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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Modell für eine Asthenopie, ein Verfahren
zum Herstellen eines Modells, ein Beurteilungsverfahren unter Verwendung
des Modells, eine Arznei, die mittels des Beurteilungsverfahrens
ausgewählt
wird. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Modell,
das zur Beurteilung einer Arznei verwendet wird, deren therapeutischer
Zweck eine Verbesserung von feinen Akkommodationen im Falle einer
akkommodativen Asthenopie ist, ein Verfahren zur Herstellung des
Modells, ein Beurteilungsverfahren unter Verwendung des Modells,
eine Arznei, die mittels des Beurteilungsverfahrens ausgewählt wird.
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STAND DER
TECHNIK
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Eine
Asthenopie wird hervorgerufen, wenn VDT (visual display terminal)
Operationen über
einen langen Zeitraum durchgeführt
werden, wenn bei Langstreckenfahrten die Fokussierung häufig geändert wird
oder dergleichen.
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Diese
Asthenopie soll zu Schwierigkeiten bei einer problemlosen Akkommodation
führen,
wenn der Ziliarmuskel aufgrund einer Überdehnung ermüdet ist
(Journal of Japanese Ophthalmology Association (Nihon Gankagakukai
Zasshi) 92, 1854–1858
(1988)). Beim Ziliarmuskel, auf den hier Bezug genommen wird, handelt es
sich um einen glatten Muskel, der einen Hauptteil der Ziliarmuskeln
ausmacht, die die kristalline Linse ringförmig in den Augengeweben umgeben.
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Im
Fall des Ziliarmuskels ist eine Kontraktion durch die Stimulation
des Ziliarmuskels eine einfache Kontraktion, und ihre Kontraktionsform
ist bekanntermaßen
isometrisch, wobei der Muskel kontrahiert wird, während beide
Enden des Muskels auf eine bestimmte Länge festgelegt sind. Und wenn
der Muskel weiterhin wiederholten Stimulationen unterworfen wird,
nimmt die Spannung der Muskelkontraktion allmählich ab und zur gleichen Zeit
wird der Kontraktionsvorgang verzögert. Das Phänomen wird
als Muskelermüdung
bezeichnet, und eine Asthenopie wird durch die Ermüdung des
Ziliarmuskels bewirkt.
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Arzneien,
wie beispielsweise Augentropfen werden zur Behandlung einer Asthenopie
verwendet.
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Allerdings
gibt es bis jetzt keine Arznei, die sicher eine Asthenopie behandeln
kann. Außerdem
ist bis jetzt noch kein Verfahren zur Beurteilung der Arznei eingeführt worden.
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Es
gibt gegenwärtig
verschiedene Verfahren zum Beurteilen einer Arznei. Tests, die vor
dem klinischen Test durchzuführen
sind, lassen sich grob in ein in vivo System und ein in vitro System
unterteilen. Insbesondere finden die in vitro Tests wegen ihrer
Einfachheit und Schnelligkeit im Anfangsstadium der Beurteilung
breite Anwendung.
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Bei
der Bestimmung durch das in vitro System zeigt sich die Ermüdung des
Ziliarmuskels durch die Phänomene
einer abnehmenden Muskelkontraktion und eines verzögerten Kontraktions/Relaxationsvorgangs.
Daher kann die Ermüdung
durch eine direkte Beobachtung bestimmt werden.
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Konkret
kann das „Magnus"-Verfahren, das einem
enukleierten Ziliarmuskel unterworfen wird, verwendet werden.
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Beim
Magnus-Verfahren wird üblicherweise
ein Magnus-Apparat verwendet, der als Hauptbestandteile umfasst:
ein Magnus-Röhrchen
(„Magnus
tube"), bei dem
es sich um ein dünnes
Röhrchen
handelt, das etwa 1 bis 2 s Durchmesser hat und 2 bis 5 cm tief
ist, zum Eintauchen eines Organs in eine künstliche Nährlösung; eine Lufteinlassröhre zum
Einbringen von Luft in die künstliche
Nährlösung; einen
Ankerabschnitt zum Befestigen eines Organendes; einen Spannungswandler
zum Befestigen des anderen Organendes und zum Messen der Organspannung;
und einen Temperaturregler zum Halten der Temperatur des Magnus-Röhrchens bei
einer bestimmten Temperatur (in den meisten Fällen 37°C).
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Das
Magnus-Verfahren ist zum Durchführen
der Messung unter physiologischen Bedingungen vorteilhaft, weil
das enukleierte Organ frei von den Einflüssen von anderen Organen eines
lebenden Körpers
ist, wie in dem Fall, in dem ein Organismus in einem solchen Zustand
einem Test unterzogen wird, und aufgrund des Nervengeflechts, das
im Muskel verbleibt, selbst wenn das Organ der Kontrolle der zentralen
Nerven entzogen wird, doch nicht seine Mobilität verliert.
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Als
solche mit dem Magnus-Verfahren zu untersuchenden pharmakologischen
Wirkungen sind ein Fall, bei dem der Muskarinrezeptor vom M3 Typ im Rinder-Ziliarmuskel untersucht wird
(Hiroshi Masuda u.a., gen. Pharmac., 30(4), 579–584 (1998)), ein Fall, bei
dem eine Relaxationsreaktion des Muskels auf Stickoxid im Rinder-Ziliarmuskel
untersucht wird (Soichiro Kamikawa u.a., Exp. Eye Res., 66, 1–7 (1998)),
(Hiroshi Masuda u.a., Current Eye Research, 16, (12), 1245–1251 (1997)),
und dergleichen berichtet worden.
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Weiterhin
wird in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. Hei 7-133225 ein Fall offenbart,
bei dem ein Ziliarmuskelspannungs-Relaxationsmittel mittels einer Ziliarmuskelprobe
beurteilt wird, bei der der Muskel vorübergehend mit Kaliumchlorid
oder Karbachol kontrahiert wird.
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Allerdings
ist die wie oben erhaltene Ziliarmuskelprobe ein Ziliarmuskel in
einem Kontraktionszustand mit einer eine Kontraktion induzierenden
Substanz, so dass kaum behauptet werden kann, dass es sich dabei um
einen Ziliarmuskel mit einer echten Ermüdung handelte.
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Daher
kann nicht davon ausgegangen werden, dass es sich bei der Beurteilung
einer Arznei auf einer Probe, bei der eine Ermüdung nicht wie in einem lebenden
Körper
reproduziert werden konnte, um eine vertretbare Beurteilung handelt.
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Weiterhin
konnte, da nur die Beurteilung für
einen Antagonisten gegen die kontraktionsinduzierende Substanz erfolgen
kann, in der obigen Offenbarung die Wirkung nicht im Verhältnis zu
anderen Arzneien zur Verbesserung einer Asthenopie beurteilt werden.
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Daher
haben im Hinblick auf die obigen Probleme als Ergebnis des Durchführens von
intensiven Studien die vorliegenden Erfinder eine Probe, bei der
der Ziliarmuskel im Hinblick auf eine Ermüdung, die bei einem lebenden
Körper
auftritt, in einem in vitro System reproduziert wird, und ein Verfahren
zur Erzeugung der Probe gefunden. Außerdem haben die vorliegenden
Erfinder ein Verfahren zum direkten und objektiven Beurteilen einer
pharmakologischen Wirkung einer Arznei zur Verbesserung einer Asthenopie
und ein Verfahren zum relativen Vergleichen mit anderen Arzneien
gefunden. Die vorliegende Erfindung wird dadurch vervollkommnet.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Erfindung gemäß Anspruch
1 betrifft ein Modell für
eine Asthenopie, wobei eine Muskelkontraktion des Ziliarmuskels
durch die Kontraktionsreaktion mit mehreren Stimulierungen weitgehend
stabil abnimmt.
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Eine
Erfindung gemäß Anspruch
2 betrifft das Modell nach Anspruch 1, wobei die Asthenopie eine
akkommodative Asthenopie ist.
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Eine
Erfindung gemäß Anspruch
3 betrifft das Modell nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine von einem nicht
humanen Säugetier
oder Geflügel
enukleierte Ziliarmuskelprobe verwendet wird.
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Eine
Erfindung gemäß Anspruch
4 betrifft das Modell nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine von einem nicht
humanen Säugetier
enukleierte Ziliarmuskelprobe verwendet wird.
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Eine
Erfindung gemäß Anspruch
5 betrifft das Modell nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Ziliarmuskel
mehrmals durch die Verwendung eines Mittels zum Hervorrufen einer
Kontraktion der glatten Muskeln kontrahiert wird.
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Eine
Erfindung gemäß Anspruch
6 betrifft das Modell nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Mittel
zum Hervorrufen einer Kontraktion der glatten Muskeln ein chemischer
Stimulus mit einer chemischen Substanz ist.
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Eine
Erfindung gemäß Anspruch
7 betrifft das Modell nach Anspruch 6, wobei die chemische Substanz aus
Acetylcholin, Serotonin, Histamin, Muskarin und Endothelin ausgewählt wird.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 8 betrifft das Modell nach einem der Ansprüche 1 bis
5, wobei das Mittel zum Hervorrufen einer Kontraktion der glatten
Muskeln ein elektrischer Stimulus ist.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 9 betrifft das Modell nach einem der Ansprüche 1 bis
8, wobei die Kontraktionsreaktion mit Stimulationen mindestens dreimal
wiederholt wird, wodurch eine weitgehend stabile Abnahme der Muskelkontraktion
erfolgt.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 10 betrifft das Modell nach einem der Ansprüche 1 bis
9, wobei der Ziliarmuskel ein Abnahmeverhältnis der Muskelkontraktion
von 50 ± 30
% zeigt.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 11 betrifft das Modell nach einem der Ansprüche 1 bis
9, wobei der Ziliarmuskel ein Abnahmeverhältnis der Muskelkontraktion
von 50 ± 20
% zeigt.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 12 betrifft das Modell nach einem der Ansprüche 1 bis
9, wobei der Ziliarmuskel ein Abnahmeverhältnis der Muskelkontraktion
von 50 ± 10
% zeigt.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 13 betrifft ein Verfahren zum Herstellen
des Modells für
eine Asthenopie, wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert, wobei
eine Muskelkontraktion des Ziliarmuskels durch eine Kontraktionsreaktion
mit mehreren Stimulationen weitgehend stabil abnimmt.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 14 betrifft ein Verfahren zum Beurteilen
einer Arznei gegen Asthenopie, gekennzeichnet durch Kontaktieren
des Modells für
Asthenopie wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert, mit
einer Medizin und Messen eines Kontraktionsverhältnisses des Ziliarmuskels,
um so die Wirkung zur Verbesserung einer Asthenopie durch die Arznei
zu beurteilen.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 15 betrifft das Verfahren nach Anspruch
14, gekennzeichnet durch Messen des Kontraktionsverhältnisses
des Ziliarmuskels vor und nach dem Verabreichen der Arznei und Vergleichen
der Kontraktionsverhältnisse.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 16 betrifft das Verfahren nach Anspruch
14 oder 15, gekennzeichnet durch das Durchführen des Verfahrens durch die
Verwendung eines Magnus-Apparats.
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Eine
Erfindung nach Anspruch 17 betrifft eine Arznei, die mittels des
nach einem der Ansprüche
14 bis 16 definierten Verfahrens ausgewählt wird.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Darstellung, die eine Änderung
des Kontraktionsverhältnisses
durch eine Acetylcholinstimulation bei der Herstellung von Proben
und im Vorversuch zeigt.
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2 ist
eine Darstellung, die den Vergleich des Kontraktionsverhältnisses
durch eine zehnte Acetylcholinstimulation im Vorversuch zeigt.
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3 ist
eine Darstellung, die eine Änderung
des Kontraktionsverhältnisses
durch die Acetylcholinstimulation im Haupttest zeigt.
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4 ist
eine Darstellung, die den Vergleich des Kontraktionsverhältnisses
durch eine zehnte Acetylcholinstimulation im Haupttest zeigt.
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BESTES VERFAHREN
ZUR DURCHFÜHRUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Arznei zum Verbessern einer Asthenopie, die in der vorliegenden
Erfindung zu beurteilen ist, ist gewöhnlich ein Medikament oder
Quasi- Medikament
und es können
bestimmte Gesundheitsprodukte (funktionelle Nahrungsmittel), Nahrungsergänzungsmittel,
wie beispielsweise Gesundheitsprodukte, Nahrungsmittel und dergleichen
umfasst sein.
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Die
Herstellung der Probe und das Beurteilungsverfahren dafür werden
nachfolgend beschrieben.
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Zuerst
wird ein zu testendes Muster, bei dem es sich um eine Probe handelt,
hergestellt.
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Ein
Verfahren zum Erhalten eines Ziliarmuskels, der das zu testende
Muster ist, ist nicht sonderlich eingeschränkt und umfasst zum Beispiel
das folgende Verfahren.
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Ein
Augapfel wird aus einem Testtier unter üblicher Anästhesie enukleiert. Der enukleierte
Augapfel wird sklerotomiert und an der Äquatorialstelle halbiert. Danach
wird der Ziliarmuskel sorgfältig
von der Sklera nach dem Entfernen der kristallinen Linse abgetragen,
um den Ziliarmuskel zu erhalten.
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Als
Testtier, von dem der Ziliarmuskel erhalten wird, können nicht
humane Säugetiere
oder Geflügel verwendet
werden, die durch Bos, Schafe, Schweine, Ziegen, Affen, Hunde, Katzen,
Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten, Mäuse, Gallus, Gänse, Wachteln,
Strauße
und dergleichen veranschaulicht werden können. Darunter wird eines der
nicht humanen Säugetiere
bevorzugt verwendet.
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Vorzugsweise
werden die Testtiere vor der Enukleierung des Ziliarmuskels unter
denselben Bedingungen nach einem herkömmlichen Verfahren gezüchtet, um
so weit wie möglich
Ziliarmuskelproben in demselben Zustand zu erhalten.
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Nach
der Enukleierung des Ziliarmuskels kann der erhaltene Ziliarmuskel
zu einer gewünschten
Größe geschnitten
werden, um eine Probe zu ergeben. Die Größe der Probe ist nicht sonderlich
eingeschränkt. Zum
Beispiel ist, wenn die Probe in einem nachfolgend beschriebenen
Magnus-Röhrchen
reagiert werden soll, ein zurechtgeschnittenes Stück von etwa
3 mm Breite und etwa 6 mm Länge
bevorzugt.
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Zweitens
wird der enukleierte Ziliarmuskel mehrmals stimuliert, um beim Ziliarmuskel
eine Kontraktionsreaktion hervorzurufen. Die verwendeten Stimuli
sind nicht sonderlich eingeschränkt,
solange die Kontraktionsreaktion beim Ziliarmuskel hervorgerufen
wird. Da der Ziliarmuskel eine Art glatter Muskel ist, ist es bevorzugt,
ein Mittel zum Hervorrufen einer Kontraktion des glatten Muskels
zu verwenden. Das Mittel zum Hervorrufen einer Kontraktion des glatten
Muskels, auf das in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, ist
der Stimulus zum Induzieren einer reversiblen Kontraktion in einem
glatten Muskel. Beispiele dafür
umfassen physikalische Stimuli, chemische Stimuli und elektrische
Stimuli. Darunter ist es bevorzugt, die chemischen Stimuli oder
die elektrischen Stimuli zu verwenden, die die Kontraktion/Relaxation
des Ziliarmuskels in einem lebenden Körper steuern.
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Beispiele
für Substanzen,
die für
die chemischen Stimuli verwendet werden können, umfassen Acetylcholin,
Serotonin, Histamin, Muskarin, Nikotin und Endothelin. Darunter
wird vorzugsweise Acetylcholin verwendet.
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Es
ist bekannt, dass Acetylcholin aus dem parasympathischen Nerv freigesetzt
wird und einen cholinergen Rezeptor stimuliert, um eine starke Kontraktion
im glatten Muskel hervorzurufen.
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Serotonin
ist ein viel versprechender Kandidat für einen intrazerebralen chemischen
Transmitter, der in der intestinalen Chromaffinzelle der Darmschleimhaut
existiert und von der Chromaffinzelle in ein Blutplättchen wandert.
Insbesondere ist es bekannt, eine Kontraktionsreaktion im vaskulären glatten
Muskel in der pulmonalen Zirkulation oder in den glatten Muskeln,
wie beispielsweise dem enukleierten Darmkanal und Bronchialmuskel,
hervorzurufen.
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Histamin
wird in einem Basophilen im Blut und in einer Gewebemastzelle gespeichert,
die eine Schlüsselrolle
bei der Entzündung
und allergischen Reaktion spielt. Es kann die Akzentuierung der
Darmperistaltik, die Beschleunigung der Magensäuresekretion und die Akzentuierung
der Dilatation und Permeabilität
von winzigen kapillaren Blutgefäßen hervorgerufen
werden. Insbesondere ist eine starke Kontraktion des Bronchus und
eine Kontraktionswirkung des glatten Muskels, z.B. in Blutgefäßen, bekannt.
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Muskarin
ist ein Alkaloid mit Giftpilzursprung und wie Acetylcholin stimuliert
es einen cholinergen Rezeptor, dessen Wirkung durch Atropin blockiert
wird. Mit anderen Worten ist eine Wirkung auf postsynaptische Membranen
zum Hervorrufen der starken Bronchuskontraktion und einer Kontraktionswirkung
des glatten Muskels, z.B. in Blutgefäßen, bekannt.
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Nikotin
ist ein Alkaloid, das aus Tabakblättern erhalten wird, und wie
Acetylcholin stimuliert es einen cholinergen Rezeptor, dessen Wirkung
durch Hexamethonium blockiert ist. Mit anderen Worten ist eine Wirkung
auf die neuromuskulären
Synapsen von autonomen Ganglien und Motorendplatten und ein Hervorrufen einer
starken Bronchuskontraktion und einer Kontraktionswirkung des glatten
Muskels, z.B. in den Blutgefäßen, bekannt.
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Endothelin
ist ein aus 21 Aminosäuren
bestehendes Polypeptid, dessen Erzeugung in humanen oder Schweineepithelzellen
nachgewiesen wur de. Es ist die starke Kontraktionswirkung von Blutgefäßen und
eine lang anhaltende, potente, blutdrucksteigernde Wirkung bekannt
(Nature, 332, 411–415
(1988); FEBS Letters, 231, 440–444
(1988)).
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Die
Konzentration der chemischen Substanz, die in den chemischen Stimuli
verwendet wird, kann in passender Weise eingestellt werden, je nach
den Arten von verwendeten chemischen Substanzen oder deren Zweck
oder den Umständen.
Darunter liegt die Konzentration vorzugsweise von 10–10 bis
10–1 mol/l,
besonders bevorzugt von 10–9 bis 10–2 mol/l.
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Wenn
die elektrischen Stimuli zur Herstellung des Modells der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, können
die Intensität
der Stimuli durch geeignetes Einstellen verschiedener Bedingungen,
wie beispielsweise das Verfahren der elektrischen Durchflutung (direkte
Stimulation oder indirekte Stimulation), die elektrischen Stromarten
(Wechselstrom, Gleichstrom oder dergleichen) oder die Intensität von elektrischem
Strom oder Spannung, die Verarbeitungsdauer, die Verarbeitungszahl
und die Intervalle zwischen jeder Verarbeitung geändert werden.
Die verwendeten Bedingungen können
in geeigneter Weise je nach dem Ermüdungsgrad, der in die Probe
induziert werden soll, eingestellt werden und sind nicht sonderlich
eingeschränkt.
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Wenn
die elektrischen Stimuli verwendet werden, kann der Grad an elektrischer
Stimulation abhängig von
verschiedenen Faktoren schwanken, wie beispielsweise eine verwendete
Vorrichtung, die verwendete Elektrodenart, z.B. deren Form und deren
Materialien, die Größe der Probe,
die Positionsbeziehung zwischen der Probe und der Elektrode und
die Art der Substanzen, die zwischen der Probe und der Elektrode
liegen (insbesondere im Fall einer indirekten Stimulation). Die
Bedingungseinstellungen, die für
den Zweck der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können in
geeigneter Weise zum Beispiel mit Bezug auf die in Masuda u.a. (Gen. Pharmac.,
30, 579–584
(1998)) beschriebenen Bedingungen vom Durchschnittsfachmann durchgeführt werden.
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Die
beim Hervorrufen der Kontraktionsreaktion zu verwendende Vorrichtung
ist nicht sonderlich eingeschränkt
und es ist bevorzugt, einen Magnus-Apparat zu verwenden. Dies führt zu einem
Vorteil insofern, als das enukleierte Organ noch immer einen intramuskulären Nervus
plexus aufweist, selbst wenn das enukleierte Organ aus der Kontrolle
der zentralen Nerven entfernt wird, so dass seine Mobilität nicht
verloren geht.
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Ein
Beispiel für
die Verwendung eines Magnus-Apparats wird erläutert.
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Zuerst
wird, während
ein Ende eines abgeschnittenen Stücks des Ziliarmuskels an einem
Ankerabschnitt, der am Boden des Magnus-Röhrchens
in dem Röhrchen
angeordnet ist, angebracht ist und das andere Ende an einem Hakenabschnitt
des Spannungswandlers angebracht ist, das Magnus-Röhrchen mit
einer künstlichen
Nährlösung gefüllt, die
durch ein herkömmliches
Verfahren hergestellt wurde. Danach wird ein Mischgas aus 5 % Kohlendioxid
und 95 % Sauerstoff das Magnus-Röhrchen
von einer Einlassröhre
her durchströmen
gelassen. Durch Regulation der Spannung mittels manuellen Bewegens
des Spannungswandlers nach oben und nach unten wird vorher eine
Last an die Probe angelegt, und das Röhrchen wird in den Magnus-Apparat
eingesetzt.
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Zum
Beispiel wird, wenn Acetylcholin oder dergleichen als Kontraktionsagonist
des glatten Muskels nach einer bestimmten Zeitdauer in dem eingestellten
Magnus-Röhrchen
verwendet wird, der Agonist zugesetzt, so dass seine erste Endkonzentration
nach 30 Minuten 10–4 mol/l ist.
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Danach
wird die Probe an einem Punkt gewaschen, an dem die Reaktion ein
Plateau erreicht, und nachdem bestätigt wurde, dass das Signal
zur Grundlinie zurückkehrt,
werden die Stimuli durch den Kontraktionsagonisten wiederholt.
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Die
Zahl der Stimulationen kann so eingestellt werden, dass der Ziliarmuskel
mit einem gewünschten stabilen
Ermüdungszustand
erhalten wird. Obwohl die Zahl je nach der Qualität und Intensität der jedes
Mal angelegten Stimuli variabel ist, liegt die Stimulationszahl
gewöhnlich
vorzugsweise bei 3 bis 50-mal, besonders bevorzugt bei 3 bis 20-mal
und ganz besonders bevorzugt bei 4- bis 15-mal. Ein höheres Ermüdungsniveau des
Ziliarmuskels kann durch Erhöhen
der Wiederholungszahl gesteigert werden, aber die Stimuli von über 50-mal
können
gewöhnlich
dem Ziliarmuskel keine zusätzliche
wirksame Ermüdung
verleihen. Darüber
hinaus ist gewöhnlich
das wiederholte Anlegen von moderaten Stimuli bis zu einem gewissen
Grad bevorzugt, um eine stabile Ermüdung zu erhalten.
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Drittens
wird die Änderung
des Kontraktionsverhältnisses
durch die Stimulation für
die wie oben hergestellte Probe aufgezeichnet.
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Das
Aufzeichnungsverfahren ist nicht sonderlich eingeschränkt. Konkret
kann das folgende Verfahren in Betracht gezogen werden.
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Zuerst
wird die Spannung der Probe nach jeder Stimulation gemessen. Als
Nächstes
wird auf der Grundlage der sich ergebenden Messwerte ein Kontraktionsverhältnis in
der Annahme berechnet, dass die Spannung, die durch Abziehen der
Kontraktionsspannung an der Grundlinie von der Kontraktionsspannung nach
der ersten Stimulation erhalten wird, als 100 % definiert wird,
und aufgezeichnet.
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Außerdem wird,
wenn das Abnehmen des Kontraktionsverhältnisses des Ziliarmuskels
stabilisiert wird, der Ziliarmuskel, der eine stabile Abnahme des
Kontraktionsverhältnisses
des Ziliarmuskels auf vorzugsweise 50 ± 30 %, besonders bevorzugt
50 ± 20
% und besonders bevorzugt 50 ± 10
% zeigt, als Probe verwendet.
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Wenn
die Probe in der vorliegenden Erfindung mittels des Magnus-Apparats unter Änderung
der chemischen Stimuli auf elektrische Stimuli oder dergleichen
erhalten wird, wird der Ziliarmuskel, der eine stabile Abnahme des
Kontraktionsverhältnisses
des Ziliarmuskels auf vorzugsweise 50 ± 30 %, besonders bevorzugt 50 ± 20 %
und ganz besonders bevorzugt 50 ± 10 % zeigt, in der Beurteilung
als Probe verwendet.
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Viertens
wird eine zu beurteilende Testformulierung mit der wie oben beschrieben
erhaltenen Probe reagiert.
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Konkrete
Beispiele des Verfahrens sind nicht sonderlich eingeschränkt und
können
durch das folgende Verfahren veranschaulicht werden.
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Zum
Beispiel wird, wenn der Magnus-Apparat verwendet wird, die Lösung in
dem Magnus-Röhrchen durch
eine künstliche
Nährlösung ersetzt,
die eine Testformulierung einer bestimmten Konzentration enthält, bevor
eine Endstimulation angelegt wird.
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Danach
wird die Änderung
des Kontraktionsverhältnisses
der Probe auf dieselbe Weise wie oben nach der Behandlung mit der
Lösung
aufgezeichnet.
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Der
obige Test kann als Vorversuch mittels einer Base für die Testformulierung
als Index vor dem Haupttest für
die Testformulierung durchgeführt
werden. Außerdem
kann ein pharmakologischer Ver gleichstest für die pharmakologische Wirksamkeit
durchgeführt
werden, indem die Ergebnisse des Vorversuchs mit den Ergebnissen
des Haupttests für
die Testformulierung verglichen werden.
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Die
Testformulierung ist nicht sonderlich eingeschränkt und umfasst bestehende
Medikamente, deren Wirkungen bereits bekannt sind, oder Arzneien,
die gegenwärtig
neu entwickelt werden und deren Wirkungen nicht vollständig bekannt
sind, und die Beurteilung kann über
alle medizinischen Wirkungen, die minimale pharmakologisch wirksame
Dosis und dergleichen erfolgen. Als ein Beispiel der vorliegenden
Erfindung können
die Formulierung von Vitamin B12 (Cyanocobalamin), das unter den
Handelsnamen: Sancoba Augentropfen 0,02 % (hergestellt von Santen
Pharmaceutical Co., Ltd.), Cabalam Augentropfen 0,02 % (hergestellt
von Nippon Tenganyaku), Softear Augentropfen 0,02 % (hergestellt
von Senju Pharmaceutical Co., Ltd.), Pharcoba Augentropfen 0,02
% (hergestellt von Toyo Pharma Kabushiki Kaisha), erhältlich ist,
und die Formulierung von Flavinadenindinukleotid, das unter den
Handelsnamen: FAD Augentropfen 0,05 % (hergestellt von Santen Pharmaceutical
Co., Ltd.), FAD T Augentropfen 0,05 % (hergestellt von Nitto Meditec),
Nitten FA Augentropfen 0,05 % (hergestellt von Nippon Tenganyaku
Laboratories), Vitast Augentropfen 0,05 % und 0,1 % (hergestellt von
Senju Pharmaceutical Co., Ltd.), Flavitan Augentropfen 0,05 % (hergestellt
von TOA EIYO Pharmaceutical Company) und dergleichen erhältlich ist,
beispielhaft gezeigt werden.
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Weiterhin
kann ein Vergleichstest über
die pharmakologische Wirksamkeit durch Durchführen eines Tests auf einer
Standardformulierung als Vergleichskontrolle, die anstelle der Testformulierung
in dem obigen Haupttest verwendet wird, und durch Vergleichen der
Ergebnisse durchgeführt
werden.
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Als
Standardarznei kann hier eine Arznei zum Verbessern einer Asthenopie,
außer
der in dem obigen Test verwendeten, verwendet werden.
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Der
pharmakologische Vergleichstest für die pharmakologische Wirksamkeit
kann dadurch durchgeführt
werden, dass Testgegenstände
unter denselben Bedingungen durchgeführt werden. Weiterhin können, da
der Ziliarmuskel, von dem eine richtige Ermüdung reproduziert wird, die
in einem lebenden Körper
hervorgerufen wird, als Probe im Fall der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, objektive und relative Vergleiche angestellt werden.
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend auf der Grundlage der folgenden
Beispiele beschrieben, die nicht als den Umfang der vorliegenden
Erfindung auf diese Beispiele einschränkend interpretiert werden sollen.
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(Herstellung der Probe)
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Acht
Kaninchen wurden anschließend
an eine Quarantäne
und Anpassung als Testtiere einem Test unterworfen.
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Die
Kaninchen wurden einzeln in einem in einem Innenraum untergebrachten
Tierzuchtkasten unter den Züchtbedingungen
bei einer Raumtemperatur von 21° ± 3°C, einer
relativen Feuchte von 50 ± 20
%, mittels einer Beleuchtungszeit von 12 Stunden (7:00 Uhr Licht
an, 19:00 Uhr Licht aus) und Lüftung
von 10–15-mal
pro Stunde gezüchtet.
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Die
obigen Testtiere wurden einer allgemeinen Anästhesie durch intramuskuläre Injektion
einer Mischlösung
aus Ketalar : Seraktal (4:5) bei 1 ml/kg unterworfen, und anschließend wurden
die Augäpfel
enukleiert.
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Hier
waren die verwendeten Anästhetika
die Ketaminhydrochlorid-Injektionslösung (hergestellt
von Sankyo Co., Ltd., speziell Ketalar 50 für die intramuskuläre Injektion)
und die Xylidinhydrochlorid-Injektionslösung (hergestellt
von Bayer Yakuhin, Ltd., speziell Seraktal 2 % Injektionen für Hunde
und Katzen).
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Jeder
enukleierte Augapfel wurde sklerotomisiert und in der Äquatorialstellung
des Augapfels halbiert, und dann wurde der Ziliarmuskel nach dem
Entfernen der kristallinen Linse sorgfältig von der Sklera abgetragen.
Der so erhaltene Ziliarmuskel wurde in einen 3 mm breiten und 6
mm langen Streifen zu einer Probe geschnitten.
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Für die obige
Enukleierungs-OP wurden herkömmliche
ophthalmische OP-Instrumente, wie beispielsweise ein Keratom, ein
Mikromesser, eine Pinzette und Scheren verwendet.
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(Erzeugung der Ermüdung)
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Die
im obigen Verfahren erhaltene Probe wurde in einem Magnus-Röhrchen suspendiert.
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Das
Magnus-Röhrchen
wurde mit einer Krebs-Henseleit-Lösung gefüllt, die mit einem Mischgas
aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durchgeblasen wurde.
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Die
Krebs-Henseleit-Lösung
wurde durch Mischen von 1 Volumen der folgenden A-Lösung, 1
Volumen B-Lösung
und 1 Volumen C-Lösung
hergestellt und danach wurde 6 Volumen destilliertes Wasser unter
gründlichem
Mischen zugegeben, und anschließend
schließlich
1 Volu men D-Lösung
der Mischlösung
zugesetzt. Die sich ergebende Lösung
wurde vor Licht abgeschirmt und bei Verwendung auf 37°C erwärmt.
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Die
Herstellungsverfahren für
die A- bis D-Lösungen
waren wie folgt.
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A-Lösung: Destilliertes
Wasser wurde zu 69,2 g NaCl, 3,50 g KCl, 1,63 g KH2PO4, 2,96 g MgSO4·7H2O gegeben, um ein Endvolumen von 1000 ml
zu erhalten. B-Lösung:
Destilliertes Wasser wurde zu 4,00 g Glucose gegeben, um ein Endvolumen
von 200 ml zu erhalten. C-Lösung:
Destilliertes Wasser wurde zu 4,20 g NaHCO3 gegeben,
um ein Endvolumen von 200 ml zu erhalten. D-Lösung: Destilliertes Wasser
wurde zu 3,68 g CaCl2·2H2O
gegeben, um ein Endvolumen von 100 ml zu erhalten.
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Die
Probe im Magnus-Röhrchen
wurde zuerst mit einem Füllgewicht
von 0,4 g mittels eines Spannungswandlers (Isometric Transducer,
Modell FD Pick-up TB-611 T, hergestellt von Nihon Kohden Corporation)
suspendiert. Nach 30 Minuten wurde Acetylcholin (Acetylcholinchlorid,
hergestellt von SIGMA) als erste Stimulation zugesetzt, um so eine
Endkonzentration von 10–4 mol/l zu ergeben.
An einem Punkt, an dem die Reaktion einen Plateauwert erreichte,
wurde die Probe gewaschen und, wie nachgewiesen wurde, kehrte die Reaktion
zur Grundlinie zurück,
und danach erfolgte wieder eine Stimulation auf dieselben Weisen
wie oben. Die Verfahren wurden neunmal wiederholt.
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Die
Spannung der Probe nach jeder Stimulation wurde durch die Datenerfasssungs-Software
(VISUAL DESIGNER Ver. 2.3, hergestellt von INTELLIGENT INSTRUMENTATION) über den
obigen Spannungswandler, ein Eingabefeld (Modell JD-112S, hergestellt
von Nihon Kohden Corporation), einen Verstärker für die Druckbeanspruchung (Modell
AP-621G, hergestellt
von Nihon Kohden Corporation) und einen A/D- Umsetzungs-Steckkarte (PCI-20428W, hergestellt
von INTELLIGENT INSTRUMENTATION) aufgezeichnet.
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Das
Kontraktionsverhältnis
wurde auf der Grundlage der resultierenden Daten unter der Annahme
berechnet, dass die Spannung, die durch Subtraktion der Kontraktionsspannung
an der Grundlinie von der nach der ersten Stimulation durch das
Kontraktionsstimulans beobachtete Kontraktionsspannung erhalten
wurde, 100 % war, und aufgezeichnet.
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Die
Ergebnisse sind in den Tabellen 1–5 und in der 1 gezeigt.
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Darüber hinaus
wurde zum Zweck der Bestätigung,
ob die Probe im Hinblick auf die Stimulation durch Acetylcholin
reagierte, auch die Spannung der Probe, die mit Atropin mit einer
Endkonzentration von 10–6 mol/l vorbehandelt
war, bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6–8 gezeigt.
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Es
ist, wie in den Tabellen 1 bis 5 und der 1 gezeigt,
zu sehen, dass die Ermüdung
des Ziliarmuskels erzeugt werden kann, weil das Kontraktionsverhältnis abnimmt
oder die Kontraktionsspannung durch wiederholte Stimulationen mittels
Acetylcholin verringert ist. Außerdem
kann aus den Tabellen 6 bis 8 nachgewiesen werden, dass die Kontraktionsreaktion
durch Acetylcholin eine Reaktion über den Muskarinrezeptor ist, weil
die Kontraktionsreaktion des Ziliarmuskels durch Ace tylcholin hervorgerufen
wird und durch die Vorbehandlung mit Atropin gehemmt wird, wodurch
ersichtlich ist, dass Acetylcholin ein Kontraktionsstimulans ist, das
sehr nahe dem von physiologischen Zuständen ist.
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(Vorversuch)
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Nach
den obigen Stimulationen und vor der Anwendung der 10. Stimulation
wurde die Lösung
im Magnus-Röhrchen
durch eine Krebs-Henseleit-Lösung ersetzt,
die Cyanocobalamin jeweils in einer Konzentration von 0 %, 0,02
%, 0,012 %, 0,0072 %, 0,0043 % und 0,0026 % enthielt, und die Probenspannung
wurde auf dieselbe Weise wie oben angegeben aufgezeichnet.
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Der
Grund, warum Cyanocobalamin in diesem Vorversuch verwendet wurde,
war der, dass Cyanocobalamin der Wirkstoff der im folgenden Haupttest
verwendeten Testformulierung ist.
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Die
Ergebnisse sind in den Tabellen 1–5 und den 1 und 2 gezeigt.
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Die
Cyanocobalamin enthaltende Krebs-Henseleit-Lösung wurde wie folgt hergestellt.
Es wurden insbesondere 1 Volumen A-Lösung, 1 Volumen B-Lösung und
1 Volumen C-Lösung
gemischt und danach 5 Volumen destilliertes Wasser und 1 Volumen
eines 10-fachen Konzentrats einer Cyanocobalamin-Lösung unter sorgfältigem Mischen
zugegeben. Schließlich
wurde 1 Volumen D-Lösung
zugesetzt. Die hergestellte Lösung wurde
vor Licht abgeschirmt und bei Verwendung auf 37°C erwärmt.
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Es
ist wie in den Tabellen 1 bis 5 und der 1 und der 2 gezeigt
ersichtlich, dass bei 0,0026 % Cyanocobalamin kein Einfluss beo bachtet
wird, aber eine Verringerung der Kontraktionsreaktion durch Acetylcholin
wird abhängig
von der Konzentration ab 0,0043 % gehemmt. Außerdem ist wie in der Tabelle
2 gezeigt ersichtlich, dass Cyanocobalamin in einer Konzentration
von 0,0043 % oder höher
die Grundlinienspannung für
keine der Konzentrationen beeinflusst, was zeigt, dass das Cyanocobalamin
als solches in einer Konzentration von 0,0043 % oder höher keine
direkte Wirkung zeigt und einen Anti-Ermüdungseffekt
aufweist. Außerdem
ist ersichtlich, dass die Anti-Ermüdungswirkung
durch Cyanocobalamin im Wesentlichen bei 0,012 % ein Plateau erreicht.
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Aus
den obigen Gründen
wurde die Konzentration der Indexarznei Cyanocobalamin für den Haupttest auf
0,012 % eingestellt und in dem folgenden Haupttest als Index verwendet.
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(Haupttest)
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Es
wurde derselbe Test wie im Vorversuch durchgeführt, allerdings mit 0,02 %
Cyanocobalamin Augentropfen TP263 (hergestellt von Toyo Pharma Kabushiki
Kaisha) als Testformulierung und Sancoba Augentropfen 0,02 % (hergestellt
von Santen Pharmaceutical Co., Ltd.) als Standardformulierung anstelle
von Cyanocobalamin. Die Ergebnisse wurden mittels des Tukey-Mehrfachvergleichverfahrens
beurteilt.
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Die
Ergebnisse sind in der Tabelle 9 und der 3 und 4 gezeigt.
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Es
zeigte sich gemäß der Erfindung
in der Tabelle 9 und der 3 und 4, dass
die Testformulierung eine Anti-Ermüdungswirkung auf den Ziliarmuskel
hat und dass ihre Effekte stärker
als die der Bezugsgröße für die Testformulierung
waren.
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Weiterhin
ist aus dem Vergleich der Testformulierung mit der Standardformulierung
ersichtlich, dass sowohl die Testformulierung als auch die Standardformulierung
eine Anti-Ermüdungswirkung
auf den Ziliarmuskel ausüben,
und die Wirkungen auf demselben Niveau liegen.
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INDUSTRIELLE
ANWENDBARKEIT
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Das
Modell der vorliegenden Erfindung ist als Modell nützlich,
das für
die Beurteilung einer Arznei zur Verbesserung einer Athenopie angewendet
werden kann, wie im Abschnitt „Mittel
zum Lösen
der Probleme" in
der vorliegenden Beschreibung beschrieben. Weiter werden ein Verfahren
zum Herstellen des Modells der vorliegenden Erfindung und ein Verfahren
zur Beurteilung einer Arznei mittels der Probe der vorliegenden
Erfindung zur Verfügung
gestellt. Das Vorsehen eines ausgezeichneten Beurteilungssystems
ist für
die Entwicklung einer ausgezeichneten Arznei, die eine wichtige
Erfindung ist, die zum Bereitstellen der ausgezeichneten Arznei
führt,
unerlässlich.
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Das
in vitro Modell der vorliegenden Erfindung weist ausgezeichnete
Merkmale auf, nämlich:
(i) die Fähigkeit
zur Beurteilung unter Bedingungen, die den physiologischen Bedingungen
nahe kommen, obwohl es sich um einen in vitro Test handelt; (ii)
die Fähigkeit,
stabil und bequem eine Probe erhalten, die die gewünschte Ermüdung mit
hoher Reproduzierbarkeit durch Änderung
der Bedingungen während
der Herstellung des Modells aufweist; (iii) die Fähigkeit
des quantitativen Bestimmens der Wirkungsbeständigkeit einer Testsubstanz;
und (iv) die Fähigkeit
eines Modells, das im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren einer eigentlichen
Asthenopie näher
kommt.
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Das
herkömmliche
in vitro Modell (zum Beispiel ein Modell, das in der japanischen
Patentveröffentlichungsschrift
Nr. Hei 7-133225 beschrieben ist) ist für ein System zum Durchführen einer
Beurteilung oder zum Screenen einer Arznei geeignet, die eine antagonistische
Wirkung gegenüber
einer vorübergehenden
Ziliarmuskelkontraktion zeigt. Allerdings kann, da eine Asthenopie
nicht durch eine vorübergehende
Ziliarmuskelkontraktion hervorgerufen wird, es als Beurteilungssystem
eines Agens zum Verbessern einer Asthenopie nicht als geeignet angesehen
werden. Da es sich dabei um ein System handelt, bei dem vor der
Einleitung der Ziliarmuskelkontraktion (präventives Verabreichungssystem)
eine Testarznei zugeführt
wird, ist das Modell außerdem
als Beurteilungssystem für
eine Arznei zum Verhindern einer Muskelkontraktion (prophylaktische
Medizin) geeignet, kann aber für
ein Beurteilungssystem für
therapeutische Arzneien nicht als geeignet angesehen werden.
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Andererseits
ist das Modell der vorliegenden Erfindung ein Beurteilungssystem
mittels eines Ziliarmuskels in einer stabilen Ermüdung, die
durch mehrmaliges Induzieren einer Kontraktion und Relaxation im Ziliarmuskel
erhalten wird, wobei es sich um ein Modell handelt, das im Vergleich
zu herkömmlichen
Modellen den Ziliarmuskel viel näher
in einem wirklichen Asthenopiezustand verwendet. Da das Modell ein
System ist, bei dem eine Arznei nach der Erzeugung einer Ermüdung zugesetzt
wird (therapeutisches Verabreichungssystem), ist es außerdem als
Beurteilungssystem für
therapeutische Arzneien geeignet.
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Weiterhin
weist das Beurteilungsverfahren unter Verwendung der Probe der vorliegenden
Erfindung ausgezeichnete Merkmale auf, nämlich: (i) es kann eine Beurteilung
der Wirkung einer Arznei mit hoher Repro duzierbarkeit durchführen; (ii)
es kann die Wirkung einer Arznei quantifizieren; (iii) Erleichterung
des Vergleichs einer Wirkungsbeständigkeit einer Standardarznei
und einer Testarznei; (iv) es ist für das Screenen nicht nur nach
einer bekannten Arznei sondern auch nach einer neuartigen Arznei
nützlich.
