CN105601728B

CN105601728B - 间充质干细胞分化

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Publication number: CN105601728B
Application number: CN201610077451.4A
Authority: CN
Inventors: K·约翰逊; L·詹宁斯; P·舒尔茨
Original assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Current assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Priority date: 2009-07-14
Filing date: 2010-07-13
Publication date: 2020-01-10
Anticipated expiration: 2030-07-13
Also published as: US10064918B2; CU24042B1; PT2453921E; EP2453921A2; UA104031C2; PL2453921T3; PE20160507A1; IL217383A; ZA201200078B; US11241482B2; MX2012000707A; GT201200011A; US10555990B2; MA33423B1; IL247310B; CN102625830B; ES2541217T3; BR112012000914B1; SG177318A1; AU2010273570A1

Abstract

本发明提供用于治疗或防止关节炎和关节损伤的方法和组合物。

Description

间充质干细胞分化

本申请是申请人于2010年7月13日提交的题为“间充质干细胞分化”的中国专利申请201080031985.4的分案申请。

对相关申请的交叉参考引用

本申请根据美国法典35第1.119(e)款，要求美国临时申请号61/225,293(2009年7月14日递交)的权利，该临时申请的全部内容通过参考引用并入本文。

发明背景

骨关节炎(OA)是最常见的肌骨疾病。目前，大约有4千万美国人患有该病，由于人口老龄化和平均寿命的增加，该数字在接下来的20年内预计将增加到6千万，使得该疾病成为导致残疾的第四位主要原因。OA的特征在于关节的缓慢退行性降解，包括关节软骨(含有为关节提供润滑和缓冲的细胞和基质)和位于关节软骨下的软骨下骨。目前，对OA的疗法包括以口服NSAIDs或选择性环加氧酶2(COX-2)抑制剂来减轻痛苦、以例如皮质类固醇和透明质素等药剂进行关节内(IA)注射、以及外科手术的方法。

间充质干细胞(MSCs)存在于成人的关节软骨中，其分离后能够在体外被程序化以经历分化而成软骨细胞和其它间充质细胞谱系。这部分地受生长因子(TGFβs、BMPs)、血清条件和细胞-细胞接触的调节。

发明概要

本发明提供了改善或防止哺乳动物关节炎或关节损伤的方法。在一些实施方案中，本发明方法包括对哺乳动物的关节施用组合物，所述组合物包含有效量的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或25具有至少95％同一性的氨基酸序列，从而改善或防止哺乳动物关节炎或关节损伤。

在一些实施方案中，个体具有关节炎或关节损伤。在一些实施方案中，个体没有关节炎或关节损伤，但具有关节炎或关节损伤的风险。

在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1或25。

在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NOs:2、3、4、26、27或28具有至少95％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID NOs:2、3、4、26、27或28。

在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NOs:5-24之任一至少80％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID NOs:5-24之任一。

在一些实施方案中，关节炎选自骨关节炎、创伤性关节炎和自身免疫性关节炎。

在一些实施方案中，哺乳动物为人。

在一些实施方案中，组合物还包括透明质酸。

本发明也提供了诱导间充质干细胞分化形成软骨细胞的方法，所述软骨细胞形成软骨基质。在一些实施方案中，本发明方法包括使间充质干细胞与足够量的多肽接触以诱导干细胞分化形成软骨细胞，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或25具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明方法在体外进行。在一些实施方案中，本发明方法在体内进行，干细胞存在于哺乳动物体内。在一些实施方案中，哺乳动物为人。

在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1或25。

本发明也提供了用于关节内递送和全身递送的药物组合物。在一些实施方案中，组合物包含药学有效量的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或25具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，组合物还包括透明质酸。

在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1或25。

本发明的其它特征、优点和实施方案可以从以下详细描述和权利要求中得到阐明或显而易见。此外，应理解的是，上述发明概述和以下的详细描述均是举例说明性的，旨在提供进一步的解释而不是限制本发明的保护范围。

定义

术语“肽模拟物”(peptidomimetic)和“模拟物”(mimetic)指合成的化学化合物，所述化合物与天然或非天然产生的多肽(例如，ANGPTL3)具有基本上相同的结构和功能特征。肽类似物普遍用在制药业中，作为与模板肽具有类似特性的非肽药物。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”(peptide mimetics或peptidomimetics)(Fauchere,J.Adv.DrugRes.15:29(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans等，J.Med.Chem.30:1229(1987)，通过参考引用将它们整合到本文中)。可以使用在结构上与治疗有用的肽相似的肽模拟物来产生等效的或增强的治疗或预防效果。通常，肽模拟物在结构上与范例多肽(paradigm polypeptide)(即，具有生物学或药理学活性的多肽)相似，例如在目的多肽中所发现的，但是其一个或多个肽键任选地被选自如下的键替代：例如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、和-CH2SO-。模拟物可以完全由合成的、非天然的氨基酸类似物组成，或者是由部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物组成的嵌合分子。模拟物也可以并入任何数量的天然氨基酸保守性替换，只要该替换不实质性地改变模拟物的结构和/或活性。例如，如果模拟组合物能够执行目的多肽的至少一种活性，它就属于本发明的范围内。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可替换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，以及适用于其中一个或多个氨基酸残基为对应的天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸、以及以和天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸、以及随后被修饰的氨基酸(例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物是指具有和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留了和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。就具体的核酸序列而言，保守修饰变体是指那些编码相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或是在核酸不编码氨基酸序列时编码基本相同的序列的核酸。因为遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质都可以由许多功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个由密码子规定丙氨酸的位置，该密码子可以改变为任何上述相应的密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异为“沉默变异”，它属于保守修饰变异的一种。在本文中每一个编码多肽的核酸序列也描述该核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员知道，可以对核酸中的每一个密码子进行修饰(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子；以及TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能相同的分子。因此，每一个所描述的序列都隐含编码多肽的核酸的每一个沉默变异。

关于氨基酸序列，技术人员知道，导致编码序列中单氨基酸或小百分数氨基酸改变、添加或缺失的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单替换、缺失或插入，当该改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸替换时，是“保守修饰变体”。提供功能类似的氨基酸的保守置换表在本领域公知。这样的保守修饰变体另外附加于并且不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。

以下八组中每一组包含互相之间保守替换的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如Creighton，Proteins(1984))。

通过在比较窗口内对两个最佳比对的序列进行比较来确定“序列同一性百分比”，其中，与不包含添加或缺失的参考序列(例如，本发明的多肽)相比较，多核苷酸序列在比较窗内的部分可以包含添加或缺失(即，空位)，以获得两个序列的最佳比对。百分比的计算如下：计算两个序列中一致的核酸碱基或氨基酸残基出现的位置的数量以得到匹配位置的数量，以匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数并将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。

在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指，两个或更多个序列或子序列是相同的序列。当使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视检查进行测定时，当为在比较窗口或指定区域内获得最大对应性而进行比较和比对时，如果两个序列具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上，或在未规定时，在整个序列上，60％相同，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同)，则两个序列是“基本相同的”。本发明提供分别与本文中例示的多肽(例如，SEQ ID NOs:1-28之任一)基本相同的多肽，以及这些多肽的应用，包括但不限于用于治疗或预防关节炎或关节损伤。可选地，同一性存在于参考序列的至少约50个核苷酸长度的区域上，或更优选地，存在于100至500个、或1000个或更多个核苷酸长度的区域上或整个长度上。

为了进行序列比较，典型地，一个序列充当参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列的坐标，如果需要的话，指定序列算法的程序参数。可以使用默认的程序参数，或指定替代参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

本文中所使用的“比较窗口”包括具有选自以下的任一数量的连续位置的区段：20至600、通常约50至约200、更多地是约100至约150，在该区段中在对两个序列进行最优比对后，可以将序列与具有相同数量的连续位置的参考序列进行比较。用于进行比较的序列比对方法在本领域公知。用于进行比较的最优序列比对可以按以下方法来进行：例如，Smith和Waterman(1970)(Adv.Appl.Math.2:482c)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch(1970)(J.Mol.Bioi.48:443)的同源性比对算法，Pearson和Lipman(1988)(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444)的相似性搜索方法，以计算机执行这些算法(Wisconsin遗传学软件包(Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或手工比对和目视检查(见，例如Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(1995年增刊)。

