CN116036002A - 用于关节软骨缺损修复的mRNA剂型生物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于关节软骨缺损修复的生物制剂、制备方法及其应用。制剂包括活性成分mRNA，如SEQ ID NO：1所示或者相似度达90％以上的序列；方法包括合成DNA片段，将DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒，将重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从重组细胞中提取质粒，PCR扩增获得DNA模板，利用DNA模板构建RNA体外合成体系并进行RNA体外合成获得活性成分mRNA；在用于软骨修复的制药中的应用。本发明使用体外转录法合成化学修饰的FoxO1mRNA基因，将制剂注射于关节软骨缺损处，能促进内源性间充质干细胞成软骨分化；其生物活性优良，在组织工程中具有应用价值。

Description

用于关节软骨缺损修复的mRNA剂型生物制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于软骨缺损修复治疗技术领域的生物制剂、制备方法和应用，尤其涉及一种mRNA剂型的关节软骨缺损修复制剂及其制备方法和应用。

背景技术

软骨缺损是骨科常见疾病，尤其是运动员，且软骨损伤通常合并了软骨下骨损伤。患者常有关节肿胀、疼痛，活动受限，影响日常生活与工作，给社会造成较大经济负担。软骨内无血管、无神经、无淋巴，损伤后自行修复能力差，治疗困难，一直是骨科的难题。而目前临床治疗手段如微骨折、骨软骨柱移植、软骨细胞移植等没有涉及骨软骨损伤的联合治疗，新生的软骨组织常常为纤维软骨而非透明软骨。纤维软骨力学性能差，无法承受膝关节日常活动中产生的巨大应力，易退变与磨损，因此无法保证远期疗效。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明是提供了一种用于关节软骨缺损修复的mRNA剂型生物制剂及其制备方法和应用，所述mRNA序列为SEQ IDNO：1，所述生物制剂具有刺激骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化标志物表达，增强细胞外基质合成能力，体内实验证实其增强了软骨基质修复，从而达到治疗软骨缺损的目的。

本发明构建一种化学修饰mRNA剂型的生物制剂，为组织工程修复提供了新的思路，通过化学修饰的mRNA增强了稳定性，降低免疫原性并增加表达效果。

为了构建组织工程支架，本发明采用的技术方案：

一、一种用于关节软骨缺损修复的mRNA剂型生物制剂：

包括活性成分mRNA和阳离子脂质体，所述活性成分mRNA为SEQ ID NO：1或者为与SEQ ID NO：1所示序列相似度达90％以上的序列。

所述生物制剂为液体制剂，为软骨缺损修复药物制剂。

所述mRNA的5’端经帽子结构和5’UTR连接；所述mRNA的3’端经3’UTR和多聚A尾连接。

所述FoxO1的mRNA中的尿嘧啶替换为Pseudo UTP。

所述软骨缺损修复制剂为注射制剂。

5、根据权利要求4所述的软骨缺损修复制剂，其特征在于，

所述活性成分mRNA加入溶剂PBS中配置成溶液，活性成分mRNA在溶液中的浓度为0.5-20μg/μl。

二、一种软骨缺损修复制剂的制备方法，方法包括以下步骤：

1)合成转录所述软骨缺损修复制剂中的活性成分mRNA对应的DNA片段，将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒；

2)将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，对重组细胞进行扩繁，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板；

3)利用DNA模板构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系并进行RNA体外合成获得所述活性成分mRNA。

所述RNA体外合成体系以1600μl计，包括以下组分：

RNase-free水440μl；

7.5mM的ATP 160μl；

7.5mM的UTP或者Pseudo UTP 160μl；

7.5mM的CTP 160μl；

7.5mM的GTP 160μl；

7.5mM的M7G(2’OMeA)pG 160μl；

150ng/μl的DNA模板40μl；

10×Buffer 160μl；

Enzyme Mix 160μl。

所述RNA体外合成的条件为36～38℃，8～12h。

三、一种mRNA剂型生物制剂和应用：

所述mRNA剂型生物制剂由所述制备方法制备而成。

所述的mRNA剂型生物制剂在用于软骨基质修复、软骨缺损修复的制药中的应用。

所述制剂中还包括递送材料；

优选地，所述递送材料包括但不限于PEI、PAMAM、多聚赖氨酸、壳聚糖、脂质体、脂质纳米颗粒；

优选地，所述递送材料是PEI。

本发明的有益效果：

本发明使用体外转录法合成化学修饰的FoxO1 mRNA基因，将制剂注射于关节软骨缺损处，能促进内源性间充质干细胞成软骨分化；其生物活性优良，在组织工程中具有应用价值。

本发明提供的mRNA剂型的软骨缺损修复制剂，包括具有刺激软骨再生的蛋白转录因子mRNA，将所述软骨缺损修复制剂导入靶细胞后能够促进BMSCs成软骨分化；所述软骨缺损修复制剂的制备简单、快速、表达量高、免疫原性低，能够快速高效促进软骨细胞外基质合成，从而达到治疗软骨缺损的目的。

根据实施例的记载，本发明提供的具有刺激软骨再生的转录因子mRNA能够在细胞内特异性的高水平表达；本发明提供的mRNA进行关节腔注射后，大鼠血清中TNFα未明显升高，说明本发明提供的mRNA剂型的软骨缺损修复制剂免疫原性更低，安全性好。

附图说明

图1为pEGFP-N1质粒的质粒图谱；

图2为PCR检测不同处理方法下转录因子FoxO1在细胞内的基因表达情况；

图3为PCR检测不同处理方法下Col2a1在细胞内的基因表达情况；

图4为大鼠注射本发明提供的mRNA剂型的软骨缺损制剂的TNFα水平。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对做本发明进一步说明。以下具体实施例用来解释说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。所有实施例使用试剂不低于分析纯标准。

本发明提供了一种mRNA剂型的软骨缺损修复制剂，包括活性成分mRNA，所述mRNA如SEQ ID No.1所示(以下简称Seq 1)：

atggccgaagcgcctcaggtggtggagaccgacccggacttcgagccgctgcctcggcagcgctcctgcacctggccgctgcccaggccggagtttaaccagtccaactcgaccacctccagcccggcgccgtcgggcagcacggccgccaaccccgacgccacggcgagcctggcctcggcgtccgctgtcagcaccgactttatgagcaacctgagcctgctagaagagagcgaggacttcgcgcgggcaccgggttgcgtggccgtggcggccgcagctgccgccagtaggggcctgtgcggggacttccagggcccggaggcgggctgcgtgcactcggcgccgccgcagcccccaccgaccgggccgctgtcgcagcccccaccggtgcctccagccgccgcggggccactcgctgggcagccgcgcaagaccagttcgtcgcgccgcaacgcgtggggcaacctgtcgtacgccgacctcatcaccaaggccatcgagagctcggcggagaagaggctcaccctgtcgcagatctacgagtggatggtgaagagtgtgccctacttcaaggataagggcgacagcaacagctcggcgggctggaagaattcaattcgccacaatctgtccctacacagcaagtttattcgagtacagaatgaaggaactgggaaaagttcttggtggatgctcaatccagagggaggcaagagtgggaaatcaccccggagaagagctgcatccatggacaacaacagtaaatttgctaagagccgaggacgggctgctaagaaaaaagcatctctccagtccgggcaagagggtcctggagatagccctgggtctcagttttctaaatggcctgcaagccctgggtcccacagcaatgatgactttgataactggagtacatttcgtcctcgaaccagctcaaacgctagcaccatcagtgggagactttctcccatcatgacagagcaggatgacctgggggatggggatgtgcattccctggtgtatccaccctctgctgccaagatggcgtctacactgcccagtctgtctgaaatcagcaatccagaaaacatggagaaccttctggataatctcaatcttctctcatccccaacatctttaactgtgtcaacccagtcctcgcctggcagcatgatgcagcagacaccttgctattcatttgcaccgccaaacaccagtctaaattcccccagccccaactacgcaaagtacacgtacggccaatccagcatgagccctgtgccccagatgcctatgcagacacttcaggacagcaaatcaagttatggaggattgaaccagtataactgtgccccaggactcttgaaagagttgctgacttctgactctcctccccacaatgatattatgtcaccagtcgatcctggagtggctcaacccaacagtcgggtcctgggccaaaatgtactgatgggccctaactcagtcatgccagcctatggcagccaggcacctcataacaaaatgatgaaccccagttcccacacccaccctggacatgcacagcaaacttcttcagtcaatggccgtgccctgccccatgtggtgaacaccatgcctcacacatctgccatgaaccgcttgaccccagtgaagacacctttacaagtgcctctgtcccaccccatgcagatgagtgccctgggcaactactcctctgtgagcagctgcaatggctatggtaggatgggtgtcctccaccaggagaagctcccaagtgacttggatggcatgtttattgagcgcttggactgtgacatggagtccatcattcggaacgacctcatggacggagataccttggattttaactttgataatgtgttgcccaaccaaagcttcccgcacagtgtcaagactacaacacacagctgggtgtcaggctag。

在本发明中，所述mRNA的5’端优选的连接帽子结构和5’UTR；所述mRNA的3’端优选的连接3’UTR和多聚A尾。

在本发明中，所述SEQ ID No.1所示的mRNA中的尿嘧啶优选的替换为Pseudo UTP，尿嘧啶替换为Pseudo UTP能够提高mRNA的稳定性和表达效率。在本发明中，所述替换优选的在mRNA体外合成的过程中，以Pseudo UTP替换原料中的UTP来实现。

在本发明中，所述软骨缺损修复制剂优选为液体制剂，更优选为注射制剂。在本发明中，所述活性成分mRNA在软骨缺损修复制剂中的浓度优选为0.5-20μg/μl。所述活性成分mRNA的溶剂优选为PBS。本发明对所述PBS的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的PBS即可。本发明对所述注射制剂的制备方法没有特殊限定，满足本领域常规注射制剂的要求即可。

本发明提供了所述的软骨缺损修复制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)合成所述软骨缺损修复制剂中的活性成分mRNA对应的DNA片段，并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒；

2)将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板；

3)构建包括所说明书DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述活性成分mRNA。

在本发明中，合成转录所述的mRNA的DNA片段，并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒。本发明对合成所述的mRNA对应的DNA片段的方法没有特殊限定，采用本领域常规的DNA合成方法即可，在本发明具体实施过程中，优选的委托生物技术公司合成。在本发明中，所述DNA片段的具体序列根据碱基互补配对原则确定。在本发明中，所述表达质粒优选为pEGFP-N1质粒，在本发明中，所述pEGFP-N1质粒的质粒图谱如图1所示，pEGFP-N1质粒中还包括了启动子SV40和PCMV、多克隆位点。

在本发明中，优选的通过酶切连接的方法将所述DNA片段克隆至表达质粒中；在本发明中，所述DNA片段优选的通过BamHI和NheI酶进行双酶切获得酶切NDA片段；所述表达质粒优选的通过BamHI和NheI酶进行双酶切后获得酶切质粒；然后将所述酶切DNA片段和酶切质粒连接获得重组质粒。本发明对所述双酶切和连接的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的双酶切和连接的操作即可。

本发明在获得所述重组质粒后，将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板。在本发明中，所述宿主细胞优选为大肠杆菌感受态细胞；本发明对所述转入的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转入方法即可。本发明在获得重组细胞后，优选的进行阳性重组细胞的筛选和菌落测序。在本发明中，所述阳性重组细胞的筛选优选的在amp抗性的固体培养基上进行。在本发明中，挑选所述amp抗性的固体培养基上的单菌落进行菌落PCR，选取菌落PCR结果含目的条带的菌落进行测序。本发明对所述菌落PCR的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的菌落PCR步骤即可。

在本发明中，提取测序正确的重组细胞的质粒；本发明对所述质粒的提取方法没有特殊限定，优选的采用质粒提取试剂盒进行。在本发明中，以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板。在本发明中，所述PCR扩增的体系以50μl计，优选的如下：

PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl

引物F1.2μl

引物R1.2μl

DNA模板1μl

水21.6μl

在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度优选为10μmol/L；所述DNA模板的浓度优选为1ng/μl。在本发明中，所述PCR的扩增程序优选的如下：预变性98℃3min；变性98℃10s，退火60℃5s，延伸72℃2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。

在本发明中，所述PCR扩增反应结束后，优选的对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测以确定反应是否成功；所述琼脂糖凝胶电泳检测的参数优选的如下：1.5％琼脂糖，5V/min，40min。在本发明中，琼脂糖凝胶电泳出现目的大小的条带认为是反应成功。

本发明在所述PCR扩增反应结束后，优选的将所述扩增产物进行浓缩和纯化。在本说明书发明中，所述浓缩优选的采用Millipore 30kDa超滤管进行；所述纯化优选的采用FPLC进行；

本发明在所述纯化后优选的采用NanoDrop检测纯化后模板的浓度，以及260/280的比值。当260/280在1.6～1.8之间，认为模板合格。

本发明在获得所述DNA模板后，构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述活性成分mRNA。

在本发明中，所述RNA体外合成体系以1600μl计，包括以下组分：

RNase-free水440μl；

7.5mM的ATP 160μl；

7.5mM的UTP(或者Pseudo UTP)160μl；

7.5mM的CTP 160μl；

7.5mM的GTP 160μl；

7.5mM的M7G(2’OMeA)pG 160μl；

150ng/μl的DNA模板40μl；

10×Buffer 160μl；

Enzyme Mix 160μl。

在本发明中，所述RNA体外合成的条件优选的为36～38℃，8～12h，更优选为37℃，10h。

在本发明中，所述RNA体外合成优选的在恒温反应器中进行；所述RNA体外合成体系优选的置于2ml RNase-free Tube管中，一次同时反应多管；

所述RNA体外合成体系中的反应试剂按照上述顺序添加。

本发明在所述RNA体外合成结束后，优选的还包括去除DNA模板、回收mRNA和纯化mRNA的步骤。在本发明中，所述去除DNA模板优选的通过DNase I消化实现；

所述消化优选的包括将DNase I与RNA体外合成反应后的溶液混合后进行；所述DNase I与RNA体外合成反应后的溶液的体积比优选为3:40；所述混合优选的通过上下颠倒所述RNase-free Tube管实现，所述上下颠倒的次数优选为8～12次，更优选为10次；

本发明在所述混合后，优选的进行离心将溶液收集至RNase-free Tube管底部。在本发明中，所述离心的转速优选为800～1200rpm，更优选为1000rpm；所述离心的时间优选为8～12s，更优选为10s。

所述消化的温度优选为37℃；

所述消化的时间优选为1h。

本发明在所述消化结束后，优选的进行DNA片段残留检测。在本发明中，所述回收mRNA优选的通过将所述醋酸铵溶液沉淀实现；

本发明在回收mRNA后，进行mRNA的质量检测；所述质量检测包括mRNA的浓度、mRNA的260/280、260/230的比值。当260/280范围为1.8～2.1，260/230范围为大于2.0时，认为mRNA合格。

在本发明中，所述纯化mRNA通过FPLC纯化实现。本发明所述纯化mRNA后，优选的对纯化后的mRNA进行分装。

本发明提供了所述的软骨缺损修复制剂在制备治疗关节软骨损伤的药物中的应用。在本发明中，所述药物制剂的使用剂量，以每一关节计，优选为10～20μg，更优选为14～16μg，最优选为15μg。

在本发明中，所述制剂中还包括递送材料，包括但不限于PEI、PAMAM、多聚赖氨酸、壳聚糖、脂质体、脂质纳米颗粒；

优选地，所述递送材料是PEI；

优选地，所述PEI和mRNA质量比是PEI：mRNA＝0.1-10：1；

在本发明中，所述药物的使用方法为关节腔注射，本发明对所述关节腔注射的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规的关节腔注射操作即可。

本发明中，所述治疗关节软骨损伤的药物以所述软骨缺损修复制剂为活性成分或，还可以包括其他活性成分；所述药物的剂型优选为注射制剂。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解说明书为对本发明保护范围的限定。

实施例1

重组质粒制备：

1)合成seq1的目的片段；

2)将目的片段和pEGFP-N1质粒分别进行BamHI和NheI双酶切；

3)使用T4连接酶进行体外连接；

4)转化大肠杆菌感受态，在amp固体培养基上培养12h；

5)菌落PCR，选取含目的条带的菌落进行测序。

步骤5)中菌落PCR步骤如下：

1、单菌落挑取把LB培养基倒入排枪槽中，然后用排枪加400μl LB培养基到48孔深孔板，用镊子拿已灭菌的小白枪头挑取平板上的单菌落并放到48孔深孔板中，同时在48孔深孔板和相应的表单上做好记录。挑好的48孔深孔板用封口膜盖好并做好相应标记(日期、板号等)，用针头在封口膜打孔，把它放在37℃摇床上摇1h。

2、菌落PCR反应配制好如下PCR反应体系，把配好的反应液加到96孔板中，用排枪加2μl菌液到其中，按照PCR程序进行扩增:

PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl

引物F1.2μl

引物R1.2μl

菌液2μl

水20.6μl

在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度优选为10μmol/L；所述DNA模板的浓度优选为1ng/μl。在本发明中，所述PCR的扩增程序优选的如下：预变性98℃3min；变性98℃10s，退火60℃5s，延伸72℃2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。

3、琼脂糖凝胶电泳先配制1％琼脂糖凝胶(称取1g琼脂糖加入100ml的TAE溶液中)，在完成PCR反应的96孔板中加入0.5μl溴酚蓝，震荡混匀，然后点样，电泳好的琼脂糖凝胶拍照、保存。

4、判断阳性克隆并测序根据琼脂糖凝胶电泳条带图来判断阳性克隆，把阳性克隆的菌液进行扩大培养，进行测序验证，选取具备完全正确序列的克隆进行下一步操作。

6)测序正确的菌落扩大培养，质粒提取。

步骤6)中所述的质粒提取的步骤参考omega D6915 Endo-free Plasmid MidiKit说明。

得到的质粒按如下反应体系进行DNA模板的扩增：

反应体积，50μl(为单个管的反应体积，一次同时反应多管)

所述PCR扩增的体系以50μl计，优选的如下说明书

PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl

引物F1.2μl

引物R1.2μl

DNA模板1μl

水21.6μl

引物F和引物R的初始浓度优选为10μmol/L；所述DNA模板的浓度优选为1ng/μl。所述PCR的扩增程序如下：预变性98℃3min；变性98℃10s，退火60℃5s，延伸72℃2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。

反应结束后，将反应液合并于1.5ml Tube管中。取10μl进行DNA琼脂糖凝胶电泳(1.5％琼脂糖，5V/min，40min)。根据电泳目的条带的大小对反应成功与否进行确认。合格标准：电泳检测出现单一的条带，且大小正确。

测定结果：条带大小单一，大小符合要求。

DNA模板超滤利用Millipore 30kDa超滤管浓缩上述获得的DNA模板。

DNA模板FPLC纯化将上述超滤得到的DNA，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液(苯酚/氯仿/异戊醇＝25/24/1)，充分震荡后，12000g离心15min。

去掉沉淀，转移上清至新的离心管中，加入上清体积的1/10 3M NaAc(pH5.2)，混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，混匀，至于-20℃静至30min。

4℃，12000g离心10min，弃上清。

用70％乙醇洗涤沉淀，12000g离心5min，取上清，于超净台晾干5min。

用适当的RNase-free水溶解纯化后的DNA模板。

用NanoDrop检测纯化后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值。取样进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测(1.5％琼脂糖，5V/min，40min)。

合格标准：260/280介于1.8至2.1之间，260/230在1.6至2.2之间。

测定结果：浓度为500ng/μl，260/280＝1.90，260/230＝1.7

FPLC纯化后模板超滤Millipore 30KDa超滤管浓缩FPLC纯化后的DNA模板，用RNase-free水洗脱溶解。用NanoDrop检测超滤后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值。最终用RNase-free水稀释至150ng/μl。

测定结果：浓度为150ng/μl，260/280＝1.95，260/230＝1.85mRNA的体外合成在恒温反应器中，进行mRNA的体外合成。

按照如下合成体系进行(反应试剂按照从上至下添加)：反应体积，1600μl(置于2ml RNase-free Tube管中，为单个管的反应体积，一次同时反应多管)。

所述RNA体外合成体系以1600μl计，包括以下组分：

RNA-free水440μl；

7.5mM的ATP 160μl；

7.5mM的UTP(或Pseudo UTP)160μl；

7.5mM的CTP 160μl；

7.5mM的GTP 160μl；

7.5mM的M7G(2’OMeA)pG 160μl；

150ng/μl的DNA模板40μl；

10×Buffer 160μl；

Enzyme Mix 160μl。

所述RNA体外合成的条件为37℃，10h。

DNase I消化去除DNA模板向mRNA体外合成后的每个Tube管中各加入120μl DNaseI。

上下颠倒10次混匀，1000rpm离心10s。

重新置于恒温反应器中，37℃，1h。

反应结束后，将反应液合并到RNase-free 50ml Tube管中，检测DNA片段的残留。三次测量结果为0.013ng，0.016ng，0.017ng每100μg mRNA。

测试1、编码转录因子的mRNA表达水平检测

实验方法：体外效力-PCR检测

BMSCs的接种

1)细胞准备：提前1-3天准备检测用细胞。取购自赛业生物的细胞，传代于细胞培养瓶内，保证使用时细胞处于对数生长期。

2)细胞消化计数：取生长状态良好的BMSCs，去掉培养基，以1ml PBS清洗细胞后，加入体积百分含量0.25％胰酶消化1min，然后加入含10％ FBS的DMEM培养基中和胰酶，吹打细胞并转至15ml离心管，反复吹打混匀，然后取10μl的细胞悬液，计数。

3)细胞稀释：取1ml细胞悬液，用含10％FBS的DMEM培养基稀释到5×10^5个/ml，吹打混匀。

4)细胞接种：取2ml细胞悬液加到6孔板内。每个mRNA样品需要准备3孔平行细胞，对照组样品(GFP-mRNA)需要准备1孔细胞，空白对照1孔。将6孔板放入(37±1)℃、(5±0.5)％CO₂培养箱培养过夜。

细胞转染

接种完细胞后约24h，观察6孔板内的细胞状态，汇合度在90％左右。在生物安全柜内，配制所需体积的90％DMEM+10％FBS培养基。转染前30min弃掉孔板的培养基，每孔加入2ml新鲜培养基(90％DMEM+10％FBS)。

a)配制转染体系：取200μl opti-MEM，加入2.5μg mRNA(其中U为U或Pseudo UTP，以下简称：Ψ)样品或空白对照，用枪头轻轻吹打混匀，再加入5μlPEI，充分混匀，静置10min。

b)将配制好的转染体系，直接均匀滴加进入培养的细胞中，再前后左右摇匀，使得转染体系均匀分布于细胞上。

c)换液：转染后6h换液，吸掉旧的培养基，每孔换为2ml新鲜培养基(90％DMEM+10％FBS)。

d)收获：转染后24h收获。吸掉旧的培养基，用1ml PBS清洗一遍。加入Trizol裂解细胞提取总RNA。

PCR结果显示，转染后，目的基因FoxO1表达水平明显提高，BMSC成软骨分化潜能增强，基质合成提升(图2、3)。

根据本发明的编码转录因子的mRNA，检测其免疫原性，评价标准为将所述mRNA对大鼠进行肌肉注射后血清中TNFα水平。

将8周龄的SD大鼠在SPF条件下，并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养，将SEQ ID No.1所示的mRNA(U或Ψ)对SD大鼠进行关节腔注射，每只大鼠的注射剂量为15μg，24h后对大鼠进行取血，分离血清。用大鼠TNFa试剂盒(RayBio)进行酶联免疫吸附分析(ELISA)。实验结果如图4所示。

大鼠注射本发明提供的转录因子mRNA制剂后，TNFα表达水平比对照组无明显升高，可见本发明提供的mRNA剂型免疫原性低，安全性好(图4)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQ ID No.1；

名称：活性成分mRNA

DNA类型：unassigned DNA

生物体来源：人工序列(Artificial Sequence)/synthetic construct

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Claims (10)

1.一种用于关节软骨缺损修复的mRNA剂型生物制剂，其特征在于：

包括活性成分mRNA，所述活性成分mRNA为SEQ ID NO：1或者为与SEQ ID NO：1所示序列相似度达90％以上的序列。

2.根据权利要求1所述的mRNA剂型生物制剂，其特征在于，

所述mRNA的5’端经帽子结构和5’UTR连接；所述mRNA的3’端经3’UTR和多聚A尾连接。

3.根据权利要求1或2所述的mRNA剂型生物制剂，其特征在于，

所述FoxO1的mRNA中的尿嘧啶替换为Pseudo UTP。

4.根据权利要求1所述的mRNA剂型生物制剂，其特征在于，

所述软骨缺损修复制剂为注射制剂。

5.根据权利要求4所述的mRNA剂型生物制剂，其特征在于，

所述活性成分mRNA加入溶剂PBS中配置成溶液，活性成分mRNA在溶液中的浓度为0.5-20μg/μl。

6.权利要求1-5任意一项所述mRNA剂型生物制剂的制备方法，其特征在于：方法包括以下步骤：

1)合成转录所述软骨缺损修复制剂中的活性成分mRNA对应的DNA片段，将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒；

2)将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，对重组细胞进行扩繁，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板；

3)利用DNA模板构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系并进行RNA体外合成获得所述活性成分mRNA。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

所述RNA体外合成体系以1600μl计，包括以下组分：

RNase-free水440μl；

7.5mM的ATP 160μl；

7.5mM的UTP或者Pseudo UTP 160μl；

7.5mM的CTP 160μl；

7.5mM的GTP 160μl；

7.5mM的M7G(2’OMeA)pG 160μl；

150ng/μl的DNA模板40μl；

10×Buffer 160μl；

Enzyme Mix 160μl。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：所述RNA体外合成的条件为36～38℃，8～12h。

9.一种mRNA剂型生物制剂，其特征在于：所述mRNA剂型生物制剂由权利要求7所述制备方法制备而成。

10.一种权利要求1-5任一所述mRNA剂型生物制剂或者由权利要求6所述制备方法制备而成的mRNA剂型生物制剂的应用，其特征在于：所述的mRNA剂型生物制剂在用于软骨基质修复、软骨缺损修复的制药中的应用。

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