JP2023530106A - 細胞外マトリックスに結合するＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）融合タンパク質 - Google Patents

細胞外マトリックスに結合するＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）融合タンパク質 Download PDF

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Abstract

本発明は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）、並びに、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びヘパラン硫酸からなる群から選択される１種以上又は全ての細胞外マトリックスタンパク質に特異的に結合する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）結合ペプチドを含む融合タンパク質、並びにＩＬ－１Ｒａ投与が有益である又はＩＬ－１Ｒａシグナル伝達を弱める必要がある状態を処置するため、組織再生、特に、骨再生及び／若しくは創傷修復を増強するため、又は、創傷、熱傷及び筋肉、軟骨、腱及び骨の障害を処置するため、増殖因子投与の再生活性を増強するため、又は増殖因子刺激に対する細胞の炎症若しくは感受性低下を低減するための融合タンパク質の使用を提供する。

Description

本発明は、融合タンパク質、並びに創傷治癒及び組織再生におけるその使用に関する。
本明細書に引用された特許又は特許出願を含む全ての参考文献は、本発明の完全な理解を可能にするために、参照により本明細書に組み込まれる。しかし、これらの参考文献は、当技術分野、オーストラリア又は他の国における共通の一般知識の一部を形成するという自白を構成するものとして読むべきではない。参考文献の議論は、それらの著者が断言することを述べるものであり、本出願人は、引用された文献の正確性及び適切性に挑戦する権利を留保する。
ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ又はＩＲＡＰ）は、炎症応答を惹起し、調節する炎症促進性サイトカインに属するインターロイキン１（ＩＬ－１）の天然アンタゴニストである。ＩＬ－１は、リンパ球及びマクロファージを刺激し、食細胞を活性化し、プロスタグランジン産生を増加させ、骨関節の変性に寄与し、骨髄細胞の増殖を増加させることができる。ＩＬ－１は、多くの慢性炎症状態に関与する。
ＩＬ－１Ｒａの投与によるＩＬ－１に関連する状態の処置は、in vitro及び動物モデルで広く研究されている。これらのモデルは、感染症、局所炎症、急性又は慢性肺傷害、代謝機能不全、自己免疫疾患、免疫媒介疾患、悪性疾患及び宿主応答のためのモデルを含む。加えて、ヒト組換えＩＬ－１Ｒａは、関節リウマチ、敗血症性ショック、ステロイド耐性移植片対宿主病、急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病に対する臨床試験でヒトに投与されている。
ＩＬ－１Ｒａの組成物は当技術分野において公知である。しかし、多くの組成物は、ＩＬ－１Ｒａの安定性と半減期、及び作用部位に提供されるＩＬ－１Ｒａの量と速度に関する問題を有している。
組換えＩＬ－１Ｒａ（アナキンラ、キネレット（登録商標））は、関節リウマチ及び新生児期発症多臓器性炎症性疾患の治療のために承認されている。複数回のバルク投与による非常に高用量（１回の注射当たり１００ｍｇを超える）での使用が必要である。免疫抑制剤としてのその使用は、報告によれば、感染症及び免疫原性に関連する。
多くの状態を処置するＩＬ－１Ｒａの可能性を考慮すれば、より良好な送達系を開発して、必要な場所で低用量のＩＬ－１Ｒａの正確な局在化と保持を可能にする必要がある。したがって、ＩＬ－１Ｒａを送達する方法の改善が望ましく、インターロイキン－１受容体によって媒介される状態及び病状の処置において有用である。
本発明の態様は、所望の作用部位で保持され得るＩＬ－１Ｒａの放出制御形態を提供しようとするものである。
ＩＬ－１Ｒａ、特に、ＩＬ－１Ｒａの放出制御形態の投与によって処置されてもよい更なる状態を決定することが、本発明の態様の更なる目的である。
第１の側面は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）、並びに、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びヘパラン硫酸からなる群から選択される１種以上又は全ての細胞外マトリックスタンパク質に特異的に結合する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）結合ペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
一態様では、ＥＣＭ結合ペプチドは、配列番号１で示すアミノ酸配列又はその保存的バリアントを含む胎盤増殖因子のヘパリン結合ドメインを含む。
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤ（配列番号１）
一態様では、ＥＣＭ結合ペプチドは、配列番号２で示すアミノ酸配列又はその保存的バリエーションを含むアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）由来のペプチドを含む。
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲ（配列番号２）
一態様では、ＥＣＭ結合ペプチドは、配列番号３で示すアミノ酸配列又はその保存的バリエーションを含むニュールツリン（ＮＲＴＮ）由来のペプチドを含む。
ＲＲＬＲＱＲＲＲＬＲＲＥ（配列番号３）
第２の側面は、第１の側面の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
第３の側面は、第２の側面の核酸分子を含むベクターを提供する。
第４の側面は、第２の側面の核酸分子又は第３の側面のベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞又は非ヒト生物を含む。
第５の側面は、第１の側面の融合タンパク質を製造する方法であって、融合タンパク質を産生する条件下で第４の側面の細胞を培養すること及び融合タンパク質を回収することを含む方法を提供する。
第６の側面は、第５の側面の方法によって製造された場合の融合タンパク質を提供する。
第７の側面は、第１の側面の融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター又は第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物と、任意に１種以上の賦形剤及び／又は担体を含む、医薬組成物又は獣医学組成物を提供する。
第８の側面は、ＩＬ－１Ｒａ投与が有益である又はＩＬ－１Ｒａシグナル伝達を弱めることが必要である状態の処置する方法であって、第１の側面若しくは第６の側面の融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター、第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物又は第７の側面の医薬組成物若しくは獣医学組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
側面第８の別の態様は、ＩＬ－１Ｒａ投与が有益である又はＩＬ－１Ｒａシグナル伝達を弱めることが必要である状態の処置のための組成物であって、第１の側面若しくは第６の側面の融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター、第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物又は第７の側面の医薬組成物若しくは獣医学組成物を含む組成物を提供する。
側面第８の更に別の態様は、ＩＬ－１Ｒａ投与が有益である又はＩＬ－１Ｒａシグナル伝達を弱めることが必要である状態を処置するための医薬の製造における、第１の側面若しくは第６の側面の融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター、第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物又は第７の側面の医薬組成物若しくは獣医学組成物の使用を提供する。
側面第８のある態様では、ＩＬ－１Ｒａ投与が有益である又はＩＬ－１Ｒａシグナル伝達を弱めることが必要である状態は、組織再生、特に、骨再生及び／又は創傷修復を必要とする状態である。第８の側面の一態様では、前記状態は、創傷、熱傷若しくは筋肉の状態、又は、軟骨、腱若しくは骨の障害である。特定の態様では、前記状態は糖尿病における創傷治癒である。一態様では、前記状態は炎症状態である。
第９の側面は、配列番号１で示すＰＩＧＦ１２３～１４１と融合したＩＬ－１Ｒａを含む融合タンパク質を提供する。
第１０の側面は、配列番号２で示すＡＲＥＧ１２６～１３８と融合したＩＬ－１Ｒａを含む融合タンパク質を提供する。
第１１の側面は、配列番号３で示すＮＲＴＮ１４６～１５７と融合したＩＬ－１Ｒａを含む融合タンパク質を提供する。
第１２の側面は、組織再生、特に、骨再生及び／若しくは創傷修復を増強する方法、又は、創傷、熱傷及び筋肉、軟骨、腱及び骨の障害を処置するための方法であって、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質を投与することを含む方法を提供する。
側面１２の別の態様は、組織再生、特に、骨再生及び／若しくは創傷修復の増強における使用のため、又は、創傷、熱傷及び筋肉、軟骨、腱及び骨の障害を処置するための、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質を提供する。
側面１２の更に別の態様は、組織再生、特に、骨再生及び／若しくは創傷修復を増強するため、又は、創傷、熱傷及び筋肉、軟骨、腱及び骨の障害を処置するための医薬の製造における、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質の使用を提供する。
第１３の側面は、増殖因子投与の再生活性を増強する方法であって、増殖因子を、第１、第６、第９、第１０若しくは第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター、第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物、又は第７の側面の医薬組成物若しくは獣医学組成物と共に投与することを含む方法を提供する。
側面１３の別の態様は、増殖因子で処置される対象に投与して、増殖因子の再生活性を増強するための、第１、第６、第９、第１０若しくは第１１の側面の融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター、第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物、又は第７の側面の医薬組成物若しくは獣医学組成物を提供する。
側面１３の更に別の態様は、増殖因子で処置される対象に投与して、増殖因子の再生活性を増強するための医薬の製造における、第１、第６、第９、第１０若しくは第１１の側面の融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター、第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物、又は第７の側面の医薬組成物若しくは獣医学組成物の使用を提供する。
第１４の側面は、増殖因子刺激に対する炎症又は感受性低下を低減するための方法であって、増殖因子を、第１、第６、第９、第１０若しくは第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター、第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物、又は第７の側面の医薬組成物若しくは獣医学組成物と一緒に投与することを含む方法を提供する。
側面１４の別の態様は、増殖因子で処置される対象に投与して、増殖因子刺激に対する炎症又は感受性低下を低減するための、第１、第６、第９、第１０若しくは第１１の側面の融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター、第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物、又は第７の側面の医薬組成物若しくは獣医学組成物を提供する。
側面１４の更に別の態様は、増殖因子で処置される対象に投与して、増殖因子刺激に対する炎症又は感受性低下を低減するための医薬の製造における、第１、第６、第９、第１０若しくは第１１の側面の融合タンパク質、第２の側面の核酸分子、第３の側面のベクター、第４の側面の細胞若しくは非ヒト生物、又は第７の側面の医薬組成物若しくは獣医学組成物の使用を提供する。
第１５の側面は、創傷、特に、糖尿病性皮膚創傷を処置するための方法であって、第１、第６、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質を投与することを含み、融合タンパク質が、慢性創傷における治癒微小環境を、ＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水よりも回復できる方法を提供する。
側面１５の別の態様は、創傷、特に、糖尿病性皮膚創傷を処置するための、第１、第６、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質であって、融合タンパク質が、慢性創傷における治癒微小環境を、ＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水よりも回復できる、ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質を提供する。
側面１５の更に別の態様は、創傷、特に、糖尿病性皮膚創傷を処置するための医薬の製造における、第１、第６、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質の使用であって、融合タンパク質が、慢性創傷における治癒微小環境を、ＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水よりも回復できる、使用を提供する。
一態様では、第１５の側面により慢性創傷における治癒微小環境をＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水よりも回復させる第１、第６、第９、第１０又は第１１の側面の融合タンパク質の能力は、糖尿病マウス（Leprｄｂ／ｄｂ）全層創傷治癒モデルにおいて、ＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水と比較して、好中球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ＋細胞）のクリアランスの増加、マクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋細胞）の蓄積の増加、ＣＤ２０６の発現の増加、炎症促進性因子濃度の低減、抗炎症性因子濃度の増加、ＭＭＰ－２及び９濃度の減少、メタロペプチダーゼ阻害剤であるＴＩＭＰ－１濃度の増加、線維芽細胞増殖因子－２（ＦＧＦ－２）、ＰＤＧＦ－ＢＢ及び血管内皮増殖因子－Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）濃度の増加、又は創傷線維芽細胞におけるＳＡ－β－ｇａｌ活性の減少のうちの少なくとも１つによって証明される。全層創傷治癒のLeprｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスは、Chen, H. et al. (1996) Cell 84(3): 491-5 and Sullivan, S.R. et al., (2004) Plastic and Reconstructive Surgery vol 113, issue 3; p953-960.に記載されている。
第１６の側面は、組織再生、特に、骨再生を増強する方法であって、第１、第６、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質を投与することを含み、融合タンパク質が、ＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水よりも高い再生能力を有する方法を提供する。
側面１６の別の態様は、組織再生、特に、骨再生のための、第１、第６、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質であって、融合タンパク質が、ＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水よりも高い再生能力を有する、ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質を提供する。
側面１６の更に別の態様は、組織再生、特に、骨再生における使用のための医薬の製造における、第１、第６、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質の使用あって、融合タンパク質が、ＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水よりも高い再生能力を有する、使用を提供する。
側面１６の一態様では、第１、第６、第９、第１０又は第１１の側面のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質は、増殖因子、例えば、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの、組織を再生する、特に、骨を再生する能力を増加できる。
一態様では、増殖因子、例えば、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの、組織を再生する、特に、骨を再生する能力を増加させる、第１、第６、第９、第１０又は第１１の側面の融合タンパク質の能力は、例えば、実施例３に記載の方法を使用して、Ｓｍｕｒｆ２発現の減少、Ｓｍａｄ１／５／８レベルの維持若しくは増加による、ＢＭＰ－２駆動分化の増強、又は、ＰＨＬＰＰの減少若しくはＡＫＴ脱リン酸化の減少による、ＰＤＧＦ－ＢＢ誘導増殖及び遊走応答の改善の少なくとも１つによって証明される。Ｓｍｕｒｆ２発現及びＳｍａｄ１／５／８レベルを検出する方法は、Zhang. Y (2001) PNAS, 98, 974-9.に記載されている。ＰＨＬＰＰを検出する方法は、Sierecki, E. et al., (2010) J Med Chem 53, 6899-6911.に記載されている。ＡＫＴ増殖を検出する方法は、Manning, B.D. and Cantley, L.C. (2007) Cell 129, 1261-1274.に記載されている。
胎盤増殖因子のヘパリン結合ドメイン（ＰＩＧＦ１２３～１５２）が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する特異的な結合活性を示すことは、以前に記載されている（例えば米国特許第9,879,062号(B2)参照）。グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＰＩＧＦ１２３～１５２又はその断片であるＰＩＧＦ１２３～１４４、ＰＩＧＦ１２３～１４１、ＰＩＧＦ１２３～１３７、ＰＩＧＦ１３０～１３７及びＰＩＧＦ１２３～１３２の融合タンパク質の、ＥＣＭタンパク質であるフィブロネクチン及びＩ型コラーゲンへの結合は、ＰＩＧＦ１２３～１４４がフィブロネクチンに対する最も強い結合親和性を有し、１型コラーゲンとの結合は、試験を行った他のいずれの融合タンパク質よりも有意に強いことが確認された。増殖因子とＥＣＭとの相互作用が、増殖因子のシグナル伝達で役割を果たすことが十分に報告されており、増殖因子をＥＣＭと結合するように改変できるかどうかを決定すること、増殖因子の活性に影響があるとすれば、それを決定することが望ましかったので、増殖因子と融合したＰＩＧＦ１２３～１４４を含む融合タンパク質を製造した。ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＢＭＰ－２、ＩＧＦ－１、ＢＤＮＦ、ＮＴ、ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β２を含む増殖因子と融合したＰＩＧＦ１２３～１４４を含む融合タンパク質は、in vitroで野生型の活性を保持していることが観察され、in vivoでＥＣＭ分子に結合し、保持された。
ＥＣＭタンパク質に結合するＩＬ－１Ｒａの能力の報告は少なく、ＥＣＭ相互作用が、ＩＬ－１Ｒａの活性に関与していることは知られていない。したがって、ＰＩＧＦのヘパリン結合ドメインをＩＬ－１Ｒａに融合することによる、ＩＬ－１Ｒａの活性に及ぼす影響は予測できなかった。それにもかかわらず、本発明者らは、ＰＩＧＦ１２３～１５２の７種の切断型を生成し、一般的なＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びフィブリノーゲン）及びヘパラン硫酸との結合を試験することによって、ＰＩＧＦ１２３～１５２に由来する最も短いＥＣＭ結合配列を決定した。ＥＣＭ結合配列のＰＩＧＦ１２３～１４１が、ヘパラン硫酸と同様に、試験を行った全てのＥＣＭタンパク質に強く結合することが判明した。ＰＩＧＦ１２３～１４１の結合親和性は、ＰＩＧＦ１２３～１４４及びＰＩＧＦ１２３～１５２を含むＰＩＧＦ１２３～１５２の他の切断型よりも有意に良好であった。これは、先行技術から予測可能ではなく、ＰＩＧＦ１２３～１４４が最高の結合親和性を有することを示唆した。
次いで、本発明者らは、ＩＬ－１Ｒａを改変してＣ末端にＰＩＧＦ１２３～１４１を有するＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を作成した。ＰＩＧＦペプチド１２３～１４１をＩＬ－１Ｒａに融合することは、親和性が４～１００倍増加し、試験を行った全てのＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びフィブリノーゲン）に対する非常に強い結合（すなわち、超親和性）を提供した。また、ＰＩＧＦ１２３～１４１融合ＩＬ－１Ｒａは、フィブリンに強く保持されたが、野生型ＩＬ－１Ｒａは、すぐに放出された。ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１は、フィブリンに保持されたが、これは、フィブリン線維及びＰＩＧＦ１２３～１４１を切断するプロテアーゼのプラスミンの存在下で徐々に放出され、放出制御組成物を提供した。とりわけ、野生型ＩＬ－１Ｒａ及びＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１がＩＬ－１βに対するマクロファージ応答を阻害する同等の能力を呈したので、ＩＬ－１Ｒａは、ＰＩＧＦ１２３～１４１との融合によって損なわれなかった。
野生型と比較して、超親和性ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質は、in vivoでの皮内投与後、更に長い保持を示し、５日後に約５０％保持された。
驚くべきことに、そして有意に、野生型と比較して、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質は、処置の９日後にほぼ１００％閉鎖の再上皮形成の程度によって特徴付けられる糖尿病性創傷の有意に良好な閉鎖を示したが、野生型で処置された創傷は、依然として大きく開いていた。融合タンパク質は慢性創傷における治癒微小環境を回復させることが可能であったと思われる。
驚くべきことに、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質による創傷の処置は、野生型ＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水による処置と比較して、好中球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ＋細胞）のクリアランスを促進し、マクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋細胞）の蓄積を促進した。また、Ｍ２様マクロファージのマーカーであるＣＤ２０６の発現は、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質処置群において有意に高く、創傷マクロファージがおそらくより抗炎症性であったことを示された。意外にも、生理食塩水及びＩＬ－１Ｒａによる処置と比較して、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質は、抗炎症性因子の濃度を増加させながら、創傷における炎症促進性因子の濃度を有意に低減した。超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質を送達することで、ＭＭＰ－２及び９のレベルは有意に減少したが、ＭＭＰ阻害剤のメタロペプチダーゼ阻害剤であるＴＩＭＰ－１のレベルが増加した。さらに、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質を送達することで、生理食塩水及びＩＬ－１Ｒａと比較して、マクロファージ及び他の細胞によって分泌される重要な創傷治癒増殖因子である、治癒促進性因子の線維芽細胞増殖因子－２（ＦＧＦ－２）、ＰＤＧＦ－ＢＢ及び血管内皮増殖因子－Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）の濃度を有意に増強した。最後に、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質は、創傷線維芽細胞におけるＳＡ－β－ｇａｌ活性を減少させ、その結果、処置の９日後に、創傷線維芽細胞は、無傷の皮膚において見られる皮膚線維芽細胞と類似のＳＡ－β－ｇａｌ活性のレベルを呈した。このことは、先行技術から予測可能ではなかった。
ＩＬ－１Ｒａがいくらかの再生能力を有することが公知なので、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質の効果を、骨再生においても試験した。驚くべきことに、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質は、その野生型と比較して、高い再生能力を有していたが、ＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢをＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質と共送達することで、ＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢ単独の送達と比較して、優れた骨再生を顕著に刺激することはより驚くべきことであった。驚くべきことに、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質でＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達を阻害することで、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢに対する骨再生応答を増強すると思われる。
骨再生では、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢは、骨常在性ＭＳＣ及び骨芽細胞に対して作用して、新たな骨の形成を促進することが周知である。ＢＭＰ－２は分化を促進するが、ＰＤＧＦ－ＢＢは走化性及び増殖を促進する。ここで、我々は、ＩＬ－１Ｒａシグナル伝達が、両者の増殖因子によって引き起こされる基礎的形態形成効果を阻害することを見いだした。メカニズム的に、我々は、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達への曝露が、２つのメカニズムによって、ＭＳＣ及び骨芽細胞をＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢに対してより低い応答性にすることを提案する。ＢＭＰ－２では、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達は、Ｓｍｕｒｆ２発現を増加させ、Ｓｍａｄ１／５／８分解を促進し、低いＳｍａｄ１／５／８レベルに起因して、ＢＭＰ－２駆動分化の機能障害をもたらす。この発見と一致して、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達によって活性化される主な転写因子であるＮＦ－κＢが、Ｓｍｕｒｆ２を介してβ－カテニン分解を促進することによって、ＭＳＣの造骨性分化を阻害することが示されている。ＰＤＧＦ－ＢＢでは、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達は、Ａｋｔ脱リン酸化を促進し、ＰＤＧＦ－ＢＢによって通常誘導される分化及び遊走応答を損なうＰＨＬＰＰの発現を増加させる。同様に、ＮＦ－κＢを介した炎症性メディエーターシグナル伝達も、ヒト軟骨細胞においてＰＨＬＰＰ１を増強することが示されている。投与により、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質は、Ｓｍｕｒｆ２発現を減少させ、Ｓｍａｄ１／５／８レベルを維持又は増加させて、ＢＭＰ－２駆動分化を増強すると予測される。加えて、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質を投与することで、ＰＨＬＰＰを減少させ、ＡＫＴ脱リン酸化を減少させて、ＰＤＧＦ－ＢＢによって誘導される分化及び遊走応答を改善すると予測される。
とりわけ、Ｓｍａｄ１／５／８及びＡｋｔは多くの増殖因子のシグナル伝達において重要であることから、ＩＬ－１Ｒ１の活性化は、組換えＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの活性だけはでなく、いくつかの治療薬、例えば、ＢＭＰ並びに血管、線維芽細胞及び上皮増殖因子ファミリーにおける増殖因子を阻害してもよい。これらの治療薬と超親和性融合タンパク質の投与は、ＩＬ－１Ｒ１活性化によるそれらの活性の減弱を克服してもよい。
炎症状態から抗炎症状態へのマクロファージ極性化は、組織治癒のために重要であることが周知である。興味深いことに、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質で処置されたマウスは、通常、ＣＤ２０６の表面発現によって特徴付けられる抗炎症性マクロファージの割合が高かった。これは、ＭＳＣ及び骨芽細胞におけるＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢシグナル伝達を回復することに加えて、超親和性ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質も、マクロファージの抗炎症性表現型への極性化をサポートすることによって骨再生を促進してもよいことを示唆する。このことは、先行技術から予測可能ではなかった。
本発明の態様は、添付の図面を参照して例示的にのみ説明される。
