CN117721115A - 用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用 - Google Patents
用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117721115A CN117721115A CN202211085631.9A CN202211085631A CN117721115A CN 117721115 A CN117721115 A CN 117721115A CN 202211085631 A CN202211085631 A CN 202211085631A CN 117721115 A CN117721115 A CN 117721115A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mrna
- seq
- preparation
- osteoarthritis
- ppp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 147
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 10
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 34
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 26
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 10
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 7
- AGWRKMKSPDCRHI-UHFFFAOYSA-K [[5-(2-amino-7-methyl-6-oxo-1H-purin-9-ium-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-oxidophosphoryl] [[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-oxidophosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-methoxyoxolan-2-yl]methoxy-oxidophosphoryl] phosphate Chemical group COC1C(OP([O-])(=O)OCC2OC(C(O)C2O)N2C=NC3=C2N=C(N)NC3=O)C(COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OCC2OC(C(O)C2O)N2C=[N+](C)C3=C2N=C(N)NC3=O)OC1N1C=NC2=C1N=CN=C2N AGWRKMKSPDCRHI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 abstract description 5
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 abstract description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 abstract description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 20
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 14
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 13
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 210000004439 collateral ligament Anatomy 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 7
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 7
- 102100035323 Fibroblast growth factor 18 Human genes 0.000 description 7
- 101000878128 Homo sapiens Fibroblast growth factor 18 Proteins 0.000 description 7
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 210000004353 tibial menisci Anatomy 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 5
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 5
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 4
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 238000010023 transfer printing Methods 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000931888 Pyxis Species 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100455633 Caenorhabditis elegans lst-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L Fast green FCF Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC(O)=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000619472 Homo sapiens Lateral signaling target protein 2 homolog Proteins 0.000 description 1
- 206010023232 Joint swelling Diseases 0.000 description 1
- 102100022150 Lateral signaling target protein 2 homolog Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100046526 Mus musculus Tnf gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004285 patellofemoral joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M sodium;2-iodoacetate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CI AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000005222 synovial tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Abstract
本发明提供了用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用。本发明一方面提供一种mRNA,其可编码序列如SEQ ID No.12的氨基酸。本发明还提供所述mRNA的制备方法。本发明还提供一种用于治疗关节软骨损伤和/或骨关节炎的药物制剂,其包含所述mRNA。本发明还提供所述mRNA和mRNA剂型的骨关节炎药物制剂的应用。本发明提供的mRNA在细胞内的特异性表达水平更高;本发明提供的mRNA制剂进行肌肉注射后,小鼠血清中TNFα水平明显更低;本发明mRNA的治疗效果更好。
Description
技术领域
本发明属于骨关节炎治疗技术领域,尤其涉及用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用。
背景技术
骨关节炎(OA)是一种常发于老年人口的退行性疾病,是老年人最常见的10种残疾原因之一。据统计,2008年至2011年,OA导致的收入损失需要花费800亿美元每年来补偿。据不完全统计,目前全世界已有5亿人受累于骨关节炎。传统的药物治疗手段,均从症状着手以缓解疼痛,无法从根本上治疗OA,也无法延缓OA的发展,部分注射类药物还存在较严重肝肾风险。
CN113244413A和CN113425855A率先公开了通过mRNA技术编码刺激软骨生长因子在关节腔软骨细胞中表达,从而促进软骨再生、起到治疗骨关节炎效果的技术方案,并公开了有效治疗骨关节炎的mRNA药物,所述mRNA药物具有软骨修复功能。但随着研究的进展和数据的不断收集,我们发现该技术方案的技术效果有较大的提升空间,其中公开的mRNA药物尚存在细胞内特异性表达水平不够高等问题,需进一步优化迭代。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
一方面,本发明提供一种mRNA,可编码序列如SEQ ID No.12的氨基酸。所述mRNA是体外合成的,所述mRNA能够作为活性成分用于治疗骨关节炎。
