa 180 185 190 Xaa Trp Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Leu Tyr Xaa Ile Lys Xaa Xaa Lys 195 200 205 Met Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 210 215 <210> 26 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of invariant amino acids between positions 225-455 of human, mouse, bovine, canine and equine ANGPTL3 proteins <220> <221> misc_feature <222> (1)..(231) <223> "X" = any amino acid <400> 26 Thr Thr Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Pro Ala Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Xaa Gly Xaa His Thr 20 25 30 Ser Gly Xaa Tyr Xaa Ile Xaa Pro Xaa Asn Ser Gln Xaa Phe Xaa Val 35 40 45 Tyr Cys Asp Xaa Xaa Ser Gly Ser Xaa Trp Xaa Leu Ile Gln Xaa Arg 50 55 60 Xaa Asp Gly Ser Gln Xaa Phe Asn Glu Thr Trp Xaa Asn Tyr Xaa Xaa 65 70 75 80 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Xaa Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Tyr Xaa Ile Val Xaa Xaa Ser Asn Tyr Xaa Leu Glu Xaa Glu Leu Xaa 100 105 110 Asp Trp Xaa Asp Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Glu Tyr Xaa Phe Xaa Leu Gly 115 120 125 Xaa His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Gly Asn 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Pro Glu Xaa Xaa Asp Leu Xaa Phe Ser Thr Trp 145 150 155 160 Xaa His Xaa Ala Lys Gly Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Glu Xaa Xaa Ser Gly 165 170 175 Gly Trp Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Xaa Xaa Asn Xaa Asn Gly Lys 180 185 190 Tyr Asn Lys Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Pro Glu Arg Xaa Xaa Gly Xaa 195 200 205 Xaa Trp Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Leu Tyr Xaa Ile Lys Xaa Xaa Lys 210 215 220 Met Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 225 230 <210> 27 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of invariant amino acids in positions 207-455 of human, mouse, bovine and canine ANGPTL3 proteins <220> <221> misc_feature <222> (1)..(249) <223> "X" = any amino acid <400> 27 Xaa Ile Xaa Glu Xaa Xaa Glu Xaa Ser Leu Ser Ser Lys Xaa Arg Ala 1 5 10 15 Pro Arg Thr Thr Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ala Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Xaa Gly Xaa 35 40 45 His Thr Ser Gly Xaa Tyr Xaa Ile Xaa Pro Xaa Asn Ser Gln Xaa Phe 50 55 60 Xaa Val Tyr Cys Asp Xaa Xaa Ser Gly Ser Xaa Trp Xaa Leu Ile Gln 65 70 75 80 Xaa Arg Xaa Asp Gly Ser Gln Xaa Phe Asn Glu Thr Trp Xaa Asn Tyr 85 90 95 Xaa Xaa Gly Phe Gly Arg Leu Asp Xaa Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu 100 105 110 Lys Ile Tyr Xaa Ile Val Xaa Xaa Ser Asn Tyr Xaa Leu Glu Xaa Glu 115 120 125 Leu Xaa Asp Trp Xaa Asp Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Glu Tyr Xaa Phe Xaa 130 135 140 Leu Gly Xaa His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Xaa Xaa Xaa Ile Xaa 145 150 155 160 Gly Asn Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Pro Glu Xaa Xaa Asp Leu Xaa Phe Ser 165 170 175 Thr Trp Xaa His Xaa Ala Lys Gly Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Glu Xaa Xaa 180 185 190 Ser Gly Gly Trp Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Xaa Xaa Asn Xaa Asn 195 200 205 Gly Lys Tyr Asn Lys Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Pro Glu Arg Xaa Xaa 210 215 220 Gly Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Leu Tyr Xaa Ile Lys Xaa 225 230 235 240 Xaa Lys Met Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 245 <210> 28 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of invariant amino acids for full-length human, bovine, mouse and canine ANGPTL3 proteins <220> <221> misc_feature <222> (1)..(469) <223> "X" = any amino acid <400> 28 Met Xaa Thr Ile Lys Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Pro Leu Val Ile Xaa 1 5 10 15 Ser Xaa Xaa Asp Xaa Asp Xaa Xaa Ser Xaa Asp Ser Xaa Xaa Xaa Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Xaa Leu Ser Leu Xaa Thr Xaa Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Xaa Thr Xaa Xaa Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Xaa Glu Leu Xaa Ser Lys Xaa Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Xaa Xaa Leu Gln Xaa Lys Val Xaa Xaa Leu Glu Xaa Gln 130 135 140 Leu Thr Xaa Leu Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Xaa Xaa Val Glu Xaa Gln Asp Asn Ser Ile Xaa 165 170 175 Xaa Leu Leu Gln Xaa Xaa Glu Xaa Gln Tyr Xaa Gln Leu Xaa Gln Gln 180 185 190 Xaa Xaa Gln Ile Lys Glu Ile Glu Xaa Gln Leu Arg Xaa Xaa Xaa Ile 195 200 205 Xaa Glu Xaa Xaa Glu Xaa Ser Leu Ser Ser Lys Xaa Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Xaa Pro Ala Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Xaa Gly Xaa His Thr 245 250 255 Ser Gly Xaa Tyr Xaa Ile Xaa Pro Xaa Asn Ser Gln Xaa Phe Xaa Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Xaa Xaa Ser Gly Ser Xaa Trp Xaa Leu Ile Gln Xaa Arg 275 280 285 Xaa Asp Gly Ser Gln Xaa Phe Asn Glu Thr Trp Xaa Asn Tyr Xaa Xaa 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Xaa Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Xaa Ile Val Xaa Xaa Ser Asn Tyr Xaa Leu Glu Xaa Glu Leu Xaa 325 330 335 Asp Trp Xaa Asp Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Glu Tyr Xaa Phe Xaa Leu Gly 340 345 350 Xaa His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Gly Asn 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Pro Glu Xaa Xaa Asp Leu Xaa Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Xaa His Xaa Ala Lys Gly Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Glu Xaa Xaa Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Xaa Xaa Asn Xaa Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Pro Glu Arg Xaa Xaa Gly Xaa 420 425 430 Xaa Trp Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Leu Tyr Xaa Ile Lys Xaa Xaa Lys 435 440 445 Met Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Ser Glu Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 465

