DE602004010073T2 - Quantifizierung von botulinum toxin - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Menge einer präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz, die in einer Probe enthalten ist.
  • Die Bestimmung der Menge einer in einer Probe enthaltenen präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz erfolgt im Allgemeinen durch Messen der tödlichen LD50-Dosis für diese Substanz bei Mäusen oder Ratten. Dieses Verfahren wird derzeit vor allem für die Bestimmung der Menge von aktivem Botulinumtoxin verwendet. Diese LD50-Verfahren sind mit einer großen Anzahl getöteter Tiere verbunden.
  • Pearce et al., TOXICON; Bd. 35, Nr. 9, September 1997, gibt eine Übersicht über Verfahren, die im Stand der Technik angewendet werden, um die Wirkungen von Botulinumneurotoxinen zu charakterisieren, zu quantifizieren und zu untersuchen. Die Tabellen 1(a)–(f) der Übersicht führen zahlreiche Verfahren zur Messung der Botulinumneurotoxin-Aktivität auf. Keines der geprüften Verfahren bietet die von der vorliegenden Erfindung präsentierte Lösung.
  • Göschel et. al., EXP. NEUROL., Bd. 147, Nr. 1, 1997, beschreiben Konzentrations-Reaktions-Kurven zur Bestimmung der relativen Aktivität von Botulinumneurotoxin in einer Probe im Vergleich zur Aktivität einer Probe mit einer bekannten Toxinmenge. Es wurden drei verschiedene Botulinumtoxinpräparate an Maus-Hemidiaphragmen getestet (zwei bekannte Proben und eine unbekannte). Dieses relative Quantifizierungsverfahren bietet nicht die numerische Quantifizierungslösung der vorliegenden Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung bietet ein neues Verfahren, das das Leben einer beträchtlichen Zahl von Tieren im Vergleich zu den üblichen LD50-Verfahren schont.
  • Demgemäß wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Ex-vivo-Verfahren zum Bestimmen der Menge einer präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz in einer Probe bereitgestellt, das die folgenden Schritte beinhaltet:
    • (i) Auswählen eines Muskelgewebes, das mit weniger als 10 V elektrisch stimuliert werden kann, um die Kontraktion des Muskelgewebes hervorzurufen, und Bestimmen der Mindestspannung Vm, die notwendig ist, um die Kontraktion des Muskelgewebes hervorzurufen, wobei das genannte Muskelgewebe über einen Bewegungsnerv mit einem elektrischen Stimulator verbunden wird;
    • (ii) Hinzufügen der Probe, die die präsynaptische neuromuskuläre Blockierungssubstanz enthält;
    • (iii) elektrisches Stimulieren des Muskelgewebes mit einer Spannung, die wenigstens Vm entspricht, in bestimmten Zeitabständen durch elektrische Impulskettenstimulationen, die Stimulationen umfassen, die eine Zeit ts andauern, die voneinander durch Perioden getrennt sind, die eine Zeit tp andauern, während der keine Stimulation erfolgt, wobei die Zeit ts 50 μs bis 500 ms, die Zeit tp 0,1 bis 10 s umfasst und das Verhältnis zwischen ts und tp 1:2 bis 1:50.0000 beträgt;
    • (iv) Vergleichen des durch die Probe hervorgerufenen Effekts mit dem durch eine Referenzsubstanz hervorgerufenen Effekt und Bestimmen der Menge der präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz in der Probe damit.
  • Unter einer präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz ist in der vorliegenden Anmeldung eine Substanz zu verstehen, die die Übertragung chemischer Nachrichten und Signale verhindert und/oder hemmt, die in der präsynaptischen neuromuskulären Aktivität involviert sind. Beispiele für präsynaptische neuromuskuläre Blockierungssubstanzen sind Substanzen, die eine Acetylcholin-(ACH)-Synthese oder -Freisetzung hemmen; hierzu gehören insbesondere biologische Toxine (wie Botulinumneurotoxine und Bungarotoxine) und Chemikalien (wie Hemicholinium oder Triethylcholin, die die ACH-Synthese inhibieren, Aminoglycosidantikörper, die die ACH-Freisetzung inhibieren oder Tubocurarin und ähnliche Verbindungen). Bevorzugte präsynaptische neuromuskuläre Blockierungssubstanzen gemäß der vorliegenden Erfindung sind Botulinumneurotoxine und Bungarotoxine (wobei α-Bungarotoxin unter den Bungarotoxinen bevorzugt wird).
  • Unter Botulinumneurotoxinen (oder Botulinumtoxinen) sind in der vorliegenden Anmeldung Botulinumneurotoxinkomplexe (vom Typ A, B, C, D, E, F oder G) sowie hochreine Botulinumneurotoxine (vom Typ A, B, C, D, E, F oder G) zu verstehen. Botulinumtoxin des Typs A beinhaltet alle Arten von Botulinumtoxin Typ A, einschließlich A1, A2 und A3.
  • Unter einem Botulinumneurotoxinkomplex (Typ A, B, C, D, E, F oder G) ist in der vorliegenden Anmeldung ein Botulinumneurotoxin (Typ A, B, C, D, E, F oder G) zu verstehen, das mit wenigstens einem anderen nicht toxischen Protein assoziiert ist.
  • Mit hochreinem Botulinumneurotoxin (Typ A, B, C, D, E, F oder G) ist in der vorliegenden Anmeldung Botulinumneurotoxin (Typ A, B, C, D, E, F oder G), abgesehen von Komplexen, gemeint, die mindestens ein anderes Protein enthalt. Mit anderen Worten, ein hochreines Botulinumneurotoxin (Typ A, B, C, D, E, F oder G) enthält keine wesentlichen Mengen irgendeines anderen von Clostridium spp abgeleiteten Proteins als Botulinumneurotoxin (Typ A, B, C, D, E, F oder G).
  • Mit Muskelgewebe ist in der vorliegenden Anmeldung eine Muskelfaserprobe gemeint, die eine oder mehrere Muskelfasern umfasst.
  • Vorzugsweise wird das Muskelgewebe in einen Puffer wie einen physiologischen Puffer eingetaucht. Der Puffer kann eine Energiequelle umfassen. Die Energiequelle kann eine ATP-Energiequelle sein, wie zum Beispiel eine oder mehrere der Folgenden: ATP, ein Zucker wie Glucose und/oder Kreativ (einschließlich Kreatinphosphat), eine Fettsäure, eine Aminosäure, Glycogen und Pyruvinsäure. Der Puffer kann vor allem für längere Assays mit Sauerstoff angereichert werden.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung ist der Puffer ein mit Sauerstoff angereicherter physiologischer Puffer, der Glucose enthält.
  • Der Puffer, in den das Muskelgewebe eingetaucht wird, enthält vorzugsweise wenigstens 10 mM Glucose (z. B. 11 mM). Vorzugsweise wird der Puffer außerdem mit Sauerstoff gesättigt (z. B. durch Hindurchperlenlassen von Sauerstoff oder eines O2/CO2-Gemischs (95/5) durch den Puffer). Ferner enthält der Puffer vorzugsweise 100 bis 200 mM NaCl, 1 bis 5 mM KCl, 10 bis 15 mM NaHCO3, 0,5 bis 2 mM MgCl2 und 1 bis 5 mM CaCl2. Der pH-Wert des Puffers liegt vorzugsweise bei etwa 7,4.
  • Vorzugsweise ist das Verfahren derart, dass die elektrische Stimulation in Schritt (iii) mit einer Spannung erfolgt, die wenigstens der supramaximalen Spannung VSM entspricht. Unter supramaximaler Spannung ist die Mindestspannung zu verstehen, mit der die maximale Zuckungsreaktion des Muskelgewebes erzielt wird.
  • Gemäß einer ersten Variante der Erfindung (im Folgenden Variante A) ist der für den Vergleich in Schritt (iv) des Verfahrens verwendete hervorgerufene Effekt die Zeit bis zur Paralyse des Muskelgewebes (in der vorliegenden Anmeldung auch „Lebensdauer" genannt). Gemäß Subvarianten kann die Zeit bis zur Paralyse auf der Basis (Variante A1) der Muskelkontraktionsstrecke (Paralyse wird erreicht, sobald die Kontraktionsstrecke gleich Null ist) oder (Variante A2) der Muskelzuckungsfrequenz (Paralyse wird erreicht, sobald die Zuckungsfrequenz gleich Null ist) bestimmt werden.
  • Gemäß einer anderen Variante der Erfindung (im Folgenden Variante B) ist der für den Vergleich in Schritt (iv) des Verfahrens verwendete hervorgerufene Effekt die Variation in der Kontraktionsrate des Muskelgewebes.
  • Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung (im Folgenden Variante C) ist der für den Vergleich in Schritt (iv) des Verfahrens verwendete hervorgerufene Effekt die Variation in der Kontraktionsstrecke des Muskelgewebes.
  • Gemäß noch einer anderen Variante der Erfindung (im Folgenden Variante D) ist der für den Vergleich in Schritt (iv) des Verfahrens verwendete hervorgerufene Effekt die Variation in der Kontraktionskraft des Muskelgewebes.
  • Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung (im Folgenden Variante E) ist der für den Vergleich in Schritt (iv) des Verfahrens verwendete hervorgerufene Effekt die Variation im Endplattenpotential oder Miniatur-Endplattenpotential des Muskelgewebes.
  • Kombinationen der Varianten A (einschließlich ihrer Subvarianten), B, C, D und E können von der Fachperson verwendet werden, um eine Verbesserung der Genauigkeit der erhaltenen Ergebnisse zu erreichen. Insbesondere kann die Fachperson eine Kombination der Subvariante A1 mit der Subvariante A2 erwägen.
  • Vorzugsweise ist die präsynaptische neuromuskuläre Blockierungssubstanz ein Botulinumneurotoxin. Insbesondere kann das Botulinumneurotoxin ausgewählt werden aus Botulinumneurotoxin Typ A, Botulinumneurotoxin Typ B und Botulinumneurotoxin Typ F. Bevorzugter wird das Botulinumneurotoxin aus Botulinumneurotoxin Typ A und Botulinumneurotoxin Typ B ausgewählt. Besonders bevorzugt ist das Botulinumneurotoxin Botulinumneurotoxin Typ A, insbesondere ein Botulinumneurotoxin-Typ-A-Komplex (wie die aktiven Grundbestandteile der handelsüblichen Produkte Dysport® oder Botox®).
  • Im Allgemeinen ist das Verfahren bei geringeren Konzentrationen (zum Beispiel 0 bis 100 LD50 Einheiten/ml und vorzugsweise 0 bis 50 oder 0 bis 10 LD50 Einheiten/ml) empfindlicher, während es evtl. nicht funktioniert, wenn hohe Konzentrationen von präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanzen in der Probe vorliegen (wobei das Muskelgewebe trotz elektrischer Stimulation paralysiert bleibt). Folglich wird die zu testende Probe vorzugsweise in wenigstens zwei oder drei Verdünnungen (z. B. unverdünnt, 10fache Verdünnung und 100fache Verdünnung) hergestellt, an denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird; auf diese Weise können auch höhere Konzentrationen von präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanzen bestimmt werden. Die Empfindlichkeit des zuvor beschriebenen Verfahrens kann jedoch wie im Folgenden erwähnt verbessert werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Art der Umsetzung der Erfindung besteht das Muskelgewebe aus einem Stück Rippenmuskel, das von einer Maus oder einer Ratte erhalten wird. Dieses Stück hat vorzugsweise eine Größe von wenigstens 2 mm mal 10 mm. Das Muskelgewebe könnte zum Beispiel eine Größe haben, die einem 2-Rippen-Abschnitt des Rippenmuskels entspricht.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Art der Umsetzung der Erfindung beinhaltet jede elektrische Stimulation stets das Anlegen einer Spannung Vs, die wenigstens gleich der Mindestspannung Vm ist, die nötig ist, um die Kontraktion des Muskelgewebes hervorzurufen, wobei Vs außerdem geringer als oder gleich eine(r) Spannung ist, die leicht über Vm liegt. Die „Spannung, die leicht über Vm" liegt, kann Vm plus 3 Volt, Vm plus 2 Volt oder Vm plus 1,5 Volt sein. Die angelegte Stimulationsspannung kann zum Beispiel mit Vm plus 1 Volt gewählt werden.
  • Weitere mögliche Merkmale der Erfindung schließen die Verwendung einer Videokamera in Kombination mit einem Videorekorder ein. Die produzierten Filme können dann analysiert und der Effekt der präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz kann präzise beurteilt werden. Die Menge der in der Probe vorliegenden präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz kann dann von dem für die Probe beobachteten Effekt im Vergleich zu dem für die Referenz beobachteten abgeleitet werden.
  • Alternativ kann für die oben genannte Variante D der zum Messen der Kontraktionskraft des Muskelgewebes verwendete Kraft-Weg-Wandler mit einem automatischen elektronischen Echtzeit-Datenerfassungssystem assoziiert werden.
  • Zum Reduzieren der Ergebnisvariabilität sendet der elektrische Stimulator in vorgegebenen Zeitabständen die gewählte Spannung Vs, die jedes Mal einen bestimmten Effekt bewirkt. Mit dem unter diesen Bedingungen beobachteten durchschnittlichen Effekt kann eine genauere Bestimmung der Menge der in der Probe vorliegenden präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz gemacht werden.
  • Eine Möglichkeit zur Erhöhung der Empfindlichkeit des Verfahrens besteht darin, das Verfahren über einen längeren Zeitraum durchzuführen, so dass mehr Daten erfasst werden können (zum Beispiel über einen Zeitraum von wenigstens 5, 10 oder 30 Minuten und bis zu 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 Stunden oder noch mehr). Für die Variante D des Verfahrens könnte das Verfahren zum Beispiel so lange durchgeführt werden, bis eine Reduzierung eines bestimmten Teils der Kontraktionskraft des Muskelgewebes gemessen wird (z. B. eine Reduzierung von 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80 oder 90%).
  • Für diese bevorzugte Umsetzungsweise muss die Lebensdauer des Muskelgewebes im Vergleich zu dem zuvor erläuterten allgemeineren Verfahren verlängert werden.
  • In einem speziellen Ansatz, der darauf abzielt, die genannte Lebensdauer zu verlängern, werden Sauerstoff und Glucose (oder eine andere ATP-Quelle) dem Muskelgewebe regelmäßig zugeführt.
  • Eine Art, um dies zu erreichen, besteht darin, in regelmäßigen Abständen ein mit Sauerstoff angereichertes physiologisches Pufferbad mit Glucose (oder einer anderen ATP-Quelle) durch ein neues auszutauschen, damit der/die verbrauchte Sauerstoff und Glucose (oder andere ATP-Quelle) ersetzt wird (wobei die genannten Abstände vorzugsweise nicht weniger als 1 Minute und nicht mehr als 24 Stunden betragen, z. B. alle 1, 2, 5, 10, 15 oder 60 Minuten). Eine andere Möglichkeit besteht darin, ein Bad zu verwenden, durch das Sauerstoff ständig perlen gelassen wird, so dass die Sauerstoffkonzentration des Bads konstant gehalten werden kann; darüber hinaus kann Glucose (oder andere ATP-Quelle) in regelmäßigen Abständen zugegeben werden, um die vom Muskelgewebe verbrauchte Glucose (oder andere ATP-Quelle) zu ersetzen.
  • Alternativ kann ein Durchflussbadsystem verwendet werden, das den Vorteil hat, dass es eine konstante Glucose-(oder andere ATP-Quelle) und fakultativ Sauerstoffkonzentration beibehält. In diesem System wird der mit Sauerstoff angereicherte physiologische Puffer, der Glucose (oder eine andere ATP-Quelle) enthält, an einem Ende des Gefäßes, in dem das Muskelgewebe eingetaucht ist, hineingepumpt und am anderen Ende herausgepumpt.
  • Die Erfindung verlängert die Lebensdauer des Muskelgewebes durch die Anwendung einer Impulskettenstimulation, die die Ermüdung der Probe verringert. Mit Impulskettenstimulation sind Stimulationen gemeint, die eine Zeit ts andauern, die voneinander durch Perioden getrennt sind, die eine Zeit tp andauern, während der keine Stimulation erfolgt. Die Zeit tg umfasst vorzugsweise 50 μs bis 500 ms, bevorzugter 100 μs bis 250 ms und noch bevorzugter 100 μs bis 1 ms (z. B. 200 μs oder etwa 200 μs); die Zeit tp umfasst vorzugsweise 0,1 bis 10 s und bevorzugter 0,5 bis 2 s (z. B. 1 s oder etwa 1 s); das Verhältnis ts/tp liegt vorzugsweise bei 1:2 bis 1:50.000, bevorzugter bei 1:5 bis 1:20.000 und noch bevorzugter bei 1:500 bis 1:10.000 (z. B. etwa 1:5000).
  • Das Wort „etwa" bezieht sich auf einen Abstand um den betrachteten Wert. Der in der vorliegenden Patentanmeldung verwendete Ausdruck „etwa X" bedeutet einen Abstand von X minus 10% von X bis X plus 10% von X und vorzugsweise einen Abstand von X minus 5% von X bis X plus 5% von X.
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie die, die normalerweise von einer auf dem Gebiet, zu dem die vorliegende Erfindung gehört, allgemein fachkundigen Person verstanden wird.
  • Die folgenden Beispiele sollen das Obenerwähnte illustrieren und sind keineswegs als eine Beschränkung des Umfangs der Erfindung anzusehen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt die relative Kontraktionsstrecke eines interkostalen Präparats einer Ratte, die in Abhängigkeit von der Zeit mit unterschiedlichen Dysport®-Konzentrationen (0, 1, 10 und 50 U) mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen wurde. Die X-Achse stellt die Zeit (s) dar, wohingegen die Y-Achse die Strecke (normalisiert auf Kontraktionsanfangsgröße) darstellt.
  • 2 zeigt die Lebensdauer eines interkostalen Ratten-Präparats, die anhand der Kontraktionsstrecke mit unterschiedlichen Dysport®-Konzentrationen (0, 1, 10 und 50 U) mit dem im 1. Beispiel beschriebenen Verfahren gemessen wurde. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 4–5. Die X-Achse bedeutet die Dysport-Konzentrationszeit (LD50-Einheiten/ml), während die Y-Achse die Zeit (s) bedeutet.
  • 3 repräsentiert die Lebensdauer eines interkostalen Ratten-Präparats, die anhand der Zuckungsfrequenz mit unterschiedlichen Dysport®-Konzentrationen (0, 1, 10 und 50 U) mit dem im 1. Beispiel beschriebenen Verfahren gemessen wurde. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 4–5. Die X-Achse stellt die Dysport-Konzentrationszeit (LD50-Einheiten/ml) dar, wohingegen die Y-Achse die Zeit (s) darstellt.
  • 4 zeigt einen 2-Rippen-Gewebeabschnitt, der an einem Kraft-Weg-Wandler in einem statischen Bad-Setup angebracht ist.
  • 5 zeigt die erfasste Zeit (Stunden) für die maximalen Zuckungskraftmessungen von 2-Rippen-Abschnitten, die entweder einem Plazebo oder 500, 1000, 1500 oder 3000 U Toxin mittels des direkten Applikationsverfahrens aus dem 3. Beispiel in dem statischen System ausgesetzt wurden (es gilt die folgende Anzahl von Experimenten n: Plazebo: n = 4; 500 U: n = 8; 1000 U: n = 5; 1500 U: n = 11). Fehlerbalken illustrieren ± S.E.M. Die X-Achse zeigt die prozentuale Abnahme der maximalen Zuckungskraft und die Y-Achse die Zeit (Stunden).
  • 6 zeigt die erfasste Zeit (Stunden) für die maximalen Zuckungskraftmessungen von 2-Rippen-Abschnitten, die entweder einem Plazebo oder 3, 6 oder 12 U/ml Toxin mittels des Eintauchverfahrens aus dem 3. Beispiel in dem statischen System ausgesetzt wurden (es gilt die folgende Anzahl von Experimenten n: Plazebo: n = 3; 3 U/ml: n = 5; 6 U/ml: n = 2; 12 U/ml: n = 2). Fehlerbalken illustrieren ± S.E.M. Die X-Achse zeigt die prozentuale Abnahme der maximalen Zuckungskraft und die Y-Achse die Zeit (Stunden).
  • BEISPIELE
  • In den folgenden Beispielen entspricht 1 Speywood-Einheit oder 1 U der mittleren intraperitonealen LD50-Dosis von Botulinumtoxin bei Mäusen.
  • Referenzbeispiel 1: Probe mit Botulinumtoxin
  • Verwendete Materialien
  • a) Verwendete Pufferlösungen:
  • Der modifizierte Ringer-Puffer, der im Folgenden als „Lillies-Ringer-Puffer" bezeichnet wird, wird durch Verdünnen der folgenden Bestandteile in Wasser hergestellt:
    NaCl 138,8 mM
    KCl 4 mM
    NaHCO3 12 mM
    KH2PO4 1 mM
    MgCl2 1 mM
    CaCl2 2 mM
  • Unmittelbar vor dem Gebrauch wird Glucose (11 mM) zur zuvor hergestellten Lösung gegeben und ein Gasgemisch aus 95% O2 und 5% CO2 wird durch die Pufferlösung perlen gelassen, um den Lillies-Ringer-Puffer zu erhalten.
  • Die im Folgenden erwähnte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wird durch Auflösen einer von Sigma gelieferten Tablette hergestellt, die, wenn sie in 200 ml Wasser gegeben wird, dem Puffer die folgenden Charakteristiken verleiht:
    Phosphatpuffer 0,01 M
    KCl 0,0027 M
    NaCl 0,137 M
    pH bei 25°C 7,4
  • b) Gewebeisolation
  • Wistar-Ratten (Gewicht ca. 275 g) werden durch Halsverdrehen nach einer CO2-Einwirkung (etwa 3 min zum Herbeiführen von Bewusstlosigkeit) geopfert. Der Brustkorb jedes Tieres wird seziert, in Lillies-Ringer-Puffer gegeben und zum Versuchsort transportiert (Beförderungsdauer: etwa 15 min). Dort wird der Brustkorb durch vorsichtiges Sezieren entlang der Wirbelsäule in zwei Abschnitte unterteilt. Das Gewebe wird in mit Sauerstoff angereichertem Puffer aufbewahrt, bevor die Versuchsverfahren durchgeführt werden.
  • c) Bestimmen der Mindestspannung Vm, die notwendig ist, um eine Muskelkontraktion hervorzurufen:
  • Jedes interkostale Präparat (halber Brustkorb) wird in eine Petrischale gegeben, die Lillies-Ringer-Puffer enthält. Für jedes Präparat wird ein interkostaler Nerv vorsichtig seziert, um etwa 1–2 mm an Nervenbündeln freizulegen. Nach dem Sezieren kann das Präparat in frisch mit Sauerstoff angereichertem Lillies-Ringer-Puffer etwa 15–20 Minuten lang wiederbelebt werden, bevor es in eine Petrischale mit 10 ml eines mit Sauerstoff angereicherten Lillies-Ringer-Puffers zurückgegeben wird. Der sezierte interkostale Nerv wird dann über eine Saugelektrode mit einem Stimulator (Grass Instruments Modell S48) verbunden, wobei eine Rücklaufkontaktelektrode in das Medium platziert wird. Es wird die Mindestspannung Vm bestimmt, die notwendig ist, um eine Muskelkontraktion hervorzurufen. Wenn eine Stimulation nicht unter 10 V erreicht werden kann, wird ein anderer Nerv seziert und das Präparat vor der Fortsetzung wiederbelebt.
  • Verfahren zum Bestimmen der Menge von Botulinumtoxin in einer Probe
  • Der Nerv wird mit einer pulsierten Spannung (5–9 V, 1 Hz) stimuliert, wobei die gewählte Spannung stets 1 V über der Schwellenspannung Vm liegt, die notwendig ist, um eine Stimulation und Muskelkontraktion zu erreichen. Eine Videomikroskopie wird an dem Abschnitt mit einem SMZ800 Stereomikroskop von Nikon durchgeführt, das mit einer JVC TKC1481EG Videokamera ausgestattet ist, die an eine TV/Videorekorder-Kombination angeschlossen ist.
  • Dysport® (aktiver Grundbestandteil; Botulinumtoxin Typ A) wird in PBS direkt über das interkostale Präparat (in 10 ml Puffer leicht eingetaucht) gegeben. Für die 50 Speywood-Einheiten (U) je ml Dosis werden 500 U Toxin in die Kulturschale (10 ml Puffer) gegeben, um eine Endkonzentration von 50 U/ml zu erhalten. Für die 10 U/ml Dosis werden 100 U in die Kulturschale gegeben, um eine Endkonzentration von 10 U/ml zu erhalten. Für die 1 U/ml Dosis werden 10 U in die Kulturschale gegeben, um eine Endkonzentration von 1 U/ml zu erhalten. Für das Plazebo (das die gleiche Zusammensetzung wie Dysport® hat, mit der Ausnahme, dass Botulinumtoxin fehlt) wird der gesamte Inhalt der Phiole (in 0,2 ml PBS) in die Kulturschale gegeben.
  • Datenanalyse
  • Die aufgezeichneten Videoaufnahmen werden in MPEG-Dateien konvertiert. Zur Unterstützung der anschließenden Analyse wird jeder Film in 2-Minuten-Abschnitte geschnitten und diese Abschnitte werden mit Adobe® Premiere® 5.1 Software auf die Hälfte ihrer Ausgangsgeschwindigkeit verlangsamt. Die Analyse erfolgt dann durch Zählen der Anzahl von Zuckungen innerhalb eines 10-s-Zeitraums (20 s bei den Aufnahmen mit halber Geschwindigkeit) und Errechnen des Mittelwerts der Anzahl von Zuckungen über diesen 10-s-Zeitraum, um einen Zuckungsfrequenzwert zu erhalten. Die Kontraktionsstrecke kann ebenfalls durch Abspielen des Films mit einem darüber gelegten Maßstabsbalken (mit arbiträren Einheiten – theoretisch eine 6–7 Punktskala) gemessen werden, wobei der Mittelwert der Daten errechnet wird, um die Kontraktionsstrecke über jeden 10-s-Zeitraum zu erhalten, oder alternativ wird die genannte Strecke mit der Ausgangskontraktionsstrecke verglichen.
  • Die Versuche werden eine bestimmte Anzahl von Malen wiederholt (0 U/ml: n = 5; 1 U/ml: n = 5; 10 U/ml: n = 4; 50 U/m: n = 4) und es wird der Mittelwert der Ergebnisse errechnet.
  • Ergebnisse
  • In 1 ist erkennbar, dass die relative Kontraktionsstrecke (d. h. die Kontraktionsstrecke in Anwesenheit von Toxin dividiert durch die Kontraktionsstrecke in Abwesenheit von Toxin) mehr oder weniger schnell in Abhängigkeit von der Dysport®-Konzentration abnimmt.
  • In 2, die Ergebnisse bezüglich der Strecken-Zuckungs-Lebensdauer (d. h. die Zeit, die ab dem Moment der Zugaben des Toxins, bis zum Zeitpunktdes Erreichens einer Kontraktionsstrecke von null nötig ist) darstellt, kann zudem eine dosisabhängige Abnahme der Muskelkontraktionsstrecke in Abhängigkeit von der Dysport®-Konzentration beobachtet werden.
  • Die Zuckungsfrequenzlebensdauer (d. h. die Zeit, die ab dem Moment der Zugabe des Toxins bis zu dem Zeitpunkt des Errechens der Zuckungsfrequenz Null nötig ist) wird ebenfalls durch Dysport® in einer dosisabhängigen Weise reduziert, wie in 3 dargestellt ist.
  • Referenzbeispiel 2: Probe mit α-Bungarotoxin
  • Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie im 1. Beispiel beschrieben wird α-Bungarotoxin anstelle von Dysport® bei einer Konzentration von 21 μM (n = 3) getestet. Die mittlere Zuckungslebensdauer des α-Bungarotoxin-Präparats beträgt 225 s (± SEM 93, n = 3) und 238 s (± SEM 93, n = 3), jeweils anhand der Kontraktionsstrecke und der Zuckungsfrequenz gemessen.
  • 3. Beispiel: Lebensverlängerungssystem Materialherstellung
  • a) Verwendete Pufferlösungen:
  • Der in diesem Beispiel verwendete modifizierte Ringer-Puffer oder „Lillies-Ringer-Puffer" ist der gleiche wie im 1. Beispiel.
  • Der in diesem Beispiel verwendete Gelatinephosphatpuffer (GPB) wird durch Verdünnen der folgenden Bestandteile in 1 Liter Wasser hergestellt:
    Gelatine 2 g
    NaHPO4, 2 H2O 10 g
  • b) Gewebeisolation
  • Männliche Wistar-Ratten (etwa 230–300 g) werden durch Halsverdrehen nach einer CO2-Einwirkung (etwa 3 min zum Herbeiführen von Bewusstlosigkeit) geopfert. Der Brustkorb des Tieres wird seziert, in Lillie-Ringers-Puffer gegeben und zum Versuchsort transportiert (Beförderungsdauer: etwa 20 min). Dort wird der Brustkorb durch vorsichtiges Sezieren entlang der Wirbelsäule und des Brustbeins in zwei Abschnitte unterteilt. Die beiden Hälften des Brustkorbs werden in 300 ml eines kontinuierlich mit Sauerstoff angereicherten Lillies-Ringer-Puffers mindestens 30 Minuten lang aufbewahrt, bevor die Versuchsverfahren durchgeführt werden.
  • c) Bestimmen der Mindestspannung Vm, die notwendig ist, um Muskelkontraktionen hervorzurufen:
  • Eine Brustkorbhälfte wird in eine Petrischale gegeben, die etwa 10 ml Lillies-Ringers-Puffer enthält, und ein interkostaler Nerv wird vorsichtig seziert, um etwa 1–2 mm an Nervenbündeln freizulegen. Dieser Nerv wird dann über eine Saugelektrode mit einem Stimulator (Grass Instruments Modell S48) verbunden, wobei eine Rücklaufelektrode in dem Medium platziert wird. Es wird die Mindestspannung Vm bestimmt, die notwendig ist, um eine Muskelkontraktion hervorzurufen. Wenn eine Stimulation nicht unter 10 V (1 Hz, 200 μs Dauer) erreicht werden kann, wird ein anderer Nerv seziert. Der 2-Rippen-Abschnitt, der den sezierten Nerv enthält, wird von der Brustkorbhälfte seziert, wobei gewährleistet wird, dass möglichst viel überschüssiges Muskelgewebe auf beiden Seiten der 2 Rippen für eine spätere Anbringung am Kraft-Weg-Wandler verbleibt.
  • d) Anbringung am Kraft-Weg-Wandler
  • Mit Bezug auf das in 4 dargestellte statische Badsystem wurden drei Metallklammern am nicht stimulierten Muskelgewebe auf beiden Seiten der beiden Rippen angebracht. Eine Seite des 2-Rippen-Abschnitts (5) wurde mit den drei Klammern am fixierten Fuß (4) befestigt, während die andere Seite am freien Fuß (9) angebracht wurde. Der fixierte Fuß wurde festgeklemmt, während der freie Fuß am Kraft-Weg-Wandler (1; Grass Instruments Modell FT03) mit einem Baumwollfaden (7) von etwa 4 cm befestigt wurde. Das fixierte Gewebe wurde in etwa 500 ml Lillies-Ringer-Puffer eingetaucht und eine Rücklaufelektrode (2) wurde in dem Puffer platziert. Der sezierte interkostale Nerv wurde über eine (positive) Saugelektrode (3) mit dem Stimulator verbunden. Das in 4 dargestellte System beinhaltet außerdem einen CO2/O2-Gaseinlass (6).
  • Verfahren zum Bestimmen der Menge von Botulinumtoxin in einer Probe
  • Die 2-Rippen-Gewebeabschnitte werden etwa 90 Minuten lang mit 15 V (Dauer 200 μs) unter Anwendung einer Impulskettenstimulation (1 Impuls/Sekunde während der ersten 5 Sekunden jeder 30-Sekunden-Periode) stimuliert.
  • Die benötigte Toxinkonzentration wird in GPB sofort unmittelbar vor der Applikation rekonstituiert. Die Toxinzufuhr erfolgt mit einem von zwei Verfahren:
    • A) Direkte Applikation – der 2-Rippen-Abschnitt wird der Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche durch Entfernen eines Teils des Puffers in dem Gewebebad ausgesetzt. Mit einer Hamilton-Spritze wird das Toxin direkt auf das exponierte Gewebe tropfenweise aufgebracht, wobei der Muskel mit der Toxinlösung überzogen wird. Das Gewebe bleibt weitere 15 Minuten lang exponiert, um eine Aufnahme des Toxins vor dem Bedecken mit dem ursprünglichen Ringers-Puffer zu ermöglichen. Bei Bedarf werden jegliche gelöste sezierte Nerven wieder mit der Saugelektrode verbunden.
    • B) Eintauchen – Mit einer Hamilton-Spritze wird das Toxin direkt in das Gewebebad in nächster Nähe zum (aber nicht direkt auf den) 2-Rippen-Abschnitt gegeben.
  • Zuckungskraftmesswerte, die anhand des Kraft-Weg-Wandlers aufgezeichnet werden, werden zunächst durch einen Grass Instruments AC/DC-Dehnungsmessverstärker (Modell P122) verstärkt und Signale werden dann mit Grass PolyVIEWTM Software aufgezeichnet.
  • Datenanalyse
  • Anhand der aufgezeichneten Spuren wurde die Zeitdauer gemessen, bis sich die erste maximale Zuckungskraftmessung (nach der Zugabe von Toxin/Plazebo) um einen bestimmten Prozentsatz verringerte. Die Experimente werden eine bestimmte Anzahl von Malen wiederholt (direktes Applikationsverfahren: Plazebo: n = 4; 500 U: n = 8; 1000 U: n = 5; 1500 U: n = 11; Eintauchverfahren: Plazebo: n = 3; 3 U/ml: n = 5; 6 U/ml: n = 2, 12 U/ml: n = 2). Aufgrund der langen Lebensdauer des Gewebes, wenn es einem Plazebo und einem geringen Toxinniveau ausgesetzt wird, sind die bei der 90%igen Reduzierung der Zuckungskraft aufgeführten Werte geschätzte Ergebnisse, die auf der Extrapolation der Daten basieren, ausgehend von einer konstanten Abnahmegeschwindigkeit.
  • Ergebnisse
  • A) Direktes Applikationsverfahren
  • Im Laufe der Zeit wird für alle Proben eine allmähliche Reduzierung der Zuckungskraftmessungen registriert, inklusive nach der Zugabe eines Plazebos, wie in 5 zu sehen ist. Nach der Plazebo-Einwirkung wird eine 50%ige Reduzierung der maximalen Zuckungskraft nach über etwa 12 Stunden beobachtet. Im Vergleich dazu nimmt die Zuckungskraft bei den Gewebeproben, die 1500 U Toxin ausgesetzt werden, schneller ab, wobei eine 50%ige Reduzierung nach etwa 5 Stunden erreicht wird.
  • B) Eintauchverfahren
  • Die Reduzierung der Zuckungskraftmessungen wurde nach der Zugabe eines Plazebos registriert, wobei eine 50%ige Reduzierung der maximalen Zuckungskraft nach etwa 20 Stunden beobachtet wurde, wie in 6 zu sehen ist. Durch Eintauchen des Gewebes in eine 3-Einheiten/ml-Toxinlösung nahm die Geschwindigkeit der Zuckungskraftreduzierung weiter zu, eine 50%ige Reduzierung der Zuckungskraft wurde nach 13 Stunden Stimulation erreicht. Bei höheren Toxinkonzentrationen ist eine dosisabhängige Reaktion weiterhin erkennbar.
  • Folglich wird eine wiederholbare dosisabhängige, toxininduzierte Unterdrückung der Muskelkontraktion unter Anwendung von sowohl dem direkten Applikations- als auch dem Eintauchverfahren der Toxinzufuhr beobachtet.

Claims (14)

  1. Ex-vivo-Verfahren zum Bestimmen der Menge einer präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz in einer Probe, das die folgenden Schritte beinhaltet: (i) Auswählen eines Muskelgewebes, das mit weniger als 10 V elektrisch stimuliert werden kann, um die Kontraktion des Muskelgewebes hervorzurufen, und Bestimmen der Mindestspannung Vm, die notwendig ist, um die Kontraktion des Muskelgewebes hervorzurufen, wobei das genannte Muskelgewebe über einen Bewegungsnerv mit einem elektrischen Stimulator verbunden wird; (ii) Hinzufügen der Probe, die die präsynaptische neuromuskuläre Blockierungssubstanz enthält; (iii) elektrisches Stimulieren des Muskelgewebes mit einer Spannung, die wenigstens Vm entspricht, in bestimmten Zeitabständen durch elektrische Impulskettenstimulationen, die Stimulationen umfassen, die eine Zeit ts andauern, die voneinander durch Perioden getrennt sind, die eine Zeit tp andauern, während der keine Stimulation erfolgt, wobei die Zeit ts μs bis 500 ms, die Zeit tp 0,1 bis 10 s umfasst und das Verhältnis zwischen ts und tp 1:2 bis 1:50.000 beträgt; (iv) Vergleichen des durch die Probe hervorgerufenen Effekts mit dem durch eine Referenzsubstanz hervorgerufenen Effekt und Bestimmen der Menge der präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz in der Probe damit.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration der präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz in einer Probe zwischen 0 und 100 LD50 Einheiten/ml liegt.
  3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Konzentration der präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz in einer Probe zwischen 0 und 50 LD50 Einheiten/ml liegt.
  4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Konzentration der präsynaptischen neuromuskulären Blockierungssubstanz in einer Probe zwischen 0 und 10 LD50 Einheiten/ml liegt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der hervorgerufene Effekt die Variation in der Kontraktionsrate des Muskelgewebes ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der hervorgerufene Effekt die Variation in der Kontraktionsstrecke des Muskelgewebes ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der hervorgerufene Effekt die Variation in der Kontraktionskraft des Muskelgewebes ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der hervorgerufene Effekt die Variation im Endplattenpotential oder Miniatur-Endplattenpotential des Muskelgewebes ist.
  9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die präsynaptische neuromuskuläre Blockierungssubstanz ein Botulinumtoxin ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Botulinumtoxin ausgewählt wird aus Botulinumtoxin Typ A, Botulinumtoxin Typ B und Botulinumtoxin Typ F.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Botulinumtoxin Botulinumtoxin Typ A ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die präsynaptische neuromuskuläre Blockierungssubstanz ein Bungarotoxin ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Bungarotoxin α-Bungarotoxin ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Muskelgewebe ein Stück Rippenmuskel von einer Maus oder einer Ratte ist.
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