根据本发明的具体实施方案,其中,所述mRNA的编码区序列如SEQ ID No.1-SEQID No.11任一序列所示。
根据本发明的具体实施方案,其中,所述mRNA的5’端连接帽子结构和5’UTR;所述mRNA的3’端连接3’UTR和多聚A尾。
根据本发明的具体实施方案,其中,所述多聚A尾包括长度为90-130的多个A,多个A为连续的或中间插入1-12nt且不全部为A的连接子;
优选地,所述多聚A尾的序列为
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID No.15)。
另一方面,本发明中,所采用的帽子结构为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)、G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')G、3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G或m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
根据本发明的具体实施方案,其中,所述5’UTR序列为
AGGGAGATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCGCCACC(SEQ ID No.16)。
根据本发明的具体实施方案,其中,所述3’UTR序列为
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG(SEQ ID No.17)。
另一方面,本发明提供一种DNA模板,其可以转录得到所述的mRNA。
另一方面,本发明提供所述的mRNA的制备方法,其包括:
将能转录所述mRNA的DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒;
将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞,体外转录合成获得所述mRNA。
可以理解,本发明的方法还可以包括所述领域的常规操作,如重组细胞的扩繁操作、提取质粒的操作等。
根据本发明的具体实施方案,其中,所述mRNA体外合成的条件为36-38℃,8-12小时。
另一方面,本发明还提供所述的mRNA在制备用于治疗关节软骨损伤和/或骨关节炎的药物中的应用。
另一方面,本发明还提供一种用于治疗关节软骨损伤和/或骨关节炎的药物制剂,其包含活性成分mRNA,所述mRNA包括前面所述的mRNA中的一种或两种以上。
根据本发明的具体实施方案,其中,活性成分mRNA包括编码区序列如SEQ IDNo.1所示的mRNA和/或编码区序列如SEQ ID No.5所示的mRNA。
根据本发明的具体实施方案,其中,所述药物制剂为注射制剂;
优选地,所述活性成分mRNA在药物制剂中的浓度为200~10000μg/ml;
优选地,所述药物制剂的使用剂量,以每一关节计,为10~20μg,优选为14~16μg,最优选为15μg。
本发明的有益效果:
本发明通过生物信息手段对序列进行优化,经过数据筛选最终选定11条优化后的mRNA,即本发明中编码区序列如SEQ ID No.1~SEQ ID No.11所示的mRNA。并对这11条mRNA进行测试,筛选得到综合表现更好的新一代治疗骨关节炎的mRNA。
本发明通过关节组织病理学分析评价mRNA制剂对内侧半月板横断(MMT)诱导的大鼠骨关节炎模型的药效。在给药后4周内动物体重增长平稳,各组之间体重无显著性差异;实际观察中相比于对照组,实验动物的骨关节炎疼痛症状有明显缓解。给药后一周大鼠膝关节肿胀有明显缓解。关节组织病理学分析评价结果显示,与模型组相比较,mRNA制剂组在给药后4周后对主要组织性质、表面规则性、结构完整性均有降低的趋势。
本发明在对编码FGF18的mRNA进行不同的优化与设计之后,最终得到了表达水平更高、半衰期更长、免疫原性更低、治疗效果更好的新一代mRNA治疗药物。与现有技术相比,本发明提供的具有刺激软骨再生的蛋白生长因子mRNA在细胞内的特异性表达水平更高、半衰期更长;本发明提供的mRNA制剂进行肌肉注射后,小鼠血清中TNFα水平明显更低,说明本发明提供的mRNA治疗药物的免疫原性更低,安全性更好;在治疗效果的评价方面,本发明mRNA亦具有更好的表现。
附图说明
图1为序列计算优化关键指标差异图。
图2为编码刺激软骨再生的蛋白生长因子mRNA的结构示意图。
图3为pRhe质粒的质粒图谱。
图4为WesternBlot检测软骨生长因子mRNA在细胞内的表达情况。
图5为小鼠注射本发明提供的mRNA剂型的骨关节炎药物制剂的TNFα水平。
图6为各实验组大鼠关节切片和番红固绿染色结果,观察软骨修复情况。
图7为各实验组大鼠关节切片OARSI评分,显示mRNA药物制剂对骨关节炎的修复作用。
图8为各实验组大鼠步态分析数据。
图9为各实验组大鼠数字DR测量数据。
图10为各实验组注射mRNA制剂或蛋白标品之后血液中相应蛋白的浓度与时间的关系。
图11为斑点印迹法(dot blot)检测RNA制备工艺中双链RNA残留情况。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解,现对本发明的技术方案进行以下详细说明,但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明提供了一种mRNA剂型的骨关节炎药物制剂,包括活性成分mRNA,在本发明中,所述mRNA的编码区序列如SEQ ID No.1~SEQ ID No.11所示。本发明中使用“T”代表RNA的尿嘧啶(U),本发明中“T”也可以代表假尿苷(ψ),本发明中“T”也可以代表N1-甲基假尿苷(m1ψ);具体如下:
SEQ ID No.1:
ATGTACAGCGCCCCTAGCGCCTGCACCTGCCTGTGCCTGCACTTCCTGCTCCTGTGCTTCCAAGTGCAAGTGCTGGTGGCCGGCAGCGAGGAGAACGTGGACTTCAGAATCCACGTGGAGAATCAGACAAGAGCTAGAGACGACGTGAGCAGAAAGCAGCTGAGACTGTATCAGCTGTACAGCAGAACAAGCGGCAAGCACATCCAAGTGCTGGGCAGAAGAATCAGCGCTAGAGGCGAGGACGGCGACAAGTACGCTCAGCTGCTGGTGGAGACCGACACCTTCGGCAGCCAAGTGAGAATCAAGGGCAAGGAGACCGAGTTCTACCTGTGCATGAACAGAAAGGGCAAGCTGGTGGGCAAGCCCGACGGCACAAGCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGCTGGAGAACAACTACACCGCCCTGATGAGCGCCAAGTACAGCGGCTGGTACGTGGGCTTCACCAAGAAGGGCAGACCTAGAAAGGGCCCCAAGACAAGAGAGAATCAGCAAGACGTGCACTTCATGAAGAGATACCCCAAGGGGCAGCCCGAGCTGCAGAAGCCCTTCAAGTACACCACCGTGACCAAGTGATAA;
SEQ ID No.2:
ATGTATTCCGCTCCTTCCGCTTGTACATGTCTCTGTCTCCATTTCCTGCTGCTGTGCTTCCAGGTGCAGGTCCTGGTTGCCGGCAGCGAGGAGAACGTGGATTTTCGGATCCACGTGGAAAACCAGACCCGCGCCCGGGATGACGTCAGCAGGAAGCAGCTCAGGCTGTACCAGCTCTACTCCCGGACATCCGGGAAGCACATCCAAGTGCTTGGCCGTCGGATCTCCGCCAGGGGCGAGGATGGTGATAAGTATGCTCAGCTCCTGGTGGAGACCGACACTTTCGGCAGCCAGGTCAGAATTAAGGGAAAAGAGACCGAATTCTACCTGTGCATGAACCGAAAGGGTAAGCTGGTTGGGAAGCCCGACGGTACCAGCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGTTGGAAAATAACTACACCGCCTTGATGAGCGCCAAGTACTCCGGCTGGTACGTGGGCTTCACCAAGAAGGGTCGGCCCCGTAAGGGGCCAAAGACCCGGGAGAACCAGCAGGATGTCCACTTCATGAAGAGGTACCCTAAGGGGCAGCCTGAGCTGCAGAAGCCCTTTAAGTACACTACGGTGACTAAGTGATAA;
SEQ ID No.3:
ATGTACTCGGCCCCCAGCGCCTGCACCTGTCTGTGCCTGCATTTCCTGTTGCTGTGCTTTCAGGTGCAGGTGCTGGTGGCCGGCAGCGAGGAGAACGTCGATTTTCGCATCCACGTGGAGAACCAGACCCGAGCACGTGATGATGTTTCCCGGAAGCAGCTCCGGCTGTACCAGCTGTACAGCCGGACTTCCGGGAAGCATATTCAGGTGCTCGGGCGTCGGATCTCCGCGCGGGGCGAAGACGGCGACAAGTATGCGCAGCTGTTGGTCGAGACGGACACGTTTGGATCACAGGTGCGCATAAAGGGTAAGGAGACCGAGTTTTACCTCTGTATGAACCGCAAGGGGAAGCTCGTCGGGAAGCCCGACGGGACTTCCAAGGAGTGCGTGTTCATAGAGAAGGTACTCGAGAATAATTACACCGCGCTGATGAGCGCGAAGTATTCGGGCTGGTATGTGGGGTTTACCAAGAAAGGTAGACCCCGCAAGGGCCCGAAGACTCGCGAGAATCAGCAGGATGTCCACTTTATGAAGCGGTATCCTAAGGGTCAGCCGGAGCTGCAGAAGCCGTTTAAGTACACGACGGTGACTAAGCGGTAA;