図１は、ＥＣＭに対して超親和性を有するＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質の設計及び試験を示す。１Ａは、ＰＩＧＦ１２３～１５２、ＰＩＧＦ１２３～１４４、ＰＩＧＦ１２３～１４１、ＰＩＧＦ１２３～１３７、ＰＩＧＦ１２３～１３４、ＰＩＧＦ１２３～１４０、ＰＩＧＦ１３０～１３７のアミノ酸配列を示す。１Ｂは、ＥＣＭタンパク質をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合したＰＩＧＦ断片でインキュベートした場合の、ＧＳＴ検出シグナルのグラフを示す。ｎ＝４。１Ｃは、ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢのＣ末端にＰＩＧＦ１２３～１４１を付加して、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１が生成することを示す概略図である。ＰＤＧＦ－ＢＢは天然では二量体である。１Ｄは、ＥＣＭ模倣ハイドロゲルシステム及び皮膚内在性ＥＣＭの模式図である。Ｆｇ、フィブリノーゲン；Ｆｎ、フィブロネクチン；Ｖｎ、ビトロネクチン；ＴｎＣ、テネイシンＣ；ＨＳ、ヘパラン硫酸。１Ｅは、ＩＬ－１Ｒａ又はＰＤＧＦ－ＢＢバリアントの累積放出を示すグラフである。ｎ＝４。ＥＣＭ模倣ハイドロゲルをＩＬ－１Ｒａ又はＰＤＧＦ－ＢＢバリアントを用いて生成し、２４時間ごとに交換する１０倍容量の緩衝液（プラスミンを含有する又は含有しない）中でインキュベートした。１Ｆは、さまざまな時点で測定した、（５ｍｍ径の全層皮膚生検からの）注入部位に残存するＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢバリアントの割合を示す。ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢバリアントをマウスに皮内注入した際の各時点でｎ＝４。Ｂ、Ｅ及びＦでは、データは平均値±ＳＥＭである。Ｂでは、ボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡによりペアワイズ比較。Ｅ及びＦでは、ボンフェローニの事後検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡによりペアワイズ比較。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。 図２は、ＰＩＧＦ１２３～１４１融合ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢのＥＣＭタンパク質に対する結合親和性を示す。ＥＬＩＳＡプレートのウェルをＥＣＭタンパク質でコーティングし、ＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質又は野生型のタンパク質と更にインキュベートした。グラフは、ＩＬ－１Ｒａ又はＰＤＧＦ－ＢＢを検出する抗体のシグナルを示す。シグナルを、Ａ４５０ｎｍ＝Ｂｍａｘ＊［タンパク質］／（Ｋｄ＋［タンパク質］）（式中、［タンパク質］は、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１、ＰＤＧＦ－ＢＢ又はＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の濃度。）を使用して、解離定数（Ｋｄ）を得るために非線形回帰にフィッティングさせた。データは平均値±ＳＥＭ。ｎ＝３。 図３は、ＰＩＧＦ１２３～１４１をＩＬ－１Ｒａ又はＰＤＧＦ－ＢＢに融合させても、それらの活性が損なわれないことを示す。（３Ａ）骨髄由来のマクロファージを、漸増濃度（０～１μｇ／ｍｌ）のＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ－１Ｒａのバリアントで同時に刺激した。ＩＬ－１βによる処置を行わないものを陰性対照とした。ＩＬ－１βを阻害するＩＬ－１Ｒａバリアントの能力を、刺激の２４時間後に、マクロファージによるＩＬ－６の放出を測定することによって評価した。ｎ＝４。（３Ｂ）皮膚線維芽細胞を基本培地（２％血清）中で培養し、漸増濃度のＰＤＧＦ－ＢＢバリアントで刺激した。新たな細胞の割合を３日後に測定した。ｎ＝４。３Ａ、３Ｂとも、データは平均値±ＳＥＭで、両側スチューデントｔ検定を行った。ｎ．ｓ．＝有意差なし。 図４は、ＩＬ－１Ｒ１のシグナル伝達が、糖尿病マウスにおける創傷治癒を損なうことを示す。（４Ａ）糖尿病マウス（Leprｄｂ／ｄｂ）及び非糖尿病同腹子（Leprｄｂ／＋）で全層創傷（５ｍｍ）を作出した。さまざまな時点で採取した創傷におけるＩＬ－１β及びＩＬ－１Ｒａの濃度。時点ごとにｎ＝４の創傷。（４Ｂ）Leprｄｂ／＋及びLeprｄｂ／ｄｂマウス由来の未刺激又は刺激（ＬＰＳ＋ＡＴＰ）後の骨髄由来マクロファージの培地中のＩＬ－１βの濃度。（４Ｃ）Leprｄｂ／ｄｂマウスをIl1r1－／－マウスと交配し、ＩＬ－１Ｒ１欠損の糖尿病マウスを作出した。１４週齢のマウスの代表的な写真を示す。スケールバー＝１ｃｍ。（４Ｄ及び４Ｅ）Leprｄｂ／ｄｂ及びLeprｄｂ／ｄｂ－Il1r1－／－マウスで全層創傷を作出した。Ｄのグラフは、組織切片の組織形態学的分析によって評価した創傷閉鎖の動態を示す。時点ごとにｎ＝１２の創傷。１０日後の代表的な組織像（ヘマトキシリン及びエオシン染色）をＥに示す。黒の矢印は創傷の縁を、灰色の矢印は上皮の舌の先端を示す。スケールバー＝１ｍｍ。Ａ、Ｂ及びＣのデータは、平均値±ＳＥＭである。Ａ及びＤでは、ボンフェローニの事後検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡによりペアワイズ比較。Ｂでは、両側スチューデントのｔ検定。＊＊＊Ｐ≦０．００１。 図５は、Leprｄｂ／ｄｂ及びLeprｄｂ／ｄｂ－Il1r1－／－マウスの血糖値を示す。１４週齢のマウスの血糖を測定した。１群当たりｎ＝４のマウス。データは平均値±ＳＥＭ。ボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡによりペアワイズ比較。＊＊＊Ｐ≦０．００１、ｎ．ｓ．＝有意差なし。 図６は、超親和性ＩＬ－１Ｒａが糖尿病マウスにおいて迅速な創傷治癒を促進することを示す。６Ａ及び６Ｂ－Leprｄｂ／ｄｂにおける全層創傷をＩＬ－１Ｒａ又はＰＤＧＦ－ＢＢのバリアントで処置した（改変したバージョンの等モル、０．５μｇの野生型）。（６Ａ）処置の９日後の代表的な組織像（ヘマトキシリン及びエオシン染色）。黒の矢印は創傷の縁を、灰色の矢印は上皮の舌の先端を示す。スケールバー＝１ｍｍ。（６Ｂ）組織切片の組織形態学的分析によって評価した創傷閉鎖。１０日目のＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１（ｎ＝１０）を除き、条件ごとにｎ＝８の創傷。（６Ｃ）糖尿病性創傷において予測されるＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の効果の概略図。ＭＭＰ、マトリックスメタロペプチダーゼ；ＳＡＳＰ、老化関連分泌表現型；灰色の矢印は移動を表す；黒の矢印は誘導を表す；赤の線は阻害を表す。（６Ｄ）フローサイトメトリーによって測定した創傷後のさまざまな時点での創傷における好中球及びマクロファージの集団。割合は総創傷細胞数に対するもの。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）をマクロファージについて測定した（Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋の細胞）。時点ごとにｎ＝８の創傷。６Ｂ及び６Ｄ、データは平均値±ＳＥＭである。５Ｂでは、ボンフェローニの事後検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡによりペアワイズ比較（６Ｄでは、比較は、生理食塩水とＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の間で行った）。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、ｎ．ｓ．＝有意差なし。 図７は、創傷中の創傷好中球及びマクロファージを分析するためのゲーティング戦略を示す。好中球及びマクロファージのパネルについて、ステップごとの代表的フローサイトメトリードットプロットを示す。ＭＦＩ、蛍光強度の中央値。 図８は、超親和性ＩＬ－１Ｒａによる処置は、治癒促進性微小環境がもたらされることを示す。（８Ａ）Leprｄｂ／ｄｂマウスで全層創傷を作出し、生理食塩水又はＩＬ－１Ｒａバリアントで処置し（ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１と等モルである、０．５μｇの野生型）、創傷組織をさまざまな時点で収集した。グラフは、組織溶解液１ｍｌ当たりのサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、メタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ－１）、及び増殖因子の濃度を示す。時点ごとにｎ＝４。（８Ｂ）皮膚線維芽細胞をＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）又は生理食塩水対照（ＰＢＳ）と培養した。９日後に、老化グリーンプローブ（ＳＧＰ）を使用して、ＳＡ－β－ｇａｌの活性を評価した。グラフは、ＳＧＰシグナルの増加率（％）を示す。ｎ＝６。（８Ｃ）Leprｄｂ／ｄｂマウスにおける全層創傷を生理食塩水又はＩＬ－１Ｒａバリアントで処置した。９日後に、ＳＧＰを使用して、ＳＡ－β－ｇａｌの活性をフローサイトメトリーによって評価した。ＳＡ－β－ｇａｌ活性を無傷の皮膚試料由来の線維芽細胞と比較した。全て、データは平均値±ＳＥＭ。Ａでは、ボンフェローニの事後検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡにより、生理食塩水とＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の間でペアワイズ比較。Ｂでは、両側スチューデントのｔ検定。Ｃでは、ボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡによりペアワイズ比較。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、ｎ．ｓ．＝有意差なし。 図９は、老化関連分泌表現型に対するＩＬ－１βの効果を示す。皮膚線維芽細胞をＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。グラフは、培地中で測定された老化関連サイトカインの濃度を示す。ｎ＝４。データは平均値±ＳＥＭ。両側スチューデントのｔ検定。＊＊＊Ｐ≦０．００１。 図１０は、創傷線維芽細胞中のβ－ｇａｌ活性を分析するためのゲーティング戦略を示す。ステップごとの代表的フローサイトメトリードットプロットを示す。ＭＦＩ、蛍光強度の中央値。 図１１は、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢによって駆動される骨再生がIl1r1－／－マウスにおいて増強されることを示す。野生型又はIl1r1－／－マウスにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損（直径４．５ｍｍ）を、フィブリンマトリックスによって送達されたＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢ（１μｇ）で処置した。処置の８週後に、マイクロコンピューター断層撮影（マイクロＣＴ）によって骨再生を測定した。（１１Ａ）代表的な頭蓋冠の再構築。元の欠損領域は、破線の輪郭を用いて陰影付けしている。（１１Ｂ）欠損の被覆率及び新たに形成された骨の体積。データは平均値±ＳＥＭ。ｎ＝６。スチューデントのｔ検定。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図１２は、ＭＳＣの表面マーカーの発現プロファイリングを示す。ＭＳＣをマウスの長い緻密骨から単離し、３継代培養した。ＭＳＣに特異的な表面マーカーの発現をフローサイトメトリーを使用して確認した。細胞はＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１９－、ＣＤ３１－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ９０．２＋、ＣＤ１４０ｂ（ＰＤＧＦＲ－ｂ）＋、及びＳｃａ－１（Ｌｙ－６Ａ／Ｅ）＋であったことから、ＭＳＣ表現型が確認された。未染色細胞のシグナルは白色で、染色細胞のシグナルは灰色である。陰性及び陽性のマーカーに対する陽性細胞の割合（％）を示す。 図１３は、ＩＬ－１βが、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの形態形成活性を阻害することを示す。（１３Ａ及び１３Ｂ）ＭＳＣを、増殖培地又はＢＭＰ－２及びＩＬ－１βを含有する骨形成誘導培地中で培養した。２１日後に、マトリックスの石灰化をアリザリンレッドで検出した。代表的なウェル（２ｃｍ２）を１３Ａに示す。骨芽細胞特異的遺伝子の発現を、７日及び１４日後に定量ＰＣＲによって決定した。通常の培地で培養したＭＳＣに対する遺伝子発現の倍数変化を１３Ｂに示す。Ａｌｐｌ、アルカリホスファターゼ；Ｒｕｎｘ２、ラント関連転写因子２；Ｉｂｓｐ、インテグリン結合シアロタンパク質。各時点でｎ＝４。（１３Ｃ及び１３Ｄ）初代ＭＳＣをＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１βと共に１０日間播種した。代表的なウェル（９ｃｍ２）を１３Ｃに示す。１３Ｄのグラフは、コロニー形成単位－線維芽細胞（ＣＦＵ－Ｆ）及びコロニーの平均サイズを示す。ｎ＝６の単離株。（１３Ｅ）ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１βによる刺激の際の、低血清（１％、基礎条件）中でのＭＳＣの増殖。基礎条件に対する細胞数の増加の割合（％）を７２時間後に測定した。ｎ＝６。（１３Ｆ）ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１βによって誘導されるトランスウェルを通過するＭＳＣの遊走。６時間後に遊走した１ｍｍ２当たりの細胞数を計数し、基礎的な遊走に対する倍数増加として表した。ｎ＝６。Ｂ、Ｄ～Ｆでは、データは平均値±ＳＥＭである。Ｂでは、スチューデントのｔ検定。Ｄ～Ｆでは、ＰＤＧＦ－ＢＢとＰＤＧＦ－ＢＢ＋ＩＬ－１βの間のボンフェローニ事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＢＭＰ－２、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＩＬ－１βの濃度はそれぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌ。 図１４は、ＩＬ－１βが骨芽細胞におけるＢＭＰ－２の活性を阻害することを示す。頭蓋冠骨から単離した骨芽細胞を、増殖培地又はＢＭＰ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有し、ＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）を含むか又は含まない骨形成誘導培地（ＯＩＭ）中で培養した。７日及び１４日後に、骨芽細胞特異的遺伝子の発現を定量ＰＣＲによって決定した。通常の培地で培養したＭＳＣに対する遺伝子発現の倍数変化を示す。Ａｌｐｌ、アルカリホスファターゼ；Ｒｕｎｘ２、ラント関連転写因子２；Ｉｂｓｐ、インテグリン結合シアロタンパク質。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントのｔ検定。 図１５は、ＩＬ－１βが骨芽細胞におけるＰＤＧＦ－ＢＢの活性を阻害することを示す。（１５Ａ）低血清（１％、基礎条件）中での骨芽細胞の増殖を、ＰＤＧＦ－ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。７２時間後に、基礎条件に対する細胞数の増加を測定した。（１５Ｂ）トランスウェルを通過する骨芽細胞の遊走が、ＰＤＧＦ－ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）によって誘導された。６時間後に、トランスウェルを通過した１ｍｍ２当たりの細胞数を計数し、基礎的な遊走に対する倍数増加として表した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）。ボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ；＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図１６は、ＩＬ－１βが、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢのシグナル伝達に対する細胞の応答性を低下させることを示す。（１６Ａ～Ｃ）ＭＳＣをＩＬ－１βと２４時間培養した。１６Ａでは、Ｓｍａｄ１／５／８レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ｎ＝６。１６Ｂでは、Ｓｍｕｒｆ１及びＳｍｕｒｆ２の発現を定量ＰＣＲによって測定した（０時間に対する倍数変化）。ｎ＝３。１６Ｃでは、Ｓｍｕｒｆ２レベルをＥＬＩＳＡによって決定した（細胞溶解液１ｍｌ当たりのＳｍｕｒｆ２の濃度）ｎ＝４。（１６Ｄ）ＭＳＣを、増殖培地又はＢＭＰ－２、ＩＬ－１β及びヘクリンを含む骨形成誘導培地（ＯＩＭ）中で培養した。２１日後に、マトリックスの石灰化をアリザリンレッドで検出した。代表的なウェル（２ｃｍ２）を示す。（１６Ｅ）ＭＳＣをＩＬ－１β及びヘクリンと培養した。２４時間後に、Ｓｍａｄ１／５／８レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。（１６Ｆ）ＭＳＣをＩＬ－１βで４時間刺激した。次いで、細胞をＰＤＧＦ－ＢＢで刺激した（０分の時点）。細胞溶解液１ｍｌ当たりのリン酸化されたＡｋｔ（Ｓ４７３、黒塗りの四角と丸、左側の縦軸）及び総Ａｋｔ（白抜きの四角と丸、右側の縦軸）をＥＬＩＳＡによって測定した。ｎ＝４。（１６Ｇ及び１６Ｈ）ＭＳＣをＩＬ－１βとインキュベートした。１６Ｇでは、Ｐｈｌｐｐ１及びＰｈｌｐｐ２の発現を定量ＰＣＲによって測定した（０時間に対する倍数変化）。１６Ｈのグラフは、２４時間後にＥＬＩＳＡによって決定したＰＨＬＰＰ１タンパク質レベルを示す（溶解液１ｍｌ当たり）。１６Ｇ及び１６Ｈではｎ＝４。（１６Ｉ）低血清（１％、基礎条件）中でのＭＳＣの増殖をＰＤＧＦ－ＢＢ、ＩＬ－１β及びNSC-45586で刺激した。７２時間後に、基礎条件に対する細胞数の増加を測定した。ｎ＝６。（１６Ｊ）ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＩＬ－１β及びNSC-45586によって誘導されるトランスウェルを通過するＭＳＣの遊走。１ｍｍ２当たりの遊走した細胞数を計数し、基礎的な遊走に対する倍数増加として表した。ｎ＝６。（１６Ｋ）ＭＳＣをNSC-45586及びＩＬ－１βと４時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＤＧＦ－ＢＢで刺激し、１２０分後に、Ａｋｔのリン酸化（Ｓ４７３）をＥＬＩＳＡによって測定した。データは平均値±ＳＥＭ。ｎ＝４。（１６Ｌ及び１６Ｍ）ＭＳＣをＩＬ－１βと最大１４日培養し、フローサイトメトリーで老化グリーンプローブ（ＳＧＰ）を測定することによって、ＳＡ－β－ｇａｌの活性を評価した（Ｌは代表的なドットプロット、Ｍは蛍光強度の中央値）。ｎ＝３。全て、データは平均値±ＳＥＭ。Ａ～Ｃ、Ｇ、Ｈ及びＭでは、スチューデントのｔ検定。Ｆでは、ボンフェローニの事後検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡ。Ｅ、Ｉ～Ｋでは、ボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．＝有意差なし。ＢＭＰ－２、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＩＬ－１βの濃度は、それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌ。ヘクリン及びNSC-45586の濃度は２０ｍＭ。 図１７は、ＩＬ－１βが、増殖因子のシグナル伝達に対する骨芽細胞の応答性を低下させることを示す。（１７Ａ）骨芽細胞をＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）を含む基礎培地中で培養した。２４時間後に、Ｓｍａｄ１／５／８のレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。データは平均値±ＳＥＭ；＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントのｔ検定。（１７Ｂ）骨芽細胞をＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）を補充した低血清培地（１％ＦＢＳ）中で４時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＤＧＦ－ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。６時間後に、リン酸化されたＡｋｔ（Ｓ４７３）及び総ＡｋｔをＥＬＩＳＡによって測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）。スチューデントのｔ検定；ｎ．ｓ．＝有意差なし、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１８は、ＩＬ－１β放出老化関連サイトカインで処置したＭＳＣを示す。ＭＳＣをＰＢＳ又はＩＬ－１β（５ｎｇ／ｍｌ）で処置した。４８時間後に、培地に放出されたサイトカインを抗体アレイを使用して検出した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３のアレイ）。スチューデントのｔ検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図１９は、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの送達が、マクロファージによるＩＬ－１βの放出を誘発することを示す。（１９Ａ及び１９Ｂ）頭蓋冠欠損を生理食塩水、ＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢ（１ｍｇ）を含むフィブリンマトリックスで処置した。欠損を囲む骨組織を含むフィブリンマトリックスをさまざまな時点で収集した。１９Ａのグラフは、ＥＬＩＳＡによって検出された採取試料におけるＩＬ－１βの濃度を示す（組織溶解液１ｍｌ当たりのＩＬ－１βの濃度）。時点ごとにｎ＝３。１９Ｂのグラフは、マクロファージを有する（対照のリポソーム）又はマクロファージが枯渇した（クロドロネートリポソーム）マウスにおいて６日目に測定したＩＬ－１βの濃度を示す。ｎ＝４。（１９Ｃ）初代マクロファージをＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢで処置した。２４時間後に、培地のＩＬ－１βの濃度をＥＬＩＳＡによって検出した。ｎ＝４。統計は、処置なし（０ｎｇ／ｍｌ）と処置の間のもの。全て、データは平均値±ＳＥＭ。Ａでは、ボンフェローニの事後検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡ。Ｂでは、スチューデントのｔ検定。Ｃでは、ボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図２０は、クロドロネートリポソームがマクロファージを枯渇させることを示す。リポソーム又は対照のリポソームを頭蓋冠手術の２日前に野生型マウスに注射した（７ｍｇ／ｍｌ、２００μｌ）。クロドロネートリポソーム又は空のリポソームを更に１００μｌ、手術の直前と６日目まで２日ごとに注射した。グラフは、代表的なフローサイトメトリープロット（２０Ａ）及び６日目に脾臓から収集したＬｙ６Ｇ－、Ｆ４／８０＋の割合（％）（２０Ｂ）を示す。マクロファージの約８０％がクロドロネートリポソームにより枯渇した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４のマウス）。＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントのｔ検定。 図２１は、マクロファージがＰＤＧＦ－ＢＢ及びＢＭＰ－２の受容体を発現することを示す。骨髄由来の初代マクロファージを、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ２、ＡＣＶＲ１及びＢＭＰＲ１Ｂの発現について、フローサイトメトリーによって分析した。マクロファージは、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ及びＡＣＶＲ１の発現を示し、ＢＭＰＲ２及びＢＭＰＲ１Ｂの発現は低かったが、ＢＭＰＲ１Ａは検出されなかった。未染色細胞由来のシグナルは白色で、染色細胞由来のシグナルは灰色で示す。受容体に対する陽性細胞の割合（％）を示す。 図２２は、ＩＬ－１Ｒ１のシグナル伝達が骨形成細胞の増殖因子に対する感受性を低下させる提案されたメカニズムを示す。骨形成細胞（ＭＳＣ及び骨芽細胞）におけるＩＬ－１Ｒ１のシグナル伝達は、ＰＨＬＰＰ及びＳｍｕｒｆ２の発現を刺激する。より高レベルのＰＨＬＰＰはＡｋｔの迅速な脱リン酸化を促進し、ＰＤＧＦ－ＢＢのシグナル伝達を弱める。高レベルのＳｍｕｒｆ２は、ユビキチン化、ひいてはＳｍａｄ１／５／８の分解を促進することによって、細胞のＢＭＰ－２に対する応答性を減じる。ＩＬ－１Ｒ１のシグナル伝達は、おそらくＳｍｕｒｆ２を介して老化も加速させる。ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢは、マクロファージによるＩＬ－１β放出を更に刺激する。リン酸化は、円で囲まれた文字Ｐで示す。 図２３は、ＢＭＰ－２が遍在するＥＣＭタンパク質に強力に結合することを示す。ＥＬＩＳＡプレートをＥＣＭタンパク質（１００ｎＭ）でコーティングし、漸増濃度（０．１～１００ｎＭ）のＢＭＰ－２と更にインキュベートした。結合したＢＭＰ－２を抗体で検出した。特異的結合シグナルを、結合曲線と解離定数（ＫＤ）を得るために、非線形回帰にフィッティングさせた。ＫＤ値をグラフ中に示す。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）。 図２４は、超親和性ＩＬ－１Ｒａが、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの再性能力を増強することを示す。（２４Ａ）超親和性ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１βの設計。ＥＣＭタンパク質に対する親和性は、ＢＭＰ－２に対しては高く、ＰＤＧＦ－ＢＢに対しては中程度であり、ＩＬ－１Ｒａに対しては低い。ＰＩＧＦ１２３～１４１（赤の楕円）をＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１ＲａのＣ末端に付加し、ＥＣＭタンパク質に対する超親和性を付与する。（２４Ｂ及びＣ）ＥＬＩＳＡによって測定した、フィブロネクチン（Ｆｎ）、ビトロネクチン（Ｖｎ）、テネイシン－Ｃ（Ｔｎｃ）及びフィブリノーゲン（Ｆｇ）に対する、野生型の親和性対ＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質の親和性（ＫＤ）。ｎ＝３。（２４Ｄ）フィブリンマトリックスを増殖因子及びＩＬ－１Ｒａバリアントと共に作製し、毎日交換される１０倍容量の緩衝液中でインキュベートした。マトリックスから放出された組換えタンパク質の割合（％）をＥＬＩＳＡによって定量した。ｎ＝３。（２４Ｅ及びＦ）野生型マウスの臨界サイズの頭蓋冠欠損（直径４．５ｍｍ）をフィブリンと共に送達する増殖因子（１ｍｇ）及びＩＬ－１Ｒａ（１ｍｇ）バリアントで処置した。処置の８週後に、マイクロＣＴによって再生を測定した。代表的な頭蓋冠の再構築を２４Ｅに示す。元の欠損領域は、破線の輪郭を用いて陰影付けしている。欠損の被覆率及び新たに形成された骨の体積を２４Ｆに示す。ｎ＝６。（２４Ｇ及びＨ）野生型マウスの臨界サイズの大腿骨欠損（幅２ｍｍ、破線のボックス）をフィブリンと共に送達する超親和性ＩＬ－１Ｒａ（１ｍｇ）を含む又は含まない、マトリックス結合増殖因子（１ｍｇ）で処置した。処置の１２週後に、マイクロＣＴによって再生を測定した。代表的な大腿骨再構築を２４Ｇに示す。形成された新たな骨の体積を２４Ｈに示す。ｎ＝４。全て、データは平均値±ＳＥＭ。Ｂ、Ｃ及びＨでは、スチューデントのｔ検定。Ｄでは、ボンフェローニの事後検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡ。Ｆでは、ＩＬ－１Ｒａのみ群及びＰＤＧＦ－ＢＢ群に対してはボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ、ＢＭＰ－２群に対してはスチューデントのｔ検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図２５は、さまざまな増殖因子及びＩＬ－１Ｒａバリアントタンパク質の配列を示す。 図２６は、プラスミンが、フィブリンからのＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質及びＢＭＰ－２の放出を誘発することを示す。増殖因子又はＩＬ－１Ｒａバリアントを含むフィブリンマトリックスを、毎日交換されるプラスミンを含む１０倍容量の放出緩衝液中でインキュベートした。ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａは迅速に放出される。ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＢＭＰ－２は、マトリックスから経時的に漸次放出される。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）。 図２７は、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１ＲａにＰＩＧＦ１２３～１４１を融合しても、活性が変化しないことを示す。（２７Ａ）ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の活性は、in vitroでＰＤＧＦ－ＢＢに類似している。低血清（１％、基礎条件）中でのＭＳＣの増殖を漸増用量のＰＤＧＦ－ＢＢＢＢ又はＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１で刺激した。７２時間後に、基礎条件に対する細胞数の増加を測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）。等濃度間でのボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ；ｎ．ｓ．＝有意差なし。（２７Ｂ）ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の阻害活性は、in vitroでＩＬ－１Ｒａに類似している。低血清（１％、基礎条件）中でのＭＳＣの増殖を、ＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下でのＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、漸増濃度のＩＬ－１Ｒａ又はＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１で刺激した。７２時間後に、基礎条件に対する細胞数の増加を測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）。ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１とＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１＋ＩＬ－１βの間、及び等濃度のＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１間でのボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ；ｎ．ｓ．＝有意差なし。＊＊＊Ｐ＜０．００１。（２７Ｃ）ＭＳＣを、増殖培地、又は、ＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）と、ＩＬ－１Ｒａ若しくはＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＢＭＰ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む骨形成誘導培地（ＯＩＭ）中で培養した。２１日後に、マトリックスの石灰化をアリザリンレッド染色により可視化した。代表的なウェルを示す（２ｃｍ２）。 図２８は、超親和性ＩＬ－１Ｒａの送達が、多くのＭ２様マクロファージが誘導することを示す。（２８Ａ）野生型マウスにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損（直径４．５ｍｍ）をフィブリンマトリックスで処置した。３日、６日及び９日後に、欠損領域におけるＭ２様マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＣＤ２０６＋）をフローサイトメトリーによって検出した。骨損傷後に抗炎症性マクロファージの割合が徐々に増加する。（２８Ｂ）野生型マウスにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損（直径４．５ｍｍ）を、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１又は生理食塩水（対照）を含有するフィブリンマトリックスで処置した。９日後に、欠損領域における抗炎症性マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＣＤ２０６＋）の割合（％）をフローサイトメトリーによって検出した。データは平均値±ＳＥＭ（時点又は条件ごとにｎ＝５）。ＩＬ－１Ｒａバリアントに対して生理食塩水を比較するボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ；Ｐ＜０．０１。 図２９は、ＥＣＭタンパク質に対するＰＩＧＦ－２、ＮＲＴＮ及びＡＲＥＧの結合親和性を示す。ＰＩＧＦ－２及びＡＲＥＧは、ＥＣＭタンパク質に対して高い親和性を示す。ＥＬＩＳＡアッセイによって得られた結果（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ）。１部位特異的結合モデルを使用して、ＫＤ値を測定：Ａ４５０ｎｍ＝Ｂｍａｘ＊［ＥＣＭタンパク質］／（ＫＤ＋［ＥＣＭタンパク質］）。ＫＤ値は表３に示す。 図３０は、フィブリンマトリックスからのＡＲＥＧ、ＰＩＧＦ－１及びＰＩＧＦ－２の放出を示す。２日後には６０％を超えるＰＩＧＦ－１が放出されたのに対して、ＰＩＧＦ－２及びＡＲＥＧの放出は、７日後で３０％未満であった（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ）。 図３１は、ＥＣＭタンパク質及びヘパラン硫酸に対する、ＰＩＧＦ－２、ＡＲＥＧ及びＮＲＴＮ断片の結合親和性を示す。ＰＩＧＦ－２１２３～１４１（ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤ）、ＮＲＴＮ１４６～１５７（ＲＲＬＲＱＲＲＲＬＲＲＥ）及びＡＲＥＧ１２６～１３８（ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲ）は、ＥＣＭタンパク質及びヘパラン硫酸に対して高い親和性を示す。ＥＬＩＳＡアッセイによって得られた結果（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ）。結果の概要を表５に示す。 図３２は、ＥＣＭタンパク質であるフィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びフィブリノーゲンに対するＡＲＥＧ１２６～１３８／ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＢＢの結合親和性を示す。 図３３Ａは、ＰＤＧＦ－ＢＢバリアントで処置したLeprｄｂ／ｄｂにおける全層創傷の処置の７日又は９日後の代表的な組織像（ヘマトキシリン及びエオシン染色）を示す。図３３Ｂは、組織切片の組織形態学的分析によって評価したＰＤＧＦ－ＢＢバリアントによる処置後の創傷閉鎖を示す。 図３４は、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１で処置した創傷の上皮バリア性を例示するための皮膚位相計の任意の単位の表面静電容量を示すグラフである。 図３５Ａは、組織切片の組織形態学的分析によって評価した、生理食塩水又はＩＬ－１Ｒａ ＰＩＧＦ１２３～１４１による処置の６日後の非糖尿病マウスにおける創傷閉鎖を示す。図３５Ｂは、生理食塩水又はＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１で処置した野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスにおける全層創傷の処置の７日又は９日後の代表的な組織像（ヘマトキシリン及びエオシン染色）を示す。
詳細な説明
本明細書及び特許請求の範囲では、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に明確な指示がない限り、示される複数の対象を含む。「ａ」（又は「ａｎ」）という用語並びに「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、同じ意味である。
さらに、本明細書では、「及び／又は」は、他のものを伴って又は伴わずに、特定する２つの特長又は構成要素のそれぞれの開示として受け取られるべきである。そのため、「及び／又は」という用語は、ここで、語句、例えば、「Ａ及び／又はＢ」では、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同じく、「及び／又は」という用語は、語句、例えば、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」では、以下の態様：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。
他に説明しない限り、この明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