两个适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST2.0，它们分别描述于Altschul等(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Bioi.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可以从美国国家生物技术信息中心公开获取。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字(当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，该短字匹配或满足某一正值阈值得分T)来鉴定高得分的序列对(HSPs)。T被称作相邻字得分阈值(Altschul等，出处同上)。这些最初的相邻字命中物将充当开始搜索的种子以寻找包含它们的更长HSPs。字命中物在两个方向沿着每个序列进行延伸，条件是累积比对分值能够增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对一对匹配残基的奖分，总是大于0)和N(对错配残基的罚分，总是小于0)，计算累积分值。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分值。字命中物在每个方向上的延伸将在以下条件下被终止：当积累的比对分值从其达到的最高分值降低数量X时；或积累的分值由于一个或多个负得分残基比对的累积，而变为0或以下时；或到达任一个序列的末端时。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4、和对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3、期望值(E)为10、和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4、和对两条链进行比较。

BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(见，例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种对相似性的量度是最小和概率(smallest sum probability)(P(N))，其指示两个核苷酸或氨基酸序列之间因偶然而发生匹配的概率。例如，如果在测试核酸对参考核酸的比较中，最小加和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则核酸被认为是与参考序列相似。

本文中所使用的术语“透明质酸”包括透明质酸的衍生物(包括透明质酸的酯、透明质酸的盐)，也包括术语透明质素(hyaluronan)。该名称也包括低和高分子量形式的透明质素和交联的透明质素或hylan。这样的透明质素的例子有Synvisc^TM(Genzyme公司，Cambridge,Mass.)，ORTHOVISC^TM(Anika Therapeutics,Woburn,Mass.)和HYALGAN^TM(Sanofi-Synthelabo公司，Malvern,Pa.)。

附图说明

图1、在体外软骨发生期间MSC诱导的Ⅱ型胶原蛋白产生的定量评估。将hMSCs(10,000/384孔)在hMSC生长培养基(Millipore)板中培养24小时。用以上蛋白质处理细胞再72小时。以无血清DMEM替换培养基并在缺乏任何额外刺激物的条件下再培养14天。终止后，以福尔马林固定细胞、洗涤、以抗Ⅱ型胶原蛋白的抗体进行染色，并以DAPI进行复染。通过高容量成像(Opera,Perkin Elmer)对Ⅱ型胶原蛋白染色量进行定量。将来自3个试验、每个剂量一式两份重复的数据(n＝6)合并。

图2、ANGPTL3诱导的软骨发生的表征。(A)使hMSCs在无血清DMEM、1X ITS和ANGPTL3(图中所示)中以团块培养(pellet culture)(1x 10⁶个细胞/团块)的方式生长21天。每3天替换一次培养基。使用人Taqman特异性探针，按照生产商的操作指南，对聚集蛋白聚糖(aggrecan)的mRNA表达进行定量(合并来自3个试验一式两份重复的数据(n＝6))。(B)分离牛软骨，打孔成对称圆形并进行器官培养。以20ng/ml的TNFa和10ng/ml的OSM(炎症介质)处理薄片48小时以在存在或缺乏ANGPTL3时诱导软骨基质的降解，以确定糖胺聚糖释放(基质损害的指示物)的抑制百分比(合并来自4个供体的数据，n＝12)。(C)铺种原代正常人软骨细胞和滑膜细胞(2500/384孔，于生长培养基中)并于37℃培养24小时。显示出，在该24小时期间响应于ANGPTL3，软骨细胞特异的细胞生长适度增加(数据为2个试验、2个重复/剂量(n＝4)的合并)。

图3、mANGPTL3。(A)蛋白质一级结构和确认的糖基化位点。(B)mANGPTL3的C-末端FLD(225-455)的原子结构(1.8埃)。

图4、ANGPTL3序列的比对。(A)人、小鼠、牛和狗的天然ANGPTL3蛋白质的序列比对；(B)人、小鼠、牛、狗和马的天然ANGPTL3蛋白质的序列比对。

图5、mANGPTL3在手术性骨关节炎模型中的体内功效。对C57BL/6小鼠(n＝12/组)右膝的前十字韧带(ACL)、内侧半月板胫骨韧带(MMTL)、和内侧副韧带(MCL)进行外科手术横断，以诱导膝关节的不稳固，从而导致OA表型。手术后一周，对小鼠按每周1次如所示的进行关节内用药3-4周。(A)在手术后第28天，收集外周血。通过ELISA(Nordic biosciences)对循环的Ⅱ型胶原蛋白片段(CTX-Ⅱ)进行定量。mANGPTL3剂量＝200ng/膝，3次按周注射。(B)按0-4等级对胫骨平台进行定量评估，0为正常，5为严重的OA(软骨的全厚度破损(fullthickness disruption))。由2位观察者对来自每只小鼠的两个切片进行盲法分级。mANGPTL3剂量＝200ng/膝，3次按周注射。(C)通过双足平衡测痛法(incapacitancetesting)，或通过确定小鼠通过监测仪器时以手术腿相对于另一腿站立的时间的百分比，来测定OA疼痛。读出值代表在手术后第36天的疼痛反应(以所示的浓度每周1剂共3剂ANGPTL3)。

发明详述

Ⅰ.前言

本发明部分基于发现：促血管生成素样3(Angiopoietin-like 3,ANGPTL3)刺激间充质干细胞的软骨细胞分化。据此，本发明提供了诱导间充质干细胞分化成软骨细胞的方法。进而，本发明提供了：通过将ANGPTL3蛋白质施用到关节、椎骨、椎盘(vertebral disc)或进行全身给药，施用ANGPTL3蛋白质以防止或改善关节炎或关节损伤。

Ⅱ.促血管生成素样3

促血管生成素样3是分泌因子的促血管生成素样家族的成员。它主要在肝脏中表达，具有促血管生成素的特征结构，由信号肽、N-末端卷曲螺旋结构域(CCD)和C-末端纤维蛋白原(FBN)样结构域组成。促血管生成素样3中的FBN-样结构域被证实与αV/β3整联蛋白结合，该结合诱导内皮细胞粘着和迁移。

根据本发明可以利用各种ANGPTL3蛋白。如本文中所解释，天然ANGPTL3蛋白在体内通常被切割成氨基端和羧基端片段。本发明涉及各种具有软骨发生活性的ANGPTL3蛋白的用途。在一些实施方案中，本发明提供了全长天然的(或其变体)ANGPTL3蛋白质氨基酸序列的应用。在一些实施方案中，本发明提供了包含ANGPTL3序列的部分(而非全长天然序列)的ANGPTL3蛋白或其变体，所述部分保留了软骨发生活性(即，不是天然蛋白质的氨基末端)。在一些实施方案中，本发明ANGPTL3蛋白质没有CCD结构域和/或没有显著的CCD活性。因此，在一些实施方案中，本发明的ANGPTL3蛋白包含至少天然小鼠(例如，SEQ ID NO:12)、人(例如，SEQ ID NO:8)、牛(例如，SEQ ID NO:16)、狗(例如，SEQ ID NO:20)、或马(例如，SEQ ID NO:24)ANGPTL3蛋白质序列的片段(例如，至少50、100、150、200、250个连续氨基酸)或基本相同的序列，但是不包含天然ANGPTL3蛋白的至少200个氨基末端连续氨基酸。

在一些实施方案中，本发明的ANGPTL3蛋白包含纤维蛋白原样结构域。在一些实施方案中，本发明的ANGPTL3蛋白包含对应于天然小鼠(例如，SEQ ID NO:12)、人(例如，SEQID NO:8)、牛(例如，SEQ ID NO:16)、狗(例如，SEQ ID NO:20)、或马(例如，SEQ ID NO:24)ANGPTL3蛋白质序列中的氨基酸207-455、207-400、207-350、225-455、225-400、225-350、241-455、241-400、241-350的连续氨基酸，或是与这样的序列基本相同，但不包括侧翼的天然ANGPTL3蛋白质氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的ANGPTL3蛋白(包括但不限于SEQ ID NOs:1-28之任一)缺乏至少C-末端序列的一部分，例如缺乏自C-末端起10、20、30、40、50个氨基酸。