SEQ ID No.4:
ATGTATTCCGCTCCTTCCGCTTGTACATGTCTCTGTCTCCACTTCCTGCTGCTGTGCTTCCAGGTGCAGGTGCTGGTGGCCGGCAGCGAAGAGAACGTGGACTTCAGGATCCACGTGGAGAACCAGACCCGCGCCAGGGACGACGTCAGCAGGAAGCAGCTCAGGCTGTACCAGCTTTACAGCAGGACCAGCGGCAAGCACATCCAGGTGCTGGGCAGGCGGATCTCCGCCAGGGGCGAGGACGGCGACAAGTACGCCCAGCTGCTGGTGGAGACCGACACCTTCGGCAGCCAGGTGAGGATAAAGGGCAAGGAGACCGAGTTCTACCTGTGCATGAACCGGAAGGGGAAGCTGGTGGGGAAGCCCGACGGCACCAGCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGCTGGAGAACAACTACACCGCCTTGATGAGCGCCAAGTACTCCGGCTGGTACGTGGGCTTCACCAAGAAGGGCAGGCCCAGGAAGGGCCCTAAGACCAGGGAGAACCAGCAGGACGTGCACTTCATGAAGAGGTACCCCAAGGGCCAGCCTGAGCTGCAGAAGCCCTTTAAGTACACCACCGTGACCAAGTGATAA;
SEQ ID No.5:
ATGTATTCCGCTCCTTCCGCTTGTACATGTCTCTGTCTCCACTTCCTGCTGCTGTGCTTCCAGGTCCAGGTACTGGTTGCGGGCAGCGAGGAGAACGTGGATTTCAGGATCCACGTCGAAAACCAGACCCGGGCCCGGGATGACGTCAGCAGGAAGCAGCTGCGGCTGTACCAACTGTACAGCCGCACCTCCGGCAAGCACATCCAAGTGCTTGGCCGGAGGATCTCCGCCCGGGGCGAGGATGGCGACAAATACGCCCAGCTGCTGGTGGAGACCGACACTTTCGGTTCGCAGGTGAGAATCAAAGGTAAGGAGACCGAATTTTACCTGTGTATGAACCGAAAGGGCAAGCTGGTGGGGAAGCCCGACGGTACCAGCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGTTGGAGAACAACTACACCGCCTTGATGAGCGCCAAGTACTCCGGCTGGTACGTGGGCTTCACTAAGAAGGGCAGGCCCCGGAAGGGGCCTAAGACGCGTGAAAATCAGCAGGACGTCCACTTCATGAAGAGGTACCCTAAGGGGCAGCCCGAGCTGCAGAAGCCCTTCAAGTACACTACGGTGACTAAGTGATAA;
SEQ ID No.6:
ATGTATTCCGCTCCTTCCGCTTGTACATGTCTCTGTCTCCACTTCCTGCTGCTGTGCTTCCAGGTCCAGGTGCTGGTCGCCGGCAGCGAGGAGAACGTGGACTTCAGGATCCACGTGGAGAACCAGACCAGGGCCAGGGACGACGTGAGCAGGAAGCAGCTGAGGCTGTACCAGCTGTACAGCCGAACCTCAGGCAAGCACATCCAGGTGCTGGGCAGGAGGATCAGCGCCAGGGGCGAGGACGGCGACAAGTACGCCCAGCTGCTGGTGGAGACCGACACCTTCGGCAGCCAGGTGAGGATCAAGGGCAAGGAGACCGAGTTCTACCTGTGCATGAACAGGAAGGGCAAGCTGGTGGGGAAGCCCGACGGCACCAGCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGCTGGAGAACAACTACACCGCCTTGATGAGCGCCAAGTACTCTGGCTGGTACGTGGGCTTCACCAAGAAGGGCAGGCCCAGGAAGGGCCCCAAGACCAGGGAGAATCAGCAGGACGTGCACTTCATGAAGAGGTACCCCAAGGGCCAGCCCGAGCTGCAGAAGCCCTTCAAGTACACAACCGTGACCAAGTGATAA;
SEQ ID No.7:
ATGTATTCCGCTCCCTCCGCTTGTACATGTCTCTGTCTTCACTTCCTGCTCTTGTGCTTCCAGGTCCAGGTTCTGGTTGCCGGCAGCGAGGAGAACGTGGATTTCCGGATCCACGTGGAAAACCAGACCCGGGCCCGGGATGACGTGAGCAGGAAGCAGCTCAGGCTGTACCAGCTTTACAGCCGCACGAGCGGCAAGCACATTCAAGTGCTTGGGCGTCGGATCTCCGCCAGGGGCGAGGACGGCGATAAGTACGCCCAGCTCCTGGTGGAGACCGACACCTTCGGTTCCCAGGTCCGAATTAAGGGCAAGGAGACCGAGTTCTACCTGTGTATGAACAGGAAGGGCAAGCTGGTTGGTAAACCCGACGGTACCAGCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGTTGGAAAATAACTACACCGCCTTGATGAGCGCAAAGTACTCCGGCTGGTACGTCGGGTTTACCAAGAAGGGTCGGCCCCGAAAGGGGCCTAAGACCCGGGAGAACCAGCAGGATGTCCACTTCATGAAGAGGTACCCCAAGGGGCAGCCTGAGCTGCAGAAGCCGTTCAAGTATACCACCGTGACCAAGACTGATAA;
SEQ ID No.8:
ATGTATTCCGCTCCCTCCGCTTGTACATGTCTCTGTCTTCATTTCCTGCTCCTGTGCTTCCAGGTCCAGGTGCTGGTGGCCGGCAGCGAAGAGAACGTGGATTTCAGGATCCACGTGGAAAACCAGACCAGGGCCAGGGACGACGTGAGCAGGAAGCAGCTCAGGCTGTACCAGCTGTACAGCCGCACCAGCGGCAAGCACATTCAGGTGCTTGGGCGGAGGATCTCCGCCAGGGGCGAGGACGGCGATAAGTACGCCCAGCTCCTGGTGGAGACCGACACCTTCGGCTCCCAGGTCCGAATCAAGGGCAAGGAGACCGAGTTCTACCTGTGCATGAACAGGAAGGGCAAGCTGGTGGGAAAGCCCGACGGTACCAGCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGTTGGAGAATAACTACACCGCCTTGATGAGCGCCAAGTACTCCGGCTGGTACGTGGGCTTTACCAAAAAGGGCCGGCCTCGAAAGGGCCCTAAGACCAGGGAGAACCAGCAGGATGTCCACTTCATGAAGAGGTACCCGAAAGGGCAGCCTGAGCTGCAGAAGCCCTTTAAGTATACCACCGTGACCAAGAGTGATAA;
SEQ ID No.9:
ATGTATTCCGCTCCCTCCGCTTGTACATGTCTCTGTCTGCACTTCCTGCTCCTGTGCTTCCAGGTGCAGGTGCTGGTGGCCGGCAGCGAGGAGAACGTGGATTTCAGGATCCACGTGGAAAACCAGACCAGGGCCAGGGACGACGTGAGCAGGAAGCAGCTTAGGCTGTACCAGCTGTACAGCAGGACCAGCGGCAAGCACATTCAGGTGCTGGGGAGGAGGATCTCCGCCAGGGGCGAGGACGGCGATAAGTACGCCCAGCTGCTGGTGGAGACCGACACCTTCGGCAGCCAGGTGAGGATCAAGGGCAAGGAGACCGAGTTCTACCTGTGCATGAACAGGAAGGGCAAGCTGGTGGGCAAGCCCGACGGCACCAGCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGCTGGAGAATAACTACACCGCCCTGATGAGCGCCAAGTACTCCGGCTGGTACGTGGGCTTTACCAAGAAGGGCCGGCCTAGGAAGGGCCCTAAGACCAGGGAGAACCAGCAGGACGTGCACTTCATGAAGAGGTACCCTAAGGGGCAGCCTGAGCTGCAGAAGCCTTTCAAGTACACCACCGTGACCAAGAGTGATAA;
SEQ ID No.10:
ATGTATTCCGCTCCCTCCGCTTGTACATGTCTCTGTCTGCATTTCCTGCTCTTGTGTTTCCAGGTCCAGGTCCTGGTTGCCGGCAGCGAGGAAAACGTGGATTTCAGGATCCACGTGGAAAACCAGACCCGGGCCCGGGACGACGTGAGCAGGAAGCAGCTCAGGCTGTACCAACTGTACAGCCGCACAAGCGGCAAGCACATCCAAGTGCTGGGCCGAAGGATCTCTGCCAGGGGCGAGGACGGCGACAAGTACGCCCAGCTCCTGGTAGAGACCGATACCTTCGGCTCTCAGGTGCGGATCAAGGGTAAAGAGACCGAGTTCTACCTGTGTATGAACAGGAAGGGCAAACTTGTCGGCAAGCCTGACGGTACCTCCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGTTGGAGAACAACTACACCGCCTTGATGAGCGCGAAGTACTCCGGCTGGTACGTGGGTTTTACCAAGAAAGGTAGGCCCCGTAAGGGGCCTAAGACCCGCGAGAACCAGCAGGATGTGCACTTCATGAAGAGGTACCCTAAGGGGCAGCCTGAGCTGCAAAAGCCCTTTAAGTACACTACGGTGACTAAGAGTGATAA;
SEQ ID No.11:
ATGTATTCCGCTCCCTCCGCTTGTACATGTCTCTGTCTGCACTTCCTGCTGCTGTGCTTCCAGGTCCAGGTGCTGGTCGCCGGCAGCGAGGAGAACGTGGATTTCAGGATCCACGTGGAGAACCAGACCAGGGCCAGGGACGACGTGAGCAGGAAGCAGCTCAGGCTGTACCAGCTGTACAGCCGCACCAGCGGCAAGCACATCCAGGTGCTGGGCCGGAGGATCTCTGCCAGGGGCGAGGACGGGGACAAGTACGCCCAGCTCCTGGTGGAGACCGACACCTTCGGCAGCCAGGTGAGGATCAAGGGCAAGGAAACCGAGTTCTACCTGTGCATGAATAGGAAGGGCAAGCTGGTTGGCAAGCCTGACGGCACCTCCAAGGAGTGCGTGTTCATCGAGAAGGTGCTGGAGAACAACTACACCGCCTTGATGAGCGCCAAGTACAGCGGCTGGTACGTGGGCTTCACCAAGAAGGGCAGGCCTCGTAAGGGGCCTAAGACCCGCGAGAACCAGCAGGACGTGCATTTTATGAAGAGGTACCCTAAGGGCCAGCCTGAGCTGCAGAAGCCTTTCAAGTACACCACCGTGACTAAGAGTGATAA;
SEQ ID No.12:
MYSAPSACTCLCLHFLLLCFQVQVLVAGSEENVDFRIHVENQTRARDDVSRKQLRLYQLYSRTSGKHIQVLGRRISARGEDGDKYAQLLVETDTFGSQVRIKGKETEFYLCMNRKGKLVGKPDGTSKECVFIEKVLENNYTALMSAKYSGWYVGFTKKGRPRKGPKTRENQQDVHFMKRYPKGQPELQKPFKYTTVTK。
在本发明中,所述mRNA的5’端优选的连接帽子结构和5’UTR;所述mRNA的3’端优选的连接3’UTR和修饰的多聚A尾。在本发明中,所述mRNA的结构示意图如图2所示。
在本发明中,所述骨关节炎药物制剂优选为液体制剂,更优选为注射制剂。在本发明中,所述活性成分mRNA在骨关节炎药物制剂中的浓度优选为200~10000μg/ml,更优选为200-5000μg/ml,更优选为250~2500μg/ml。所述活性成分mRNA的溶剂优选为生理盐水。本发明对所述生理盐水的制备方法没有特殊限定,采用本领域常规的生理盐水即可。本发明对所述注射制剂的制备方法没有特殊限定,满足本领域常规注射制剂的要求即可。
本发明提供了所述的骨关节炎药物制剂的制备方法,包括以下步骤:1)合成所述的骨关节炎药物制剂中的活性成分mRNA对应的DNA片段,并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒;2)将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞,从扩繁后的重组细胞中提取质粒,以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板;3)构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述活性成分mRNA。
在本发明中,合成转录所述的mRNA的DNA片段,并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒。本发明对合成所述的mRNA对应的DNA片段的方法没有特殊限定,采用本领域常规的DNA合成方法即可,在本发明具体实施过程中,优选的委托生物技术公司合成。在本发明中,所述DNA片段的具体序列根据碱基互补配对原则确定。在本发明中,所述表达质粒优选为pRhe质粒,在本发明中,所述pRhe质粒的质粒图谱如图3所示。在本发明中,优选的通过酶切连接的方法将所述DNA片段克隆至表达质粒中;在本发明中,所述DNA片段优选的通过BamHI和NheI酶进行双酶切获得酶切NDA片段;所述表达质粒优选的通过BamHI和NheI酶进行双酶切后获得酶切质粒;然后将所述酶切DNA片段和酶切质粒连接获得重组质粒。本发明对所述双酶切和连接的具体操作没有特殊限定,采用本领域常规的双酶切和连接的操作即可。
本发明在获得所述重组质粒后,将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞,从扩繁后的重组细胞中提取质粒,以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板。在本发明中,所述宿主细胞优选为大肠杆菌感受态细胞;本发明对所述转入的方法没有特殊限定,采用本领域常规的转入方法即可。本发明在获得重组细胞后,优选的进行阳性重组细胞的筛选和菌落测序。在本发明中,所述阳性重组细胞的筛选优选的在amp抗性的固体培养基上进行。在本发明中,挑选所述amp抗性的固体培养基上的单菌落进行菌落PCR,选取菌落PCR结果含目的条带的菌落进行测序。在本发明中,所述菌落PCR的引物包括引物F和引物R;所述引物F的序列如下:GAAATATAAGAGCCGCCACC(SEQ ID No.13);所述引物R的序列如下:CCTACTCAGGCTTTATTCAAAGAC(SEQ ID No.14);本发明对所述菌落PCR的具体步骤没有特殊限定,采用本领域常规的菌落PCR步骤即可。
在本发明中,提取测序正确的重组细胞的质粒;本发明对所述质粒的提取方法没有特殊限定,优选的采用质粒提取试剂盒进行。在本发明中,以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板。在本发明中,所述PCR扩增的体系以50μl计,优选的如下:
在本发明中,所述引物F和引物R的初始浓度优选为10μmol/L;所述DNA模板的浓度优选为1ng/μl。在本发明中,所述引物F的序列如下:GAAATATAAGAGCCGCCACC(SEQ IDNo.13);所述引物R的序列如下:CCTACTCAGGCTTTATTCAAAGAC(SEQ ID No.14)。在本发明中,所述PCR的扩增程序优选的如下:预变性98℃3分钟;变性98℃10秒,退火60℃5秒,延伸72℃2分钟,34个循环;最后延伸72℃,10分钟。
在本发明中,所述PCR扩增反应结束后,优选的对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测以确定反应是否成功;所述琼脂糖凝胶电泳检测的参数优选的如下:1.5%琼脂糖,5V/min,40分钟。在本发明中,琼脂糖凝胶电泳出现目的大小的条带认为是反应成功。
本发明在所述PCR扩增反应结束后,优选的将所述扩增产物进行浓缩和纯化。在本发明中,所述浓缩优选的采用Millipore 30Kd超滤管进行;所述纯化优选的采用FPLC进行;本发明在所述纯化后优选的采用NanoDrop检测纯化后模板的浓度,以及260/280、260/230的比值。优选260/280范围为1.8-2.1,260/230范围为大于2.0。
本发明在获得所述DNA模板后,构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述活性成分mRNA。在本发明中,所述RNA体外合成体系以1600μl计,包括以下组分:
在本发明中,所述RNA体外合成的条件优选的为36~38℃,8~12小时,更优选为37℃,10小时。在本发明中,所述RNA体外合成优选的在恒温反应器中进行;所述RNA体外合成体系优选的置于2ml RNase-free Tube管中,一次同时反应多管;所述RNA体外合成体系中的反应试剂按照上述顺序添加。
本发明在所述RNA体外合成结束后,优选的还包括去除DNA模板、回收mRNA和纯化mRNA的步骤。在本发明中,所述去除DNA模板优选的通过DNase I消化实现;所述消化优选的包括将DNase I与RNA体外合成反应后的溶液混合后进行;所述DNase I与RNA体外合成反应后的溶液的体积比优选为3:40;所述混合优选的通过上下颠倒所述RNase-free Tube管实现,所述上下颠倒的次数优选为8~12次,更优选为10次;本发明在所述混合后,优选的进行离心将溶液收集至RNase-free Tube管底部。在本发明中,所述离心的转速优选为800~1200rpm,更优选为1000rpm;所述离心的时间优选为8~12秒,更优选为10秒。所述消化的温度优选为37℃;所述消化的时间优选为1小时。本发明在所述消化结束后,优选的进行DNA片段残留检测。在本发明中,所述回收mRNA优选的通过将所述醋酸铵溶液沉淀实现;具体实施方法参见实施例记载;本发明在回收mRNA后,进行mRNA的质量检测;所述质量检测包括mRNA的浓度、mRNA的260/280、260/230的比值,纯mRNA的A260/A280的值为2.0~2.1,A260/A230范围为1.8~2.2。在本发明中,所述纯化mRNA通过FPLC纯化实现。本发明所述纯化mRNA后,优选的对纯化后的mRNA进行分装。
