CN109963579A - 用于治疗软骨损伤和关节炎的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于治疗软骨损伤或关节炎的方法和组合物。
Description
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表特此通过引用以其全文并入。2017年10月26日创建的所述ASCII副本名称为PAT057513-WO-PCT_SL.txt，大小为95,244字节。
技术领域
本发明涉及用于治疗软骨损伤(例如，关节软骨损伤)或关节炎的方法和组合物。
背景技术
骨关节炎(OA)代表最常见的肌肉骨骼障碍。目前大约有4000万美国人受到影响；由于人口老龄化和预期寿命延长，预计在未来20年内，这一数字将增加到6000万，使骨关节炎成为导致残疾的第四大原因。OA的特征在于关节的缓慢退行性破坏，该关节包括关节软骨(含有细胞和基质，其为关节产生润滑和缓冲)和关节软骨下面的软骨下骨。OA可被认为是多种病因的结果。例如，骨关节炎可能由关节软骨或骨的异常生物力学应力或者遗传或后天异常引起。
关节损伤例如急性关节损害(如半月板或韧带撕裂)或关节内骨折也可导致关节炎，例如创伤后关节炎。由于关节软骨的修复能力有限，即使很小的不可检测的损伤通常会随着时间的推移而恶化并导致OA。
尽管手术技术和再生技术在软骨修复、减缓退化和改善关节损伤(例如关节软骨损伤)的修复方面取得了一些进展，但仍需要对用于软骨再生、治疗关节损伤例如关节软骨损伤或OA的组合物和方法的改进。
发明内容
本发明提供了用于通过向受试者的关节给予关节内剂量的具有软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽来治疗受试者(例如，人受试者)的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法和组合物。
本文提供了通过向人受试者的关节给予约0.2-200mg关节内剂量的多肽来治疗该人受试者中的关节炎或软骨损伤的方法，该多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，并且该多肽具有软骨形成活性。在一些实施例中，该人受试者患有软骨损伤。在一些实施例中，该人受试者患有骨关节炎、创伤性关节炎或自身免疫性关节炎。
在一些实施例中，该多肽中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸是Q或S或者是缺失的。在一些实施例中，该多肽包含表1中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，该多肽由表1中列出的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，本文提供了通过向人受试者的关节给予约0.2-200mg关节内剂量的包含SEQ ID NO:17的多肽来治疗该人受试者中的关节炎或软骨损伤的方法。在一些实施例中，本文提供了通过向人受试者的关节给予约0.2-200mg关节内剂量的由SEQ ID NO:17组成的多肽来治疗人受试者中的关节炎或软骨损伤的方法。
在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约0.2-100mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约0.2-60mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约0.2-40mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约2-40mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约10-40mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约20-40mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约40-60mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约0.2mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约2mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约10mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约20mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约40mg。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽的关节内剂量为约60mg。
在一些实施例中，将该ANGPTL3多肽以单次注射给予至受试者的关节。在一些实施例中，将该ANGPTL3多肽以多次注射给予至受试者的关节。在一些实施例中，将该ANGPTL3多肽每两周给予一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或软骨损伤。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽每月给予一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或软骨损伤。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽每周给予一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或软骨损伤。
在一些实施例中，这些方法还包括对该受试者中的受累及关节进行外科手术。该多肽可以在该外科手术之前、期间或之后给予。
在一些实施例中，这些方法还包括另外的程序。例如，可以将该多肽或组合物与骨髓刺激、软骨置换、自体软骨细胞移植(ACI)或基质诱导的自体软骨细胞移植(MACI)中的任何一种一起给予。在一些实施例中，可以将该多肽或组合物与ACI一起给予。
本文还提供了包含约0.2-200mg多肽的组合物，该多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，该组合物用于治疗人受试者中的关节炎或软骨损伤，其中该多肽是经关节内给予的。该关节炎可以是骨关节炎、创伤性关节炎或自身免疫性关节炎。
在一些实施例中，该多肽中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸是Q或S或者是缺失的。在一些实施例中，该多肽包含表1中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，该多肽由表1中列出的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，本文提供了包含约0.2-200mg的含有SEQ ID NO:17的多肽的组合物，以用于治疗人受试者中的关节炎或软骨损伤，其中该多肽是经关节内给予的。在一些实施例中，本文提供了包含约0.2-200mg的由SEQ ID NO:17组成的多肽的组合物，以用于治疗人受试者中的关节炎或软骨损伤，其中该多肽是经关节内给予的。
在一些实施例中，本文提供了组合物，其包含约0.2-60mg(例如，约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg)的含有SEQ ID NO:17的多肽，以用于治疗人受试者中的关节炎或软骨损伤，其中该多肽是经关节内给予的。
在一些实施例中，本文提供了组合物，其包含约0.2-60mg(例如，约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg)的由SEQ ID NO:17组成的多肽，以用于治疗人受试者中的关节炎或软骨损伤，其中该多肽是经关节内给予的。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管可以使用与本文所述那些方法和材料类似或等同的方法和材料来实践本发明，但是下面描述了合适的方法和材料。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其全文并入。在冲突存在的情况下，则以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法、和实例仅仅是示例性的并且不旨在是限制性的。
本发明的一个或多个实施例的细节陈述于附图和下文的描述中。根据说明书和附图并且根据权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将是清楚的。
附图说明
图1示出了在计划进行全膝关节置换的原发性骨关节炎患者中，SEQ ID NO:17的ANGPTL3多肽的随机、安慰剂对照、双盲的首次人类单一递增剂量研究的研究设计。
具体实施方式
本发明提供了用于通过向受试者的关节给予关节内剂量的具有软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽来治疗受试者(例如，人受试者)的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法和组合物。
定义
本领域技术人员将认识到许多类似于或等同于本文所述那些的方法和材料，这些方法和材料可用于实践本发明。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。
应该理解，尽管并非总是明确说明，但所有数字标号前面都有术语“约”。因此，除非有相反的指示，否则说明书和权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以根据本披露试图获得的所需特性而变化。当提及可测量值时，术语“约”意指包括来自指定值的+/-10％、更优选+/-5％、甚至更优选+/-1％、并且再更优选+/-0.1％的变化。例如，当提及pH时，术语“约”意指包括指定pH值的+/-0.3的变化。
“ANGPTL3”是指血管生成素样3，其是分泌因子的血管生成素样家族的成员。它主要在肝脏中表达，并具有血管生成素的特征结构，其由信号肽、N-末端卷曲螺旋结构域(CCD)和C-末端纤维蛋白原(FBN)样结构域组成。ANGPTL3显示结合αV/β3整合素，并且单独的FBN样结构域足以诱导内皮细胞粘附和体内血管生成(Camenisch等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:17281-17290,2002)。内源性ANGPTL3通常在体内裂解成氨基末端和羧基末端片段。
ANGPTL3的氨基酸序列(GenBank登录号NP_055310.1)如SEQ ID NO:1所示；并且其相应的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(NCBI参考序列号NM_014495.3)。
血管生成素相关蛋白3前蛋白原[智人，NP_055310.1]
MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE(SEQ ID NO:1)
智人血管生成素样3(ANGPTL3)，cDNA[NM_014495.3]
“ANGPTL3多肽”是指天然存在的ANGPTL3蛋白或其片段或变体。出于本披露的目的，通常参考全长野生型人ANGPTL3多肽序列(SEQ ID NO:1)确定氨基酸的编号。因此，在其中本发明的多肽仅含有全长ANGPTL3的C-末端部分但不包含N-末端部分的实施例中，尽管该肽的长度小于460个氨基酸，但这些位置的编号是基于SEQ ID NO:1。例如，对本发明的ANGPTL3多肽的位置423的提及是指SEQ ID NO:1的位置423，即使本发明的ANGPTL3多肽本身长度可能仅为200个氨基酸。在确定目标序列中“对应于”参考序列如SEQ ID NO:1中的位置的氨基酸时，这通过最佳地比对这些序列来进行，例如使用默认的CLUSTAL比对参数或默认的BLAST 2比对参数并比较这些序列来进行。例如，在“参考SEQ ID NO:1确定的”目标序列中的位置423或“对应于”SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸意指当与SEQ ID NO:1最佳地比对时与SEQ ID NO:1的位置423对齐的氨基酸。