単位、接頭辞及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）が認めた形式で表される。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。他に示さない限り、アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向で左から右に記述される。この明細書で用いた見出しは、全体として本明細書を参照することによって有され得る本発明のさまざまな側面又は態様の限定ではない。したがって、以下で定義する用語は、本明細書のその全体での言及によってより完全に定義される。
態様が「含む」という語を用いて記載される場合には常に、「からなる」及び／又は「から本質的になる」という用語で記載される、他の類似する態様も提供されることが理解される。
アミノ酸は、一般に公知の三文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨される一文字記号のいずれかで記述する。ヌクレオチドは、同じく、一般に認められた一文字コードで記述する。
この明細書では、「融合タンパク質」は、元々は別々のポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子の接続によって作出される融合遺伝子から作製されるタンパク質である。
この明細書では、「ポリペプチド」は、長さ、翻訳後修飾又は機能にかかわらず、２つ以上のアミノ酸の任意の配列を指す。ポリペプチドは、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含むことができる。ポリペプチドは、さまざまな標準的な化学的方法で修飾することもできる（例えば、アミノ酸は保護基で修飾できる；カルボキシル末端のアミノ酸は末端アミド基とすることができる；アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強する基で修飾できる；あるいは、ポリペプチドは、化学的にグリコシル化し、又は、他の修飾を行い、安定性若しくはin vivo半減期を増加させることができる）。ポリペプチドの修飾は、ポリペプチドへの別の構造（例．環状化合物又は他の分子）の結合を含むことができ、１つ以上のアミノ酸を変更された立体配置（すなわち、Ｒ若しくはＳ；又はＬ若しくはＤ）で有するポリペプチドを含むこともできる。
この明細書では、「ペプチド」は、１２～５０アミノ酸残基長、好ましくは、１２～４０、１２～３０、１２～２５又は１２～２４、より好ましくは、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４アミノ酸残基長のアミノ酸の任意の鎖を意味する。
インターロイキン－１受容体アンタゴニストについての代表的な配列を、配列番号４で示す。
ヒトインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）
ＲＰＳＧＲＫＳＳＫＭＱＡＦＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫＩＤＶＶＰＩＥＰＨＡＬＦＬＧＩＨＧＧＫＭＣＬＳＣＶＫＳＧＤＥＴＲＬＱＬＥＡＶＮＩＴＤＬＳＥＮＲＫＱＤＫＲＦＡＦＩＲＳＤＳＧＰＴＴＳＦＥＳＡＡＣＰＧＷＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹＦＱＥＤＥ（配列番号４）
インターロイキン－１受容体アンタゴニストの更なる代表的な配列を、図２５に示す（配列番号５、マウスＩＬ－１Ｒａ）。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、組織の構造を支持し、細胞にシグナル伝達能力を提供する。ＥＣＭは、発生及び組織修復において重要な役割を果たす。本発明は、ＩＬ－１Ｒａ及びＥＣＭタンパク質に特異的に結合するペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
特異的結合は、この用語が生物学分野において通常使用されるように、非標的組織と比較して高い親和性で標的に結合する分子を指し、一般に、複数の非共有結合的相互作用（例．静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合など）を含む。特異的結合相互作用は、抗体－抗原結合、酵素－基質結合及び特異的結合タンパク質－受容体相互作用によって特徴付けられ；そのような分子は、時々、それらの標的以外の組織に結合してもよいが、そのような結合は、特異性を欠くと言われ、特異的結合ではない。
この明細書では、ペプチドは、他のタンパク質に優先して、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びヘパラン硫酸からなる群から選択される１つ以上又は全ての細胞外マトリックスタンパク質に特異的に結合する。一態様では、１つ以上又は全てのＥＣＭタンパク質に特異的に結合するペプチドは、高親和性で、好ましくは、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満又は約１０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。
ＰＩＧＦは、複数のスプライスバリアントに存在する血管新生サイトカインである。ＰＩＧＦは、元々は胎盤において特定され、そこで、栄養膜の成長及び分化を制御すると考えられている。ＰＩＧＦは、初期胚発生の間に発現する。ＰＩＧＦは、絨毛栄養膜で発現することが示されているが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、絨毛膜板内の間葉起源の細胞で発現する。ＰＩＧＦは、心臓、肺、甲状腺、骨格筋及び脂肪組織を含むいくつかの器官で発現する。ＰＩＧＦは、単球によるＶＥＧＦ分泌の強力な刺激要因として作用し、健康な対象の末梢血単核細胞において、炎症促進性サイトカインであるインターロイキン－１β、インターロイキン－８、単球走化性タンパク質－１及びＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルを有意に増加させる。ＰＩＧＦは、循環造血前駆細胞及びマクロファージを腫瘍が成長する部位にリクルートすることによって腫瘍血管新生を誘導する。
ＥＣＭ結合ペプチド（下線部）を含むＰＩＧＦバリアントの代表的な配列を以下に示す。
胎盤増殖因子－２（ＰｌＧＦ－２）：
ＭＰＶＭＲＬＦＰＣＦＬＱＬＬＡＧＬＡＬＰＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳＡＧＮＧＳＳＥＶＥＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹＣＲＡＬＥＲＬＶＤＶＶＳＥＹＰＳＥＶＥＨＭＦＳＰＳＣＶＳＬＬＲＣＴＧＣＣＧＤＥＮＬＨＣＶＰＶＥＴＡＮＶＴＭＱＬＬＫＩＲＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴＦＳＱＨＶＲＣＥＣＲＰＬＲＥＫＭＫＰＥＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡＶＰＲＲ（配列番号６）
胎盤増殖因子－４（ＰｌＧＦ－４）：
ＭＰＶＭＲＬＦＰＣＦＬＱＬＬＡＧＬＡＬＰＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳＡＧＮＧＳＳＥＶＥＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹＣＲＡＬＥＲＬＶＤＶＶＳＥＹＰＳＥＶＥＨＭＦＳＰＳＣＶＳＬＬＲＣＴＧＣＣＧＤＥＮＬＨＣＶＰＶＥＴＡＮＶＴＭＱＬＬＫＩＲＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴＦＳＱＨＶＲＣＥＣＲＨＳＰＧＲＱＳＰＤＭＰＧＤＦＲＡＤＡＰＳＦＬＰＰＲＲＳＬＰＭＬＦＲＭＥＷＧＣＡＬＴＧＳＱＳＡＶＷＰＳＳＰＶＰＥＥＩＰＲＭＨＰＧＲＮＧＫＫＱＱＲＫＰＬＲＥＫＭＫＰＥＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡＶＰＲＲ（配列番号７）
ＰＩＧＦ－２のヘパリン結合ドメインは、ＰＩＧＦ１２３～１５２、ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡＶＰＲＲ、配列番号８に位置する。
図１（Ｂ）に示すように、配列番号１で示すアミノ酸配列は、フィブリノーゲン、並びに、細胞外マトリックスタンパク質であるフィブロネクチン、ビトロネクチン及びテネイシンＣに非常に強力に結合する。配列番号１で示すアミノ酸配列をＰＩＧＦ１２３～１４１という。
配列番号１で示すアミノ酸配列を含む配列番号８で示す断片及びバリアントは、第１の側面の融合タンパク質において使用してもよい。これらには、配列番号１で示すアミノ酸配列のオルソログが含まれる。
ＲＲＫＴＫＧＫＲＫＲＳＲＮＳＱＴＥＥ（配列番号９）－配列番号１のマウス同等物
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＫＲＥＫＱＲＰＴＤ（配列番号１０）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ７［イヌ（Canis lupus familiaris）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＫＰＴＤ（配列番号１１）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［ワウワウテナガザル（Hylobates moloch）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＫＤ（配列番号１２）－増殖因子アイソフォームＸ１［コモンマーモセット（Callithrix jacchus）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＫＲＤＫＱＲＰＴＤ（配列番号１３）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［マレーヒヨケザル（Galeopterus variegatus）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＫＲＥＫＱＫＰＴＤ（配列番号１４）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［フィリピンメガネザル（Carlito syrichta）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＫＲＥＫＱＲＨＴＤ（配列番号１５）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ３［カマイルカ（Lagenorhynchus obliquidens）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＫＲＥＫＱＲＰＲＤ（配列番号１６）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ３［ミーアキャット（Suricata suricatta）］
ＲＲＲＳＲＧＲＧＫＲＫＲＥＫＱＲＰＴＤ（配列番号１７）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［フロリダマナティー（Trichechus manatus latirostris）］
ＲＲＲＰＫＧＱＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰ（配列番号１８）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［スッポン（Pelodiscus sinensis）］
ＲＲＲＰＫＧＳＧＫＲＫＫＥＫＱＲＰＴＤ（配列番号１９）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［オオクビワコウモリ（Eptesicus fuscus）］
ＲＲＲＰＫＧＱＧＫＲＫＲＥＫＱＲＰ（配列番号２０）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［セイブニシキガメ（Chrysemys picta bellii）］
ＲＲＲＨＫＧＲＲＫＲＫＲＥＫＱＲＰＴＤ（配列番号２１）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［ジャイアントパンダ（Ailuropoda melanoleuca）］
ＲＲＲＰＫＶＲＧＫＲＫＲＥＫＱＫＰＴ（配列番号２２）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［ダマラランドデバネズミ（Fukomys damarensis）］
ＲＲＲＰＫＧＲＳＫＲＫＲＡＫＱＲＰＫＤ（配列番号２３）－胎盤増殖因子［ムラリスカベカナヘビ（Podarcis muralis）］
ＲＲＲＰＫＧＲＳＫＲＫＲＡＫＱＲＰＫＤ（配列番号２４）－胎盤増殖因子［ニワカナヘビ（Lacerta agilis）］
ＲＲＲＬＫＧＲＧＫＲＫＫＥＫＱＲＳＴＤ（配列番号２５）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［ジュウサンセンジリス（Ictidomys tridecemlineatus）］
ＲＲＲＰＫＶＲＧＫＲＫＲＥＮＱＫＰＴ（配列番号２６）－胎盤増殖因子アイソフォームＸ１［モルモット（Cavia porcellus）］
ＲＲＲＹＲＧＲＧＫＲＫＲＥＫＱＲＡＴＤ（配列番号２７）－胎盤増殖因子［ヒメハリテンレック（Echinops telfairi）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＲＫＲＫＥＫＱＲ（配列番号２８）－胎盤増殖因子様［デンキウナギ（Electrophorus electricus）］
ＲＲＲＮＫＧＳＧＫＲＫＫＥＫＱＲＰＴ（配列番号２９）－胎盤増殖因子［ウスイロオオヘラコウモリ（Phyllostomus discolor）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＧＥＫＫＲＲＫＤ（配列番号３０）－胎盤増殖因子［マガモ（Anas platyrhynchos）］
ＲＲＲＱＫＧＲＧＲＫＲＫＤＫＱＲＰＫＤ（配列番号３１）－胎盤増殖因子［パラモルミロプス キングスレイ（Paramormyrops kingsleyae）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＱＤＫＭＲ（配列番号３２）－胎盤増殖因子［フクロウオウム（Strigops habroptila）］
ＲＲＲＳＫＤＲＧＫＲＫＲＥＲＰＲＰＴ（配列番号３３）－胎盤増殖因子［カモノハシ（Ornithorhynchus anatinus）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＱＥＲＴＲ（配列番号３４）－胎盤増殖因子［アオボウシインコ（Amazona aestiva）］
ＲＲＲＰＲＧＲＧＲＫＲＫＥＫＱＲ（配列番号３５）－予測：血管内皮増殖因子Ａ様［ピラニア ナッテリー（Pygocentrus nattereri）］
ＲＲＲＦＫＧＲＧＫＲＫＲＤＫＱＲＴＫＤ（配列番号３６）－胎盤増殖因子［タスマニアデビル（Sarcophilus harrisii）］
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＫＲＥＫＱＲＰＴＤ（配列番号３７）－コンセンサス胎盤増殖因子配列（ヒト配列とは１アミノ酸のみ異なる）
ＰｌＧＦに由来する別のＥＣＭ結合ペプチドには、以下のアミノ酸配列又はその保存的バリエーション
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣ（配列番号３８） ＰｌＧＦ１２３－１４２
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨ（配列番号３９） ＰｌＧＦ１２３－１４３
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣ（配列番号４０） ＰｌＧＦ１２３－１４５
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧ（配列番号４１） ＰｌＧＦ１２３－１４６
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤ（配列番号４２） ＰｌＧＦ１２３－１４７
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡ（配列番号４３） ＰｌＧＦ１２３－１４８
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡＶ（配列番号４４） ＰｌＧＦ１２３－１４９
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡＶＰ（配列番号４５） ＰｌＧＦ１２３－１５０
ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡＶＰＲ（配列番号４６） ＰｌＧＦ１２３－１５１
が含まれる。
ＰｌＧＦに由来する別のアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）結合ペプチドには、以下のアミノ酸配列又はその保存的バリエーション
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮ（配列番号４７） ＡＲＥＧ１２６－１３９
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲ（配列番号４８） ＡＲＥＧ１２６－１４０
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫ（配列番号４９） ＡＲＥＧ１２６－１４１
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫ（配列番号５０） ＡＲＥＧ１２６－１４２
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫ（配列番号５１） ＡＲＥＧ１２６－１４３
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮ（配列番号５２） ＡＲＥＧ１２６－１４４
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰ（配列番号５３） ＡＲＥＧ１２６－１４５
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣ（配列番号５４） ＡＲＥＧ１２６－１４６
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮ（配列番号５５） ＡＲＥＧ１２６－１４７
ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡ（配列番号５６） ＡＲＥＧ１２６－１４８
ＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰ（配列番号５７） ＡＲＥＧ１２３－１４５
ＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰ（配列番号５８） ＡＲＥＧ１２４－１４５
ＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰ（配列番号５９） ＡＲＥＧ１２５－１４５
が含まれる。
本発明は、ＩＬ－１ＲをアンタゴナイズできるＩＬ－１Ｒａのオルソログ、機能的ホモログ若しくはバリアント、及び／又は、ＥＣＭ結合ペプチドのオルソログ、機能的ホモログ若しくはバリアントであるペプチドを含む融合タンパク質にも及ぶ。
この明細書で使用するオルソログは、その配列が非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物に由来する第１の側面の融合タンパク質において使用されるタンパク質又はペプチドの等価物である。
機能的ホモログ又はバリアントは、天然のカルボキシル末端配列でアミノ酸を挿入、欠失若しくは置換するか、又は、天然のカルボキシル末端配列の化学修飾によって誘導していてもよい。アミノ酸挿入バリアントとしては、アミノ及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに単一又は複数のアミノ酸の配列内挿入が挙げられる。挿入アミノ酸配列バリアントは、１つ以上のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されるものであるが、ランダム挿入も、得られる生成物の好適なスクリーニングを伴って可能である。欠失バリアントは、配列からの１つ以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。置換アミノ酸バリアントは、配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、別の２０の主要なタンパク質アミノ酸によって、又は非タンパク質アミノ酸によって置き換えられているものである。一態様では、置換は、保存的アミノ酸による。
保存的置換は、あるアミノ酸残基が、類似の生化学的特性、例えば、電荷、疎水性及びサイズを有する別の残基によって置換される場合である。
保存的置換は、以下のアミノ酸残基のクラス間のものを含む。
脂肪族－Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ
ヒドロキシル又は硫黄含有－Ｓ、Ｃ、Ｔ、Ｍ
芳香族－Ｆ、Ｙ、Ｗ
塩基性－Ｒ、Ｋ、Ｈ
酸及びそのアミド－Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ
一態様では、本発明の融合タンパク質において使用されるＩＬ－１Ｒａ又はＥＣＭ結合ペプチドのバリアントは、元の配列の機能が保持される条件で、天然のＩＬ－１Ｒａ又はＥＣＭ結合ペプチドと比較して、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの挿入、欠失又は置換を含んでいてもよい。
一態様では、アミノ酸は、グリシンを除き、Ｌ絶対配置のものである。また、Ｄ配置アミノ酸を使用してもよい。
使用するＩＬ－１Ｒａ又はＥＣＭ結合ペプチドは、当技術分野において利用可能な方法、例えばグリコシル化を使用して、循環半減期を増加させるためのポリマーへの結合、ペグ化又は他の化学修飾によって、貯蔵安定性、生物活性、循環半減期を改善するために、又は他の目的のために改変してもよいことを当業者は認識する。
配列番号４で示すヒトＩＬ－１Ｒａ配列、又は配列番号１、２若しくは３で示すのＥＣＭ結合ペプチドのバリアントは、好ましくは、明細書に開示する関連ヒト配列（参照配列）と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。通常、バリアントは、参照配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
場合によって、明細書に示す配列に対するペプチド又はタンパク質の同一性の割合を決定することが必要な場合がある。そのような場合では、同一性の割合は、ペプチド若しくはタンパク質、又は、ペプチド若しくはタンパク質の一部分の残基の数に対して測定される。例えば、９０％の同一性を有するポリペプチドは、より大きなポリペプチド又はタンパク質の一部分の可能性もある。
参照ポリペプチド配列に対する、アミノ酸配列の「同一性の割合（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性の割合を達成した後、任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮することなく、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列の同一性の割合を決定する目的のためのアライメントは、当技術分野における技術に含まれるさまざまな方法で、例えば、公的に入手可能であるコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はMegalign（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、達成できる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要なアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定できる。
本発明の融合タンパク質において、ＥＣＭ結合ペプチドは、ＩＬ－１ＲａのＣ末端若しくはＮ末端で、又はその近くで挿入される。Ｃ末端又はＮ末端でのＥＣＭ結合ペプチドの挿入は、融合タンパク質の安定性を変化させてもよい。
本発明の融合タンパク質において、ＩＬ－１Ｒａは、ＥＣＭ結合ペプチドに直接連結していてもよく、又はリンカーによって間接的に連結していてもよい。ある態様では、リンカーは、ＩＬ－１Ｒａ及びＥＣＭ結合ペプチドの間に存在する。好適なリンカーは、グリシン及びセリンを含み、例えば、ＧＧＳ若しくはＳＧＧ又はそれらの反復配列を含む。
好ましくは、リンカー配列は約１～２０種のアミノ酸、より好ましくは約１～１６種のアミノ酸を含む。リンカー配列は、ＩＬ－１Ｒａが単一の望ましくない配置で保持されないように、好ましくは可撓性である。
本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドドメインを更に含んでいてもよく、これは、好適な宿主細胞において、例えば細胞外分泌のプロセシングを可能にする。好ましくは、Ｎ末端シグナルペプチドドメインは、プロテアーゼ、例えば、シグナルペプチダーゼの切断部位を含み、発現の後又は間に除去されて、成熟タンパク質を得てもよい。
さらに、融合タンパク質は、認識／精製ドメイン、例えば、Ｓｔｒｅｐタグドメイン及び／又はポリＨｉｓドメインを含んでいてもよく、これは、Ｎ末端又はＣ末端に位置してもよい。一態様では、融合タンパク質はＮ末端にヒスチジンタグを含む。
特定の態様では、融合タンパク質は、直接、あるいはリンカー、好ましくは、ＧＧＳ若しくはＳＧＧ又はそれらの反復配列を含むリンカーを介して、配列番号１、２、３又は８～５９のいずれか１つで示すＥＣＭ結合ペプチドに連結された、配列番号２で示すＩＬ－１Ｒａ又はそれに対する配列同一性が少なくとも８０％であるバリアントを含む。ＥＣＭ結合ペプチドは、融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端にあってもよい。
特定の態様では、融合タンパク質は、場合によってはリンカー、例えばＳＧＧ、ＧＧＳ、ＳＧＧＳＧＧ又はＧＧＳＧＧＳを介して、配列番号４又は５で示すアミノ酸配列にそのＣ末端で連結された、配列番号１、２、３若しくは８～５９のいずれか１つで示すアミノ酸配列又はそれに対する配列同一性が少なくとも８０％であるバリアントを含む。
特定の態様では、融合タンパク質は、場合によってはリンカー、例えばＳＧＧ、ＧＧＳ、ＳＧＧＳＧＧ又はＧＧＳＧＧＳを介して、配列番号４又は５で示すアミノ酸配列にそのＮ末端で連結された、配列番号１、２、３若しくは８～５９のいずれか１つで示すアミノ酸配列又はそれに対する配列同一性が少なくとも８０％であるバリアントを含む。
特定の態様では、融合タンパク質は、場合によってはリンカー、例えばＳＧＧ、ＧＧＳ、ＳＧＧＳＧＧ又はＧＧＳＧＧＳを介して、配列番号４で示すアミノ酸配列にそのＣ末端で連結された、配列番号１で示すアミノ酸配列又はそれに対する配列同一性が少なくとも８０％であるバリアントを含む。
特定の態様では、融合タンパク質は、場合によってはリンカー、例えばＳＧＧ、ＧＧＳ、ＳＧＧＳＧＧ又はＧＧＳＧＧＳを介して、配列番号４で示すアミノ酸配列にそのＮ末端で連結された、配列番号１で示すアミノ酸配列又はそれに対する配列同一性が少なくとも８０％であるバリアントを含む。
好ましい態様では、融合タンパク質は、そのＣ末端にＰＩＧＦ１２３～１４１（配列番号１－太字）を有する配列番号４（ヒトＩＬ１－Ｒａ）を含み、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023530106000002
 のＩＬ１－Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を提供する。
好ましい態様では、融合タンパク質は、そのＣ末端にＰＩＧＦ１２３～１４１（配列番号１－太字）を有し、Ｎ末端にヒスチジンタグ（下線）を有する配列番号５で示すアミノ酸配列（マウスＩＬ１－Ｒａ）を含み、図２５に示す以下のアミノ酸配列（配列番号６１）：
Figure 2023530106000003
 のＩＬ１－Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を提供する。
一般に、本発明の融合タンパク質の調製は、明細書に開示する手順によって、及び例えば、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡのライゲーション、ｍＲＮＡの単離、好適な細胞へのＤＮＡの導入、宿主のトランスフォーメーション又はトランスフェクション、宿主の培養を含む認識されている組換えＤＮＡによって、達成できる。加えて、融合タンパク質は、カオトロピック剤、並びに、周知の電気泳動、遠心分離及びクロマトグラフの方法を使用して、単離及び精製できる。
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする、核酸配列、特に、ＤＮＡ配列を更に提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列は、染色体外複製に適したベクター、例えば、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ又はエピソームによって運ばれる。特に、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを使用して、明細書に記載の製造方法を容易にでき、かなりの量の融合タンパク質を得ることができる。ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されるタンパク質コード配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含有するベクターに挿入できる。各種の宿主－ベクター系を、タンパク質コード配列を発現させるために用いてもよい。これらとしては、ウイルス（例．ワクシニアウイルス、アデノウイルス）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例．バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；微生物、例えば、酵母ベクターを含有する酵母、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられる。用いられる宿主－ベクター系に応じて、多くの好適な転写及び翻訳エレメントのいずれか１つを使用してもよい。
一般に、本発明による好ましいＤＮＡベクターは、５’から３’の方向に、ＥＣＭ結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＬ－１Ｒａをコードする第１のヌクレオチド配列の導入のための第１のクローニング部位を含む、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチド配列を含む。
ほとんどの例では、融合タンパク質構成要素のそれぞれが「カセット」形式で提供されるＤＮＡベクターによってコードされることが好ましい。「カセット」という用語により、それぞれの構成要素が、標準的な組換え法によって別の構成要素に容易に置換されてもよいことを意味する。
本発明の融合タンパク質は、好ましくは、標準的な組換えＤＮＡによって産生される。得られたハイブリッドＤＮＡ分子は、好適な宿主細胞において発現されて、融合タンパク質が産生されてもよい。ＤＮＡ分子は、ライゲーション後に、コードされるポリペプチドの翻訳フレームが変更されない（すなわち、ＤＮＡ分子は、互いにインフレームでライゲーションされる）ように、５’から３’の方向に、互いにライゲーションされる。得られるＤＮＡ分子は、インフレームで融合タンパク質をコードする。
融合タンパク質の構成要素は、その意図される機能を行うことが可能なそれぞれ提供されるほぼ任意の順序で組織化されてもよい。
いくつかの戦略を利用して、本発明の融合タンパク質を発現させることができる。例えば、上記構築物を、公知の手段によって、例えば、構築物の挿入のためにベクターを切断する制限酵素の使用とそれに続くライゲーションによって、好適なベクターに組み込むことができる。次いで、遺伝子構築物を含有するベクターは、融合タンパク質の発現のために好適な宿主に導入される。好適なベクターの選択は、クローニングプロトコールに関連する要因に基づいて、経験的に行うことができる。例えば、ベクターは、利用される宿主に対して適合性であり、適したレプリコンを有していなければならない。さらに、ベクターは、発現されるべき融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を適応させることが可能でなければならない。好適な宿主細胞としては、真核及び原核細胞、好ましくは、容易に形質転換し、培地中で迅速な成長を示し得るそれらの細胞が挙げられる。具体的には、好ましい宿主細胞としては、原核生物、例えば、大腸菌、枯草菌など、及び真核生物、例えば、動物細胞及び酵母株、例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）が挙げられる。哺乳動物細胞は、一般に好ましく、特に、Ｊ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２－Ｏ又はＣＨＯが好ましい。他の好適な宿主としては、例えば、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９が挙げられる。従来の培養条件が利用される。次いで、安定にトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞株を選択できる。本発明による融合タンパク質を発現する細胞を、公知の手順によって決定できる。
所望の融合タンパク質をコードする核酸を、細胞をトランスフェクトするための標準的な技術によって、宿主細胞に導入できる。「トランスフェクトする」又は「トランスフェクト」という用語は、核酸を宿主細胞に導入するための全ての従来の技術を包含することが意図され、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入及び／又は組込みを含む。
本発明は、目的の融合タンパク質を単離するための生産方法を更に提供する。この方法は、調節配列に作動可能に連結された融合タンパク質をコードする核酸が導入された宿主細胞（例．酵母、真菌、昆虫、細菌又は動物細胞）を、培地において、生産スケールで成長させる。その後、目的の融合タンパク質は、回収した宿主細胞又は培地から単離される。標準的なタンパク質の精製法により、培地又は回収した細胞から融合タンパク質を単離できる。特に、精製法により、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター又は発酵槽を含む各種の実行から、所望の融合タンパク質を大規模に（すなわち、少なくともミリグラム単位で）発現及び精製できる。
