JP2517962B2 - 骨多孔症治療剤 - Google Patents
骨多孔症治療剤Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は骨多孔症治療剤に関する。更に詳しくは、ポ
リペプチドBUF−３（以下BUF−３と記す）を有効成分と
する骨多孔症治療剤に関する。
リペプチドBUF−３（以下BUF−３と記す）を有効成分と
する骨多孔症治療剤に関する。
従来技術 最近、老人人口の増加に伴い我が国においても骨多孔
症（別名、骨粗鬆症ともいう）患者が増加し、大きな社
会問題となっている。現在、この罹患患者数は約400万
人と推定されているが、社会の老令化に伴い今後増加す
ると思われる疾患である。
症（別名、骨粗鬆症ともいう）患者が増加し、大きな社
会問題となっている。現在、この罹患患者数は約400万
人と推定されているが、社会の老令化に伴い今後増加す
ると思われる疾患である。
さて、骨多孔症は骨の量が減少したり、骨格組織が萎
縮している疾患である。この疾患は骨量の減少により骨
梁が細くなって骨がもろくなり、その結果として椎骨，
大腿骨，頚骨等が骨折する極めて危険な疾患である。
縮している疾患である。この疾患は骨量の減少により骨
梁が細くなって骨がもろくなり、その結果として椎骨，
大腿骨，頚骨等が骨折する極めて危険な疾患である。
本疾患は閉経後の女性にみられる閉経期骨多孔症と
男女を問わず老人にみられる老年性骨多孔症の大きく
２つに分けられる。
男女を問わず老人にみられる老年性骨多孔症の大きく
２つに分けられる。
この骨多孔症の治療薬としては、従来骨溶解を抑制す
るカルチトニン、女性ホルモン（特に閉経後の女性に対
して投与される）、活性型ビタミンD3や蛋白同化スラロ
イドが用いられている。
るカルチトニン、女性ホルモン（特に閉経後の女性に対
して投与される）、活性型ビタミンD3や蛋白同化スラロ
イドが用いられている。
しかし、これらの治療剤では骨量の減少を食い止め、
骨量の増加を図るという根本的な治療には至っていな
い。
骨量の増加を図るという根本的な治療には至っていな
い。
またビタミンD3を用いた場合には、高カルシウム尿症
が出現するなど、いずれもいくつかの副作用が存在する
という問題点があった。
が出現するなど、いずれもいくつかの副作用が存在する
という問題点があった。
従って副作用が少なく、しかも骨量の減少を食い止
め、更に骨量の増加もたらす骨多孔症の治療薬の開発が
望まれているのが現状である。
め、更に骨量の増加もたらす骨多孔症の治療薬の開発が
望まれているのが現状である。
発明が解決しようとする問題点 従って本発明の課題は副作用が少なく、しかも骨多孔
症の根本的な治療に有効な因子を、ヒト細胞の産生する
種々の蛋白質の中から見つけ出し、新規な骨多孔症治療
剤を提供することにある。
症の根本的な治療に有効な因子を、ヒト細胞の産生する
種々の蛋白質の中から見つけ出し、新規な骨多孔症治療
剤を提供することにある。
問題点を解決するための手段 本発明者等は叙上の問題点を解決するため種々のヒト
細胞の生産物について骨形成促進作用物質を検索した結
果、ヒト悪性単球細胞を特定の分化誘導物質の共存下で
培養することによって生産されるポピペプチドBUF−３
がヒト骨髄細胞の増殖を促進する作用を有し、かつこの
作用により、骨多孔症を根本的に治療し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の骨
多孔症治療剤は下記の理化学的性質を有するポリペプチ
ドBUF−３を有効成分として含有することを特徴とす
る。
細胞の生産物について骨形成促進作用物質を検索した結
果、ヒト悪性単球細胞を特定の分化誘導物質の共存下で
培養することによって生産されるポピペプチドBUF−３
がヒト骨髄細胞の増殖を促進する作用を有し、かつこの