如本文所用的术语“蛋白酶抗性”是指包含修饰的多肽，该修饰使得该多肽与相应的未修饰的野生型多肽相比更不易被胰蛋白酶样蛋白酶裂解。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对氨基酸(可包括蛋白质的或肽的序列)的最大数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，其例如在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，该蛋白质存在很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段，基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“变体”是指一种多肽，其与参考多肽具有基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列编码并且能够具有参考多肽的一种或多种活性。例如，变体可以与参考多肽具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，同时保留该参考多肽的一种或多种活性。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸和硒代半胱氨酸。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者其中所述核酸不编码具有基本上相同的序列的氨基酸序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文中由多核苷酸编码的每个多肽序列包括核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所述序列中。本领域技术人员将认识到核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加(这相对于原始编码的氨基酸序列改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸)导致“保守修饰的变体”，其中该改变产生了对一个氨基酸用化学上相似的氨基酸的取代和/或如下多肽序列，该多肽序列产生与原始蛋白质具有相似功能活性的结构上相似的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。这种保守修饰的变体是对本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除这些多态变体、种间同源物和等位基因。
术语“保守氨基酸取代”是指来自一个组的氨基酸被来自相同组的不同氨基酸取代(从概念上或以其他方式)。取代的一个实例是基于分析同源生物的相应蛋白质之间的氨基酸变化的归一化频率(参见例如，Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,Principles of ProteinStructure[蛋白质结构原理],Springer-Verlag[施普林格])。根据这样的分析，可以定义氨基酸组，其中组内的氨基酸彼此优先交换，因此，它们对总体蛋白质结构的影响彼此最为相似(参见例如，Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,Principles of Protein Structure[蛋白质结构原理],Springer-Verlag[施普林格])。以这种方式定义的一组氨基酸组的一个实例包括：(i)由Glu和Asp、Lys、Arg和His组成的带电组；(ii)由Lys、Arg和His组成的带正电的组；(iii)由Glu和Asp组成的带负电的组；(iv)由Phe、Tyr和Trp组成的芳香族组；(v)由His和Trp组成的氮环组；(vi)由Val、Leu和Ile组成的大脂肪族非极性组；(vii)由Met和Cys组成的略带极性的组；(viii)由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro组成的小残基组；(ix)由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成的脂肪族组；以及(x)由Ser和Thr组成的小羟基组。基于共有物理特性的保守取代的其他实例是以下组中的取代：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton,Proteins[蛋白质](1984))。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置均被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，那么它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数的直接函数；例如，如果两个序列中这些位置的一半(例如，长度为10个亚基的聚合物中的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果这些位置的90％(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。“序列同一性”的百分比可以通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定，其中该比较窗口中的氨基酸序列的片段与用于这两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(例如，缺口或突出)。可以通过以下方法计算该百分比：测定在这两个序列中出现相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数，将该匹配位置数除以该比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。输出是主题序列关于查询序列的百分比同一性。
适用于确定序列同一性和序列相似度百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，所述长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。字命中沿着每个序列在两个方向上扩展，远至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，停止每个方向上的字命中的延伸：该累积比对得分从其最大获得值下降数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分趋于零或低于零；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3、期望值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。该BLAST算法还对两个序列之间的相似度进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似度量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示该核酸或蛋白质被纯化为基本不含天然状态下与其结合的其他细胞组分。它通常处于同质或接近同质的状态。它可以是干燥的或者是水溶液。纯度和同质性可使用本领域已知和常用的分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱等测定。蛋白质作为制剂中存在的主要物质，是基本上纯化的。在一些实施例中术语“纯化的”表示蛋白质在电泳凝胶中产生基本一个条带。通常，这意味着蛋白质为至少85％纯、更优选至少95％纯以及最优选至少99％纯。
术语“受试者”是指根据提供的本发明方法进行治疗的动物、人或非人。考虑了兽医应用和非兽医应用。该术语包括但不限于哺乳动物，例如人、其他灵长类动物、猪、啮齿动物如小鼠和大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、牛、马、猫、狗、绵羊和山羊。典型的受试者包括人、农场动物和家养宠物，如猫和狗。
术语“治疗”(“treat”或“treatment”)是指治疗性治疗和预防性或防护性措施，其中目的是预防或减缓不期望的生理变化或障碍。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻症状、降低疾病程度、疾病状态稳定(即，不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。
具有软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽
本披露涉及向受试者(例如人受试者)关节内给予具有软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽，以用于治疗软骨损伤(例如，关节软骨损伤)或关节炎。具有软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽已在WO 2014/138687中描述，将其通过引用以其全文并入。
本文所述的ANGPTL3多肽具有软骨形成活性。如本文所定义，软骨形成或软骨形成活性是指从间充质干细胞(MSC)发育软骨细胞。间充质干细胞(MSC)存在于成人关节软骨中，并且在分离后可以在体外程序化以分化成软骨细胞和其他间充质细胞谱系，并且可以用于软骨再生。软骨形成活性的指示物包括但不限于软骨基质产生。可以通过各种标记物测量软骨基质产生，如Sox9、II型胶原或糖胺聚糖(GAG)产生。在一些实施例中，II型胶原表达是以软骨基质产生的标记物来测量。在一些实施例中，GAG产生是以软骨基质产生的标记物来测量。在一些实施例中，随着软骨特异性蛋白质表达，GAG产量增加3倍表明阳性软骨基质产生。
本文描述的ANGPTL3多肽是蛋白酶抗性的。可以使用测量通过丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶的裂解的任何已知测定来评估多肽的蛋白酶抗性。在一些实施例中，用于评价蛋白质水解易感性的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶。如果多肽与其野生型对应物相比时对胰蛋白酶具有降低的敏感性，则认为该多肽是蛋白酶抗性的。测定的实例是测量当多肽与相应的天然人肽相比经一段时间暴露于胰蛋白酶时生成的裂解产物的量。可以使用任何已知的测定例如SDS PAGE或LCMS来测量裂解。
在说明性测定中，通过胰蛋白酶解的有限蛋白质水解是通过在室温下将质量比为8000:1(蛋白质:胰蛋白酶)的10ng待评估的蛋白质与胰蛋白酶一起孵育1小时来进行。然后可以通过添加乙酸使反应达到pH3.0来猝灭胰蛋白酶解反应。然后通过例如在4％-12％Tris-Bis凝胶上的SDS-PAGE分离分析这些猝灭的样品，以从通过胰蛋白酶裂解生成的片段的出现而裂解的那些蛋白质中鉴定对裂解有抗性的蛋白质。这些蛋白酶抗性多肽与其野生型对应物相比，前者中不存在裂解产物或裂解产物减少。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，并且该多肽具有软骨形成活性。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基是Q或S或者是缺失的。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与选自SEQ ID NO:3-30中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，并且该多肽具有软骨形成活性。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与选自SEQ ID NO:3-30中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基是Q或S或者是缺失的。
在另一个实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与选自SEQ ID NO:3-18中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，并且该多肽具有软骨形成活性。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与选自SEQ ID NO:3-18中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基是Q或S或者是缺失的。