発現させた融合タンパク質は、公知の方法によって単離及び精製できる。通常、培地は、遠心分離し、次いで、上清は、アフィニティー又は免疫アフィニティークロマトグラフィー、例えば、プロテインＡ若しくはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、又は発現させた融合タンパク質に結合するモノクローナル抗体の使用を含む免疫アフィニティープロトコールによって精製する。本発明の融合タンパク質は、公知の技術の適切な組合せによって分離及び精製できる。これらの方法としては、例えば、溶解度の差を用いる方法（例．塩析、溶媒沈殿）、分子量の相違を用いる方法（例．透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、電荷の相違を用いる方法（例．イオン交換カラムクロマトグラフィー）、特異的な親和性を用いる方法（例．アフィニティークロマトグラフ）、疎水性の相違を用いる方法（例．逆相高速液体クロマトグラフ）、等電点の相違を用いる方法（例．等電点電気泳動）、金属アフィニティーカラム（例．Ｎｉ－ＮＴＡ）が挙げられる。
本発明の融合タンパク質は、実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質は、天然でそれが付随する細胞置換成分から単離され、その結果、融合タンパク質は、好ましくは、少なくとも８０％又は９０％～９５％（w/w）の均一性で存在する。少なくとも９８～９９％（w/w）の均一性を有する融合タンパク質は、多くの薬学的、臨床及び研究適用のために最も好ましい。実質的に精製されると、融合タンパク質は、治療のために、混入物を実質的に含むことはできない。部分的に又は実質的な純度まで精製されると、可溶性融合タンパク質は、治療的に、又は、明細書に記載のin vitro若しくはin vivoアッセイを行う際に使用できる。実質的な純度は、各種の標準的な技術、例えば、クロマトグラフィー及びゲル電気泳動によって決定できる。
本発明による融合タンパク質は、必要に応じて薬学的に許容される担体又は賦形剤と一緒に、医薬組成物中で投与してもよい。本発明による融合タンパク質は、必要に応じて動物への投与のために好適な担体又は賦形剤と一緒に、獣医学組成物中で投与してもよい。
医薬の希釈剤、賦形剤、増量剤又は担体（薬学的に許容される担体ともいう）は、投与の形態に応じ、及び従来の慣行と一致するように、好適に選択される。
薬学的に許容される担体又は賦形剤を使用して、明細書の記載の態様を送達してもよい。賦形剤は、治療剤のための希釈剤又は媒体として使用する不活性物質を指す。薬学的に許容される担体は、一般に、化合物を治療のため又は製品として有用にするために、化合物と共に使用される。一般に、任意の物質について、担体は、動物への送達のために物質と組み合わされる材料である。従来の医薬担体である、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であってもよく、又は望ましくてもよい。場合によって、担体は、例えば、液体送達のために不溶性化合物を可溶化するために、送達に必須であり；その活性を保存するための物質のｐＨの制御のための緩衝剤；又は貯蔵容器中での物質の損失を防止するための希釈剤である。他の場合では、しかしながら、担体は、便宜上、例えば、より好都合な投与のための液体である。明細書に記載した化合物の薬学的に許容される塩は、当業者に公知の方法により合成してもよい。薬学的に許容される物質又は組成物は、混入物を含まないように高度に精製され、無菌であり、生体適合性である。それらは、患者への投与に適した担体、塩又は賦形剤を更に含んでいてもよい。担体として水の場合では、水は、高度に精製され、混入物、例えば、エンドトキシンを含まないように処理される。
送達可能な化合物は、経口、直腸、局所、静脈内注射、関節内注射、非経口投与、鼻腔内又は気管投与に好適な形態で作製してもよい。担体としては、固体又は液体が挙げられ、担体の種類は、投与の種類に基づいて選択される。好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤、流動化剤及び溶融剤が、例えば、丸剤のための担体として含まれていてもよい。例えば、活性構成要素は、経口の非毒性の薬学的に許容される不活性担体、例えば、ラクトース、ゼラチン、寒天、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなどと組み合わせることができる。化合物は、固体剤形（例．カプセル剤、錠剤及び散剤）で、又は液体剤形（例．エリキシル剤、シロップ剤及び懸濁剤）で、経口投与できる。活性化合物は、無菌の液体剤形で非経口投与することもできる。また、生理学的なｐＨ又はオスモル濃度を達成するための緩衝液を使用してもよい。
本発明は、一側面では、状態の処置に関する。「処置する」及び「処置」という用語は、この明細書では、症状の重症度及び／又は頻度の低減、症状及び／又は根本原因の排除、症状（予防的）及び／又はそれらの根本原因の出現の予防、並びに損傷の改善又は修正を指す。そのため、例えば、状態を「処置する」本方法は、罹患しやすい個体における状態の予防、臨床症状を示す個体における状態の処置及び有益な効果のための健康な個体の処置を包含する。
「予防的」、「予防の」又は「予防」療法は、この明細書では、状態に陥る可能性があるが、まだ陥ったしたとは診断されていない対象における、状態の発生を予防すること、又は状態のその後の進行を改善することを含む。
この明細書では、「状態」は、正常な健康からの逸脱を指し、疾患、障害、欠損又は傷害（例．外傷による傷害）、及び、加齢、炎症、感染若しくは遺伝性障害に起因する又は環境に起因する悪化を含む。
ＩＬ－１Ｒａ投与が有益である状態は先行技術に開示されている。それらのうち、本発明に従って処置されてもよい状態は、一般に、組織再生を必要とするもの、特に、軟骨細胞、コラーゲン、プロテオグリカン、軟骨又は筋肉量の形態又は機能の増加が望ましいものである。
軟骨細胞は、軟骨においてのみ見いだされる細胞である。それらは、主にＩＩ型コラーゲン、プロテオグリカン及びエラスチンから構成される軟骨マトリックスを産生及び維持する。
軟骨は、骨の間の関節、胸郭、耳、鼻、肘、膝、足首、気管支及び椎間板の間の間節を含む、ヒト及び動物の身体の多くの領域において見いだされる柔軟性結合組織である。他の結合組織とは異なり、軟骨には、血管がなく、そのため修復能力は限定されている。軟骨細胞が小窩に結合しているので、それらは、損傷領域に遊走できない。したがって、軟骨が損傷すると、治癒は困難で遅い。
この開示の目的のために、処置できる状態には、軟骨組織又は軟骨細胞の修復又は新たな成長から利益を得る軟骨細胞関連状態が含まれる。しかし、これは、排他的ではなく、明細書で開示する方法の利益を強調するためのものである。
軟骨細胞関連状態は、軟骨損傷を含む関節障害を含み、脛骨プラトーの復元によって引き起こされる軟骨損傷を含む。
骨関節炎の原因は多因子性であり、体形、遺伝的特徴及びホルモン状態が含まれる。
骨関節炎では、骨を覆う軟骨（関節軟骨－硝子軟骨のサブセット）が薄くなり、最終的に、完全に摩耗し、「骨対骨」関節、動きの低下及び疼痛をもたらす。現在の治療法は、疼痛を低減すること及び関節機能を増加させることを目的としている。非侵襲性介入、例えば、運動及び体重減少が、処置の第一選択肢であり、これに抗炎症薬物療法が続く。後者の処置は、症状は軽減するものの、疾患の特徴の変化をもたらす過程を阻害せず、実際には、関節の破壊を加速する可能性がある。これらの処置の失敗は、通常、外科的介入（関節形成術）に至る。関節置換術は、患者の可動性を回復させること及び疼痛を減少させることに関して、非常に成功する。しかし、摩耗した残屑又は生体力学的に関連する骨量減少に起因する骨溶解及び無菌的緩みの結果としての失敗は、これらのインプラントの寿命を制限し、患者の病的状態及び失敗率の増加を伴い、高いリスクの再置換術を必要とする。本発明は、骨関節炎の処置を提供する。
外傷性の破裂又は剥離により、膝の軟骨は、高頻度で損傷され、膝軟骨補充療法により部分的に修復できる。
軟骨形成不全では、乳児期及び小児期の長骨の骨端板における軟骨細胞の増殖の低減は、低身長症をもたらす。
肋軟骨炎は、肋骨における軟骨の炎症であり、胸痛を引き起こす。
脊椎円板ヘルニア形成では、椎間板の非対称の圧迫が、嚢状の板を破裂させ、その軟性内容物のヘルニア形成を引き起こす。ヘルニアは、多くの場合、隣接する神経を圧迫し、背痛を引き起こす。
再発性多発性軟骨炎では、軟骨、特に鼻及び耳の軟骨の破壊、おそらく自己免疫が、外観を損なわせる。死は、喉頭のその硬性の喪失及び崩壊としての窒息によって引き起こされる。
良性又は悪性のいずれかの軟骨組織で構成される腫瘍が発生することがある。
本発明は、上記の状態それぞれの処置を提供する。これらの状態のいずれかは、本発明の融合タンパク質を用いるこの明細書で開示する方法により、新たな軟骨又は軟骨細胞を修復すること又は成長させることによって処置できる。
本発明に従って処置されてもよい他の状態としては、軟骨軟化症の膝蓋骨；軟骨軟化症；軟骨肉腫－頭頸部；軟骨肉腫；肋軟骨炎；内軟骨腫；硬直母趾；臀部唇裂；離断性骨軟骨炎（ＯＣＤ）；骨軟骨異形成症；軟骨膜炎；多発性軟骨炎；又は半月板損傷が挙げられる。
本発明は、軟骨性マトリックスの維持において既存の軟骨細胞と軟骨の機能を改善する手段を提供する。それはまた、軟骨細胞と軟骨の成長を促進する手段を提供し、インプラント又はプロステーシスと共に、又はこれらはなしで、軟骨性マトリックスを提供する。一態様では、本発明は、例えば軟骨の発生又は修復のための細胞の足場又は組織工学における軟骨の形成又は修復を促進して、鼻、隔膜、耳、肘、膝、足首及び無脊椎動物円板（invertebrate discs）を含む組織内で新たな軟骨組織を成長させる手段を提供する。
一側面では、融合タンパク質は、インプラントなどと共に投与して、明細書で開示する状態を処置するためのインプラントと相互作用してもよい軟骨細胞又は軟骨組織を産生又は修復する。この明細書では、「相互作用する」は、所望の生物学的転帰を達成するための構成要素の併用効果を指す。
理論によって拘束されることは望まないが、インプラントが軟骨細胞と「相互作用する」場合、状態の処置におけるインプラントの効果は、インプラント単独の効果よりも大きく、相乗的であってもよい。
一側面では、融合タンパク質は、増殖因子と組み合わせて投与し、増殖因子の再生活性を増強する又は増殖因子刺激に対する細胞の感受性低下を低減する。融合タンパク質及び増殖因子による処置の効果は、それぞれの処置の相加効果よりも高くてもよく、相乗的であってもよい。
この明細書では、「増殖因子」は、生存、増殖、遊走及び分化を含む細胞の機能の多くの側面を調節するタンパク質である。増殖因子は、細胞がニューロン又はグリア系列の前駆体から分化する際の細胞の運命を決定する。加えて、胚発生の間に、増殖因子は、ニューロンの生存を調節し、細胞の運命を決定し、適した接続性を確立するために極めて重要である。増殖因子は、通常、細胞間のシグナル伝達分子として作用する。それらは、多くの場合、細胞の分化及び成熟を促進し、この作用は、増殖因子間で異なる。例えば、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）は、造骨性分化を増強するが、線維芽細胞増殖因子及び血管内皮増殖因子は、血管分化（血管新生）を刺激する。
増殖因子の再生活性を増強する又は増殖因子刺激に対する細胞の感受性低下を低減するために、本発明の融合タンパク質と組み合わせて投与してもよい増殖因子としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ及び骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、特に、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＶＥＧＦ－Ａ及びＢＭＰ－２が挙げられる。
この態様では、本発明によって提供される「所望の生物学的転帰」は、好ましくは、創傷治癒、又は、骨若しくは軟骨の修復及び成長、より好ましくは、骨関節炎の症状の除去、最も好ましくは、骨関節炎の処置及び予防である。
本発明の融合タンパク質は、筋肉の成長を促進するため、傷害、外傷若しくは使用からの筋肉の回復を改善するため、筋力を改善するため、運動耐容能を改善するため、筋肉の割合を増加させるため、筋肉量を増加させる、筋消耗を減少させる、筋肉修復を改善するために使用でき、又は、それを必要とする対象において、消耗性障害（例．悪液質及びホルモン欠乏症、食欲不振、ＡＩＤＳ消耗症候群、サルコペニア、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動神経疾患、神経筋接合部の疾患、炎症性ミオパチー）を含む筋肉の障害を処置するために有用であってもよいことも企図される。
本発明は、筋肉の障害及び筋肉の変性の特徴に関連する疾患の処置に及ぶ。そのような障害の非限定的な例は、さまざまな神経筋疾患、心不全、収縮筋又は膀胱筋といった単一の筋肉の衰弱、血管平滑筋細胞の収縮機能による問題で引き起こされる低血圧又は高血圧、インポテンス／勃起不全、失禁、ＡＩＤＳ関連筋力低下、並びに全身の及び加齢関連の筋萎縮症である。
筋肉の障害は、特に、筋消耗が主要な症状の１つである筋消耗状態又は障害を含む。
「筋消耗」は、筋肉量の進行性の喪失、並びに／又は運動を制御する骨格筋若しくは随意筋、心臓を制御する心筋及び平滑筋を含む筋肉の進行性の衰弱及び変性を指す。一態様では、筋消耗状態又は障害は、慢性筋消耗状態又は障害である。「慢性筋消耗」は、慢性的な（すなわち、長期間にわたって持続する）筋肉量の進行性の喪失、並びに／又は筋肉の慢性的な進行性の衰弱及び変性と定義される。慢性筋消耗は、老化過程の一部として生じてもよい。
筋消耗の間に生じる筋肉量の喪失は、筋肉タンパク異化による筋肉タンパク質の崩壊又は分解によって特徴付けることができる。タンパク異化は、タンパク質分解の異常に早い速度、タンパク質合成の異常に遅い速度又はその組合せのために生じる。タンパク異化又は枯渇が、高度のタンパク質分解又は低度のタンパク質合成によって引き起こされるかどうかにかかわらず、筋肉量の減少及び筋消耗に至る。「異化」という用語は、当技術分野におけるその一般に公知の意味、具体的には、代謝のエネルギー燃焼形態を有する。
筋消耗は、年齢、病状、疾患、状態又は障害の結果として発生する可能性がある。一態様では、病状、疾病、疾患又は状態は、慢性である。別の態様では、病状、疾病、疾患又は状態は、遺伝性である。別の態様では、病状、疾病、疾患又は状態は、神経性である。別の態様では、病状、疾病、疾患又は状態は、感染性である。この出願では、病状、疾患、状態又は障害は、筋肉量の消耗（すなわち、喪失）、すなわち、筋消耗障害を直接的に又は間接的に生じる。
関節又は骨格の変形を伴う神経筋疾患の処置も考えられる。一態様では、対象における筋消耗は、対象が筋ジストロフィー、筋萎縮又はＸ連鎖性球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）に罹患した結果である。
筋ジストロフィーは、運動を制御する骨格筋又は随意筋の進行性の衰弱及び変性によって特徴付けられる遺伝性疾患である。心臓の筋肉及び一部の他の不随意筋も、一部の筋ジストロフィーの形態で影響を受ける。筋ジストロフィー（ＭＤ）の主要な形態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー及びエメリー－ドレイフス型筋ジストロフィーである。
筋ジストロフィーは、全ての年齢の人に影響を及ぼす可能性がある。乳児期及び小児期に最初に現れる形態もあれば、中年以後まで現れない形態もある。デュシェンヌ型ＭＤは、最も一般的な形態であり、通常、小児に影響を及ぼす。筋緊張性ジストロフィーは、成人における最も一般的なこれらの疾患である。
筋萎縮（ＭＡ）は、筋肉の痩せ細り又は縮小、及び筋肉量の減少によって特徴付けられる。例えば、ポリオ後ＭＡは、ポリオ後症候群（ＰＰＳ）の一部として生じる筋消耗である。萎縮は、衰弱、筋肉疲労及び疼痛を含む。別の種類のＭＡは、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ－ケネディ病としても公知）である。この疾患は、Ｘ染色体上のアンドロゲン受容体遺伝子の欠損から生じ、男性のみに影響を及ぼし、その発症は成人期である。
サルコペニアは、高齢者及び慢性的に体調がすぐれない患者を苦しめる衰弱性疾患であり、筋肉の量及び機能の喪失によって特徴付けられる。さらに、除脂肪量の増加は、病的状態の減少、及びある特定の筋消耗障害についての死亡率に関係する。加えて、他の状況及び状態が筋消耗障害に関係しており、それを引き起こす可能性がある。例えば、慢性下背部痛の重度の症例において、傍脊柱筋消耗が存在することが示されている。
筋消耗及び他の組織消耗は、高齢にも関連している。老齢期の全身衰弱は筋消耗に起因すると考えられている。身体が老化するにつれて、骨格筋が線維性組織に置き換わる割合が増加する。その結果、筋肉の力、性能及び耐久性の著しい低減する。
疾病や傷害、又は例えば手足が動かない場合の生活の不活発に起因する長期入院は、筋消耗又は他の組織の消耗につながる可能性もある。研究によると、傷害、慢性疾病、熱傷、外傷又はがんを患い、長期間入院している患者では、長期的な片側性筋萎縮と体重の減少があることが示されている。
中枢神経系（ＣＮＳ）に対する傷害又は損傷は、筋消耗及び他の消耗性障害にも関連する。ＣＮＳに対する傷害又は損傷は、例えば、疾患、外傷又は化学物質によって引き起こされる可能性がある。その例は、中枢神経傷害又は損傷、末梢神経傷害又は損傷、及び脊髄傷害又は損傷である。一態様では、ＣＮＳ損傷又は傷害には、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、怒り（うつ）；食欲不振、神経性食欲不振、加齢及び／又はアサーティブネス（うつ）に関連する食欲不振を含む。
別の態様では、筋消耗又は他の組織（例．腱又は靱帯）消耗は、アルコール依存症の結果であってもよい。
一態様では、処置される消耗性疾患、障害又は状態は、慢性疾病に関連する。
一部の態様では、この態様は、任意の消耗性障害を処置することを対象とし、消耗性障害は、筋消耗、体重減少、栄養障害、飢餓又は組織量の喪失に起因する機能の消耗若しくは消失を反映するものであってもよい。
一部の態様では、消耗性疾患又は障害、例えば、栄養障害、結核、ハンセン病、糖尿病、腎臓疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、がん、末期腎不全、肺気腫、骨軟化症又は心筋症によって引き起こされる悪液質を、本発明の方法によって処置してもよい。
一部の態様では、消耗は、エンテロウイルス、エプスタインバーウイルス、帯状疱疹、ＨＩＶ、トリパノソーマ、インフルエンザ、コクサッキー、リケッチア、旋毛虫、住血吸虫又はマイコバクテリアによる感染に起因する。
悪液質は、疾患によって又は疾病の副作用として引き起こされる衰弱及び体重減少である。心臓悪液質、すなわち、心筋及び骨格筋の筋肉タンパク質の消耗は、うっ血性心不全の特徴である。がん悪液質は、固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を有する患者で生じる症候群であり、脂肪組織及び除脂肪筋肉量の大量の枯渇を伴う体重減少が認められる。
悪液質は、ＣＯＰＤ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連ミオパチーにおいてもみられ、及び／又は、筋力低下／消耗は、ＡＩＤＳの比較的一般的な臨床兆候である。ＨＩＶ関連ミオパチー又は筋力低下若しくは筋消耗を有する個体は、通常、著しい体重減少、全身性又は近位筋衰弱、圧痛及び筋萎縮を経験する。
未処置の筋消耗障害は、健康に深刻な影響を及ぼす可能性がある。筋消耗の間に生じる変化は、身体の能力不足及び有害な健康効果をもたらす衰弱した身体的状態に至る可能性がある。
そのため、筋萎縮は、動かなくなった患者のリハビリテーションを深刻に制限する可能性がある。慢性疾患に起因する筋消耗は、運動機能の早期喪失に至る可能性があり、疾患に関連する病的状態のリスクを増加させる可能性がある。不使用に起因する筋消耗は、既に加齢に伴う筋肉の機能と量の不足に苦しんでいる可能性がある高齢者で特に深刻な問題で、持続的な障害と早期の死亡、骨折率の増加につながる。状態の臨床上の重要性にもかかわらず、この状態を予防又は反転させる治療法はほとんどない。本発明者らは、本発明の融合タンパク質が、上述した状態に関連する筋消耗又は筋委縮の予防、修復及び処置に使用できることを提案する。
好ましい態様では、融合タンパク質は熱傷及び敗血症を処置するために使用される。
本発明は、他の側面では、筋肉量、筋力、筋肉機能又は全体的な体格の増加を引き起こすために健康な個体を処置することも企図する。
「筋肉量の増加」という用語は、処置前の筋肉量の量と比較して、処置後の多く筋肉が存在すること指す。
「筋力の増加」という用語は、処置前と比較して、処置後に大きな力を生み出す能力を有する筋肉が存在することを指す。
「筋肉機能の増加」という用語は、処置前と比較して、処置後に多くの機能を有する筋肉が存在することを指す。
「運動耐容能の増加」という用語は、治療前に必要とされたものと比較して、治療後の運動の間の休憩が少ない状態で運動する能力を指す。
筋肉は、力の起源として主に機能する身体の組織である。身体には３種類の筋肉が存在する：ａ）骨格筋－運動、姿勢及び呼吸の維持を可能にする骨格に委ねられる力を発生する原因となる横紋筋；ｂ）心筋－心臓の筋肉；並びにｃ）平滑筋－動脈及び腸の壁にある筋肉。本発明の方法は、骨格筋に特に適用可能であるが、心筋及び／又は平滑筋に対するいくつかの効果を有していてもよい。骨格筋は、骨、筋肉及び腱の間の相互作用も含み、筋繊維及び関節を含む。
好ましい態様では、本発明の融合タンパク質は、状態、例えば、皮膚創傷治癒（糖尿病性創傷及び潰瘍を含む）、皮膚熱傷、骨欠損及び骨折、骨粗しょう症、骨関節炎、脊椎固定術、足首固定術、筋肉及び腱欠損、軟骨欠損及び変性、虚血組織（虚血肢、虚血心臓組織、及び脳卒中後の虚血脳を含む）を処置するために使用される。
本発明による融合タンパク質は、任意の好適な経路で投与してもよく、当業者は、処置される状態及び対象のために最も好適な経路及び用量を容易に決定できる。融合タンパク質は、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント及び媒体を有する投薬単位調合物で、経口、舌下、頬側、鼻腔内、吸入、経皮、局所、関節内又は非経口で投与してもよい。非経口という用語は、この明細書では、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、頭蓋内の注射又は注入法を含む。
一態様では、融合タンパク質は、インプラント、医療デバイス若しくはプロステーシスと共に、又はそれらに含めて投与してもよい。インプラントは、生分解性インプラント若しくは徐放性デポー、又は当業者に公知の他のインプラントであってもよい。そのような態様は、筋肉の外傷又は損傷後の筋成長及び筋力を改善するために特に適切である。一態様では、融合タンパク質は、ＩＬ－１Ｒａを、その意図される作用部位、例えば、創傷に送達すること、及び担体又は送達媒体の不存在下でのＩＬ－１Ｒａの持続放出を提供できる。
熱傷を処置するために使用される場合、融合タンパク質は、経口、局所又は非経口投与してもよい。
融合タンパク質を含む組成物は、治療有効量で投与されるべきである。この明細書では、「有効量」は、所望の生物学的転帰を達成して低減するために十分である投薬量である。所望の生物学的転帰は、筋肉量の増加、筋力の増加、筋成長、又は熱傷若しくは創傷の処置を含む任意の治療利益であってもよい。そのような改善は、除脂肪体重及び脂肪体重（例．デュアル線スキャニング解析）、筋力又は筋細胞の形成を測定する方法を含む各種の方法によって測定されてもよい。
代表的な一日投薬量は、送達の様式に応じて、約１μｇ／ｋｇ～最高１００ｍｇ／ｋｇ以上であってもよい。
融合タンパク質の投薬量は、１日当たり約０．１ｍｇ～約５０ｍｇであってもよく、又は１日当たり約０．２５ｍｇ～約１ｍｇであってもよい。製剤を製造するために担体材料と組み合わされてもよい融合タンパク質の量は、処置される対象及び投与方法に応じて変化する。例えば、ヒトに投与する調合物は、約１ｍｇ～１ｇの融合タンパク質を、総組成物の約５～９５％まで変更されてもよい適切な及び従来の量の担体材料と共に含有していてもよい。投薬単位形態は、一般に、約０．１ｍｇ～５０ｍｇの活性成分を含有する。
しかし、特定の対象のための具体的な用量が、利用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、体調、性別、食事、投与の回数、投与の経路、排出率、薬物の組合せ及び治療を受ける疾患の重症度を含む各種の要因に依存することが理解される。
投薬スケジュールは、融合タンパク質の半減期又は対象の重症度に応じて調整できる。
一般に、組成物は、投与後の最長期間にわたって循環するペプチドのレベルを最大化するために、ボーラス用量として投与される。持続注入はまた、ボーラス用量後に使用してもよい。
一態様では、融合タンパク質の単一用量は、生体材料と組み合わせて局所送達される。必要により、融合タンパク質の更なる用量が、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、６か月又は１年以上から選択される期間後に送達されてもよい。
本発明の処置は、それを必要とする患者に好適である。「対象」は、この明細書では、ヒト及び非ヒト動物を指す。
「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類（特に、高等霊長類）、ヒツジ、ウマ、イヌ、げっ歯動物（例．マウス又はラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、及び非哺乳動物、例えば、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。一態様では、対象は、実験動物、疾患モデルとして好適な動物又は畜産動物（食物源としての動物）であり、この場合、除脂肪筋肉量を増加させるための方法は、産業に非常に有益である。加えて、方法は、競走馬において特に重要である。
一態様では、処置は、ヒト、特に、成人、１１～１６歳、４～１０歳の小児、１８月～４歳までの幼児、１８月までの乳児のためのものである。処置はまた、高齢者又は衰えたヒトのために行ってもよい。
一態様では、本発明の処置は、同じ状態のための別の処置を補充するために使用される。例えば、融合タンパク質は、関節及び筋肉の修復のための幹細胞療法を補充するために使用できる。
明細書に記載の発明は、本開示のある特定の側面及び態様を単に例示するために含まれる以下の実施例を参照して容易に理解され、いかなる様にも本発明を限定することを意図しない。
実施例１
ＰＩＧＦ１２３～１４１に融合したＩＬ－１ＲａはＥＣＭ構成成分に対する超親和性を示す
ＩＬ－１Ｒ１が欠損した糖尿病マウスは、はるかに速く創傷を閉鎖することから、発明者らは、ＩＬ－１Ｒａを創傷に直接送達し、創傷閉鎖を促進することを提案した。陽性対照として、慢性創傷の治癒を促進することが周知である臨床的に重要な増殖因子であるＰＤＧＦ－ＢＢを使用した。ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢの送達を最適化するために、それらを胎盤増殖因子のヘパリン結合ドメインに由来するＥＣＭ結合配列（ＰＩＧＦ１２３～１５２）に融合させることによって、組換えタンパク質の内在性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分に対する親和性を増強することを選択した。
最初に、ＰＩＧＦ１２３～１５２の７つの切断バージョンを生成し、一般的なＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びフィブリノーゲン）及びヘパラン硫酸に対するそれらの結合について試験することによって、ＰＩＧＦ１２３～１５２に由来する最も短いＥＣＭ結合配列を決定した。
組換えＰＩＧＦ断片の生成及び精製
ＰＩＧＦ断片の配列を発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ－１（GE healthcare）にクローニングした。タンパク質を精製するために、ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ）を断片のＣ末端に融合した。この断片を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させた。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌの溶原ブロス（ＬＢ）培地中で、細菌を一晩培養した。次いで、培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２５０ｍｌのＬＢ培地で１：１００に希釈し、３７℃で３時間培養した。１ｍＭのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを用いてタンパク質産生を２５℃で一晩誘導した。次いで、培養物を４，０００ｇで１０分間遠心分離した。１錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）、５０ｍｇのリゾチーム（Roche）を含む冷ＰＢＳ中にペレットを再懸濁させた。この溶液を最大振幅で２０秒間の超音波処理を３～４サイクル行った。Benzonase（登録商標）（５００Ｕ、Millipore）、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び１％のTtriton（登録商標）X-100を添加し、溶液を４℃で３０分間、ローター上でインキュベートした。溶解液を１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を０．２２μｍのフィルターでろ過した。最初にGSTrap HP 5ml、次にHisTrap HP 5ml（GE healthcare）アフィニティーカラムを用いて、タンパク質を精製した。ＡＴＰ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．４）を使用して、シャペロンタンパク質を除去した。Triton（登録商標）X-114緩衝液（０．１％のTriton（登録商標）X-114を含むＰＢＳ）を使用して、リポ多糖を除去した。最終タンパク質溶液をＰＢＳに対して透析し、０．２２μｍのフィルターでろ過した。断片は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって純度が９９％を超えることを確認し、－８０℃で保存した。
ＰＩＧＦ断片のＥＣＭタンパク質への結合
ＥＬＩＳＡプレート（96-Well Medium Binding, Greiner bio-one）を、ＰＢＳ中１００ｎＭのヒト血漿フィブロネクチン（Sigma）、ヒトビトロネクチン（Peprotech）、ヒトテネイシンＣ（R&D Systems）又はヒトフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories）で、３７℃にて１時間コーティングした。ウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ、０．０５％のTween（登録商標）20を含むＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ－Ｔ中１％のＢＳＡで室温にて１時間ブロッキングした。次いで、ウェルを、（０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中の）１００ｎＭのＧＳＴ融合ＰＩＧＦ断片と室温で１時間インキュベートした。ＧＳＴ（１００ｎＭ）を陰性対照として使用した。ウェルを、洗浄緩衝液で３回洗浄し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中の０．１μｇ／ｍｌのＧＳＴに対するＨＲＰコンジュゲート抗体と、室温で４５分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、テトラメチルベンジジン基質により検出し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＰＩＧＦ断片のヘパラン硫酸への結合
ヘパリン結合プレート（Corning, #354676）を、２５μｇ／ｍｌのヘパラン硫酸（Sigma-Aldrich, H7640）で室温にて一晩コーティングし、０．２％のゼラチン及び０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で室温にて１時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＡｃ、０．２％のTween（登録商標）20、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。ＧＳＴ融合ＰＩＧＦ断片（０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ中の１００ｎＭ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、結合したＧＳＴ断片をＧＳＴに対するＨＲＰコンジュゲート抗体（０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中の０．１μｇ／ｍｌ；GE healthcare, RPN1236V）を用いて検出した。ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、テトラメチルベンジジン基質により検出し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
本発明者らは、ＥＣＭ結合配列の短いバージョンであるＰＩＧＦ１２３～１４１が、ヘパラン硫酸だけでなく試験を行った全てのＥＣＭタンパク質に強力に結合することを見いだした（図１Ａ、Ｂ）。次いで、ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢのＣ末端をＰＩＧＦ１２３～１４１で改変し、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を生成した（図１Ｃ）。
組換えタンパク質の生成及び精製
ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を、それらのＮ末端に６×ヒスチジンタグ及びＣ末端にＰＩＧＦ１２３～１４１配列を有するように設計した。組換えタンパク質をｐＥＴ－２２ｂ（Novagen）を使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で生成した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地中で、細菌を一晩培養した。次いで、培養物を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１ＬのＬＢ培地で１：１００に希釈し、３７℃で３時間インキュベートした。１ｍＭのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを用いてタンパク質産生を２５℃で一晩誘導した。次いで、培養物を４，０００ｇで１０分間遠心分離した。タンパク質産生及び細菌溶解の後に、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の可溶性画分を、キレートＳＦＦ（Ｎｉ）カラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーにおいて、大量のTriton（登録商標）X-114洗浄剤（０．１％ v/v）を用いて精製し、エンドトキシンを除去した。可溶化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、６ＭのＧｕＨＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．５）を使用して、ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を封入体から抽出した。次いで、抽出したタンパク質を、リフォールディング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧ、ｐＨ８．２）中に、４℃で４日間かけて１滴ずつ添加し、最終的なタンパク質溶液対緩衝液の比を１：１００とした。次いで、リフォールディングされたタンパク質を、キレートＳＦＦ（Ｎｉ）カラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーにおいて、大量のTriton（登録商標）X-114洗浄剤（０．１％ v/v）を用いて精製し、エンドトキシンを除去した。二量体を含有する画分を回収した。ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で保存し、ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ－２１２３～１４１を４ｍＭのＨＣｌ中で保存した。マウスの野生型ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢは、Peprotechから購入した。
ＰＩＧＦ１２３～１４１融合ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢのＥＣＭタンパク質に対する結合親和性
ＥＬＩＳＡプレート（Medium binding, Greiner bio-one）を、１００ｎＭのＥＣＭタンパク質；ヒト血漿フィブロネクチン（Sigma）、ヒトビトロネクチン（Peprotech）、ヒトテネイシンＣ（R&D Systems）、ヒトフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories）、を有するＰＢＳ５０μｌで、３７℃にて１時間コーティングした。次いで、ウェルをＰＢＳ－Ｔ（０．０５％のTween（登録商標）20を含むＰＢＳ）で洗浄し、１％のＢＳＡを含有する３００μｌのＰＢＳ－Ｔで室温にて１時間ブロッキングした。ＥＣＭ及び対照（ＥＣＭなし、かつＢＳＡでブロッキングされている）のウェルを、０～１００ｎＭのマウスＰＤＧＦ－ＢＢ（Peprotech）、ＩＬ－１Ｒａ（R&D Systems）又はＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質の溶液（０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ、５０μｌ；PROKEEPチューブ、Watson bio lab）と、室温で１時間、更にインキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中でビオチン化抗体を使用して、結合したＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａバリアントを検出した。使用した抗体は、ＰＤＧＦ－ＢＢではPDGF-BB DuoSet ELISA（R&D Systems, DY8464）、ＩＬ－１ＲａではIL-1ra/IL-1F3 DuoSet ELISA（R&D Systems, DY480）からのものであった。解離定数（ＫＤ）を計算するために、
Ａ４５０ｎｍ＝Ｂｍａｘ＊［増殖因子又はＩＬ－１Ｒａバリアント］／（ＫＤ＋［増殖因子又はＩＬ－１Ｒａバリアント］）
を使用する１部位特異的結合モデルに、特異的結合値をフィッティングさせた。
注目すべきことに、改変したタンパク質は、ＥＣＭタンパク質に対する親和性が４～１００倍増加した（表１、図２）。さらに、ＰＩＧＦ１２３～１４１をＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢに融合しても、それらの活性は変化しなかった。野生型ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１に応答した皮膚線維芽細胞の増殖は類似していた（図３）。同様に、ＩＬ－１βに対するマクロファージの応答を阻害するＩＬ－１Ｒａ及びＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の能力は同等であった（図３）。
Figure 2023530106000004
次に、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びヘパラン硫酸から構成されるＥＣＭ模倣ハイドロゲルを使用して、ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢがＥＣＭに結合する能力を評価した（図１Ｄ）。
ＥＣＭ模倣ハイドロゲルからの放出アッセイ
ＥＣＭ模倣ハイドロゲル（５０μｌ）を、８ｍｇ／ｍｌのヒトフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories）、１ｍｇ／ｍｌのヒト血漿フィブロネクチン（Sigma）、５００μｇ／ｍｌのヒトビトロネクチン（Peprotech）、５０ｕｇ／ｍｌのヒトテネイシンＣ（R&D Systems）、５０ｕｇ／ｍｌのヘパラン硫酸（Sigma）及び５００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＢＢ又はＩＬ－１Ｒａバリアントを含有するＨＥＰＥＳ溶液（２０ｍＭ、１５０ｎＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）から生成した。マトリックスを、１０Ｕ／ｍｌのウシトロンビン（Sigma）及び５ｍＭのＣａＣｌ２を用いて、Ultra Low Cluster ９６ウェルプレート（Corning）中で３７℃にて２時間重合させた。次いで、マトリックスを、５００μｌの緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４）が入ったUltra Low Cluster ２４ウェルプレート（Corning）に移した。１００％放出対照としての役割を果たす対照ウェルは、５００μｌの緩衝液中にＰＤＧＦ－ＢＢ又はＩＬ－１Ｒａバリアントのみを含有した。２４時間ごとに緩衝液を除去して－２０℃に保ち、新しい緩衝液と交換した。１００％放出対照ウェルでは、２０μｌの緩衝液を毎日取り出し、－２０℃で保存した。７日後に、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａバリアントの累積放出を、参照として１００％放出対照を使用するＥＬＩＳＡで定量した（PDGF-BB DuoSet, IL-1Ra/IL-1F3 DuoSet; R&D Systems）。プラスミンによる放出アッセイでは、放出緩衝液が１００μＵ／ｍｌのプラスミン（Roche）を含む点以外は、同じ方法で行った。
野生型は直ちに放出されたが、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１はハイドロゲル内に保持された。さらに、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１は、ハイドロゲルを形成するＥＣＭタンパク質及びＰＩＧＦ１２３～１４１を切断するプロテアーゼであるプラスミンの存在下で漸次放出された（図１Ｅ）。
最後に、in vivoでのＥＣＭへの結合を確認するために、皮内投与後の融合タンパク質の保持について試験した。
マウス
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをMonash Animal Research Platformから入手した。ＢＫＳ．Ｃｇ－Ｄｏｃｋ７ｍ ＋／＋ Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ（Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ）マウスをJackson Laboratoryから入手した。Leprｄｂ／ｄｂマウスは繁殖不能であるため、Leprｄｂ／＋マウスとIl1r1－／－マウスを交配して、繁殖力のあるLeprｄｂ／＋－Il1r1－／＋マウスを得た。次いで、Leprｄｂ／＋－Il1r1－／＋を一緒に交配させ、Leprｄｂ／ｄｂ－Il1r1－／－マウスを得た。動物を特定の病原体フリーの条件で飼育した。全ての動物実験は、Monash Universityのガイドラインに従って行い、地元の倫理委員会によって承認された。
皮内保持アッセイ
Ｃ５６ＢＬ／６マウス（８週齢）の背中を剃毛し、ＰＢＳ中の１０μｌの６×ヒスチジンタグを有する野生型（ＩＬ－１Ｒａ－Ｈｉｓ、Sapphire Biosciences）又はＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を皮内に注射した。注射部位をマークし、直後に（１００％対照のみ）、又は１日、３日、５日及び８日後に直接安楽死させた。全層皮膚組織を採取し、注射部位の領域を６ｍｍの生検パンチで収集した。組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（５０ｍｌごとに１錠、Roche）を含有するT-PER Tissue Protein Extraction Reagent（Thermo Fisher Scientific）５００μｌ中に移し、切り刻んだ。試料を撹拌しながら室温で１時間インキュベートし、５，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を－８０℃で保存した。ＩＬ－１Ｒａ－Ｈｉｓ又はＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の濃度を、抗ヒスチジンタグ捕捉抗体（Abcam、ab18184）及びIL-1Ra/IL-1F3 DuoSet DuoSet ELISA Kit（R&D Systems）の検出抗体を利用するＥＬＩＳＡで決定した。０日目の濃度を１００％として使用して、保持率（％）を算出した。
注目すべきことに、野生型と比較して、ＰＩＧＦ１２３～１４１が融合したＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢは、５日後に約５０％が保持され、組織内での保持がはるかに長かった（図１Ｆ）。
考察
増殖因子及びサイトカインなどの生物製剤を、慢性創傷に、より一般的には再生医療のために、効率的に送達することは、それらの安定性が低いこと、送達後の活性ウインドウが狭いことにより、非常に困難であることが実証されている。これらの問題は、多量の用量を送達することによって解決できるが、高用量の増殖因子及びサイトカインは重大な有害作用を誘発する場合がある。さらに、高用量の治療薬の使用によって、費用対効果が低くなり、拡張性が低下する。例えば、組換えＩＬ－１Ｒａ（アナキンラ、Kineret）は、関節リウマチ及び新生児発症の多臓器炎症性疾患の治療のために承認されている。しかし、ＩＬ－１Ｒａは非常に高用量（注射１回ごとに１００ｍｇを超える）で複数回投与する必要があり、その使用によって免疫原性などの副作用が生じる可能性がある。高用量の組換えＰＤＧＦ－ＢＢ（ベカプレルミン、Regranex）の使用は、慢性創傷の治療で承認されているが、その製品は、安全性及び費用対効果に関して大きな懸念をもたらした。したがって、低用量のこれらの薬物を送達部位に正確に局在化させ、保持させることを確実にするために、良好な送達系を開発する必要がある。戦略のうちの１つは、組換えタンパク質を、生体材料担体又はそれらが送達される組織の内在性ＥＭＣに強力に結合するように改変することである。本発明者らは、以前に、ＰＩＧＦのＥＣＭ結合配列を有するように増殖因子を改変することによって、ＥＣＭ構成成分に超親和性が付与されることを示した。ここでは、同様にして超親和性ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢを設計し、創傷に保持させ、ＥＣＭ結合配列を切断するプロテアーゼによる漸次放出を可能にすることを考えた。ＥＣＭ結合配列としてＰＩＧＦ１２３～１４４を以前に報告したが、ここでは、より短い配列であるＰＩＧＦ１２３～１４１がＥＣＭ構成成分により強力に結合することが判明した。そこで、ＰＩＧＦ１２３～１４１を使用して、超親和性ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢを設計し、これらの改変された因子がＥＣＭ模倣ハイドロゲル中及び皮膚組織中により長時間保持されることを実証した。
ＰＤＧＦ－ＢＢを使用することが慢性創傷の治癒を促進するための最も有望な戦略の１つであることが示されていたため、超親和性ＩＬ－１Ｒａの創傷治癒を促進する能力を評価するために、改変されたアンタゴニストを超親和性ＰＤＧＦ－ＢＢと比較した。以前の研究は、ゼラチン－トランスグルタミナーゼゲルと共に送達された非常に高用量の野生型ＩＬ－１Ｒａ（７５０μｇのアナキンラ）によって糖尿病マウスの創傷閉鎖が促進されることが報告している。ここでは、生体材料担体を用いずに一度に送達する低用量の野生型ＩＬ－１Ｒａ（０．５μｇ）による創傷の処置は、糖尿病マウスの創傷閉鎖にわずかな効果しか示さないことが判明した。しかし、同用量の超親和性ＩＬ－１Ｒａは治癒を有意に促進し、処置の１週後には創傷をほぼ閉鎖できることが実証された。興味深いことに、超親和性ＩＬ－１Ｒａによる処置は、同用量の超親和性ＰＤＧＦ－ＢＢ（０．５μｇ）と比較して、創傷閉鎖の促進が更に迅速であり、免疫調節シグナルを送達することがモルフォゲンを送達することよりも重要である可能性があることが示された。ＩＬ－１Ｒａを送達する際に生じる可能性がある問題の１つは、細菌感染の場合に免疫応答を弱めるというリスクである。しかし、慢性創傷の管理には防腐剤と全身性抗生物質の使用が一般的であり、低用量の超親和性ＩＬ－１Ｒａは、送達部位にのみ局在化するその能力のため、全身に影響を与えることはない。
実施例２
糖尿病性慢性創傷を処置するためのＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質
慢性創傷は、糖尿病患者、高齢の患者及び寝たきりの患者を含むいくつかのリスクを抱える集団に影響を及ぼす可能性があり、世界の医療制度にとって大きな課題となっている。創傷治癒の障害をもたらす原因は比較的多様であるが、慢性創傷には、共通して、過剰な炎症促進性免疫細胞及びサイトカイン、高濃度のプロテアーゼ、低レベルの増殖因子並びに多数の老化細胞などの特徴がある。細胞及び分子のこれらの特徴のために、慢性創傷は通常、治癒過程の炎症期にふさがれ、治癒の正常な段階を踏んで順序良く、かつ適時に進行できない。慢性創傷が抗炎症状態や修復状態に進行するのを妨げる持続的な炎症は、おそらく免疫シグナル伝達の調節不全に起因している。実際、不十分な免疫反応と免疫シグナル伝達の不均衡は、糖尿病患者及び高齢患者で非常に多く、そこでは、炎症促進性サイトカインであるインターロイキン－１（ＩＬ－１）が高レベルであることが中心的な役割を担っている。例えば、肥満及び高血糖は、マクロファージなどの免疫細胞を含むいくつかの細胞で、ＩＬ－１βの発現を誘導することが知られている。
慢性創傷におけるＩＬ－１βの影響は依然として不明であるが、ＩＬ－１βは、他の細胞において炎症シグナルを誘導することに加えて、創傷マクロファージにおいてインフラマソーム活性を持続させるための上流シグナルとして作用することが知られている。インフラマソームの活性化はＩＬ－１βの放出を促進するため、炎症促進性サイトカインは、マクロファージの抗炎症性表現型への極性化を妨げる炎症の正のフィードバックループの一部の可能性がある。より一般的には、創傷における過剰なＩＬ－１βに駆動される炎症性シグナルは、創傷閉鎖を妨げる事象のカスケードを誘発する可能性がある。例えば、これらの事象には、炎症細胞のクリアランスの遅れ、線維芽細胞の老化、及び高レベルのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）による修復促進性増殖因子と細胞外マトリックスタンパク質の分解が含まれる可能性がある。したがって、ＩＬ－１β又はＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ１）のシグナル伝達をブロックすることは、慢性創傷における持続的な炎症状態を低減し、治癒を促進するための興味深い選択肢の可能性がある。
この実施例では、最初に、ノックアウトマウスを使用して、糖尿病性創傷治癒におけるＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達の実際の影響を評価した。ＩＬ－１Ｒ１が糖尿病状態における創傷閉鎖を妨げることを実証する。次いで、細胞外マトリックスに結合するＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ融合タンパク質を使用して、低用量の組換えＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）を局所的かつ持続的に送達するためにタンパク質操作システムを最適化し、生体材料担体を使用する必要性を排除した。本発明者らは、ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質による創傷処置が、低レベルの炎症促進性細胞、サイトカイン及び老化線維芽細胞、並びに、高レベルの抗炎症性サイトカイン及び増殖因子によって特徴付けられる糖尿病マウスにおける治癒微小環境を再構築することによって、創傷の治癒を促進することを示す。さらに、ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質は、血小板由来の増殖因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）による増殖因子ベースの処置よりも驚くほど優れていた。改変されたＩＬ－１Ｒａは、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達を弱める必要がある慢性創傷や他の炎症状態の処置への移行が期待される。
方法
マクロファージの単離及び刺激
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）の大腿骨及び脛骨由来の骨髄を、２７ゲージの針とシリンジを使用して、Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Gibco）で洗い流した。細胞を、７０μｍのナイロンストレーナーでろ過し、４℃にて５００ｇで１０分間遠心分離し、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン及び１０ｎｇ／ｍｌのマウスＭ－ＣＳＦ（R&D Systems）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁した。直径１５０ｍｍのペトリ皿に、５×１０７の密度で細胞を播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で７日間培養した。培地は３日ごとに交換した。７日後に、マクロファージを、３ｍＭのＥＤＴＡを含有するTrypLE（Gibco）を使用して分離し、１０％の熱不活性化ＦＢＳ及び１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１ウェル当たり２×１０５個の細胞の密度で、１２ウェルプレートに播種した。分泌されたＩＬ－１βの測定のために、マクロファージを刺激しないか、又は１００ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ（InvivoGene）で３時間、その後５ｍＭのＡＴＰ（InvivoGene）で２１時間刺激した。培地中に放出されたＩＬ－１の濃度をＥＬＩＳＡ（IL-1 DuoSet ELISA Kit、R&D Systems）によって測定した。ＩＬ－１βによるマクロファージの刺激では、細胞をＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）及び漸増濃度（０～１μｇ／ｍｌのＩＬ－１Ｒａ又は等モル濃度のＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１）のＩＬ－１Ｒａバリアントで同時に刺激した。２４時間後に、培地中に放出されたＩＬ－６の濃度をＥＬＩＳＡ（IL-6 DuoSet ELISA Kit、R&D Systems）によって測定した。
血糖の測定
非空腹時血糖値を、１０週齢のLeprｄｂ／ｄｂ、Leprｄｂ／＋－Il1r1－／＋及びＣ５７ＢＬ／６マウスで測定した。簡潔に説明すると、尾静脈を穿刺して少量（２～５μｌ）の血液試料を採取し、FreeStyle Optium Neoメーター（Abbott）を使用して血糖濃度を測定した。グルコースメーターの最大表示値を超える値はいずれも５００ｍｇ／ｄｌと記録した。
皮膚創傷治癒モデル
雄性マウス（１２～１４週齢）の背中を剃毛し、４つの全層パンチ生検創傷（直径５ｍｍ）をMochizuki, M et al., (2019) Nat Biomed Engに記載されているように作出した。１０分後に、創傷を１０μｌの生理食塩水（ＰＢＳ）又はＰＢＳ中タンパク質溶液（０．５μｇのＩＬ－１Ｒａ、０．６１μｇのＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１、０．５μｇのＰＤＧＦ－ＢＢ、０．６５μｇのＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１）で処置した。非糖尿病マウス（Leprｄｂ／＋）では、糖尿病マウスと比較してそれらのサイズが小さいため、創傷の作出はマウス１匹当たり２つのみとした。創傷を非接着性ドレッシング（Adaptic、Johnson & Johnson）及び接着性フィルムドレッシング（Hydrofilm、Hartmann）で覆った。損傷後の特定の時点で動物を安楽死させ、生化学的又は組織学的分析のために創傷を回収した。
組織学的分析
創傷を８ｍｍの組織生検パンチで回収し、１０％の中性緩衝ホルマリンで室温にて２４時間固定した。試料を創傷の端までトリミングし、パラフィンに包埋し、創傷の中心を通過するまで４μｍスライドに連続的に切片化した。再上皮化の程度を組織形態学的分析により測定した。スライドをヘマトキシリン及びエオシンで染色し、Aperio ImageScope Viewer（Germany）を使用して皮筋ギャップの距離を測定することによって創傷の中心を決定した。創傷閉鎖の程度は、皮筋ギャップの長さに対する表皮閉鎖の比として計算した。
創傷の生化学的分析
直径８ｍｍの領域を創傷の中心から切り出し、ハサミで切り刻み、１０ｍｌに対して１錠のプロテアーゼ阻害剤（Roche）を含有するT-PER Tissue Protein Extraction Reagent（創傷ごとに５００μｌ、Thermo Fisher Scientific）中で室温にて１時間インキュベートした。次いで、試料を５，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を－８０℃で保存した。総タンパク質濃度をBradfordアッセイ（Millipore）により測定した。サイトカイン、増殖因子及びＭＭＰ及びＴＩＭＰ－１は、R&D Systems社製のＥＬＩＳＡ；マウスIL-1ra/IL-1F3 DuoSet ELISA；マウスIL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA；マウスIL-6 DuoSet ELISA；マウスCXCL1/KC DuoSet ELISA；マウス塩基性FGF/FGF2/bFGF DuoSet ELISA；マウス／ラットPDGF-BB DuoSet ELISA；マウスVEGF DuoSet ELISA；マウスTGF-β1 DuoSet ELISA；マウスIL-10 Quantikine ELISA Kit；マウスIL-4 DuoSet ELISA；全MMP-2 Quantikine ELISA Kit；マウス全MMP-9 DuoSet ELISA；マウスTIMP-1 DuoSet ELISAによって検出した。
皮膚線維芽細胞の単離
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾を根元から完全に切断し、その後、７０％エタノール中に２分間浸漬する簡易な滅菌手順を行った。尾の根本から先端までを正中線に沿って切開し、皮膚を骨から剥がした。尾をＰＢＳ中ですすぎ、１～２ｃｍ２の小片に切り出し、２ｍｇ／ｍｌの氷冷ディスパーゼＩＩ（Sigma）で４℃にて１０～１２時間インキュベートした。次いで、皮膚片を洗浄し、毛包と共に表皮をはがした。真皮片を、３００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩＩ（Sigma）を用い、３７℃で３０分間切り刻み、消化した。上清を収集し、１００μｍのフィルターでろ過し、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）により不活性化した。細胞を５００ｇで１０分間遠心分離し、線維芽細胞培地（２ｍＭのGlutaMAX、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）中のＴ７５フラスコ（尾当たり１フラスコ）に播種した。全ての細胞を、最初の３継代培養以内に実験で使用した。
増殖アッセイ
皮膚線維芽細胞（継代培養４）を低血清α－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、２％ＦＢＳ）中で２４時間飢餓状態とした。次いで、ＰＤＧＦ－ＢＢバリアントを含有する低血清α－ＭＥＭが入った９６ウェルプレートに細胞を播種した（２，０００細胞／ウェル）。Cyquant（Thermo Fisher Scientific）及び式
（（基礎増殖群の細胞数／刺激群の細胞数）－１）×１００
を使用して、基礎増殖（低血清α－ＭＥＭのみ）に対する新しい細胞の割合（％）を算出した。
好中球及びマクロファージのin vivo表現型
マウス（１２週齢）をこれまでに述べたように損傷させ、６日、９日、１４日後に安楽死させた。背中の皮膚を切除し、８ｍｍの生検パンチで創傷を採取し、ＲＰＭＩ培地１０４０（Gibco）及び２％ＢＳＡ中に置いた。創傷をハサミで切り刻み、コラゲナーゼＸＩで３７℃にて３０分間消化した。酵素消化を５ｍＭのＥＤＴＡで中和し、混合物を７０μｍのセルストレーナーに通過させた。単一細胞懸濁液を、Biolegends社製の抗体：ＢＶ７１１抗Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ビオチン抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＣＤ２０６（Ｃ０８６２Ｃ）、ＢＶ４２１抗Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８）（２μｇ／ｍｌ）、を使用して、氷上で２０分間染色した。UV379-streptavidinはBD Biosciences社製である。固定可能な生／死の生存能力染色はZombie Aqua Fixable Viability Kit（Biolegend）を使用した。全てのフローサイトメトリーは、BD LSR Fortessa X20フローサイトメーターで行い、FlowJo（Tree Star）を使用して分析した。
老化関連β－ガラクトシダーゼ活性
マウス（１２週齢）を上記のように損傷させ、９日後に安楽死させた。損傷した皮膚を８ｍｍの生検を使用して採取し、健康な皮膚組織を無傷のものから収集した。試料を切り刻み、１．５ｍｇ／ｍｌのCollagenase XI（Sigma）で、３７℃にて４５分間、２回消化した。コラゲナーゼを５ｍＭのＥＤＴＡで不活性化し、上清は７０μｍのフィルターでろ過した。細胞を最初に、LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit（ＰＢＳ中１：５００に希釈した、Invitrogen）を用いて４℃で３０分間染色し、その後、フローサイトメトリー緩衝液（５％のＦＢＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で希釈した１０μｇ／ｍｌのTruStain ＦｃＸ抗ＣＤ１６／３２（９３、BioLegend）抗体とインキュベートした。次いで、フローサイトメトリー緩衝液で希釈したＣＤ１１ｂ（２ｕｇ／ｍｌ、Ｍ１／７０）、Ｆ４／８０（５ｕｇ／ｍｌ、ＢＭ８）及びＣＤ４５（１ｕｇ／ｍｌ、３０－Ｆ１１）に対するＢＶ７１１結合Biolegendラット抗マウス抗体を用いて、４℃で３０分間、細胞を染色した。ＳＡ－β－ｇａｌ染色は、CellEvent Senescence Green Flow Cytometry Assay Kit（Invitrogen, #C10840）を使用し、製造業者の指示に従って実施した。次いで、細胞を１％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡにおいて０．２５％のTriton（登録商標）X-100を用いて室温で１５分間透過処理した。細胞を０．２５％のサポニンを含有するフローサイトメトリー緩衝液で洗浄し、さらに、ビメンチン（０．２μｇ／ｍｌ、EPR3776）、Ｈｓｐ４７（２５μｇ／ｍｌ、EPR4217）及びＳ１００Ａ４に（７．５μｇ／ｍｌ、EPR14639(2)）対するAbcamウサギモノクローナル抗体で４℃にて４５分間染色し、その後、二次抗体Alexa Fluor（登録商標）６４７結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Abcam, #ab150083）を用いて、４℃にて４５分間染色した。最後に、細胞を洗浄し、フローサイトメーター緩衝液に再懸濁させ、BD LSRFortessa X-20で分析した。獲得後の分析は、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）を使用した。in vitro実験では、線維芽細胞（継代培養２）を、ＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）又はＰＢＳ対照を含む１０％のＦＢＳ中で培養した。培地を３日目と６日目の２回交換した。９日目に、細胞をLIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit及びCellEvent Senescence Green Flow Cytometry Assay Kitを用いて染色した。
統計分析
全てのデータは平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は、GraphPad Prism 8統計ソフトウェア（GraphPad）を使用した。有意差は、スチューデントのｔ検定を用いるか又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって算出し、その後、群間の多重比較を実施する場合はボンフェローニの事後検定を行った。Ｐ＜０．０５を統計的有意差とみなした。記号、＊、＊＊、及び＊＊＊は、それぞれ、０．０５、０．０１、及び０．０１未満のＰ値を示し；ｎ．ｓ．は有意差なしを示す。
結果
ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達は糖尿病マウスにおける創傷治癒を損う
ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達は、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）によって厳密に制御されており、組織中のＩＬ－１βとＩＬ－１Ｒａの間の比率が高いと、強固なＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達がもたらされる。そこで、最初に、非糖尿病マウスと糖尿病マウスの皮膚創傷の間で、ＩＬ－１βとＩＬ－１Ｒａの比率が異なるかどうかを検討した。Leprｄｂ／ｄｂマウス（糖尿病）とLepr＋／ｄｂマウス（非糖尿病の同腹子）の創傷におけるＩＬ－１βとＩＬ－１Ｒａの濃度を損傷後のさまざまな時点で測定した。いずれの時点でも、非糖尿病マウスと比較して、糖尿病マウスではＩＬ－１βが有意に上昇し、ＩＬ－１Ｒａが有意に低いことが判明した（図４Ａ）。損傷した組織に蓄積する循環単球に由来するマクロファージは、ＩＬ－１βの重要な供給源であることが知られている。そこで、Leprｄｂ／ｄｂとLepr＋／ｄｂの単球由来マクロファージによるＩＬ－１β産生を比較した。Leprｄｂ／ｄｂのマクロファージは、定常状態において、そして、リポ多糖（ＬＰＳ）とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）による刺激後に、有意に多くのＩＬ－１βを分泌した（図４Ｂ）。次いで、糖尿病マウスの創傷治癒におけるＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達の実際の影響を評価するために、Leprｄｂ／ｄｂマウスをIl1r1－／－と交配させ、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達が欠損した糖尿病マウス（Leprｄｂ／ｄｂ－Il1r1－／－）を得た（図４Ｃ、図５）。興味深いことに、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達が欠損した糖尿病マウスは傷の治癒が非常に早く、９日後にはほぼ完全に再上皮化したのに対し、糖尿病性創傷はおよそ５０％が開いていた（図４Ｄ、４Ｅ）。
超親和性ＩＬ－１Ｒａは糖尿病マウスにおいて創傷治癒を促進する
ＩＬ－１Ｒａの局所送達が糖尿病性創傷の治癒を促進するかどうかを評価するために、再度Leprｄｂ／ｄｂモデルマウスを選択した。低用量のＩＬ－１Ｒａバリアント及びＰＤＧＦ－ＢＢバリアントを、全層創傷後に１回だけ生理食塩水中で局所的に送達した（０．５μｇのＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢ、並びに等用量の改変された形態）。処置の１週後、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１が投与された創傷は、生理食塩水対照、ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢと比較して、有意に多くの閉鎖－再上皮化の程度によって特徴付けられる－が認められた（図６Ａ、６Ｂ）。ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を投与した創傷では、処置の９日後にほぼ１００％の閉鎖が観察されたが、生理食塩水、ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢで処置した創傷は依然として大部分が開いていた（図６Ａ、６Ｂ）。
