KR100538425B1 - 안정 피로 모델, 그 제작방법, 그 모델을 사용하는평가방법 및 그 평가방법을 이용함으로써 선택된 약제 - Google Patents

안정 피로 모델, 그 제작방법, 그 모델을 사용하는평가방법 및 그 평가방법을 이용함으로써 선택된 약제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 우수한 안정 피로 모델: 이의 우수한 제작방법: 이 모델을 사용하는, 약물의 우수한 평가방법: 및 이 평가방법을 이용함으로써 선택된 우수한 약물을 제공한다. 반복된 자극에 기인한 수축 반응을 통해 모양체근 수축력이 안정하게 저하된 안정 피로 모델: 이의 제작방법: 이 모델을 사용하는, 약물의 평가방법: 및 이 평가방법을 이용함으로써 선택된 약물.

Description

안정 피로 모델, 그 제작방법, 그 모델을 사용하는 평가방법 및 그 평가방법을 이용함으로써 선택된 약제 {EYESTRAIN MODEL, METHOD OF CONSTRUCTING THE SAME, EVALUATION METHOD WITH THE USE OF THE MODEL AND DRUGS SCREENED BY USING THE EVALUATION METHOD}
본 발명은 안정 피로 (eyestrain) 모델, 그 제작방법, 그 모델을 사용하는 평가방법, 그 평가방법을 이용함으로써 선택된 (screened) 약제에 관한 것이고, 보다 상세하게는 조절성 안정 피로에 있어서의 미동 조절의 개선을 치료 목적으로 한 약제의 평가에 사용하는 모델, 그 제작방법, 그 모델을 사용하는 평가방법 및 그 평가방법을 이용함으로써 선택된 약제에 관한 것이다.
안정 피로는 VDT (Visual Display Terminal) 작업을 장시간 동안 실시한 경우 또는 장거리 운전으로 초점을 빈번하게 변화시킨 경우 등에 발생된다.
이 안정 피로는 모양체근이 과도하게 긴장함으로써 피로해지면 원활하게 조절되지 않게 됨으로써 발생되는 것으로 알려져 있다 (일본 안과학회 잡지, 92, 1854-1858 (1988)). 여기에서 말하는 모양체근이란 안구 조직에 있어서 수정체를 둘러싸고, 윤상 (輪狀) 을 이루며 존재하는 모양체근의 주요 구성부분을 이루는 평활근이다.
모양체근의 경우에는, 그에 대한 자극에 의한 수축은 단수축이고, 수축 양식은 근육의 양끝을 일정한 길이로 고정시켜 수축시키는 등척성인 것으로 알려져 있다. 그리고, 근육에 대해 계속해서 자극을 반복하면 근육의 수축장력은 서서히 감소되고 동시에 수축 과정의 지연이 발생된다. 이 현상을 근피로라고 하고, 모양체근 피로에 의해 안정 피로가 발생된다.
안정 피로에 대해서는 점안제 등의 약제가 그 치료에 사용되고 있다.
그러나, 안정 피로를 확실하게 치료할 수 있는 약제는 현재 존재하지 않는다. 또한, 그 약제의 평가방법도 아직 확립되어 있지 않다.
현재의 약물 평가방법으로는 여러가지가 있으나, 임상시험에 선행하여 이루어지는 시험에는 크게 나누어 생체내 (in vivo) 계와 시험관내 (in vitro) 계가 있다. 특히 평가의 초기 단계에서는 간편ㆍ신속하다는 이유에서 시험관내 계가 널리 사용되고 있다.
시험관내 계에서 측정하는 경우, 모양체근의 피로는 근육의 수축력의 감소와 수축ㆍ이완 과정의 지연이라는 현상으로서 나타난다는 점에서, 이것을 직접 관찰함으로써 측정할 수 있다.
구체적으로는, 적출 모양체근을 대상으로 하는 마그누스법의 사용이 있다.
마그누스법에는 통상적으로 인공영양액을 수납하여 장기를 이 인공 영양액에 침지시키기 위한, 직경 약 1 ~ 2 sㆍ깊이 약 2 ~ 5 ㎝ 정도의 세관인 마그누스관, 인공영양액에 공기를 도입하기 위한 공기도입관, 장기의 일단부를 고정시키기 위한 앵커 부분, 장기의 타단부를 고정시켜 그 장기의 장력을 측정하는 장력 트랜스듀서 및 마그누스관을 소정 온도 (대개의 경우 37 ℃) 로 보온하기 위한 항온조를 주요 구성부품으로 하는 마그누스 장치가 사용된다.