在另外的实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，并且该多肽具有软骨形成活性。在另外的实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基是Q或S或者是缺失的。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含选自表1所列序列中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含选自SEQ ID NO:3-30中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含选自SEQ ID NO:3-18中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含SEQ ID NO:17。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含SEQ ID NO:18。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含SEQ ID NO:37。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由选自表1所列序列中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由选自SEQ ID NO:3-30中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由选自SEQ ID NO:3-18中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由SEQ ID NO:17组成。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由SEQ ID NO:18组成。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由SEQ ID NO:37组成。
表1：ANGPTL3变体构建体
本文所述的ANGPTL3多肽可在该多肽的C-末端部分中具有至少一个取代或缺失，以使该多肽蛋白酶具有抗性。该取代或缺失在R或K残基处，使得多肽对蛋白酶(例如对胰蛋白酶样蛋白酶)具有增加的抗性。任何氨基酸都可以取代蛋白酶抗性ANGPTL3多肽中的R或K，或者R或K残基可以是缺失的。在一些实施例中，取代是极性氨基酸，例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些实施例中，取代是H、N、Q、S、T或Y。在一些实施例中，取代是S或Q。在一些实施例中，该取代是Q。在一些实施例中，该取代是S。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3肽在参考SEQ ID NO:1的位置423处具有除K或R之外的氨基酸。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含作为极性氨基酸的在位置423(参考SEQ ID NO:1)处的氨基酸，例如位置423(参考SEQ ID NO:1)处的该氨基酸可以是Q或S或另一种极性氨基酸。在某些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽在位置423(参考SEQ ID NO:1)处具有Q。在其他实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽在位置423(参考SEQ ID NO:1)处具有S。在一些实施例中，除了在位置423(参考SEQ ID NO:1)处的取代以外，蛋白酶抗性ANGPTL3肽在SEQ ID NO:1或其变体的C-末端具有另一个R或K的取代，其中该取代是除R或K之外的极性氨基酸。在一些实施例中，在位置423(参考SEQ ID NO:1)处的取代是蛋白酶抗性ANGPTL3肽中的Q或S。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸在蛋白酶抗性ANGPTL3肽中是缺失的。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的长度为250个氨基酸或更少，并且包含选自SEQ ID NO:5-18中任一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽是人ANGPTL3蛋白的羧基末端(C-末端)片段(例如，至少100、150、200、220或215个连续氨基酸)，或者与人ANGPTL3蛋白序列的C-末端片段具有基本上相同的序列，其中该多肽保留软骨形成活性。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽缺少该C-末端序列的至少一部分，例如缺少来自SEQ ID NO:1的C-末端的5、10、15或20个氨基酸(即，缺少SEQ ID NO:1的456-460、451-460、446-460或441-460)。
在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含对应于这些氨基酸区域的连续氨基酸：SEQ ID NO:1的氨基酸241-455或241-460；SEQ ID NO:1的氨基酸242-455或242-460；SEQ ID NO:1的氨基酸233-455或233-460；SEQ ID NO:1的氨基酸228-455或228-460；SEQID NO:1的氨基酸226-455或226-260或氨基酸225-455或225-260，其中氨基酸取代R或K残基，或者R或K残基是缺失的。在一些实施例中，取代或缺失在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸区域207-455或207-460的连续氨基酸，其中氨基酸取代R或K残基，或者R或K残基是缺失的。在一些实施例中，取代或缺失是在位置423。在一些实施例中，取代是极性氨基酸，例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些实施例中，取代是H、N、Q、S、T或Y。在一些实施例中，取代是S或Q。在一些实施例中，取代是Q。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基是缺失的。
在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸240-454、SEQ ID NO:1的氨基酸241-455或SEQ ID NO:1的氨基酸242-455具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸处具有取代，其中该被取代的氨基酸不是R，并且其中该多肽具有软骨形成活性。在其他实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸240-454、SEQ IDNO:1的氨基酸241-455或SEQ ID NO:1的氨基酸242-455，每个多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸处具有取代，其中该被取代的氨基酸是Q或S。在其他实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸240-454、SEQ ID NO:1的氨基酸241-455或SEQID NO:1的氨基酸242-455，每个多肽具有对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基的缺失。
在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸242-455或242-460、SEQ ID NO:1的241-455或241-460、SEQ ID NO:1的氨基酸233-455或233-460、SEQ ID NO:1的氨基酸228-455或228-460、SEQ ID NO:1的氨基酸226-455或226-260、或SEQID NO:1的氨基酸225-455或225-260具有至少95％或至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸取代R或K。在一些实施例中，该取代是在位置423。在一些实施例中，取代是极性氨基酸，例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些实施例中，取代是H、N、Q、S、T或Y。在一些实施例中，该取代是S或Q。在一些实施例中，该取代是Q。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基是缺失的。
在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽是PEG化的。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽与异源肽融合。在某些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽与下列中的任一种融合：人血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、多组氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、麦芽糖结合蛋白(MBP)或一种或多种前述异源多肽中任一种的片段。在具体实施例中，该异源多肽在该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的氨基末端融合。在另外的或替代的实施例中，该异源多肽在该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的羧基末端融合。
在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含至少一个非天然氨基酸。在一些实施例中，多肽包含1、2、3、4或更多个非天然氨基酸。制备非天然存在的氨基酸并将其引入蛋白质中的方法是已知的。参见例如，美国专利号7,083,970和7,524,647。对于产生适合于制备包含一种或多种所需非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统的一般原理是本领域已知的，正如产生正交翻译系统的一般方法一样。例如，参见国际公开号WO 2002/086075，标题为“METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS”[用于产生正交tRNA-氨基酸-tRNA合成酶对的方法和组合物]；WO2002/085923，标题为“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”[在体内并入非天然氨基酸]；WO2004/094593，标题为“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”[扩增真核遗传密码]；2004年7月7日提交的WO 2005/019415；2004年7月7日提交的WO 2005/007870；2004年7月7日提交的WO2005/007624；2005年10月27日提交的WO 2006/110182，标题为“ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OFUNNATURAL AMINO ACIDS”[用于在体内掺入非天然氨基酸的正交翻译组件]；以及2007年3月7日提交的WO2007/103490，标题为“SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONALTRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS”[用于在真细菌宿主细胞中表达正交翻译组分的系统]。对于掺入非天然氨基酸的正交翻译系统和用于其产生和使用的方法的讨论还参见：Wang和Schultz,(2005)“Expanding the Genetic Code.”[扩增遗传密码]Angewandte Chemie Int Ed[德国应用化学国际版]44:34-66；Xie和Schultz,(2005)“An Expanding Genetic Code.”[扩增性遗传密码]Methods[方法论]36:227-238；Xie和Schultz,(2005)“Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire.”[将氨基酸添加至基因库中]Curr Opinion in Chemical Biology[化学生物学新见]9:548-554；以及Wang,等人,(2006)“Expanding the Genetic Code.”[扩增遗传密码]Annu Rev Biophys BiomolStruct[生物物理与生物分子结构年度评论]35:225-249；Deiters,等人,(2005)“In vivoincorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli.”[将炔体内掺入大肠杆菌的蛋白质中]Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters[生物有机化学与医药化学通讯]15:1521-1524；Chin,等人,(2002)“Addition of p-Azido-L-phenylalanine tothe Genetic Code of Escherichia coli.”[将对叠氮基-L-苯基丙氨酸添加至大肠杆菌的遗传密码中]J Am Chem Soc[美国化学学会杂志]124:9026-9027；以及2005年9月20日提交的国际公开号WO 2006/034332。另外的细节可从以下文献中找到：美国专利号7,045,337；7,083,970；7,238,510；7,129,333；7,262,040；7,183,082；7,199,222；和7,217,809。