Claims (36)

1. 포유동물의 관절에 서열 1 또는 25와 적어도 95%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유효량으로 포함하는 조성물을 투여하여 포유동물에서 관절염 또는 관절 손상을 완화시키거나 예방하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 관절염 또는 관절 손상을 완화시키거나 예방하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 PEG화된 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 혈청 알부민 (HSA), 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 폴리히스티딘, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 또는 말토스 결합 단백질 (MBP)에 융합된 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 개체가 관절염 또는 관절 손상을 앓는 개체인 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 개체가 관절염 또는 관절 손상을 앓고 있지는 않지만, 그러한 위험이 있는 개체인 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 1 또는 25를 포함하는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28과 적어도 95%의 동일성을 가진 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28을 포함하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 5, 9, 13, 17, 또는 21과 적어도 80% 동일한 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 5, 9, 13, 17, 또는 21을 포함하는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 관절염이 골관절염, 외상 관절염, 및 자가면역 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 포유동물이 인간, 개, 또는 고양이인 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 조성물이 추가로 히알루론산을 포함하는 것인 방법.
15. 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화를 유도하기에 충분한 양의, 서열 1 또는 25와 적어도 95%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 중간엽 줄기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 폴리펩티드가 PEG화된 것인 방법.
17. 제15항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 혈청 알부민 (HSA), 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 폴리히스티딘, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 또는 말토스 결합 단백질 (MBP)에 융합된 것인 방법.
18. 제15항에 있어서, 폴리펩티드가 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
19. 제15항에 있어서, 시험관내에서 수행되는 것인 방법.
20. 제15항에 있어서, 상기 방법이 생체내에서 수행되고, 줄기 세포가 포유동물에 존재하는 것인 방법.
21. 제15항에 있어서, 포유동물이 인간, 개, 또는 고양이인 것인 방법.
22. 제15항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 1 또는 25를 포함하는 것인 방법.
23. 제15항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28과 적어도 95%의 동일성을 가진 것인 방법.
24. 제15항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28을 포함하는 것인 방법.
25. 제15항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 5, 9, 13, 17, 또는 21과 적어도 80% 동일한 것인 방법.
26. 제15항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 5, 9, 13, 17, 또는 21을 포함하는 것인 방법.
27. 서열 1 또는 25와 적어도 95%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제약 유효량으로 포함하는, 관절내 전달용의 제약 조성물.
28. 제27항에 있어서, 폴리펩티드가 PEG화된 것인 조성물.
29. 제27항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 혈청 알부민 (HSA), 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 폴리히스티딘, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 또는 말토스 결합 단백질 (MBP)에 융합된 것인 조성물.
30. 제27항에 있어서, 폴리펩티드가 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 비천연 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
31. 제27항에 있어서, 추가로 히알루론산을 포함하는 것인 조성물.
32. 제27항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 1 또는 25를 포함하는 것인 조성물.
33. 제27항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28과 적어도 95%의 동일성을 가진 것인 조성물.
34. 제27항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 2, 3, 4, 26, 27, 또는 28을 포함하는 것인 조성물.
35. 제27항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 5, 9, 13, 17, 또는 21과 적어도 80% 동일한 것인 조성물.
36. 제27항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 5, 9, 13, 17, 또는 21을 포함하는 것인 조성물.

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