마그누스법은 생체를 있는 그대로의 상태에서 실험에 사용하는 경우와 같이, 그 생체의 다른 부분의 영향을 받는다는 문제가 없고, 또한 적출된 장기는 중추로부터의 신경지배가 제거되어 있어도 근육 내 신경총이 잔존하므로 운동기능은 상실되지 않았기 때문에 생리 조건 하에서의 측정이 가능하다는 이점이 있다.
마그누스법에 의한 약리작용을 검토한 것으로는, 소의 모양체근에서의 M3 타입의 무스카린 수용체에 대해 검토한 예 (Hiroshi Masuda 등, [Gen. Pharmac., 30(4), 579-584 (1998)]), 및 소의 모양체근에서의 NO 에 의한 근육의 이완 반응에 대해 검토한 예 (Soichiro Kamikawa 등, [Exp. Eye Res., 66, 1-7 (1998)]), (Hiroshi Masuda 등, [Current Eye Research, 16, (12), 1245-1251 (1997)]) 등이 보고되어 있다.
또한, 일본 공개특허 공보 평7-133225 호에서는 염화칼륨 또는 카르바콜에 의해 일과성으로 근육을 수축시킨 모양체근 표본을 사용하여 모양체근 긴장 완화제를 평가한 예가 개시되어 있다.
그러나, 상기에 의해 얻어진 모양체근 표본은 수축 야기 물질에 의해 수축된 상태에 있는 모양체근으로, 본래의 피로 상태의 모양체근이라고는 하기 어려웠다.
그래서, 생체 내에서의 피로가 재현되지 않은 표본에 대한 약제의 평가에서는 올바른 평가가 이루어졌다고는 할 수 없다.
또한, 상기 개시에서는 수축 야기 물질에 대한 길항제의 평가 밖에 할 수 없다는 점에서, 다른 안정 피로 개선용 약제와 그 효과를 상대적으로 평가할 수 없었다.
그래서, 이러한 사정을 감안하여, 본 발명자들은 예의 연구 결과, 시험관내 계에서 생체 내에서 발생되는 피로 상태의 모양체근을 재현한 표본 및 그 제작방법을 알아내었다. 또한, 안정 피로 개선용 약제의 약리 효과를 직접 그리고 객관적으로 올바르게 평가하는 방법 및 다른 약제와 상대적으로 비교하는 방법을 알아내고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 개시
청구항 1 에 관련되는 발명은, 복수회의 자극에 의한 수축반응에 의하여 모양체근의 근수축력을 실질적으로 안정적으로 저하시켜 이루어지는 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 2 에 관련되는 발명은, 상기 안정 피로가 조절성 안정 피로인, 청구항 1 에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 3 에 관련되는 발명은, 비인간 포유동물 또는 가금으로부터 적출한 모양체근 표본을 사용하여 이루어지는, 청구항 1 또는 2 에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 4 에 관련되는 발명은, 비인간 포유동물로부터 적출한 모양체근 표본을 사용하여 이루어지는, 청구항 1 또는 2 에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 5 에 관련되는 발명은, 평활근 수축 유도수단을 사용하여 모양체근을 복수회 수축시켜 이루어지는, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 6 에 관련되는 발명은, 상기 평활근 수축 유도수단으로서 화학물질에 의한 화학자극을 사용하여 이루어지는, 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 7 에 관련되는 발명은, 상기 화학물질로서 아세틸콜린, 세로토닌, 히스타민, 무스카린, 엔도세린에서 선택되는 물질을 사용하여 이루어지는, 청구항 6 에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 8 에 관련되는 발명은, 상기 평활근 수축 유도수단으로서 전기자극을 사용하여 이루어지는, 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 9 에 관련되는 발명은, 상기 자극에 의한 수축반응을 적어도 3회 반복함으로써 근수축력을 실질적으로 안정적으로 저하시켜 이루어지는, 청구항 1 내지 8 항 중 어느 한 항에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 10 에 관련되는 발명은, 상기 모양체근이 50 ±30% 의 근수축력 저하율을 나타내며 이루어지는, 청구항 1 내지 9 항 중 어느 한 항에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 11 에 관련되는 발명은, 상기 모양체근이 50 ±20% 의 근수축력 저하율을 나타내며 이루어지는, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 12 에 관련되는 발명은, 상기 모양체근이 50 ±10% 의 근수축력 저하율을 나타내며 이루어지는, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 안정 피로 모델에 관한 것이다.