“非天然编码的氨基酸”是指如下氨基酸，该氨基酸不是常见氨基酸或吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种。可以与术语“非天然编码的氨基酸”同义使用的其他术语是“非天然氨基酸”、“非天然的氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”以及其各种带有连字符和没有连字符的形式。术语“非天然编码的氨基酸”还包括但不限于如下氨基酸，这些氨基酸是通过对天然编码氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸和硒代半胱氨酸)的修饰(例如翻译后修饰)而产生的，但它们本身不是通过翻译复合物天然地掺入生长的多肽链中。这种非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于N-乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
非天然编码的氨基酸通常是具有除二十种天然氨基酸中使用的取代侧链之外的任何取代侧链的任何结构。因为这些非天然编码的氨基酸通常仅在侧链结构中不同于天然氨基酸，所以这些非天然编码的氨基酸与其他氨基酸(包括但不限于天然或非天然编码的氨基酸)形成酰胺键，这些酰胺键的形成方式与天然存在的多肽中形成它们的方式相同。然而，这些非天然编码的氨基酸具有将它们与天然氨基酸区分开的侧链基团。例如，R任选地包含烷基-、芳基-、酰基-、酮-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤代-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸盐、硼酸酯、磷酸、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基基团等或其任何组合。可适用于本发明的其他目标非天然存在的氨基酸包括但不限于包含可光活化的交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光固化和/或可光致异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸如糖取代的丝氨酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、含酮氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂解的和/或光可裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有细长侧链的氨基酸(该细长侧链包括但不限于聚醚或长链烃，该长链烃包括但不限于大于约5或大于约10个碳)、碳连接的含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或多个毒性部分的氨基酸。
可适用于本发明并且可用于与水溶性聚合物反应的示例性非天然编码氨基酸包括但不限于具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物和炔烃反应基团的那些氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含糖部分。这种氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这种氨基酸的实例还包括以下实例，其中该氨基酸与该糖之间的天然存在的N-或O-连接被自然界中不常见的共价连接取代，该共价连接包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等。这种氨基酸的实例还包括在天然存在的蛋白质中不常见的糖类，如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
可任选地引入ANGPTL3多肽(例如在多肽链内或在N-或C-末端)中例如以延长体内半衰期的另一种修饰类型是PEG化或掺入长链聚乙二醇聚合物(PEG)。引入PEG或PEG的长链聚合物增加了本发明多肽的有效分子量，例如以防止快速过滤至尿液中。在一些实施例中，ANGPTL3序列中的赖氨酸残基直接或通过接头与PEG缀合。这种接头可以是例如Glu残基或含有用于连接适当修饰的PEG链的硫醇官能团的酰基残基。用于引入PEG链的替代方法是首先在C-末端或在溶剂暴露的残基处引入Cys残基，如替代Arg或Lys残基。然后将该Cys残基位点特异性地附接至含有例如马来酰亚胺官能的PEG链。掺入PEG或PEG的长链聚合物的方法是本领域熟知的(其描述在例如Veronese,F.M.,等人,Drug Disc.Today[今日药物发现]10:1451-8(2005)；Greenwald,R.B.,等人,Adv.Drug Deliv.Rev.[高级药物递送评论]55:217-50(2003)；Roberts,M.J.,等人,Adv.Drug Deliv.Rev.[高级药物递送评论],54:459-76(2002))，其内容通过引用并入本文。本领域已知的其他聚合物缀合方法也可用于本发明。在一些实施例中，聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)(PMPC)作为与ANGPTL3多肽的聚合物缀合物而引入(参见例如WO2008/098930；Lewis,等人,Bioconjug Chem.[生物缀合化学],19:2144-55(2008))。在一些实施例中，含有磷酰胆碱的与ANGPTL3多肽的聚合物缀合物可用于本发明。技术人员将容易认识到可以使用其他生物相容性聚合物缀合物。
最近报道的通过掺入非天然氨基酸(如上所述)掺入PEG或PEG聚合物的替代途径可以用本发明的多肽进行。此途径利用进化的tRNA/tRNA合成酶对，并通过琥珀抑制密码子在表达质粒中编码(Deiters,A,等人(2004).Bio-org.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]14,5743-5)。例如，对叠氮基苯丙氨酸可以掺入本发明的多肽中，然后在还原剂和铜离子(以促进称为“Huisgen[3+2]环加成”的有机反应)的存在下与具有乙炔部分的PEG聚合物反应。
在某些实施例中，本发明还考虑了该ANGPTL3多肽的特定突变，以改变该多肽的糖基化。可以选择这种突变以引入或消除一个或多个糖基化位点，包括但不限于O-连接或N-连接的糖基化位点。在某些实施例中，该ANGPTL3多肽具有相对于天然存在的ANGPTL3蛋白未改变的糖基化位点和模式。在某些实施例中，ANGPTL3多肽的变体包括糖基化变体，其中糖基化位点的数目和/或类型相对于天然存在的ANGPTL3蛋白已经改变。在某些实施例中，多肽的变体相对于天然多肽包含更多或更少数目的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点的特征在于以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸外的任何氨基酸残基。取代氨基酸残基以产生该序列为添加N-连接的碳水化合物链提供了潜在的新位点。可替代地，消除该序列的取代将去除现有的N-连接的碳水化合物链。在某些实施例中，提供了N-连接的碳水化合物链的重排，其中消除了一个或多个N-连接的糖基化位点(通常是天然存在的那些糖基化位点)并且产生了一个或多个新的N-连接位点。
在一些实施例中，这些ANGPTL3多肽的功能变体或修饰形式包括ANGPTL3多肽的融合蛋白和一个或多个融合结构域。熟知的融合结构域的实例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和/或人血清白蛋白(HSA)。可以选择融合结构域或其片段以赋予所需特性。例如，一些融合结构域特别适用于通过亲和色谱法分离这些融合蛋白。出于亲和纯化的目的，使用用于亲和色谱法的相关基质，如谷胱甘肽-、淀粉酶-、和镍-或钴-缀合的树脂。许多这样的基质可以以“试剂盒”的形式获得，如Pharmacia GST纯化系统和可与融合配偶体(HIS6(SEQ ID NO:44))一起使用的QLAexpressTM系统(Qiagen)。作为另一个实例，可以选择融合结构域以促进对ANGPTL3多肽的检测。这种检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如GFP)以及“表位标签”，该表位标签通常是可对其提供特异性抗体的短肽序列。对其易于提供特异性单克隆抗体的熟知表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，这些融合结构域具有蛋白酶(如因子Xa或凝血酶)裂解位点，其允许相关蛋白酶部分消化这些融合蛋白，从而从中释放该重组蛋白。然后可以通过随后的色谱分离从该融合结构域分离这些释放的蛋白质。在某些实施例中，ANGPTL3多肽与在体内稳定该ANGPTL3多肽的结构域(“稳定剂”结构域)融合。“稳定”意指任何能增加血清半衰期的方式，无论这是因为破坏减少、肾脏清除率降低还是其他药代动力学效应。已知与免疫球蛋白的Fc部分的融合赋予广泛的蛋白质所需的药代动力学特性。同样，与人血清白蛋白的融合可以赋予期望的特性。可以选择的其他类型的融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能结构域(根据需要赋予另外的生物学功能)。可以构建融合物，使得异源肽在ANGPTL3多肽的氨基末端和/或ANGPTL3多肽的羧基末端融合。
治疗方法和治疗用途
本文提供了治疗受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤的方法，包括向该受试者(例如，人受试者)的关节给予关节内剂量的具有本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽或包含具有软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的组合物。在一些实施例中，该受试者患有软骨损伤。在一些实施例中，该受试者患有关节炎，例如骨关节炎、创伤性关节炎或自身免疫性关节炎。在一些实施例中，该患者患有关节炎或软骨损害。在一些实施例中，该个体不患有关节炎或软骨损害，但具有此风险。
在一些实施例中，根据本文所述的剂量方案给予该ANGPTL3多肽。调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。用于本发明的该ANGPTL3多肽的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症。
在一些实施例中，将该ANGPTL3多肽以单次注射给予至该受试者(例如，人受试者)的关节。在一些实施例中，将该ANGPTL3多肽以多次注射给予至该受试者(例如，人受试者)的关节。在一些实施例中，将该ANGPTL3多肽每两周给予一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或软骨损伤。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽每月给予一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或软骨损伤。在一些实施例中，该ANGPTL3多肽每周给予一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或软骨损伤。
