JPS63277629A - 骨多孔症治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は骨多孔症治療剤に関する。更に詳しくは、４リ
ペグチドＢＵＦ−３（以下ＢＵＦ−３と記す）を有効成
分とする骨多孔症治療剤に関する。

従来技術 最近、老人人口の増加に伴い我が国においても骨多孔症
（別名、骨粗鬆症ともいう）患者が増加し、大きな社会
問題となっている。現在、この罹患患者数は約４００万
人と推定されているが、社会の老令化骨多孔症は骨の量
が減少したシ、骨格組織が萎縮していく疾患である。こ
の疾患は骨量の減少により骨量か細くなって骨がもろく
なり、その結果として椎骨、大腿骨１頭骨等が骨折する
極めて危険な疾患である。

本疾患は■閉経後の女性にみられる閉経期骨多孔症と■
男女を問わず老人にみられる老年性骨多孔症の大きく２
つに分けられる。

この骨多孔症の治療薬としては、従来骨溶解を抑制する
カルチトニン、女性ホルモン（特に閉経後の女性に対し
て投与される）、活性型ビタミンＤ３や蛋白同化スラロ
イドが用いられている。

しかし、これらの治療剤では骨量の減少を食い止め、骨
量の増加を図るという根本的な治療には至っていない。

またビタミンＤ３を用いた場合には、高カルシウム尿症
が出現するなど、いずれもいくつかの副作用が存在する
という問題点があった。

従って副作用が少なく、しかも骨量の減少を食い止め、
更に骨量の増加もたらす骨多孔症の治療薬の開発が望ま
れているのが現状である。

発明が解決しようとする問題点 従って本発明の課題は副作用が少なく、しかも骨多孔症
の根本的な治療に有効な因子を、ヒト細胞の産生ずる種
々の蛋白質の中から見つけ出し、新規な骨多孔症治療剤
を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者等は叙上の問題点を解決するため種々のヒト細
胞の生産物について骨形成促進作用物質を検索した結果
、ヒト悪性単球細胞を特定の分化誘導物質の共存下で培
養することによって生産されるポリペプチドＢＵＦ−３
がヒト骨髄細胞の増殖を促進する作用を有し、かっこの
作用にょシ、骨多孔症を根本的に治療し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の骨
多孔症治療剤は下記の理化学的性質を有するポリペグチ
ドＢＵＦ−３ｉ有効成分として含有することを特徴とす
る。

（ａ）分　子　ｉ：１６±１ｋｄ（１．０慢メルカプト
エタノール存在下、ＳＤＳ−電気泳動法） ２５±１ｋｄ（メルカプトエタノール非存在下、ＳＤＳ
−電気泳動法） （ｂ）等　電　点：　ｐｉ　６．３±０．２（クロマト
フヤーカンング法）Ｐｌ７．３（等電点電気泳動法） （ｃ）Ｐｌ（安定性：ｐ）！２．０〜１０．０の範囲で
安定（ｄ）熱安定性＝６５℃、６０分の加熱で安定（ｅ
）有機溶媒安定性：低級アルコール、アセトニトリルに
対し安定 （ｆ）グロテアーゼ耐性：プロナーゼ処理で完全に失活
する。

（ｇ）比活性：２Ｘ１０ＵＡ蛋白 （ｈ）アミノ酸配列： Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙｉ　Ａｍｐ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｙｓ　Ｖａｌ’　Ａｓｎ　　ｌｌ５Ｃｙｓ　　Ｃｙｇ　
　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｎ　　Ｐｈａ　　Ｐｈｅ　
Ｍａｌ　　Ｓｅｒ　　ＰｈｅＬｙｓ　Ａｓｐ　　ＩＩＩ
　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　　ＩＩｓ
　　ｌ１ｅＡｌａ　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ
　Ｈｌｓ　　Ａｌａ　Ａａｎ　Ｔｙｒ　　ＣｙｓＧｌｕ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　Ｈ
ｌｓ　　ＩＩＩ　Ａ１１ｌ　ＧｌｙＴｈｒ　　Ｓｅｒ　
　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　
　Ｐｈｅ　　Ｈｌｓ　　５ｅｒＴｈｒ　Ｖａｔ　　ＩＩ
Ｉ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ
　ＧｌｙＨ１ｓ　　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　Ａｌａ
　Ａｓｎ　Ｌ＠ｕ　　Ｌｙｅ　　Ｓｅｒ　　ＣｙｓＣｙ
ｓ　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　Ａ
ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ？ｊ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１００Ｍ＠ｔ　Ｌ＠ｕ　　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓ
ｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　　ｌ１ｅＩＩ＠
　　Ｌｙｅ　　Ｌｙｅ　Ａｍｐ　　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ａ
ｓｎ　Ｍａｔ　　Ｉｌｅ　Ｖａ１Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　　Ｃ
ｙａ　　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ尚、本発明に係るポ
リペプチドＢＵＦ−３（以下、ＢＵＦ−３と略する）と
は、上記アミノ酸配列を有するポリペプチド以外にも骨
形成促進作用を有すれば、上記アミノ酸配列中の１個又
は複数のアミノ酸を他のアミノ酸に置きかえた構造のポ
リペプチド及び上記配列において１個もしくは複数個の
アミノ酸がＮ末端又はＣ末端に付加されたポリペグチド
、更には、上記配列のＮ末端又はＣ末端より１個もしく
は複数のアミノ酸が欠損し、かつ連続しているアミノ酸
配列よシなるポリペプチドも含まれる。