本发明提供了所述的骨关节炎药物制剂在制备治疗关节软骨损伤的药物中的应用。在本发明中,所述药物制剂的使用剂量,以每一关节计,优选为10~20μg,更优选为14~16μg,最优选为15μg。在本发明中,所述药物的使用方法为关节腔注射,本发明对所述关节腔注射的具体方法没有特殊限定,采用本领域常规的关节腔注射操作即可。本发明中,所述治疗关节软骨损伤的药物以所述骨关节炎药物制剂为活性成分或,还可以包括其他活性成分;所述药物的剂型优选为注射制剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供mRNA序列计算优化的过程。
本发明中对影响mRNA稳定性及翻译效率的几个重要影响因素进行了序列设计优化。其中,提高GC含量,降低最小自由能(Minimum Free Energy,MFE,单位为kcal/mol)能提升mRNA的稳定性,避免稀有密码子的使用,提高密码子适应指数(Codon AdaptationIndex,CAI)能增加mRNA翻译效率。如图1所示,RH1231A序列在GC含量、MFE和CAI发明均显著优于随机生成的序列。其中,GC含量平均提升约23.3%,MFE平均提升约88.9%,CAI平均提升约38.4%,本发明从20万条随机序列中筛选优化得到11条序列,即本文中SEQ ID No.1-SEQ ID No.11。
实施例2
本实施例提供所述mRNA的制备方法。
本实施例中mRNA的5’端连接帽子结构和5’UTR;mRNA的3’端连接3’UTR和修饰的多聚A尾。本实施例mRNA的结构示意图如图2所示。其中,制备的mRNA的编码区序列如SEQ IDNo.1-SEQ ID No.11所示;帽子结构为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG;5’UTR的序列为
AGGGAGATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCGCCACC(SEQ ID No.16);3’UTR序列为
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG(SEQ ID No.17);修饰的多聚A尾的序列为
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID No.15)。
制备mRNA的具体步骤如下。
重组质粒制备:
1)合成序列依次为5’UTR、SEQ ID No.1-SEQ ID No.11中的一段、3’UTR、修饰的多聚A尾的DNA片段(各实施例及附图中简写为Seq1-Seq11);
2)将目的片段和pRhe质粒分别进行BamHI和NheI双酶切,
3)使用T4连接酶进行体外连接;
4)转化大肠杆菌感受态,在amp固体培养基上培养12小时;
5)菌落PCR,选取含目的条带的菌落进行测序。
6)测序正确的菌落扩大培养,质粒提取。
步骤5)中菌落PCR步骤如下:
1、单菌落挑取
把LB培养基倒入排枪槽中,然后用排枪加400μl LB培养基到48孔深孔板,用镊子拿已灭菌的小白枪头挑取平板上的单菌落并放到48孔深孔板中,同时在48孔深孔板和相应的表单上做好记录。挑好的48孔深孔板用封口膜盖好并做好相应标记(日期、板号等),用针头在封口膜打孔,把它放在37℃摇床上摇1小时。
2、菌落PCR反应
配制好如下PCR反应体系,把配好的反应液加到96孔板中,用排枪加2μl菌液到其中,按照PCR程序进行扩增:
在本发明中,所述引物F和引物R的初始浓度优选为10μmol/L;所述DNA模板的浓度优选为1ng/μl。在本发明中,所述引物F的序列如下:GAAATATAAGAGCCGCCACC(SEQ IDNo.13);所述引物R的序列如下:CCTACTCAGGCTTTATTCAAAGAC(SEQ ID No.14)。在本发明中,所述PCR的扩增程序优选的如下:预变性98℃3分钟;变性98℃10秒,退火60℃5秒,延伸72℃2分钟,34个循环;最后延伸72℃,10分钟。
3、琼脂糖凝胶电泳
先配制1%琼脂糖凝胶(称取1g琼脂糖加入100ml的TAE溶液中),在完成PCR反应的96孔板中加入0.5μl溴酚蓝,震荡混匀,然后点样,电泳好的琼脂糖凝胶拍照、保存。
4、判断阳性克隆并测序
根据琼脂糖凝胶电泳条带图来判断阳性克隆,把阳性克隆的菌液进行扩大培养,进行测序验证,选取具备完全正确序列的克隆进行下一步操作。
步骤6)中所述的质粒提取的步骤参考omega D6915 Endo-free Plasmid MidiKit说明书。
得到的质粒按如下反应体系进行DNA模板的线性化:
标准反应体系:
反应结束后,将反应液合并于1.5ml Tube管中。取10μl进行DNA琼脂糖凝胶电泳(1.5%琼脂糖,5V/min,40分钟)。根据电泳目的条带的大小对反应成功与否进行确认。合格标准:电泳检测出现单一的条带,且大小正确。
测定结果:条带大小单一,大小符合要求。
DNA模板超滤
利用Millipore 30Kd超滤管浓缩上述获得的DNA模板。
DNA模板FPLC纯化
将上述超滤得到的DNA,加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液(苯酚/氯仿/异戊醇=25/24/1),充分震荡后,12000g离心15分钟。
去掉沉淀,转移上清至新的离心管中,加入上清体积的1/10 3M NaAc(pH 5.2),混匀,然后加入2倍体积的无水乙醇,混匀,至于-20℃静至30分钟。
4℃,12000g离心10分钟,弃上清。
用70%乙醇洗涤沉淀,12000g离心5分钟,取上清,于超净台晾干5分钟。
用适当的RNase-free水溶解纯化后的DNA模板。
用NanoDrop检测纯化后模板的浓度,以及260/280、260/230的比值。取样进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测(1.5%琼脂糖,5V/min,40分钟)。
合格标准:260/280介于1.8至2.1之间,260/230在1.6至2.2之间。
测定结果:浓度为500ng/μl,260/280=1.93,260/230=1.75。
FPLC纯化后模板超滤
Millipore 30Kd超滤管浓缩FPLC纯化后的DNA模板,用RNase-free水洗脱溶解。用NanoDrop检测超滤后模板的浓度,以及260/280、260/230的比值。最终用RNase-free水稀释至150ng/μl。
测定结果:浓度为150ng/μl,260/280=1.96,260/230=1.87。
mRNA的体外合成
在恒温反应器中,进行mRNA的体外合成。
按照如下合成体系进行(反应试剂按照从上至下添加):
反应体积,1600μl(置于2ml RNase-free Tube管中,为单个管的反应体积,一次同时反应多管)。
所述RNA体外合成体系以1600μl计,包括以下组分:
所述RNA体外合成的条件为37℃,10小时。
DNase I消化去除DNA模板
向mRNA体外合成后的每个Tube管中各加入120μl DNase I。
上下颠倒10次混匀,1000rpm离心10秒。
重新置于恒温反应器中,37℃,1小时。
反应结束后,将反应液合并到RNase-free 50ml Tube管中,检测DNA片段的残留。
DNA残留检测的方法:
采用定量实时PCR检测方法,具体操作步骤如下:
(1)供试品溶液配制:取样品适量,用无酶水稀释10倍,混匀,混得。
(2)标准品溶液配制:用无酶水将标定过的质粒标准品进行稀释至1E+08copies/μl,然后再进行梯度稀释。具体操作如下:
稀释管标识 | 稀释方法 | 浓度 |
ST0 | 20μl质粒标准品+148.2μl无酶水 | 1E+08copies/μl |
ST1 | 10μl ST+90μl无酶水 | 1E+07copies/μl |
ST2 | 10μlST0+90μl无酶水 | 1E+06copies/μl |
ST3 | 10μlST1+90μl无酶水 | 1E+05copies/μl |
ST4 | 10μlST2+90μl无酶水 | 1E+04copies/μl |
ST5 | 10μlST3+90μl无酶水 | 1E+03copies/μl |
ST6 | 10μlST4+90μl无酶水 | 1E+02copies/μl |
ERC的制备:取20μl供试品溶液,加入20μl ST4,混匀,即得。
MIX反应液配制:以SuperFast Probe Mixtuure:W2306F:W2521R:W2430P:H2O=10:0.6:0.6:0.4:7.4的比例进行配制,混匀,即得。
PCR管加样:每孔加入19μl qPCR MIX、再依次加入1μl标准曲线(ST1/ST2/ST3/ST4/ST5/ST6)、ERC、NTC、供试品溶液,混匀。每个样各做三个平行。
PCR程序设定如下:
计算公式:以标准品的Ct值对其浓度的对数值做图,线性回归分析,将样品Ct值代入方程,计算“稀释10倍后的浓度对数的检测值”,计算“DNA残留”。
DNA残留浓度(copies/μl)=检测值×稀释倍数
结果判定:三个平行孔间的Ct差值应小于1.0;Ct值大于35的样本除外。
线性相关系数R2>0.99。
无模板对照NTC应不得检出或大于标准曲线最低浓度2个Ct值。
标准规定:应不高于10ng/剂量。
mRNA沉淀回收
向上一步骤中的每个50ml Tube管中,加入等体积的醋酸铵溶液。
上下颠倒10次混匀。
置于-20℃2小时,沉淀。
17000g,4℃离心,30分钟。
去掉上清,用70%乙醇洗涤沉淀。
17000g,4℃离心,10分钟。
去掉70%乙醇,于超净台中蒸干,每管加入RNase-free水20ml。
静置10分钟后,用枪头轻吹混匀。
用NanoDrop检测回收后的mRNA浓度为5.06μg/μl,A260/A280为1.81、A260/A230为1.95。
取1μl,稀释10倍,进行RNA ScreenTape assay以及琼脂糖凝胶电泳检测其片段完整性。
检测结果为,条带符合大小,片段完整。
LiCl沉淀纯化mRNA
将上一步骤中回收的mRNA按照其1.5倍体积加入Rnase-free水,混匀。
加入原mRNA 1.5倍体积-20预冷的LiCl溶液,混匀。
然后于-20℃静至2小时。
16000g离心20分钟。
弃上清,用70%乙醇洗涤沉淀,16000g离心15分钟。
取上清,于超净台晾干5分钟。
用适当的RNase-free水溶解纯化后的mRNA。
纯化后的mRNA浓度为2μg/μl,A260/A280为1.95、A260/A230为1.84。
mRNA分装
将上一步骤中纯化后的mRNA分装至西林瓶。
本实施例制备的mRNA,其编码区序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.11所示,5’端连接帽子结构(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG)和5’UTR(SEQ ID No.16);3’端连接3’UTR(SEQID No.17)和修饰的多聚A尾(SEQ ID No.15),在各实施例和附图中简写为Seq1-Seq11。
实施例3
本实施例提供编码软骨生长因子的mRNA表达水平检测的方法。
实验方法:体外效力-Western Blot检测
293T细胞的接种
1)细胞准备:提前1-3天准备检测用细胞。取购自中科院细胞库的293T细胞,传代于细胞培养瓶内,保证使用时细胞处于对数生长期。
2)细胞消化计数:取生长状态良好的293T细胞,去掉培养基,以10ml PBS清洗细胞后,加入体积百分含量0.25%胰酶(T75瓶加1ml 0.25%胰酶,T175瓶加3ml0.25%胰酶)消化5分钟,然后加入含10%FBS的DMEM培养基(T75瓶用9ml培养基,T175瓶用17ml培养基)中和胰酶,吹打细胞并转至50ml离心管,反复吹打混匀,然后取0.3~0.5ml的细胞悬液,计数。
3)细胞稀释:取1ml细胞悬液,用含10%FBS的DMEM培养基稀释到5×105个/ml,吹打混匀。
4)细胞接种:取2ml细胞悬液加到6孔板内。每个mRNA样品需要准备2孔平行细胞,对照组样品(GFP-mRNA)需要准备1孔细胞,空白对照1孔。将6孔板放入(37±1)℃、(5±0.5)%CO2培养箱培养过夜。
细胞转染
接种完细胞后约24小时,观察6孔板内的细胞状态,汇合度在90%左右。在生物安全柜内,配制所需体积的90%DMEM+10%FBS培养基。转染前30分钟弃掉孔板的培养基,每孔加入1ml新鲜培养基(90%DMEM+10%FBS)。
a)配制转染体系:取200μl opti-MEM,加入10μg mRNA样品(Seq1-Seq11)或阴性对照GFP-mRNA,用枪头轻轻吹打混匀,再加入60μl PEI(浓度1mg/ml),立即置于漩涡振荡器上振荡10次,每次1秒,充分混匀,静置10分钟。
b)将配制好的转染体系,直接均匀滴加进入培养的细胞中,再前后左右摇匀,使得转染体系均匀分布于细胞上。
c)换液
转染后6小时换液,吸掉旧的培养基,每孔换为2ml新鲜培养基(90%DMEM+10%FBS)。
d)收获
转染后30小时收获。吸掉旧的培养基,用1ml PBS清洗一遍。
吸掉PBS,继续用1ml PBS将细胞吹打下来,收集于1.5ml离心管中,300g离心5分钟。将离心后的上清尽量吸去干净,沉淀的细胞用于Western blot检测。
蛋白提取
1.配制细胞裂解液:0.1%Triton X-100(sigma,P/N T9284),150mM NaCl(sigma,P/N S5886),50mM HEPES pH8(sigma,P/N V900477),EDTA-free protease inhibitorcocktail(sigma,P/N 11873580001);
2.在之前收集的细胞沉淀中加入100μL 4℃预冷的细胞裂解液,重悬细胞沉淀,4℃冰浴30分钟;
3.将细胞样品置于冰盒上进行超声破碎(小美超声仪器(昆山)有限公司,XM-20MINI)1分钟:功率10W,循环模式:1秒on/1秒off;
4.超声后置于离心机中,4℃,20000rcf,离心10分钟。收集上清液。
5.BCA法测上清液蛋白浓度,BCA试剂盒(Thermo Scientific,P/N 23225),操作步骤参见试剂盒说明书,具体如下:
A.用超纯水稀释BSA标准品,配制2000、1000、500、250、125、62.5、31.25μg/ml的标准品系列,另外加一个超纯水作为空白样品,各准备100μL。
B.取10μl上清液,加入90μl超纯水混匀。
C.配制1X工作试剂:取50份体积试剂A,加入1份体积试剂B,混匀。
D.将样品加到96孔板,每孔25μL,做3个平行。
E.每孔加入200μL工作试剂,震荡30S混匀。
F.将96孔板放置37℃孵育30分钟。
G.孵育结束后,等待2分钟冷却到室温。用酶标仪对562nm读板。
H.吸光值平均扣除空白对照。标准品扣除空白吸光值对浓度作图,代入样品吸光值计算。
SDS-PAGE
1.待测蛋白样品制备:蛋白定量后,取50μg蛋白,用裂解液定容至20μL,加入5μL 5×Loading buffer(购自生工生物工程(上海)股份有限公司,P/N C508320),混匀后共25μL,使用95℃孵育5分钟,结束后室温放置;
按照表1的配方配制6%SDS-PAGE分离胶和12%SDS-PAGE分离胶(1mm厚度)
表1 6%SDS-PAGE分离胶和12%SDS-PAGE分离胶配方
6%分离胶对应4%浓缩胶,12%分离胶对应5%浓缩胶,按照表2的配方配制浓缩胶。
表2 4%SDS-PAGE浓缩胶和5%SDS-PAGE浓缩胶配方
2.配制电泳缓冲液:取100ml 10×蛋白电泳缓冲液(生工,P/N C520001),用超纯水稀释至1000ml;
3.将凝胶夹紧到电泳槽中(Bio-rad,P/N 1658004),灌入电泳缓冲液;
4.将25μL待测蛋白样品和5μL蛋白分子量Marker(thermo,P/N 26619)分别加到样品孔中;
5.使用80V电泳30分钟;
6.然后用140V电泳,对于6%分离胶,电泳至70kDa分子量Marker跑到底部但未跑出去为止;对于12%分离胶,电泳至25kDa分子量Marker跑到底部但未跑出去为止;
Western blot
7.使用半干转膜仪(Pyxis,型号SPJ-1000A)进行转膜,转膜前准备配套耗材(Pyxis,P/N SPJ-T20S),内含Top buffer,Down Buffer,Balance buffer和滤纸,另需自行裁剪与滤纸大小相同的PVDF膜(millipore,P/N IPVH00010);
8.将滤纸分别放入两个方形培养皿,标记好Top和Down;
9.将20ml Top、Down buffer倒入对应的方形培养皿中,浸泡滤纸5分钟至完全浸润;
10.将10ml Balance倒入方形培养皿,放入PVDF膜,孵育5分钟;
11.用撬板把凝胶玻璃板撬开,切去浓缩胶,小心取出凝胶,防止撕裂;
12.凝胶泡入超纯水的方形培养皿;
13.取出转膜仪的转印槽,去除盖子,将Down滤纸摆好在最底层;
14.将PVDF膜小心地覆盖Down滤纸,确认无气泡;
15.将凝胶覆盖在PVDF膜上,确认无气泡;
16.将Top滤纸覆盖在凝胶上,用滚轮滚动排气泡;
17.盖好转印槽盖子,放入转膜仪;
18.对于6%分离胶,使用11分钟进行转膜,对于12%分离胶,使用14分钟进行转膜;
19.转膜完成后,用镊子小心取出膜,在此后,膜应避免干燥;
20.用超纯水洗5分钟;
21.配制TBS:取100ml 10×TBS(生工,P/N C520002),用水稀释至1000ml;
22.配制TBST:取1000ml TBS加入1ml Tween-20(sigma,P/N P1379);
23.配制5%脱脂牛奶:取2.5g脱脂奶粉(伊利脱脂奶粉)溶解于50ml TBST;
24.去除超纯水,用TBS洗5分钟;
25.去除TBS,用TBST洗5分钟;
26.用5%脱脂牛奶在室温封闭1小时
27.6%凝胶转的膜,用于检测S蛋白,12%凝胶转的膜,用于检测GAPDH蛋白;
28.目的蛋白一抗孵育:取3μl FGF18一抗稀释到3ml 5%脱脂牛奶中(稀释比1:1000),置于4℃摇床过夜孵育;
29.GAPDH蛋白一抗孵育:取0.25μL GAPDH antibody(proteintech,P/N60004-1-Ig)稀释到5ml 5%脱脂牛奶中(稀释比1:20000),置于4℃过夜孵育;
30.一抗孵育结束后,去除一抗溶液,用TBST洗三次,每次5分钟;
31.二抗孵育:取1μL HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(proteintech,P/N SA00001-1)稀释到5ml 5%脱脂牛奶中(稀释比1:5000),常温孵育1小时;
32.二抗孵育结束后,去除二抗溶液,用TBST洗三次,每次5分钟;
33.最后将膜浸泡在TBS中;
34.准备好显影液(thermo,P/N 34580),把成像仪(analytikjena,型号UVPChemstudio touch)的相机和软件打开,进行预冷;
35.预冷完成后,取500μL显影A液和500μL显影B液混合,把膜放在托盘中,向表面倒入500μL显影混合液,反应1分钟;
36.在成像仪中选择ECL程序进行成像,曝光时间根据情况而定;
37.保存图片;
结果判定
结果如图4所示,供试品应呈现明显色带,GAPDH为内参蛋白,1-11分别代表Seq1-Seq11,其中Seq1、Seq2、Seq3、Seq4、Seq5的蛋白表达量相对较高,经过筛选,最终决定选择Seq1-Seq5作为后续的试验样品进行动物实验。
实施例4
本实施例提供检测编码软骨生长因子的mRNA的免疫原性的方法。