尽管以上所描述的本发明的ANGPTL3蛋白可以不包括位于以上所描述的区域侧翼的天然ANGPTL3蛋白质序列，但本发明的ANGPTL3蛋白可以包括非天然ANGPTL3蛋白质侧翼序列。例如，可以将ANGPTL3蛋白的软骨发生活性部分与一个或多个异源氨基酸融合以形成融合蛋白。融合配偶体序列可以包括但不限于氨基酸标签、非L-(例如，D-)型氨基酸或其它氨基酸模拟物(以延长体内半衰期和/或对蛋白酶的抗性)、靶向序列或其它序列。

本发明的ANGPTL3蛋白包括天然ANGPTL3蛋白的变体和截短物，以及本文中所描述的活性片段的变体和截短物。可以用许多为本领域技术人员所知的方法来鉴定活性变体。在一些实施方案中，可以进行活性蛋白质的氨基酸比对，以鉴定那些不变的或包括保守氨基酸改变的位置。SEQ ID NOs:1、2、3或4代表共有序列，所述共有序列包含在人、小鼠、牛和狗天然ANGPTL3蛋白的某些区域(分别为位置241-455、225-455和207-455，以及天然全长)之间不变的氨基酸。SEQ ID NOs:25、26、27或28代表共有序列，所述共有序列包含在人、小鼠、牛、狗和马天然ANGPTL3蛋白的某些区域(分别为位置241-455、225-455和207-455，以及天然全长)之间不变的氨基酸。因此，在一些实施方案中，本发明的软骨发生ANGPTL3蛋白包括SEQ ID NOs:1、2、3、4、25、26、27或28。在一些实施方案中，本发明的软骨发生ANGPTL3蛋白包含与SEQ ID NOs:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24之任一基本相同的氨基酸序列(跨SEQ ID NOs的长度进行的度量)。

本发明的ANGPTL3蛋白具有软骨发生活性(chondrogenic activity)。如本文中所定义，软骨发生或软骨发生活性是指从MSC到软骨细胞的发育。软骨发生活性的指示物包括但不限于软骨基质的生成。可以通过各种标记对软骨基质的生成进行测定，所述标记例如Sox9、II型胶原蛋白、或糖胺聚糖(GAG)的产生。在一些实施方案中，测定GAG的产生作为软骨基质生成的标记。在一些实施方案中，伴随软骨特异性蛋白表达的GAG产生的3倍增加，指示阳性软骨基质生成。

在一些实施方案中，本发明的ANGPTL3多肽包含至少一个非天然编码的氨基酸。制备非天然氨基酸和将其导入到蛋白质中的方法是已知的。见例如，美国专利号7,083,970和7,524,647。适于制备包含一个或多个目的非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统(orthogonal translation systems)的一般生产原则在本领域公知，用于产生正交翻译系统的一般方法也在本领域公知。例如，见国际公布号WO 2002/086075，名为“用于产生正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶对的方法和组合物”；WO 2002/085923，名为“非天然氨基酸的体内掺入”；WO 2004/094593，名为“扩充真核生物的遗传密码”；WO 2005/019415，2004年7月7日递交；WO 2005/007870，2004年7月7日递交；WO 2005/007624，2004年7月7日递交；WO 2006/110182，2005年10月27日递交，名为“用于非天然氨基酸体内掺入的正交翻译组分”和WO2007/103490，2007年3月7日递交，其名为“用于在真细菌宿主细胞中表达正交翻译组分的系统”。这些申请的每一均就其全部通过参考引用整合到本文中。对于掺入非天然氨基酸的正交翻译系统的讨论，以及用于产生和应用它们的方法，也见Wang和Schultz，(2005)“扩充遗传密码”Angewandte Chemie Int Ed 44:34-66；Xie和Schultz(2005)“扩充的遗传密码”Methods 36:227-238；Xie和Schultz(2005)“向遗传库中添加氨基酸”Curr Opinion inChemical Biology 9:548-554；和Wang等(2006)“扩充遗传密码”Annu Rev BiophysBiomol Struct 35:225-249；Deiters等(2005)“在大肠杆菌中将炔体内整合进蛋白质中”Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524；Chin等(2002)“向大肠杆菌的遗传密码添加对-叠氮-L-苯丙氨酸”J Am Chern Soc 124:9026-9027；以及国际公布号W02006/034332，2005年9月20日递交，每一文献的内容均就其全部通过参考引用整合到本文中。另外的细节见于美国专利号7,045,337、7,083,970、7,238,510、7,129,333、7,262,040、7,183,082、7,199,222和7,217,809。

“非天然编码氨基酸”是指非常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸。可以使用的与术语“非天然编码氨基酸”同义的其它术语有“非-天然的氨基酸”、“非天然氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”，以及它们的各种带连字符和不带连字符的形式。术语“非天然编码氨基酸”也包括但不限于通过修饰(例如，翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而产生的氨基酸，但是其自身不通过翻译复合物天然整合进正在生长的多肽链中。这样的非天然存在的氨基酸的例子包括但不限于N-乙酰氨基葡萄糖基(glucosaminyl)-L-丝氨酸、N-乙酰氨基葡萄糖基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。

非天然编码氨基酸典型地为具有不用于20种天然氨基酸中的任何取代侧链的任何结构。因为本发明的非天然编码氨基酸典型地仅在侧链的结构上不同于天然氨基酸，故非天然编码氨基酸与其它氨基酸(包括但不限于天然或非天然编码的)形成酰胺键，形成方式与在天然存在的多肽中酰胺键的形成方式相同。然而，非天然编码氨基酸具有与天然氨基酸不同的侧链基团。例如，R任选地包括烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、链烯基、炔基、醚、硫醇、硒基、磺酰基、硼酸、硼酸酯(boronate)、磷酸、磷酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或它们的任何组合。可适用于在本发明中应用的其它目的非天然存在的氨基酸包括但不限于，包含光激活交联剂的氨基酸；自旋标记氨基酸；荧光氨基酸；金属结合氨基酸；含金属氨基酸；放射性氨基酸；具有新官能基团的氨基酸；与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸；photocaged和/或光致异构化的氨基酸；包含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化的氨基酸(例如糖取代的丝氨酸)；其它碳水化合物修饰的氨基酸；含酮氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学断裂和/或光断裂的氨基酸；与天然氨基酸相比具有延长的侧链的氨基酸，所述侧链包括但不限于聚醚或长链烃(包括但不限于多于约5个或多于约10个碳原子)；包含与碳连接的糖的氨基酸；具有氧化还原活性的氨基酸；包含氨基硫代酸的氨基酸；以及包含一个或多个毒性结构组分的氨基酸。

可适用于在本发明中应用并可用于与水溶性聚合物反应的示例性非天然编码氨基酸包括但不限于，那些具有羰基、氨基氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮和炔反应基团的氨基酸。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含糖结构组分(moiety)。这样的氨基酸的例子包括N-乙酰-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-氨基甘露糖基-L-丝氨酸。这样的氨基酸的例子也包括在氨基酸和糖之间的天然N-或O-连接被在天然中不常见的共价键(包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等)替代的例子。这样的氨基酸的例子也包括在天然存在的蛋白质中不常见的糖，例如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。

另一类能够可选地引入到本发明ANGPTL3蛋白中的修饰(例如，在多肽链内部或在N-或C-端)(例如，为了延长体内半衰期)是聚乙二醇化或长链聚乙二醇(PEG)聚合物的掺入。引入PEG或长链PEG聚合物可以增加本发明多肽的有效分子量，例如以防止快速过滤到尿液中。在一些实施方案中，ANGPTL3序列中的赖氨酸残基直接或通过接头缀合PEG。这样的接头可以是，例如Glu残基或包含硫醇官能团的酰基残基，以用于连接到经合适修饰的PEG链。用于引入PEG链的另一可选方法是首先在C-末端或在溶剂暴露残基处(例如替换Arg或Lys残基)引入Cys残基。该Cys残基随后位点特异性地连接到包含例如马来酰亚胺官能的PEG链。用于掺入PEG或PEG长链聚合物的方法在本领域公知，其描述于例如Veronese,F.M.等，Drug Disc.Today 10:1451-8(2005)；Greenwald,R.B.等，Adv.Drug Deliv.Rev.55:217-50(2003)；Roberts,M.J.等，Adv.Drug Deliv.Rev.,54:459-76(2002)，其内容通过参考引用并入本文。其它在本领域已知的聚合物缀合方法也可以用于本发明中。在一些实施方案中，将聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(PMPC)作为聚合物引入与本发明的ANGPTL3蛋白连接(见例如，W02008/098930；Lewis等，Bioconjug Chem.,19:2144-55(2008))。在一些实施方案中，与ANGPTL3蛋白缀合的含磷酸胆碱的聚合物可以用于本发明中。技术人员十分明了，可利用其他生物相容的聚合物缀合物。

最近报道了通过掺入非天然氨基酸(如以上所描述)来掺入PEG或PEG聚合物的可供选择的方法，可以对本发明的多肽使用此方法。该方法利用进化的tRNA/tRNA合成酶对(在表达质粒中由琥珀抑制密码子编码)(Deiters,A.等(2004)Bia-arg.Med.Chem.Lett.14,5743-5)。例如，可以将p-叠氮基苯丙氨酸掺入进本发明的多肽，然后p-叠氮基苯丙氨酸在能够促进称为“Huisgen[3+2]环加成”的有机反应的还原剂和铜离子的存在下，和具有乙炔部分的PEG聚合物进行反应。

在某些实施方案中，本发明涉及ANGPTL3蛋白的特定突变以改变多肽的糖基化。可以对这样的突变进行选择以引入或消除一个或多个糖基化位点，所述糖基化位点包括但不限于O-连接的或N-连接的糖基化位点。在某些实施方案中，与天然存在的ANGPTL3蛋白相比较，本发明的ANGPTL3蛋白具有未经改变的糖基化位点和模式。在某些实施方案中，ANGPTL3蛋白的变体包括糖基化变体，与天然存在的ANGPTL3蛋白相比较，变体中糖基化位点的数量和/或类型已经被改变了。在某些实施方案中，与天然的多肽相比较，多肽的变体包含更多或更少数量的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点以序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr为特征，其中标为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸以外的其它任何氨基酸残基。通过对氨基酸残基的替换来获得该序列，可以提供用于添加N-连接的糖链的潜在新位点。可选地，消除该序列的替换将移去已存的N-连接的糖链。在某些实施方案中，提供对N-连接的糖链的重排，其中消除一个或多个N-连接的糖基化位点(典型地那些天然存在的位点)并建立一个或多个新的N-连接位点。

示例性ANGPTL3蛋白变体包括半胱氨酸变体，与天然存在的ANGPTL3蛋白的氨基酸序列相比较，变体中的一个或多个半胱氨酸残基被缺失或被另外的氨基酸(例如，丝氨酸)替代。在某些实施方案中，当ANGPTL3蛋白必须重折叠成生物活性构象时(例如在分离不溶性包涵体后)，半胱氨酸变体可能是有用的。在某些实施方案中，半胱氨酸变体具有比天然多肽更少的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，半胱氨酸变体具有偶数个半胱氨酸残基以使由于不成对的半胱氨酸导致的相互作用降到最低。

在一些实施方案中，ANGPTL3蛋白的功能性变体或修饰形式包括本发明ANGPTL3蛋白和一个或多个融合结构域的融合蛋白。融合结构域的众所周知例子包括但不限于多聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、或人血清白蛋白。可以对融合结构域进行选择以赋予期望特性。例如，一些融合结构域对通过亲和层析来分离融合蛋白特别有用。为了亲和纯化目的，可以使用相关的亲和层析基质，例如谷胱甘肽-、淀粉酶-、镍-或钴-缀合的树脂。许多这样的基质可以以“试剂盒”的形式获得，例如Pharmacia GST纯化系统和与(HIS₆)融合配偶体一起使用的QIAexpress^TM系统(Qiagen)。作为另一个例子，可以对融合结构域进行选择以方便ANGPTL3蛋白的检测。这样的检测结构域的例子包括各种荧光蛋白(例如，GFP)以及“表位标签”，所述表位标签通常是可获得特异性抗体的短肽序列。众所周知的特异性单克隆抗体容易获得的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点(例如对于因子Xa或凝血酶)，这允许相关蛋白酶部分地消化融合蛋白从而将重组蛋白从其中释放出来。然后可以利用随后的层析分离从融合结构域中分离释放的蛋白质。在某些实施方案中，将ANGPTL3蛋白与在体内稳定ANGPTL3蛋白的结构域(“稳定者”结构域)融合。“稳定”意指增加血清半衰期的任何事件，不管是因为降低破坏、降低肾清除，还是由于其它药代动力学效应。已知与免疫球蛋白Fc部分的融合可以赋予许多蛋白质期望的药代动力学特性。类似地，与人血清白蛋白的融合能够赋予期望特性。可以选择的其它类型融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能性结构域(即赋予所需要的额外的生物学功能的结构域)。

Ⅲ.促血管生成素样3蛋白质的疾病适应症

可以想到的是，本发明的多肽、组合物和方法可以用于治疗或防止任何类型的关节炎或关节损伤。还可以想到的是，本发明的多肽、组合物和方法可以用于治疗或防止各种软骨病症(cartilaginous disorders)。在一些实施方案中，施用本发明的蛋白质以防止关节炎或关节损伤，例如在有关节炎或关节损伤的遗传或家族史时或在关节外科手术之前或期间。可以以本发明的多肽、组合物和方法进行治疗或预防的示例性病情(conditions)或病症包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年慢性关节炎、骨关节炎、退行性椎间盘病、脊椎关节病、系统性硬化病(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、Sjogren综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性睡眠性血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(Graves病、桥本氏甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎(atrophic thyroiditic))、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢神经系统和周围神经系统的脱髓鞘病(例如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多发性神经病或Guillain-Barr综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病)、肝胆疾病(例如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎和其它非嗜肝病毒)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎)、炎性肠病(溃疡性结肠炎：克罗恩病)、麸质过敏性肠病、Whipple病、自身免疫或免疫介导的皮肤病(包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、牛皮癣)、过敏性疾病(例如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏反应和荨麻疹)、肺部免疫性疾病(例如嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎)、移植相关疾病(包括移植排斥和移植物抗宿主病)。在本发明的一些实施方案中，本发明的多肽、组合物和方法可以用于治疗骨关节炎。

在一些实施方案中，本发明的多肽、组合物和方法提供用于在因创伤性损伤或软骨病而已被损坏的软骨组织中刺激软骨细胞增殖和软骨产生的方法。对于治疗特别重要的是展示关节面的组织，例如脊椎、肩、肘、腕、指关节、髋、膝、踝和足关节。可以通过治疗而获益的疾病的例子包括骨关节炎、类风湿性关节炎、其他自身免疫病、或分离性骨软骨炎。此外，软骨畸形常见于人的侏儒症中，表明本发明的多肽、组合物和方法可对这些病人有用。

可以想到的是，本发明的多肽、组合物和方法可以用来治疗哺乳动物。文中所使用的“哺乳动物”是指任何分类为哺乳动物的哺乳动物，包括人、家畜及农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物、例如牛(例如奶牛)、马、狗、棉羊、猪、兔、山羊、猫等。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物为人。

在一些实施方案中，本发明的多肽可以与待治疗的哺乳动物异源。例如，使用牛ANGPTL3蛋白或其片段，即来源于牛ANGPTL3蛋白的蛋白质或肽(例如，修饰的牛ANGPTL3蛋白、牛ANGPTL3蛋白的保守变体、来源于牛ANGPTL3蛋白的肽模拟物)治疗人类患者。在一些实施方案中，可以使用异源的ANGPTL3蛋白扩增培养中的软骨细胞群以用于移植。在一些实施方案中，然后将扩增的培养物和与待治疗的哺乳动物同源的多肽和组合物混合，施用于关节间隙或直接施用于软骨缺损处。可选地，本发明的多肽来源于相同的物种，即，使用人ANGPTL3蛋白或其片段——来源于人ANGPTL3蛋白的蛋白质或肽(例如，修饰的人ANGPTL3蛋白、人ANGPTL3蛋白的保守变体、来源于人ANGPTL3蛋白的肽模拟物)——治疗人类患者。通过使用来源于与待治疗的哺乳动物相同物种的蛋白质，可以避免非有意的免疫反应。