ＢＵＦ−３はマウスフレンドウィルス誘発白血病細胞Ｆ
５−５に対する分化誘導作用を指標に精製されたポリペ
プチドである。

また、ＢＵＦ−３はマウス白血病細胞を正常細胞に分化
成熟せしめる活性（特願昭６１−１５００３３、特願昭
６１−２５５４９８　）以外にも、貧血防止作用（特願
昭６０−１９７２７６　）及び卵胞刺激ホルモン分泌作
用（Ｎａｔｕｒｅ、　３２１．７７６７７９．　（１９
８６）　）を合せもつ有用な物質である。

さて、本発明のＢＵＦ−３は、骨芽細胞様細胞株ＭＣ３
Ｔ３に対して石灰化即ち骨形成作用を有し、またマウス
及びヒトの培養細胞に対して毒性を示さないことより、
ヒトの骨多孔症の治療に有効であると考えられる。

本発明の骨多孔症治療剤は主として非経口的（静脈内、
皮下、筋肉内）に投与される。前記有効成分ＢＵＦ−３
の投与量は症状により異るが、通常成人ａ、ｐｏ、ｏｓ
■〜５０ｍ９の用量範囲で一般に１回ないし数回に分け
て投与すればよい。従って一日当シの投与量は約０．０
５〜２００ＭＩｙである。もちろん、投与量は患者の病
状、患者の体重及び当業者が認める他の因子によって変
化するので、上記投与量を厳守する必要はなく、臨機応
変に決定すればよい。

゛本発明に使用するＢＵＦ−３の製剤化は通常の方法に
よって行われ、主として注射剤とされるが、他にカプセ
ル剤、錠剤等の剤型へ製剤化される。注射剤を調製する
場合には専薬のＢＵＦ−３に必要に上り一調整剤、緩衝
剤、安定化剤、保存剤などを添加し常法によシ靜脈内、
皮下、筋肉内用注射剤とすればよい。又、経口用製剤を
調製する場合はＢＵＰ−３１ｃ賦形剤、さらに必要に応
じて、結合剤、崩壊剤、着色剤等を加え常法によシ錠剤
、カプセル剤等とする。

次に骨形成促進作用を有するＢＵＦ−３の製造法につい
て、以下に説明する。ＢＵＦ−３を産生ずるヒト悪性化
単球細胞としては、ヒト白血病細胞又はヒト骨髄細胞を
人為的に悪性化させたもの、より具体的に例示すれば次
のようなものが有る。ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｕ−
９３７Ａ’ｒＣＣＣＲＬ　１５９３　。

Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎａ＠ｒ　１７　：　５６５（１９７
６）、に５６２．　Ｂｌｏｏｄ４５　：　３２１（１９
７５）　）　、急性単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１、Ｉ
ｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｅ＠ｒ　２６　：　１７１−１７６（
１９８０）　）ｅもちろん、ＢＵＦ−３を生産していれ
ば、上記以外のヒト白血病細胞を用いてもかまわない。

さて特定の分化誘導物質は、悪性化単球細胞と接触させ
た時、この細胞をマクロファージ、顆粒球の単球細胞に
分化誘導させると共に、ＢＵＦ−３を生産せしめる作用
を有する物質であり、具体的にはアクチノマイシンＤ、
マイトマイシンＣ，コンカナバリンＡ及びホルデールエ
ステル（ＴＰＡ　）等の特定の分化誘導物質である。

本発明のＢＵＦ−３を生成せしめる方法は、悪性化単球
細胞を少くとも１種又は２種以上の上記特定の分化誘導
物質の共存下で培養することによシなされ、ＢＵＦ’−
３は培養液中（細胞外）に産生される。

悪性化単球細胞を培養する培地は、動物細胞を培養する
通常の培地が用いられる・。例を挙げれば、ローズウェ
ル・パーク・メモリアル・インスティテ、−）１６４０
培地（Ｒｏａｗ＠ｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒ１ｍｌＩ
ｎｓｔｉｔｕｔ＠１６４０　、以下ＲＰＭＩ−１６４０
と略す。）が好適である。

悪性化単球細胞の培養は、通常１〜５　Ｘ　１０’個／
―の細胞密度で、３５〜３８℃にて４〜６％の炭酸ガス
気流中でゆるやかに攪拌しつつ行われる。特　　・定の
分化誘導物質は、通常培養の最初よシ培地に添加しても
良く又培養の途中から添加しても良い。

添加量は分化誘導物質の種類によって異なるがアクチノ
マイシンＤ、マイトマイシ／ｃ等の場合には０．１〜１
０ｔｓｆ／ｙｄ、ＴＰＡ　Ｏ場合には１〜５００μｐ／
ｄである。このようにして１〜５日間培養するとＢＵＦ
−３は培養液中に蓄積される。

ＢＵＦ−３は、骨形成促進作用以外にもＦｒｉ・ｎｄウ
ィルス誘発白血病細胞Ｆ５−５　（Ｂｌｂｌ、Ｈａｅｍ
ａｔ、、４３．３７（１９７６）　）に対する分化誘導
作用を有するので、この作用を利用してＢＵＦ−３の定
性及び定量分析ができ、Ｆ５−５′ｔ−用いる分析は、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａａａｄ。

Ｓｃｉ、、　７１．に記載の方法に従って行われる。又
活性の表示はＦ５−５細胞分化が明瞭に確認される検体
原液の稀釈率の逆数の値を原液１．０−当シの活性とす
る。この発明方法でＢＵＦ−３を生産した時、培養液は
４〜１０００単位／−の活性を示す。また上記方法以外
の方法、例えばＢＵＦ−３をコードする遺伝子を含有す
るプラスミドにより形質転換された真核生物細胞を培養
液中で培養し、培養液中に該ＢＵＦ−３を製造せしめる
という方法（昭和６２年２月２３日出願、出願人、味の
素（株））をもちいてもかまわない。

さて、このように生産されたＢＵＦ−３の精製は通常の
ポリペプチドの精製法に準じて行われる。例えば培養液
を限外濾過法で濃縮し、この濃縮液からポリ（プチドを
塩析し、透析後隘イオン交換体を使用するイオン交換ク
ロマトグラフィーを行うことにより粗デリペズテド標品
が得られる。この粗標品について疎水クロマトグラフィ
ー又はクロマトフオーカシング法によシ殆んどの夾雑蛋
白が除去される。又この両者を組合せると更に精製倍率
を向上することができる。このようにして精製した標品
について逆相高速液体クロマトグラフィー　（ＨＰＬＣ
）又はスーパーローズ又はＭｏｎｏ　ＱＨＲ５１５カラ
ムを装備し九ＦＰＬＣ（ファルマシア製ＦａｓｔＰｒｏ
ｔｅｌｎ　Ｐ＠ｐｔｌｄ＠Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｔｉｄｅ
　ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　）シス
テムによる高性能ｒル濾過法又はイオン交換クロマトグ
ラフィーを行うことにより精製することができる。

本発明の効果 本発明に係るＢＵＦ−３を有効成分とする骨多孔症治療
剤は従来の治療薬である活性型ビタミンＤ３、カルシト
ニンなどとは異なって骨の石灰化即ち骨形成を促進する
作用を有する為に根本的な骨多孔症の治療に有効である
。

また、ＢＵＦ−３はヒト由来蛋白なので、抗原性が低く
、アレルギーを起こしにくい為に長期間の使用が可能で
ある。

更に本発明の骨多孔症治療剤は活性型ビタミンＤ、とは
異って、当然高カルシウム尿症等の副作用を起こさない
という利点も有する。

以下、本発明を実施例に従って具体的に説明する。

実施例１ ５％牛脂児血清を有するＲＰＭＩ−１６４０無菌培地５
．０１を２０１容スピナーフラスコに張り込み、この培
地にＴＨＰ−１細胞を２×１０　個／ｄになるように懸
濁した。これを３７℃で４日間培養し、得られた培養液
を遠心分離しＴＨＰ−１細胞を無菌的に採取した。この
細胞を別のスピンナーフラスコに入れた血清を含まない
上記ＲＰＭＩ−１６４０培地５．０ノに移し、これにＴ
ＰＡを１０　ｎｆ／Ｍｌ添加し、ゆるやかに液を攪拌（
１００ｒ、ｐ、ｍ、）しつつ、３７℃で２日間培養（誘
導）を行った。このようにして得られた培養液を遠心分
離して細胞を分離、除去し２０単位／ｄの活性を有する
培養液を得た。このようにして得た培養液に硫酸アンモ
ニウム７０％飽和になるように添加し、生ずる沈澱物を
遠心分離（１０，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、　、１０分間）に
よシ採取し、少量の純水に溶解した。これを０．０５Ｍ
　）　’Ｊスス−酸塩緩衝液（ＰＩ（７，７）に対して
十分透析した（５℃、２４時間）。透析内液を同緩衝液
で平衡化したＤＥＡＥ−トーヨ−ノ９−ル６５０Ｍカラ
ム（７，□ｘ７０ｃ１１Ｌ）に負荷した。このカラムを
同緩衝液５．Ｏｌで洗浄した後、０．２Ｍの食塩を含有
する同緩衝液で溶出した。この溶出区分を集め固型硫安
を７０％飽和加えて硫安沈澱させた。遠心分離によりこ
の沈澱物を集め、水２０１１７に溶解した。この液に８
０％飽和の硫安溶液を２０−加え、４０％飽和硫安を含
む０．０５Ｍ）リスーＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，７）であ
らかじめ平衡化させたプチルトーヨーパール６５０Ｍカ
ラム（２５×３０ｃＩＬ）に負荷した。硫安濃度を段階
的に下げた後、３０％エタノールで溶出すると分化誘導
活性物質が溶出された。このプチルトーヨーパールによ
る疎水クロマトグラフィーの溶出パターンを第１図に示
す。活性区分を集め減圧下で濃縮してエタノールを除去
し、この濃縮液を０．０５Ｍトリス−ＨＣ２緩衝液（ｐ
Ｈ７，７）に対して透析した。透析内液を同緩衝液で平
衡化したスーパーローズ（ファルマシア社製ｒル濾適用
カラム）を用いてダル濾過を行った。そのｒル濾過パタ
ーンを第２図に示す。第２図に示すようにＦ５−５に対
する分化誘導活性物質の溶出時間は５６．０分であり、
標準蛋白質の溶出時間に基づいてＢＵＦ−３の分子量を
１０±０．５　ｋｄと算出した。このサンプルを０．０
５　Ｍトリス−塩酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）に対して透
析し、これを同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ
５／　５カラム（ファルマシア製陰イオン交換体）を使
用するファルマシアＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ　Ｐ＠ｐｔｌｄ＊＊Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｓｏｔｉｄ＊
＋　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　）
システムにより精製した。溶出は０．０５　Ｍから０．
１Ｍまでの食塩のグラジエ／ト溶出を行った。ＢＵＦ−
３活性は０．１　Ｍ附近の食塩で溶出された。このニー
に於る精製倍率は約５倍であシ、はぼ単一な蛋白に精製
された。次にこのサンプルをハイポ７ＲＰ３０４（バイ
オラッド社製、Ｃ−４逆相用カラム）を用いて逆相ＨＰ
ＬＣを行った。条件は０．１％）リフルオロ酢酸を展開
液としｎ−グロパノールの濃度を８０％直線的に変えて
溶出した。その溶出パターンを第３図に示す。第３図に
示す蛋白ピークと活性は完全に一致した。この活性ピー
クを集めて約１００μ？の精製標品を得た。このサンプ
ルについてＳＤＳ−ポリアクリルアミドグル電気泳動（
グル濃度１５．０％、メルカグトエタノール共存下）を
行った。その結果、１５．５　ｋｄに単一なバンド（銀
染色法）が認められ、他に蛋白のバンドは検出されなか
った。

このようにして精製されたサンプルの比活性は約２Ｘ１
０Ｕ／ダ蛋白であった。

尚、実施例１で使用したＴＨＰ−１はＩｎｔ、Ｊ、Ｃａ
ｎｃｅｒ＊２６　、１７１−１７６　、　（１９８０）
に記載されているものであり、この雑文の著者よシ分与
されたものである。

実施例２ 骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅｌ　（Ｈ，Ｋｏｄａｍ
ａ　ａｔ　ｈＬ。

Ｊｐｎ、Ｊ、０ｒａｌ　Ｂｉｏｌ、２３　：８９９−９
０１（１９８１））を１０嘱牛脂児血清を含むα−ＭＥ
Ｍ培地１−中に２Ｘ１０５個になるようにけんだくし、
２４穴マルチウエルプレートにはん種した。３７℃、５
％Ｃ０２存在下に静置し、２日後に培地を静かに取シ除
き、新鮮な同培地１−を加えた。以後、同様に、２日毎
に培地の交換ヲ行ツタ。１２１目Ｋ　１０”　〜１０−
’　ＭＯＢＵＦ−３を含んだα−ＭＥＭ培地（１％の牛
胎児血清、２０ｎＩＭＨＥＰＥＳ　、２．９　ｍＭＰＯ
４を含む）１＄に交換し、再び２日後に、Ａ群としては
１０万ｅｐｍのＣａＣｌ２を含む同培地１ｄに、Ｂ群と
しては１μＣ１の〔３Ｈ〕ＴｄＲを含む同培地１−に交
換し、２日間３７℃、５％ＣＯ２下に静置した後ホスフ
ェートバッファーセーラインで２回洗滌した。引き続き
、Ａ群は細胞を液体シンチレーシ冒ンカウンター用バイ
アルに移し、０．１ｄの６０％ＨＣｔＯ４と０．２−の
３０％Ｈ２０□を加え、７０℃で１時間加熱した後メチ
ルセロソルブを加えて放射活性を測定した。Ｂ群は、細
胞に１０％ＴＣＡを加え、再び２回洗滌した後エタノー
ルエーテル（３：１）で洗ってから２５０μｊのＮａＯ
Ｈに溶解し、放射活性を測定した。いずれの場合も、Ｂ
ＵＦ−３無添加をコントロールにした。

Ａ群の結果より、第４図に示すように、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１
細胞による基質層への　Ｃａの蓄積はＢＵＦ−３により
用量依存性に増加し、１０　　Ｍの投与により約７０％
増加した。一方、Ｂ群の結果より、第５図に示すように
、ＣＨ）チミジンのＤＮＡへの取り込みは１０　　Ｍ　
（７）　ＢＵＦ−３により７７％Ｋ、更に１ｏ−９Ｍの
ＢＵＦ−３によシ５０％にまで低下した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明ＢＵＦ−３のプチルトーヨーパールに
よる疎水クロマトグラフィーの溶出ノ臂ターンである。 第２図は、本発明のＢＵＦ−３のｒル濾過クロマトグラ
フィーの溶出−臂ターンである。 第３図は本発明ＢＵＦ−３の逆相高速液体クロマトグラ
フィーの溶出ノぐターンである。 第４図は本発明ＢＵＦ−３のＭＣ３Ｔ３−Ｅｌ細胞に対
するＣａ蓄積の影響を調べたものである。 第５図は本発明ＢＵＦ−３のＭＣ３Ｔ３−Ｅｌ細胞に対
する（’Ｉ（）ＴｄＲ取り込みの影響を調べたものであ
る。 第３図 溶出時間（分） 第４図 Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＢＬＪＦ−３ｏｎ４５Ｃａａｃｃ
ｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎｔ。 ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｍａｔｒｉｘ　１ａｙｅｒ　ｏｆ　
ＭＣ３Ｔ３−Ｅｌ　ｃｅｌｌｓＮｏｎｅ　　１０−１１
　１０−１０　１０−’ＢＵＦ−３（Ｍ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記理化学的性質を有するポリペプチドＢＵＦ−３を有
   効成分とする、骨多孔症治療剤 （ａ）分子量：１６±１ｋｄ（１．０％メルカプトエタ
   ノール存在下、ＳＤＳ−電気泳動法） ２５±１ｋｄ（メルカプトエタノール非存在下、ＳＤＳ
   −電気泳動法） （ｂ）等電点：ｐｌ６．３±０．２（クロマトフォーカ
   シング法）ｐｌ７．３（等電点電気泳動法） （ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ２．０〜１０．０の範囲で安定 （ｄ）熱安定性：６５℃、６０分の加熱で安定 （ｅ）有機溶媒安定性：低級アルコール、アセトニトリ
   ルに対し安定 （ｆ）プロテアーゼ耐性：プロナーゼ処理で完全に失活
   する。 （ｇ）比活性：２×１０＾６Ｕ／ｍｇ蛋白 （ｈ）アミノ酸配列： （Ｎ末端） 【アミノ酸配列があります】