청구항 13 에 관련되는 발명은, 복수회의 자극에 의한 수축반응에 의하여 모양체근의 근수축력을 실질적으로 안정적으로 저하시키는 안정 피로 모델의 제작방법에 관한 것이다.
청구항 14 에 관련되는 발명은, 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 모델에 약제를 접촉시키고, 모양체근의 수축력을 측정하여 약제의 안정 피로 개선효과를 평가하는 것을 특징으로 하는, 안정 피로 개선약의 평가방법에 관한 것이다.
청구항 15 에 관련되는 발명은, 약제 투여 전후의 모양체근의 수축률을 측정, 비교함으로써 평가하는 것을 특징으로 하는, 청구항 14 에 기재된 평가방법에 관한 것이다.
청구항 16 에 관련되는 발명은, 마그누스 장치를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는, 청구항 14 또는 15 에 기재된 평가방법에 관한 것이다.
청구항 17 에 관련되는 발명은, 청구항 14 내지 16 중 어느 한 항에 기재된 방법을 사용하여 선택되는 약제에 관한 것이다.
도 1 은 표본 제작 및 예비 시험에 있어서의 아세틸콜린 자극에 의한 수축률의 추이를 나타낸 그래프이다.
도 2 는 예비 시험에 있어서의 10 회째의 아세틸콜린 자극에 의한 수축률의 비교를 나타낸 그래프이다.
도 3 은 본 시험에 있어서의 아세틸콜린 자극에 의한 수축률의 추이를 나타낸 그래프이다.
도 4 는 본 시험에 있어서의 10 회째의 아세틸콜린 자극에 의한 수축률의 비교를 나타낸 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에서의 평가 대상인 안정 피로 개선용 약제는 통상적으로 의약품 또는 의약부외품이지만, 특정 보건용 식품 (기능성 식품), 건강 식품 등의 보조 식품이나 식품 등도 포함된다.
아래에, 표본의 제작 및 평가방법에 대해 설명하기로 한다.
첫째로, 표본인 피시험체를 준비한다.
피시험체인 모양체근의 취득방법은 특별히 한정되지 않고, 예컨대 이하의 방법을 들 수 있다.
전신마취 하의 시험동물로부터 안구를 적출하고, 적출한 안구를 강막 절개하여 안구의 적도 면에서 반으로 절단하고, 수정체를 제거한 후 강막에서 모양체근을 조심해서 박리시켜 모양체근을 얻는다.
모양체근을 얻는 시험동물로는 비인간 포유동물 또는 가금류가 사용되고, 소, 양, 돼지, 염소, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 집오리, 메추라기, 타조 등을 예시할 수 있다. 그 중에서도 비인간 포유동물 중의 일종이 바람직하게 사용된다.
모양체근의 적출 전의 시험동물은 통상적인 방법에 따라 동일한 조건 하에서 사육하는 것이 바람직하다. 이것은 가급적 동일 상태의 표본을 얻기 위해서이다.
모양체근을 적출한 후, 얻어진 모양체근을 원하는 크기로 잘라 표본을 제작한다. 그 크기는 특별히 제한되지 않는데, 예컨대 후술하는 마그누스관 내에서 반응시킨다면 폭 3 ㎜, 길이 6 ㎜ 의 샘플이 바람직하다.
둘째로, 적출한 모양체근에 복수회의 자극을 주어 모양체근에 수축반응을 일어나게 한다. 사용하는 자극은 모양체근에 수축반응을 야기시키는 것이면 특별히 한정되지 않는데, 모양체근은 평활근의 일종이므로, 평활근 수축 유도수단을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 말하는 평활근 수축 유도수단이란 평활근에 가역적 수축을 야기시키는 자극을 의미한다. 예컨대 물리자극, 화학자극, 전기자극을 들 수 있고, 그 중에서도 생체 내에서의 모양체근의 수축 이완을 제어하는 화학자극 또는 전기자극을 사용하는 것이 바람직하다.
화학자극에 사용할 수 있는 물질의 예로는, 아세틸콜린, 세로토닌, 히스타민, 무스카린, 니코틴, 엔도세린을 들 수 있다. 그 중에서도 아세틸콜린을 사용하는 것이 바람직하다.
아세틸콜린은 부교감신경에서 유리되어 콜린 작동성 수용체를 자극하여 평활근에 강한 수축을 일으키는 것으로 알려져 있다.