因此，本文提供了通过向受试者的关节给予约0.2-200mg关节内剂量的具有本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽来治疗该受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法。例如，该ANGPTL3多肽可以按如下剂量经关节内给予：约0.2-200mg、约0.2-150mg、约0.2-120mg、约0.2-100mg、约0.2-90mg、约0.2-80mg、约0.2-70mg、约0.2-60mg、约0.2-50mg、约0.2-40mg、约0.2-30mg、约0.2-20mg、约0.2-10mg、约0.2-2mg、约2-200mg、约2-150mg、约2-120mg、约2-100mg、约2-90mg、约2-80mg、约2-70mg、约2-60mg、约2-50mg、约2-40mg、约2-30mg、约2-20mg、约2-10mg、约10-200mg、约10-150mg、约10-120mg、约10-100mg、约10-90mg、约10-80mg、约10-70mg、约10-60mg、约10-50mg、约10-40mg、约10-30mg、约10-20mg、约20-200mg、约20-150mg、约20-120mg、约20-100mg、约20-90mg、约20-80mg、约20-70mg、约20-60mg、约20-50mg、约20-40mg、约20-30mg、约40-200mg、约40-150mg、约40-120mg、约40-100mg、约40-90mg、约40-80mg、约40-70mg、约40-60mg、约40-50mg、约50-200mg、约50-150mg、约50-120mg、约50-100mg、约50-90mg、约50-80mg、约50-70mg、约50-60mg、约60-200mg、约60-150mg、约60-120mg、约60-100mg、约60-90mg、约60-80mg、约60-70mg、约70-200mg、约70-150mg、约70-120mg、约70-100mg、约70-90mg、约70-80mg、约80-200mg、约80-150mg、约80-120mg、约80-100mg、约80-90mg、约90-200mg、约90-150mg、约90-120mg、约90-100mg、约100-200mg、约100-150mg、约100-120mg、约120-200mg、约120-150mg或约150-200mg。
在一些实施例中，本文提供了通过向受试者的关节给予约0.2-60mg关节内剂量的具有本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽来治疗该受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法。例如，该ANGPTL3多肽可以按如下剂量经关节内给予：约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg或约60mg。
在一些实施例中，本文提供了通过向受试者的关节给予约0.2-40mg关节内剂量的具有本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽来治疗该受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法。例如，该ANGPTL3多肽可以按如下剂量经关节内给予：约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-40mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg或约40mg。
在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约0.2-100mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约0.2-60mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约0.2-40mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约2-40mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约10-40mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约20-40mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约40-60mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约0.2mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约2mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约10mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约20mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约40mg。在一些实施例中，蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的关节内剂量为约60mg。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，并且该多肽具有软骨形成活性。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基是Q或S或者是缺失的。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含选自表1所列序列中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由选自表1所列序列中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含SEQ ID NO:17。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由SEQ ID NO:17组成。
在一些实施例中，本文提供了通过向受试者的关节给予约0.2-200mg关节内剂量的包含SEQ ID NO:17的多肽来治疗该受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法。例如，包含SEQ ID NO:17的多肽可以按如下剂量经关节内给予：约0.2-200mg、约0.2-150mg、约0.2-120mg、约0.2-100mg、约0.2-90mg、约0.2-80mg、约0.2-70mg、约0.2-60mg、约0.2-50mg、约0.2-40mg、约0.2-30mg、约0.2-20mg、约0.2-10mg、约0.2-2mg、约2-200mg、约2-150mg、约2-120mg、约2-100mg、约2-90mg、约2-80mg、约2-70mg、约2-60mg、约2-50mg、约2-40mg、约2-30mg、约2-20mg、约2-10mg、约10-200mg、约10-150mg、约10-120mg、约10-100mg、约10-90mg、约10-80mg、约10-70mg、约10-60mg、约10-50mg、约10-40mg、约10-30mg、约10-20mg、约20-200mg、约20-150mg、约20-120mg、约20-100mg、约20-90mg、约20-80mg、约20-70mg、约20-60mg、约20-50mg、约20-40mg、约20-30mg、约40-200mg、约40-150mg、约40-120mg、约40-100mg、约40-90mg、约40-80mg、约40-70mg、约40-60mg、约40-50mg、约50-200mg、约50-150mg、约50-120mg、约50-100mg、约50-90mg、约50-80mg、约50-70mg、约50-60mg、约60-200mg、约60-150mg、约60-120mg、约60-100mg、约60-90mg、约60-80mg、约60-70mg、约70-200mg、约70-150mg、约70-120mg、约70-100mg、约70-90mg、约70-80mg、约80-200mg、约80-150mg、约80-120mg、约80-100mg、约80-90mg、约90-200mg、约90-150mg、约90-120mg、约90-100mg、约100-200mg、约100-150mg、约100-120mg、约120-200mg、约120-150mg或约150-200mg。
在一些实施例中，本文提供了通过向受试者的关节给予约0.2-60mg关节内剂量的包含SEQ ID NO:17的多肽来治疗该受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法。例如，包含SEQ ID NO:17的多肽可以按如下剂量经关节内给予：约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg或约60mg。
在一些实施例中，本文提供了通过向受试者的关节给予约0.2-40mg关节内剂量的包含SEQ ID NO:17的多肽来治疗该受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法。例如，包含SEQ ID NO:17的多肽可以按如下剂量经关节内给予：约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-40mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg或约40mg。
在一些实施例中，本文提供了通过向受试者的关节给予约0.2-200mg关节内剂量的由SEQ ID NO:17组成的多肽来治疗该受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法。例如，由SEQ ID NO:17组成的多肽可以按如下剂量经关节内给予：约0.2-200mg、约0.2-150mg、约0.2-120mg、约0.2-100mg、约0.2-90mg、约0.2-80mg、约0.2-70mg、约0.2-60mg、约0.2-50mg、约0.2-40mg、约0.2-30mg、约0.2-20mg、约0.2-10mg、约0.2-2mg、约2-200mg、约2-150mg、约2-120mg、约2-100mg、约2-90mg、约2-80mg、约2-70mg、约2-60mg、约2-50mg、约2-40mg、约2-30mg、约2-20mg、约2-10mg、约10-200mg、约10-150mg、约10-120mg、约10-100mg、约10-90mg、约10-80mg、约10-70mg、约10-60mg、约10-50mg、约10-40mg、约10-30mg、约10-20mg、约20-200mg、约20-150mg、约20-120mg、约20-100mg、约20-90mg、约20-80mg、约20-70mg、约20-60mg、约20-50mg、约20-40mg、约20-30mg、约40-200mg、约40-150mg、约40-120mg、约40-100mg、约40-90mg、约40-80mg、约40-70mg、约40-60mg、约40-50mg、约50-200mg、约50-150mg、约50-120mg、约50-100mg、约50-90mg、约50-80mg、约50-70mg、约50-60mg、约60-200mg、约60-150mg、约60-120mg、约60-100mg、约60-90mg、约60-80mg、约60-70mg、约70-200mg、约70-150mg、约70-120mg、约70-100mg、约70-90mg、约70-80mg、约80-200mg、约80-150mg、约80-120mg、约80-100mg、约80-90mg、约90-200mg、约90-150mg、约90-120mg、约90-100mg、约100-200mg、约100-150mg、约100-120mg、约120-200mg、约120-150mg或约150-200mg。
在一些实施例中，本文提供了通过向受试者的关节给予约0.2-60mg关节内剂量的由SEQ ID NO:17组成的多肽来治疗该受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法。例如，由SEQ ID NO:17组成的多肽可以按如下剂量经关节内给予：约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg或约60mg。
在一些实施例中，本文提供了通过向受试者的关节给予约0.2-40mg关节内剂量的由SEQ ID NO:17组成的多肽来治疗该受试者(例如，人受试者)中的关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)的方法。例如，由SEQ ID NO:17组成的多肽可以按如下剂量经关节内给予：约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-40mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg或约40mg。