作用により、骨多孔症を根本的に治療し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の骨
多孔症治療剤は下記の理化学的性質を有するポリペプチ
ドBUF−３を有効成分として含有することを特徴とす
る。
（ａ）分 子 量:16±1kd（1.0％メルカプトエタノー
ル存在下、SDS−電気泳動法） 2.5±1kd（メルカプトエタノール非存在下、SDS−電気
泳動法） （ｂ）等 電 点:pl6.3±0.2（クロマトフャーカシン
グ法） pl7.3（等電点電気泳動法） （ｃ）pH安定性:pH2.0〜10.0の範囲で安定 （ｄ）熱安定性:65℃,60分の加熱で安定 （ｅ）有機溶媒安定性：低級アルコール，アセトニトリ
ルに対し安定 （ｆ）プロテアーゼ耐性：プロナーゼ処理で完全に失活
する。
ル存在下、SDS−電気泳動法） 2.5±1kd（メルカプトエタノール非存在下、SDS−電気
泳動法） （ｂ）等 電 点:pl6.3±0.2（クロマトフャーカシン
グ法） pl7.3（等電点電気泳動法） （ｃ）pH安定性:pH2.0〜10.0の範囲で安定 （ｄ）熱安定性:65℃,60分の加熱で安定 （ｅ）有機溶媒安定性：低級アルコール，アセトニトリ
ルに対し安定 （ｆ）プロテアーゼ耐性：プロナーゼ処理で完全に失活
する。
（ｇ）比 活 性:2×106U/mg蛋白 （ｈ）アミノ酸配列： 尚、本発明に係るポリペプチドBUF−３（以下、BUF−
３と略する）とは、上記アミノ酸配列を有するポピペプ
チド以外にも骨形成促進作用を有すれば、上記のアミノ
酸配列中の１個又は複数のアミノ酸を他のアミノ酸に置
きかえた構造のポリペプチド及び上記配列において１個
もしくは複数個のアミノ酸がＮ末端又はＣ末端に付加さ
れたポリペプチド、更には、上記配列のＮ末端又はＣ末
端より１個もしくは複数のアミノ酸が欠損し、かつ連続
しているアミノ酸配列よりなるポリペプチドも含まれ
る。
３と略する）とは、上記アミノ酸配列を有するポピペプ
チド以外にも骨形成促進作用を有すれば、上記のアミノ
酸配列中の１個又は複数のアミノ酸を他のアミノ酸に置
きかえた構造のポリペプチド及び上記配列において１個
もしくは複数個のアミノ酸がＮ末端又はＣ末端に付加さ
れたポリペプチド、更には、上記配列のＮ末端又はＣ末
端より１個もしくは複数のアミノ酸が欠損し、かつ連続
しているアミノ酸配列よりなるポリペプチドも含まれ
る。
BUF−３はマウスフレンドウィルス誘発白血病細胞F5
−５に対する分化誘導作用を指標に精製されたポリペプ
チドである。
−５に対する分化誘導作用を指標に精製されたポリペプ
チドである。
また、BUF−３はマウス白血病細胞を正常細胞に分化
成熟せしめる活性（特願昭61−150033、特願昭61−2554
98）以外にも、貧血防止作用（特願昭60−197276）及び
卵胞刺激ホルモン分泌作用（Nature,321,776−779,（19
86））を合せもつ有用な物質である。
成熟せしめる活性（特願昭61−150033、特願昭61−2554
98）以外にも、貧血防止作用（特願昭60−197276）及び
卵胞刺激ホルモン分泌作用（Nature,321,776−779,（19
86））を合せもつ有用な物質である。
さて、本発明のBUF−３は、骨芽細胞様細胞株MC3T3に
対して石灰化即ち骨形成作用を有し、またマウス及びヒ
トの培養細胞に対して毒性を示さないことより、ヒトの
骨多孔症の治療に有効であると考えられる。
対して石灰化即ち骨形成作用を有し、またマウス及びヒ
トの培養細胞に対して毒性を示さないことより、ヒトの
骨多孔症の治療に有効であると考えられる。
本発明の骨多孔症治療剤は主として非経口的（静脈
内、皮下、筋肉内）に投与される。前記有効成分BUF−
３の投与量は症状により異るが、通常成人当り0.05mg〜
50mgの用量範囲で一般に１回ないし数回に分けて投与す