可以通过直接注射到关节的滑液中、全身给药(口服或静脉内)或直接施用于软骨缺损处，单独地或与合适的载体(用于延长蛋白质的释放)组合地，应用本发明的多肽和组合物。也可以使用本发明的多肽、组合物和方法来扩增培养中的软骨细胞群以用于自体或同种异体软骨细胞移植。任选地，可以在施用移植时，进行施用本发明的多肽和组合物的并行治疗。在这些方法中，例如，可以在关节镜下从损坏关节的未受伤的微小承重区收集软骨细胞，并在本发明的多肽和组合物的存在下对其进行培养，以在移植前增加细胞的数量。然后将扩增的培养物与本发明的多肽和组合物混合并施用于关节间隙或直接施用于缺损处。可以与骨膜或软骨膜移植物结合使用本发明的多肽和组合物，所述移植物包含能够形成软骨的细胞、和/或帮助将移植的软骨细胞或其前体细胞保持在适当的位置。可以与关节灌洗，骨髓刺激、磨削关节成形术、软骨下钻孔、软骨下骨微骨折术结合，使用本发明的多肽和组合物来修复软骨损伤。此外，在由于施用本发明的多肽和组合物导致软骨生长后，可能需要额外的外科手术治疗来使新形成的软骨表面具有合适的轮廓。

Ⅳ.药物组合物

用于治疗上述疾病或病症的本发明的化合物的剂量根据施用方式、治疗对象的年龄和体重、以及治疗对象的情况的不同而不同，并最终由主治医师或兽医决定。由主治医师或兽医确定的化合物的量在本文中称为“有效量”。

合适施用的制剂包括赋形剂，包括但不限于，水和非水溶液、等渗无菌溶液(其可以包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂处于等渗的溶质)、以及水和非水无菌悬浮液(其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。

在本发明情况下，给患者施用的剂量应足以在治疗对象中产生一段时间的有益反应。剂量可以由所使用的具体蛋白质的功效和治疗对象的情况、以及治疗对象的体重或治疗区域的表面积来确定。剂量的大小也可以由在特定的对象中伴随着特定蛋白质或载体的施用的任何不利副作用的出现、性质和程度来确定。可以以单剂量或分剂量的方式进行施用。

Ⅴ.施用方法

可以使用任何可用于将本发明的蛋白质递送到受损关节的方法。实施本发明时，可以采用例如关节内(即，施用到关节中)、口服、静脉内方式施用组合物。化合物的制剂可以在单位剂量或多剂量的密封容器(例如安瓿和小瓶)中提供。可以用前面描述的无菌粉末、颗粒和药片来配制溶液和悬浮液。也可以根据所需疗法或效果，与一种或多种其他活性剂(例如，透明质酸或其盐)联合，有效地应用本发明的蛋白质。

实施例

现提供以下实施例对要求保护的发明进行举例说明，但并非是限定该发明。

实施例1：高通量筛选软骨发生的诱导物

为了鉴定和定义OA关节修复的新的、非侵入性策略，我们开发了对蛋白质的无偏高通量筛选，以筛选能够选择性地指导人间充质干细胞(MSC)分化成软骨细胞的蛋白质。该分析系统模仿软骨中内在的MSC，鉴定可以刺激天然修复潜力和增强整体软骨再生的介质。我们选择通过对人和小鼠MSC进行高通量、基于细胞的筛选来检测独特的分泌蛋白文库。该方法提供了一种策略，使得可以快速地鉴定出影响软骨发生的未表征的天然蛋白质配体。

采取了两种方法来研究这些分泌蛋白：从哺乳动物生产细胞系(HEK293T)产生条件培养基(CM)和从Free style HEK-F细胞产生纯化的蛋白质。这两个互补方法一起已经允许在各种应用中进行新靶鉴定。

通过MSC分析法筛选蛋白质，鉴定出了先导(lead)候选物，促血管生成素样3，简称ANGPTL3。ANGPTL3在CM和纯化蛋白质两者的两个平行但正交的初始筛选中被鉴定出来。在概念CM筛选(concept CM screen)的证据中，转移CM后将C3H10t1/2细胞培养7天。通过Alcian兰染色检测软骨基质生成，在包含ANGPTL3-75的孔中发现了软骨发生。通过基于人MSC的软骨细胞分化来筛选531个纯化的蛋白质，独立地鉴定了ANGPTL3-75。

在这些初始筛选试验后，随后在6个次级分析试验中对ANGPTL3进行了表征。这些分析试验包括：(1)小鼠间充质C3H10t1/2细胞的单层培养物：诱导Ⅱ型胶原蛋白和Sox9蛋白表达(软骨发生的标志物)，但不诱导骨钙素(骨发生的标志物)；(2)在牛软骨细胞中抑制TNFα/制瘤素M(OSM)——诱导的一氧化氮(NO)释放；(3)在牛软骨器官培养物中抑制TNFα/OSM——诱导的糖胺聚糖(GAG)释放；(4)诱导软骨基质基因(聚集蛋白聚糖)在人MSC团块培养系统中表达；(5)在原代人软骨细胞、人滑膜成纤维细胞和人MSC中缺乏毒性；(6)刺激人软骨细胞增殖。

小鼠ANGPTL3蛋白可以在小鼠、人和牛细胞类型中起作用，由于其强效诱导(0.5-5nM)软骨发生性分化，因此被选择用于进一步表征，尽管在定量的基于成像的Ⅱ型胶原蛋白分析中(图1)，与其它以前知道的软骨发生诱导物相比，其人类同源物保留类似的软骨发生功效。当以0.5-5nM的ANGPTL3处理时，小鼠和人MSC都在单层和团块培养(分别地)中分化18到21天，并表达3种软骨特异性蛋白质：Ⅱ型胶原蛋白、Sox9和聚集蛋白聚糖。这通过免疫组织化学染色和Taqman的mRNA定量(图2A)进行了评价。此外，数据表明，在小鼠MSC培养18天后，通过降低碱性磷酸酶的表达，ANGPTL3抑制朝向纤维素化修复反应的自发倾向。为了评估防止组织损伤的潜在能力，以TNFα和制瘤素M(OSM)刺激牛软骨器官培养物。刺激的糖胺聚糖释放(基质降解的指示物)被ANGPTL3处理所显著抑制(图2B)。此外，对原代人软骨细胞的处理而非对人滑膜细胞的处理导致了24小时内细胞生长的2倍增加(图2C)，表明其对软骨作用的特异性。该蛋白对原代人软骨细胞、滑膜成纤维细胞和MSC的存活力也没有明显的体外毒性效应(<100μM)(未显示数据)。

在对目前临床试验的两个候选物的直接比较中，以100ng/ml的FGF18或100ng/ml的BMP7进行的治疗能够诱导软骨结节，但与ANGPTL3相比较，总体基质产生较少。FGF18缺乏增加Alcain蓝、Sox9或Ⅱ型胶原蛋白染色的能力，表示其缺乏真正软骨基质特异性。100ng/ml的BMP7增加了Alcian蓝、Sox9和Ⅱ型胶原蛋白的染色，但在相似的浓度下显著性不如ANGPTL3。