在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约0.2-100mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约0.2-60mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约0.2-40mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约2-40mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约10-40mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约20-40mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约40-60mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约0.2mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约2mg。在一些实施例中，包含SEQ IDNO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约10mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约20mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约40mg。在一些实施例中，包含SEQ ID NO:17或由其组成的该多肽的关节内剂量为约60mg。
在一些实施例中，这些方法还包括对该受试者中的受累及关节进行外科手术。该多肽或组合物可以在该外科手术之前、期间或之后给予。
在一些实施例中，这些方法还包括另外的程序。例如，可以将该多肽或组合物与骨髓刺激、软骨置换、自体软骨细胞移植(ACI)或基质诱导的自体软骨细胞移植(MACI)中的任何一种一起给予。在一些实施例中，可以将该多肽或组合物与ACI一起给予。
还提供了包含具有本文所述抗原活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的组合物，以用于治疗关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)。例如，这种组合物可以包含ANGPTL3多肽，该多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，并且该多肽具有软骨形成活性。在一些实施例中，这种组合物包含ANGPTL3多肽，该多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基是Q或S或者是缺失的。在一些实施例中，这种组合物包含ANGPTL3多肽，该多肽包含选自表1所列序列中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，这种组合物包含ANGPTL3多肽，该多肽由选自表1所列序列中任一个的氨基酸序列组成。
这种组合物可以包含约0.2-200mg(例如，0.2-200mg、约0.2-150mg、约0.2-120mg、约0.2-100mg、约0.2-90mg、约0.2-80mg、约0.2-70mg、约0.2-60mg、约0.2-50mg、约0.2-40mg、约0.2-30mg、约0.2-20mg、约0.2-10mg、约0.2-2mg、约2-200mg、约2-150mg、约2-120mg、约2-100mg、约2-90mg、约2-80mg、约2-70mg、约2-60mg、约2-50mg、约2-40mg、约2-30mg、约2-20mg、约2-10mg、约10-200mg、约10-150mg、约10-120mg、约10-100mg、约10-90mg、约10-80mg、约10-70mg、约10-60mg、约10-50mg、约10-40mg、约10-30mg、约10-20mg、约20-200mg、约20-150mg、约20-120mg、约20-100mg、约20-90mg、约20-80mg、约20-70mg、约20-60mg、约20-50mg、约20-40mg、约20-30mg、约40-200mg、约40-150mg、约40-120mg、约40-100mg、约40-90mg、约40-80mg、约40-70mg、约40-60mg、约40-50mg、约50-200mg、约50-150mg、约50-120mg、约50-100mg、约50-90mg、约50-80mg、约50-70mg、约50-60mg、约60-200mg、约60-150mg、约60-120mg、约60-100mg、约60-90mg、约60-80mg、约60-70mg、约70-200mg、约70-150mg、约70-120mg、约70-100mg、约70-90mg、约70-80mg、约80-200mg、约80-150mg、约80-120mg、约80-100mg、约80-90mg、约90-200mg、约90-150mg、约90-120mg、约90-100mg、约100-200mg、约100-150mg、约100-120mg、约120-200mg、约120-150mg、约150-200mg)的具有本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽。
在一些实施例中，这种组合物包含约0.2-60mg(例如，约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg)的具有本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽。
在一些实施例中，这种组合物包含约0.2-40mg(例如，约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-40mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg)的本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽。
在一些实施例中，提供了包含含有SEQ ID NO:17的多肽的组合物，以用于治疗关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)。在一些实施例中，提供了包含由SEQ ID NO:17组成的多肽的组合物，以用于治疗关节炎或软骨损伤(例如，关节软骨损伤)。
这种组合物可以包含约0.2-200mg(例如，0.2-200mg、约0.2-150mg、约0.2-120mg、约0.2-100mg、约0.2-90mg、约0.2-80mg、约0.2-70mg、约0.2-60mg、约0.2-50mg、约0.2-40mg、约0.2-30mg、约0.2-20mg、约0.2-10mg、约0.2-2mg、约2-200mg、约2-150mg、约2-120mg、约2-100mg、约2-90mg、约2-80mg、约2-70mg、约2-60mg、约2-50mg、约2-40mg、约2-30mg、约2-20mg、约2-10mg、约10-200mg、约10-150mg、约10-120mg、约10-100mg、约10-90mg、约10-80mg、约10-70mg、约10-60mg、约10-50mg、约10-40mg、约10-30mg、约10-20mg、约20-200mg、约20-150mg、约20-120mg、约20-100mg、约20-90mg、约20-80mg、约20-70mg、约20-60mg、约20-50mg、约20-40mg、约20-30mg、约40-200mg、约40-150mg、约40-120mg、约40-100mg、约40-90mg、约40-80mg、约40-70mg、约40-60mg、约40-50mg、约50-200mg、约50-150mg、约50-120mg、约50-100mg、约50-90mg、约50-80mg、约50-70mg、约50-60mg、约60-200mg、约60-150mg、约60-120mg、约60-100mg、约60-90mg、约60-80mg、约60-70mg、约70-200mg、约70-150mg、约70-120mg、约70-100mg、约70-90mg、约70-80mg、约80-200mg、约80-150mg、约80-120mg、约80-100mg、约80-90mg、约90-200mg、约90-150mg、约90-120mg、约90-100mg、约100-200mg、约100-150mg、约100-120mg、约120-200mg、约120-150mg、约150-200mg)的包含SEQ ID NO:17的多肽。
在一些实施例中，这种组合物包含约0.2-60mg(例如，约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg)的包含SEQ ID NO:17的多肽。
在一些实施例中，这种组合物包含约0.2-40mg(例如，约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-40mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg)的包含SEQ ID NO:17的多肽。
这种组合物可以包含约0.2-200mg(例如，0.2-200mg、约0.2-150mg、约0.2-120mg、约0.2-100mg、约0.2-90mg、约0.2-80mg、约0.2-70mg、约0.2-60mg、约0.2-50mg、约0.2-40mg、约0.2-30mg、约0.2-20mg、约0.2-10mg、约0.2-2mg、约2-200mg、约2-150mg、约2-120mg、约2-100mg、约2-90mg、约2-80mg、约2-70mg、约2-60mg、约2-50mg、约2-40mg、约2-30mg、约2-20mg、约2-10mg、约10-200mg、约10-150mg、约10-120mg、约10-100mg、约10-90mg、约10-80mg、约10-70mg、约10-60mg、约10-50mg、约10-40mg、约10-30mg、约10-20mg、约20-200mg、约20-150mg、约20-120mg、约20-100mg、约20-90mg、约20-80mg、约20-70mg、约20-60mg、约20-50mg、约20-40mg、约20-30mg、约40-200mg、约40-150mg、约40-120mg、约40-100mg、约40-90mg、约40-80mg、约40-70mg、约40-60mg、约40-50mg、约50-200mg、约50-150mg、约50-120mg、约50-100mg、约50-90mg、约50-80mg、约50-70mg、约50-60mg、约60-200mg、约60-150mg、约60-120mg、约60-100mg、约60-90mg、约60-80mg、约60-70mg、约70-200mg、约70-150mg、约70-120mg、约70-100mg、约70-90mg、约70-80mg、约80-200mg、约80-150mg、约80-120mg、约80-100mg、约80-90mg、约90-200mg、约90-150mg、约90-120mg、约90-100mg、约100-200mg、约100-150mg、约100-120mg、约120-200mg、约120-150mg、约150-200mg)的由SEQ ID NO:17组成的多肽。
在一些实施例中，这种组合物包含约0.2-60mg(例如，约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg)的由SEQ ID NO:17组成的多肽。
在一些实施例中，这种组合物包含约0.2-40mg(例如，约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-40mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg)的由SEQ ID NO:17组成的多肽。
考虑到本发明的多肽、组合物和方法可用于治疗任何类型的关节软骨损伤(例如，关节损伤或损害)，包括例如由创伤事件或腱或韧带撕裂引起的损伤。在一些实施例中，多肽、组合物和方法用于治疗关节损伤(例如，关节软骨损伤)。在具体实施例中，关节损伤是创伤性关节损害(例如，创伤性软骨损伤)。在其他实施例中，关节损伤或关节软骨损伤是由年龄或不活动或遗传因素引起的损伤。在又其他实施例中，关节损伤或关节软骨损伤是由自身免疫障碍引起的损伤。在本发明的一些实施例中，本发明的多肽、组合物和方法可用于治疗骨关节炎。
在一些实施例中，本发明的多肽、组合物和方法提供了刺激例如已经由于创伤性损害或软骨病受损的软骨组织中的软骨细胞增殖和/或软骨产生的方法。在具体实施例中，本发明的多肽、组合物和方法可用于治疗在关节中例如在关节面处的软骨损伤(例如，关节软骨损伤)，该关节例如脊柱、肩膀、肘、腕、手指关节、臀、膝盖、踝和脚关节。可受益于治疗的疾病或障碍的实例包括骨关节炎、类风湿性关节炎、其他自身免疫疾病或分离性骨软骨炎。此外，由于某些遗传或代谢障碍而发生软骨损伤或破坏，软骨畸形常常以人类侏儒症的形式出现，和/或软骨损伤或破坏通常是重建手术的结果；因此，无论是单独的还是与其他途径相结合的多肽、组合物和方法都可以是这些患者中的有用疗法。
进一步考虑到本发明的多肽、组合物和方法可用于治疗各种软骨障碍和/或这种病症的相关症状或影响。用本文所述的多肽、组合物和方法治疗的示例性病症或障碍包括但不限于类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、骨关节炎、退行性椎间盘疾病、脊柱关节病、Ehler Danlos综合征、系统性硬化病(硬皮病)或腱疾病。