ればよい。従って一日当りの投与量は約0.05〜200mgで
ある。もちろん、投与量は患者の病状、患者の体重及び
当業者が認める他の因子によって変化するので、上記投
与量を厳守する必要はなく、臨機応変に決定すればよ
い。
内、皮下、筋肉内）に投与される。前記有効成分BUF−
３の投与量は症状により異るが、通常成人当り0.05mg〜
50mgの用量範囲で一般に１回ないし数回に分けて投与す
ればよい。従って一日当りの投与量は約0.05〜200mgで
ある。もちろん、投与量は患者の病状、患者の体重及び
当業者が認める他の因子によって変化するので、上記投
与量を厳守する必要はなく、臨機応変に決定すればよ
い。
本発明に使用するBUF−３の製剤化は通常の方法によ
って行われ、主として注射型とされるが、他にカプセル
剤、錠剤等の剤型へ製剤化される。注射剤を調製する場
合には主薬のBUF−３に必要によりpH調整剤、緩衝剤、
安定化剤、保存剤などを添加し常法により静脈内、皮
下、筋肉内用注射剤とすればよい。又、経口用製剤を調
製する場合はBUF−３に賦形剤、さらに必要に応じて、
結合剤、崩壊剤、着色剤等を加え常法により錠剤、カプ
セル剤等とする。
って行われ、主として注射型とされるが、他にカプセル
剤、錠剤等の剤型へ製剤化される。注射剤を調製する場
合には主薬のBUF−３に必要によりpH調整剤、緩衝剤、
安定化剤、保存剤などを添加し常法により静脈内、皮
下、筋肉内用注射剤とすればよい。又、経口用製剤を調
製する場合はBUF−３に賦形剤、さらに必要に応じて、
結合剤、崩壊剤、着色剤等を加え常法により錠剤、カプ
セル剤等とする。
次に骨形成促進作用を有するBUF−３の製造法につい
て、以下に説明する。BUF−３を産生するヒト悪性化単
球細胞としては、ヒト白血病細胞又はヒト骨髄細胞を人
為的に悪性化させたもの、より具体的に例示すれば次の
ようなものが有る。ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｕ−93
7 ATCC CRL 1593.Int.J.Cancer17:565（1976）,K562,Bl
ood45:321（1975））、急性単球性白血病細胞（THP−1,
Int.J.Cancer26:171−176（1980））。もちろん、BUF−
３を生産していれば、上記以外のヒト白血病細胞を用い
てもかまわない。さて特定の分化誘導物質は、悪性化単
球細胞と接触させた時、この細胞をマクロファージ、顆
粒球の単球細胞に分化誘導させると共に、BUF−３を生
産せしめる作用を有する物質であり、具体的にはアクチ
ノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、コンカナバリンＡ及
びホルボールエステル（TPA）等の特定の分化誘導物質
である。
て、以下に説明する。BUF−３を産生するヒト悪性化単
球細胞としては、ヒト白血病細胞又はヒト骨髄細胞を人
為的に悪性化させたもの、より具体的に例示すれば次の
ようなものが有る。ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｕ−93
7 ATCC CRL 1593.Int.J.Cancer17:565（1976）,K562,Bl
ood45:321（1975））、急性単球性白血病細胞（THP−1,
Int.J.Cancer26:171−176（1980））。もちろん、BUF−
３を生産していれば、上記以外のヒト白血病細胞を用い
てもかまわない。さて特定の分化誘導物質は、悪性化単
球細胞と接触させた時、この細胞をマクロファージ、顆
粒球の単球細胞に分化誘導させると共に、BUF−３を生
産せしめる作用を有する物質であり、具体的にはアクチ
ノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、コンカナバリンＡ及