实施例2：重组全长ANGPTL3和突变蛋白的表达及功能分析

小鼠ANGPTL3被预测为51kDa的蛋白质。其属于包括7个鉴定的促血管生成素样(ANGPTL)蛋白质的家族，这些蛋白与促血管生成素具有结构类似性，但缺乏结合Tie2受体的能力，并具有不同的功能。它们包含N-端卷曲螺旋结构域(CCD)和C-端纤维蛋白原样结构域(FLD)。ANGPTL蛋白受其微环境严格调控并与细胞外基质(ECM)相互作用，然而精确的相互作用位点和配偶体没有得到详细阐明。ANGPTL3由肝脏分泌并全身循环。它通过肝脏X受体(LXR)被控制，证据是LXR诱导的高甘油三酯血症是由ANGPTL3释放引起的。CCD和ECM之间通过推定的肝素结合基序的相互作用可以导致在原蛋白转化酶识别序列(R221-R224)处的切割受到抑制，这与关于ANGPTL4的报道类似。切割导致CCD抑制脂蛋白脂肪酶活性(LPL)的能力显著增加，从而导致甘油三酯(TG)增加。这是本发明之前鉴定到的ANGPTL3的主要生物学功能。C-末端FLD在大鼠角膜内直接移植后在体内足以诱导内皮细胞粘着和介导血管发生。重组ANGPTL3也被证实能够和纯化的αVβ3整联蛋白结合并导致内皮细胞中FAK、MAPK和AKT信号传导的增强。这些数据说明，FLD与整联蛋白相互作用以介导血管发生。

ANGPTL3在人软骨细胞、hMSC或人滑膜成纤维细胞中的表达未有过报告，在我们使用western印迹的研究中也没有观察到该表达；而且在小鼠膝关节中也没有发现其表达。此外，没有人报道过任何片段在关节细胞中具有与我们筛选中鉴定到的该新软骨发生功能相关的活性。

我们的数据表明，全长ANGPTL3是软骨发生和软骨保护的新介质。我们检测了对于这种新的软骨发生功能关键的ANGPTL3结构域。对ANGPTL3的一系列截短物和全长蛋白在工程化HEK-S细胞系中进行了表达和纯化，所述HEK-S细胞系提供了有限的和同质的糖基化用于进行详细的生物物理学表征。质谱方法证实了所有4个预测的N-连接的糖基化(N115、N232、N296和N357，图3A)的占据。从HEK内源加工的片段，确定了CCD和FLD结构域之间的蛋白酶解切割位点为R224。通过尺寸排阻色谱洗脱全长ANGPTL3，其质量大于400kDa，指示了具有异质糖基化的三聚体。对经尺寸排阻和静态光散射后显示为单体的FLD(241-455)进行了结晶。在1.8埃分辨率下确定了FLD的原子结构。FLD的结构显示出核心β折叠构型以及螺旋区段，这些螺旋区段使3个环方向朝向C端，这是其它FLD同源物所典型的(图3B)。在该结构域的C-末端部分中温度系数高于此结构的其它部分，表明了该区域中高度的柔性。与ANGPTL2/Tie2结构(PDB编号：2GY7)的叠合，表明FLD的C-末端部分可能涉及蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

在多个软骨发生分析中对所构建的5个截短物进行了评估。结果表明，CCD单独不能保持活性，而FLD保留了活性。此外，用全长或突变体G或H单独刺激3天，SMAD1磷酸化增强，表明软骨发生信号级联的激活。

尽管关节内注射的蛋白质的全身性暴露由于滑液淋巴排流(lymph drainage)而是有限的，但有时期望将全身性暴露量降到最低。如果存在全身性暴露，ANGPTL3的切割可以导致释放CCD结构域。CCD引起的LPL活性抑制的增强可能导致患者TG水平发生改变。我们的结果显示出ANGPTL3潜在的临床优势。例如，通过解剖ANGPTL3中软骨发生活性所在的位置，我们可以将该不想要的对脂质代谢的全身性影响或该血管发生特性降到最低或排除掉。软骨发生活性主要位于C端，因此对该结构域的特别使用将减轻与全长分子或N端的TG调节有关的顾虑。由于全长ANGPTL3通常存在于血清中，因此不存在预期的免疫原性。使用C端的另外优点是它经过了切割，与三聚体化的全长蛋白相比较，它是单体(约29kDa)，因此可减少可能存在于血液循环中的任何小百分比的系统半衰期，和限制来自血管发生的任何潜在效应。

实施例3：ANGPTL3的体内分析

我们对全长ANGPTL3进行了几种体内评估，以阐明潜在的不利事件和关节内停留。在对8周龄C57BL/10小鼠的左膝关节进行关节内(IA)注射3.6μg的全长ANGPTL3之后，我们通过免疫组织化学进行了24小时表达(在存在和缺乏暴露时)评估。到24小时，应该有非常少至没有可检测水平的ANGPTL3存留在滑液中，这是因为蛋白质和水通过反滑液流进入滑膜淋巴管的典型周转为约2小时。结果显示，在未处理的关节中没有ANGPTL3的内源表达，但是甚至在24小时的时间点上，在关节软骨和半月板中在细胞周围基质中显著检测到该蛋白质。此外，没有在体内检测到广泛的对软骨细胞的细胞毒性或软骨损坏。在一系列的3次IA注射到大鼠的膝关节中(每周一次，进行3周)后，在大鼠的关节中没有临床毒性(无关节肿胀或步态上的改变)或急性炎症反应的迹象。在组织学上，在5只经注射的大鼠的关节中，没有增加的滑膜炎或不受控制的增殖。与在小鼠中一样，能够在软骨基质和软骨细胞的周围检测到ANGPTL3。这些结果表明，ANGPTL3不对软骨本身产生任何不期望的效应，并表明在体内ANGPTL3确实进入并留在软骨和半月板中。

OA不是单一的疾病实体，它可被视为是多种病因的结果。在人类中，它常由异常的生物机械应力或关节软骨或骨的遗传或获得性异常而引起。因此，选择“最佳”小动物OA模型是困难的，应该探索多种模型以确定任何疗法的保护性特性。我们已经在慢性OA模型(胶原酶Ⅶ诱导的，基于van der Kraan及其同事描述的研究)和急性外科手术模型(涉及关节中3个主要韧带(ACL、MCL和MMTL)的横断，基于Glasson等的工作)中进行了功效研究。两种模型都诱导与OA普遍相关的病理学改变：蛋白聚糖染色的丧失、软骨和骨的侵蚀、骨赘的形成以及滑膜和韧带中的化生性改变可以在OA开始后4-8周是明显的。图5描绘了OA的手术模型中ANGPTL3的再生能力。为了开始检测用于OA的潜在生物标志，在手术模型期间收集了外周血以测定由于软骨损伤而释放的Ⅱ型胶原蛋白片段(图5A)。组织学分析和其后的胫骨内侧平台的分级揭示了以200ng的ANGPTL3/膝每周处理一次共处理3周后软骨基质的再生(图5B)。

在小鼠的8周手术OA子集中，通过双足平衡测痛，检测了3个剂量的ANGPTL3对于OA诱导的疼痛的减轻作用。该方法测量手术和非手术腿之间的重量分配。与以媒介物处理的手术膝相比较，在手术和用PRO1每周1次共3次处理后第36天，低至100ng/膝的给药显示出了显著的改善(图5C)。这些综合的数据提供了明确的证据证明ANGPTL3在两个OA模型中具有体内功效(病理学矫正和疼痛减弱)，并为其作为新OA疗法的开发提供了支持。

应理解的是，本文中所描述的实施方案和实施例只是为了举例说明目的，对于本领域技术人员，其各种修改和改变形式是明显的，这些修改和改变包括在本申请的精神和范畴中以及后附权利要求的范围内。在本文中引用的所有出版物、专利和专利申请就其全部内容通过参考并入本文中用于所有目的。

序列表

X＝任何氨基酸

括号内的氨基酸表示该氨基酸可以不存在或存在

SEQ ID NO:1

241-455共有

XXPAXCXXXYNXGXHTSGXYXIXPXNSQXFXVYCDXXSGSXWTLIQHRXDGSQXFNETWENYXXGFGRLDGEFWLGLEKIYXIVXQSNYXLRXELXDWXD(X)KXYXEYXFXLGXHETNYTLHXXXIXGNXXXAXPEXXDLXFSTWXHXAKGXXXCPEXXSGGWWXXXXCGENNLNGKYNKXXXKXXPERXXGXXWXXQXXXLYXIKXXKMXXXPXX

SEQ ID NO:2

225-455共有

TTPXXXXNEXXNXXXXXXPAXCXXXYNXGXHTSGXYXIXPXNSQXFXVYCDXXSGSXWTLIQHRXDGSQXFNETWENYXXGFGRLDGEFWLGLEKIYXIVXQSNYXLRXELXDWXD(X)KXYXEYXFXLGXHETNYTLHXXXIXGNXXXAXPEXXDLXFSTWXHXAKGXXXCPEXXSGGWWXXXXCGENNLNGKYNKXXXKXXPERXXGXXWXXQXXXLYXIKXXKMXXXPXX

SEQ ID NO:3

207-455共有

XIXEXXEXSLSSKXRAPRTTPXXXXNEXXNXXXXXXPAXCXXXYNXGXHTSGXYXIXPXNSQXFXVYCDXXSGSXWTLIQHRXDGSQXFNETWENYXXGFGRLDGEFWLGLEKIYXIVXQSNYXLRXELXDWXD(X)KXYXEYXFXLGXHETNYTLHXXXIXGNXXXAXPEXXDLXFSTWXHXAKGXXXCPEXXSGGWWXXXXCGENNLNGKYNKXXXKXXPERXXGXXWXXQXXXLYXIKXXKMXXXPXX

SEQ ID NO:4

全长共有

MXTIKLXLXXXPLVIXSXXDXDXXSXDSXXXEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLXTXEIKEEEKELRRXTXXLQVKNEEVKNMSXELXSKXES LLEEKXXLQXKVXXLEXQLTXLI XXXXXXXEXXEVTS LKXXVEXQDNS IXXLLQXVEXQYXQLXQQXXQIKEIEXQLR(X)XXIXEXXEXSLSSKXRAPRTTPXXXXNEXXNXXXXXXPAXCXXXYNXGXHTSGXYXIXPXNSQXFXVYCDXXSGSXWTLIQHRXDGSQXFNETWENYXXGFGRLDGEFWLGLEKIYXIVXQSNYXLRXELXDWXD(X)KXYXEYXFXLGXHETNYTLHXXXIXGNXXXAXPEXXDLXFSTWXHXAKGXXXCPEXXSGGWWXXXXCGENNLNGKYNKXXXKXXPERXXGXXWXXQXXXLYXIKXXKMXXXPXX(SEXXE)

SEQ ID NO:5

人ANGPTL3241-455

GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD

SEQ ID NO 6

人ANGPTL3 225-455

TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD

SEQ ID NO 7

人ANGPTL3 207-455

IQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD

SEQ ID NO 8

全长人ANGPTL3 gi|7656888|ref|NP_055310.1|[Homo sapiens]

MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE

SEQ ID NO:9

小鼠ANGPTL3 241-455

DLPADCSAVYNRGEHTSGVYTIKPRNSQGFNVYCDTQSGSPWTLIQHRKDGSQDFNETWENYEKGFGRLDGEFWLGLEKIYAIVQQSNYILRLELQDWKDSKHYVEYSFHLGSHETNYTLHVAEIAGNIPGALPEHTDLMFSTWNHRAKGQLYCPESYSGGWWWNDICGENNLNGKYNKPRTKSRPERRRGIYWRPQSRKLYAIKSSKMMLQPTT

SEQ ID NO 10

小鼠ANGPTL3 225-455

TTPPLQLNETENTEQDDLPADCSAVYNRGEHTSGVYTIKPRNSQGFNVYCDTQSGSPWTLIQHRKDGSQDFNETWENYEKGFGRLDGEFWLGLEKIYAIVQQSNYILRLELQDWKDSKHYVEYSFHLGSHETNYTLHVAEIAGNIPGALPEHTDLMFSTWNHRAKGQLYCPESYSGGWWWNDICGENNLNGKYNKPRTKSRPERRRGIYWRPQSRKLYAIKSSKMMLQPTT

SEQ ID NO 11

小鼠ANGPTL3 207-455

IQEPSENSLSSKSRAPRTTPPLQLNETENTEQDDLPADCSAVYNRGEHTSGVYTIKPRNSQGFNVYCDTQSGSPWTLIQHRKDGSQDFNETWENYEKGFGRLDGEFWLGLEKIYAIVQQSNYILRLELQDWKDSKHYVEYSFHLGSHETNYTLHVAEIAGNIPGALPEHTDLMFSTWNHRAKGQLYCPESYSGGWWWNDICGENNLNGKYNKPRTKSRPERRRGIYWRPQSRKLYAIKSSKMMLQPTT

SEQ ID NO 12

全长小鼠ANGPTL3 gi|33469117|ref|NP_038941.1|[Mus musculus]

MHTIKLFLFVVPLVIASRVDPDLSSFDSAPSEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLRTNEIKEEEKELRRTTSTLQVKNEEVKNMSVELNSKLESLLEEKTALQHKVRALEEQLTNLILSPAGAQEHPEVTSLKSFVEQQDNSIRELLQSVEEQYKQLSQQHMQIKEIEKQLRKTGIQEPSENSLSSKSRAPRTTPPLQLNETENTEQDDLPADCSAVYNRGEHTSGVYTIKPRNSQGFNVYCDTQSGSPWTLIQHRKDGSQDFNETWENYEKGFGRLDGEFWLGLEKIYAIVQQSNYILRLELQDWKDSKHYVEYSFHLGSHETNYTLHVAEIAGNIPGALPEHTDLMFSTWNHRAKGQLYCPESYSGGWWWNDICGENNLNGKYNKPRTKSRPERRRGIYWRPQSRKLYAIKSSKMMLQPTT

SEQ ID NO:13

牛ANGPTL3 241-454

DIPADCTIIYNQGKHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVMQSNYILRIELEDWKDKYYTEYSFHLGDHETNYTLHLAEISGNGPKAFPEHKDLMFSTWDHKAKGHFNCPESNSGGWWYHDVCGENNLNGKYNKPKAKAKPERKEGICWKSQDGRLYSIKATKMLIHPSD

SEQ ID NO 14

牛ANGPTL3 225-454

TTPSFHSNETKNVEHDDIPADCTIIYNQGKHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVMQSNYILRIELEDWKDKYYTEYSFHLGDHETNYTLHLAEISGNGPKAFPEHKDLMFSTWDHKAKGHFNCPESNSGGWWYHDVCGENNLNGKYNKPKAKAKPERKEGICWKSQDGRLYSIKATKMLIHPSD

SEQ ID NO 15

牛ANGPTL3 207-454

IKESTEISLSSKPRAPRTTPSFHSNETKNVEHDDIPADCTIIYNQGKHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVMQSNYILRIELEDWKDKYYTEYSFHLGDHETNYTLHLAEISGNGPKAFPEHKDLMFSTWDHKAKGHFNCPESNSGGWWYHDVCGENNLNGKYNKPKAKAKPERKEGICWKSQDGRLYSIKATKMLIHPSD

SEQ ID NO 16

全长牛ANGPTL3 gi|122692391|ref|NP_001073814.1|

[Bos taurus]

MYTIKLFLIIAPLVISSRTDQDYTSLDSISPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTNEIKEEEKELRRATSKLQVKNEEVKNMSLELDSKLESLLEEKILLQQKVRYLEDQLTDLIKNQPQIQEYLEVTSLKTLVEQQDNSIKDLLQIVEEQYRQLNQQQSQIKEIENQLRRTGIKESTEISLSSKPRAPRTTPSFHSNETKNVEHDDIPADCTIIYNQGKHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVMQSNYILRIELEDWKDKYYTEYSFHLGDHETNYTLHLAEISGNGPKAFPEHKDLMFSTWDHKAKGHFNCPESNSGGWWYHDVCGENNLNGKYNKPKAKAKPERKEGICWKSQDGRLYSIKATKMLIHPSDSENSE

SEQ ID NO:17

犬ANGPTL3 240-454

DIPANCTTIYNRGEHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYRYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYILRIELEDWNDNKHYIEYFFHLGNHETNYTLHLVEITGNILNALPEHKDLVFSTWDHKAKGHVNCPESYSGGWWWHNVCGENNLNGKYNKQRAKTKPERRRGLYWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPID

SEQ ID NO:18

犬ANGPTL3 224-454

TTPFLHLNETKNVEHNDIPANCTTIYNRGEHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYRYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYILRIELEDWNDNKHYIEYFFHLGNHETNYTLHLVEITGNILNALPEHKDLVFSTWDHKAKGHVNCPESYSGGWWWHNVCGENNLNGKYNKQRAKTKPERRRGLYWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPID

SEQ ID NO:19

犬ANGPTL3 206-454

IQESTENSLSSKPRAPRTTPFLHLNETKNVEHNDIPANCTTIYNRGEHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYRYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYILRIELEDWNDNKHYIEYFFHLGNHETNYTLHLVEITGNILNALPEHKDLVFSTWDHKAKGHVNCPESYSGGWWWHNVCGENNLNGKYNKQRAKTKPERRRGLYWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPID

SEQ ID NO:20

全长犬ANGPTL3 gi|57086505|ref|XP_536686.1|[Canis familiaris]

MYTIKLFLFIIPLVISSKIDRDYSSYDSVSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTNEIKEEEKELRRTTSKLQVKNEEVKNMSLELNSKVESLLEEKILLQQKVRYLEKQLTSLIKNQPEIQEHPEVTSLKTFVEQQDNSIKDLLQTVEEQYRQLNQQHSQIKEIENQLRNVIQESTENSLSSKPRAPRTTPFLHLNETKNVEHNDIPANCTTIYNRGEHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYRYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYILRIELEDWNDNKHYIEYFFHLGNHETNYTLHLVEITGNILNALPEHKDLVFSTWDHKAKGHVNCPESYSGGWWWHNVCGENNLNGKYNKQRAKTKPERRRGLYWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPIDSESSE

SEQ ID NO:21

马ANGPTL3 241-455

DFPADCTTIYNRGEHTSGIYSIKPSNSQVFNVYCDVISGSSWILIQRRIDGSQNFNETWQNYKYGFGRLDFEFWLGLEKIYSIVKRSNYILRIELEDWKDNKHTIEYSFHLGNHETNYTLHLVEITGNVPNALPEHKDLVFSTWDHKAKGQLNCLESYSGGWWWHDVCGGDNPNGKYNKPRSKTKPERRRGICWKSQNGRLYTIKSTKMLIHPID

SEQ ID NO:22

马ANGPTL3 225-455

TTPSFHLNETKDVEHDDFPADCTTIYNRGEHTSGIYSIKPSNSQVFNVYCDVISGSSWILIQRRIDGSQNFNETWQNYKYGFGRLDFEFWLGLEKIYSIVKRSNYILRIELEDWKDNKHTIEYSFHLGNHETNYTLHLVEITGNVPNALPEHKDLVFSTWDHKAKGQLNCLESYSGGWWWHDVCGGDNPNGKYNKPRSKTKPERRRGICWKSQNGRLYTIKSTKMLIHPID

SEQ ID NO:23

马ANGPTL3 207-455

IQESTENSLSSKPRAPRTTPSFHLNETKDVEHDDFPADCTTIYNRGEHTSGIYSIKPSNSQVFNVYCDVISGSSWILIQRRIDGSQNFNETWQNYKYGFGRLDFEFWLGLEKIYSIVKRSNYILRIELEDWKDNKHTIEYSFHLGNHETNYTLHLVEITGNVPNALPEHKDLVFSTWDHKAKGQLNCLESYSGGWWWHDVCGGDNPNGKYNKPRSKTKPERRRGICWKSQNGRLYTIKSTKMLIHPID

SEQ ID NO:24

全长马ANGPTL3[equus caballus]

MYTIKLFLVIAPLVISSRIDQDYSSLDSIPPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYALSLQTNEIKEEEKELRRTTSKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKSLLQQKVKYLEEQLTKLIKNQPEIQEHPEVTSLKTFVEQQDNSIKDLLQTMEEQYRQLNQQHSQIKEIENQLRRTGIQESTENSLSSKPRAPRTTPSFHLNETKDVEHDDFPADCTTIYNRGEHTSGIYSIKPSNSQVFNVYCDVISGSSWILIQRRIDGSQNFNETWQNYKYGFGRLDFEFWLGLEKIYSIVKRSNYILRIELEDWKDNKHTIEYSFHLGNHETNYTLHLVEITGNVPNALPEHKDLVFSTWDHKAKGQLNCLESYSGGWWWHDVCGGDNPNGKYNKPRSKTKPERRRGICWKSQNGRLYTIKSTKMLIHPIDSESFELRQIKKPMN

SEQ ID NO:25

241-455共有

XXPAXCXXXYNXGXHTSGXYXIXPXNSQXFXVYCDXXSGSXWXLIQXRXDGSQXFNETWXNYXXGFGRLDXEFWLGLEKIYXIVXXSNYXLEXELXDWXD(X)KXXXEYXFXLGXHETNYTLHXXXIXGNXXXAXPEXXDLXFSTWXHXAKGXXXCXEXXSGGWWXXXXCGXXNXNGKYNKXXXKXXPERXXGXXWXXQXXXLYXIKXXKMXXXPXX

SEQ ID NO:26

225-455共有

TTPXXXXNEXXXXXXXXXPAXCXXXYNXGXHTSGXYXIXPXNSQXFXVYCDXXSGSXWXLIQXRXDGSQXFNETWXNYXXGFGRLDXEFWLGLEKIYXIVXXSNYXLEXELXDWXD(X)KXXXEYXFXLGXHETNYTLHXXXIXGNXXXAXPEXXDLXFSTWXHXAKGXXXCXEXXSGGWWXXXXCGXXNXNGKYNKXXXKXXPERXXGXXWXXQXXXLYXIKXXKMXXXPXX

SEQ ID NO:27

207-455共有

XIXEXXEXSLSSKXRAPRTTPXXXXNEXXXXXXXXXPAXCXXXYNXGXHTSGXYXIXPXNSQXFXVYCDXXSGSXWXLIQXRXDGSQXFNETWXNYXXGFGRLDXEFWLGLEKIYXIVXXSNYXLEXELXDWXD(X)KXXXEYXFXLGXHETNYTLHXXXIXGNXXXAXPEXXDLXFSTWXHXAKGXXXCXEXXSGGWWXXXXCGXXNXNGKYNXXXXKXXPERXXGXXWXXQXXXLYXIKXXKMXXXPXX

SEQ ID NO:28

全长共有

MXTIKLXLXXXPLVIXSXXDXDXXSXDSXXXEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYXLSLXTXEIKEEEKELRRXTXXLQVKNEEVKNMSXELXSKXESLLEEKXXLQXKVXXLEXQLTXLIXXXXXXXEXXEVTSLKXXVEXQDNSIXXLLQXXEXQYXQLXQQXXQIKEIEXQLR(X)XXIXEXXEXSLSSKXRAPRTTPXXXXNEXXXXXXXXXPAXCXXXYNXGXHTSGXYXIXPXNSQXFXVYCDXXSGSXWXLIQXRXDGSQXFNETWXNYXXGFGRLDXEFWLGLEKIYXIVXXSNYXLEXELXDWXD(X)KXXXEYXFXLGXHETNYTLHXXXIXGNXXXAXPEXXDLXFSTWXHXAKGXXXCXEXXSGGWWXXXXCGXXNXNGKYNKXXXKXXPERXXGXXWXXQXXXLYXIKXXKMXXXPXX(SEXXEXXXXXXXXX)

Claims

1.多肽，其由选自如下的氨基酸序列组成：

氨基酸序列SEQ ID NO:5、6、7、9、10、11、13、14、15、17、18、19、21、22或23，

且其中所述多肽具有软骨发生活性。

2.融合蛋白，其包含权利要求1中的一条多肽，

所述多肽与选自人血清白蛋白(HAS)、免疫球蛋白Fc、多聚组氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、或麦芽糖结合蛋白(MBP)的异源蛋白质融合。

3.权利要求1的多肽或权利要求2的融合蛋白，其中多肽被聚乙二醇化。

4.权利要求1的多肽或权利要求2的融合蛋白，其中多肽包含1、2、3、4或更多个非天然氨基酸。

5.药物组合物，其包含权利要求1的多肽或权利要求2的融合蛋白。

6.权利要求5的药物组合物，其中所述组合物还包含透明质酸。

7.权利要求5的药物组合物，用于关节内递送。