根据本发明的编码软骨生长因子的mRNA,检测其免疫原性,评价标准为将所述mRNA对小鼠进行肌肉注射后血清中TNFα水平。
将6-8周龄的balb/c小鼠(购自北京维通利华)在SPF条件下,并且保持12小时光亮和12小时黑暗循环下的通气笼中饲养,将Seq1-Seq11所示的mRNA对balb/c小鼠进行肌肉注射,每只小鼠的注射剂量为100μg,24小时后对小鼠进行眼眶取血,分离血清。用小鼠TNFa试剂盒(RayBio)进行酶联免疫吸附分析(ELISA)。实验结果如图5所示。
小鼠注射本发明提供的软骨生长因子mRNA制剂后,TNFα表达水平低于注射FGF18蛋白的处理及对照组(CN113425855A优效组,即Seq 2-1组),可见本发明提供的mRNA剂型中Seq1、Seq5免疫原性相比于蛋白对照组及对照组更低,安全性更好,将Seq1和Seq5进行后续的动物实验。
实施例5
本实施例研究编码软骨生长因子的mRNA修复大鼠关节软骨损伤的状况。
将6~8周龄的SD大鼠(购自北京维通利华)在SPF条件下,并且保持12小时光亮和12小时黑暗循环下的通气笼中饲养,膝关节注射单点乙酸(MIA)诱导关节软骨损伤(详细步骤参见参考文献Takahashi I,Matsuzaki T,Kuroki H,et al.Induction ofosteoarthritis by injecting monosodium iodoacetate into the patellofemoraljoint of an experimental rat model[J].PLoS One,2018,13(4):e0196625.),待造模成功后(通过大鼠膝关节组织切片番红固绿染色和HE染色,观察到明显的软骨组织损伤;认为是造模成功),将TNFα表达水平低的Seq1、Seq5所示的mRNA以及对照组(CN113425855A优效组,即Seq 2-1组)mRNA对大鼠进行关节腔注射,每只大鼠关节的注射剂量为50μl(15μg),同时设置蛋白对照组,每只大鼠关节注射10μg相应蛋白药物(FGF18蛋白),注射频率为每周一次,持续4周,随后对大鼠关节处进行切片和染色,观察软骨修复状况。
OARSI评分标准如下:
0正常
1表面轻微纤维化,但没有软骨损失
2关节软骨表面出现轻微裂痕;
3关节软骨表面裂痕磨损<25%;
4关节软骨表面裂痕磨损25%~50%;
5关节软骨表面裂痕磨损50%~75%;
6关节软骨表面裂痕磨损>75%。
结果如图6和图7所示,相比于蛋白药物和对照组(CN113425855A优效组,即Seq 2-1组)对骨关节软骨治疗效果,本发明的mRNA药物对骨关节炎有更加明显的治疗效果,其中Seq1、Seq5均有良好的软骨保护效果,综合比较Seq1的保护效果相对更加优秀。
实施例6
本实施例提供采用步态行为系统验证编码软骨生长因子的mRNA对造模大鼠关节的影响的方法。
将6~8周龄的Lewis大鼠(购自北京维通利华)在SPF条件下,并且保持12小时光亮和12小时黑暗循环下的通气笼中饲养,采用手术切断内侧副韧带+内侧半月板建立大鼠骨关节炎模型,具体操作如下:将模型组大鼠采用异氟烷吸入(1%~4%诱导麻醉,0.25%~2%维持麻醉)麻醉后,对大鼠关节手术部位备皮,采用碘酒消毒后,经右后肢膝关节内侧行切口,暴露膝关节腔内侧副韧带和内侧半月板,并行内侧副韧带切断和内侧半月板横断术,用0.9%氯化钠注射液溶液冲洗干净后逐层缝合关节腔。剩余12只大鼠经膝关节内侧行切口,显露内侧副韧带,但不进行切除,逐层缝合切口,作为假手术组。术后给予肌肉注射青霉素20万U,每天2次,连续3天。
手术当天计为D0,术后第7天(D7)开始给药,各给药组每次按50uL/只经右后肢膝关节注射给予相应浓度的RNA溶液,给药组包括蛋白对照组、CN113425855A中优效组Seq 2-1组、本发明Seq1组和Seq5组;正常对照组和模型对照组分别注射给予等体积的0.9%氯化钠注射液,连续给药4次,每次给药间隔1周。每周采集步态数据,分析比较大鼠后足支撑力的变化情况。
结果如图8所示,mRNA药物Seq1组和Seq5组对骨关节炎有明显的治疗效果,并且优于蛋白阳性对照组和CN113425855A筛选的RNA序列。
实施例7
本实施例提供组织病理学检查验证编码软骨生长因子的mRNA对造模大鼠关节的影响。
将6~8周龄的Lewis大鼠(购自北京维通利华)在SPF条件下,并且保持12小时光亮和12小时黑暗循环下的通气笼中饲养,采用手术切断内侧副韧带+内侧半月板建立大鼠骨关节炎模型,具体操作如下:将模型组大鼠采用异氟烷吸入(1%~4%诱导麻醉,0.25%~2%维持麻醉)麻醉后,对大鼠关节手术部位备皮,采用碘酒消毒后,经右后肢膝关节内侧行切口,暴露膝关节腔内侧副韧带和内侧半月板,并行内侧副韧带切断和内侧半月板横断术,用0.9%氯化钠注射液溶液冲洗干净后逐层缝合关节腔。剩余12只大鼠经膝关节内侧行切口,显露内侧副韧带,但不进行切除,逐层缝合切口,作为假手术组。术后给予肌肉注射青霉素20万U,每天2次,连续3天。
手术当天计为D0,术后第7天(D7)开始给药,各给药组每次按50uL/只经右后肢膝关节注射给予相应浓度的RNA溶液,给药组包括蛋白对照组、CN113425855A中优效组Seq 2-1和本发明的Seq1组和Seq5组;正常对照组和模型对照组分别注射给予等体积的0.9%氯化钠注射液,连续给药4次,每次给药间隔1周。给药组大鼠自末次给药后第7天,经异氟烷吸入麻醉后,腹主动脉放血安乐死,采集数字DR数据,分观察各组大鼠软骨组织和滑膜组织形态学变化。
结果如图9所示,Seq1组和Seq5组的mRNA药物对骨关节炎有明显的治疗效果,并且优于蛋白阳性对照组和前期筛选的RNA序列,其中Seq1组步态分析结果最好,证明其治疗效果更加有效。
实施例8
本实施例检测本发明mRNA表达水平和半衰期。
注射本发明的编码软骨生长因子的mRNA,检测其表达产物的表达水平和半衰期,评价标准为将等量mRNA药物关节腔注射大鼠后检测关节液中的FGF18蛋白浓度。
将12周龄的SD大鼠(购自北京维通利华)在SPF条件下,并且保持12小时光亮和12小时黑暗循环下的通气笼中饲养,将Seq1和Seq5所示的mRNA、对照组(CN113425855A优效组,即Seq 2-1组)mRNA以及FGF18蛋白对大鼠进行膝关节腔注射,每只大鼠的注射剂量为250μg,蛋白用量为500μg,24小时后打开大鼠关节腔,收集关节液。通过酶联免疫吸附分析(ELISA)检测FGF18蛋白含量。实验结果如图10所示。
大鼠关节腔注射本发明提供的软骨生长因子mRNA制剂后,蛋白表达水平长时间高于注射FGF18蛋白,可见本发明提供的mRNA剂型表达量更高,表达时间也更长,血液中蛋白含量的半衰期更长。
实施例9
本实施例提供采用斑点印迹法(dot blot)检测RNA制备工艺中双链RNA残留的实验。
将供试品溶液滴加到固相载体(例如尼龙膜)上,固相载体带有正电荷,可以吸附带有负电荷的RNA。以固相载体上的双链RNA作为抗原,与对应的双链RNA抗体(称为第一抗体)起免疫反应,使用特定的第二抗体去识别第一抗体,第二抗体带有辣根过氧化物酶(HRP),能够在过氧化氢存在下催化鲁米诺试剂使其发光,这个过程成为显色反应,经过成像系统拍摄即可捕捉底物的信号,形成斑点印迹图,斑点的灰度值高低代表含量的高低,对比印迹图中的供试品与双链RNA标准品的灰度值高低,可以定性地检测供试品的双链RNA残留含量,结果见图11,本发明中使用的更新的工艺,其中RNA双链残留含量更低,产品质量更优异。检验步骤:
1)取供试品(CN113425855A中样品、本发明中样品)适量,用无酶水稀释至含500ng/μL mRNA,即得供试品溶液;
2)在超净工作台中,用洁净的剪刀剪出合适大小的尼龙膜;
3)取4μL稀释后的供试品,分别滴在尼龙膜上,做2个重复,
4)所有样品都滴加完毕后,在尼龙膜右下角空白处剪出倒角,用于识别正反面;将该尼龙膜风干30分钟;
5)佩戴干净无酶的手套,将膜卷入50mL离心管,并确保正面朝向管内而非管壁,加入10ml PBST,缓慢上下颠倒润洗10次,倒掉PBST;
6)加入10mL 5%脱脂牛奶,置于滚轴混匀仪,设置20rpm,室温孵育1小时;
7)倒去脱脂牛奶,重新加入3mL脱脂牛奶和3μL J2抗体,混匀,置于滚轴混匀仪,设置20rpm,4℃孵育过夜;
8)倒去离心管中的抗体溶液,加入20mL PBST,置于滚轴混匀仪,洗涤5分钟倒去PBST,重复三次;
9)重新加入5mL脱脂牛奶和1μL二抗,混匀,置于滚轴混匀仪,设置20rpm,室温孵育1小时;
10)去除离心管中的抗体溶液,加入20mL PBST,置于滚轴混匀仪,洗涤5分钟,重复三次;
11)将显影剂AB液按1:1混合,共1mL,将尼龙膜铺平在成像仪样品盘中央,排除气泡,将AB混合液快速均匀地滴加在尼龙膜表面;
12)使用智能成像仪进行化学发光的曝光保存;
13)用核酸染料按1:5000稀释于TAE buffer,将膜泡入染料1分钟,取出,用智能成像仪分别在化学发光模式和核酸成像模式下分析;保存图片。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (13)
1.一种mRNA,可编码序列如SEQ ID No.12的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的mRNA,其中,所述mRNA的编码区序列如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.11任一序列所示。
3.根据权利要求2所述的mRNA,其中,所述mRNA的5’端连接帽子结构和5’UTR;所述mRNA的3’端连接3’UTR和多聚A尾。
4.根据权利要求2所述的mRNA,其中,所述多聚A尾包括长度为90-130的多个A,多个A为连续的或中间插入1-12nt且不全部为A的连接子;
优选地,所述多聚A尾的序列为AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ IDNo.15)。