びホルボールエステル（TPA）等の特定の分化誘導物質
である。
本発明のBUF−３を生成せしめる方法は、悪性化単球
細胞を少くとも１種又は２種以上の上記特定の分化誘導
物質の共存下で培養することによりなされ、BUF−３は
培養液中（細胞外）に産生される。
細胞を少くとも１種又は２種以上の上記特定の分化誘導
物質の共存下で培養することによりなされ、BUF−３は
培養液中（細胞外）に産生される。
悪性化単球細胞を培養する培地は、動物細胞を培養す
る通常の培地が用いられる。例を挙げれば、ローズウェ
ル・パーク・メモリアル・インスティテュート1640培地
（Roswell Park Memorial Institute1640、以下、RPMI
−1640と略す。）が好適である。
る通常の培地が用いられる。例を挙げれば、ローズウェ
ル・パーク・メモリアル・インスティテュート1640培地
（Roswell Park Memorial Institute1640、以下、RPMI
−1640と略す。）が好適である。
悪性化単球細胞の培養は、通常１〜５×106個/mlの細
胞密度で、35〜38℃にて４〜６％の炭酸ガス気流中でゆ
るやかに撹拌しつつ行われる。特定の分化誘導物質は、
通常培養の最初より培地に添加しても良く又培養の途中
から添加しても良い。添加量は分化誘導物質の種類によ
って異なるがアクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ等
の場合には0.1〜10μg/ml、TPAの場合には１〜500μg/m
lである。このようにして１〜５日間培養するとBUF−３
は培養液中に蓄積される。
胞密度で、35〜38℃にて４〜６％の炭酸ガス気流中でゆ
るやかに撹拌しつつ行われる。特定の分化誘導物質は、
通常培養の最初より培地に添加しても良く又培養の途中
から添加しても良い。添加量は分化誘導物質の種類によ
って異なるがアクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ等
の場合には0.1〜10μg/ml、TPAの場合には１〜500μg/m
lである。このようにして１〜５日間培養するとBUF−３
は培養液中に蓄積される。
BUF−３は、骨形成促進作用以外にもFriendウィルス
誘発白血病細胞F5−５（Bibl.Haemat.,43,37（1976））
に対する分化誘導作用を有するので、この作用を利用し
てBUF−３の定性及び定量分析ができ、F5−５を用いる
分析は、Proc.Natl.Acad.Sci.,71，に記載の方法に従っ
て行われる。又活性の表示はF5−５細胞分化が明瞭に確
認される検体原液の稀釈率の逆数の値を原液1.0ml当り
の活性とする。この発明方法でBUF−３を生産した時、
培養液は４〜1000単位/mlの活性を示す。また上記方法
以外の方法、例えばBUF−３をコードする遺伝子を含有
するプラスミドにより形質転換された真核生物細胞を培
養液中で培養し、培養液中に該BUF−３を製造せしめる
という方法（昭和62年２月23日出願、出願人、味の素
（株））をもちいてもかまわない。
誘発白血病細胞F5−５（Bibl.Haemat.,43,37（1976））
に対する分化誘導作用を有するので、この作用を利用し
てBUF−３の定性及び定量分析ができ、F5−５を用いる
分析は、Proc.Natl.Acad.Sci.,71，に記載の方法に従っ
て行われる。又活性の表示はF5−５細胞分化が明瞭に確
認される検体原液の稀釈率の逆数の値を原液1.0ml当り
の活性とする。この発明方法でBUF−３を生産した時、
培養液は４〜1000単位/mlの活性を示す。また上記方法
以外の方法、例えばBUF−３をコードする遺伝子を含有
するプラスミドにより形質転換された真核生物細胞を培