在一些实施例中，通过直接注射至关节的滑液中或直接注射至软骨缺损中来给予本发明的多肽和组合物。本发明的多肽、组合物和方法也可以与在受累及的关节处的外科手术一起使用。本发明多肽的给予可以是在外科手术之前进行、期间或一起进行和/或之后进行。例如，本发明的多肽、组合物和方法可用于扩增培养物中的软骨细胞群体以用于自体或同种异体软骨细胞移植。可以移植软骨细胞，任选地伴随与由给予本发明多肽和组合物组成的并行治疗。在这些程序中，例如可以从受损关节的未损害的小负荷区域通过关节镜收获软骨细胞，并且可以在体外培养，任选地在本发明的多肽和组合物和/或其他生长因子的存在下培养以在移植前增加细胞数。然后任选地将扩增的培养物与本发明的多肽和组合物混合和/或置于关节空间中或直接置于缺损中。在某些实施例中，将扩增的培养物(任选地具有本发明的多肽)置于悬浮在基质或膜中的关节空间中。在其他实施例中，本发明的多肽和组合物可以与一个或多个骨膜或软骨膜移植物组合使用，该骨膜或软骨膜移植物含有软骨形成细胞和/或有助于将移植的软骨细胞或软骨细胞前体细胞保持在适当位置。在一些实施例中，将本发明的多肽和组合物与其他程序一起用于修复软骨损伤(例如，关节软骨损伤)，该程序包括但不限于关节的灌洗、骨髓的刺激、磨削成形术、软骨下骨钻孔术或近端软骨下骨的微骨折。任选地，在本发明的多肽和组合物的给予以及软骨的生长之后，另外的手术治疗可以有利于适当地勾画新形成的一个或多个软骨表面。
药物组合物
本文还提供了组合物例如药物组合物，其包含具有本文所述软骨形成活性的一种或多种蛋白酶抗性ANGPTL3多肽。这种组合物可以包含一种或多种赋形剂或载体，例如药学上可接受的赋形剂或载体。
在一些实施例中，在混合物中的包含治疗有效量的蛋白质或肽的药物组合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体一起配制，该赋形剂或载体根据与给予模式、递送形式和所需剂量的适合性来选择。
在一些实施例中，包含具有软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的药物组合物适用于关节内给予。
这些药物组合物可以是各种形式。这些形式包括例如液体、半固体或固体形式。该形式取决于给予和治疗应用的预期模式。在一些实施例中，该药物组合物是液体溶液，例如可注射溶液。在一些实施例中，该药物组合物是粉末，例如冻干物。冻干的药物组合物对于储存通常不需要特定条件，如冷藏。冻干可用于开发经重构并通过注射给予患者的药物产品。例如，可以在注射之前通过添加合适的给药稀释剂(例如，无菌水)来重构冻干的药物产品。
本文提供了组合物例如药物组合物，其包含约0.2-200mg的具有本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽。例如，这种组合物可以包含约0.2-200mg、约0.2-150mg、约0.2-120mg、约0.2-100mg、约0.2-90mg、约0.2-80mg、约0.2-70mg、约0.2-60mg、约0.2-50mg、约0.2-40mg、约0.2-30mg、约0.2-20mg、约0.2-10mg、约0.2-2mg、约2-200mg、约2-150mg、约2-120mg、约2-100mg、约2-90mg、约2-80mg、约2-70mg、约2-60mg、约2-50mg、约2-40mg、约2-30mg、约2-20mg、约2-10mg、约10-200mg、约10-150mg、约10-120mg、约10-100mg、约10-90mg、约10-80mg、约10-70mg、约10-60mg、约10-50mg、约10-40mg、约10-30mg、约10-20mg、约20-200mg、约20-150mg、约20-120mg、约20-100mg、约20-90mg、约20-80mg、约20-70mg、约20-60mg、约20-50mg、约20-40mg、约20-30mg、约40-200mg、约40-150mg、约40-120mg、约40-100mg、约40-90mg、约40-80mg、约40-70mg、约40-60mg、约40-50mg、约50-200mg、约50-150mg、约50-120mg、约50-100mg、约50-90mg、约50-80mg、约50-70mg、约50-60mg、约60-200mg、约60-150mg、约60-120mg、约60-100mg、约60-90mg、约60-80mg、约60-70mg、约70-200mg、约70-150mg、约70-120mg、约70-100mg、约70-90mg、约70-80mg、约80-200mg、约80-150mg、约80-120mg、约80-100mg、约80-90mg、约90-200mg、约90-150mg、约90-120mg、约90-100mg、约100-200mg、约100-150mg、约100-120mg、约120-200mg、约120-150mg、约150-200mg的具有软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽。
在一些实施例中，本文提供了组合物，例如药物组合物，其包含约0.2-60mg(例如，约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg)的具有本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽。
在一些实施例中，本文提供了组合物，例如药物组合物，其包含约0.2-40mg(例如，约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-40mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg)的具有本文所述软骨形成活性的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，并且该多肽具有软骨形成活性。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸残基是Q或S或者是缺失的。
在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含选自表1所列序列中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由选自表1所列序列中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含SEQ ID NO:17。在一些实施例中，该蛋白酶抗性ANGPTL3多肽由SEQ ID NO:17组成。
在一些实施例中，本文提供了组合物，例如药物组合物，其包含约0.2-60mg(例如，约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg)的包含SEQ ID NO:17的多肽。
在一些实施例中，本文提供了组合物，例如药物组合物，其包含约0.2-60mg(例如，约0.2-60mg、约0.2-55mg、约0.2-50mg、约0.2-45mg、约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-60mg、约2-55mg、约2-50mg、约2-45mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-60mg、约5-55mg、约5-50mg、约5-45mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-60mg、约10-55mg、约10-50mg、约10-45mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-60mg、约15-55mg、约15-50mg、约15-45mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-60mg、约20-55mg、约20-50mg、约20-45mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-60mg、约30-55mg、约30-50mg、约30-45mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-60mg、约35-55mg、约35-50mg、约35-45mg、约35-40mg、约40-60mg、约40-55mg、约40-50mg、约40-45mg、约45-60mg、约45-55mg、约45-50mg、约50-60mg、约50-55mg、约55-60mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg)的由SEQ ID NO:17组成的多肽。
在一些实施例中，本文提供了组合物，例如药物组合物，其包含约0.2-40mg(例如，约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-40mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg)的包含SEQ ID NO:17的多肽。
在一些实施例中，本文提供了组合物，例如药物组合物，其包含约0.2-40mg(例如，约0.2-40mg、约0.2-35mg、约0.2-30mg、约0.2-25mg、约0.2-20mg、约0.2-15mg、约0.2-10mg、约0.2-5mg、约0.2-2mg、约2-40mg、约2-35mg、约2-30mg、约2-25mg、约2-20mg、约2-15mg、约2-10mg、约2-5mg、约5-40mg、约5-35mg、约5-30mg、约5-25mg、约5-20mg、约5-15mg、约5-10mg、约10-40mg、约10-35mg、约10-30mg、约10-25mg、约10-20mg、约10-15mg、约15-40mg、约15-35mg、约15-30mg、约15-25mg、约15-20mg、约20-40mg、约20-35mg、约20-30mg、约20-25mg、约25-60mg、约25-55mg、约25-50mg、约25-45mg、约25-40mg、约25-35mg、约25-30mg、约30-40mg、约30-35mg、约35-40mg、约0.2mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg)的由SEQ ID NO:17组成的多肽。
在一些实施例中，这些组合物还包含碳水化合物。在一些实施例中，这些组合物还包含缓冲液或缓冲液组分。在一些实施例中，这些组合物还包含表面活性剂，例如聚山梨醇酯80。
在一些实施例中，本文所述的组合物包含缓冲液或缓冲液组分。众所周知，缓冲液用于pH控制，其作为在生理上相容的pH(即，以改善耐受性)下递送药物(例如多肽)以及提供有利于药物(例如多肽)化学稳定性的溶液条件的手段。
可用于本文所述组合物的缓冲液的非限制性实例包括组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液或盐酸缓冲液。在一些实施例中，本文所述的组合物包含选自组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或乙酸盐缓冲液、或其组分的缓冲液。优选的缓冲液是组氨酸缓冲液，并且优选的缓冲液组分是组氨酸。
pH对于获得优化的蛋白质组合物例如具有增加的稳定性的液体蛋白质组合物是关键的。pH可以通过影响蛋白质的构象和/或聚集和/或降解和/或反应性起作用。pH优选小于7.0，更优选约5.0至约7.0、更优选约5.5至约6.1的范围，更优选约5.8。在一些实施例中，本文所述组合物的pH在5.5与6.1之间，例如约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1。优选地，该组合物的pH为约5.8。
在一些实施例中，该组合物中包含碳水化合物。碳水化合物可以使蛋白质更紧密，并且例如掩藏或以其他方式阻碍进入活性部分。这可以增加蛋白质稳定性，例如通过减少蛋白质聚集来实现。
在一些实施例中，本文所述的组合物包含碳水化合物。优选的碳水化合物是蔗糖。适合使用的其他优选碳水化合物包括：海藻糖、麦芽糖、棉子糖、葡萄糖、山梨糖醇、葡聚糖、环糊精或甘露糖醇。可用于稳定该蛋白质的其他合适物质包括：碳水化合物如乳糖和阿拉伯糖；多元醇如甘露糖醇、甘油和木糖醇；氨基酸如甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸；以及聚合物如PEG、泊洛沙姆(poloxomer)、葡聚糖、聚丙二醇、多糖、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、水解明胶和人白蛋白。在一些实施例中，这些碳水化合物中的两种或更多种(例如蔗糖和海藻糖)的组合用于本文所述的组合物中。可以测试该组合对于候选碳水化合物的适合性。
可以在该组合物中添加表面活性剂以增加蛋白质稳定性，例如减少例如由于摇动/运送时的空气/液体界面发生的蛋白质降解。选择增加蛋白质稳定性的表面活性剂，例如不会引起组合物中的蛋白质降解。适合使用的表面活性剂是例如聚山梨醇酯80。
实例
在以下实例中进一步描述了本发明，这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实例1：向原发性骨关节炎人患者给予ANGPTL3多肽
淬
研究设计如图1所示，其被设计成在全膝关节置换(TKR)中取出膝关节之前向原发性骨关节炎(OA)患者的膝关节中关节内(i.a.)注射一次后，评价ANGPTL3多肽的安全性和耐受性。大约28名患者将被纳入七个群组中。在每个群组中，三名患者用ANGPTL3多肽治疗且一名患者用安慰剂治疗。在TKR之前约7天，群组1患者经关节内注射0.2mg/膝的ANGPTL3多肽或安慰剂。在TKR之前约7天，群组2患者经关节内注射2mg/膝的ANGPTL3多肽或安慰剂。在TKR之前约7天，群组3患者经关节内注射10mg/膝的ANGPTL3多肽或安慰剂。在TKR之前约7天，群组4患者经关节内注射20mg/膝的ANGPTL3多肽或安慰剂。基于群组1-4的分析选择群组5-7的手术前的剂量和时间。在TKR之前约2小时，群组5患者将经关节内注射20mg/膝的ANGPTL3多肽或安慰剂。在TKR之前约21天，群组6患者将经关节内注射20mg/膝的ANGPTL3多肽或安慰剂。在TKR之前约7天，群组7患者将经关节内注射40mg/膝的ANGPTL3多肽或安慰剂。群组1-4的患者群体和人口统计信息显示在表2和表3中。
基于从大鼠和狗给药研究获得的安全性和功效数据来将对于人患者的起始剂量选择为0.2mg/膝，并且预期该剂量提供适度的药理学效果。
基于关节滑液的体积和SEQ ID NO:17的ANGPTL3多肽在关节滑液中的溶解性以及狗关节内给药研究来将对于人患者的剂量选择为20mg/膝。狗膝关节软骨面积估计为196mm2；而人膝关节软骨面积估计为1215mm2。基于狗关节内给药研究，20mg/膝剂量具有可接受的安全范围。
对于中期分析(包括群组1至群组4直到TKR手术访视的所有患者)，所有安全终点(包括不良事件CTC-AE、体检、生命体征、ECG、安全性实验室和使用KOOS测量的疼痛)均被测量直到并包括给药后7天。没有任何不良事件被报告为怀疑与该治疗有关。
总之，在群组1-4中没有观察到显著的安全性发现。在给予SEQ ID NO:17的ANGPTL3多肽的16名患者中未观察到免疫原性。
由于群组4中20mg/膝的测试剂量在所有治疗的患者(N＝3)中都具有良好的耐受性而没有任何特定的安全性问题，因此计划对群组7进一步增加剂量至40mg/膝。基于对狗和大鼠的毒性研究(参见表4)，40mg/膝的剂量下估计的全身暴露仍将与足够的安全范围相关联。除了高全身安全范围外，包括40mg/膝的基本原理还基于(i)临床前药理学研究，该研究证明需要研究SEQ ID NO:17的ANGPTL3多肽的潜在更有效剂量的安全性；(ii)高达20mg/膝的SEQ ID NO:17的ANGPTL3多肽的有利安全性，迄今未证实具有与药物相关的不良事件；(iii)来自狗研究的局部软骨安全范围(参见表5)。
表2.患者群体。
表3.患者人口统计学。
表4.全身安全范围
表5.局部安全范围
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与熟知本披露所属领域的专业人员通常理解的相同含义。
除非另有说明，否则所有未详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知如本领域技术人员所知的方式执行并且已经以此方式执行。例如，再次参考本文提及的标准手册和一般背景技术以及其中引用的其他参考文献。除非另有说明，否则本文引用的每篇参考文献均通过引用以其全文并入。
本发明的权利要求是非限制性的，并在下文提供。
尽管本文已经详细披露了特定方面和权利要求，但是这仅仅是出于说明的目的通过示例的方式进行的，并且不旨在限制所附权利要求的范围或任何相应的未来申请的权利要求的主题的范围。具体而言，诸位发明人考虑到可以对本披露进行各种替换、改变和修改而不脱离权利要求所限定的本披露的精神和范围。认为核酸起始材料、目标克隆或文库类型的选择对于具有本文所述各方面知识的本领域普通技术人员而言是常规工作。认为其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明具体方面的许多等同物。这种等同物旨在由以下权利要求涵盖。在后面提交的相应申请中重新起草权利要求范围可能是由于各个国家的专利法的限制，并且不应该被解释为放弃权利要求的主题。
Claims (53)
1.一种治疗人受试者中的关节炎或软骨损伤的方法，该方法包括向该人受试者的关节给予约0.2-200mg关节内剂量的多肽，该多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，并且该多肽具有软骨形成活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中该多肽中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸是Q或S或者是缺失的。
3.如权利要求1所述的方法，其中该多肽包含表1中列出的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的方法，其中该多肽由表1中列出的氨基酸序列组成。
5.如权利要求1所述的方法，其中该多肽包含SEQ ID NO:17。
6.如权利要求1所述的方法，其中该多肽由SEQ ID NO:17组成。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约0.2-60mg。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约0.2-40mg。
9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约2-40mg。
10.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约10-40mg。
11.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约20-40mg。
12.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约40-60mg。
13.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约0.2mg。
14.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约2mg。
15.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约10mg。
16.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约20mg。
17.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约40mg。
18.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该关节内剂量为约60mg。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中将该多肽以单次注射给予至该人受试者的该关节。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中将该多肽以多次注射给予至该人受试者的该关节。
21.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中向该人受试者的该关节每两周给予该多肽一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或该软骨损伤。
22.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中向该人受试者的该关节每月给予该多肽一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或该软骨损伤。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，该方法还包括对该受试者的受累及关节进行外科手术。
24.如权利要求23所述的方法，其中给予该多肽是在该外科手术之前、期间或之后进行。
25.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中给予该多肽与骨髓刺激、软骨置换、自体软骨细胞移植(ACI)或基质诱导的自体软骨细胞移植(MACI)中的任何一种一起进行。
26.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中给予该多肽与自体软骨细胞移植(ACI)一起进行。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该人受试者患有骨关节炎、创伤性关节炎或自身免疫性关节炎。
28.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该人受试者患有软骨损伤。
29.一种组合物，该组合物包含约0.2-200mg多肽，该多肽包含与表1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中该多肽包含在如参考SEQ ID NO:1所确定的位置423处作为除K或R之外的极性氨基酸的氨基酸，该组合物用于治疗人受试者中的关节炎或软骨损伤，其中该多肽是经关节内给予的。
30.如权利要求29所述的组合物，其中该多肽中对应于SEQ ID NO:1的位置423的氨基酸是Q或S或者是缺失的。
31.如权利要求29所述的组合物，其中该多肽包含表1中列出的氨基酸序列。
32.如权利要求29所述的组合物，其中该多肽由表1中列出的氨基酸序列组成。
33.如权利要求29所述的组合物，其中该多肽包含SEQ ID NO:17。
34.如权利要求29所述的组合物，其中该多肽由SEQ ID NO:17组成。
35.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约0.2-60mg的该多肽。
36.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约0.2-40mg的该多肽。
37.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约2-40mg的该多肽。
38.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约10-40mg的该多肽。
39.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约20-40mg的该多肽。
40.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约40-60mg的该多肽。
41.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约0.2mg的该多肽。
42.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约2mg的该多肽。
43.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约10mg的该多肽。
44.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约20mg的该多肽。
45.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约40mg的该多肽。
46.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约60mg的该多肽。
47.如权利要求29-46中任一项所述的组合物，其中将该多肽以单次注射经关节内给予。
48.如权利要求29-46中任一项所述的组合物，其中将该多肽以多次注射经关节内给予。
49.如权利要求29-46中任一项所述的组合物，其中将该多肽经关节内每两周给予一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或该软骨损伤。
50.如权利要求29-46中任一项所述的组合物，其中将该多肽经关节内每月给予一次，持续一段足够长的时间以治疗该关节炎或该软骨损伤。
51.如权利要求29-50中任一项所述的组合物，该组合物用于在外科手术之前、期间或之后对关节炎或软骨损伤的治疗。
52.如权利要求29-50中任一项所述的组合物，其中该治疗与骨髓刺激、软骨置换、自体软骨细胞移植(ACI)或基质诱导的自体软骨细胞移植(MACI)一起进行。
53.如权利要求29-52中任一项所述的组合物，其中该关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎或自身免疫性关节炎。
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