세로토닌은 유력한 뇌내 화학전달물질의 후보로서, 장 점막의 장 크로마핀 세포에 존재하고, 그곳에서 혈소판 내로 들어간다. 특히, 폐순환에 의해 혈관 평활근 또는 적출 장관 및 기관지근 등의 평활근 수축반응을 나타내는 것으로 알려져 있다.
히스타민은 혈액 중 호염기구와 조직 비만 세포에 저장되어 있고, 염증과 알레르기 반응의 주역이다. 장연동의 항진, 위산분비 촉진, 미세 모세혈관의 확장 및 투과성의 항진을 일으키는데, 특히 기관지의 강한 수축과 혈관 등의 평활근 수축작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
무스카린은 버섯 유래의 알칼로이드로서, 아세틸콜린과 마찬가지로 콜린 작동성 수용체를 자극하고, 그 작용은 아트로핀에 의해 차단된다. 즉 시냅스 후막에 작용하여, 기관지의 강한 수축과 혈관 등의 평활근 수축작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
니코틴은 담배의 잎에서 얻어지는 알칼로이드로서, 아세틸콜린과 마찬가지로 콜린 작동성 수용체를 자극하고, 그 작용은 헥사메토늄에 의해 차단된다. 즉, 자율신경근의 신경절 시냅스 및 운동종판에 작용하여 기관지의 강한 수축과 혈관 등의 평활근 수축작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
엔도세린은 21 개의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 인간이나 돼지의 내피세포에서 생산되는 것으로 확인되었다. 강력한 혈관 수축작용 및 지속적이고 강한 승압작용을 갖는 것으로 알려져 있다 ([Nature, 332, 411-415 (1988)]; [FEBS Letters, 231, 440-444 (1988)]).
화학자극에 사용되는 화학물질의 농도는 사용하는 화학물질의 종류, 그 목적이나 상황에 따라 적절하게 설정하면 된다. 그 중에서도 10-10 ~ 10-1 ㏖/ℓ 인 것이 바람직하고, 10-9 ~ 10-2 ㏖/ℓ 인 것이 더욱 바람직하다.
전기자극을 본 발명의 모델 제작에 사용할 때에는, 전기부하의 방법 (직접자극, 간접자극), 전류의 종류 (교류, 직류 등), 전류 및 전압의 세기, 처리시간, 처리회수, 각 처리 간의 간격 등의 여러 조건을 적절히 설정함으로써 자극의 세기를 변화시킬 수 있다. 사용하는 조건은 표본에 야기시키고자 하는 피로의 정도 등에 따라 적절히 조정하면 되고, 특별히 한정되지 않는다.
전기자극을 사용할 때에는, 사용하는 장치, 사용하는 전극의 종류 (형상이나 소재 등), 표본의 크기, 표본과 전극의 위치관계, 표본과 전극 간에 개재되는 물질의 종류 (특히 간접자극의 경우) 등, 각종 인자에 따라서도 전기자극의 정도가 달라지는데, 본 발명의 목적에 맞는 조건 설정은 당업자이면 예컨대 Masuda 등의 [Gen. Pharmac., 30, 579-584 (1998)] 에 기재된 조건을 참조함으로써 적절히 실시할 수 있다.
수축반응을 일으킬 때에 사용되는 장치는 특별히 한정되지 않으나, 마그누스 장치를 사용하는 것이 바람직하다. 그 이유는, 적출된 장기는 중추로부터의 신경지배가 제거되어도 근육 내 신경총이 잔존하고 있기 때문에 운동기능이 상실되지 않는다는 이점이 있기 때문이다.
마그누스 장치를 사용하는 하나의 실시예를 설명한다.
먼저, 마그누스관 내에서 모양체근 샘플의 일단을 마그누스관의 하부에 있는 앵커부에 걸고, 타단부를 장력 트랜스듀서의 후크부에 장착하며, 통상적인 방법에 따라서 조제한 인공 영양액을 마그누스관 내에 채우고, 이어서 도입관으로부터 마그누스관 내로 이산화탄소 5% 와 산소 95% 의 혼합가스를 통기시키고, 수동으로 장력 트랜스듀서를 상하로 움직이면서 장력을 조절하고, 미리 표본에 부하를 가하여 마그누스 장치에 세트한다.
세트된 마그누스관 내에 일정 시간 후, 예컨대 아세틸콜린 등을 평활근 수축작용약으로서 사용할 경우, 30 분 후에 1 회째의 최종농도가 10-4 ㏖/ℓ가 되도록 첨가한다.
그리고, 반응이 플래토 (plateau) 에 달했을 때 세정하고, 베이스 라인으로 되돌아가는 것을 확인한 후에, 수축작용약에 의한 자극을 반복한다.
자극을 주는 회수는 원하는 안정된 피로 상태를 갖는 모양체근을 얻을 수 있도록 설정하면 되고, 1 회 당 가해지는 자극의 질이나 세기 등에 의해 변화되는데, 통상 바람직하게는 3 회 ~ 50 회, 더욱 바람직하게는 3 ~ 20 회, 특히 바람직하게는 4 ~ 15 회이다. 반복 회수를 늘림으로써 더욱 정도가 심한 피로 조건이 야기되는데, 통상 50 회보다 많이 반복해도 모양체근에 그 이상 효과적으로 피로를 줄 수 없다. 또한, 통상적으로 그다지 강하지 않은 자극을 어느 정도의 회수로 반복해주는 것이 안정적인 피로 상태를 얻을 수 있다.
세째로, 이상에 의해 제작된 표본에 대해, 자극에 의한 수축률의 추이를 기록한다.
그 방법은 특별히 한정되지 않으나, 구체적으로는 다음의 방법을 생각할 수 있다.
먼저 표본의 장력을 각 회의 자극을 준 후에 측정한다. 다음으로, 그 얻은 측정치를 토대로 하여, 1 회째의 자극 후의 수축장력에서 베이스 라인의 수축장력을 뺀 장력을 100% 로 하여 수축률을 산출하고 이것을 기록한다.
그리고, 이 모양체근의 수축률의 저하가 안정되었을 때, 바람직하게는 50 ±30%, 더욱 바람직하게는 50 ±20%, 특히 바람직하게는 50 ±10% 로 안정적으로 저하된 모양체근을 표본으로 한다.
화학자극을 전기자극 등으로 변경하고, 마그누스 장치를 사용하여 본 발명의 표본을 얻는 경우에도, 모양체근의 수축률이 바람직하게는 50 ±30%, 더욱 바람직하게는 50 ±20%, 특히 바람직하게는 50 ±10% 로 안정적으로 저하된 모양체근을 표본으로 하여 평가에 사용한다.
네번째로, 상기에 의해 얻은 표본에 대해 평가 대상이 되는 시험 제제를 사용하여 반응시킨다.
구체적인 방법으로는 특별히 한정되지 않으나, 아래의 방법을 예시할 수 있다.
예를 들어, 마그누스장치를 사용하는 경우, 최종회의 자극을 주기 전에, 소정 농도의 시험 제제를 함유한 인공 영양액으로 마그누스관 중의 액을 치환한다.
그 후, 이 액으로 반응시킨 후에 이 표본의 수축률의 추이를 상기와 동일하게 기록한다.
상기 시험을 시험 제제에 대한 본 시험에 앞서, 그 지표로서 시험 제제 기제에 대해 예비 시험으로 실시해도 된다. 그리고, 그 예비 시험의 결과와 시험 제제에 대한 본 시험의 결과를 비교함에 따른 약효약리 비교시험을 실시할 수 있다.
시험 제제로는, 효과가 이미 판명된 기존 약이나 효과가 충분히 판명되어 있지 않은 신규 개발 중인 약제 등 특별한 한정이 없이, 모든 약제의 효과, 최저 약효량 등을 평가할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시예로는 예컨대 비타민 B12 (시아노코발라민) 제제인 산코바 점안액 0.02% (산텐제약 제조), 코바람 점안액 0.02% (닛뽄 점안약 연구소 제조), 소프티아 점안액 0.02% (센쥬제약 제조), 파르코바 점안액 0.02% (토요파르마 제조) 및 후라빈아데닌디누클레오티드 제제인 FAD 점안액 0.05% (산텐제약 제조), FAD T점안액 0.05% (닛토메디크 제조), 닛텐FA 점안 0.05% (닛뽄 점안약 연구소 제조), 비타스트 점안액 0.05% 및 0.1% (센쥬제약 제조), 후라비탄 점안액 0.05% (토아에이요 제조) 등을 예시할 수 있다.
그리고, 상기 본 시험에서의 시험 제제 대신에 비교대조로서 표준 제제에 대한 시험을 실시하고, 이들 결과를 비교함에 의한 약효 비교시험을 실시할 수도 있다.
표준 약제로는 상기 시험에 사용한 것 이외의 안정 피로 개선용 약제를 사용할 수 있다.
이러한 약효약리 비교시험은 동일 조건 하의 피험체일 때 비로소 가능하고, 나아가 본 발명의 경우에는 생체 내에서 발생되는 본래의 피로 상태가 재현된 모양체근을 표본으로 하여 사용하는 점에서, 객관적이고 상대적인 비교가 가능해지는 것이다.
이하에서, 본 발명을 실시예에 기초하여 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않는다.
(표본의 제작)
실험 동물로서 토끼 8 마리를 검역하고 환경에 적응시켜 시험에 제공하였다.
사육 환경으로서 실온 21 ±3 ℃, 상대 습도 50 ±20%, 조명 시간 12 시간 (오전 7 시 점등, 오후 7 시 소등), 환기 회수 10 ~ 15 회/시간의 조건 하에서의 실내에 설치된 동물 사육용 랙을 사용하여 개별적으로 사육하였다.
상기 실험 동물에게 케타랄ㆍ세락탈 (4:5) 혼액 1 ㎖/㎏ 의 근육주사를 놓아 전신마취시키고 안구를 적출하였다.
또한, 마취제로는 염산 케타민 주사액 (산쿄주식회사 제조, 케타랄 50 근육주사용) 및 염산 키시라진 주사액 (바이엘 약품주식회사 제조, 세락탈 2% 개ㆍ고양이 주사용) 을 사용하였다.
적출한 안구는 강막 절개하여 안구의 적도부에서 반으로 절단하고, 수정체를 제거한 후 강막으로부터 모양체근을 조심스럽게 박리하였다. 얻어진 모양체근을 폭 3 ㎜, 길이 6 ㎜ 의 샘플로 잘라 표본을 얻었다.
또한, 적출 수술에는 케라톰, 마이크로나이프, 핀셋, 가위 등의 안료용 수술기구를 사용하였다.
(피로 상태의 제작)
상기 과정에 의해 얻은 표본을 마그누스관 중에 현수하였다.
마그누스관 중에는, 산소 95%ㆍ이산화탄소 5% 의 혼합가스를 통기시키고 Krebs-Henseleit 액을 채웠다.
Krebs-Henseleit 액은 아래에 나타내는 A 용액 1 용량 (容), B 용액 1 용량 및 C 용액 1 용량을 혼합하고, 이어서 증류수 6 용량을 첨가하여 충분히 혼합한 후, 마지막으로 D 용액 1 용량을 첨가하여 조제하였다. 얻어진 액은 차광하고 37 ℃ 로 가온하여 사용하였다.
아래에 A 내지 D 용액의 조제방법을 나타내었다. A 용액 : NaCl 69.2 g, KCl 3.50 g, KH2PO4 1.63 g, MgSO4ㆍ7H2O 2.96 g 에 증류수를 첨가하여 용해시키고 전량을 1000 ㎖ 로 하였다. B 용액 : 글루코스 4.00 g 에 증류수를 첨가하여 용해시키고 전량을 200 ㎖ 로 하였다. C 용액 : NaHCO3 4.20 g 에 증류수를 첨가하여 용해시키고 전량을 200 ㎖ 로 하였다. D 용액 : CaCl2ㆍ2H2O 3.68 g 에 증류수를 첨가하여 용해시키고 전량을 100 ㎖ 로 하였다.
마그누스관 중의 표본에 먼저 장력 트랜스듀서 (등척성 아이소메트릭 트랜스듀서, FD 픽업 TB-611T 형, 닛뽄 광전공업 제조) 를 사용하여 0.4 g 의 부하를 가하여 현수하였다. 30 분 후에 1 회째의 자극으로서 아세틸콜린 (염화 아세틸콜린, SIGMA 제조) 을 최종농도가 10-4 ㏖/ℓ가 되도록 첨가하였다. 반응이 플래토에 도달했을 때, 세정하고 베이스라인으로 돌아오는 것을 확인한 후, 다시 동일한 순서로 자극을 가하였다. 이 순서를 9 회 반복하였다.
각 회의 자극에 의한 표본의 장력을 상기 장력 트랜스듀서, 입력케이스 (JD-112S 형, 닛뽄 광전공업 제조), 변형압력용 앰프 (AP-621G 형, 닛뽄 광전공업 제조) 및 AD 변환보드 (PCI-20428W, INTELLIGENT INSTRUMENTATION 제조) 를 통해 데이터 수집 소프트 (VISUAL DESIGNER ver.2.3, INTELLIGENT INSTRUMENTATION 제조) 에 기록하였다.
그 측정치를 토대로 하여, 1 회째의 수축 자극제에 의한 자극 후의 수축장력에서 베이스라인의 수축장력을 뺀 장력을 100% 로 하여 수축률을 산출하고 그것을 기록하였다.
그 결과를 표 1 ~ 5 및 도 1 에 나타내었다.
또한, 표본이 아세틸콜린에 의한 자극에 반응하는지의 여부를 확인하는 목적에서, 최종농도 10-6 ㏖/ℓ의 아트로핀 전처치를 실시한 표본에 대해서도 그 장력을 측정하였다.
그 결과를 표 6 ~ 8 에 나타낸다.
농도 적출기관 No. / 수축장력 (g) 평균치 ±표준편차 억제율 (%)
1 2
대조군 0.1487 0.1693 0.1590 ±0.0146 -
10-6 ㏖/ℓ 0.0228 0.0262 0.0245 ±0.0024 84.6
농도 적출기관 No. / 수축장력 (g) 평균치 ±표준편차 억제율 (%)
1 2
대조군 0.1829 0.2630 0.2230 ±0.0566 -
10-6 ㏖/ℓ 0.0330 0.0472 0.0401 ±0.0100 82.0
농도 적출기관 No. / 수축장력 (g) 평균치 ±표준편차 억제율 (%)
1 2
대조군 0.0342 0.0937 0.0640 ±0.0421 -
10-6 ㏖/ℓ 0.0102 0.0210 0.0156 ±0.0076 75.6
표 1 ~ 5 및 도 1 이 나타내는 바와 같이, 아세틸콜린에 의한 자극을 반복함으로써 수축률의 감소 즉, 수축장력이 감소된 점에서 모양체근의 피로 상태를 제작할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 표 6 ~ 8 에서, 아세틸콜린은 모양체근에서 수축반응을 야기시켰으나, 아트로핀 전처치에 의해 억제된 점에서 아세틸콜린에 의한 수축반응이 무스카린 수용체를 통한 반응인 것을 확인할 수 있어, 생리적 조건에 매우 가까운 수축자극제인 것을 알 수 있었다.
(예비 시험)
상기 자극을 가한 후, 10 회째의 자극을 가하기 전에 0%, 0.02%, 0.012%, 0.0072%, 0.0043% 및 0.0026% 의 각 농도의 시아노코발라민 함유 Krebs-Henseleit 액으로 마그누스관 중의 액을 치환하고, 표본의 장력을 상기와 동일하게 기록하였다.
이 예비 시험에서 시아노코발라민을 사용한 것은, 시아노코발라민이 이하의 본 시험에서 사용하는 시험 제제의 유효성분이기 때문이었다.
그 결과를 표 1 ~ 5, 도 1 및 도 2 에 나타내었다.
또한, 시아노코발라민 함유 Krebs-Henseleit 액을 아래와 같이 제조하였다. 즉, 상기 A 용액 1 용량, B 용액 1 용량 및 C 용액 1 용량을 혼합하고, 다음으로 증류수 5 용량 및 시아노코발라민 10 배 농축액 1 용량을 첨가하여 충분히 혼합한 후, 마지막으로 D 용액 1 용량을 첨가하여 조제하였다. 조제한 액은 차광하여 37 ℃ 로 가온하여 사용하였다.
표 1 ~ 5, 도 1 및 도 2 가 나타낸 바와 같이, 시아노코발라민 0.0026% 에서는 아무런 영향을 주지 않았으나, 0.0043% 에서 농도 의존적으로 아세틸콜린에 의한 수축반응의 감약을 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한, 표 2 가 나타내는 바와 같이, 0.0043% 이상의 시아노코발라민은 어떠한 농도에서도 베이스라인의 장력에 영향을 주지 않았던 점에서 0.0043% 이상의 시아노코발라민은 그 자체로는 직접적인 작용을 보이지 않아 항피로 효과를 갖는 것을 알 수 있었다. 그리고, 시아노코발라민에 의한 항피로 효과는 0.012% 에서 거의 플래토가 되는 것을 알 수 있었다.
이상에서, 본 시험에 대한 지표 약제인 시아노코발라민의 농도를 0.012% 로 설정하고, 아래의 본 시험에서의 지표로 사용하였다.
(본 시험)
예비 시험과 동일한 시험을, 예비 시험에서의 시아노코발라민 대신에, 시험 제제로서 시아노코발라민 0.02% 점안제인 TP263 (토요파르마 주식회사 제조) 및 표준 제제로서 산코바 점안액 (산텐제약 주식회사 제조) 을 사용하여 실시하였다. 그 결과를 Tukey 다중 비교법으로 평가하였다.
그 결과를 표 9, 도 3 및 도 4 에 나타내었다.
표 9, 도 3 및 도 4 에 의하면, 시험 제제는 모양체근에서의 항피로 효과를 갖는 것을 알 수 있었다. 또한 시험 제제 기제보다도 효과가 크다는 것도 알 수 있었다.
또한, 시험 제제와 표준제제의 비교에서는 모두 모양체근에서의 항피로 효과를 갖고, 그 효과는 동일하다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 모델은 본 명세서의「과제를 해결하기 위한 수단」항에 기재한 바와 같이 안정 피로 개선약의 평가에 이용할 수 있는 모델로서 유용하다. 나아가 본 발명의 모델 제작방법 및 본 발명의 표본을 사용한 약물의 평가방법도 제공한다. 우수한 평가계의 제공은 우수한 약제의 개발에 불가결한 것으로, 우수한 약제의 제공으로 어어지는 중요한 발명이다.
본 발명의 시험관내 모델은 하기와 같은 우수한 특징을 갖는다: ① 시험관내 시험이면서 생리조건 하에 가까운 조건에서 평가할 수 있고, ② 제작 시의 조건을 변화시킴으로써 원하는 피로 상태를 갖는 표본의 재현성이 양호하고, 안정적이며 간편하게 얻을 수 있으며, ③ 피험물질의 작용강도를 정량적으로 파악할 수 있고, ④ 종래의 방법에 비해 실제의 안정 피로에 가까운 모델이다.
종래의 시험관내 모델 (예를 들어, 일본 공개특허 공보 평7-133225 호에 기재된 모델) 은, 모양체근의 일과성 수축에 대해 길항제 작용을 나타내는 약제의 평가 또는 스크리닝을 실시하는 계로는 적당하나, 안정 피로가 일과성의 모양체근의 수축에 기인하는 것이 아니기 때문에, 안정 피로 개선제의 평가계로서 그다지 적당하다고는 할 수 없다. 또한, 모양체근에 수축을 야기시키기 전에 피험약제를 첨가하여 평가하는 계 (예방투여계) 이므로 근수축을 예방하는 약제 (예방약) 의 평가계로는 적당하나, 치료약의 평가계로는 적당하다고 할 수 없다.
이에 대해, 본 발명의 모델은 모양체근에 복수회, 수축이완을 야기시킴으로써 얻은 안정적인 피로 상태에 있는 모양체근을 사용하는 평가계로서, 종래의 모델에 비해 실제의 안정 피로 상태에 보다 가까운 상태의 모양체근을 사용한 모델이다. 또한, 피로 상태 제작 후에 약제를 첨가하는 계 (치료투여계) 이므로 치료약의 평가계로서 적당하다.
또한, 본 발명의 표본을 사용한 평가방법은 하기와 같은 우수한 특징을 함께 갖는다: ① 약물의 효과를 재현성 높게 평가할 수 있고, ② 약물의 효과를 정량적으로 파악할 수 있으며, ③ 표준약과 피험약물의 작용강도를 비교하기 쉽고, ④ 기존 약뿐만 아니라 신규 약물의 스크리닝계로도 유용하다.
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  18. in vitro 에서의 안정피로에 대한 의약 효과의 평가를 위한 실험 모델로서, 상기 안정피로가 평활근 수축-유도 수단의 사용에 의하여 비인간 포유동물 또는 가금으로부터 적출된 모양체근을 반복적으로 수축시키는 것에 의하여 야기됨으로써, 상기 모양체근이 근수축력에 있어서 50 ± 30 % 의 실질적으로 안정적인 근수축력의 안정적인 저하율을 나타낼 때까지, in vitro 에서 이의 반복된 수축이 유도되는 실험 모델.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 모양체근이 근수축력에 있어서 50 ± 20 % 의 저하율을 나타내는 실험 모델.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 모양체근이 근수축력에 있어서 50 ± 10 % 의 저하율을 나타내는 실험 모델.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평활근 수축-유도 수단이, 아세틸콜린, 세로토닌, 히스타민, 무스카린, 니코틴 및 엔도세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학 자극제인 실험 모델.
  22. 안정 피로에 대한 의약 효과의 평가 방법으로서, 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 안정피로에 대한 실험 모델에서 의약과 접촉시키고, 모양체근의 수축비를 측정함으로써, 의약에 의한 안정피로 개선의 효과를 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 의약의 투여 전 및 후에 모양체근의 수축비를 측정하고, 상기 수축비를 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 마그누스(Magnus) 장치의 사용에 의하여 상기 방법을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 마그누스 장치의 사용에 의하여 상기 방법을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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