養液中で培養し、培養液中に該BUF−３を製造せしめる
という方法（昭和62年２月23日出願、出願人、味の素
（株））をもちいてもかまわない。
さて、このように生産されたBUF−３の精製は通常の
ポリペプチドの精製法に準じて行われる。例えば培養液
を限外濾過法で濃縮し、この濃縮液からポリペプチドを
塩析し、透析後陰イオン交換体を使用するイオン交換ク
ロマトグラフィーを行うことにより粗ポリペプチド標品
が得られる。この粗標品について疎水クロマトグラフィ
ー又はクロマトフォーカシング法により殆んどの夾雑蛋
白が除去される。又この両者を組合せると更に精製倍率
を向上することができる。このようにして精製した標品
について逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）又は
スーパーローズ又はMonoQHR5/5カラムを装備したFPLC
（ファルマシア製Fast Protein Peptide Polynucletide
Liquid Chromatography）システムによる高性能ゲル濾
過法又はイオン交換クロマトグラフィーを行うことによ
り精製することができる。
ポリペプチドの精製法に準じて行われる。例えば培養液
を限外濾過法で濃縮し、この濃縮液からポリペプチドを
塩析し、透析後陰イオン交換体を使用するイオン交換ク
ロマトグラフィーを行うことにより粗ポリペプチド標品
が得られる。この粗標品について疎水クロマトグラフィ
ー又はクロマトフォーカシング法により殆んどの夾雑蛋
白が除去される。又この両者を組合せると更に精製倍率
を向上することができる。このようにして精製した標品
について逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）又は
スーパーローズ又はMonoQHR5/5カラムを装備したFPLC
（ファルマシア製Fast Protein Peptide Polynucletide
Liquid Chromatography）システムによる高性能ゲル濾
過法又はイオン交換クロマトグラフィーを行うことによ
り精製することができる。
本発明の効果 本発明に係るBUF−３を有効成分とする骨多孔症治療
剤は従来の治療薬である活性型ビタミンD3、カルシトニ
ンなどとは異なって骨の石灰化即ち骨形成を促進する作
用を有する為に根本的な骨多孔症の治療に有効である。
剤は従来の治療薬である活性型ビタミンD3、カルシトニ
ンなどとは異なって骨の石灰化即ち骨形成を促進する作
用を有する為に根本的な骨多孔症の治療に有効である。
また、BUF−３はヒト由来蛋白なので、抗原性が低
く、アレルギーを起こしにくい為に長期間の使用が可能
である。
く、アレルギーを起こしにくい為に長期間の使用が可能
である。
更に本発明の骨多孔症治療剤は活性型ビタミンD3とは
異って、当然高カルシウム尿症等の副作用を起こさない
という利点も有する。
異って、当然高カルシウム尿症等の副作用を起こさない
という利点も有する。
以下、本発明を実施例に従って具体的に説明する。
実施例１ ５％牛胎児血清を有するRPMI−1640無菌培地5.0を2
0容スピナーフラスコに張り込み、この培地にTHP−１
細胞を２×105個/mlになるように懸濁した。これを37℃
で４日間培養し、得られた培養液を遠心分離しTHP−１
細胞を無菌的に採取した。この細胞を別のスピンナーフ
ラスコに入れた血清を含まない上記RPMI−1640培地5.0
に移し、これにTPAを10ng/ml添加し、ゆるやかに液を
撹拌（100r.p.m.）しつつ、37℃で２日間培養（誘導）
を行った。このようにして得られた培養液を遠心分離し
て細胞を分離、除去し20単位/mlの活性を有する培養液
を得た。このようにして得た培養液に硫酸アンモニウム
70％飽和になるように添加し、生ずる沈澱物を遠心分離
（10,000r.p.m.、10分間）により採取し、少量の純水に