これらの結果に基づき、ＩＬ－１Ｒａで処置することにより、ＩＬ－１βの阻害に起因する一連の分子事象（図６Ｃ）が引き起こされると仮定した。ＩＬ－１βは、炎症性好中球とマクロファージの移動を誘導する強力な炎症応答を引き起こす。したがって、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１が、治癒過程中の創傷における好中球及びマクロファージの蓄積をどの程度まで調節するかを、フローサイトメトリーを使用して試験した（図７）。興味深いことに、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１による創傷の処置は、野生型ＩＬ－１Ｒａ又は生理食塩水による処置と比較して、好中球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ＋細胞）の迅速なクリアランスと多くのマクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋細胞）の蓄積を促進した（図６Ｄ）。さらに、Ｍ２様マクロファージのマーカーであるＣＤ２０６の発現は、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１処置群で有意に高く、創傷マクロファージがより抗炎症性の傾向にあることが示された（図６Ｄ）。
超親和性ＩＬ－１Ｒａは治癒促進性微小環境をもたらす
創傷微小環境におけるサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び増殖因子の量は、治癒の進行に重要である。そこで、超親和性ＩＬ－１Ｒａによる処置の、創傷治癒中のこれらの因子の濃度に対する影響を調査した。最初に、炎症促進性サイトカインであるＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＣＸＣケモカインリガンド（ＣＸＣＬ）１（好中球の化学誘引物質）、並びに、抗炎症性サイトカインである形質転換増殖因子１（ＴＧＦ－β１）、ＩＬ－１０及びＩＬ－４の創傷濃度を測定した。注目すべきことに、生理食塩水及びＩＬ－１Ｒａによる処置と比較して、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１は、創傷における炎症促進性因子の濃度を有意に低下させ、抗炎症性因子の濃度は増加させた（図８Ａ）。次に、通常は糖尿病性創傷において過剰に協働し、ＥＣＭ構成成分及び増殖因子を分解することが知られているＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９のレベルを測定した。ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を送達することにより、ＭＭＰ－２及び９は有意に減少したが、ＭＭＰ阻害剤であるメタロペプチダーゼ阻害剤ＴＩＭＰ－１は増加した。最後に、マクロファージ及び他の細胞が分泌する重要な創傷治癒増殖因子である線維芽細胞増殖因子－２（ＦＧＦ－２）、ＰＤＧＦ－ＢＢ及び血管内皮増殖因子－Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）に注目した。ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を送達すると、生理食塩水及びＩＬ－１Ｒａと比較して、これらの治癒促進性因子の濃度が有意に上昇した（図８Ａ）。
線維芽細胞の老化は糖尿病性創傷治癒の大きな障害であることから、創傷線維芽細胞の老化に対するＩＬ－１Ｒａ処置の効果を調査した。最初に、in vitroでの皮膚線維芽細胞に対するＩＬ－１βの効果を試験した。老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）の活性の増加が老化の特徴であると考えられていることから、これを測定することにした。興味深いことに、初代皮膚線維芽細胞をＩＬ－１βで処置することにより、ＳＡ－β－ｇａｌ活性が上昇することが判明し、サイトカインが細胞の老化を促進することが示唆された（図８Ｂ）。線維芽細胞をＩＬ－１βで刺激すると、ＭＭＰ－２、並びに、ＩＬ－６、ＣＣケモカインリガンド（ＣＣＬ）１及び３、並びにＣＸＣＬ２及び１０を含む代表的な老化関連サイトカインの分泌が誘導され（図９）、ＩＬ－１βへの曝露が老化を駆動することが確認された。最後に、ＩＬ－１Ｒａによる糖尿病性創傷の処置により、創傷線維芽細胞の老化が低減されるかどうかを試験した。いずれのＩＬ－１Ｒａバリアントも、しかしＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１はより多く、創傷線維芽細胞のＳＡ－β－ｇａｌ活性を低下させることが判明した。興味深いことに、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１で処置した９日後に、創傷線維芽細胞は、無傷の皮膚の皮膚線維芽細胞と同様のＳＡ－β－ｇａｌ活性を示した（図８Ｃ、図１０）。
考察
最近、慢性創傷、より一般的には組織修復のための、免疫モジュレーションに基づく治療法の開発に関心が高まっている。例えば、いくつかの戦略によって、生体材料、サイトカイン、マイクロＲＮＡ及び細胞外小胞の使用が検討されている。しかし、これらのアプローチを臨床に応用することは、安全性、拡張性及び費用対効果に関する問題により、困難な場合がある。さらに、免疫系が創傷治癒過程を妨げる又は促進する最も重要な分子経路をより深く理解することは、新規で効果的な治療法を設計するために不可欠である。この実施例では、ＩＬ－１βを介したＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達を、慢性創傷における修復促進性微小環境の成熟を妨げる最も重要な経路の１つであると仮定した。糖尿病マウス（Leprrｄｂ／ｄｂ）は、十分に確立され、広く受け入れられている創傷治癒障害の臨床的に重要な実験モデルであることから、モデルとして、当該マウスの全層創傷治癒を使用した。
組織におけるＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達は、ＩＬ－１とＩＬ－１Ｒａの比率によって厳密に調節されている。したがって、最初の実験では、非糖尿病マウス及び糖尿病マウスの創傷におけるＩＬ－１βとＩＬ－１Ｒａの濃度を測定し、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達の強度及び持続性が、糖尿病モデルにおいてより強力であるかどうかを決定した。ＩＬ－１β：ＩＬ－１Ｒａの比率はLeprｄｂ／ｄｂの創傷において継続的により高いことが判明し、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達は、糖尿病において、おそらく、はるかに顕著であることが示された。興味深いことに、糖尿病マウスの角膜創傷におけるｍＲＮＡレベルでも同様に比率が高いことが報告されている。次いで、ＩＬ－１Ｒ１が欠損した糖尿病マウス（Leprｄｂ／ｄｂ－Il1r1－／－）を作出して、糖尿病マウスの創傷治癒中のＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達の実際の影響を評価することを試みた。驚くべきことに、ＩＬ－１Ｒ１欠損糖尿病マウスは、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達が機能している糖尿病マウスと比較して、有意に早く創傷を治癒した。まとめると、これらの結果は、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達が糖尿病マウスの創傷治癒を妨げる重要な構成成分であることを強く示唆し、創傷治癒を促進する可能な治療法として、ＩＬ－１Ｒａの送達によるその阻害を検討することが促された。
増殖因子及びサイトカインなどの生物製剤を、慢性創傷に、より一般的には再生医療のために、効率的に送達することは、それらの安定性が低いこと、送達後の活性ウインドウが狭いことにより、非常に困難であることが実証されている。これらの問題は、多量の薬剤の送達することによって解決できるが、高用量の増殖因子及びサイトカインは重大な有害作用を誘発する可能性がある。さらに、高用量の治療薬の使用によって、費用対効果が低くなり、拡張性が低下する。例えば、組換えＩＬ－１Ｒａ（アナキンラ、Kineret）は、関節リウマチ及び新生児発症の多臓器炎症性疾患の治療のために承認されている。しかし、ＩＬ－１Ｒａは非常に高用量（注射１回ごとに１００ｍｇを超える）で複数回投与する必要があり、また、その使用によって免疫原性などの副作用が生じる可能性がある。高用量の組換えＰＤＧＦ－ＢＢ（ベカプレルミン、Regranex）の使用は、慢性創傷の治療で承認されているが、その製品は、安全性及び費用対効果に関して大きな懸念をもたらした。したがって、低用量のこれらの薬物を送達部位に正確に局在化させ、保持させることを確実にするために、良好な送達系を開発する必要がある。その戦略のうちの１つは、組換えタンパク質を、生体材料担体又はそれらが送達される組織の内在性ＥＭＣに強力に結合するように改変することである。本発明者らは、以前に、ＰＩＧＦのＥＣＭ結合配列を有するように増殖因子を改変することによって、ＥＣＭ構成成分に超親和性が付与されることを示した。ここでは、同様にして超親和性ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢを設計し、創傷に保持させ、ＥＣＭ結合配列を切断するプロテアーゼによる漸次放出を可能にすることを考えた。ＥＣＭ結合配列としてのＰＩＧＦ１２３～１４４を以前に説明したが、ここでは、より短い配列であるＰＩＧＦ１２３～１４１がＥＣＭ構成成分により強力に結合することが判明した。そこで、ＰＩＧＦ１２３～１４１を使用して超親和性ＩＬ－１Ｒａ及びＰＤＧＦ－ＢＢを設計し、これらの改変された因子がＥＣＭ模倣ハイドロゲル中及び皮膚組織中により長時間保持されることを実証した。
ＰＤＧＦ－ＢＢの使用が慢性創傷の治癒促進の最も有望な戦略の１つであることが示されていたことから、超親和性ＩＬ－１Ｒａの創傷治癒を促進する能力を評価するために、改変されたアンタゴニストを超親和性ＰＤＧＦ－ＢＢと比較した。以前の研究は、ゼラチン－トランスグルタミナーゼゲルと共に送達された非常に高用量の野生型ＩＬ－１Ｒａ（７５０μｇのアナキンラ）によって、糖尿病マウスの創傷閉鎖が促進されることが報告している。ここでは、生体材料担体を用いずに一度に送達する低用量の野生型ＩＬ－１Ｒａ（０．５μｇ）による創傷の処置は、糖尿病マウスの創傷閉鎖にわずかな効果しか示ないことが判明した。しかし、同用量の超親和性ＩＬ－１Ｒａは治癒を有意に促進し、処置の１週後には創傷をほぼ閉鎖できることが実証された。興味深いことに、超親和性ＩＬ－１Ｒａによる処置は、同用量の超親和性ＰＤＧＦ－ＢＢ（０．５μｇ）と比較して、創傷閉鎖の促進が更に迅速で、免疫調節シグナルを送達することがモルフォゲンを送達することよりも重要である可能性があることが示された。ＩＬ－１Ｒａを送達する際に生じる可能性がある問題の１つは、細菌感染の場合に免疫応答を弱めるというリスクである。しかし、慢性創傷の管理には防腐剤と全身性抗生物質の使用が一般的であり、低用量の超親和性ＩＬ－１Ｒａは、送達部位にのみ局在化するその能力のため、全身に影響を与えることはない。
超親和性ＩＬ－１Ｒａが糖尿病性創傷の治癒を促進する根底にあるメカニズムを理解するために、創傷の好中球とマクロファージに注目したが、これは、免疫調節不全と相まったこれらの細胞の数の増加が、治癒しない創傷発生の原因であるためである。例えば、慢性創傷において好中球数が異常に多いことにより、炎症性サイトカイン、活性酸素種（ＲＯＳ）、細胞外トラップ及びプロテアーゼ（ＭＭＰ及びセリンプロテアーゼ）の過剰産生が引き起こされる。同様に、創傷のマクロファージが抗炎症性表現型に変換できないと、炎症促進性サイトカイン（例．ＩＬ－１β及びＩＬ－６）及びプロテアーゼが高レベルであることと、ＶＥＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ及びＴＧＦ－β１などの重要な増殖因子の低減につながる。全体として、これは、ＥＣＭの分解と低レベルの増殖因子が組み合わさった炎症性シグナルの悪化のために創傷が増殖期と治癒期に進行できない非治癒性微小環境を作り出す。興味深いことに、超親和性ＩＬ－１Ｒａによる処置によって、創傷における全細胞に対する好中球の割合が低下することが判明した。その結果、この群ではマクロファージの割合が上がった。しかし、他の群と比較して、マクロファージ表面のＣＤ２０６の発現は高く、抗炎症性表現型への極性化がより進んでいることが示された。炎症促進性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１）及びＭＭＰ（ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９）の創傷濃度は著しく低かったことから、超親和性ＩＬ－１Ｒａによる処置後の炎症性免疫細胞のレベルの低下が更に裏付けられ、一方、抗炎症性サイトカイン（ＴＧＦ－β１、ＩＬ－４、ＩＬ－１０）及びＴＩＭＰ－１の濃度は高かった。創傷治癒増殖因子（ＦＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＶＥＧＦ－Ａ）の濃度も超親和性ＩＬ－１Ｒａによる処置後により高かった。まとめると、超親和性ＩＬ－１Ｒａ処置によって誘導される修復促進性微小環境は、おそらく、創傷における増殖因子を発現するＭ２様マクロファージの数の増加、及びＥＣＭ構成成分と増殖因子を分解するＭＭＰの量の低下に起因する可能性がある。
最後に、創傷線維芽細胞の老化は糖尿病性創傷の治癒における主要な障害であることから、創傷線維芽細胞の老化に対する超親和性ＩＬ－１Ｒａによる処置の効果を探索した。機構的には、創傷部位の免疫細胞によるＲＯＳの過剰産生がＥＣＭ及び細胞膜の損傷の原因であり、細胞の早期老化をもたらすことが報告されている。さらに、炎症性マクロファージは、皮膚線維芽細胞の老化プログラムを活性化することが示されている。皮膚線維芽細胞の老化が高レベルであることは、炎症促進性サイトカイン、ケモカイン及びプロテアーゼのレベルの上昇によって特徴付けられる老化関連セクレトームの存在により、創傷の慢性化に更に寄与する。この実施例では、最初に、ＩＬ－１βが皮膚線維芽細胞でβ－ｇａｌ活性を増加させることをin vitroで示し、炎症促進性サイトカインが老化を加速させる可能性を示した。さらに、この効果を裏付けるように、ＩＬ－１βは、老化の表現型と一般的に関連するＩＬ－６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ３、ＣＸＣＬ２及びＣＸＣＬ１０を含む炎症促進性サイトカイン及びケモカインの分泌を誘導した。最後に、超親和性ＩＬ－１Ｒａによる創傷処置は、損傷の９日後に、皮膚線維芽細胞の見かけの老化を無傷の皮膚で観察されるレベルまで低下させることができた。まとめると、これらの結果は、超親和性ＩＬ－１Ｒａが、線維芽細胞におけるＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達を阻害することによって直接的に、かつ、創傷における好中球及び炎症性マクロファージのレベルを低下させることによって間接的に、皮膚線維芽細胞の老化を低減することを示唆する。
結論として、本発明者らは、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達が糖尿病性創傷の治癒を妨げる主要な要因であることを証明している。ＩＬ－１Ｒａの改変されたマトリックス結合形態を送達することによるＩＬ－１Ｒ１の単純な阻害は、生体材料担体を必要とせずに、創傷における正確な局在化と保持を可能にし、迅速な創傷治癒を促進する。改変されたＩＬ－１Ｒａによる創傷処置は、低レベルの炎症促進性細胞、サイトカイン及び老化線維芽細胞、並びに、高レベルの抗炎症性サイトカイン及び増殖因子によって特徴付けられる治癒促進性微小環境を再確立する。ＥＣＭ結合型ＩＬ－１Ｒａは、慢性創傷に対する臨床応用の可能性を秘めており、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達を抑制する必要がある他の組織や炎症状態で使用してもよい。
実施例３
ＥＣＭに対して結合親和性を有するＩＬ－１受容体アンタゴニスト融合タンパク質（ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質）によるＩＬ－１受容体の局所的で持続的な阻害は、２つの骨再生モデルにおいて増殖因子の再生効果を強化する
増殖因子は、細胞の増殖、遊走及び分化を含む種々の細胞プロセスを刺激できる強力な分子である。したがって、再生医療への期待が高まっており、いくつかの増殖因子に基づく製品が臨床で使用されている。それにもかかわらず、組換え増殖因子による治療は、低用量では効果がなく、高用量では重篤な副作用が生じるという制約のため、依然として妨げられている。例えば、これらの制約により、米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）は、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）及び血小板由来増殖因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）などのいくつかの増殖因子について、強力な警告を発表している。実際に、再生医療において増殖因子を制限する問題は、最適でない送達系の使用と確実に関連している。そこで、組換え増殖因子の組織内での正確な局在化を確実にし、その放出を制御するさまざまな戦略が開発されてきた。しかし、増殖因子の局在化及び放出の制御は、それらの再生能力及び安全性を改善するための第一歩に過ぎないかもしれない。増殖因子放出後のシグナル伝達の、組織の微小環境による影響を理解することは最も重要であると思われる。重要なことに、組織修復再生過程にはほとんど常に免疫反応が伴うが、免疫系及び炎症シグナルの増殖因子シグナル伝達への影響は見落とされており、十分に理解されていない。特に、増殖因子に対する細胞の応答は、送達部位での炎症及び免疫微小環境に応じて変化する可能性がある。さらに、増殖因子は、組織に常在する幹細胞や前駆細胞などの新しい組織を作製する細胞を標的として送達されるが、損傷した組織に存在する免疫細胞の多くも増殖因子受容体を発現していることから、必然的にそのような免疫細胞にも作用する。しかし、組換え増殖因子の局所送達後の免疫細胞の応答については、未だ解明されていない。
炎症促進性サイトカインであるインターロイキン－１（ＩＬ－１）及びその遍在的に発現する受容体（ＩＬ－１Ｒ１）は、自然免疫及び炎症の中心的なメディエーターであり、事実上全ての細胞及び臓器に影響を及ぼす。さらに、ＩＬ－１Ｒ１は、さまざまな組織の修復及び再生に大きな影響を与えることが示されている。本発明者らは、免疫系の制御を統合する成功する再生戦略の設計を最終目標として、ＩＬ－１Ｒ１が媒介する炎症促進性シグナル伝達の、組換え増殖因子によって駆動される組織再生に及ぼす影響の程度を調査した。モデルとして、再生医療で臨床的に重要な増殖因子であるＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢによって駆動されるマウスの骨再生を使用した。
材料及び方法
マウス
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをMonash Animal Research Platform又はJapan SLCから入手した。Il1r1－／－マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに９世代以上戻し交配した。動物を特定の病原体がない条件で飼育した。全ての動物実験は、Monash Universityのガイドラインに従って行われ、その倫理委員会によって承認されたか、大阪大学微生物病研究所の動物研究委員会によって承認された。
頭蓋冠欠損モデル
手術に使用したマウスは１０～１２週齢であった。マウスをイソフルランで麻酔し、それらの頭頂部を剃毛した。長手方向に切開し、軟部組織を後退させることによって頭蓋骨の組織を露出させた。ドリルを使用して、矢状縫合線の両側の頭頂骨に２つの開頭欠損（直径４．５ｍｍ）を作出した。欠損を生理食塩水で洗浄し、硬膜を重合したフィブリンマトリックス（欠損ごとに４０μｌ、１４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories）、４Ｕ／ｍｌのウシトロンビン（Sigma）、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２５μｇ／ｍｌアプロチニン（Roche））で覆った。選択した条件では、マトリックスに、１μｇの増殖因子及びＩＬ－１Ｒａバリアントを添加した。次いで、軟部組織を縫合糸で閉じた。鎮痛剤として、マウスにプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。手術の８週後にマウスを屠殺し、頭蓋骨をマイクロＣＴで解析した。
マイクロＣＴ
頭蓋骨をmicroCT 40（Scanco Medical AG）を用い、エネルギー５５ｋＶｐ及び強度１４５ミリ秒でスキャンし、詳細に測定した。スキャンは、公称３０μｍの等方性解像度で再構築した。再構築後、3D Gaussianフィルター（シグマ１．２、サポート１）を全ての画像に適用した。最大灰色値であるグローバル閾値２２．４％を使用して、骨と背景を分割した。その後、円筒形のマスクを欠損部に手動で配置した。これらのマスク内の骨被覆率と体積を、スキャナソフトウェア（IPL, Scanco Medical AG）を使用して算出した。被覆率を円筒形領域の背腹投影に関して算出した。大腿骨を、詳細な測定のために、エネルギー５５ｋＶｐ、強度１４５ミリ秒及び積分時間３００ミリ秒で作動する同じマイクロＣＴでスキャンした。スキャンは高解像度モードで実施して、公称等方解像度１５μｍを得た。再構築後、3D Gaussianフィルター（シグマ１．２、サポート１）を全ての画像に適用した。画像を回転させ、骨の縦軸を画像のＹ軸に合わせた。最大灰色値であるグローバル閾値３１．６％を使用して骨と背景を分割し、２５０×３２０×２５０ボクセルの領域を欠損領域の中心で選択した。骨体積はスキャナソフトウェア（IPL, Scanco Medical AG）を使用して算出した。
緻密骨由来ＭＳＣの単離
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）の長骨（腕及び脚）の筋肉及び軟骨組織を全て取り除き、７０％で短時間浸漬した後、ＰＢＳ中で洗浄した。各骨の骨端部を切り落とし、ＰＢＳを満たした１０ｍｌシリンジに取り付けた２７ゲージ針を使用して骨髄を洗い流した。清浄化した骨を１～２ｍｍのチップに切り出し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＩ（Merck）を含有する５ｍｌのα－ＭＥＭ中で３７℃にて１時間消化した。チップをα－ＭＥＭ（１０％のＦＢＳを含む）で洗浄し、細胞培養皿（マウス１匹につき１０ｃｍ２の皿１枚）に均一に広げ、６ｍｌの培地（α－ＭＥＭ、１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、１０％のＦＢＳ）で覆った。チップを３７℃、５％ＣＯ２で１０日間インキュベートし、細胞を遊走させて表面に接着させた。５日目に培地を交換した。細胞及びチップをＰＢＳで洗浄し、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、細胞培養皿に移した（マウス１匹につき２１ｃｍ２の皿２枚）。細胞は８０％コンフルエントになるまで増殖させ、チップを含まず細胞のみを、フラスコ（マウス１匹につき１７５ｃｍ２のフラスコ１本）に移した。ＭＳＣは、１：４の分割比で２継代培養し、液体窒素中に保存した。１μｇ／ｍｌのTruStain ＦｃＸ抗ＣＤ１６／３（９３、BioLegend）及びLIVE/DEAD Zombie Aqua（1:500希釈、BioLegend）で細胞を染色して、ＭＳＣの表現型を評価した。次いで、細胞をBiolegend社製の以下の抗体で標識した；２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１１ｂ ＰＥ（Ｍ１／７０）、５μｇ／ｍｌのＣＤ４５ ＦＩＴＣ（３０－Ｆ１１）、１ｕｇ／ｍｌの抗ＭＨＣＩＩ ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｍ５／１１４．１５．２）、２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４４ ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＩＭ７）、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２９ ＰＥ（ＨＭβ１－１）、２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ９０．２ ＡＰＣ（３０－Ｈ１２）、２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ１４０ｂ ＡＰＣ（ＡＰＢ５）、２ｕｇ／ｍｌの抗Ｓｃａ－１ ＰＥ（Ｄ７）。BD Pharmigen社製の抗ＣＤ１９ ＡＰＣ（１Ｄ３）を２μｇ／ｍｌで使用した。抗体をフローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ）で希釈した。試料をCyAn ADP（Beckman Coulter）で獲得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）で分析した。
骨芽細胞の単離
３日齢のＣ５７ＢＬ／６の頭蓋冠を、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＩ型（Merck）及び２ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（Sigma）を含有するα－ＭＥＭ中で、３７℃にて２０分間振とう水浴で消化し、頭蓋冠細胞を放出させた。細胞を含む上清を新しいチューブに移し、３００×ｇで遠心分離し、ペレットを１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％のＦＢＳを含有するα－ＭＥＭ中に再懸濁させた。この頭蓋冠を更に３回消化し、合計４回の消化を行った。骨芽細胞を含有する消化物３と４を合わせて、組織培養処理済みの皿に３×１０５細胞／ｍｌの密度で移した。頭蓋冠の細胞を、骨形成誘導培地（２ｍＭのＬ－グルタミン、１０％のＦＢＳ、１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｍＭのアスコルビン酸－リン酸、１０ｍＭのβ－グリセロリン酸、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ－２を含むα－ＭＥＭ）中で２週間培養し、使用まで液体窒素中で保存した。
マトリックスの石灰化
ＭＳＣ（継代培養３）を、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ－２及び／又は１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－１β（Peprotech）を含む、７５０μｌの骨芽細胞分化培地（２ｍＭのＬ－グルタミン、１０％のＦＢＳ、１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｍＭのアスコルビン酸－リン酸、１０ｍＭのβ－グリセロリン酸を含むα－ＭＥＭ）が入った２４ウェルプレートに播種した（１０，０００個の細胞／ウェル）。Ｓｍｕｒｆ２阻害実験では、培地に２０ｍＭのヘクリン（R&D Systems）を添加した。５日後に、骨形成誘導培地をＩＬ－１β又はヘクリンを含まないものに変更した。培地は２１日目まで４日ごとに交換した。石灰化の度合を決定するために、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。細胞を１０％ホルマリンで室温にて１時間固定し、ウェルを水で洗浄した後、２％アリザリンレッドで２０分間染色した。アリザリンレッドを吸引し、写真撮影の前にウェルを水で２回洗浄した。
骨芽細胞の分化のための定量的ＰＣＲ
細胞（ＭＳＣ継代培養３又は骨芽細胞）を、マウスＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）を含むか又は含まず、ＢＭＰ－２を含む、７５０μｌの骨芽細胞誘導培地（２ｍＭのＬ－グルタミン、１０％のＦＢＳ、１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｍＭのアスコルビン酸－リン酸、１０ｍＭのβ－グリセロリン酸を含むα－ＭＥＭ）が入った２４ウェルプレートに播種した（１０，０００個の細胞／ウェル）。５日後に、骨形成誘導培地を（ＩＬ－１βを含まないものに）変更した。４日ごとに培地を交換した。ＩＬ－１βで刺激した７日又は１４日後に、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）を使用して、総ＲＮＡを単離し、ReverTra Ace（Toyobo Co., Ltd.）を使用して逆転写を実施した。ＴａｑＭａｎアッセイを使用するABI PRISM 7500を用い、定量的ＰＣＲを実施した。Applied Biosystems社製の以下のプライマーを使用した：Alplマウス, Mm00475834_m1；Runx2マウス, Mm00501580_m1；Ibspマウス, Mm00492555_m1；真核細胞18S rRNA内在性対照（VIC/MGB Probe, Primer limited）。
ＭＳＣコロニー形成
新鮮なＭＳＣを６ウェルプレートに播種し（１００個の細胞／ウェル）、ＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）及びＰＤＧＦ－ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むか又は含まない６ｍｌのａ－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax及び１０％のＦＢＳ含有する）中で５日間増殖させた。培地を一度交換し、細胞を更に５日間培養した。コロニー形成を評価するために、培地を吸引し、プレートをＰＢＳですすいだ。次いで、メタノール中３％のクリスタルバイオレット溶液で細胞を１０分間染色した。過剰なクリスタルバイオレットが除去されるまで、プレートを水で洗浄した。コロニーの数（５０個以上、光学顕微鏡により決定した）を数え、その大きさをＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。
細胞増殖アッセイ
細胞（ＭＳＣ継代培養３又は骨芽細胞）を、低血清α－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、１％のＦＢＳ）中で２４時間飢餓状態とした。次いで、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＢＢ及び／又は１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－１β（Peprotech）を含有する低血清α－ＭＥＭが入った９６ウェルプレートに細胞を播種した（１，５００個の細胞／ウェル）。ＰＨＬＰＰ阻害実験では、培地に２０ｍＭのNSC-45586（Aobious）を添加した。ＩＬ－１Ｒａバリアントを用いる実験では、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は１，０００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１Ｒａ（R&D Systems）又はＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を培地に添加した。ＰＤＧＦ－ＢＢバリアントを用いる実験では、培地は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ又は２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＢＢ又はＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１のみ含有した。Cyquant（Thermo Fisher）及び式
（（基礎増殖群の細胞数／刺激群の細胞数）－１）×１００
を使用して、基礎増殖（低血清α－ＭＥＭのみ）に対する新しい細胞の割合（％）を算出した。
遊走アッセイ
１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－１βを含むか又は含まず、１０ｎｇ／ｍｌのマウスＰＤＧＦ－ＢＢを含む、低血清α－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、１％のＦＢＳ）を、コラーゲンＩ型（C4243, Sigma）で被覆したトランスウェル（８ｍｍ孔サイズ、Millipore）の底側に添加した。ＰＨＬＰＰ阻害実験では、培地に２０ｍＭのNSC-45586（Aobious）を添加した。直後に、細胞（２００ｍｌ中３０，０００個の細胞）をトランスウェルの上側に添加した。６時間後に、各インサートの膜を取り除き、ＤＡＰを有するVectashield封入剤（Vector Laboratories）を使用して、顕微鏡用スライドガラス上に載せた。膜の底側に遊走した細胞の数を、蛍光顕微鏡を使用して３つのランダムフィールドで計数した。遊走の倍数増加を、基礎的遊走（培地のみの底側）に対して計算した。
Ｓｍａｄタンパク質の定量
細胞（ＭＳＣ継代培養３又は骨芽細胞）を６ウェルプレートに播種し、α－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、１０％のＦＢＳ）を用いて、７０％コンフルエンシーとなるまで培養した。次いで、細胞を低血清のα－ＭＥＭで２４時間飢餓状態にしてから、ＰＢＳ又は１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－１β（Peprotech）で刺激した。Ｓｍｕｒｆ２阻害実験では、２０ｍＭのヘクリン（R&D Systems）を培地に添加した。２４時間後に、Ｓｍａｄ１／５／８相対レベルを、製造業者の指示に従い高感度ＥＬＩＳＡキット（Signosis、TE-0015）で定量した。
ＳＭＵＲＦ及びＰＨＬＰＰ定量的ＰＣＲ
細胞（ＭＳＣ継代培養３又は骨芽細胞）を６ウェルプレートに播種し、α－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、１０％のＦＢＳ）を用いて、７０％コンフルエンシーとなるまで培養した。次いで、細胞を低血清のα－ＭＥＭで２４時間飢餓状態にしてから、１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－１β（Peprotech）で０～７２時間（Ｓｍｕｒｆ実験）又は０～２４時間（ＰＨＬＰＰ実験）刺激した。RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）を使用して総ＲＮＡを単離し、ReverTra Ace（Toyobo Co., Ltd.）を使用して逆転写を実施した。以下のプライマーを用いるＴａｑＭａｎアッセイを使用して、定量的ＰＣＲをABI PRISM 7500を用いて実施した：Smurf1, Mm00547102_m1；Smurf2, Mm03024086_m1；Phlpp1, Mm01295850_m1；Phlpp2マウス, Mm01244267_m1；真核細胞18S rRNA内在性対照（VIC/MGB Probe, Primer limited）（Applied Biosystems）。
ＳＭＵＲＦ２及びＰＨＬＰＰ１のＥＬＩＳＡ
細胞（ＭＳＣ継代培養３又は骨芽細胞）を６ウェルプレートに播種し、α－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、１０％のＦＢＳ）を用いて、７０％コンフルエンシーとなるまで培養した。次いで、細胞を低血清のα－ＭＥＭで２４時間飢餓状態にしてから、ＰＢＳ又は１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－１β（Peprotech）で刺激した。２４時間後に、Ｓｍｕｒｆ２及びＰＨＬＰＰ１を、製造業者の指示に従いＥＬＩＳＡ（Mouse E3 Ubiquitin-Protein Ligase SMURF2及びMouse PH Domain Leucine-Rich Repeat-Containing Protein Phosphatase 1 ELISA Kit、MyBiosource）によって定量した。
Ａｋｔリン酸化アッセイ
細胞（ＭＳＣ継代培養３又は骨芽細胞）を６ウェルプレートに播種し、α－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、１０％のＦＢＳ）を用いて、７０％コンフルエンシーとなるまで培養した。細胞を低血清のα－ＭＥＭで２４時間飢餓状態にしてから、ＰＢＳ又は１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－１β（Peprotech）で４時間刺激した。次いで、マウスＰＤＧＦ－ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ、Peprotech）を０～１８０分間培地に添加した。ＰＨＬＰＰ阻害実験では、２０ｍＭのNSC-45586（Aobious）を培地に添加した。総Ａｋｔ及びリン酸化したＡｋｔを、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Phospho-Akt(S473)Pan Specific DuoSet IC、R&D Systems）で定量した。
ＳＡ－β－ｇａｌアッセイ
ＭＳＣ（継代培養４）を、ＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ、Peprotech）を含有するα－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、５％のＦＢＳ）に、３，０００個の細胞／ｃｍ２で播種した。培地は３日ごとに交換し、５日目と１５日目に細胞を老化分析した。１５日目に播種した細胞は、期間中に２回継代し、過剰なコンフルエンシーを避けた。指定の時点で、細胞をTrypLE Express（Gibco）を使用して採取し、最初に、LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit（ＰＢＳ中で１：５００に希釈、Invitrogen）で４℃にて３０分間染色した。次いで、CellEvent Senescence Green Flow Cytometry Assay Kit（Invitrogen, #C10840）を使用して、製造業者の指示に従い、ＳＡ－β－ｇａｌ活性を測定した。簡潔に説明すると、細胞をパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中２％）で室温にて１５分間固定した。次いで、細胞を１％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、さらに、CellEvent Senescence Green Probe（予め温めたCellEvent Senescence Buffer中１：５００に希釈）で３７℃にて２時間、ＣＯ２の不存在下で染色した。インキュベーション後に、細胞を１％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液（１％のＢＳＡ及び５ｍｍのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中に再懸濁させ、BD LSRFortessa X-20で分析した。獲得後の分析はFlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）を使用した。
老化関連サイトカインの検出
ＭＳＣ（継代培養４）を６ウェルプレートに播種し、α－ＭＥＭ（１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのglutamax、２％のＦＢＳ）中で７０％コンフルエンシーとし、ＩＬ－１β（５ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。４８時間後に、培地中のサイトカインを、製造業者の指示に従って抗体アレイ（Mouse Cytokine Array Panel A、R&D Systems）を使用して検出した。４００ｍｌの細胞培養上清を用いアッセイした。化学発光シグナルは、ImageQuant LAS 4000を使用して検出し、ImageQuant TLソフトウェア（GE healthcare Life Sciences）で定量した。
骨損傷後のＩＬ－１βの放出
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの頭蓋冠欠損（直径４．５ｍｍ）を、頭蓋冠欠損モデルの項で説明したように、１ｍｇのマウスＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢ（Peprotech）を含むフィブリンマトリックスで処置した。１日、３日、６日、１０日及び１５日後に、部分的にリモデリングされたマトリックスと欠損を囲む骨組織（１ｍｍ遠位）を収集した。対照として、４．５ｍｍ直径の頭蓋冠骨組織を収集した（０日目）。フィブリン性マトリックス及び組織試料を、プロテアーゼ阻害剤（１０ｍｌに対して１錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche））を含む１ｍｌの組織タンパク質抽出試薬（T-PER、Thermo Scientific）中でインキュベートし、組織ホモジナイザーでホモジナイズした。組織溶解液を４℃で１時間インキュベートし、５，０００×ｇで５分間遠心分離した後、－８０℃で保存した。サイトカインを、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Mouse IL-1β/IL-1F2 DuoSet、R&D Systems）で検出した。
マクロファージの枯渇
手術の前日に、５ｍｇ／ｍｌのクロドロネートリポソーム又は空のリポソーム（Liposoma）２００μｌをＣ５７ＢＬ６マウス（１０～１２週齢）に静脈内注射した。更に２００μｌのクロドロネートリポソーム又は空のリポソームを６日目まで２日ごとに腹腔内注射した。マウスの脾臓を採取し、粉砕し、赤血球溶解緩衝液（８．３ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、蒸留水中１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）で赤血球を溶解させた。マクロファージの枯渇は、脾臓細胞を非特異的結合をブロックする１μｇ／ｍｌのTruStain FcX抗CD16/32（93、BioLegend）抗体に再懸濁し、ＰＢＳで希釈したZombie Aqua（BioLegend）で１：５００希釈することで確認した。次に、脾臓細胞をフローサイトメトリー緩衝液（１％のＢＳＡ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で希釈した以下の抗体で標識した；１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１１ｂ ＰＥ（Ｍ１／７０、BioLegend）、１μｇ／ｍｌの抗Ｌｙ６Ｇ ＢＶ４２１（１Ａ８、BioLegend）及び０．４μｇ／ｍｌのストレプトアビジンAPC/Fire 750（BioLegend）と結合した３μｇ／ｍｌの抗Ｆ４／８０ビオチン（ＲＥＡ１２６、Miltenyi Biotech）。試料をBD FACS Fortessa X20で獲得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）で分析した。
増殖因子によるマクロファージ刺激及び増殖因子受容体の検出
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８～１２週齢）の大腿骨及び脛骨由来の骨髄を、２７ゲージの針と１０ｍｌのシリンジを使用して、Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Gibco）で洗い流した。細胞を、７０μｍのナイロンストレーナーでろ過し、４℃にて５００×ｇで１０分間遠心分離し、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン及び２０％のＬ９２９線維芽細胞順化培地を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁させた。直径１５０ｍｍのペトリ皿に、５×１０７個の密度で細胞を播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で７日間培養した。培地は３日ごとに交換した。７日後に、３ｍＭのＥＤＴＡを含むＴｒｙｐＬＥ（Gibco）を使用してマクロファージを分離し、１０％の熱不活性化ＦＢＳ及び１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１ウェル当たり２×１０５個の細胞の密度で、１２ウェルプレートに播種した。１日後に、マクロファージを分離し、１μｇ／ｍｌのTruStain ＦｃＸ抗ＣＤ１６／３２（９３、BioLegend）とLIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit（ＰＢＳ中で１：５００希釈、Invitrogen）を用いて室温で３０分間染色した。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ビオチン抗ＣＤ１４０ａ（ＰＤＧＦＲａ）（１０μｇ／ｍｌ、ＡＰＡ５、Biolegend）、ＡＰＣ抗ＣＤ１４０ｂ（ＰＤＧＦＲｂ）（１０μｇ／ｍｌ、ＡＰＢ５、Biolegend）、Alexa Fluor 488抗ＢＭＰＲ１Ａ（２０μｇ／ｍｌ、Ｃ３２４４７、Signalway Antibody）、Alexa Fluor 647抗ＢＭＰＲ１Ｂ（２０μｇ／ｍｌ、Ｃ３２５４７、Signalway Antibody）、Alexa Fluor 488抗ＢＭＰＲ２（２０μｇ／ｍｌ、Ｃ３２９６１、Signalway Antibody）又はAlexa Fluor 647抗ＡＣＶＲ１（２０μｇ／ｍｌ、Ｃ４３６２７、Signalway Antibody）と共にインキュベートした。ＰＥ－ストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ、Biolegend）をビオチン抗マウスＣＤ１４０ａと共に使用した。細胞をLSRFortessa X-20で獲得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）を用いて解析した。
増殖因子及びＩＬ－１βのＥＣＭタンパク質への結合
ＥＬＩＳＡプレート（Greiner bio-one medium binding、Thermo Fisher Scientific）を、５０ｍｌのＰＢＳ中１００ｎＭのＥＣＭタンパク質で、３７℃にて１時間コーティングした。次いで、ウェルを４００ｍｌのＰＢＳ－Ｔ（０．０５％のTween（登録商標）20）で洗浄し、３００ｍｌのＢＳＡ溶液（ＰＢＳ－Ｔ中１％）で室温にて１時間ブロッキングした。ＥＣＭタンパク質をコーティングしていないウェル、及びＢＳＡ溶液のみでブロックしたウェルを、非特異的結合に関する対照として使用した。ＥＣＭをコーティングしたウェル及び対照ウェルを、ＢＭＰ－２（Peprotech）、マウスＰＤＧＦ－ＢＢ（Peprotech）、ＩＬ－１Ｒａ（R&D Systems）又はＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質の０～１００ｎＭの溶液（タンパク質低結合チューブ（PROKEEP、Watson bio lab）中で調製した０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中５０ｍｌ）と共に室温で１時間更にインキュベートした。次いで、ウェルを３００ｍｌのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中５０ｍｌのビオチン化ポリクローナル検出抗体と共に１時間インキュベートした。使用した検出抗体は、ＢＭＰ－２ではBMP-2 DuoSet ELISA（R&D Systems、DY355）、ＰＤＧＦ－ＢＢではPDGF-BB DuoSet ELISA（R&D Systems、DY8464）及びＩＬ－１ＲａではIL-1Ra/IL-1F3 DuoSet ELISA（R&D Systems、DY480）からのものであった。ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回更に洗浄し、５０ｍｌのストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共に２０分間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、ＴＭＢ（ThermoFisher）と、その後に５０ｍｌの停止溶液（０．１６Ｍの硫酸）を添加した。検出抗体及びストレプトアビジン－ＨＲＰの濃度は、製造業者の指示に従って使用した。解離定数（ＫＤ）を算出するために、
Ａ４５０ｎｍ＝Ｂｍａｘ＊［増殖因子又はＩＬ－１Ｒａバリアント］／（ＫＤ＋［増殖因子又はＩＬ－１Ｒａバリアント］）
を使用する１部位特異的結合モデルに、特異的結合値をフィッティングさせた。
フィブリンマトリックスからの増殖因子及びＩＬ－１Ｒａバリアントの放出
８ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories）、２Ｕ／ｍｌのヒトトロンビン（Sigma）、５ｍＭのＣａＣｌ２及び５００ｎｇ／ｍｌの増殖因子又はＩＬ－１Ｒａバリアントを用いて、フィブリンマトリックスを生成した。フィブリンマトリックスを３７℃で１時間重合させ、５００ｍｌの緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４）が入ったUltra Low Cluster ２４ウェルプレート（Corning）に移した。１００％放出対照としての役割を果たす対照ウェルは、５００ｍｌの緩衝液中に増殖因子及びＩＬ－１Ｒａバリアントのみを含有した。２４時間ごとに緩衝液を除去して－２０℃に保ち、新しい緩衝液と交換した。１００％放出対照のウェルでは、２０ｍｌの緩衝液を毎日取り出し、－２０℃で保存した。７日後に、増殖因子及びＩＬ－１Ｒａバリアントの累積放出を、参照として１００％放出対照を使用するＥＬＩＳＡで定量した（BMP-2 DuoSet、PDGF-BB DuoSet、IL-1Ra/IL-1F3 DuoSet；R&D Systems）。ＭＭＰによる放出アッセイでは、放出緩衝液が１００ｍＵ／ｍｌのプラスミン（Roche）を含む点以外は、同じ方法を使用した。
組換え増殖因子及びＩＬ－１Ｒａバリアント
ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を、それらのＮ末端に６×ヒスチジンタグ及びＣ末端にＰＩＧＦ１２３～１４１配列を有するように設計した。組換えタンパク質を、ｐＥＴ－２２ｂ（Novagen）を使用して大腸菌中で産生させ、次に、精製及びリフォールディングした。簡潔に説明すると、タンパク質産生及び細菌溶解の後に、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の可溶性画分を、キレートＳＦＦ（Ｎｉ）カラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーにおいて、大量のTriton（登録商標）X-114洗浄剤（０．１％ v/v）を用いて精製し、エンドトキシンを除去した。可溶化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、６ＭのＧｕＨＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．５）を使用して、ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を封入体から抽出した。次いで、抽出したタンパク質を、リフォールディング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧ、ｐＨ８．２）中に、４℃で４日間かけて１滴ずつ添加し、最終的なタンパク質溶液対緩衝液の比を１：１００とした。次いで、リフォールディングされたタンパク質を、キレートＳＦＦ（Ｎｉ）カラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーにおいて、大量のTriton（登録商標）X-114洗浄剤（０．１％ v/v）を用いて精製し、エンドトキシンを除去した。二量体を含有する画分を一緒に回収した。ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で保存し、ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を４ｍＭのＨＣｌ中で保存した。マウスの野生型ＩＬ－１Ｒａ及びＢＭＰ－２は、Peprotechから購入し、エンドトキシンは含まれていなかった。
マクロファージの極性化
頭蓋冠欠損を上述したフィブリンマトリックスで処置した。マトリックスをＩＬ－１Ｒａ ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１（２５０ｎｇ）で機能化した。マウスを、術後３日、６日又は９日目に屠殺し、マトリックスを、欠損領域を囲む骨（１ｍｍ遠位）と共に採取した。次いで、採取した材料を機械的に細かく砕き、３７℃でコラゲナーゼＸＩ（１ｍｇ／ｍｌ、Gibco）により消化した。３０分後に、５００μｌの血清を添加し、消化した材料を７０μｍのセルストレーナーに通過させ、遠心分離した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し，ＰＢＳ中のLIVE/DEAD Zombie Aqua（１：５００希釈、BioLegend）で標識した。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２％の熱不活性化ＦＢＳを含むＰＢＳ中で１５分間、表面を染色した。細胞をＦｏｘＰ３固定及び透過処理キット（eBioScience）を使用して固定し、Biolegends社製の以下の抗体；抗Ｆ４／８０ ＦＩＴＣ（ＢＭ８）、抗ＣＤ１１ｂ ＰＥ（Ｍ１／７０）、抗ＣＤ８０ ＢＶ４２１（１６－１０Ａ１）及び抗ＣＤ２０６ ＰＥ－Ｃｙ７（Ｃ０６８Ｃ２）と共にインキュベートした。試料をCyAn ADP（Beckman Coulter）で獲得し、データをFlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）で分析した。
長骨欠損
手術に使用したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）は１４週齢であった。大腿骨欠損及び安定化は、RISystem（RIS.401.130）から購入したMouseFixプレート６穴システムを使用した。簡潔に説明すると、マウスをイソフルランで麻酔した。左後肢を剃毛し、ヨードワイプを使用して無菌手術のためにスクラビングした。皮膚及び筋膜を股関節から膝まで切開し、外側広筋と大腿二頭筋を分割して大腿骨の全長を露出させた。安定化プレートを大腿骨に４本のネジで固定し、ソーガイドとワイヤーソーを使用して２ｍｍの骨切除術を実施した。欠損を、大腿骨の制限された末端間で、重合したフィブリンマトリックスで満たした（欠損ごとに４０μｌ、１４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories）、２Ｕ／ｍｌのトロンビン（Sigma-Aldrich）、５ｍＭのＣａＣｌ２、２５μｇ／ｍｌのアプロチニン（Roche））。１μｇのＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を含むか又は含まない、１μｇのＢＭＰ－２及び１μｇのＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１で、マトリックスを機能化した。マウスを手術の１２週後に屠殺し、大腿骨をマイクロＣＴで分析した。
結果
ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの再生効果はIl1r1－／－マウスにおいて増強される
増殖因子の局所送達によって駆動される骨再生中のＩＬ－１Ｒ１の重要性を評価するために、ＩＬ－１Ｒ１ノックアウトマウスにおいて、組換えＢＭＰ－２とＰＤＧＦ－ＢＢの再生能を分析した。代表的な骨再生モデルとして、フィブリンマトリックスで送達された増殖因子によって処置された臨界サイズの頭蓋冠欠損を使用した。処置の２か月後に、石灰化した骨による欠損の被覆率及び新たに形成された骨の体積を測定した。予測したように、野生型マウスにＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢを送達すると、再生がある程度増強された。しかし、両増殖因子の再生効果は、Il1r1－／－マウスにおいて有意に増強され、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢによって駆動される再生が、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達によって損なわれることが示唆された（図１１）。
ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達は骨形成細胞のＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢに対する応答を阻害する
骨再生中に、ＢＭＰ－２は、骨形成細胞、すなわち骨幹／前駆細胞及び骨芽細胞の分化を誘導し、ＰＤＧＦ－ＢＢはこれらの細胞の遊走及び増殖を誘導する。したがって、骨損傷後に放出される主要なＩＬ－１Ｒ１リガンドであるＩＬ－１βが、これらの重要な細胞プロセスを誘導する増殖因子の能力に及ぼす影響を検討した。骨形成細胞モデルとして、緻密骨由来の間葉系間質細胞（ＭＳＣと呼ぶ－図１２）及び骨芽細胞を使用した。ＩＬ－１βは、ＢＭＰ－２の骨芽細胞特異的遺伝子を上方調節する能力及びＭＳＣにおいてマトリックスの石灰化を誘導する能力を有意に阻害した（図１３Ａ、１３Ｂ）。同じ効果は、骨芽細胞の分化マーカーの発現で観察された（図１４）。ＭＳＣはＰＤＧＦ受容体－β（ＰＤＧＦＲ－β又はＣＤ１４０ｂ、図１２）を高度に発現しているので、ＰＤＧＦ－ＢＢによる刺激は、コロニー形成単位－線維芽細胞（ＣＦＵ－Ｆ）の形成を増強する。しかし、ＩＬ－１βが、ＣＦＵ－Ｆ形成におけるＰＤＧＦ－ＢＢのブースト効果を阻害することが判明した（図１３Ｃ、１３Ｄ）。同様に、ＩＬ－１βはＰＤＧＦ－ＢＢに駆動されるＭＳＣ及び骨芽細胞の増殖及び遊走を阻害し（図１３Ｅ及び１３、図１５）、これらの骨形成細胞の増殖因子に対する応答が、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達によって損なわれることが更に裏付けられた。
ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達への曝露はＭＳＣ及び骨芽細胞の増殖因子に対する感受性を低下する
Ｓｍａｄタンパク質（Ｓｍａｄ１／５／８）はＢＭＰ－２シグナル伝達において重要であるため、ＩＬ－１Ｒ１活性化のＳｍａｄ１／５／８に対する影響を検討した。Ｓｍａｄ１／５／８に特異的なＥＬＩＳＡ系を使用して、ＭＳＣ及び骨芽細胞をＩＬ－１βで刺激すると、Ｓｍａｄ１／５／８の減少がもたらされることが判明した（図１６Ａ、図１７Ａ）。さらに、ＩＬ－１βは、Ｓｍａｄ１／５／８をユビキチン化及び分解の標的とするＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼＳｍｕｒｆ２の発現を有意に上方調節した（図１６Ｂ、１６Ｃ）。ＩＬ－１βが、Ｓｍｕｒｆ２に起因するＳｍａｄ１／５／８分解によるＢＭＰ－２駆動骨芽細胞分化を阻害することを検証するために、Ｓｍｕｒｆ２の選択的阻害剤であるヘクリンを使用した。ＩＬ－１βによるＢＭＰ－２駆動骨芽細胞分化の阻害は、マトリックス石灰化の救済によって示されるように、ヘクリンの存在下で停止した（図１６Ｄ）。ＩＬ－１β－Ｓｍｕｒｆ２－Ｓｍａｄ１／５／８軸を更に確認すると、ＩＬ－１β刺激後のＳｍａｄ１／５／８分解は、ヘクリンの存在下で阻害された（図１６Ｅ）。
Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）リン酸化はＰＤＧＦ－ＢＢシグナル伝達の中心であるため、このキナーゼに対するＩＬ－１Ｒ１刺激の影響を試験した。ＭＳＣ及び骨芽細胞をＩＬ－１βとプレインキュベートした場合、ＰＤＧＦ－ＢＢ刺激後に通常誘導される（Ｓｅｒ４７３での）Ａｋｔリン酸化が急速に低下し（図１６Ｆ、図１７Ｂ）、細胞がＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達にさらされるとＡｋｔ脱リン酸化が速くなることが示された。Ａｋｔの脱リン酸化は主にプレクストリン相同性ドメインロイシンリッチリピートタンパク質ホスファターゼ（ＰＨＬＰＰｓ）によって引き起こされるので、ＩＬ－１βがそれらの発現を調節するか否かを更に試験した。注目すべきことに、ＩＬ－１βによるＭＳＣの刺激は、ＰＨＬＰＰの発現を急速に増加させることが判明した（図１６Ｇ、１６Ｈ）。次いで、ＩＬ－１βが、ＰＨＬＰＰが駆動するＡｋｔの脱リン酸化により、ＰＤＧＦ－ＢＢに対する応答を阻害することを確認するために、ＰＨＬＰＰの選択的阻害剤であるNCS-45586を使用した。NCS-45586の存在下で、ＩＬ－１βによるＭＳＣの増殖及び遊走の阻害、並びにＡｋｔの脱リン酸化が抑制され（図１６Ｉ、１６Ｊ、１６Ｋ）、ＩＬ－１β－ＰＨＬＰＰｓ－Ａｋｔ経路が確認された。
最後に、Ｓｍｕｒｆ２がこの細胞プロセスに関連していることから、ＭＳＣの老化に対するＩＬ－１βの効果を試験した。老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）活性の増加が老化の特徴であると考えられていることから、それを測定することを選択した。興味深いことに、ＭＳＣをＩＬ－１βで処置すると、時間依存的にＳＡ－β－ｇａｌ活性が上昇することが判明し、ＩＬ－１βがこれらの細胞における老化誘導を加速させることが示唆された（図１６Ｌ、１６Ｍ）。さらに、ＩＬ－１βによるＭＳＣ処置は、ＩＬ－６、ＣＣケモカインリガンド（ＣＣＬ）１及び３、並びにＣＸＣケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１、マウスのＩＬ－８相同物）を含む代表的な老化関連サイトカインの分泌を誘導した（図１８）。
ＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢの局所送達はマクロファージによるＩＬ－１βの放出を誘導する
ＩＬ－１βは、骨治癒における主要なＩＬ－１Ｒ１リガンドであることから、増殖因子で処置した後の頭蓋冠欠損におけるその濃度を測定した。驚くべきことに、ＩＬ－１βは骨損傷後に放出されたが、ＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢの送達により、処置後の最初の２週間でサイトカインが有意に増加した（図１９Ａ）。次に、どの細胞型が欠損微小環境におけるＩＬ－１βの主要な供給源であるかを決定するために、クロドロネートリポソームによってマクロファージが枯渇したマウスで実験を繰り返した（図２０）が、これは、これらの細胞が多量のＩＬ－１βを放出するためである。興味深いことに、マクロファージの非存在下では、骨欠損部におけるＩＬ－１β濃度は、ＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢの送達によって増強されず、２つの増殖因子がマクロファージによるＩＬ－１βの放出を引き起こすことが示唆された（図１９Ｂ）。実際に、初代骨髄由来マクロファージ（非極性化）は、それらの受容体の一部（ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ及びＡＣＶＲ１、並びに少ないもののＢＭＰＲ１Ｂ及びＢＭＰＲ２；図２１）を発現するので、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＢＭＰ－２に応答するようになっていることを確認した。ＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢによるin vitroでのマクロファージの刺激がＩＬ－１βの放出を誘導し（図１９Ｃ）、増殖因子がマクロファージによるＩＬ－１βの放出を引き起こすことが確認された。まとめると、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達への曝露は、骨形成細胞（ＭＳＣ及び骨芽細胞）のＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢに対する応答を阻害し、増殖因子の局所送達は、マクロファージによるＩＬ－１β放出を引き起こすことでＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達を更に促進することを示す（図２２）。
ＰＩＧＦ１２３～１４１とＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａの融合はＥＣＭタンパク質に対する超親和性を付与する
ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達が、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの再生促進性効果を厳密に阻害することが判明したため、増殖因子をＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）と同時に送達し、優れた再生を促進することを考えた。最初に、送達を最適化するために、フィブリン及び内在性の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する組換えタンパク質の親和性を増強することにした。ＢＭＰ－２は、フィブリン及びさまざまなＥＣＭタンパク質に対して高い結合親和性を有することが知られているところ、増殖因子がフィブリン及び一部の一般的なＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、及びテネイシンＣ）に強力に結合することを確認した（図２３）。ＰＤＧＦ－ＢＢのフィブリン及び他のＥＣＭタンパク質に対する結合親和性は中程度であることが知られているが、ＩＬ－１ＲａがＥＣＭタンパク質に結合する能力は、ほとんど報告されていない。したがって、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａを、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）由来の非常に親和性の高いＥＣＭ／フィブリン結合配列を含むように改変した。ＰＩＧＦ１２３～１４１をＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１ＲａのＣ末端に付加して、ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を生成した（図２４Ａ、図２５）。ＰＩＧＦ１２３～１４１をＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａに融合させることにより、試験を行った全てのＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びフィブリノーゲン）に対して非常に強力な結合（すなわち、超親和性）がもたらされ、親和性は４～１００倍増加した（図２４Ｂ、２４Ｃ）。さらに、ＢＭＰ－２並びにＰＩＧＦ１２３～１４１融合ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａはフィブリンに強力に保持され、野生型のＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａはすぐに放出された（図２４Ｄ）。ＢＭＰ－２、ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１及びＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１は、フィブリンに保持されていたが、フィブリン線維及びＰＩＧＦ１２３～１４１を切断するプロテアーゼであるプラスミンの存在下で徐々に放出された（図２６）。注目すべきは、野生型ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１に応答したＭＳＣの増殖が同様であった（図２７）ため、ＰＤＧＦ－ＢＢにＰＩＧＦ１２３～１４１を融合しても、その増殖因子の活性は変化しなかったことである。同様に、野生型ＩＬ－１Ｒａ及びＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１が同じ阻害活性を示した（図２７）ため、ＩＬ－１Ｒａは、ＰＩＧＦ１２３～１４１との融合によって損なわれなかった。
超親和性ＩＬ－１Ｒａは増殖因子駆動骨再生を強化する
超親和性ＩＬ－１Ｒａの局所送達がＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢによって駆動される骨再生をサポートするかどうかを試験するために、マウスにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損モデルを使用した。増殖因子を含まない野生型ＩＬ－１Ｒａを送達することにより、フィブリンのみの対照と比較して再生がわずかに増強されたのに対して、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１は野生型ＩＬ－１Ｒａと比較して有意に多くの骨形成を誘導した（図２４Ｅ、２４Ｆ）。ＢＭＰ－２を野生型ＩＬ－１Ｒａと同時に送達することにより、ＢＭＰ－２単独で送達する場合と比較して骨再生が強力に刺激された（図１１、図２４Ｅ、２４Ｆ）。しかし、ＢＭＰ－２のＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１とＢＭＰ－２との同時送達は、ＢＭＰ－２の野生型ＩＬ－１Ｒａとの同時送達と比較して有意により多くの骨形成を促進し、欠損がほぼ１００％被覆され、多くの骨体積が形成された（図２４Ｅ、２４Ｆ）。同様に、ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１のＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１との同時送達は、ＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１単独の送達及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１の野生型ＩＬ－１Ｒａとの同時送達と比較して、再生が有意に改善した（図２４Ｅ、２４Ｆ）。
ＩＬ－１ＲａはＩＬ－１βの炎症促進性作用を阻害するので、次いで、アンタゴニスト送達における、骨再生中のマクロファージの極性化に対する影響を試験した。マンノース受容体ＣＤ２０６は、組織中のＭ２様マクロファージの検出に広く受け入れられているので、この表面マーカーの上方調節に注目した。フィブリンのみで処置した欠損では、ＣＤ２０６陽性マクロファージは、損傷後の最初の９日間で徐々に増加した（図２８）。したがって、更なる分析のために９日目を選択した。興味深いことに、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１で処置したマウスは、９日後にＣＤ２０６陽性マクロファージの割合が高く（図２８）、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１が、マクロファージの抗炎症性表現型への迅速な極性化を促進することが示唆された。
最後に、超親和性ＩＬ－１Ｒａが、マウス大腿骨における臨界サイズの欠損モデルで、増殖因子によって駆動される骨再生を改善する可能性があるかどうかを試験した。２ｍｍの欠損を生成し、金属プレートで安定化させた。次いで、フィブリンを介するＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１と共に、又は、フィブリンを介するＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１なしで、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を送達した。注目すべきことに、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１と共に増殖因子を同時に送達することにより、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１不存在下での増殖因子の送達と比較して、３月後の欠損のほぼ完全な再生に至る多くの骨体積の形成がはっきりと誘導された（図２４Ｇ、２４Ｈ）。
考察
増殖因子は再生医療の強力なツールであるが、その応用は、シグナル伝達のダイナミクスをよく理解し、送達系を最適化することでおそらく克服できる多くの問題によって制限されている。さらに、組換え増殖因子の送達に対する免疫細胞の応答についてはほとんど解明されていないが、増殖因子の有効性と安全性を最適化するために非常に重要であると思われる。実際、免疫系は、増殖因子に基づく再生戦略を設計する際に考慮すべき重要なパラメータであると思われる。この実施例では、増殖因子に対する再生応答は、実際には常に組織の修復及び再生に付随する免疫性及び炎症性微小環境によって影響を受けると仮定した。炎症促進性サイトカインＩＬ－１は炎症及び免疫の中心的メディエーターであることから、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達が増殖因子によって駆動される再生にどの程度影響を及ぼすかを検討し、再生システムとしての骨に注目した。
骨再生の評価に一般的に使用されるモデルの中で、基礎研究及び応用研究において信頼性が高く、かつ、ばらつきの少ない、マウスの臨界サイズ頭蓋冠欠損モデルを選択した。さらに、このモデルは、ＩＬ－１Ｒ１欠損マウスを利用できるので、増殖因子で駆動される再生中のＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達の影響を調査するのに理想的である。注目すべきことに、Il1r1－／－マウスでは、組換えＢＭＰ－２とＰＤＧＦ－ＢＢの再生効果が大幅に増強されることが判明し、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達は、増殖因子の再生促進能力を損うことが強く示された。最も重要なことは、ＩＬ－１Ｒ１のブロックが、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢによって駆動される再生の改善に使用できることを示唆している。
骨再生に関連して、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢは、骨に常在するＭＳＣ及び骨芽細胞に作用し、新たな骨形成を促進することが周知である。ＢＭＰ－２は分化を促進し、ＰＤＧＦ－ＢＢは走化性及び増殖を促進する。この実施例では、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達が、両増殖因子によって引き起こされる基本的な形態形成作用が阻害されることが見いだされた。機構的に、本発明者らは、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達への曝露は、２つのメカニズムによって、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢに対するＭＳＣ及び骨芽細胞の応答性を低下させることを提唱する。ＢＭＰ－２では、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達によって、Ｓｍｕｒｆ２発現が増加し、Ｓｍａｄ１／５／８の分解が促進される。そして、Ｓｍａｄ１／５／８レベルの低下に起因して、ＢＭＰ－２に駆動される分化が損なわれる。この発見に一致して、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達によって活性化される主要な転写因子であるＮＦ－κＢは、Ｓｍｕｒｆ２を介してβ－カテニン分解を促進することによって、ＭＳＣの骨形成分化を阻害することが示されている。ＰＤＧＦ－ＢＢでは、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達によって、Ａｋｔの脱リン酸化を促進するＰＨＬＰＰの発現が増加し、通常ＰＤＧＦ－ＢＢが誘導する増殖及び遊走応答を損なう。同様に、ＮＦ－κＢを介してシグナル伝達する炎症性メディエーターも、ヒト軟骨細胞でＰＨＬＰＰ１を増強することが示されている。特に、Ｓｍａｄ１／５／８及びＡｋｔは多くの増殖因子のシグナル伝達に重要であることから、ＩＬ－１Ｒ１の活性化は、組換えＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの活性を阻害するだけではなく、ＢＭＰ、並びに、血管、線維芽細胞及び上皮増殖因子ファミリーの増殖因子など、他の有効な治療薬も阻害する可能性がある。
幹細胞及び前駆細胞など、修復及び再生に重要な細胞の老化は、筋骨格組織の治癒にとって大きな障害である。近年、ヒト及びマウスにおいて、ＮＦ－κＢが骨格幹／前駆細胞の老化及び機能不全と関連付けられている。この実施例では、増殖因子シグナル伝達におけるＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達の負の影響に加え、細胞をＩＬ－１βで処置した場合に、ＭＳＣのＳＡ－βｇａｌ活性が経時的に増強されたことから、ＩＬ－１Ｒ１の長期活性化（１～２週間）がＭＳＣの老化を促進することを示した。ＩＬ－１Ｒ１で駆動される老化に関する正確なシグナル伝達機構は依然として不明であるが、Ｓｍｕｒｆ２活性が細胞の老化と強く関連することが示されたため、ＩＬ－１Ｒ１活性化後のＳｍｕｒｆ２の発現の増強がおそらく重要である。
興味深いことに、骨欠損におけるＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの送達により、損傷組織中のＩＬ－１β濃度が有意に増加することが判明した。単球及びマクロファージが枯渇したマウスに増殖因子を送達してもＩＬ－１β濃度は増強されなかったため、ＩＬ－１βの増加は、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢに対するマクロファージの応答によるものと思われる。したがって、ＭＳＣ及び骨芽細胞におけるＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達の有害な効果は、組換えＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの送達に応答するマクロファージによってin vivoで悪化すると思われる。単球及びマクロファージへのＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの作用は依然として不明である。例えば、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢが単球及びマクロファージの走化性を誘導することが示されている。さらに、ＢＭＰ－２は、マクロファージの抗炎症性表現型への極性化を正又は負に調節してもよい。それにもかかわらず、ＢＭＰ－２の臨床使用における主な副作用の１つは、炎症の蔓延である。我々のデータは、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢに応答するマクロファージがＩＬ－１βの放出を引き起こし、炎症を促進することを示唆する。
ＩＬ－１βはＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの再生促進性作用を阻害し、これらの増殖因子はマクロファージによるＩＬ－１β放出を更に引き起こすため、これらをＩＬ－１Ｒａと同時送達して、骨再生を増強することを検討した。組換えＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢはいずれも、骨形成を促進することがＵＳＦＤＡで認可されている。しかし、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢは、おそらくは最適でない送達系に関連する高用量での使用のため、複数の臨床応用で、安全性と費用対効果に関して大きな懸念が提起された。ＩＬ－１Ｒａ（アナキンラ、Kineret）は、関節リウマチ及び新生児発症の多臓器炎症性疾患の処置のために承認されている。しかし、ＩＬ－１Ｒａは非常に高用量（注射１回当たり１００ｍｇを超える）を複数回のバルク投与で使用する必要があり、この免疫抑制剤の使用は感染症及び免疫原性の原因となることが報告されている。したがって、組換えＢＭＰ－２、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａの全体的な臨床的有効性を考慮すると、送達部位に低用量の薬剤を正確に局在化させ、保持させることを可能にする、より優れた送達系を開発する必要がある。その戦略の１つは、生体材料担体及び送達される組織に存在する内在性ＥＣＭに強く結合するように組換えタンパク質を改変することである。ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａは、本来、ＥＣＭ構成成分及びフィブリンに対する親和性が比較的低いため、ＰＩＧＦ１２３～１４１を含むようにそれらを改変し、また、ＢＭＰ－２は、本来、多くの遍在するＥＣＭタンパク質と高い親和性で結合することから、野生型の形態で使用することに決定した。この戦略により、超親和性ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａ、並びにＢＭＰ－２をフィブリンマトリックス中に保持させ、フィブリン線維及びＰＩＧＦ１２３～１４１配列を自然に切断するプロテアーゼによって「オンデマンド」に放出することが可能になる。
全ての処置の組合せを試験するために、最初に、骨再生戦略の評価における簡便さと信頼性から、スクリーニングモデルとしてマウス頭蓋冠欠損を使用した。次いで、最も重要な処置を試験するために、臨床との関連が高いマウス大腿骨臨界サイズ欠損モデルに移行した。特に送達系又は骨誘導性生体材料を用いずに、野生型ＢＭＰ－２を低用量（欠損ごとに１ｍｇ未満）で送達すると、頭蓋冠欠損に適度な再生効果があることが知られているが、野生型ＰＤＧＦ－ＢＢの低用量（欠損ごとに１ｍｇ未満）では通常有意な効果がない。予測したように、野生型ＢＭＰ－２がある程度の再生を引き起こすことが観察されたが、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＩＬ－１Ｒａの超親和性バージョンは、野生型と比較して、再生能が高いことが判明した。改変したＰＤＧＦ－ＢＢとＩＬ－１Ｒａの活性の増強は、フィブリン及び内在性ＥＣＭタンパク質への結合親和性が非常に高く、そのため、送達部位での保持が高いためであると考えられる。最も重要なことに、ＢＭＰ－２を超親和性ＩＬ－１Ｒａと同時送達すること、又は超親和性ＰＤＧＦ－ＢＢを超親和性ＩＬ－１Ｒａと同時送達することにより、ＢＭＰ－２又は超親和性ＰＤＧＦ－ＢＢ単独の送達と比較して、優れた骨再生が有意に刺激されることが実証された。さらに、大腿骨欠損モデルにおける超親和性ＩＬ－１Ｒａによって、増殖因子の再生能が増強されることが確認された。したがって、これらのモデルの結果は、超親和性ＩＬ－１ＲａによりＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達を阻害すると、ＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢに対する骨再生応答が増強されることを明確に示している。
マクロファージが炎症性から抗炎症性へ状態と極性化することは、組織治癒において重要であることがよく知られている。したがって、マクロファージの極性化に対するＩＬ－１Ｒａ送達の影響も試験した。興味深いことに、超親和性ＩＬ－１Ｒａで処置したマウスは、一般的にＣＤ２０６の表面発現によって特徴付けられる抗炎症性マクロファージの割合が高かった。これは、超親和性ＩＬ－１Ｒａが、ＭＳＣ及び骨芽細胞におけるＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢのシグナル伝達を回復させることに加えて、抗炎症性表現型へのマクロファージの極性化をサポートすることによって、骨再生を促進する可能性があることを示唆する。
ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１を用いてＩＬ－１Ｒ１を局所的に阻害し、ＢＭＰ－２又はＰＤＧＦ－ＢＢの再生活性をサポートするという戦略は、モデルマウスにおいて非常に有望な結果を示している。しかし、このような戦略は、臨床に移行する前に、ヒトの骨構造と類似する骨構造を有するヒツジなどの大型動物で検証する必要がある。また、脊椎（ＢＭＰ－２）、足／足首（ＰＤＧＦ－ＢＢ）などの他の骨形成モデルで、この戦略を評価してもよい。増殖因子の野生型及びＩＬ－１Ｒａは臨床で承認されていることから、この戦略の移行は容易であるかもしれない。
結論として、増殖因子を再生医療に応用する場合、炎症及び免疫系を考慮することの重要性が強調される。実際、増殖因子による再生治療に、免疫経路の制御を統合することは、増殖因子の局在化と放出を制御するスマートな送達系と同程度に重要である。骨再生では、ＩＬ－１Ｒａのマトリックス結合形態が組換えＢＭＰ－２及びＰＤＧＦ－ＢＢの再生効率を大幅に向上させることを実証した。この戦略は、骨再生及び骨形成のみならず、慢性的な骨の炎症や、ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達が負の影響を有する他の組織で使用してもよい。
実施例４
ＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質で使用する更なるＥＣＭタンパク質の特定及び試験
ＥＣＭ結合候補物質の特定
ＰＩＧＦ－２１２３～１４１の配列は、ＲとＫ残基が１～４回繰り返された６つのブロックによって特徴付けられている。したがって、１個又は２個の非塩基性アミノ酸で分割された塩基性アミノ酸の６本のストレッチを含有するタンパク質モチーフを生成し、E. de Castro et al., (2006) Nucleic Acids Res., vol. 34, no. Web Server issue, pp. W362-5.に記載のScanPrositeオンラインツールを使用してUniProtKBデータバンクでこの検索モチーフを有するタンパク質の検索に使用した。
検索モチーフは以下のルールで作成した：
ＲとＫは互換性があり、［ＲＫ］と表記する。
ＰＩＧＦ－２１２３～１４１における［ＲＫ］の１回の繰り返しのブロックは、検索モチーフで［ＲＫ］（１、２）と表記した１回又は２回の繰り返しに変換できる。
ＰＩＧＦ－２１２３～１４１における［ＲＫ］のｎ回の繰り返しのブロックは、検索モチーフで［ＲＫ］（２、ｎ＋１）（式中ｎは２以上）と表記した２回～ｎ＋１回の繰り返しに変換できる。
ＰＩＧＦ－２１２３～１４１における［ＲＫ］のブロックを分割する残基は、検索モチーフでＸと表記した任意の残基の１回又は２回の繰り返しに変換できる。
続いて、得られた検索モチーフを含有する５０～１０００アミノ酸長のヒトタンパク質が同定された。次いで、そのリストからの増殖因子を、Altschul, S.F. et al., (1990), J. Mol. Biol., vol 215, no. 3, pp403-10.に記載の方法を使用して同一性スコアを生成するために、基本的なローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）を使用してＰＩＧＦ－２１２３～１４１に対して整列させた。
［ＲＫ］（２，４）Ｘ（１，２）［ＲＫ］（１，２）Ｘ（１，２）－［ＲＫ］（１，２）Ｘ（１，２）［ＲＫ］（２，５）Ｘ（１，２）［ＲＫ］（１，２）Ｘ（１，２）［ＲＫ］（１，２）
検索により、表２Ａに示す４つの増殖因子を含む検索モチーフを含有する３５７の配列が同定された。
Figure 2023530106000005
２つの配列が、ＥＣＭ結合能がMartino, M. M. et al, (2014) Science, vol. 343, no. 6173, pp. 885-8.で既に知られているＰＩＧＦ－２及び血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）に含まれたが、残りの２つは、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）及びアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）に由来し、これらのタンパク質のＥＣＭに対する親和性は未だ不明である。
ＮＲＴＮ１４６～１６０、ＡＲＥＧ１２６～１４３、及びＶＥＧＦ－Ａ１３３～１４７を、ＢＬＡＳＴを使用してＰＩＧＦ－２１２３～１４１とアラインし、同一性スコアを生成した（表２Ｂ）。興味深いことに、ＮＲＴＮ１４６～１６０は最も高いスコアを生じたが、ＶＥＧＦ－Ａ１３３～１４７についてはアルゴリズムがアライメントを生成できなかった。
Figure 2023530106000006
ＮＲＴＮ及びＡＲＥＧのＥＣＭタンパク質との結合親和性
ＮＲＴＮ及びＡＲＥＧのＥＣＭに結合する能力を確認するために、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びフィブリノーゲンに対する親和性を試験した（図２９）。表３は、ＥＣＭタンパク質に対するＰＩＧＦ－２、ＮＲＴＮ及びＡＲＥＧのＫＤ値（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ）を示す。ＡＲＥＧは、ＥＣＭタンパク質に対して、ＰＩＧＦ－２と同様に非常に高い親和性を示したが、ＮＲＴＮの親和性ははるかに低かった。ＢＬＡＳＴ同一性スコアが示すように、ＮＲＴＮはＡＲＥＧよりもＰＩＧＦ－２１２３～１４１との類似性が高く、ＮＲＴＮは新たに特定された２つの増殖因子の中で最も高い親和性を有することが示唆されることから、この結果は驚くべきことである。
Figure 2023530106000007
次いで、ＡＲＥＧがＥＣＭアナログに保持される能力を評価した。ＥＣＭに対する親和性が低いＡＲＥＧ、ＰＩＧＦ－２及びＰＩＧＦ－１をフィブリンマトリックスに添加し、マトリックスから放出されるタンパク質の割合を７日間毎日評価した（図３０）。ＰＩＧＦ－１の放出は２日後に６０％を超えたが、ＰＩＧＦ－２及びＡＲＥＧの放出は、７日後で３０％未満であった（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ）。注目すべきことに、ＡＲＥＧは、ＰＩＧＦ－２と同様にフィブリンマトリックス中に保持され、タンパク質の大部分は７日後にも依然としてマトリックスと結合していたが、ＰＩＧＦ－１の５０％より多くは２日後に放出された。
ＮＲＴＮ及びＡＲＥＧの断片はＥＣＭ及びヘパラン硫酸と特異的に結合する
ＮＲＴＮ及びＡＲＥＧの最小限のＥＣＭ結合配列を特定するために、ＮＲＴＮ１４６～１６３では５種、ＡＲＥＧ１２３～１４８では８種（表４）の切断構築物を生成した。断片を合成し、細菌発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ－１中にクローニングした。この断片を大腸菌ＢＬ２１で発現させ、GSTrap HP 5ml及びHis-tag HP 5ml（GE healthcare）アフィニティーカラムで精製した。フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びフィブリノーゲン、並びにヘパラン硫酸に対する親和性を試験し、その結果を図３１に示す。
Figure 2023530106000008
ＰＩＧＦ－２１２３～１４１（ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤ）、ＮＲＴＮ１４６～１５７（ＲＲＬＲＱＲＲＲＬＲＲＥ）及びＡＲＥＧ１２６～１３８（ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲ）は、ＥＣＭタンパク質及びヘパラン硫酸に対してより親和性を示した。ＥＬＩＳＡアッセイによって得られた結果（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ）の概要を表５に示す。ＩＬ－１Ｒａに融合したこれらの配列を含む融合タンパク質は、ＩＬ－１Ｒａに融合したＰＩＧＦ由来のＥＣＭ結合ペプチドを含む融合タンパク質と同一又は類似の活性を有することが期待される。さらに、ＮＲＴＮ１４６～１５７又はＡＲＥＧ１２６～１３８を含むか、これからなるＥＣＭ結合配列を、ＩＬ－１Ｒａ以外のタンパク質をＥＣＭに送達するのに使用してもよく、このようなタンパク質には、特に創傷治癒及び組織再生のために、例えば、増殖因子、サイトカイン、抗体などの他の生物薬剤が含まれる。
Figure 2023530106000009
実施例５
ＡＲＥＧ１２６～１３８／ＰＤＧＦ－ＢＢ融合タンパク質のＥＣＭタンパク質への結合
ＡＲＥＧ１２６～１３８をＰＤＧＦ－ＢＢのＮ末端に融合し、ＡＲＥＧ１２６～１３８／ＰＤＧＦ－ＢＢを生成した。ＥＬＩＳＡプレートのウェルをＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びフィブリノーゲン）でコーティングし、ＡＲＥＧ１２６～１３８融合タンパク質又は野生型のタンパク質と更にインキュベートした。グラフは、ＰＤＧＦ－ＢＢを検出する抗体のシグナルを示す。シグナルを、
Ａ４５０ｎｍ＝Ｂｍａｘ＊［タンパク質］／（Ｋｄ＋［タンパク質］）
（式中、［タンパク質］は、ＰＤＧＦ－ＢＢ又はＡＲＥＧ１２６～１３８／ＰＤＧＦ－ＢＢの濃度）
を使用して、解離定数（Ｋｄ）を得るために非線形回帰にフィッティングさせた。代表的な結合曲線を図３２に示す。
ＡＲＥＧ１２６～１３８融合タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、試験を行ったＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びフィブリノーゲン）に対して高い親和性を示した。
実施例６
糖尿病性創傷を処置するためのＡＲＥＧ１２６～１３８／ＰＤＧＦ－ＢＢ融合タンパク質
ＰＤＧＦ－ＢＢバリアントの局所送達が糖尿病性創傷の治癒を促進するかどうかを評価するために、再度Leprｄｂ／ｄｂモデルマウスを利用した。単一低用量のＰＤＧＦ－ＢＢ又は融合タンパク質を、全層創傷後に、生理食塩水中で局所的に送達した（０．５μｇのＰＤＧＦ－ＢＢ、及び等モル用量の改変された形態のＡＲＥＧ１２６～１３８／ＰＤＧＦ－ＢＢ）。
図３３Ａは、処置の７日又は９日後の代表的な組織像（ヘマトキシリン及びエオシン染色）を示す。黒の矢印は創傷の縁を、灰色の矢印は上皮の舌の先端を示す。上皮（存在する場合）は、創傷の上に均質な角化細胞層として現れる。上皮の下の肉芽組織は暗色の核を有する顆粒球を含有する。脂肪組織は透明な泡のように見える。スケールバー＝１。図３３Ｂは、組織切片の組織形態学的分析によって評価したＰＤＧＦ－ＢＢバリアントによる処置後の創傷閉鎖を示す。データは平均値±ＳＥＭであり、生理食塩水及びＡＲＥＧ１２６～１３８／ＰＤＧＦ－ＢＢではｎ＝１０の創傷、ＰＤＧＦ－ＢＢではｎ＝８の創傷である。ボンフェローニの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡによりペアワイズ比較（特に指定しない限り、有意差は生理食塩水と他の群との間で示される）。＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
処置の１週後に、ＡＲＥＧ１２６～１３８／ＰＤＧＦ－ＢＢを投与した創傷は、生理食塩水対照及びＰＤＧＦ－Ｂと比較して、有意に多くの閉鎖－再上皮化の程度によって特徴付けられる－が認められた。ＡＲＥＧ１２６～１３８／ＰＤＧＦ－ＢＢで処置した創傷では処置の９日後にはほぼ１００％の閉鎖が観察されたが、生理食塩水又はＰＤＧＦ－ＢＢで処置した創傷は依然として大きく開いていた。
実施例７
創傷を処置するためのＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質
ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質の創傷への効果を決定するために、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１で処置した創傷の表面電気容量を測定することによって、処置の９日後の上皮バリア性を試験した。生理食塩水で処置した創傷の静電容量は高い値を示したが、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１で処置した創傷は、無傷の皮膚で測定した値と同様の値を示し、体液の漏れが少なく、上皮バリアの再形成が示された（図３４）。
実施例８
皮膚創傷を処置するためのＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質
非糖尿病性創傷へのＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１融合タンパク質の効果を決定するために、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）のスプリントした全層の創傷を、生理食塩水又はＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１（０．６１μｇ）で処置した。処置の６日後の創傷閉鎖を、図３３Ａに示すように、組織切片の組織形態学的分析によって評価した。データは平均値±ＳＥＭ。状態ごとにｎ＝８の創傷。両側ウェルチのｔ検定。＊Ｐ≦０．０５。処置６日後の代表的な組織像（ヘマトキシリン及びエオシン染色）を図３３Ｂに示す。黒の矢印は創傷の縁を、灰色の矢印は上皮の舌の先端を示す。上皮の下の肉芽組織は暗色の核を有する顆粒球を含有する。脂肪組織は透明な泡のように見える。スケールバー＝１ｍｍ。
生理食塩水対照による処置と比較して、ＩＬ－１Ｒａ／ＰＩＧＦ１２３～１４１による処置は、野生型マウスの創傷閉鎖を有意に、しかし適度に改善した。
参考文献
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Claims (23)

  1. インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）、並びに、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ及びヘパラン硫酸からなる群から選択される１種以上又は全ての細胞外マトリックスタンパク質に特異的に結合する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）結合ペプチド、を含む融合タンパク質。
  2. 前記ＥＣＭ結合ペプチドが、配列番号１で示すアミノ酸配列又はその保存的バリアントを含む胎盤増殖因子のヘパリン結合ドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
    ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤ 配列番号１
  3. 前記ＥＣＭ結合ペプチドが、配列番号２で示すアミノ酸配列又はその保存的バリエーションを含むアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）由来のペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
    ＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲ 配列番号２
  4. 前記ＥＣＭ結合ペプチドが、配列番号３で示すアミノ酸配列又はその保存的バリエーションを含むニュールツリン（ＮＲＴＮ）由来のペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
    ＲＲＬＲＱＲＲＲＬＲＲＥ 配列番号３
  5. 前記ＥＣＭ結合ペプチドが、そのＮ末端でＩＬ－１Ｒａと直接的に又はリンカーを介して間接的に連結した、請求項１に記載の融合タンパク質。
  6. 前記ＩＬ－１Ｒａのアミノ酸配列が、配列番号４又は配列番号５で示すアミノ酸配列である、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記ＥＣＭ結合ペプチドが、配列番号１～３又は８～５９のいずれか１つで示すアミノ酸配列を有する又は含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  8. 配列番号６０又は配列番号６１で示すアミノ酸配列を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
  10. 請求項９に記載の核酸分子を含むベクター。
  11. 請求項９に記載の核酸分子又は請求項１０に記載のベクターが導入された細胞又は非ヒト生物。
  12. 請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、前記方法が、前記融合タンパク質を産生する条件で請求項１１に記載の細胞又は生物を培養すること、及び前記融合タンパク質を回収することを含む、方法。
  13. 請求項１２に記載の方法によって製造された融合タンパク質。
  14. 請求項１～８若しくは１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、又は、請求項１１に記載の細胞若しくは非ヒト生物と、場合によっては１種以上の賦形剤及び／又は担体を含む、医薬組成物又は獣医学組成物。
  15. ＩＬ－１Ｒａ投与が有益である又はＩＬ－１Ｒａシグナル伝達を弱める必要がある状態を処置する方法であって、前記方法が、請求項１～８若しくは１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載の細胞若しくは非ヒト生物、又は、請求項１４に記載の医薬組成物若しくは獣医学組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  16. 前記ＩＬ－１Ｒａ投与が有益である又はＩＬ－１Ｒａシグナル伝達を弱める必要がある状態が、組織再生、特に、骨再生及び／又は創傷修復を必要とする状態である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記状態が、創傷、熱傷若しくは筋肉の状態、又は、軟骨、腱若しくは骨の障害、特に、糖尿病性創傷である、請求項１６に記載の方法。
  18. 配列番号１で示すＰＩＧＦ１２３～１４１と融合したＩＬ－１Ｒａを含む融合タンパク質。
  19. 配列番号２で示すＡＲＥＧ１２６～１３８と融合したＩＬ－１Ｒａを含む融合タンパク質。
  20. 配列番号３で示すＮＲＴＮ１４６～１５７と融合したＩＬ－１Ｒａを含む融合タンパク質。
  21. 組織再生、特に、骨再生及び／若しくは創傷修復を増強する、又は、創傷、熱傷、並びに、筋肉、軟骨、腱及び骨の障害を処置する方法であって、前記方法が、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子が導入された細胞若しくは非ヒト生物、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター、又は、前記融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞若しくは非ヒト生物を含む医薬組成物若しくは獣医学組成物を投与することを含む、方法。
  22. 増殖因子投与の再生活性を増強する方法であって、前記方法が、前記増殖因子を、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子が導入された細胞若しくは非ヒト生物、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター、又は、前記融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞若しくは非ヒト生物を含む医薬組成物若しくは獣医学組成物と共に投与することを含む、方法。
  23. 増殖因子刺激に対する細胞の炎症又は感受性低下を低減する方法であって、前記方法が、前記増殖因子を、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のＩＬ－１Ｒａ融合タンパク質、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子が導入された細胞若しくは非ヒト生物、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター、又は、前記融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞若しくは非ヒト生物を含む医薬組成物若しくは獣医学組成物と一緒に投与することを含む、方法。
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