5.根据权利要求3或4所述的mRNA,其中,所述帽子结构为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)、G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')G、3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G或m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
6.根据权利要求3-5中任意一项所述的mRNA,其中,所述5’UTR序列为AGGGAGATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCGCCACC(SEQ ID No.16)。
7.根据权利要求3-6中任意一项所述的mRNA,其中,所述3’UTR序列为GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG(SEQ ID No.17)。
8.一种DNA模板,其可以转录得到权利要求1-7任一项所述的mRNA。
9.权利要求1-7任一项所述的mRNA的制备方法,其包括:
将能转录权利要求1-7任一项所述mRNA的DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒;
将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞,体外转录合成获得所述mRNA。
10.权利要求1-7任一项所述的mRNA在制备用于治疗关节软骨损伤和/或骨关节炎的药物中的应用。
11.一种用于治疗关节软骨损伤和/或骨关节炎的药物制剂,其包含活性成分mRNA,所述mRNA包括权利要求1-7任一项所述的mRNA中的一种或两种以上。
12.根据权利要求11所述的药物制剂,其中,活性成分mRNA包括编码区序列如SEQ IDNo.1所示的mRNA和/或编码区序列如SEQ ID No.5所示的mRNA。
13.根据权利要求11或12所述的药物制剂,其为注射制剂;
优选地,所述活性成分mRNA在药物制剂中的浓度为200~10000μg/ml;
优选地,所述药物制剂的使用剂量,以每一关节计,为10~20μg,优选为14~16μg,最优选为15μg。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211085631.9A CN117721115A (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用 |
PCT/CN2023/117283 WO2024051748A1 (zh) | 2022-09-06 | 2023-09-06 | 用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211085631.9A CN117721115A (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117721115A true CN117721115A (zh) | 2024-03-19 |
Family
ID=90192043
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211085631.9A Pending CN117721115A (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117721115A (zh) |
WO (1) | WO2024051748A1 (zh) |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2392883T3 (es) * | 2006-08-25 | 2012-12-14 | Ares Trading S.A. | Tratamiento de trastornos de cartílagos con FGF-18 |
JP5815206B2 (ja) * | 2006-08-25 | 2015-11-17 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | Fgf−18を用いた軟骨障害の治療 |
EP3684791A1 (en) * | 2017-09-21 | 2020-07-29 | Merck Patent GmbH | Fusion protein comprising an fgf-18 moiety |
CN113425855B (zh) * | 2021-06-28 | 2023-11-07 | 深圳瑞吉生物科技有限公司 | 一种mRNA剂型的骨关节炎药物制剂及其制备方法和应用 |
CN113244413B (zh) * | 2021-06-28 | 2021-10-26 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 一种mRNA剂型的骨关节炎药物制剂及其制备方法和应用 |
CN113846064A (zh) * | 2021-09-18 | 2021-12-28 | 拜澳泰克(沈阳)生物医学集团有限公司 | 一种fgf18基因修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-09-06 CN CN202211085631.9A patent/CN117721115A/zh active Pending
-
2023
- 2023-09-06 WO PCT/CN2023/117283 patent/WO2024051748A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2024051748A1 (zh) | 2024-03-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107815441B (zh) | 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用 | |
CN113244413B (zh) | 一种mRNA剂型的骨关节炎药物制剂及其制备方法和应用 | |
KR102336158B1 (ko) | 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 백신 조성물 | |
CN112280753A (zh) | 一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用 | |
CN113425855B (zh) | 一种mRNA剂型的骨关节炎药物制剂及其制备方法和应用 | |
CN114940999B (zh) | 一种基于1083骨架的疫苗制备方法 | |
CN111793721B (zh) | eEF1D蛋白在制备预防或治疗口蹄疫病毒感染药物中的应用 | |
CN117721115A (zh) | 用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用 | |
WO2022120936A1 (zh) | 一种修饰的核酸及其应用 | |
CN115094164A (zh) | 不同基因缺失型ASFV的多重qPCR试剂盒及检测方法 | |
CN114107176A (zh) | 一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用 | |
CN113244412B (zh) | 一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法 | |
CN113564132A (zh) | 柯萨奇病毒a16型毒株及其应用 | |
CN113621598A (zh) | 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用 | |
CN110904056A (zh) | 一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用 | |
CN116286978B (zh) | 一种重组载体、重组菌株或细胞系、重组钙结合蛋白及其应用 | |
CN116036002A (zh) | 用于关节软骨缺损修复的mRNA剂型生物制剂及其制备方法和应用 | |
CN114908065B (zh) | 猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用 | |
CN116286988A (zh) | 一种稳定表达冠状病毒3cl蛋白酶的腺相关病毒体系、动物模型及构建方法和应用 | |
CN113755493A (zh) | 一种抗骨关节炎的重组miR-140及其生产方法和应用 | |
CN107475452B (zh) | 一种检测鸭瘟病毒icp4基因的引物以及rt-pcr和荧光定量pcr检测方法 | |
WO2023154105A1 (en) | Attenuated sars-cov-2 | |
CN117327735A (zh) | 传染性支气管炎和新城疫重组腺病毒表达载体及制备方法和应用 | |
KR100464357B1 (ko) | 한국에서 분리된 신규한 개 홍역 바이러스 및 이를이용하는 개 홍역 예방 재조합 백신 | |
CN116479046A (zh) | Dock8基因在调控htlv-1病毒感染中的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |