CN104840486A

CN104840486A - 一种组合物及其应用、制剂

Info

Publication number: CN104840486A
Application number: CN201510217226.1A
Authority: CN
Inventors: 徐献毅; 贾颖敏; 史军; 吕垚
Original assignee: BEIJING IMMUNOGENE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING IMMUNOGENE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2015-08-19

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种组合物及其应用、制剂。该组合物由透明质酸或其药学上可接受的盐和间充质干细胞组成。与单纯透明质酸和单纯干细胞治疗相比，经过干细胞和透明质酸联合干预治疗后，动物模型病变的软骨有明显减轻修复表现。

Description

一种组合物及其应用、制剂

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种组合物及其应用、制剂。

背景技术

骨关节炎为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。根据有无局部和全身致病因素，将骨关节炎分为原发性和继发性两大类。目前，对于骨关节炎的治疗主要包括以下几种方法：

1)药物治疗：包括改善症状的药物(镇痛剂)；糖皮质激素；软骨保护剂；

2)外科和关节镜下治疗：根据病情采用关节镜下关节冲洗、骨软骨移植；关节畸形严重者，可采用截骨矫形术；关节破坏严重者可行关节置换术；

3)粘性补充疗法——单纯透明质酸注射治疗：透明质酸是一种独特的线性大分子酸性粘多糖。其广泛分布于动物和人体结缔组织细胞外基质中，在眼玻璃体、脐带、皮肤、软骨和滑液中含量较高。透明质酸因其高度的粘弹性、可塑性、渗透性、独特的保湿性、优良的生物相容性和可降解性，已被广泛应用于临床医学和高级化妆品。比如在医学领域，透明质酸已被广泛应用于关节疾病、眼科手术、预防术后粘连、治疗烫伤以及作为药物载体和助剂等。对于关节疾病的治疗，透明质酸通过向关节腔内注射大分子量透明质酸溶液，恢复关节组织的粘弹性，重建透明质酸对关节组织的保护作用，减轻滑膜炎症和软骨退变。透明质酸可阻止软骨发生退行性变，对已发生病变的关节有促进修复作用；

4)单纯干细胞治疗：

间充质干细胞(MSCs)是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛分布于各种不同的组织中，如骨髓、外周血、脐血、脂肪等组织。其中脐带作为医疗废弃物来源丰富，收集方法简单易行，对供体无损伤，微生物和肿瘤细胞污染的可能性小，不涉及社会、伦理及法律方面的更多争论，因此脐带间充质干细胞(UCMSCs)有望成为细胞治疗和组织工程的焦点。动物实验和临床研究表明，MSCs不表达MHC-II类分子和FasL，不表达共刺激分子B7-1、B7-2，低水平表达MHC-I类分子、CD40，将MSCs与异基因单个核细胞或同种异体T淋巴细胞共培养后不能引起同种异体T淋巴细胞显著增殖，说明MSCs具有低免疫原性和较低的抗原提呈能力，为他们临床应用的安全性和有效性提供了可靠的理论依据，可成为理想的细胞治疗材料，即使在HLA不匹配的个体间进行移植也不需要对宿主采用免疫抑制，这一新的细胞种类的发现为许多疾病的细胞替代治疗和治愈带来了光明的前景。同时，干细胞还具有营养、抗炎及免疫抑制等作用。对于关节疾病的治疗，将干细胞直接注射到关节腔内治疗骨关节炎可明显修复关节软骨，并延缓病情进展。

然而，用目前的技术和方法难以逆转关节疾病的进展，单纯透明质酸和间充质干细胞对关节疾病的治疗有一定效果，但并不显著。在关节疾病治疗领域，如何延缓、逆转细胞死亡，甚至替换死亡的软骨细胞对该类疾病的治疗具有重要价值。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种组合物及其应用、制剂。该组合物比单纯间充质干细胞和单纯透明质酸治疗有更好的修复作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种组合物，由透明质酸或其药学上可接受的盐和间充质干细胞组成。

关节腔内注射干细胞治疗以及粘性补充疗法——透明质酸注射治疗，两种治疗手段均可减轻软骨破坏，修复损伤的软骨组织，抑制滑膜炎症，延缓骨关节炎疾病进展。本发明将两者组成新型复合物，并探讨其最佳治疗配比以及其治疗骨、关节变性的作用机制及机理。透明质酸可以抑制TGF-α和其受体在软骨的表达，抑制IL-1β和基质降解酶的表达。这些炎症介质有损伤软骨作用外，均对间充质干细胞有促凋亡作用。透明质酸的抗炎作用可以为间充质干细胞迁移、增殖和分化创造微环境。研究表明间充质干细胞联合透明质酸比单纯间充质干细胞和单纯透明质酸治疗有更好的修复作用。

在本发明提供的一些实施例中，以ml/个计，透明质酸或其药学上可接受的盐与间充质干细胞的比例为(0.1～1)：(1×10⁴～1×10⁷)。

作为优选，以ml/个计，透明质酸或其药学上可接受的盐与间充质干细胞的比例为(0.1～0.5)：(1×10⁴～1×10⁵)。

优选地，以ml/个计，透明质酸或其药学上可接受的盐与间充质干细胞的比例为0.5：0.5×10⁵。

在本发明提供的一些实施例中，药学上可接受的盐为钠盐。

在本发明提供的一些实施例中，透明质酸或其药学上可接受的盐的分子量(Mr)为1800000～2200000。

本发明还提供了该组合物在制备治疗骨关节炎疾病药物中的用途；该组合物由透明质酸或其药学上可接受的盐和间充质干细胞组成；在本发明提供的一些实施例中，以ml/个计，透明质酸或其药学上可接受的盐与间充质干细胞的比例为(0.1～1)：(1×10⁴～1×10⁷)；作为优选，以ml/个计，透明质酸或其药学上可接受的盐与间充质干细胞的比例为(0.1～0.5)：(1×10⁴～1×10⁵)；优选地，以ml/个计，透明质酸或其药学上可接受的盐与间充质干细胞的比例为0.5：0.5×10⁵；在本发明提供的一些实施例中，药学上可接受的盐为钠盐；在本发明提供的一些实施例中，透明质酸或其药学上可接受的盐的分子量为1800000～2200000。

本发明还提供了一种药物制剂，包括本发明提供的组合物和药学上可接受的辅料；该组合物由透明质酸或其药学上可接受的盐和间充质干细胞组成；在本发明提供的一些实施例中，以ml/个计，透明质酸或其药学上可接受的盐与间充质干细胞的比例为(0.1～1)：(1×10⁴～1×10⁷)；作为优选，以ml/个计，透明质酸或其药学上可接受的盐与间充质干细胞的比例为(0.1～0.5)：(1×10⁴～1×10⁵)；优选地，以ml/个计，透明质酸或其药学上可接受的盐与间充质干细胞的比例为0.5：0.5×10⁵；在本发明提供的一些实施例中，药学上可接受的盐为钠盐；在本发明提供的一些实施例中，透明质酸或其药学上可接受的盐的分子量为1800000～2200000。

在本发明提供的一些实施例中，药物制剂的剂型为注射液。

在本发明提供的一些实施例中，药物制剂的施药部位为关节腔。

本发明提供了一种组合物及其应用、制剂。该组合物由透明质酸或其药学上可接受的盐和间充质干细胞组成。本发明通过对骨关节炎模型兔子进行疗效观察试验，在大大减少干细胞和透明质酸的用量后，联合治疗组患侧的IL-1β浓度(17.79pg/ml)反而比透明质酸治疗组患侧(19.97pg/ml)及干细胞治疗组患侧(18.60pg/ml)的IL-1β浓度降低了；电镜图片显示，相对与干细胞组和透明质酸组，干细胞+透明质酸治疗组软骨细胞的各种细胞器丰富，细胞核形态正常，胞质丰富，染色质较均匀，细胞表面突起基本消失，细胞内有大量粗面内质网，胞浆中有空泡出现，细胞周围质地较为密实；表明两者联合治疗关节炎损伤具有协同增效作用。由此可见，与单纯透明质酸和单纯干细胞治疗相比，经过干细胞和透明质酸联合干预治疗后，动物模型病变的软骨有明显减轻修复表现，本发明组合物可有效治疗骨关节炎。

附图说明

图1示各组动物关节软骨细胞电镜照片；其中，图A示对照组软骨细胞(10000×)；图B示OA组软骨细胞(10000×)；图C示干细胞治疗组软骨细胞(10000×)；图D示透明质酸治疗组软骨细胞(10000×)；图E示干细胞+透明质酸治疗组软骨细胞(10000×)。

具体实施方式

本发明公开了一种组合物及其应用、制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的组合物及其应用、制剂中所用原料药或辅料均可由市场购得。其中，脐带购自北科生物科技有限公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 间充质干细胞的分离、培养及鉴定

脐带间充质干细胞的原代分离培养：在无菌条件下将脐带浸入无血清的改良Eagle培养(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中，磷酸盐缓冲(phosphatebuffered saline，PBS)洗涤去除残存血，并向培养液中加入血清替代品。将脐带剪碎至1mm³大小组织块，先后经胶原酶IV和0.1％胰酶消化，细胞筛过滤，离心，PBS洗涤。以1.0×10⁶密度接种到10cm塑料培养皿，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下细胞培养箱中培养。至10～14d单层贴壁细胞接近90％汇合时，0.25％胰蛋白酶消化，1∶2传代。以后随细胞扩增均于80％～90％汇合时按1∶2持续体外传代培养。

间充质干细胞的流式细胞术鉴定表面标志：鉴定表面标志的目的是确定干细胞培养是否合格。具体操作为：体外培养细胞至第4代，接近90％汇合时，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，取约1×10⁶个细胞悬于100μl PBS中，分别加入适量异硫氰酸标记CD29、CD73、CD90、CD44、CD105抗体避光染色30min。CD14，CD19，CD34，CD45，HLA-DR检测采用间接荧光标记法，细胞与抗体反应30min后，需再与异硫氰酸标记的二抗避光反应30min。最后用1％多聚甲醛600μl重悬，流式细胞仪检测分析。流式细胞仪检测表面标记显示CD29，CD44，CD73，CD90，CD105阳性率均在为95％以上；CD14，CD19，CD34，CD45，HLA-DR的表达率均低于2％。此结果表明干细胞培养合格，可用于关节炎的治疗。

实施例2 动物实验

兔骨关节炎动物模型的建立：20只兔子建立骨关节炎模型，按Vandman法将兔的左膝用石膏固定于伸直位，固定范围从踝关节下3cm至腹股沟下1.5cm，踝背屈30～40°，时间6周。6周后去除石膏制成骨关节炎模型。

取实施例1获得的生长状态良好的第3代细胞制备的细胞悬液，加入0.5ml的透明质酸凝胶，作为干细胞+透明质酸治疗试验组。

分组及处理方法：将上述制得的20只骨关节炎模型兔子随机分成OA组(骨关节炎模型组)、对照组、干细胞治疗组、透明质酸治疗组、干细胞+透明质酸组，每组4只。OA组在分组后立即处死，干细胞治疗组膝关节腔注射1×10⁵个/ml的hUMSCs 1ml，透明质酸治疗组关节腔内注射透明质酸1ml，干细胞+透明质酸组(干细胞为1×10⁵个/ml 0.5ml、透明质酸为0.5ml)关节腔内注射治疗，对照组在关节腔内注射等量生理盐水，每周1次连续4次，最后1次注射后1周处死。施药方案如表1所示。

表1 施药方案

组别	施药剂量
		对照组	生理盐水1ml
OA组	——
		干细胞治疗组	hUMSCs 1×10⁵个
透明质酸治疗组	透明质酸1ml
		干细胞+透明质酸治疗组	干细胞0.5×10⁵个+透明质酸0.5ml

1、标本处理：所有动物处死后取关节液0.2ml于-20℃冰箱保存，留检IL-1β浓度。用ELISA双抗夹心法标记所收集关节液中的IL-1β，使呈有色反应，酶标仪450nm处读取OD值，通过绘制标准曲线，计算IL-1β浓度；见表2。

表2 IL-1β含量

由表2所示，在大大减少干细胞和透明质酸的用量后，联合治疗组患侧的IL-1β浓度(17.79pg/ml)反而比透明质酸治疗组患侧(19.97pg/ml)及干细胞治疗组患侧(18.60pg/ml)的IL-1β浓度降低了，结果显示干细胞与透明质酸联合治疗后具有一定的协同增效作用。

2、电镜标本处理：另取滑膜立刻置入0.25％戊二醛中做电镜标本，1％锇酸固定2h，梯度乙醇及丙烯酮脱水，618环氧树脂包埋，超薄片机切成60nm厚薄片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察。电镜图片见图1。

由图1可以看出，对照组细胞周围质地松散，细胞外形不规则，细胞界限不清晰(图1A)；OA组软骨细胞细胞内有大量空泡，外形不规则，细胞周晕消失，核膜不明显，细胞周围几乎未见其它组织结果(图1B)；干细胞组软骨细胞核呈卵圆形，细胞表面有细长突起，胞体及包膜较为完整，胞浆内可见许多的细胞器，细胞内有大量粗面内质网，细胞周围质地松散(图1C)；透明质酸组软骨细胞比较完整，细胞外形较规则，细胞间有联系，但细胞周围质地松散(图1D)；干细胞+透明质酸治疗组软骨细胞的各种细胞器丰富，细胞核形态正常，胞质丰富，染色质较均匀，细胞表面突起基本消失，细胞内有大量粗面内质网，胞浆中有空泡出现，细胞周围质地较为密实(图1E)。

可见，经过干细胞和透明质酸联合干预治疗后，动物模型病变的软骨有明显减轻修复表现。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种组合物，其特征在于，由透明质酸或其药学上可接受的盐和间充质干细胞组成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以ml/个计，所述透明质酸或其药学上可接受的盐与所述间充质干细胞的比例为(0.1～1)：(1×10⁴～1×10⁷)。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述药学上可接受的盐为钠盐。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述透明质酸或其药学上可接受的盐的分子量为1 800 000～2 200 000。

5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物在制备治疗骨关节炎疾病药物中的用途。

6.一种药物制剂，其特征在于，包括如权利要求1至4中任一项所述的组合物和药学上可接受的辅料。

7.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为注射液。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的施药部位为关节腔。