JP3176377B2 - 骨形態形成タンパク質および繊維芽細胞増殖因子組成物と心臓発生の誘導方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明の分野は非心臓組織において心臓発生（カルジ
オジェネシス）を誘発させることができる治療組成物に
関する。特に本発明の分野はトランスフォーミング増殖
因子−βタンパク質および繊維芽細胞増殖因子タンパク
質を含む試薬に関する。

発明の背景 ドクター ジョン ラウ（Dr.John Lough）の研究室
において、ニワトリ６期胚の心臓形成部（HFR）からの
前外側板内胚葉細胞が外植心臓前方中胚葉で心臓発生を
特異的に誘導することを認めた。サルコメアα−アクチ
ンを発現する律動的な収縮性細胞の多層小胞形成で特徴
づけられるプロセスである（ワイ．スギとジェイ．ラウ
（Sugi,Y.and Lough,J.）、Dev.Dvn.200:155−162,199
4）。ワイ．スギとジェイ．ラウの最近の報告による
と、繊維芽細胞増殖因子（FGF1、２および４）、トラン
スフォーミング増殖因子−β（TGF−β）ファミリー
（アクチビンＡ）を含む内胚葉関連因子は心臓前中胚葉
上でHRF内胚葉の擬態的な心臓遺伝子の効果を示す（ワ
イ．スギとジェイ．ラウ、Dev.Biol.169:567−574,199
5）。現状の技術では、非心臓組織において心臓発生を
誘導可能な組成物はない。

発明の開示 本発明はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク
質および繊維芽細胞増殖因子の精製混合物を含む心臓遺
伝子の（cardiogenic）組成物である。特にトランスフ
ォーミング増殖因子−βタンパク質は骨形態形成タンパ
ク質（BMP）、BMP−２、BMP−３、BMP−４、BMP−５、B
MP−６、BMP−７、BMP−８、BMP−９、BMP−10、BMP−1
1、BMP−12、BMP−13およびBMP−15からなる群からな
る。トランスフォーミング増殖因子−βタンパク質は、
もっとも好ましくは、BMP−２である。

繊維芽細胞増殖因子（FGF）は、好ましくは、FGF1〜1
5からなる群から選ばれる。もっとも好ましいFGFはFGF
−４もしくはFGF−２のいずれかである。

別の実施態様において、本発明は骨形態形成タンパク
質２および繊維芽細胞増殖因子（FGF−２またはFGF−
４）の精製混合物に細胞をさらし、サルコメアα−アク
チンを発現する律動的な収縮性細胞の発生を観察する段
階を含んでなる、非心臓系細胞における心臓発生を誘導
する方法に関する。このさらしを行うのは生体内（in v
ivo）でも試験管内（in vitro）でも良い。

本発明の１実施態様では、タンパク質混合物を外因的
に試験管内で細胞に適用した。別の実施態様では、細胞
を骨形態形成タンパク質および繊維芽細胞増殖因子をエ
ンコードする遺伝構成物で形質転換した。次に、遺伝構
成物に心臓遺伝子のタンパク質を発現させた。

本発明の重要な特徴は心臓細胞が非心臓組織から誘導
されることにある。

本発明のほかの目的、特徴および長所は明細書、図面
および請求の範囲を検討することで明らかになろう。

図面の簡単な説明 図1AおよびＢはBMP−２およびFGF−４で処理した非心
臓前中胚葉細胞で心臓発生が起きることを示す。図1Aは
鳥類６期胚の心臓形成部（前心臓組織）および非心臓前
組織部を示す。図1BはFGF−４、BMP−２、またはFGF−
４とBMP−２の組み合わせ処理に対し、得られた収縮性
外植片率のグラウである。

発明を実施するための最良の形態 本発明は非心臓前組織、好ましくはヒト組織で心臓発
生を誘導するための組成物および方法に関する。ここで
「心臓発生」は非心臓系部分細胞からサルコメアα−ア
クチンを発現する律動的、同調的な収縮性細胞の発生を
言う。細胞は顕微鏡観察によって心臓細胞として確認で
きることが好ましい。以下の例はサルコメアα−アクチ
ンを認識するモノクローナル抗体が、細胞がα−アクチ
ンを発現していることを、確認できることを実証する。

「非心臓前組織」は心臓系でない組織を意味する。た
とえば、次の組織は非心臓前組織で、繊維芽細胞、これ
は結合組織、骨格筋などのようにほかの中胚葉派生体に
なる細胞もある。

１実施態様において、組成物はトランスフォーミング
増殖因子−β（TGF−β）ファミリーの骨形態形成タン
パク質のサブファミリーメンバーおよび繊維芽細胞増殖
因子（FGF）を含む。試薬は、好ましくは、骨形態形成
タンパク質２（BMP−２）およびFGF−４を含む。

組成物はタンパク質の「精製」混合物を含む。ここで
「精製」は、該当タンパク質が天然または組換え細菌源
から精製されたことを言う。たとえば、細胞粗抽出物
は、個別にほとんど100％均質に精製されたタンパク質
の組み合わせとして「精製」されている。

以下の実験項に記述する実験はBMP−２およびFGF−４
の組み合わせが、ただしいずれの因子も単独ではなく、
鳥類胚の非心臓前中胚葉で心臓発生を誘導することを実
証する。このタンパク質分子の組み合わせが、TGF−β
およびFGFファミリーメンバーの別の組み合わせもおそ
らく、ヒト非心臓組織などのほかの非心臓前組織に心臓
発生を誘導するものと予見される。

BMP−２の代表的起源は細菌に発現している骨または
組換えヒトBMP−２である。

BMP−２に加えまたは代わりに、本発明の組成物はタ
ンパク質のTGF−βスーパーファミリーのメンバーであ
る１種以上のほかのタンパク質、特にBMP−２を含む骨
形態形成タンパク質サブファミリーに特徴的な高度に保
存された７−システイン構造を維持するタンパク質を含
み得る。したがって本発明の組成物は治療に有用な薬
剤、たとえば米国特許第5,013,649号、5,116,738号、5,
106号,748、５号,187,076号および5,141,905号に開示さ
れたBMPタンパク質、BMP−３、BMP−４、BMP−５、BMP
−６およびBMP−７、国際特許公開WO91/18098に開示さ
れたBMP−８、国際特許公開WO93/00432に開示されたBMP
−９、国際特許出願WO94/26893に開示されたBMP−10、
国際特許出願WO94/26892に開示されたBMP−11、国際特
許出願WO95/16035に開示されたBMP−12またはBMP−13、
1995年５月18日に提出された同時係属特許出願、出願番
号08/446,924に開示されたBMP−15を含んでも良い。

そのほかに有用な組成物には、ジョーンズら（Jones
et al.）が、Mol.Endocrinol.6:1961−1968（1992）に
記述したVgr−２および国際特許出願WO94/15965、WO94/
15949、WO95/01801、WO95/1802、WO94/21681、WO94/159
66ほかに記述されたものを含む、増殖分化因子GDFsのい
ずれかが含まれる。

本発明のそのほかに有用な組成物は国際特許出願WO94
/01557に開示されたBIPおよびWO93/16099に開示されたM
P52でも良い。

FGF−４の好ましい起源はヒトタンパク質を発現して
いる組換え細菌である。

FGF−４はｋ−FGFとして公知でありまた米国特許第5,
430,019号に記述されているが、これに加えまたは代わ
りに、本発明の組成物はタンパク質のFGFファミリーの
メンバーである１種以上のほかのタンパク質、たとえば
塩基性FGF（FGF−２）、酸性FGF（FGF−１）および米国
特許番号5,430,019に記述されているほかのFGFを含み得
る。上記のすべての出願、特許および文献に開示された
事項は引用としてここに取り込まれる。繊維芽細胞増殖
因子は、好ましくはFGF1〜15からなる群から選択する。
もっとも好ましいFGFはFGF−２もしくはFGF−４であ
る。

本発明の組成物は、TGF−βタンパク質およびFGFタン
パク質に加え、表皮増殖因子（EGF）、トランスフォー
ミング増殖因子（TGF−αおよびTGF−β）、アクチビン
類、インヒビン類およびインスリン様増殖因子（IGF）
のような増殖因子を含むほかの治療に有効な薬剤を含み
得る。

ある組成物が本発明に適格であるかを決定する場合
は、以下に記述する鳥類の非心臓前中胚葉を評価する方
法で、試験組成物を評価できるはずである。本発明に適
格な組成物は鳥類の試験非心臓前中胚葉に、以下に実証
する少なくとも50％程度の心臓発生を誘導する。

本発明の組成物はまた適切なマトリックスを含み得
る。たとえば、組成物を支持し、心筋細胞の増殖および
／またはほかの組織の増殖のために表面を提供するマト
リックスを求めても良い。マトリックスはタンパク質の
緩徐な放出および／またはその状態に適切な環境、細胞
浸潤に適切な環境を提供する。かかるマトリックスは、
医療用に移植して使用されるほかの材料で形成され得
る。

マトリックス材の選択は生体適合性、生分解性、機械
的性質、整形上の外見および界面の性状による。組成物
の特定の用途によって適切な配合が定まる。組成物に対
し可能なマトリックスは生物分解性で、かつポリ乳酸、
ポリグリコールポリオルトエステル類およびポリ無水物
などの化学的重合物である。ほかに可能な材料は生分解
性で、かつコラーゲンなどのように生物的によく明らか
にされたものがある。マトリックスは、さらに純粋なタ
ンパク質または細胞外マトリックス要素を含み得る。そ
のほかに可能なマトリックスは生分解性でない、かつ化
学的に明らかにされた焼成ヒドロキシアパタイト、バイ
オガラス、アルミン酸塩またはほかのセラミックスであ
る。マトリックスは上記物質およびそのほかの適切な種
類の材料とのいかなる組み合わせを含んでも良く、細孔
径、粒径、粒子形状および生分解性を変えるために組成
および処理を変更し得る。

骨形態形成タンパク質および繊維芽細胞増殖因子タン
パク質は、好ましくはモル比で1:1に混合する。ここ
で、「1:1」は少なくとも20％のばらつきを許容する。
しかし、ほかの比率でも心臓発生がみられ、適切な比率
であると思われる。

用量処方計画は医師の立ち会いのもとに、タンパク質
組成物の作用を修飾する種々な因子、たとえば形成させ
る組織量、組織の損傷部位、損傷組織の状態、傷の大き
さ、損傷組織の種類、患者の年齢、性別および食餌、感
染の程度、投与時期おびそのほかの臨床的要因を考慮し
て決定する。投与量は再構成に使用されるマトリックス
の種類および組成物中のタンパク質の種類によって変え
ても良い。他の既知な増殖因子、IGF Ｉ（インスリン
様成長因子Ｉ）などを最終組成物に追加すると、用量に
影響することもある。

本発明の組成物の潜在的な利用には、心臓組織損傷患
者またはストレス患者の処置が含まれる。組成物は損傷
またはストレスを受けた組織に直接適用する外科的処置
の付加物として使用しても良い。本実施態様において
は、組成物はそれ自体でまたは心臓系細胞または心筋細
胞系に分化可能な培養細胞とともに使用される。かかる
実施態様に有用な細胞には、培養心細胞または培養心筋
細胞、心細胞または心筋細胞の前駆体、繊維芽細胞、胎
児性中胚葉細胞または中胚葉に分化可能な早期胚幹細胞
がある。

また、組成物は、オートロガスまたは異種（ヘテロロ
ガス）であろうと、心臓系細胞または心筋細胞系細胞の
処置、成長促進、増殖、分化および／または維持のいず
れかに使用できる。このように処理された細胞は次に、
単独または本発明のタンパク質組成物と一緒に、損傷ま
たはストレスを受けた組織に適用される。

ほかの実施態様においては、本組成物のタンパク質を
エンコードするDNA配列が細胞内に移入し、細胞にBMPお
よびFGFタンパク質を産生させる。移入細胞はBMPおよび
FGFタンパク質を産生することができ、次に損傷または
ストレスを受けた組織部位に移植される。

適切なマトリックスは上記実施態様のいずれとも、組
成物および／または細胞を、損傷またはストレスを受け
た組織部位に維持するために使用できる。または、組成
物を注入可能にした処方は、タンパク質および／または
細胞組成物のいずれかの投与に使用できる。前記処方は
組織の損傷またはストレスを防止または縮小するための
予防処置に使用できる。

例 1.全般的 HFR中胚葉に付加したTGF−βファミリー増殖因子を検
出するための染色で、ショウジョウバエ、デカペンタプ
レジック（decapentaplegic（dpp））様タンパク質の刺
激的な発現パターンが現れたので、これらの細胞によっ
て発現される脊椎動物のdpp様因子を同定するために、
縮重逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（RT/PCR）スクリー
ンを実施した。これまでの50を超えるPCR配列産生物う
ち、半数以上が骨形態形成因子２（BMP−２）と確認さ
れた。

次に、BMP−２が心臓前中胚葉上でHFR内胚様の心臓遺
伝子の効果を擬態するかを、非心臓前中胚葉を心臓系に
再特異化する能力とともに調査した。規定媒体中に単に
補助体として存在する場合には、BMP−２は心臓前また
は非心臓前中胚葉の生存率のいずれも支持できないこと
を報告する。FGF−４は心臓前中胚葉で心臓発生を支持
するが、この因子は外植片の増殖を維持したけれども、
非心臓前中胚葉での心臓発生を誘導しなかった。しか
し、FGF−４およびBMP−２の組み合わせで非心臓前中胚
葉を処理すると、外植片の高い発生率において、心臓発
生を著しく誘導した。このことは、この増殖因子の組み
合せが胎児性細胞を心臓系に再特異化できることを示し
ている。

2.材料および方法 胎児性中胚葉の外植と培養： ニワトリの胚をハンブルガーとハミルトン（Hamburge
r and Hamilton）の基準（ブイ．ハンブルガーとエッ
チ．エル．ハミルトン（Hamburger,V.and H.L.Hamilto
n）、J.Morphol.38:49−92,1951）にしたがって段階付
けした。前方外側板心臓前中胚葉および６期胚の後半部
からの非心臓前中胚葉を顕微解剖し、ラブ−テク（Lab
−Tek）チャンバースライドに外植し、前記のようにM19
9中で培養した（ワイ．スギとジェイ．ラウ、前掲、199
4;ワイ．スギとジェイ．ラウ、前掲、1995）。移植片が
フィブロネクチン基質に付着した後、成長因子の指示最
終濃度を加えた。ヒト組換えFGF−４はアールアンドデ
ィーシステム社（Ｒ＆D System）から購入した。ヒト組
換えBMP−２はジェネティックインスティチュート社
（（Genetic Institute）ケンブリッジ、マサチューセ
ット州）によって提供された。増殖因子を含む媒体は毎
日取り替えた。

免疫組織化学： 生化学的分化を免疫組織化学的に、サルコメアα−ア
クチンを認識するモノクローナル抗体（シグマ（Sigm
a）、Cat.No.A−2172）を使用して観察（モニター）し
た。２次抗体は蛍光イソチオシアネート（FITC）で標識
した山羊抗マウスIgM（Cappel）を使用した。ドクター
エフ．ミカエルホフマン（Dr.F.Michael Hoffman）に
よって提供されたショウジョウバエデカペンタプレジッ
クを認識するポリクローナル抗体（1:1,000）（ウィス
コンシン大学、ジー．イー．エフ．パンガニバンら（Pa
nganiban,G.E.F.,et al.）、Mol.Cell.Biol.10:2669−2
677,1990）を使用してデカペンタプレジック様タンパク
質を局所化した。１次抗体として使用した正常ウサギの
血清を同濃度に希釈したものおよび１次抗体を省いたも
のを対照群とした。FITC複合ヤギ抗ウサギIgG（1:500）
を２次抗体とした。免疫組織化学手順のすべては、５′
−ブロモデオキシウリジン取り込みの決定を含め、既に
記述した（ワイ．スギとジェイ．ラウ、前掲、1995）。

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT/PCR）： 顕微解剖したHFR6期中胚葉のRNAを５μｇの鎖状ポリ
アクリルアミドをキャリアとし、RNAスタット（stat）
（テル−テスト社（Tel−Test））を使用して精製し
た。相補的DNAをオリゴ−dT−プライムRNAのＭ−MLV逆
転写酵素仲介エクステンションによって合成した。ゲノ
ムDNAの混入をなくするために、比逆転写RNAを同時に処
理した。縮重したプライマーはTGF−βdppサブファミリ
ーの保存ドメインを認識するために設計した。上流プラ
イマーは （SEQ ID NO:1）、下流側標的の逆相補配列は （SEQ ID NO:2）であった。

相補的DNAをサーマス アクアチクス（Thermus aquat
icus（Tag））DNAポリメラーゼ（プロメガ（Promeg
a））を使用し、40サイクル変成（94℃、１分）、プラ
イマー・アニーリング（45℃、1.5分）およびエクステ
ンション（72℃、２分）で増殖した。予想200塩基対産
生物中の相補的DNAをピーシーアールエスクリプト（pCR
Script（Stratagene））中にクローン化した。クローン
化した挿入断片の同定はジーンバンク／イーエムビーオ
ー（GeneBank/EMBO）データベースとのシーケンシング
および比較によって決定した。

3.結果 HFR内胚様におけるDPP様タンパク質の免疫組織化学的局
所化： ショウジョウバエデカペンタプレジック（dpp）様タ
ンパク質がHFR内胚様と関連があるか確認するために、
培養HFR内胚葉の抗dpp染色パターンを外植心臓前中胚葉
と比較して決定した。HRF内胚葉細胞の末梢は強い染色
を示し、心臓前中胚葉または正常なウサギ血清で染色し
た対照外植片では観察されなかった。

HFR内胚葉におけるBMP−２のRT/PCR実証： dppはBMP−２および４と75％が相同であるので、上述
した抗原はこれらの因子またはTGF−βdppサブグループ
のほかのメンバーを代表すると考えられた。HRF内胚葉
が発現するdppmRNAを同定するために、このサブグルー
プの保存ドメインを標的にした縮重プライマーを用い
て、RT/PCRスクリーンを実施した。dppcDNAの予想サイ
ズである単一200塩基対PCR産生物をクローン化し、HFR
内胚葉が発現したdpp様因子を個別に同定するために配
列決定した。現在まで配列したcDNA約50のうち、半数以
上が162塩基伸長にわたってBMP−２と同一であった。こ
の162塩基伸長はニワトリ相同体のヌクレオチド800−96
2、プライマー特異化ドメインに対応するピー．エッ
チ．フランシスら（Francis,P.H.et al.）、Developmen
t 120:209−218,1994）。そのほかの既知なまたは新規
なdppサブグループのメンバーは確認されなかった。残
存のクローンcDNAには相互に類似な配列がみられたが、
データベースエントリーのいずれとも相同ではない。こ
の事実は、BMP−２がHFR内胚葉が発現するdppグループ
の主要なメンバーであることを示唆している。非心臓前
組中胚葉におけるBMP−２およびFGF−４の心臓発生誘
導： 上記の結果に基づき、BMP−２が、特定媒体中に単独
で存在するとき、心臓前中胚葉上でHFR内胚葉の心臓遺
伝子の効果を擬態するかどうかを決定することが関心事
であった。FGFと異なり（ワイ．スギとジェイ．ラウ、
前掲、1995;エックス．ツーら（Zhu,X.,et al.）「胎児
の心臓発育を制御する自己分泌およびパラ分泌機構に、
繊維芽細胞増殖因子１および４が参画する根拠」、提出
文献）、BMP−２は心臓前中胚葉の生存も分化も支持し
なかった。しかし、予想されるようにFGF−４をBMP−２
に含ませると心臓前中胚葉に末期心臓発生を誘導した。

図1AおよびＢはBMP−２およびFGF−４で処理した非心
臓前胚葉での心臓発生の発生率を示す。非心臓前中胚葉
は６期杯の後半部位から外植しFGF−４および／またはB
MP−２の存在のもとに指定濃度で培養した。FGF−４もB
MP−２のいずれも単独では外植片に心臓の分化を誘導し
なかったが、両増殖因子で処理した外植片の大部分が１
日又は２日以内に細胞多層化および律動的な収縮性を示
した。図1Bを参照して説明すると、括弧内の数字は５つ
の実験集合で行った実験の反復数を示し、実験集合のそ
れぞれは約５複製外植片を含む。分化の発生率（40〜60
％）は各反復実験において同様であった。

図1A薄ブロック図が示すように、これらの判定は６期
杯の後半部位から外植した非心臓前中胚葉で行った。こ
の部位の細胞は、非心臓胚外中胚葉および外側板中胚葉
になるように運命づけられている（調査文献：ジー．ニ
コレット（Nicolet,G.）、Adv.Morphogenesis 9:231−2
62,1971）。図1Bが示すように、FGF−４もBMP−２も単
独では非心臓前中胚葉において収縮性外植片の形成を誘
導できなかった。BMP−２単独で培養した細胞は培養皿
から剥離し生存できなかった。FGF−４の単独処理で
は、５′−ブロモデオキシウリジン取り込みで示される
ように、細胞増殖を支持したが、分化は観察できなかっ
た。しかし、FGF−４およびBMP−２の組み合わせでは、
非心臓前中胚葉外植片の半数以上で、明らかに、律動的
な収縮性およびサルコメアα−アクチン分化を示す多細
胞性小胞形成によって示される心臓遺伝子の分化を誘導
した（図1B）。非心臓前中胚葉の分化は通常試験管内で
は２日まで観察されないので（図1B）、分化が１日で観
察される心臓前中胚葉と異なり、非心臓前中胚葉外植片
における再特異化段階の存在が示唆される。これらの結
果は増殖因子が相乗的に機能して、心臓系に定められて
いない細胞で心臓発生を誘導することを示す。

4.考察 HFR内胚葉が末期的分化を誘導する能力において特異
的である（ワイ．スギとジェイ．ラウ、前掲、1994）と
いう前記結果を、さらに確認するのが、ティー．エム．
シュルティスら（Schultheiss,T.M.,et al.,Developmen
t 121:4203−4214,1995）の報告で、HFR内胚葉は胎児の
細胞を心臓系に再特異化できると報じている。後者に関
し本例の観察では、HFR内胚葉は後部非心臓前中胚葉を
再特異化しなかったが（ワイ．スギとジェイ．ラウ、前
掲、1994）、これは明らかに内胚葉因子の局所濃度が不
適正なことを反映していて、外植片を隣接というより培
養皿の反対側に置いたことが原因である。ここに報告し
た、BMP−２およびFGF−４の複合活性が、両者ともにHF
R内胚葉に発現し、非心臓前中胚葉で心臓発生を誘導し
た事実は、細胞を心臓遺伝子系に再特異化するHFR内胚
葉の能力と一致する。

我々は、HFR内胚葉がFGFファミリーの３メンバー（FG
F−１、２および４）を発現し、それぞれが心臓前中胚
葉の分化を支持することを既に確めた（ワイ．スギとジ
ェイ．ラウ、前掲、1995;エックス．ツーら、前掲、Dev
elopmental Dynamics、印刷中）。さらに、FGFの同族体
レセプタへの結合を特異的に阻害する塩素酸ナトリウム
を用いる実験で、FGFシグナルが内胚葉仲介心臓発生に
必須であることを示した（未公表観察）。しかし、FGF
の主な役割は、明らかに、心臓前中胚葉の増殖を制御す
ることであり、BMP−２などの「分化」因子との協力関
係が心筋細胞の分化誘導に必要と思われる。この解釈に
おいて、分離心臓前中胚葉がFGF単独で培養中に分化で
きるというこの観察は、これら細胞が胚から体外培養さ
れる以前にBP−２によってシグナルを受けていたことを
示唆する。アクチビンとFGFとの間の協力関係がアフリ
カツメガエルで中胚葉の誘導を制御することを示された
（アール．コルネルとキメルマン ディー．（Cornell,
R.and D.Kimelman）、Development 120:453−462,1994;
シー．ラボネとホワイトマン エム．（LaBonne C.and
M.Whitman）、Development 120:463−472,1994）、従来
の結果が示すところによると、アクチビンは非心臓前中
胚葉の分化を支持するBMP−２を代替できない。またFGF
−４およびBMP−２はマウス肢芽の外胚葉頂堤に発現し
肢成長を、それぞれ促進および阻害するが（エル．ニス
ワンダーとマーチン ジー．アール．（Niswander L.an
d G.R.Martin）、Nature 361:68−71,1993）、BMP−２
の成長阻害効果はその分化機能の結果として考えること
ができる。最後に、BMPが分化潜在能を有する可能性は
最近、BMP−４が筋節を骨格ミオサイト系に特異化した
ことを実証したオー．ポールクイエらによって報告され
た（Pourguie.O.,et al.Cell 84:461−472,1995）。

5.動物実験による予測結果 ウサギモデルを用いる継続中の実験で、骨形態形成タ
ンパク質（BMP）および繊維芽細胞増殖因子（FGF）の組
み合わせが、それぞれの因子単独ではいずれも逆である
が、実験的に誘導した一過性虚血の出現および再灌流か
らの心臓防御を有意に増強させることが予想される。

理論的根拠：この実験の理論的根拠は以下の通りであ
る。塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF;FGF−２）は単独
で、虚血および再灌流前に直ちに投与された場合にラッ
ト分離心臓において機能回復を増進することが示された
（アール．アール．パドゥアら（Padua.R.R.et al.）、
Nol.Cell Biochem.143:129−135,1995）。この心臓防御
効果は冠血管系に直接投与し、ラット心臓あたり10μｇ
のFGF−２投与で達成された。さらにイヌでは、FGF−２
処置は血行力学の効果または新生血管を形成することな
く再灌流後７日で、心筋梗塞の程度を軽減することが最
近示された。この心臓防御効果は再灌流前にFGF−２を
イヌ心臓あたり10μｇ、歯冠内投与で達成された（エ
ム．シー．ジー．ホリガンら（Horrigan,M.C.G.,et a
l.）、Circulation 94:1927−1933,1996）。

骨形成タンパク質１（hOP−１）はBMPに密接に関連す
るTGF−βスーパーファミリーのメンバーである。hOP−
１を再灌流前に動物あたり用量20μｇを静脈内投与する
と、冠状動脈虚血および再灌流生体内ラットモデルにお
いて、24時間後に再灌流障害が軽減した（エー．エム．
レファーら（Lefer,A.M.et al.）、J.Mol.Cell Cardio
l.24:585−493,1992）。

FGF−４＋BMP−2:FGF−４またはFGF−２とBMP−２と
の組み合わせが心臓系に運命づけられていない胎児性中
胚葉細胞を、生体内で微視的な心臓に類似な同調的に収
縮する中空小胞に誘導することが最近発見された。FGF
−４（またはFGF−２）単独、またはBMP−２単独では効
果はなかった（ジェイ．ラウら、Developmental Biolog
y 178:198−202,1996）。この結果から、BMPは胚におい
て細胞を心臓遺伝子系に補充するために機能し、FGFが
これら細胞を心臓分化の経路に沿って支持することが予
想される。胚における状況と異なり、成人心細胞は増殖
も発育もしない。その結果、心筋梗塞などの発作中に被
った損傷は往々にして破局的な結果を招く。成人心筋細
胞が成長できず、再生できない理由は未知である。機能
的に有用な情況において、FGFおよびBMPなどの増殖因子
が利用できないことが、成人心臓において細胞が再生で
きない主要な原因と予想される。

実験計画：一般的 心臓防御に関し、心臓バイパス手術、血管形成術など
の随意的虚血および心臓発作を患う患者にみられる状況
である虚血または再灌流の作用に対して心機能を維持す
る、または心筋を防御する際の、BMP自体の役割を考察
する研究は、単独またはほかの増殖因子との関連のいず
れにおいても、なされていない。BMP−２およびFGF−２
を組み合わせることによって、上記FGF−２単独の心臓
防御効果が増大すると期待している。したがって、発明
者の１人であるドクター ジョンベーカー研究室で定期
的に用いられたプロトコルを使用して、虚血前好気性心
機能および虚血症に続く虚血後快復に冠し、組み合わせ
増殖因子での処置の生理学的利点を確定することにす
る。実験モデルには、１サイクルの虚血および再灌流下
においた分離ウサギ心臓を用いた。虚血／再灌流発作か
らの心機能の快復は組み合わせた増殖因子処置が有効で
あることを決定するための終点（エンドポイント）とし
て用いられよう。この心臓防御効果の論拠は再生した心
筋増殖および分化が起きるかどうかの面から、ドクター
ラウの研究室でルーチンである技術を用い、細胞およ
び分子的レベルで決定されよう。

実験計画：特定的 実験は４グループを使用し無作為に実施して、BMP−
２がFGF−２の心臓防御効果を相乗作用的に改善するか
どうかを測定する。実験の４グループを以下に示す。

第１グループ：食塩賦形剤対照（増殖因子なし）−投与
経路は静脈 第２グループ:BMP−２のみ（80μg/kg、静脈） 第３グループ:FGF−２のみ（40μg/kg、静脈） 第４グループ:BMP−２（80μg/kg、静脈）とFGF−２（4
0μg/kg、静脈）の組み合わせ。

用量および意図した投与経路はFGFおよびBMP関連増殖
因子（１〜３）の心臓防御効果を実証した公表された報
告書によった。各グループは７〜10日齢の未成熟ウサギ
８匹よりなる。この新生児発育期まで、心臓は完全に機
能的であり、最近に正常な増殖を終えた心筋細胞からな
る。すべてのグループにつき、心臓の切除および調査の
24時間前に処置を開始し、薬剤が心臓に（仮定上の）予
防効果を及ぼす時間を検討した。処置の24時間後に大動
脈にカニューレを挿入し、分離心臓の灌流を一定圧ラン
ゲンドルフ法による、39℃の重炭酸塩バッファーで直ち
に開始する。食塩充満ラテックスバルーンを発生圧測定
のために左右心室に設置する。心臓を平衡化期間の30分
間灌流し、その間二心室機能および冠流速を定常状態下
で記録する。心臓を30分間39℃で完全なノーフロー虚血
下におく。虚血期間の後、心機能を再度定常状態下で測
定する。こうして、それぞれの心臓は自己制御して働
く。心機能の快復は虚血前値のパーセントで表す。結果
は増殖因子処理グループ（第２〜４グループ）内の虚血
前および虚血後の機能を、対照グループ（第１グルー
プ）における快復と比較して評価する。

産業上の利用可能性 本発明は非心臓組織に心臓発生を誘導できる治療組成
物である。組成物はトランスフォーミング増殖因子−β
タンパク質と繊維芽細胞増殖因子の精製混合物である。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）氏名：エムシーダブリユー リサーチ フオ
ンデーシヨン インコーポレーテツド （Ｂ）通り：ウオータータウン プランク ロード
8701 （Ｃ）市：ミルウオーキー （Ｄ）州：ウイスコンシン （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:53226 （Ｇ）電話：（414）456−4402 （Ｈ）FAX:（414）266−8522 （ii）発明の名称：心臓発生組成物 （iii） 配列の数:2 （iv）通信住所： （Ａ）受信人：クオーレス アンド ブラデイ （Ｂ）通り：イースト ウイスコンシン アベニユ
ー 411 （Ｃ）市：ミルウオーキー （Ｄ）州：ウイスコンシン （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:53202−4497 （ｖ）コンピューター判読形態： （Ａ）ミディウムタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパーチブル （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース ＃
1.0, バージョン ＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：ベーカー，ジーン シー． （Ｂ）登録番号:35,433 （Ｃ）参照／名簿番号:650053.91134 （ix）電気通信情報： （Ａ）電話：（414）277−5709 （Ｂ）FAX:（414）271−3552 （２）配列番号（SEQ ID NO）:1: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:25 塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド （ix）特徴： （Ａ）名称／記号：種々の相違（misc_differenc
e） （Ｂ）存在位置：置換（replace）（11..12,
“ ”） （Ｃ）他の情報:/注＝“11位はＮと記録されるがイ
ノシンであった。” （ix）特徴： （Ａ）名称／記号：種々の相違 （Ｂ）存在位置：置換（17..18,“ ”） （Ｃ）他の情報:/注＝“17位はＮと記録されるがイ
ノシンであった。” （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号（SEQ ID NO）:2: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:25 塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド （ix）特徴： （Ａ）名称／記号：種々の相違 （Ｂ）存在位置：置換（11..12,“ ”） （Ｃ）他の情報:/注＝“11位はＮと記録されるがイ
ノシンであった。” （ix）特徴： （Ａ）名称／記号：種々の相違 （Ｂ）存在位置：置換（20..21,“ ”） （Ｃ）他の情報:/注＝“20位はＮと記録されるがイ
ノシンであった。” （xi）配列：配列番号:2:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バロン，マシユー アール. アメリカ合衆国 53226 ウイスコンシ ン ウオーワトーサ ウエスト ヴリー ト ストリート 12106 (72)発明者 ブログリー，マイケル エー. アメリカ合衆国 53219 ウイスコンシ ン ミルウオーキー ＃14 ウエスト アーサー コート 4416 (72)発明者 ツー，キシアオレイ アメリカ合衆国 53213 ウイスコンシ ン ミルウオーキー ノース 76ス ス トリート ＃１ 170 (72)発明者 ベーカー，ジヨン イー. アメリカ合衆国 53213 ウイスコンシ ン ウオーワトーサ ウエスト ガーフ イールド アベニユー 7126 (56)参考文献 ＳＵＧＩ Ｙ．他「Ｉｎｈｉｂｉｔｉ ｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｃａｒｄｉａｃ Ｍ ｅｓｏｄｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉ ｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｓｅ ｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌ ｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ ｒｙ ｔｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇ ｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−２（ＦＧＦ −２）」ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．157（1993年) Ｐ．28−37 ＰＯＴＴＳ Ｊ．他「Ｅｐｉｔｈｅｌ ｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒ ａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍ ｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｄｉａｃ ｅｎ ｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ａ ｍｏ ｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏ ｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β３」Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ. ＵＳＡ，Ｖｏｌ．88，Ｎｏ．４（1991 年）Ｐ．1516−1520 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/58 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】トランスフォーミング増殖因子−βタンパ
   ク質および繊維芽細胞増殖因子の精製混合物を含むこと
   を特徴とする非心臓前組織から心臓組織を誘導する組成
   物。
2. 【請求項２】前記トランスフォーミング増殖因子−βタ
   ンパク質がBMP−２、BMP−３、BMP−４、BMP−５、BMP
   −６、BMP−７、BMP−８、BMP−９、BMP−10、BMP−1
   1、BMP−12、BMP−13およびBMP−15からなる群から選択
   された請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】前記トランスフォーミング増殖因子−βが
   ７−システイン構造ファミリーのメンバーからなる群か
   ら選択された請求項２記載の組成物。
4. 【請求項４】前記トランスフォーミング増殖因子−βタ
   ンパク質がBMP−２である請求項３記載の組成物。
5. 【請求項５】前記繊維芽細胞増殖因子がFGF1〜15からな
   る群から選択された請求項１記載の組成物。
6. 【請求項６】前記繊維芽細胞増殖因子がFGF−４である
   請求項１記載の組成物。
7. 【請求項７】前記トランスフォーミング増殖因子−βタ
   ンパク質と繊維芽細胞増殖因子の比率が1:1のモル比で
   ある請求項１記載の組成物。
8. 【請求項８】前記組成物がマトリックス材を付加的に含
   む請求項１記載の組成物。
9. 【請求項９】マトリックス材がコラーゲンである請求項
   １記載の組成物。