溶解した。これを0.05Mトリス−塩酸塩緩衝液（pH7.7）
に対して十分透析した（５℃、24時間）。透析内液を同
緩衝液で平衡化したDEAE−トーヨーパール650Mカラム
（7.0×70cm）に負荷した。このカラムを同緩衝液5.0
で洗浄した後、0.2Mの食塩を含有する同緩衝液で溶出し
た。この溶出区分を集め固型硫安を70％飽和加えて硫酸
沈澱させた。遠心分離によりこの沈澱物を集め、水20ml
に溶解した。この液に80％飽和の硫安溶液を20ml加え、
40％飽和硫安を含む0.05Mトリス−HCl緩衝液（pH7.7）
であらかじめ平衡化させたブチルトーヨーパール650Mカ
ラム（25×30cm）に負荷した。硫安濃度を段階的に下げ
た後、30％エタノールで溶出すると分化誘導活性物質が
溶出された。このブチルトーヨーパールによる疎水クロ
マトグラフィーの溶出パターンを第１図に示す。活性区
分を集め減圧下で濃縮してエタノールを除去し、この濃
縮液を0.05Mトリス−HCl緩衝液（pH7.7）に対して透析
した。透析内液を同緩衝液で平衡化したスーパーローズ
（ファルマシア社製ゲル濾過用カラム）を用いてゲル濾
過を行った。そのゲル濾過パターンを第２図に示す。第
２図に示すようにF5−５に対する分化誘導活性物質の溶
出時間は56.0分であり、標準蛋白質の溶出時間に基づい
てBUF−３の分子量を10±0.5kdと算出した。このサンプ
ルを0.05Mトリス−塩酸塩緩衝液（pH8.0）に対して透析
し、これを同緩衝液で平衡化したMonoQHR5/5カラム（フ
ァルマシア製陰イオン交換体）を使用するファルマシア
FPLC（Fast Protein,Peptide,Polynucleotide,Liquid C
hromatography）システムにより精製した。溶出は0.05M
から0.1Mまでの食塩のグラジエント溶出を行った。BUF
−３活性は0.1M附近の食塩で溶出された。この工程に於
る精製倍率は約５倍であり、ほぼ単一な蛋白に精製され
た。次にこのサンプルをハイポアRP304（バイオラッド
社製、Ｃ−４逆相用カラム）を用いて逆相HPLCを行っ
た。条件は0.1％トリフルオロ酢酸を展開液としｎ−プ
ロパノールの濃度を80％直線的に変えて溶出した。その
溶出パターンを第３図に示す。第３図に示す蛋白ピーク
と活性は完全に一致した。この活性ピークを集めて約10
0μｇの精製標品を得た。このサンプルについてSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度15.0％、メル
カプトエタノール共存下）を行った。その結果、15.5kd
に単一なバンド（銀染色法）が認められ、他に蛋白のバ
ンドは検出されなかった。このようにして精製されたサ
ンプルの比活性は約２×106U/mg蛋白であった。
0容スピナーフラスコに張り込み、この培地にTHP−１
細胞を２×105個/mlになるように懸濁した。これを37℃
で４日間培養し、得られた培養液を遠心分離しTHP−１
細胞を無菌的に採取した。この細胞を別のスピンナーフ
ラスコに入れた血清を含まない上記RPMI−1640培地5.0
に移し、これにTPAを10ng/ml添加し、ゆるやかに液を
撹拌（100r.p.m.）しつつ、37℃で２日間培養（誘導）
を行った。このようにして得られた培養液を遠心分離し
て細胞を分離、除去し20単位/mlの活性を有する培養液
を得た。このようにして得た培養液に硫酸アンモニウム
70％飽和になるように添加し、生ずる沈澱物を遠心分離
（10,000r.p.m.、10分間）により採取し、少量の純水に
溶解した。これを0.05Mトリス−塩酸塩緩衝液（pH7.7）
に対して十分透析した（５℃、24時間）。透析内液を同
緩衝液で平衡化したDEAE−トーヨーパール650Mカラム
（7.0×70cm）に負荷した。このカラムを同緩衝液5.0
で洗浄した後、0.2Mの食塩を含有する同緩衝液で溶出し
た。この溶出区分を集め固型硫安を70％飽和加えて硫酸
沈澱させた。遠心分離によりこの沈澱物を集め、水20ml
に溶解した。この液に80％飽和の硫安溶液を20ml加え、
40％飽和硫安を含む0.05Mトリス−HCl緩衝液（pH7.7）
であらかじめ平衡化させたブチルトーヨーパール650Mカ
ラム（25×30cm）に負荷した。硫安濃度を段階的に下げ
た後、30％エタノールで溶出すると分化誘導活性物質が
溶出された。このブチルトーヨーパールによる疎水クロ
マトグラフィーの溶出パターンを第１図に示す。活性区
分を集め減圧下で濃縮してエタノールを除去し、この濃
縮液を0.05Mトリス−HCl緩衝液（pH7.7）に対して透析
した。透析内液を同緩衝液で平衡化したスーパーローズ
（ファルマシア社製ゲル濾過用カラム）を用いてゲル濾
過を行った。そのゲル濾過パターンを第２図に示す。第
２図に示すようにF5−５に対する分化誘導活性物質の溶
出時間は56.0分であり、標準蛋白質の溶出時間に基づい
てBUF−３の分子量を10±0.5kdと算出した。このサンプ
ルを0.05Mトリス−塩酸塩緩衝液（pH8.0）に対して透析
し、これを同緩衝液で平衡化したMonoQHR5/5カラム（フ
ァルマシア製陰イオン交換体）を使用するファルマシア
FPLC（Fast Protein,Peptide,Polynucleotide,Liquid C
hromatography）システムにより精製した。溶出は0.05M
から0.1Mまでの食塩のグラジエント溶出を行った。BUF
−３活性は0.1M附近の食塩で溶出された。この工程に於
る精製倍率は約５倍であり、ほぼ単一な蛋白に精製され
た。次にこのサンプルをハイポアRP304（バイオラッド
社製、Ｃ−４逆相用カラム）を用いて逆相HPLCを行っ
た。条件は0.1％トリフルオロ酢酸を展開液としｎ−プ
ロパノールの濃度を80％直線的に変えて溶出した。その
溶出パターンを第３図に示す。第３図に示す蛋白ピーク
と活性は完全に一致した。この活性ピークを集めて約10
0μｇの精製標品を得た。このサンプルについてSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度15.0％、メル
カプトエタノール共存下）を行った。その結果、15.5kd
に単一なバンド（銀染色法）が認められ、他に蛋白のバ
ンドは検出されなかった。このようにして精製されたサ
ンプルの比活性は約２×106U/mg蛋白であった。
尚、実施例１で使用したTHP−１はInt.J.Cancer,26,1
71−176,（1980）に記載されているものであり、この報
文の著者より分与されたものである。
71−176,（1980）に記載されているものであり、この報
文の著者より分与されたものである。
実施例２ 骨芽細胞様細胞株MC3T3−E1（H.Kodama et al.Jpn.J.
Oral Biol.23:899−901（1981））を10％牛胎児血清を
含むα−MEM培地1ml中に２×105個になるようにけんだ
くし、24穴マルチウェルプレートにはん種した。37℃,5
％CO2存在下に静置し、２日後に培地を静かに取り除
き、新鮮な同培地1mlを加えた。以後、同様に、２日毎
に培地の交換を行った。12日目に10-11〜10-9MのBUF−
３を含んだα−MEM培地（１％の牛胎児血清,20mM HEPE
S,2.9mM PO4を含む）1mlに交換し、再び２日後に、Ａ群
としては10万cpmの45CaCl2を含む同培地1mlに、Ｂ群と
しては１μCiの〔3H〕TdRを含む同培地1mlに交換し、２
日間37℃,5％CO2下に静置した後ホスフェートバッファ
ーセーラインで２回洗滌した。引き続き、Ａ群は細胞を
液体シンチレーションカウンター用バイアルに移し、0.
1mlの60％HClO4と0.2mlの30％H2O2を加え、70℃で１時
間加熱した後メチルセロソルブを加えて放射活性を測定
した。Ｂ群は、細胞に10％TCAを加え、再び２回洗滌し
た後エタノールエーテル（3:1）で洗ってから250μの
NaOHに溶解し、放射活性を測定した。いずれの場合も、
BUF−３無添加をコントロールにした。
Oral Biol.23:899−901（1981））を10％牛胎児血清を
含むα−MEM培地1ml中に２×105個になるようにけんだ
くし、24穴マルチウェルプレートにはん種した。37℃,5
％CO2存在下に静置し、２日後に培地を静かに取り除
き、新鮮な同培地1mlを加えた。以後、同様に、２日毎
に培地の交換を行った。12日目に10-11〜10-9MのBUF−
３を含んだα−MEM培地（１％の牛胎児血清,20mM HEPE
S,2.9mM PO4を含む）1mlに交換し、再び２日後に、Ａ群
としては10万cpmの45CaCl2を含む同培地1mlに、Ｂ群と
しては１μCiの〔3H〕TdRを含む同培地1mlに交換し、２
日間37℃,5％CO2下に静置した後ホスフェートバッファ
ーセーラインで２回洗滌した。引き続き、Ａ群は細胞を
液体シンチレーションカウンター用バイアルに移し、0.
1mlの60％HClO4と0.2mlの30％H2O2を加え、70℃で１時
間加熱した後メチルセロソルブを加えて放射活性を測定
した。Ｂ群は、細胞に10％TCAを加え、再び２回洗滌し
た後エタノールエーテル（3:1）で洗ってから250μの
NaOHに溶解し、放射活性を測定した。いずれの場合も、
BUF−３無添加をコントロールにした。
Ａ群の結果より、第４図に示すように、MC3T3 E1細胞
による基質層への45Caの蓄積はBUF−３により用量依存
性に増加し、10-9Mの投与により約70％増加した。一
方、Ｂ群の結果より、第５図に示すように、〔3H〕チミ
ジンのDNAへの取り込みは10-11MのBUF−３により77％
に、更に10-9MのBUF−３により50％にまで低下した。
による基質層への45Caの蓄積はBUF−３により用量依存
性に増加し、10-9Mの投与により約70％増加した。一
方、Ｂ群の結果より、第５図に示すように、〔3H〕チミ
ジンのDNAへの取り込みは10-11MのBUF−３により77％
に、更に10-9MのBUF−３により50％にまで低下した。
第１図は、本発明BUF−３のブチルトーヨーパールによ
る疎水クロマトグラフィーの溶出パターンである。 第２図は、本発明のBUF−３のゲル濾過クロマトグラフ
ィーの溶出パターンである。 第３図は本発明BUF−３の逆相高速液体クロマトグラフ
ィーの溶出パターンである。 第４図は本発明BUF−３のMC3T3−E1細胞に対するCa蓄積
の影響を調べたものである。 第５図は本発明BUF−３のMC3T3−E1細胞に対する〔3H〕
TdR取り込みの影響を調べたものである。
る疎水クロマトグラフィーの溶出パターンである。 第２図は、本発明のBUF−３のゲル濾過クロマトグラフ
ィーの溶出パターンである。 第３図は本発明BUF−３の逆相高速液体クロマトグラフ
ィーの溶出パターンである。 第４図は本発明BUF−３のMC3T3−E1細胞に対するCa蓄積
の影響を調べたものである。 第５図は本発明BUF−３のMC3T3−E1細胞に対する〔3H〕
TdR取り込みの影響を調べたものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−240700（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−234097（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−141596（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
BUF−３を有効成分として含有する骨多孔症治療剤。 アミノ酸配列： （Ｎ末端）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62113828A JP2517962B2 (ja) | 1987-05-11 | 1987-05-11 | 骨多孔症治療剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62113828A JP2517962B2 (ja) | 1987-05-11 | 1987-05-11 | 骨多孔症治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63277629A JPS63277629A (ja) | 1988-11-15 |
| JP2517962B2 true JP2517962B2 (ja) | 1996-07-24 |
Family
ID=14622061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62113828A Expired - Fee Related JP2517962B2 (ja) | 1987-05-11 | 1987-05-11 | 骨多孔症治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2517962B2 (ja) |
-
1987
- 1987-05-11 JP JP62113828A patent/JP2517962B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63277629A (ja) | 1988-11-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |