JP2004521128A - Ｂｍｐによるヒト骨髄由来ｃｄ１０５＋細胞の軟骨形成能 - Google Patents
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Abstract
軟骨修復に有用なＢＭＰの組成物ならびにこれらの組成物を利用する方法が、開示される。骨髄から単離され、かつ軟骨修復に有用なＢＭＰを用いて処理された、組織培養で拡張されていない細胞を含む組成物、ならびにこれらの組成物を利用する方法がまた、開示される。この組成物は、変形性関節症の処置、軟骨欠損の処置および関連する組織修復において、有用である。本発明において、ＢＭＰを含む組成物は、軟骨修復を必要としている患者、または軟骨組織を含む疾患または欠損（例えば、変形性関節症）を有する患者に投与される。好ましい実施形態において、本発明は、有効量のＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物を含む。
Description
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、結合組織および軟骨修復を含む組織修復の分野に関する。より詳細には、本発明は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）および軟骨形成において重要な役割を果たす組成物に関する。特に、本発明はまた、軟骨組織（例えば、関節軟骨）の誘導のためのＢＭＰの使用、およびＩＬ−１の阻害効果を部分的にブロックするための治療剤としてのＢＭＰの使用に関する。
【０００２】
本発明はさらに、組織修復において使用するための、骨髄から単離された非組織培養拡張細胞の使用に関する。本発明はさらに、骨髄から単離された非組織培養拡張細胞および軟骨組織（例えば、関節軟骨）の誘導のための骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む組成物に関する。
【０００３】
関節軟骨は、無血管性かつ無神経性であり、そして濃い細胞外マトリックス成分からなる特殊化した微小環境中に空間的に包埋された軟骨細胞からなる。軟骨細胞は、バランスのとれた同化機能および異化機能によって、軟骨の構造を維持する［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １（５）、９８９−９４（１９８９）］。軟骨傷害は、これらの機能のバランスを乱し、そして炎症性サイトカイン（インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む）の存在と関連する［Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｉｎｔ２（２）、４９−５３（１９８２）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２９（４）、４６１−７０（１９８６）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２９（２）、２６２−７３（１９８６）］。軟骨が外傷または疾患プロセスによって損傷される場合、関節軟骨はまた、限定された自発的修復応答を有する。
【０００４】
骨髄由来細胞成分は、前駆細胞の供給源であり、そしてその分化に必要な関連増殖因子であることによって、損傷した関節軟骨の修復において、重要な役割を果たす。外科的手順は、周りの環境がこれらの細胞の分化について適切な刺激を提供することを望んで、基礎をなす肋軟骨下の骨を貫通することによって、創傷した部位へ骨髄由来の間充織前駆細胞を補充することを目的とする。これらの手順は、通常、関節軟骨ではなく線維軟骨を生じる［Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４２、１３３１−１３４２（１９９８）；Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｄ Ｋｎｅｅ Ｊｏｉｎｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ（Ｅｗｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．編）、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）］。損傷した関節軟骨の修復には、損傷部位において、サイトカインおよび因子によるこれらの前駆細胞の動員および分化が必要である。複雑なインビボ環境が、軟骨への前駆細胞の形質転換において重要な分化因子の同定を困難にしている［Ｓｕｈら、Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ．７：２７０−２７８（１９９７）Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ．８０：１７９５−１８１２（１９９８）］。骨髄は、２つの細胞性成分からなる：非造血細胞とその直ぐ近位に存在する造血細胞。非造血区画内に、多能間充織特性を示す細胞集団が存在し、多能性間充織細胞（ＭＭＣ）［Ｍａｊｕｍｄａｒら、Ｊｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１８５：９８−１０６（２０００）；Ｍａｊｕｍｄａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２００１）１８９：２７５−２８４］、間充織幹細胞（ＭＳＣ）［Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８４：１４３−１４７（１９９９）］または間充織前駆細胞（ＭＰＣ）［Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２３８：２６５−２７２（１９９８）］。骨髄中に存在する間充織前駆細胞は、インビボおよびまたはインビトロの環境に適切に配置される場合に、複数の結合組織系統（骨芽細胞、軟骨細胞、タン細胞、脂肪細胞および筋細胞を含む）に分化する能力を有する［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９、１５２８−１５３０（１９９８）；Ｂｏｎｅ １９、４２１−４２８（１９９６）；Ｂｏｎｅ １３、８１−９５（１９９２）；Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４、４１５−４２８（１９９８）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｔｈｐｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６、４０６−４１３（１９９８）］。これらの骨髄由来の間充織細胞は、組織培養拡張後にのみ、多能間充織特徴を獲得する。ＭＭＣは、細胞表面マーカー（これらの細胞によって発現されるエンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）（ＣＤ１０５））を認識する免疫選択手順を使用して、ヒト骨髄から単離されている［Ｍａｊｕｍｄａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１８５：９８−１０６（２０００）］。
【０００５】
骨、軟骨、腱および骨中に存在する他の組織の形成を担う分子ならびに他の組織抽出物についての研究は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）と称される新規セットの分子の発見を導いた。とりわけ、いくつかのタンパク質（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１６と称される）の構造が、以前に解明されている。骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＧＦ−βおよびインスリン様増殖因子は、インビボおよびインビトロの両方において、軟骨形成を促進するか、または軟骨形成効果を示すことが示されている［Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８５（１）、９８−１０６（２０００）；Ｂｏｎｅ １９（補遺１）、１Ｓ−１２Ｓ（１９９６）；Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ（補遺３６７）、Ｓ１８６−２０３（１９９９）］。ＢＭＰは、元々鉱物質除去された骨において検出され、この鉱物質除去された骨から精製された、増殖および分化因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーの分泌分子である［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８５（２４）、９４８４−８（１９９８）］。２０種の哺乳動物ＢＭＰが同定され、そして３つのＩＩ型レセプターがＢＭＰに結合することが示されている［Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １０（１）、１６−２１（１９９４）］。ＢＭＰ結合は、リン酸化およびＳｍａｄ経路を介したシグナル伝達の前に、Ｉ型およびＩＩ型レセプターの二量体化を生じる［Ｂｏｎｅ １９（６）、５６９−７４（１９９６）］。ＢＭＰは、軟骨および骨の形成において重要な調節因子として機能することが示されており［Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７、７５３−９１（１９９８）］、そしてまた成体骨格系の修復および再構築においても機能することが示されている［Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３（１１）、１６５７−６８（１９８９）；Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １４（１０）、１７３４−４１（１９９９）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）］。
【０００６】
転写因子Ｓｏｘ−９は、ＢＭＰ−２シグナル伝達経路の下流の重要な媒介因子であることが示されている［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）］。Ｓｏｘ−９は、性決定領域Ｙ（Ｓｒｙ）のアミノ酸に高い相同性を有する、７９アミノ酸の高移動群型のＤＮＡ結合ドメインの存在によって特徴付けられる［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ７（３）、３３８−４４（１９９７）］。Ｓｏｘ−９は、胚発生の間にＣｏｌ２Ａ１の遺伝子のパターンと密接に対応するパターンで発現され［Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２０９（４）、３７７−８６（１９９７）；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １８３（１）、１０８−２１（１９９７）］そして軟骨マトリックス合成の間に発現され［Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３（１１）、１６５７−６８（１９８９）；Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １４（１０）、１７３４−４１（１９９９）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９（５４７７）、３１３−６（２０００）；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（２４）、１７９３７−４５（２０００）；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ７（３）、３３８−４４（１９９７）；Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２０９（４）、３７７−８６（１９９７）；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １８３（１）、１０８−２１（１９９７）；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １６（２）、１７４−８（１９９７）］、このことは、軟骨形成および骨格形成におけるＳｏｘ−９の役割を示唆する。Ｓｏｘ−９のアップレギュレーションが、不死化細胞株においてＣｏｌ２Ａ１およびアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）の両方の発現を増強することが示されている［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）］。ＩＬ−１およびＴＮＦを含む炎症促進性分子は、Ｃｏｌ２Ａ１およびアグレカンの発現を阻害する［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８２（６）、２０２６−３７（１９９８）；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０５２（３）、３６６−７８（１９９０）；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６６（２）、３５１−９（１９９６）］。これらの炎症性サイトカインの阻害効果は、Ｓｏｘ−９のダウンレギュレーションによって媒介されることが報告されている［Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（５）、３６８７−９２（２０００）］。変形性関節症および慢性関節リウマチにおいて上昇したレベルで存在するＩＬ−１およびＴＮＦの阻害効果は、これらの疾患状態における軟骨の破壊に関与していた［Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｉｎｔ ２（２）、４９−５３（２０００）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２９（４）、４６１−７０（１９８６）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２９（２）、２６２−７３９（１９８６）；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（５）、３６８７−９２（２０００）］。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明によって、本出願人らは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９が、ヒト間充織前駆細胞の軟骨形成分化を促進することを実証した。本出願人らは、これらのＢＭＰの軟骨形成能が、ＩＬ−１の炎症効果を克服できたことをさらに実証した。ＢＭＰが関節の軟骨細胞によるマトリックス合成を刺激する能力および軟骨細胞表現型を維持する能力は、軟骨欠損修復および変形性関節症の予防／逆転、軟骨細胞表現型を含む重要な適用を示唆する。これらのＢＭＰは、軟骨の分化、増殖、維持および修復について特に有用であり得る。従って、本発明は、軟骨形成における、ＢＭＰを含む組成物および方法に関する。本発明はさらに、ＩＬ−１の炎症効果をブロックするかまたは部分的にブロックするためのＢＭＰの使用に関する。ＢＭＰおよび本発明において有用な他のタンパク質を、以下にさらに記載する。
【０００８】
本発明において、ＢＭＰを含む組成物は、軟骨修復を必要としている患者、または軟骨組織を含む疾患または欠損（例えば、変形性関節症）を有する患者に投与される。好ましい実施形態において、本発明は、有効量のＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物を含む。
【０００９】
この組成物において、タンパク質は、薬学的に受容可能なビヒクルと混合され得る。特定の実施形態において、この組成物はさらに、１以上のさらなるトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質または骨形態形成タンパク質を含み得る。ＢＭＰ関連タンパク質および別のＴＧＦ−βまたはＢＭＰの両方を含む組成物は、関節軟骨の処置のために特に有用であり得、ここで、関節表面、軟骨、肋軟骨下の骨および／または軟骨と骨との間の潮標（ｔｉｄｅｍａｒｋ）界面は、修復される必要があり得る。
【００１０】
本発明はまた、軟骨組織の治癒および組織修復のための方法、変形性関節症もしくは他の軟骨欠損を処置するための方法、ならびにこれらを必要とする患者における軟骨組織形成を誘導するための方法も含み、この方法は、有効量のＢＭＰ組成物をこの患者に投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、この方法において利用される組成物は、ＢＭＰ−２および／またはＢＭＰ−９を含む。本発明はまた、軟骨細胞または軟骨組織の誘導のために有用なタンパク質のアミノ酸配列を有する１つのモノマー、およびＴＧＦ−βサブファミリーの別のタンパク質のアミノ酸配列を有する１つのモノマーを含む、ヘテロ二量体タンパク質分子を含む。
【００１１】
本発明はさらに、軟骨形成能を有する、骨髄から単離された非組織培養拡張細胞を含む組成物に関する。好ましい実施形態において、非組織培養拡張細胞は、ＣＤ１０５＋細胞である。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ヒト骨髄から単離された非組織培養拡張細胞、ならびに軟骨および／または骨の形成を誘導するタンパク質を含む。骨髄および非組織培養拡張細胞から単離されたこれらの細胞は、ＢＭＰによって処理された場合、軟骨形成能を実証する。
【００１２】
好ましい実施形態において、非組織培養拡張細胞の処理のため、および本発明の他の実施形態における使用のための活性因子としては、タンパク質のトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーとして公知のタンパク質からなる群より選択される、１以上のタンパク質、好ましくは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）ならびに本明細書中でより完全に記載される他のタンパク質から選択される、１以上のタンパク質が挙げられる。本発明において有用な、骨形成タンパク質、ＤＮＡ配列、組成物およびこれらを作製する方法は、ＢＭＰタンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７（例えば、米国特許第５，１０８，９２２号；同第５，０１３，６４９号；同第５，１１６，７３８号；同第５，１０６，７４８号；同第５，１８７，０７６号；同第５，４５９，０４７号；同第５，８４９，８８０号および同第５，１４１，９０５号に開示される）；ＢＭＰ−８（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０９８に開示される）；およびＢＭＰ−９（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示される）、ＢＭＰ−１０（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６８９３に開示される）；ＢＭＰ−１１（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６８９２に開示される）、またはＢＭＰ−１２もしくはＢＭＰ−１３（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１６０３５に開示される）、またはＢＭＰ−１５（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３６７１０に開示される）もしくはＢＭＰ−１６（１９９６年９月１８日出願の、同時係属中の特許出願番号０８／７１５／２０２に開示される）を含む。好ましい実施形態において、このＢＭＰは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される。
【００１３】
さらに有用であり得る他のＤＮＡ分子およびそれらがコードするタンパク質としては、Ｖｇｒ−２、ならびに任意の増殖因子および分化因子［ＧＤＦ］（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１５９６５；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１；ＷＯ９５／０１８０２；ＷＯ９４／２１６８１；ＷＯ９４／１５９６６などに開示されるものを含む）をコードするものが挙げられる。さらに本発明において有用であるのは、ＢＩＰ（ＷＯ９４／０１５５７に開示される）；ならびにＭＰ５２（ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１６０９９に開示される）であり得る。上記の出願全ての開示は、その中に含まれる開示について、本明細書によって参考として援用される。
【００１４】
有用であり得る他のＤＮＡ分子およびそれらがコードするタンパク質としては、増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質（例えば、ソニック（ｓｏｎｉｃ）ｈｅｄｇｅｈｏｇ、インドｈｅｄｇｅｈｏｇおよび砂漠ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、副甲状腺ホルモンおよび副甲状腺ホルモン関連ペプチド、カドヘリン、アクチビン、インヒビン、およびＩＧＦ、ＦＳＨ、ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、ｆｒｚｂタンパク質、ｆｒａｚｚｌｅｄタンパク質、ＰＤＧＦおよび他の内皮増殖因子）、ＢＭＰ結合タンパク質（例えば、コルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）およびフェツイン（ｆｅｔｕｉｎ））、エストロゲンおよび他のステロイド、ならびにこれらの短縮バージョン、ならびに転写因子（例えば、ｗｎｔタンパク質、ｍａｄ遺伝子およびｃｂｆａ）が挙げられる。
【００１５】
上記で同定された出願の開示は、参考として本明細書中に本明細書によって援用される。これらのタンパク質の骨における存在と共に、これらのタンパク質の特有の誘導性の活性は、これらのタンパク質が、骨修復プロセスおよび軟骨修復プロセスの重要な調節因子であり、そして骨組織の正常な維持に関与し得ることを示唆する。
【００１６】
本発明の単離された細胞は、ＢＭＰまたは他の軟骨誘導タンパク質を用いて処理され得る。さらなる実施形態において、ＢＭＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、当業者に公知の方法を用いてこれらの細胞中に取り込まれ得る。
【００１７】
拡張せずに骨髄から直接単離された細胞が、いくつかの理由のために治療目的に対して好ましい。第１に、接着に基づく選択は、軟骨形成の潜在性と必ずしも関連付けられることが今まで示されていない特徴を示す細胞の部分集団を優先的に選択する。それらが接着ができないことに基づいて、軟骨形成の可能性を有する潜在的な重要な細胞部分集団を破棄してしまう可能性が減少される。細胞拡張の間の分化因子に対するインビトロ応答が、細胞表面特徴を変化させ得、それらの細胞を宿主に対して免疫原性にし、そして移植後に対宿主性移植片反応を引き起こすことという可能性はある。最後に、本発明によって、ＣＤ１０５＋細胞の軟骨形成分化が、細胞の培養および／または細胞の拡張に依存しないことが実証された。従って、無血清条件のＢＭＰの存在下における３次元マトリクス中でのヒト骨髄由来ＣＤ１０５＋細胞の軟骨形成分化に基づいて、本発明は、関節軟骨の修復のために移植される骨髄由来自己細胞を利用する、臨床移植プロトコルを特徴とする。このプロトコルは、長期であり、高価であり、そして面倒な細胞の培養拡張を排除する。
【００１８】
従って、本発明は、ヒト骨髄から単離され、そしてアルギネートの３次元マトリクス中に直接カプセル化され、そして無血清培地中で培養された、ＣＤ１０５＋細胞をさらに特徴とする。従って、本発明の組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルまたは適切なマトリクスをさらに含み得る。
【００１９】
本発明はまた、軟骨組織治癒および軟骨組織修復を必要とする患者において軟骨組織治癒および軟骨組織修復のための方法、変形性関節症または他の軟骨欠損の処置を必要とする患者において変形性関節症または他の軟骨欠損を処置するための方法、ならびに軟骨組織形成の誘導を必要とする患者においてにおいて軟骨組織形成を誘導するための方法を含み、これらの方法は、本発明の組成物の有効量を上記の患者に投与する工程を包含し、この組成物は、骨髄から単離され、組織培養で拡張されていない細胞、ならびに骨誘導タンパク質および／または軟骨誘導タンパク質を含む。好ましい実施形態において、この組成物は、ＣＤ１０５＋細胞およびＢＭＰを含む。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＣＤ１０５＋細胞および有効量のＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物を投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、細胞と同時にかまたはその後に、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物の有効量をこの患者に投与する工程を包含する。
【００２１】
初代幹細胞および前駆細胞を用いて種々の臨床適用が提唱されている［Ｆｕｃｈｓら、Ｃｅｌｌ．１００：１４３−１５５（２０００）］。間葉細胞治療が、培養で拡張した細胞を用いる種々の組織修復に対して提唱されている［Ｃａｐｌａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．９：６４１−６５０（１９９１）］。本発明は、細胞に基づく組織修復の臨床適用を拡張し、それらの細胞のインビトロ操作を最小化する手順が有利である。本発明によって示されるように、培養による拡張を伴なわない間葉細胞の分化潜在性は、結合組織疾患の臨床治療を提供する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、軟骨形成性分化を促進するＢＭＰを含む組成物に関する。これらの組成物は、変形性関節症に関連した生理学的レベルのＩＬ−１の存在下で、軟骨特異的細胞外マトリクス分子の発現を維持し得る。本発明は、さらに、これらの組成物を利用する方法に関する。これらの組成物および方法に好ましいＢＭＰは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９である。ＢＭＰ−２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびＢＭＰ−２のアミノ酸配列、ならびにこれらを調製する方法は、米国特許第５，０１３，６４９号の実施例に記載され、その開示は、本明細書中で参考として援用される。ＢＭＰ−９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびＢＭＰ−９のアミノ酸配列は、ＷＯ９３／００４３２に開示され、その開示は、本明細書中で参考として援用される。
【００２３】
本発明はまた、骨髄から単離された、非組織培養拡張された細胞（これは、軟骨形成能を有する）を含む組成物に関する。好ましい実施形態では、非組織培養拡張された細胞は、ＣＤ１０５＋細胞である。さらなる実施形態では、本発明の組成物は、ヒト骨髄から単離された、非組織培養拡張された細胞、ならびに軟骨および／または骨の形成を誘導するタンパク質を含む。骨髄から単離され、そして非組織培養拡張された、これらの細胞は、ＢＭＰで処理した場合、軟骨形成能を示す。本発明により、本出願人らは、これらの細胞が、軟骨修復を含む結合組織疾患の臨床的処置に重要な、前駆体細胞の供給源となる可能性を有することを示した。従って、単離された細胞は、ＢＭＰタンパク質で処理され得る。さらなる実施形態では、ＢＭＰをコードする配列が、細胞に組み込まれ得る。
【００２４】
本発明の組成物および方法は、軟骨組織または他の組織が、通常形成されず、そして軟骨の治癒（例えば、ヒトおよび他の動物における、関節軟骨の断裂、変形および他の軟骨欠損）に関する適用を有する状況において、軟骨組織または他の組織の形成の誘導に関する適用を見出す。タンパク質を誘導する軟骨組織を用いるこのような調製物は、軟骨組織に対する損傷を防ぐことに関する予防的用途、ならびに骨または他の組織に対する軟骨の改善された固定に関する用途、および軟骨組織に対する欠損を修復することに関する用途を有し得る。本発明の組成物により誘導された新規の軟骨組織形成は、先天性軟骨欠損、外傷誘発性軟骨欠損、または他の起源の他の軟骨欠損の修復に寄与し、そして軟骨の付着または修復のための手術に有用である。本発明の組成物はまた、関節炎および他の軟骨欠損の処置に有用であり得る。本発明の組成物はまた、軟骨組織を治癒または再生することが望ましい他の適応症に用いられ得る。このような適応症としては、関節軟骨に対する損傷の再生または修復が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、軟骨形成細胞を誘引するか、軟骨形成細胞の増殖を刺激するか、または軟骨形成細胞の前駆体の分化を誘導する環境を提供し得る。
【００２５】
本発明の方法に有用なタンパク質は、軟骨組織の形成を誘導し得る。軟骨組織とは、軟骨細胞、および軟骨細胞により形成される組織を意味し、これらは軟骨の組織学的特徴および組成上の特徴を示す。これらのタンパク質は、以下に記載されるアッセイにおいて軟骨組織形成活性を示す能力により、さらに特徴付けされ得る。これらのタンパク質が、他の型の組織（例えば、腱および靱帯）の形成を誘導する能力を有し得ることが意図される。
【００２６】
本発明の軟骨組織形成を誘導するための組成物は、タンパク質を誘導する有効量の軟骨組織を含み得る。好ましい実施形態では、活性な薬剤は、本明細書中でさらに十分に記載されるような、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのタンパク質として公知のタンパク質の群から選択される（好ましくは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）、ならびに他のタンパク質から選択される）１つ以上のタンパク質である。本発明において有用な、骨形成タンパク質、ＤＮＡ配列、組成物、およびこれらを作製する方法は、ＢＭＰタンパク質である、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７（例えば、米国特許第５，１０８，９２２号；同第５，０１３，６４９号；同第５，１１６，７３８号；５，１０６，７４８号；同第５，１８７，０７６号；同第５，４５９，０４７号；同第５，８４９，８８０号；および同第５，１４１，９０５号に開示される）；ＢＭＰ−８（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０９８に開示される）；ならびにＢＭＰ−９（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示される）；ＢＭＰ−１０（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６８９３に開示される）；ＢＭＰ−１１（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６８９２に開示される）、またはＢＭＰ−１２もしくはＢＭＰ−１３（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１６０３５に開示される）、またはＢＭＰ−１５（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３６７１０に開示される）またはＢＭＰ−１６（１９９６年９月１８日に出願された、同時係属特許出願番号０８／７１５／２０２に開示される）を含むものである。これらの組成物および方法に好ましいＢＭＰは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９である。ＢＭＰ−２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびＢＭＰ−２のアミノ酸配列、ならびにこれらを調製する方法は、例えば、米国特許第５，０１３，６４９号（その開示は本明細書中で参考として援用される）に開示される。ＢＭＰ−９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびＢＭＰ−９のアミノ酸配列は、例えば、ＷＯ９３／００４３２（その開示は本明細書中で参考として援用される）に開示される。
【００２７】
他のＤＮＡ分子およびこのＤＮＡがコードするタンパク質（これらもまた有用であり得る）としては、Ｖｇｒ−２、および任意の増殖および分化因子［ＧＤＦ］（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１５９６５；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１；ＷＯ９５／０１８０２；ＷＯ９４／２１６８１；ＷＯ９４／１５９６６などに開示されるものを含む）をコードするものが挙げられる。ＢＩＰ（ＷＯ９４／０１５５７に開示される）；およびＭＰ５２（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１６０９９に開示される）もまた本発明において有用であり得る。上記の出願の全ての開示は、これらに含まれる開示について本明細書中で参考として援用される。
【００２８】
タンパク質は、他の関連するタンパク質および増殖因子と協力して、または、恐らく、相乗的に作用することが予想される。ＢＭＰタンパク質をコードするＤＮＡに加えて、他のＤＮＡ分子、およびこのＤＮＡがコードするタンパク質（これらも有用である得る）としては、以下を含む、他の治療的に有用な薬剤をコードするＤＮＡ分子が挙げられる：増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、白血病阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ））、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１１）、ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）タンパク質（例えば、ソニック（ｓｏｎｉｃ）ヘッジホッグ、インディアン（ｉｎｄｉａｎ）ヘッジホッグおよびデザート（ｄｅｓｅｒｔ）ヘッジホッグ）、副甲状腺ホルモンおよび副甲状腺ホルモン関連ペプチド、カドヘリン、アクチビン、インヒビン、ならびにＩＧＦ、ＦＳＨ、ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、ｆｒｚｂタンパク質、またはｆｒａｚｚｌｅｄタンパク質，ＰＤＧＦおよび他の上皮増殖因子、ＢＭＰ結合タンパク質（例えば、コルジン（ｃｈｏｒｄｉｎ）およびフェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ））、エストロゲンおよび他のステロイド、およびその短縮型バージョン、ならびに転写因子（例えば、ｗｎｔタンパク質、ｍａｄ遺伝子、およびｃｂｆａ）。これらの薬剤の部分もまた、本発明の組成物に用いられ得る。このような組成物は、軟骨と骨の間の接合部の欠損（これは、連続する解剖学的位置で同時に生じる）を処置するために有用であり得、そして骨に付着した軟骨の部位での組織の再生に有用であり得る。
【００２９】
上記で確認される出願の開示は、本明細書中で参考として援用される。これらのタンパク質の固有の誘導活性は、骨におけるこれらの存在と共に、これらが、骨および軟骨の修復プロセスの重要な調節因子であり、そして骨組織の通常の維持に関与し得ることを示唆する。
【００３０】
本明細書中で提供される軟骨組織誘導タンパク質はまた、天然に存在するタンパク質の配列に類似する配列によりコードされる因子を含むが、このタンパク質に対する改変は、天然で提供され得る（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸変化を生じ得るヌクレオチド配列中の対立遺伝子改変体）か、または故意に操作され得る。例えば、合成ポリペプチドは、タンパク質のアミノ酸残基の連続する配列を、完全に複製し得るか、または部分的に複製し得る。これらの配列は、一次構造、二次構造、または三次構造および立体配座特徴を、天然に存在するタンパク質の軟骨組織増殖因子ポリペプチドまたは軟骨組織維持因子ポリペプチドと共有することにより、これらに共通する、軟骨組織または他の組織の増殖因子または成長因子の生物学的特性を保有し得る。従って、これらは、治療用組成物および治療プロセスにおける、天然に存在する軟骨組織誘導性ポリペプチドおよび軟骨組織維持ポリペプチドの、生物学的に活性な代用物として用いられ得る。
【００３１】
本明細書中に記載される軟骨組織誘導性タンパク質の配列の他の特異的変異は、グリコシル化部位の改変に関与する。これらの改変は、Ｏ連結グリコシル化部位またはＮ連結グリコシル化部位に関与し得る。例えば、グリコシル化の欠如または部分的のみのグリコシル化は、アスパラギンが連結したグリコシル化認識部位でのアミノ酸の置換または欠失から生じる。このアスパラギンが連結したグリコシル化認識部位は、適切な細胞性グリコシル化酵素により特異的に認識される、トリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、アスパラギン−Ｘ−セリン、またはアスパラギン−Ｘ−システインであり得、ここで、Ｘは、通常、プロリンを除く任意のアミノ酸である。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の１つまたは両方での種々のアミノ酸置換または欠失（および／あるいは第２の位置でのアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列においてグリコシル化を生じない。さらに、タンパク質の細菌発現はまた、たとえグリコシル化部位が改変されていなくとも、非グリコシル化タンパク質の産生を生じる。
【００３２】
このような生理学的に受容可能なタンパク質組成物の調製および処方（ｐＨ、等張性、安定性などに関して適切である）は、当業者の範囲内である。治療用組成物はまた、ＴＧＦ−βタンパク質における種特異性の欠如に起因して、獣医学的適用のために現在価値がある。特に、ヒトに加えて、家畜動物およびサラブレッドウマは、本発明の組成物を用いるこのような処置について、望ましい患者である。
【００３３】
治療方法は、この組成物を、注射可能物および／またはインプラントまたはデバイスとして、局所的、全身に、または局部的に投与する工程を包含する。投与される場合、本発明における使用のための治療組成物は、当然のことながら、発熱物質を含まず、生理学的に受容可能な形態である。さらに、この組成物は、望ましくは、組織損傷の部位に送達するために、カプセル化され得るかまたは粘性形態で注射され得る。局所的投与は、創傷治癒および組織修復に適切であり得る。やはり上記の組成物に必要に応じて含まれ得るタンパク質以外の治療的に有用な薬剤は、代替的にまたはさらに、本発明の方法においてこの組成物を同時にまたはこの組成物と連続して投与され得る。さらに、本発明の組成物は、軟骨傷害の現在利用可能な処置（例えば、縫合（例えば、ビクリル縫合、外科的腸縫合（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ））または軟骨異型移植片もしくは自己移植片）とともに、縫合または移植片の治癒可能性を増強または促進するために、使用され得る。例えば、縫合、異型移植片または自己移植片は、移植前に、本発明の組成物中に浸漬され得る。タンパク質または本発明の組成物を、例えば、凍結乾燥により、縫合材料に組み込むこともまた可能である。
【００３４】
上記のように、本発明の組成物は、多くの軟骨欠損を処置するための方法（例えば、軟骨損傷の領域における軟骨組織の再生）において使用されて、軟骨組織の断裂および種々の他の型の組織欠損または創傷の修復を補助し得る。これらの方法は、本発明の方法に従って、このような軟骨組織または他の組織修復の必要な患者に、軟骨組織誘導タンパク質（例えば、その開示が、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９５／１６０３５に記載されるタンパク質）の有効量を含む組成物を投与する工程を包含する。これらの方法はまた、上記のＢＭＰタンパク質の少なくとも１つとともに、軟骨組織誘導タンパク質の投与を包含する。
【００３５】
別の実施形態において、この方法は、モノマーの１つが軟骨組織誘導ＢＭＰポリペプチドであり、第２のモノマーが、増殖因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであるヘテロダイマータンパク質の投与を包含し得る。さらに、これらの方法はまた、他の増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、およびＩＧＦを含む）とともに、軟骨組織誘導タンパク質の投与を包含する。
【００３６】
従って、本発明のさらなる局面は、軟骨組織を修復するための治療的方法および組成物、ならびに関節炎および関節炎に関連する他の状態を処置することである。このような組成物は、薬学的に受容可能なビヒクル、キャリアまたはマトリクスと混合された状態で、１以上の軟骨組織誘導タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９）の治療的有効量を含む。
【００３７】
培養により拡張されたＭＭＣは、関節の軟骨修復の部位に軟骨形成性増殖因子を送達するために操作され得る。従って、ＭＭＣとＢＭＰの組み合わせは、臨床的軟骨修復手順を提供し得、かつこの手順を大きく改良し得る。
【００３８】
本発明の実施形態のための投薬レジメンは、組成物の作用を改変する種々の要因（例えば、形成することが所望される軟骨組織の量、軟骨組織損傷の部位、損傷を受けた軟骨組織の状態、創傷のサイズ、損傷を受けた組織の型、患者の年齢、性別および食餌、任意の感染の重篤性、投与の時間および他の臨床的要因）を考慮に入れて、主治医により決定される。この投薬量は、再構成に使用されるマトリクスの型および組成物中のさらなるタンパク質の型によって変化し得る。最終組成物への他の公知の増殖因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ））の添加はまた、投薬量に影響を及ぼし得る。概して、軟骨組織の形成を誘導するに有用な組換えＢＭＰタンパク質の量は、容積で約２０ｃｃの欠損について約１〜約１００μｇの量にある。概して、軟骨組織の維持を誘導するために有用な組換えＢＭＰタンパク質の量は、溶液１ｍｌあたり約１〜約１０００ｎｇの量にある。
【００３９】
関節の軟骨損傷を含む種々の状態の処置が必要な患者の同定は、当該分野で周知の手順により達成され得る。これらの手順は、複式エネルギーＸ線吸収測定（ｄｕａｌ ｅｎｅｒｇｙ Ｘ−ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）（ＤＥＸＡ）（Ｋｉｌｇｕｓら、Ｊ．Ｂｏｎｅ ＆ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，７５−Ｂ：２７９−２８７（１９９２）；Ｍａｒｋｅｌら、Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ，６１：４８７−４９８（１９９０））；および定量的コンピュータ連動断層撮影（ＱＣＴ）（Ｌａｖｅｌ−Ｊｅａｎｔｅｔら、Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ａｓｓｉｓｔ Ｔｏｍｏｇｒ，１７：９１５−９２１（１９９３）；Ｍａｒｋｅｌ，Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ，４９：４２７−４３２（１９９１））；シングルフォトン吸収測定（ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）（Ｍａｒｋｅｌら、Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ，４８：３９２−３９９（１９９１））；超音波伝達速度（ＵＴＶ）（Ｈｅａｎｅｙら、ＪＡＭＡ，２６１：２９８６−２９９０（１９８９）；Ｌａｎｇｔｏｎら、Ｃｌｉｎ Ｐｈｙｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｍｅａｓ，１１：２４３−２４９（１９９０））；ならびにｘ線評価（ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（Ｇｌｕｅｒら、Ｊ．Ｂｏｎｅ＆Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ，９：６７１−６７７（１９９４））を使用する骨質量／骨密度の測定を含む。他の同定方法は、当業者に公知である。上記の刊行物は、本明細書中に参考として援用される。
【００４０】
進行は、軟骨組織形成、または軟骨組織増殖および／もしくは軟骨組織修復の定期的評価によりモニターされ得る。この進行は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｘ線、関節鏡検査、組織形態決定およびテトラサイクリン標識）によりモニターされ得る。
【００４１】
拡張させずに骨髄から直接単離した細胞は、いくつかの治療的利点を有する。接着に基づく選択は、軟骨形成能力と必ず相関することを決して示さない特徴を示す細胞亜集団を優先的に選択する。細胞の接着する能力に基づいて、軟骨形成能力を有する細胞の潜在的に重要な亜集団を除く可能性が減少される。培養拡張の間の分化因子に対するインビトロでの応答は、細胞表面特徴を改変し得、このことは、細胞を宿主に対して免疫原性にし、移植後に対宿主性移植片応答を生じさせる。最後に、本発明により、ＣＤ１０５＋細胞の軟骨形成性分化は、細胞の培養および／または拡張に依存しないことが実証された。無血清条件にてＢＭＰの存在下で３次元マトリクスにおけるヒト骨髄由来ＣＤ１０５＋細胞の軟骨形成性分化に基づいて、従って、本発明は、関節軟骨の修復のための移植された骨髄由来自己細胞を使用する臨床的移植プロトコルを特徴とする。このプロトコルは、長時間にわたる、高価かつ労力を要する細胞の培養拡張を排除する。
【００４２】
本発明は、ヒト骨髄から単離したＣＤ１０５＋細胞を拡張させ、およびアルギン酸の３次元マトリクス中に直接カプセル化し、無血清培地中で培養される非組織培養をさらに特徴とする。従って、さらなる実施形態は、適切なマトリクスを含む。
【００４３】
本発明は、軟骨性組織治癒および軟骨組織修復のため、変形性関節症または他の軟骨欠損を処置するため、および軟骨組織形成の必要がある患者において軟骨組織形成を誘導するための方法を包含し、この方法は、骨髄から単離した非組織培養拡張細胞ならびに骨および／または軟骨誘導タンパク質を含む本発明の組成物の有効量を、この患者に投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、この組成物は、非組織培養拡張ＣＤ１０５＋細胞およびＢＭＰを含む。好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤ１０５＋細胞および有効量のＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物を含む。この方法は、細胞または引き続き有効量の、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物を同時にこの患者に投与する工程を包含する。
【００４４】
初代幹細胞および前駆体細胞を使用する種々の臨床的用途が提唱されてきた［Ｆｕｃｈｓら、Ｃｅｌｌ．１００：１４３−１５５（２０００）］。間葉細胞治療は、培養拡張細胞を使用した種々の組織修復のために提唱されてきた［Ｃａｐｌａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．９：６４１−６５０（１９９１）］。本発明は、細胞ベースの組織修復の臨床的適用を拡げ、これら細胞のインビトロ操作を最小にする手順は有利である。本発明により示されるように培養拡張を伴わない間葉細胞の分化能力は、結合組織疾患の臨床的処置を提供する。
【００４５】
本発明の組成物は、キャリアとして適切なマトリクスおよび／または金属イオン封鎖剤を含み得る。例えば、このマトリクスが、この組成物を支持し得るか、または軟骨組織形成および／または他の組織形成のための表面を提供し得る。このマトリクスは、タンパク質の遅い放出および／またはその提示のための適切な環境を提供し得る。金属イオン封鎖剤は、注射または他の手段を介して投与を容易にすることに役立つ物質であり得るか、または適用の部位からタンパク質の移動を遅くし得る。
【００４６】
キャリア材料の選択は、生体適合性、生体分解性、機械的特性、審美的外観、および界面特性に基づく。この組成物の特定の適用により、適切な処方が規定される。この組成物の潜在的なマトリクスは、生体分解性かつ化学的に規定され得る。さらにマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクス成分から構成される。他の潜在的なマトリクスは、非生体分解性かつ化学的に規定される。好ましいマトリクスとしては、Ｈｅｌｉｓｔａｔ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，Ｎ．Ｊ．）のようなコラーゲンベースの材料（スポンジを含む）または注射可能な形態のコラーゲン、ならびに例えば、ヒアルロン酸由来の金属イオン封鎖剤（生体分解性であり得る）が挙げられる。生体分解性材料（例えば、セルロースフィルムまたは手術用メッシュ）はまた、マトリクスとして役立ち得る。このような材料は、傷害部位に縫合されるかまたは軟骨の周りに巻きつけられ得る。
【００４７】
キャリアの別の好ましいクラスは、ポリマーマトリクスであり、これらのマトリクスとしては、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）のポリマー、および乳酸とグリコール酸とのコポリマーが挙げられる。これらのマトリクスは、スポンジの形態または多孔性粒子の形態であり得、そしてまた金属イオン封鎖剤を含み得る。適切なポリマーマトリクスは、例えば、Ｗ０９３／０００５０（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００４８】
本願の実施において有用なさらなる適切な組成物としては、例えば、マンニトール、スクロース、ラクトース、グルコースまたはグリシンのような凍結保護剤（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ）（凍結乾燥の間にタンパク質が変性するのを防ぐため）、抗微生物性防腐剤（例えば、メチルパラベンおよびプロピルパラベン、ならびにベンジルアルコール）；抗酸化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、クエン酸およびＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）；ならびに界面活性剤（例えば、ポリ（ソルベート）およびポリ（オキシエチレン））が挙げられる。
【００４９】
金属イオン封鎖剤の好ましいファミリーとしては、血液、フィブリン凝固および／またはアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）のようなセルロース材料（メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる）が挙げられ、最も好ましくは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン性塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤としては、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。本明細書中で有用な金属イオン封鎖剤の量は、処方物の総重量に基づいて、０．５〜２０ｗｔ％、好ましくは、１〜１０ｗｔ％である。これは、ポリマーマトリクスからタンパク質の脱着を防止し、組成物の適切な取り扱いを提供するために必要な量を表すが、前駆体細胞が、マトリクスに浸潤することを妨げるほどではなく、それによりこのタンパク質に前駆体細胞の活性を補助する機会を提供する。
【００５０】
本発明の特定の実施形態において、組成物の成分は、再吸収性ポリマー送達系（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはそれらのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリオルトカーボネート、および他のポリマー）にカプセル化され得る。適切なポリマーは、ＥＰ ０１４５２４０中の実施例に開示され、この開示は、本明細書中に参考として援用される。あるいは、ＢＭＰは、リポソーム中にカプセル化され得る。例えば、ＴＧＦ−βタンパク質のリポソーム送達は、米国特許第５，２０６，０２３号、同第５，２７０，３００号、および同第５，３６８，８５８号に開示され、これらの開示の各々は、本明細書中に参考として援用される。これらの送達系はともに、後にまたはより持続した期間にわたりＢＭＰの放出を提供するように改変され得、軟骨細胞および軟骨維持に対するＢＭＰの有利な効果が、軟骨細胞および軟骨組織の誘導に対するＢＭＰの有利な効果を補足するように作用させる。
【００５１】
本発明のタンパク質および組成物はまた、細胞集団（例えば、胚細胞または幹細胞の集団）を処理して、これらの細胞の増殖、分化および／または維持を増強または高めるために有用であり得る。処置された細胞集団は、遺伝子治療適用に有用であり得る。
【００５２】
以下の実施例は、ＢＭＰがヒト間葉前駆体細胞の軟骨形成性分化を促進することおよびこれらＢＭＰがＩＬ−１の炎症性効果を克服する能力を実証することにおいて、本発明の実施を例示する。
【００５３】
以下の実施例は、ＢＭＰが非組織培養拡張ヒト間葉前駆体細胞の軟骨形成性分化を促進することを実証することにおいて、本発明の実施をさらに例示する。
【００５４】
（実施例１：ＭＭＣの単離および培養拡張）
ヒトＭＭＣを以前報告された手順［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １７６，５７−６６９（１９９８）］に従って単離した。単球（ＭＮＣ）を、以前報告された手順［Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８５（１），９８−１０６（２０００）］の改変に従って、ヒト骨髄サンプルから単離した。骨髄サンプル中の有核細胞全てを、単離緩衝液（カルシウムおよびマグネシウム非含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．６％クエン酸ナトリウムおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を使用して、１ｍｌあたり７×１０６細胞の濃度に希釈した。３０〜３５ｍｌの希釈細胞懸濁液を、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に重層し、８００×ｇにて２０分間遠心分離した。ＭＮＣを回収し、計数し、磁性活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）緩衝液（０．５％ ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ，ｐＨ７．２）で洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液中にて２〜４×１０８細胞／ｍｌに再懸濁した。１×１０８のＭＮＣを、０．２ｍｌの抗ヒトＣＤ１０５抗体−マイクロビーズとともに４℃にて４５分間インキュベートし、ＣＤ１０５＋細胞を、ＭＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して製造業者の推奨に従って単離した。ＣＤ１０５−細胞を、カラム溶出液として回収する一方、ＣＤ１０５＋細胞を、カラムに結合させたままにした。ＣＤ１０５＋細胞を、磁石からはずし、細胞をＭＡＣＳ緩衝液を使用して流すことにより、カラムから回収した。ＣＤ１０５＋細胞を、１８５ｃｍ２ Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｏｌｏフラスコ（Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）中に、１フラスコあたり５〜７．５×１０５細胞の密度にて入れて、α−ＭＥＭ（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）および１％抗真菌性抗生物質を補充した）からなる完全培地中で３７℃にて、空気中５％ＣＯ２で培養した。培地を４８時間後に交換し、その後は３〜４日ごとに交換した。１４日目に、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡとともにインキュベートすることにより細胞を剥がし（初代（ｐ０）と称する）、１フラスコあたり１×１０６細胞の密度にて拡張するために、継代１細胞として、再び入れた。この細胞は、６日から７日で９０％コンフルエントに達し、その後、この細胞を、上記のように継代するか、または他のアッセイにおいて使用するか、または将来使用するために液体窒素中で、９０％ ＦＢＳおよび１０％ ジメチルスルホキシド中に保存するかのいずれかであった。この研究のために使用した細胞は、継代２または継代３から得た。ＣＤ１０５＋細胞は、間葉起源であり、多能性分化能を有するので、ＣＤ１０５＋細胞をＭＭＣと称した。
【００５５】
（実施例２：アルギン酸中でのＭＭＣの培養）
ＭＭＣを、以前報告した手順［Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８５（１），９８−１０６（２０００）］に従ってアルギン酸中にカプセル化した。簡潔には、ＭＭＣを、剥がし、洗浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０）を使用して洗浄し、洗浄緩衝液中に１．２％アルギン酸中で２５×１０６／ｍｌの密度に再懸濁した。細胞懸濁液の個々のビーズを、２０ゲージ針を介して、１０２ｍＭ ＣａＣｌ２および２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）を含む溶液へと直ぐに移した。このビーズを、１０分間重合させ、洗浄緩衝液中で１回洗浄し、完全培地中で３回洗浄し、同じ培地中で、空気中５％ＣＯ２により３７℃にて一晩培養した。翌日、この培地を、化学的に規定された培地（高グルコース、１００ｎＭ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸−２−ホスフェート（ＷＡＫＯ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０μｇ／ｍｌ プロリン（Ｓｉｇｍａ）、１％ ＩＴＳ−Ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）および１００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２もしくはｒｈＢＭＰ−９を含有するＤＭＥＭからなる）に交換した。この培地を、翌２〜３週にわたり１週間に２回交換した。ＲＮＡを、培養の間に種々の時間間隔で遺伝子の発現を試験するために細胞から単離した。
【００５６】
ＩＬ−１研究に関して、軟骨形成性分化のために、ＢＭＰ含有または非含有無血清培地にて１４〜２１日間、アルギン酸中でＭＭＣを培養した。１４日目、ビーズを洗浄し、２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有する培地中で、先の研究［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １７６，５７−６６（１９９８）］において報告したように、７２時間培養した（１７日目）。再び、ビーズを洗浄し、ＢＭＰ含有培地中で９６時間培養した（２１日目）。ＲＮＡを１４日目、１７日目および２１日目に細胞から単離した。次の研究において、ＭＭＣをアルギン酸ビーズ中で１４日間培養し、引き続いてＢＭＰ単独、ＩＬ−１単独、またはＩＬ−１とＢＭＰの種々の組み合わせにて、さらに７日間培養した。ＲＮＡを、１４日目および２１日目に細胞から単離した。
【００５７】
別の研究において、拡張させた細胞を、３次元アルギン酸マトリクス中にカプセル化し、ＩＬ−１１とＢＭＰ−９ありまたはなしで無血清培地中で培養して、軟骨形成性分化を受けるそれらの能力について分析した。
【００５８】
（実施例３：ＲＮＡ調製およびノーザンブロット分析）
培養拡張ＭＭＣをアルギン酸ビーズにカプセル化し、無血清培地中で培養した。ＲＮＡ単離に関して、ビーズを細胞回収緩衝液（５５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．０）に移し、４℃にて１０分間インキュベートし、細胞をアルギン酸マトリクスから放出し、１４００×ｇにて１５分間、４℃で遠心分離して、細胞を回収した。総ＲＮＡを、以前報告した手順［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １７６，５７−６６（１９９８）］により細胞ペレットから調製した。簡潔には、細胞ペレットを、溶解緩衝液（４Ｍ グアニジウムイソチオシアネート、０．０３Ｍ 酢酸ナトリウムおよび０．４ｇ／ｍｌ 塩化セシウム）中に再懸濁し、溶解物を５．７Ｍ 塩化セシウムに重層し、ＳＷ４０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で１５５，０００×ｇにて１８時間遠心分離した。ＲＮＡペレットを、０．５〜１ｍｇ／ｍｌにて水中に溶解した。ノーザンブロッティング分析に関して、１サンプルあたり５μｇの総ＲＮＡを、１％ホルムアミド−アガロースゲルで分画した。電気泳動に続いて、ＲＮＡを、正に荷電したナイロン膜（ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））に転写した。ノーザン分析用の遺伝子プローブを表Ｉに列挙する特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅産物として調製し、この増幅産物を配列決定によって確認した。これらのプローブを、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により、ランダムプライマー法を使用して、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，ＮＪ）が推奨するように放射性標識し、ｕｌｔｒａｈｙｂ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）中で一晩ハイブリダイズさせた。Ｃｏｌ２Ａｌハイブリダイゼーションを、５４℃にて行い、他は全て、４２℃にて行った。フィルターを、２×ＳＳＣ／０．１ ％ＳＤＳ中で室温にて洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６５℃にて３０分間洗浄した。このフィルターを、Ｘ線フィルムに一晩曝した。ハイブリダイゼーションシグナルを、ｘ線画像をスキャンし、画像尺度（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ ａｎｄ Ｆｉｌｍ Ｃｏ，Ｊａｐａｎ）を利用することにより定量した。Ｃｏｌ２Ａ１、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＣＯＭＰおよびＳｏｘ−９のｍＲＮＡレベルを、β２−ミクログロブリンとの正規化によりＲＮＡ負荷について較正した。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるＣｏｌ２ＡＩ遺伝子発現の検出に関して、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）による２〜３の溶解ビーズから単離した細胞から調製した。ＲＴ−ＰＣＲを、テンプレートとしての総ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮＡ ＰＣＲコアキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＣＴ）を使用して行った。増幅産物を、１．２％ Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で分析した。
【００５９】
【表１】
（実施例４；ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９は、ＭＭＣの軟骨形成性分化を誘導する）
ＴＧＦ−βの存在下で培養した間葉幹細胞および前駆体細胞を、軟骨形成性分化させる［Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４，４１５−４２８（１９９８）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｊｅｒｙ ８０（１２），１７４５−１７５７（１９９８）］。アルギン酸中で培養し、ＴＧＦ−β３により刺激したＭＭＣは、Ｃｏｌ２Ａ１を発現し、軟骨形成性系統に沿って分化する［Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８５（１），９８−１０６（２０００）］。ＢＭＰの軟骨形成性分化に対する効果を試験するために、３名のドナー由来の、単層培養により拡張させたＭＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２またはｒｈＢＭＰ−９の存在下で３次元アルギン酸マトリクス中にてさらに培養した。ＲＴ−ＰＣＲを、種々の時間間隔で細胞から抽出したＲＮＡに対して行い、Ｃｏｌ２Ａ１の発現を検出した。この結果は、Ｃｏｌ２Ａ１発現が、８日目〜１４日目に３名のドナー全ての細胞において誘導されることを示した。１４日目に、総ＲＮＡを培養中の細胞から調製し、ノーザンブロット分析を行った。この結果は、３名のドナー全てが、ＢＭＰおよび発現されたＣｏｌ２Ａｌの両方による刺激に応答する一方、その発現は、非処理細胞において検出されないことを示した。この結果はまた、ＢＭＰ−９処置が、ＢＭＰ−２より高いレベルのＣｏｌ２Ａｌ発現を誘導することを示した。
【００６０】
これは、ＢＭＰ−２が軟骨形成関連転写因子Ｓｏｘ−９の発現をアップレギュレートし、続いてＣｏｌ２Ａｌおよびアグリカンの発現を調節するというマウス研究において示された［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２），１５１−１６０（２０００）］。ヒトＭＭＣにおけるこの観察を評価し、軟骨形成性系統の進行の状態をさらに分析するために、軟骨形成性特異的マーカー（アグリカン、軟骨オリゴマータンパク質（ＣＯＭＰ）およびＳｏｘ−９）の発現を調査した。複数のドナー由来のＭＭＣを分析した。結果は、この群の代表的な１名のドナーからのものである。アグリカンおよびＣＯＭＰの両方の発現は、Ｃｏｌ２Ａｌ発現に類似の様式で、ＢＭＰに応答して増大した。Ｓｏｘ−９は、未処理細胞における発現の基底レベルを示したが、ＢＭＰで処理した細胞において、観察可能なアップレギュレーションを受けた。従って、アルギン酸培養におけるＭＭＣを、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９により軟骨形成性系統に沿って分化するように誘導することが意図される。
【００６１】
ＩＬ−１１およびＢＭＰ−９研究において、ＩＬ−１１もＢＭＰ−９も非含有およびＩＬ−１１単独のみ含有させて培養した細胞は、Ｃｏｌ２Ａｌを発現しなかった。漸増濃度のＢＭＰ−９とともに培養した細胞は、未処理細胞と比較した場合、有意なレベルのＣｏｌ２Ａｌ発現を示した。ＩＬ−１１とＢＭＰ−９を組み合わせて培養した細胞は、ＢＭＰ−９単独より高いレベルのＣｏｌ２Ａｌ発現を示した。ＩＬ−１１とＢＭＰ−９の相乗効果は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１１の濃度にて最適であった。この濃度にて、Ｃｏｌ２Ａｌ発現がＢＭＰ−９単独より５倍超高かった。
【００６２】
（実施例５：ＭＭＣにおける軟骨形成マーカーの時間依存的様式での発現において安定して増加するＢＭＰ誘導）
アルギネートビーズ中で培養したＭＭＣから、５日、１０日および１５日目に単離したＲＮＡを、ノーザン分析に供した。結果（図１）は、Ｃｏｌ２Ａ１遺伝子発現は、１０日目に検出され１５日目まで連続して増加することを示した。アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）発現は、５日目に検出され、培養物中で日ごと進行性の増加を示した。また、ＢＭＰ−９処理細胞は、Ｃｏｌ２Ａ１およびアグリカン両方の、ＢＭＰ−２処理細胞より高い発現を示した。この結果は、ＭＭＣがＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９で処理される場合、アグリカン発現が、Ｃｏｌ２Ａ１発現より早く応答することを示す。
【００６３】
（実施例６：ＢＭＰは、ＩＬ−１の炎症性効果を克服する）
以前の研究は、ＩＬ−１が、Ｃｏｌ２Ａ１およびアグリカンを含む軟骨形成特異的遺伝子を、転写因子Ｓｏｘ−９のダウンレギュレーションによって阻害することを示した（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０５２（３），３６６−７８（１９９０）；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６６（２），３５１−９（１９９６）；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（５），３６８７−９２（２０００））。これら３つの遺伝子の発現を分析することによって、軟骨形成に分化したＭＭＣに対するＩＬ−１の効果を試験した。結果は、１４日目に、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９が、Ｃｏｌ２Ａ１およびアグリカンの発現を誘導し、以前に言及したように、ＢＭＰ−９処理が、ＢＭＰ−２処理よりも高レベルの発現を生じさせることを示した（図２、レーン１〜３）。ＢＭＰの除去およびＩＬ−１の７２時間にわたる添加は、Ｃｏｌ２Ａ１、アグリカンおよびＳｏｘ−９の減少したレベルの発現を導いた（レーン４〜６）。ＩＬ−１の除去およびＢＭＰのさらなる９６時間の期間にわたる添加は、２１日間にわたってＢＭＰに連続して曝露した細胞（レーン１０〜１２）に類似した発現レベルを有する３つの遺伝子の発現回復を生じた（レーン７〜９）。
【００６４】
次いで、ＩＬ−１の存在下でのＢＭＰの効果を、試験した。細胞を、軟骨形成系統にそって１４日間分化させ、続いて、ＩＬ−１単独、ＢＭＰ単独，ならびにＩＬ−１およびＢＭＰを一緒に、７日間存在させた。結果（図３）は、未処理細胞（レーン１）および漸増濃度のＩＬ−１にさらに７日間曝露した１４日目の未処理細胞が、予想通り、Ｃｏｌ２Ａ１の発現はなく、測定可能なＳｏｘ−９の発現はない（レーン２〜４）ことを示した。ＢＭＰで処理した細胞は、Ｃｏｌ２Ａ１発現によって例証されるように、最初の１４日間、軟骨形成性分化を介して進行した（レーン５および１８）。軟骨形成性に分化した細胞を漸増濃度のＢＭＰ−２にさらに７日間曝露したことによって、Ｃｏｌ２Ａ１およびＳｏｘ−９の発現が増加した（レーン６〜８）。同様の効果を、ＢＭＰ−９処理で観察した（レーン１９〜２１）が、ＢＭＰ−９に対する最大応答は、１００ｎｇ／ｍｌの最低用量で達成された。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の両方は、ＩＬ−１誘導性のＣｏｌ２Ａ１およびＳｏｘ−９の抑制を、特に、使用したＩＬ−１の最低濃度（２０ｐｇ／ｍｌ）で部分的に妨げ得た（それぞれ、レーン９〜１７および２２〜３０）。さらに、ＢＭＰ−９は、全ての濃度のＩＬ−１でより高いレベルのＣｏｌ２Ａ１発現を維持し得た。これらの観察は、ＢＭＰが、炎症性サイトカインを含む環境において同化因子として機能する能力を有する潜在的分子であることを示した。
【００６５】
（実施例７：ＣＤ１０５＋細胞の単離および培養拡張）
ヒトＭＭＣを、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１８５：９８−１０６（２０００））に従って単離した。単核細胞（ＭＮＣ）を、ヒト骨髄より単離し、０．５％ ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）からなる磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）緩衝液で洗浄した。これらの細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、１×１０８個のＭＮＣを、０．２ｍｌの抗ヒトＣＤ１０５抗体−微小ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）とともに、４℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、製造業者の推薦に従って、磁気カラムＭＳ＋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で分離した。カラム溶出物は、ＣＤ１０５＋細胞からなる。磁石からカラムを回収して、ＭＡＣＳ緩衝液で細胞をフラッシュすることによって、付着したＣＤ１０５＋細胞を回収した。小画分のＣＤ１０５＋細胞（５〜７．５×１０５個）を、１８５ｃｍ２ Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｏｌｏフラスコ（Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）および１％抗真菌性抗生物質（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充したα−ＭＥＭからなる完全培地中で、空気中５％ＣＯ２中３７℃にてプレートして、細胞のプレーティング効率について分析した。１４日目、細胞を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）処理によって剥がし、将来の使用のために、液体窒素中で９０％ ＦＢＳおよび１０％ジメチルスルホキシド中で貯蔵した。
【００６６】
（実施例８：フローサイトメトリー）
細胞表面分子の分析を、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１７６：５７−６６（１９９８））に従って行った。カラムで単離したＣＤ１０５＋細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）中で洗浄し、細胞のアリコート（１×１０５〜１×１０６個）を、抗ヒトＣＤ４５蛍光色素結合体化モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、細胞ペレットを、１％パラホルムアルデヒドを含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。非特異的蛍光を、マウスアイソタイプモノクローナル抗体とともにインキュベートした細胞調製物の等量のアリコートを使用して決定した。Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ装置（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で１０，０００〜５０，０００回の事象を分析することによって、データを収集した。
【００６７】
（実施例９：アルギネートでのＣＤ１０５＋細胞の培養）
ＣＤ１０５＋細胞を、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）の改変によって、アルギネート中にカプセル化した。細胞を、洗浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０））で洗浄し、１０〜２０×１０６個／ｍｌの細胞密度で、洗浄緩衝液中１．２％アルギネート中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁物の個々のビーズを、２０ゲージの注射針を通して、１０２ｍＭ ＣａＣｌ２および２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）を含有する溶液中に徐々に搾り出した。ビーズを１０分間重合させ、洗浄緩衝液で１回、完全培地で３回洗浄し、空気中５％ＣＯ２中３７℃にて同一の培地中で一晩培養した。次の日、培地を、化学的に規定された培地（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）に交換した。アルギネートビーズを、上記の培地（未処理）または１００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−９で補充した培地（処理）中で培養した。培地を、次の３週間にわたって、週に２回交換した。ＭＮＣおよびＣＤ１０５−細胞をまた、アルギネートビーズ中に同一濃度でカプセル化し、同様に培養した。
【００６８】
（実施例１０：ＲＮＡ調製および分析）
複数のドナー由来のＣＤ１０５＋細胞を、アルギネートビーズ中にカプセル化し、３週間培養した。培養期間の最後に、細胞をビーズから回収し、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって細胞ペレットより抽出し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）−ｅｌｉｓａを、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）に従って行った。簡単には、ＲＴ−ＰＣＲを、テンプレートとしての総ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー（表ＩＩ）、ＲＮＡ ＰＣＲコアキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＣＴ）を使用して行い、そしてデオキシヌクレオチドをジゴキシゲニン標識ヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と置換して増幅産物を標識した。Ｅｌｉｓａを製造業者（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって推奨されるように行った。各ドナー由来の各未処理サンプルおよび処理サンプルについてのデータを、ｂ２−ミクログロブリンに対して正規化した。軟骨特異的マーカー（ＩＩ型コラーゲン、アグリコンおよび連結タンパク質が挙げられる）によって、進行を決定した。各ドナーについて、ＩＩ型コラーゲン、アグリコンおよび連結タンパク質の発現を、未処理に対する倍数増加（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）として見積もった。結果は、３人のドナーについての平均倍数増加である。ＲＴ−ＰＣＲ ｅｌｉｓａ分析（図４）は、未処理細胞と比較して、ＢＭＰ−２処理細胞およびＢＭＰ−９処理細胞が、Ｃｏｌ２Ａ１、アグリコンおよび連結タンパク質を含む軟骨形成特異的遺伝子についての遺伝子発現における有意な増加を有したことを示した。このことは、ＣＤ１０５＋細胞が軟骨形成性分化を行うことを示唆する。対照的に、ＭＮＣおよびＣＤ１０５−細胞は、軟骨形成性の分化の証拠を示さなかった。
【００６９】
【表２】
（実施例１１：免疫組織化学）
免疫組織化学を、アルギネート中のＩＩ型コラーゲンタンパク質の存在を検出するために、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）に従って行った。培養物からのアルギネートビーズを、水で洗浄し、そして、不可逆的な重合のために１００ｍＭ塩化バリウム中で１０分間インキュベートした。次いで、ビーズを水で再度洗浄し、１０％緩衝化ホルマリン中で固定化し、パラフィン中に包埋した。アルギネートビーズの切片を、ヤギ抗ＩＩ型コラーゲン抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）とともにインキュベートした。切片を、ビオチン化抗ヤギ抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼＨ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともにインキュベートすることによって、免疫反応性を検出した。この切片をペルオキシダーゼ基質３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびＨ２Ｏ２で処理することによって、シグナルを発色させた。画像を、３５ｍｍスライドフィルム上に記録し、そして多パネルの図を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて作成した。実験コントロールは、非免疫一次抗体、続く二次抗体で染色したアルギネート切片からなった。結果は、未処理細胞と比較して、ＢＭＰ−２処理細胞およびＢＭＰ−９処理細胞が、ＩＩ型コラーゲンタンパク質の有意な存在を示したことを、示す。ＩＩ型コラーゲンタンパク質は、分化する細胞によるこのタンパク質の分泌、続いてアルギネートマトリクス中へのエントラップメントに起因して、細胞間領域に存在した。非免疫一次抗体で染色したアルギネート切片は、免疫反応性を何ら示さなかった。
【００７０】
本発明は、詳細に示され、そしてその好ましい実施形態に対する参照とともに記載されるが、形態における種々の変更および詳細が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を逸脱することなく本明細書中でなされ得ることは、当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】図１は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９による、時間依存様式での、軟骨形成マーカーの発現の誘導に関する。図１Ａ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブ、アグリカンプローブ、およびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。図１Ｂ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナル、アグリカンシグナル、およびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。レーン１、４および７−未処理細胞；レーン２、５および８−ｒｈＢＭＰ−２処理細胞；レーン３，６および９−ｒｈＢＭＰ−９処理細胞。
【図１Ｂ】図１は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９による、時間依存様式での、軟骨形成マーカーの発現の誘導に関する。図１Ａ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブ、アグリカンプローブ、およびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。図１Ｂ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナル、アグリカンシグナル、およびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。レーン１、４および７−未処理細胞；レーン２、５および８−ｒｈＢＭＰ−２処理細胞；レーン３，６および９−ｒｈＢＭＰ−９処理細胞。
【図２Ａ】図２は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９が、ＩＬ−１撤退後の軟骨形成マーカーの発現を逆転し得ることを示す。図２Ａ、総ＲＮＡが単離され、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブ、アグリカンプローブ、およびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。培養の１４日後のＣｏｌ２Ａ１、アグリカンおよびＳｏｘ−９の発現を示す（レーン１〜３）。培養物由来の細胞のアリコートを、取り出し、洗浄し、そして２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１を有する培地中で７２時間培養した（レーン４〜６）。ＩＬ−１で処理した細胞の細胞アリコートを、取り出し、洗浄し、そしてさらに９６時間、ＢＭＰの有りまたは無しで培養した（レーン７〜９）。ＢＭＰの有りまたは無しでの並行培養はまた、２１日の総培養期間の間維持された（レーン１０〜１２）。図２Ｂ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナル、アグリカンシグナル、およびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図２Ｂ】図２は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９が、ＩＬ−１撤退後の軟骨形成マーカーの発現を逆転し得ることを示す。図２Ａ、総ＲＮＡが単離され、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブ、アグリカンプローブ、およびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。培養の１４日後のＣｏｌ２Ａ１、アグリカンおよびＳｏｘ−９の発現を実証する（レーン１〜３）。培養物由来の細胞のアリコートを、取り出し、洗浄し、そして２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１を有する培地中で７２時間培養した（レーン４〜６）。ＩＬ−１で処理した細胞の細胞アリコートを、取り出し、洗浄し、そしてさらに９６時間、ＢＭＰの有りまたは無しで培養した（レーン７〜９）。ＢＭＰの有りまたは無しでの並行培養はまた、２１日の総培養期間の間維持された（レーン１０〜１２）。図２Ｂ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナル、アグリカンシグナル、およびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図３Ａ】図３は、ＩＬ−１の阻害効果を克服するＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の能力を示す。図３Ａおよび３Ｃ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブおよびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。細胞を２１日間処理せず（レーン１）、そして１４日間培養した未処理の細胞を、続いて、７日間、ＩＬ−１で処理した（レーン２〜４）。細胞を、１４日間ＢＭＰ−２で処理し（レーン５）、ＢＭＰ−２処理細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−２（レーン６〜８）か、またはＢＭＰ−２とＩＬ−１を共に（レーン９〜１７）のいずれかで、さらに７日間培養した。細胞を、ＢＭＰ−９で１４日間処理した（レーン１８）、ＢＭＰ−９処理した細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−９（レーン１９〜２１）か、またはＢＭＰ−９とＩＬ−１を共に（レーン２２〜３０）のいずれかで、さらに７日間培養した。図３Ｂおよび３Ｄ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナルおよびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図３Ｂ】図３は、ＩＬ−１の阻害効果を克服するＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の能力を示す。図３Ａおよび３Ｃ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブおよびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。細胞を２１日間処理せず（レーン１）、そして１４日間培養した未処理の細胞を、続いて、７日間、ＩＬ−１で処理した（レーン２〜４）。細胞を、１４日間ＢＭＰ−２で処理し（レーン５）、ＢＭＰ−２処理細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−２（レーン６〜８）か、またはＢＭＰ−２とＩＬ−１を共に（レーン９〜１７）のいずれかで、さらに７日間培養した。細胞を、ＢＭＰ−９で１４日間処理した（レーン１８）、ＢＭＰ−９処理した細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−９（レーン１９〜２１）か、またはＢＭＰ−９とＩＬ−１を共に（レーン２２〜３０）のいずれかで、さらに７日間培養した。図３Ｂおよび３Ｄ、走査デンシトメトリーによるｃｏｌ２Ａ１シグナルおよびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図３Ｃ】図３は、ＩＬ−１の阻害効果を克服するＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の能力を示す。図３Ａおよび３Ｃ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブおよびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。細胞を２１日間処理せず（レーン１）、そして１４日間培養した未処理の細胞を、続いて、７日間、ＩＬ−１で処理した（レーン２〜４）。細胞を、１４日間ＢＭＰ−２で処理し（レーン５）、ＢＭＰ−２処理細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−２（レーン６〜８）か、またはＢＭＰ−２とＩＬ−１を共に（レーン９〜１７）のいずれかで、さらに７日間培養した。細胞を、ＢＭＰ−９で１４日間処理した（レーン１８）、ＢＭＰ−９処理した細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−９（レーン１９〜２１）か、またはＢＭＰ−９とＩＬ−１を共に（レーン２２〜３０）のいずれかで、さらに７日間培養した。図３Ｂおよび３Ｄ、走査デンシトメトリーによるｃｏｌ２Ａ１シグナルおよびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図３Ｄ】図３は、ＩＬ−１の阻害効果を克服するＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の能力を示す。図３Ａおよび３Ｃ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブおよびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。細胞を２１日間処理せず（レーン１）、そして１４日間培養した未処理の細胞を、続いて、７日間、ＩＬ−１で処理した（レーン２〜４）。細胞を、１４日間ＢＭＰ−２で処理し（レーン５）、ＢＭＰ−２処理細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−２（レーン６〜８）か、またはＢＭＰ−２とＩＬ−１を共に（レーン９〜１７）のいずれかで、さらに７日間培養した。細胞を、ＢＭＰ−９で１４日間処理した（レーン１８）、ＢＭＰ−９処理した細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−９（レーン１９〜２１）か、またはＢＭＰ−９とＩＬ−１を共に（レーン２２〜３０）のいずれかで、さらに７日間培養した。図３Ｂおよび３Ｄ、走査デンシトメトリーによるｃｏｌ２Ａ１シグナルおよびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図４】図４は、アルギナート培養中のＣＤ１０５＋細胞による、軟骨特異的マーカーの遺伝子発現を示す。ヒト骨髄から単離されたＣＤ１０５＋細胞を、アルギナートにカプセル化し、そしてＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を補充した無血清培地（未処理）で、３週間培養した。ＩＩ型コラーゲン、アグリカンおよびリンクタンパク質についてのＲＴ−ＰＣＲ ｅｌｉｓａを、細胞から抽出したＲＮＡに対して実施した。バーは、３人のドナーの平均（＋ＳＥＭ）を示す。
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、結合組織および軟骨修復を含む組織修復の分野に関する。より詳細には、本発明は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）および軟骨形成において重要な役割を果たす組成物に関する。特に、本発明はまた、軟骨組織（例えば、関節軟骨）の誘導のためのＢＭＰの使用、およびＩＬ−１の阻害効果を部分的にブロックするための治療剤としてのＢＭＰの使用に関する。
【０００２】
本発明はさらに、組織修復において使用するための、骨髄から単離された非組織培養拡張細胞の使用に関する。本発明はさらに、骨髄から単離された非組織培養拡張細胞および軟骨組織（例えば、関節軟骨）の誘導のための骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む組成物に関する。
【０００３】
関節軟骨は、無血管性かつ無神経性であり、そして濃い細胞外マトリックス成分からなる特殊化した微小環境中に空間的に包埋された軟骨細胞からなる。軟骨細胞は、バランスのとれた同化機能および異化機能によって、軟骨の構造を維持する［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １（５）、９８９−９４（１９８９）］。軟骨傷害は、これらの機能のバランスを乱し、そして炎症性サイトカイン（インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む）の存在と関連する［Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｉｎｔ２（２）、４９−５３（１９８２）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２９（４）、４６１−７０（１９８６）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２９（２）、２６２−７３（１９８６）］。軟骨が外傷または疾患プロセスによって損傷される場合、関節軟骨はまた、限定された自発的修復応答を有する。
【０００４】
骨髄由来細胞成分は、前駆細胞の供給源であり、そしてその分化に必要な関連増殖因子であることによって、損傷した関節軟骨の修復において、重要な役割を果たす。外科的手順は、周りの環境がこれらの細胞の分化について適切な刺激を提供することを望んで、基礎をなす肋軟骨下の骨を貫通することによって、創傷した部位へ骨髄由来の間充織前駆細胞を補充することを目的とする。これらの手順は、通常、関節軟骨ではなく線維軟骨を生じる［Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４２、１３３１−１３４２（１９９８）；Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｄ Ｋｎｅｅ Ｊｏｉｎｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ（Ｅｗｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．編）、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）］。損傷した関節軟骨の修復には、損傷部位において、サイトカインおよび因子によるこれらの前駆細胞の動員および分化が必要である。複雑なインビボ環境が、軟骨への前駆細胞の形質転換において重要な分化因子の同定を困難にしている［Ｓｕｈら、Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ．７：２７０−２７８（１９９７）Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ．８０：１７９５−１８１２（１９９８）］。骨髄は、２つの細胞性成分からなる：非造血細胞とその直ぐ近位に存在する造血細胞。非造血区画内に、多能間充織特性を示す細胞集団が存在し、多能性間充織細胞（ＭＭＣ）［Ｍａｊｕｍｄａｒら、Ｊｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１８５：９８−１０６（２０００）；Ｍａｊｕｍｄａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２００１）１８９：２７５−２８４］、間充織幹細胞（ＭＳＣ）［Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８４：１４３−１４７（１９９９）］または間充織前駆細胞（ＭＰＣ）［Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２３８：２６５−２７２（１９９８）］。骨髄中に存在する間充織前駆細胞は、インビボおよびまたはインビトロの環境に適切に配置される場合に、複数の結合組織系統（骨芽細胞、軟骨細胞、タン細胞、脂肪細胞および筋細胞を含む）に分化する能力を有する［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９、１５２８−１５３０（１９９８）；Ｂｏｎｅ １９、４２１−４２８（１９９６）；Ｂｏｎｅ １３、８１−９５（１９９２）；Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４、４１５−４２８（１９９８）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｔｈｐｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６、４０６−４１３（１９９８）］。これらの骨髄由来の間充織細胞は、組織培養拡張後にのみ、多能間充織特徴を獲得する。ＭＭＣは、細胞表面マーカー（これらの細胞によって発現されるエンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）（ＣＤ１０５））を認識する免疫選択手順を使用して、ヒト骨髄から単離されている［Ｍａｊｕｍｄａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１８５：９８−１０６（２０００）］。
【０００５】
骨、軟骨、腱および骨中に存在する他の組織の形成を担う分子ならびに他の組織抽出物についての研究は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）と称される新規セットの分子の発見を導いた。とりわけ、いくつかのタンパク質（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１６と称される）の構造が、以前に解明されている。骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＧＦ−βおよびインスリン様増殖因子は、インビボおよびインビトロの両方において、軟骨形成を促進するか、または軟骨形成効果を示すことが示されている［Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８５（１）、９８−１０６（２０００）；Ｂｏｎｅ １９（補遺１）、１Ｓ−１２Ｓ（１９９６）；Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ（補遺３６７）、Ｓ１８６−２０３（１９９９）］。ＢＭＰは、元々鉱物質除去された骨において検出され、この鉱物質除去された骨から精製された、増殖および分化因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーの分泌分子である［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８５（２４）、９４８４−８（１９９８）］。２０種の哺乳動物ＢＭＰが同定され、そして３つのＩＩ型レセプターがＢＭＰに結合することが示されている［Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １０（１）、１６−２１（１９９４）］。ＢＭＰ結合は、リン酸化およびＳｍａｄ経路を介したシグナル伝達の前に、Ｉ型およびＩＩ型レセプターの二量体化を生じる［Ｂｏｎｅ １９（６）、５６９−７４（１９９６）］。ＢＭＰは、軟骨および骨の形成において重要な調節因子として機能することが示されており［Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７、７５３−９１（１９９８）］、そしてまた成体骨格系の修復および再構築においても機能することが示されている［Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３（１１）、１６５７−６８（１９８９）；Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １４（１０）、１７３４−４１（１９９９）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）］。
【０００６】
転写因子Ｓｏｘ−９は、ＢＭＰ−２シグナル伝達経路の下流の重要な媒介因子であることが示されている［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）］。Ｓｏｘ−９は、性決定領域Ｙ（Ｓｒｙ）のアミノ酸に高い相同性を有する、７９アミノ酸の高移動群型のＤＮＡ結合ドメインの存在によって特徴付けられる［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ７（３）、３３８−４４（１９９７）］。Ｓｏｘ−９は、胚発生の間にＣｏｌ２Ａ１の遺伝子のパターンと密接に対応するパターンで発現され［Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２０９（４）、３７７−８６（１９９７）；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １８３（１）、１０８−２１（１９９７）］そして軟骨マトリックス合成の間に発現され［Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３（１１）、１６５７−６８（１９８９）；Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １４（１０）、１７３４−４１（１９９９）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９（５４７７）、３１３−６（２０００）；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（２４）、１７９３７−４５（２０００）；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ７（３）、３３８−４４（１９９７）；Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２０９（４）、３７７−８６（１９９７）；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １８３（１）、１０８−２１（１９９７）；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １６（２）、１７４−８（１９９７）］、このことは、軟骨形成および骨格形成におけるＳｏｘ−９の役割を示唆する。Ｓｏｘ−９のアップレギュレーションが、不死化細胞株においてＣｏｌ２Ａ１およびアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）の両方の発現を増強することが示されている［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）］。ＩＬ−１およびＴＮＦを含む炎症促進性分子は、Ｃｏｌ２Ａ１およびアグレカンの発現を阻害する［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２）、１５１−１６０（２０００）；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８２（６）、２０２６−３７（１９９８）；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０５２（３）、３６６−７８（１９９０）；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６６（２）、３５１−９（１９９６）］。これらの炎症性サイトカインの阻害効果は、Ｓｏｘ−９のダウンレギュレーションによって媒介されることが報告されている［Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（５）、３６８７−９２（２０００）］。変形性関節症および慢性関節リウマチにおいて上昇したレベルで存在するＩＬ−１およびＴＮＦの阻害効果は、これらの疾患状態における軟骨の破壊に関与していた［Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｉｎｔ ２（２）、４９−５３（２０００）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２９（４）、４６１−７０（１９８６）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２９（２）、２６２−７３９（１９８６）；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（５）、３６８７−９２（２０００）］。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明によって、本出願人らは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９が、ヒト間充織前駆細胞の軟骨形成分化を促進することを実証した。本出願人らは、これらのＢＭＰの軟骨形成能が、ＩＬ−１の炎症効果を克服できたことをさらに実証した。ＢＭＰが関節の軟骨細胞によるマトリックス合成を刺激する能力および軟骨細胞表現型を維持する能力は、軟骨欠損修復および変形性関節症の予防／逆転、軟骨細胞表現型を含む重要な適用を示唆する。これらのＢＭＰは、軟骨の分化、増殖、維持および修復について特に有用であり得る。従って、本発明は、軟骨形成における、ＢＭＰを含む組成物および方法に関する。本発明はさらに、ＩＬ−１の炎症効果をブロックするかまたは部分的にブロックするためのＢＭＰの使用に関する。ＢＭＰおよび本発明において有用な他のタンパク質を、以下にさらに記載する。
【０００８】
本発明において、ＢＭＰを含む組成物は、軟骨修復を必要としている患者、または軟骨組織を含む疾患または欠損（例えば、変形性関節症）を有する患者に投与される。好ましい実施形態において、本発明は、有効量のＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物を含む。
【０００９】
この組成物において、タンパク質は、薬学的に受容可能なビヒクルと混合され得る。特定の実施形態において、この組成物はさらに、１以上のさらなるトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質または骨形態形成タンパク質を含み得る。ＢＭＰ関連タンパク質および別のＴＧＦ−βまたはＢＭＰの両方を含む組成物は、関節軟骨の処置のために特に有用であり得、ここで、関節表面、軟骨、肋軟骨下の骨および／または軟骨と骨との間の潮標（ｔｉｄｅｍａｒｋ）界面は、修復される必要があり得る。
【００１０】
本発明はまた、軟骨組織の治癒および組織修復のための方法、変形性関節症もしくは他の軟骨欠損を処置するための方法、ならびにこれらを必要とする患者における軟骨組織形成を誘導するための方法も含み、この方法は、有効量のＢＭＰ組成物をこの患者に投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、この方法において利用される組成物は、ＢＭＰ−２および／またはＢＭＰ−９を含む。本発明はまた、軟骨細胞または軟骨組織の誘導のために有用なタンパク質のアミノ酸配列を有する１つのモノマー、およびＴＧＦ−βサブファミリーの別のタンパク質のアミノ酸配列を有する１つのモノマーを含む、ヘテロ二量体タンパク質分子を含む。
【００１１】
本発明はさらに、軟骨形成能を有する、骨髄から単離された非組織培養拡張細胞を含む組成物に関する。好ましい実施形態において、非組織培養拡張細胞は、ＣＤ１０５＋細胞である。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ヒト骨髄から単離された非組織培養拡張細胞、ならびに軟骨および／または骨の形成を誘導するタンパク質を含む。骨髄および非組織培養拡張細胞から単離されたこれらの細胞は、ＢＭＰによって処理された場合、軟骨形成能を実証する。
【００１２】
好ましい実施形態において、非組織培養拡張細胞の処理のため、および本発明の他の実施形態における使用のための活性因子としては、タンパク質のトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーとして公知のタンパク質からなる群より選択される、１以上のタンパク質、好ましくは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）ならびに本明細書中でより完全に記載される他のタンパク質から選択される、１以上のタンパク質が挙げられる。本発明において有用な、骨形成タンパク質、ＤＮＡ配列、組成物およびこれらを作製する方法は、ＢＭＰタンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７（例えば、米国特許第５，１０８，９２２号；同第５，０１３，６４９号；同第５，１１６，７３８号；同第５，１０６，７４８号；同第５，１８７，０７６号；同第５，４５９，０４７号；同第５，８４９，８８０号および同第５，１４１，９０５号に開示される）；ＢＭＰ−８（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０９８に開示される）；およびＢＭＰ−９（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示される）、ＢＭＰ−１０（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６８９３に開示される）；ＢＭＰ−１１（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６８９２に開示される）、またはＢＭＰ−１２もしくはＢＭＰ−１３（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１６０３５に開示される）、またはＢＭＰ−１５（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３６７１０に開示される）もしくはＢＭＰ−１６（１９９６年９月１８日出願の、同時係属中の特許出願番号０８／７１５／２０２に開示される）を含む。好ましい実施形態において、このＢＭＰは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される。
【００１３】
さらに有用であり得る他のＤＮＡ分子およびそれらがコードするタンパク質としては、Ｖｇｒ−２、ならびに任意の増殖因子および分化因子［ＧＤＦ］（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１５９６５；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１；ＷＯ９５／０１８０２；ＷＯ９４／２１６８１；ＷＯ９４／１５９６６などに開示されるものを含む）をコードするものが挙げられる。さらに本発明において有用であるのは、ＢＩＰ（ＷＯ９４／０１５５７に開示される）；ならびにＭＰ５２（ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１６０９９に開示される）であり得る。上記の出願全ての開示は、その中に含まれる開示について、本明細書によって参考として援用される。
【００１４】
有用であり得る他のＤＮＡ分子およびそれらがコードするタンパク質としては、増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質（例えば、ソニック（ｓｏｎｉｃ）ｈｅｄｇｅｈｏｇ、インドｈｅｄｇｅｈｏｇおよび砂漠ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、副甲状腺ホルモンおよび副甲状腺ホルモン関連ペプチド、カドヘリン、アクチビン、インヒビン、およびＩＧＦ、ＦＳＨ、ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、ｆｒｚｂタンパク質、ｆｒａｚｚｌｅｄタンパク質、ＰＤＧＦおよび他の内皮増殖因子）、ＢＭＰ結合タンパク質（例えば、コルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）およびフェツイン（ｆｅｔｕｉｎ））、エストロゲンおよび他のステロイド、ならびにこれらの短縮バージョン、ならびに転写因子（例えば、ｗｎｔタンパク質、ｍａｄ遺伝子およびｃｂｆａ）が挙げられる。
【００１５】
上記で同定された出願の開示は、参考として本明細書中に本明細書によって援用される。これらのタンパク質の骨における存在と共に、これらのタンパク質の特有の誘導性の活性は、これらのタンパク質が、骨修復プロセスおよび軟骨修復プロセスの重要な調節因子であり、そして骨組織の正常な維持に関与し得ることを示唆する。
【００１６】
本発明の単離された細胞は、ＢＭＰまたは他の軟骨誘導タンパク質を用いて処理され得る。さらなる実施形態において、ＢＭＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、当業者に公知の方法を用いてこれらの細胞中に取り込まれ得る。
【００１７】
拡張せずに骨髄から直接単離された細胞が、いくつかの理由のために治療目的に対して好ましい。第１に、接着に基づく選択は、軟骨形成の潜在性と必ずしも関連付けられることが今まで示されていない特徴を示す細胞の部分集団を優先的に選択する。それらが接着ができないことに基づいて、軟骨形成の可能性を有する潜在的な重要な細胞部分集団を破棄してしまう可能性が減少される。細胞拡張の間の分化因子に対するインビトロ応答が、細胞表面特徴を変化させ得、それらの細胞を宿主に対して免疫原性にし、そして移植後に対宿主性移植片反応を引き起こすことという可能性はある。最後に、本発明によって、ＣＤ１０５＋細胞の軟骨形成分化が、細胞の培養および／または細胞の拡張に依存しないことが実証された。従って、無血清条件のＢＭＰの存在下における３次元マトリクス中でのヒト骨髄由来ＣＤ１０５＋細胞の軟骨形成分化に基づいて、本発明は、関節軟骨の修復のために移植される骨髄由来自己細胞を利用する、臨床移植プロトコルを特徴とする。このプロトコルは、長期であり、高価であり、そして面倒な細胞の培養拡張を排除する。
【００１８】
従って、本発明は、ヒト骨髄から単離され、そしてアルギネートの３次元マトリクス中に直接カプセル化され、そして無血清培地中で培養された、ＣＤ１０５＋細胞をさらに特徴とする。従って、本発明の組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルまたは適切なマトリクスをさらに含み得る。
【００１９】
本発明はまた、軟骨組織治癒および軟骨組織修復を必要とする患者において軟骨組織治癒および軟骨組織修復のための方法、変形性関節症または他の軟骨欠損の処置を必要とする患者において変形性関節症または他の軟骨欠損を処置するための方法、ならびに軟骨組織形成の誘導を必要とする患者においてにおいて軟骨組織形成を誘導するための方法を含み、これらの方法は、本発明の組成物の有効量を上記の患者に投与する工程を包含し、この組成物は、骨髄から単離され、組織培養で拡張されていない細胞、ならびに骨誘導タンパク質および／または軟骨誘導タンパク質を含む。好ましい実施形態において、この組成物は、ＣＤ１０５＋細胞およびＢＭＰを含む。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＣＤ１０５＋細胞および有効量のＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物を投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、細胞と同時にかまたはその後に、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物の有効量をこの患者に投与する工程を包含する。
【００２１】
初代幹細胞および前駆細胞を用いて種々の臨床適用が提唱されている［Ｆｕｃｈｓら、Ｃｅｌｌ．１００：１４３−１５５（２０００）］。間葉細胞治療が、培養で拡張した細胞を用いる種々の組織修復に対して提唱されている［Ｃａｐｌａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．９：６４１−６５０（１９９１）］。本発明は、細胞に基づく組織修復の臨床適用を拡張し、それらの細胞のインビトロ操作を最小化する手順が有利である。本発明によって示されるように、培養による拡張を伴なわない間葉細胞の分化潜在性は、結合組織疾患の臨床治療を提供する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、軟骨形成性分化を促進するＢＭＰを含む組成物に関する。これらの組成物は、変形性関節症に関連した生理学的レベルのＩＬ−１の存在下で、軟骨特異的細胞外マトリクス分子の発現を維持し得る。本発明は、さらに、これらの組成物を利用する方法に関する。これらの組成物および方法に好ましいＢＭＰは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９である。ＢＭＰ−２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびＢＭＰ−２のアミノ酸配列、ならびにこれらを調製する方法は、米国特許第５，０１３，６４９号の実施例に記載され、その開示は、本明細書中で参考として援用される。ＢＭＰ−９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびＢＭＰ−９のアミノ酸配列は、ＷＯ９３／００４３２に開示され、その開示は、本明細書中で参考として援用される。
【００２３】
本発明はまた、骨髄から単離された、非組織培養拡張された細胞（これは、軟骨形成能を有する）を含む組成物に関する。好ましい実施形態では、非組織培養拡張された細胞は、ＣＤ１０５＋細胞である。さらなる実施形態では、本発明の組成物は、ヒト骨髄から単離された、非組織培養拡張された細胞、ならびに軟骨および／または骨の形成を誘導するタンパク質を含む。骨髄から単離され、そして非組織培養拡張された、これらの細胞は、ＢＭＰで処理した場合、軟骨形成能を示す。本発明により、本出願人らは、これらの細胞が、軟骨修復を含む結合組織疾患の臨床的処置に重要な、前駆体細胞の供給源となる可能性を有することを示した。従って、単離された細胞は、ＢＭＰタンパク質で処理され得る。さらなる実施形態では、ＢＭＰをコードする配列が、細胞に組み込まれ得る。
【００２４】
本発明の組成物および方法は、軟骨組織または他の組織が、通常形成されず、そして軟骨の治癒（例えば、ヒトおよび他の動物における、関節軟骨の断裂、変形および他の軟骨欠損）に関する適用を有する状況において、軟骨組織または他の組織の形成の誘導に関する適用を見出す。タンパク質を誘導する軟骨組織を用いるこのような調製物は、軟骨組織に対する損傷を防ぐことに関する予防的用途、ならびに骨または他の組織に対する軟骨の改善された固定に関する用途、および軟骨組織に対する欠損を修復することに関する用途を有し得る。本発明の組成物により誘導された新規の軟骨組織形成は、先天性軟骨欠損、外傷誘発性軟骨欠損、または他の起源の他の軟骨欠損の修復に寄与し、そして軟骨の付着または修復のための手術に有用である。本発明の組成物はまた、関節炎および他の軟骨欠損の処置に有用であり得る。本発明の組成物はまた、軟骨組織を治癒または再生することが望ましい他の適応症に用いられ得る。このような適応症としては、関節軟骨に対する損傷の再生または修復が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、軟骨形成細胞を誘引するか、軟骨形成細胞の増殖を刺激するか、または軟骨形成細胞の前駆体の分化を誘導する環境を提供し得る。
【００２５】
本発明の方法に有用なタンパク質は、軟骨組織の形成を誘導し得る。軟骨組織とは、軟骨細胞、および軟骨細胞により形成される組織を意味し、これらは軟骨の組織学的特徴および組成上の特徴を示す。これらのタンパク質は、以下に記載されるアッセイにおいて軟骨組織形成活性を示す能力により、さらに特徴付けされ得る。これらのタンパク質が、他の型の組織（例えば、腱および靱帯）の形成を誘導する能力を有し得ることが意図される。
【００２６】
本発明の軟骨組織形成を誘導するための組成物は、タンパク質を誘導する有効量の軟骨組織を含み得る。好ましい実施形態では、活性な薬剤は、本明細書中でさらに十分に記載されるような、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのタンパク質として公知のタンパク質の群から選択される（好ましくは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）、ならびに他のタンパク質から選択される）１つ以上のタンパク質である。本発明において有用な、骨形成タンパク質、ＤＮＡ配列、組成物、およびこれらを作製する方法は、ＢＭＰタンパク質である、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７（例えば、米国特許第５，１０８，９２２号；同第５，０１３，６４９号；同第５，１１６，７３８号；５，１０６，７４８号；同第５，１８７，０７６号；同第５，４５９，０４７号；同第５，８４９，８８０号；および同第５，１４１，９０５号に開示される）；ＢＭＰ−８（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０９８に開示される）；ならびにＢＭＰ−９（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示される）；ＢＭＰ−１０（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６８９３に開示される）；ＢＭＰ−１１（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６８９２に開示される）、またはＢＭＰ−１２もしくはＢＭＰ−１３（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１６０３５に開示される）、またはＢＭＰ−１５（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３６７１０に開示される）またはＢＭＰ−１６（１９９６年９月１８日に出願された、同時係属特許出願番号０８／７１５／２０２に開示される）を含むものである。これらの組成物および方法に好ましいＢＭＰは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９である。ＢＭＰ−２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびＢＭＰ−２のアミノ酸配列、ならびにこれらを調製する方法は、例えば、米国特許第５，０１３，６４９号（その開示は本明細書中で参考として援用される）に開示される。ＢＭＰ−９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびＢＭＰ−９のアミノ酸配列は、例えば、ＷＯ９３／００４３２（その開示は本明細書中で参考として援用される）に開示される。
【００２７】
他のＤＮＡ分子およびこのＤＮＡがコードするタンパク質（これらもまた有用であり得る）としては、Ｖｇｒ−２、および任意の増殖および分化因子［ＧＤＦ］（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１５９６５；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１；ＷＯ９５／０１８０２；ＷＯ９４／２１６８１；ＷＯ９４／１５９６６などに開示されるものを含む）をコードするものが挙げられる。ＢＩＰ（ＷＯ９４／０１５５７に開示される）；およびＭＰ５２（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１６０９９に開示される）もまた本発明において有用であり得る。上記の出願の全ての開示は、これらに含まれる開示について本明細書中で参考として援用される。
【００２８】
タンパク質は、他の関連するタンパク質および増殖因子と協力して、または、恐らく、相乗的に作用することが予想される。ＢＭＰタンパク質をコードするＤＮＡに加えて、他のＤＮＡ分子、およびこのＤＮＡがコードするタンパク質（これらも有用である得る）としては、以下を含む、他の治療的に有用な薬剤をコードするＤＮＡ分子が挙げられる：増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、白血病阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ））、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１１）、ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）タンパク質（例えば、ソニック（ｓｏｎｉｃ）ヘッジホッグ、インディアン（ｉｎｄｉａｎ）ヘッジホッグおよびデザート（ｄｅｓｅｒｔ）ヘッジホッグ）、副甲状腺ホルモンおよび副甲状腺ホルモン関連ペプチド、カドヘリン、アクチビン、インヒビン、ならびにＩＧＦ、ＦＳＨ、ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、ｆｒｚｂタンパク質、またはｆｒａｚｚｌｅｄタンパク質，ＰＤＧＦおよび他の上皮増殖因子、ＢＭＰ結合タンパク質（例えば、コルジン（ｃｈｏｒｄｉｎ）およびフェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ））、エストロゲンおよび他のステロイド、およびその短縮型バージョン、ならびに転写因子（例えば、ｗｎｔタンパク質、ｍａｄ遺伝子、およびｃｂｆａ）。これらの薬剤の部分もまた、本発明の組成物に用いられ得る。このような組成物は、軟骨と骨の間の接合部の欠損（これは、連続する解剖学的位置で同時に生じる）を処置するために有用であり得、そして骨に付着した軟骨の部位での組織の再生に有用であり得る。
【００２９】
上記で確認される出願の開示は、本明細書中で参考として援用される。これらのタンパク質の固有の誘導活性は、骨におけるこれらの存在と共に、これらが、骨および軟骨の修復プロセスの重要な調節因子であり、そして骨組織の通常の維持に関与し得ることを示唆する。
【００３０】
本明細書中で提供される軟骨組織誘導タンパク質はまた、天然に存在するタンパク質の配列に類似する配列によりコードされる因子を含むが、このタンパク質に対する改変は、天然で提供され得る（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸変化を生じ得るヌクレオチド配列中の対立遺伝子改変体）か、または故意に操作され得る。例えば、合成ポリペプチドは、タンパク質のアミノ酸残基の連続する配列を、完全に複製し得るか、または部分的に複製し得る。これらの配列は、一次構造、二次構造、または三次構造および立体配座特徴を、天然に存在するタンパク質の軟骨組織増殖因子ポリペプチドまたは軟骨組織維持因子ポリペプチドと共有することにより、これらに共通する、軟骨組織または他の組織の増殖因子または成長因子の生物学的特性を保有し得る。従って、これらは、治療用組成物および治療プロセスにおける、天然に存在する軟骨組織誘導性ポリペプチドおよび軟骨組織維持ポリペプチドの、生物学的に活性な代用物として用いられ得る。
【００３１】
本明細書中に記載される軟骨組織誘導性タンパク質の配列の他の特異的変異は、グリコシル化部位の改変に関与する。これらの改変は、Ｏ連結グリコシル化部位またはＮ連結グリコシル化部位に関与し得る。例えば、グリコシル化の欠如または部分的のみのグリコシル化は、アスパラギンが連結したグリコシル化認識部位でのアミノ酸の置換または欠失から生じる。このアスパラギンが連結したグリコシル化認識部位は、適切な細胞性グリコシル化酵素により特異的に認識される、トリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、アスパラギン−Ｘ−セリン、またはアスパラギン−Ｘ−システインであり得、ここで、Ｘは、通常、プロリンを除く任意のアミノ酸である。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の１つまたは両方での種々のアミノ酸置換または欠失（および／あるいは第２の位置でのアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列においてグリコシル化を生じない。さらに、タンパク質の細菌発現はまた、たとえグリコシル化部位が改変されていなくとも、非グリコシル化タンパク質の産生を生じる。
【００３２】
このような生理学的に受容可能なタンパク質組成物の調製および処方（ｐＨ、等張性、安定性などに関して適切である）は、当業者の範囲内である。治療用組成物はまた、ＴＧＦ−βタンパク質における種特異性の欠如に起因して、獣医学的適用のために現在価値がある。特に、ヒトに加えて、家畜動物およびサラブレッドウマは、本発明の組成物を用いるこのような処置について、望ましい患者である。
【００３３】
治療方法は、この組成物を、注射可能物および／またはインプラントまたはデバイスとして、局所的、全身に、または局部的に投与する工程を包含する。投与される場合、本発明における使用のための治療組成物は、当然のことながら、発熱物質を含まず、生理学的に受容可能な形態である。さらに、この組成物は、望ましくは、組織損傷の部位に送達するために、カプセル化され得るかまたは粘性形態で注射され得る。局所的投与は、創傷治癒および組織修復に適切であり得る。やはり上記の組成物に必要に応じて含まれ得るタンパク質以外の治療的に有用な薬剤は、代替的にまたはさらに、本発明の方法においてこの組成物を同時にまたはこの組成物と連続して投与され得る。さらに、本発明の組成物は、軟骨傷害の現在利用可能な処置（例えば、縫合（例えば、ビクリル縫合、外科的腸縫合（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ））または軟骨異型移植片もしくは自己移植片）とともに、縫合または移植片の治癒可能性を増強または促進するために、使用され得る。例えば、縫合、異型移植片または自己移植片は、移植前に、本発明の組成物中に浸漬され得る。タンパク質または本発明の組成物を、例えば、凍結乾燥により、縫合材料に組み込むこともまた可能である。
【００３４】
上記のように、本発明の組成物は、多くの軟骨欠損を処置するための方法（例えば、軟骨損傷の領域における軟骨組織の再生）において使用されて、軟骨組織の断裂および種々の他の型の組織欠損または創傷の修復を補助し得る。これらの方法は、本発明の方法に従って、このような軟骨組織または他の組織修復の必要な患者に、軟骨組織誘導タンパク質（例えば、その開示が、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９５／１６０３５に記載されるタンパク質）の有効量を含む組成物を投与する工程を包含する。これらの方法はまた、上記のＢＭＰタンパク質の少なくとも１つとともに、軟骨組織誘導タンパク質の投与を包含する。
【００３５】
別の実施形態において、この方法は、モノマーの１つが軟骨組織誘導ＢＭＰポリペプチドであり、第２のモノマーが、増殖因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであるヘテロダイマータンパク質の投与を包含し得る。さらに、これらの方法はまた、他の増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、およびＩＧＦを含む）とともに、軟骨組織誘導タンパク質の投与を包含する。
【００３６】
従って、本発明のさらなる局面は、軟骨組織を修復するための治療的方法および組成物、ならびに関節炎および関節炎に関連する他の状態を処置することである。このような組成物は、薬学的に受容可能なビヒクル、キャリアまたはマトリクスと混合された状態で、１以上の軟骨組織誘導タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９）の治療的有効量を含む。
【００３７】
培養により拡張されたＭＭＣは、関節の軟骨修復の部位に軟骨形成性増殖因子を送達するために操作され得る。従って、ＭＭＣとＢＭＰの組み合わせは、臨床的軟骨修復手順を提供し得、かつこの手順を大きく改良し得る。
【００３８】
本発明の実施形態のための投薬レジメンは、組成物の作用を改変する種々の要因（例えば、形成することが所望される軟骨組織の量、軟骨組織損傷の部位、損傷を受けた軟骨組織の状態、創傷のサイズ、損傷を受けた組織の型、患者の年齢、性別および食餌、任意の感染の重篤性、投与の時間および他の臨床的要因）を考慮に入れて、主治医により決定される。この投薬量は、再構成に使用されるマトリクスの型および組成物中のさらなるタンパク質の型によって変化し得る。最終組成物への他の公知の増殖因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ））の添加はまた、投薬量に影響を及ぼし得る。概して、軟骨組織の形成を誘導するに有用な組換えＢＭＰタンパク質の量は、容積で約２０ｃｃの欠損について約１〜約１００μｇの量にある。概して、軟骨組織の維持を誘導するために有用な組換えＢＭＰタンパク質の量は、溶液１ｍｌあたり約１〜約１０００ｎｇの量にある。
【００３９】
関節の軟骨損傷を含む種々の状態の処置が必要な患者の同定は、当該分野で周知の手順により達成され得る。これらの手順は、複式エネルギーＸ線吸収測定（ｄｕａｌ ｅｎｅｒｇｙ Ｘ−ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）（ＤＥＸＡ）（Ｋｉｌｇｕｓら、Ｊ．Ｂｏｎｅ ＆ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，７５−Ｂ：２７９−２８７（１９９２）；Ｍａｒｋｅｌら、Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ，６１：４８７−４９８（１９９０））；および定量的コンピュータ連動断層撮影（ＱＣＴ）（Ｌａｖｅｌ−Ｊｅａｎｔｅｔら、Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ａｓｓｉｓｔ Ｔｏｍｏｇｒ，１７：９１５−９２１（１９９３）；Ｍａｒｋｅｌ，Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ，４９：４２７−４３２（１９９１））；シングルフォトン吸収測定（ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）（Ｍａｒｋｅｌら、Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ，４８：３９２−３９９（１９９１））；超音波伝達速度（ＵＴＶ）（Ｈｅａｎｅｙら、ＪＡＭＡ，２６１：２９８６−２９９０（１９８９）；Ｌａｎｇｔｏｎら、Ｃｌｉｎ Ｐｈｙｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｍｅａｓ，１１：２４３−２４９（１９９０））；ならびにｘ線評価（ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（Ｇｌｕｅｒら、Ｊ．Ｂｏｎｅ＆Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ，９：６７１−６７７（１９９４））を使用する骨質量／骨密度の測定を含む。他の同定方法は、当業者に公知である。上記の刊行物は、本明細書中に参考として援用される。
【００４０】
進行は、軟骨組織形成、または軟骨組織増殖および／もしくは軟骨組織修復の定期的評価によりモニターされ得る。この進行は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｘ線、関節鏡検査、組織形態決定およびテトラサイクリン標識）によりモニターされ得る。
【００４１】
拡張させずに骨髄から直接単離した細胞は、いくつかの治療的利点を有する。接着に基づく選択は、軟骨形成能力と必ず相関することを決して示さない特徴を示す細胞亜集団を優先的に選択する。細胞の接着する能力に基づいて、軟骨形成能力を有する細胞の潜在的に重要な亜集団を除く可能性が減少される。培養拡張の間の分化因子に対するインビトロでの応答は、細胞表面特徴を改変し得、このことは、細胞を宿主に対して免疫原性にし、移植後に対宿主性移植片応答を生じさせる。最後に、本発明により、ＣＤ１０５＋細胞の軟骨形成性分化は、細胞の培養および／または拡張に依存しないことが実証された。無血清条件にてＢＭＰの存在下で３次元マトリクスにおけるヒト骨髄由来ＣＤ１０５＋細胞の軟骨形成性分化に基づいて、従って、本発明は、関節軟骨の修復のための移植された骨髄由来自己細胞を使用する臨床的移植プロトコルを特徴とする。このプロトコルは、長時間にわたる、高価かつ労力を要する細胞の培養拡張を排除する。
【００４２】
本発明は、ヒト骨髄から単離したＣＤ１０５＋細胞を拡張させ、およびアルギン酸の３次元マトリクス中に直接カプセル化し、無血清培地中で培養される非組織培養をさらに特徴とする。従って、さらなる実施形態は、適切なマトリクスを含む。
【００４３】
本発明は、軟骨性組織治癒および軟骨組織修復のため、変形性関節症または他の軟骨欠損を処置するため、および軟骨組織形成の必要がある患者において軟骨組織形成を誘導するための方法を包含し、この方法は、骨髄から単離した非組織培養拡張細胞ならびに骨および／または軟骨誘導タンパク質を含む本発明の組成物の有効量を、この患者に投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、この組成物は、非組織培養拡張ＣＤ１０５＋細胞およびＢＭＰを含む。好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤ１０５＋細胞および有効量のＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物を含む。この方法は、細胞または引き続き有効量の、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を含む組成物を同時にこの患者に投与する工程を包含する。
【００４４】
初代幹細胞および前駆体細胞を使用する種々の臨床的用途が提唱されてきた［Ｆｕｃｈｓら、Ｃｅｌｌ．１００：１４３−１５５（２０００）］。間葉細胞治療は、培養拡張細胞を使用した種々の組織修復のために提唱されてきた［Ｃａｐｌａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．９：６４１−６５０（１９９１）］。本発明は、細胞ベースの組織修復の臨床的適用を拡げ、これら細胞のインビトロ操作を最小にする手順は有利である。本発明により示されるように培養拡張を伴わない間葉細胞の分化能力は、結合組織疾患の臨床的処置を提供する。
【００４５】
本発明の組成物は、キャリアとして適切なマトリクスおよび／または金属イオン封鎖剤を含み得る。例えば、このマトリクスが、この組成物を支持し得るか、または軟骨組織形成および／または他の組織形成のための表面を提供し得る。このマトリクスは、タンパク質の遅い放出および／またはその提示のための適切な環境を提供し得る。金属イオン封鎖剤は、注射または他の手段を介して投与を容易にすることに役立つ物質であり得るか、または適用の部位からタンパク質の移動を遅くし得る。
【００４６】
キャリア材料の選択は、生体適合性、生体分解性、機械的特性、審美的外観、および界面特性に基づく。この組成物の特定の適用により、適切な処方が規定される。この組成物の潜在的なマトリクスは、生体分解性かつ化学的に規定され得る。さらにマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクス成分から構成される。他の潜在的なマトリクスは、非生体分解性かつ化学的に規定される。好ましいマトリクスとしては、Ｈｅｌｉｓｔａｔ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，Ｎ．Ｊ．）のようなコラーゲンベースの材料（スポンジを含む）または注射可能な形態のコラーゲン、ならびに例えば、ヒアルロン酸由来の金属イオン封鎖剤（生体分解性であり得る）が挙げられる。生体分解性材料（例えば、セルロースフィルムまたは手術用メッシュ）はまた、マトリクスとして役立ち得る。このような材料は、傷害部位に縫合されるかまたは軟骨の周りに巻きつけられ得る。
【００４７】
キャリアの別の好ましいクラスは、ポリマーマトリクスであり、これらのマトリクスとしては、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）のポリマー、および乳酸とグリコール酸とのコポリマーが挙げられる。これらのマトリクスは、スポンジの形態または多孔性粒子の形態であり得、そしてまた金属イオン封鎖剤を含み得る。適切なポリマーマトリクスは、例えば、Ｗ０９３／０００５０（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００４８】
本願の実施において有用なさらなる適切な組成物としては、例えば、マンニトール、スクロース、ラクトース、グルコースまたはグリシンのような凍結保護剤（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ）（凍結乾燥の間にタンパク質が変性するのを防ぐため）、抗微生物性防腐剤（例えば、メチルパラベンおよびプロピルパラベン、ならびにベンジルアルコール）；抗酸化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、クエン酸およびＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）；ならびに界面活性剤（例えば、ポリ（ソルベート）およびポリ（オキシエチレン））が挙げられる。
【００４９】
金属イオン封鎖剤の好ましいファミリーとしては、血液、フィブリン凝固および／またはアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）のようなセルロース材料（メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる）が挙げられ、最も好ましくは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン性塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤としては、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。本明細書中で有用な金属イオン封鎖剤の量は、処方物の総重量に基づいて、０．５〜２０ｗｔ％、好ましくは、１〜１０ｗｔ％である。これは、ポリマーマトリクスからタンパク質の脱着を防止し、組成物の適切な取り扱いを提供するために必要な量を表すが、前駆体細胞が、マトリクスに浸潤することを妨げるほどではなく、それによりこのタンパク質に前駆体細胞の活性を補助する機会を提供する。
【００５０】
本発明の特定の実施形態において、組成物の成分は、再吸収性ポリマー送達系（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはそれらのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリオルトカーボネート、および他のポリマー）にカプセル化され得る。適切なポリマーは、ＥＰ ０１４５２４０中の実施例に開示され、この開示は、本明細書中に参考として援用される。あるいは、ＢＭＰは、リポソーム中にカプセル化され得る。例えば、ＴＧＦ−βタンパク質のリポソーム送達は、米国特許第５，２０６，０２３号、同第５，２７０，３００号、および同第５，３６８，８５８号に開示され、これらの開示の各々は、本明細書中に参考として援用される。これらの送達系はともに、後にまたはより持続した期間にわたりＢＭＰの放出を提供するように改変され得、軟骨細胞および軟骨維持に対するＢＭＰの有利な効果が、軟骨細胞および軟骨組織の誘導に対するＢＭＰの有利な効果を補足するように作用させる。
【００５１】
本発明のタンパク質および組成物はまた、細胞集団（例えば、胚細胞または幹細胞の集団）を処理して、これらの細胞の増殖、分化および／または維持を増強または高めるために有用であり得る。処置された細胞集団は、遺伝子治療適用に有用であり得る。
【００５２】
以下の実施例は、ＢＭＰがヒト間葉前駆体細胞の軟骨形成性分化を促進することおよびこれらＢＭＰがＩＬ−１の炎症性効果を克服する能力を実証することにおいて、本発明の実施を例示する。
【００５３】
以下の実施例は、ＢＭＰが非組織培養拡張ヒト間葉前駆体細胞の軟骨形成性分化を促進することを実証することにおいて、本発明の実施をさらに例示する。
【００５４】
（実施例１：ＭＭＣの単離および培養拡張）
ヒトＭＭＣを以前報告された手順［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １７６，５７−６６９（１９９８）］に従って単離した。単球（ＭＮＣ）を、以前報告された手順［Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８５（１），９８−１０６（２０００）］の改変に従って、ヒト骨髄サンプルから単離した。骨髄サンプル中の有核細胞全てを、単離緩衝液（カルシウムおよびマグネシウム非含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．６％クエン酸ナトリウムおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を使用して、１ｍｌあたり７×１０６細胞の濃度に希釈した。３０〜３５ｍｌの希釈細胞懸濁液を、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に重層し、８００×ｇにて２０分間遠心分離した。ＭＮＣを回収し、計数し、磁性活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）緩衝液（０．５％ ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ，ｐＨ７．２）で洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液中にて２〜４×１０８細胞／ｍｌに再懸濁した。１×１０８のＭＮＣを、０．２ｍｌの抗ヒトＣＤ１０５抗体−マイクロビーズとともに４℃にて４５分間インキュベートし、ＣＤ１０５＋細胞を、ＭＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して製造業者の推奨に従って単離した。ＣＤ１０５−細胞を、カラム溶出液として回収する一方、ＣＤ１０５＋細胞を、カラムに結合させたままにした。ＣＤ１０５＋細胞を、磁石からはずし、細胞をＭＡＣＳ緩衝液を使用して流すことにより、カラムから回収した。ＣＤ１０５＋細胞を、１８５ｃｍ２ Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｏｌｏフラスコ（Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）中に、１フラスコあたり５〜７．５×１０５細胞の密度にて入れて、α−ＭＥＭ（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）および１％抗真菌性抗生物質を補充した）からなる完全培地中で３７℃にて、空気中５％ＣＯ２で培養した。培地を４８時間後に交換し、その後は３〜４日ごとに交換した。１４日目に、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡとともにインキュベートすることにより細胞を剥がし（初代（ｐ０）と称する）、１フラスコあたり１×１０６細胞の密度にて拡張するために、継代１細胞として、再び入れた。この細胞は、６日から７日で９０％コンフルエントに達し、その後、この細胞を、上記のように継代するか、または他のアッセイにおいて使用するか、または将来使用するために液体窒素中で、９０％ ＦＢＳおよび１０％ ジメチルスルホキシド中に保存するかのいずれかであった。この研究のために使用した細胞は、継代２または継代３から得た。ＣＤ１０５＋細胞は、間葉起源であり、多能性分化能を有するので、ＣＤ１０５＋細胞をＭＭＣと称した。
【００５５】
（実施例２：アルギン酸中でのＭＭＣの培養）
ＭＭＣを、以前報告した手順［Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８５（１），９８−１０６（２０００）］に従ってアルギン酸中にカプセル化した。簡潔には、ＭＭＣを、剥がし、洗浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０）を使用して洗浄し、洗浄緩衝液中に１．２％アルギン酸中で２５×１０６／ｍｌの密度に再懸濁した。細胞懸濁液の個々のビーズを、２０ゲージ針を介して、１０２ｍＭ ＣａＣｌ２および２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）を含む溶液へと直ぐに移した。このビーズを、１０分間重合させ、洗浄緩衝液中で１回洗浄し、完全培地中で３回洗浄し、同じ培地中で、空気中５％ＣＯ２により３７℃にて一晩培養した。翌日、この培地を、化学的に規定された培地（高グルコース、１００ｎＭ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸−２−ホスフェート（ＷＡＫＯ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０μｇ／ｍｌ プロリン（Ｓｉｇｍａ）、１％ ＩＴＳ−Ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）および１００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２もしくはｒｈＢＭＰ−９を含有するＤＭＥＭからなる）に交換した。この培地を、翌２〜３週にわたり１週間に２回交換した。ＲＮＡを、培養の間に種々の時間間隔で遺伝子の発現を試験するために細胞から単離した。
【００５６】
ＩＬ−１研究に関して、軟骨形成性分化のために、ＢＭＰ含有または非含有無血清培地にて１４〜２１日間、アルギン酸中でＭＭＣを培養した。１４日目、ビーズを洗浄し、２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有する培地中で、先の研究［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １７６，５７−６６（１９９８）］において報告したように、７２時間培養した（１７日目）。再び、ビーズを洗浄し、ＢＭＰ含有培地中で９６時間培養した（２１日目）。ＲＮＡを１４日目、１７日目および２１日目に細胞から単離した。次の研究において、ＭＭＣをアルギン酸ビーズ中で１４日間培養し、引き続いてＢＭＰ単独、ＩＬ−１単独、またはＩＬ−１とＢＭＰの種々の組み合わせにて、さらに７日間培養した。ＲＮＡを、１４日目および２１日目に細胞から単離した。
【００５７】
別の研究において、拡張させた細胞を、３次元アルギン酸マトリクス中にカプセル化し、ＩＬ−１１とＢＭＰ−９ありまたはなしで無血清培地中で培養して、軟骨形成性分化を受けるそれらの能力について分析した。
【００５８】
（実施例３：ＲＮＡ調製およびノーザンブロット分析）
培養拡張ＭＭＣをアルギン酸ビーズにカプセル化し、無血清培地中で培養した。ＲＮＡ単離に関して、ビーズを細胞回収緩衝液（５５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．０）に移し、４℃にて１０分間インキュベートし、細胞をアルギン酸マトリクスから放出し、１４００×ｇにて１５分間、４℃で遠心分離して、細胞を回収した。総ＲＮＡを、以前報告した手順［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １７６，５７−６６（１９９８）］により細胞ペレットから調製した。簡潔には、細胞ペレットを、溶解緩衝液（４Ｍ グアニジウムイソチオシアネート、０．０３Ｍ 酢酸ナトリウムおよび０．４ｇ／ｍｌ 塩化セシウム）中に再懸濁し、溶解物を５．７Ｍ 塩化セシウムに重層し、ＳＷ４０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で１５５，０００×ｇにて１８時間遠心分離した。ＲＮＡペレットを、０．５〜１ｍｇ／ｍｌにて水中に溶解した。ノーザンブロッティング分析に関して、１サンプルあたり５μｇの総ＲＮＡを、１％ホルムアミド−アガロースゲルで分画した。電気泳動に続いて、ＲＮＡを、正に荷電したナイロン膜（ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））に転写した。ノーザン分析用の遺伝子プローブを表Ｉに列挙する特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅産物として調製し、この増幅産物を配列決定によって確認した。これらのプローブを、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により、ランダムプライマー法を使用して、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，ＮＪ）が推奨するように放射性標識し、ｕｌｔｒａｈｙｂ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）中で一晩ハイブリダイズさせた。Ｃｏｌ２Ａｌハイブリダイゼーションを、５４℃にて行い、他は全て、４２℃にて行った。フィルターを、２×ＳＳＣ／０．１ ％ＳＤＳ中で室温にて洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６５℃にて３０分間洗浄した。このフィルターを、Ｘ線フィルムに一晩曝した。ハイブリダイゼーションシグナルを、ｘ線画像をスキャンし、画像尺度（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ ａｎｄ Ｆｉｌｍ Ｃｏ，Ｊａｐａｎ）を利用することにより定量した。Ｃｏｌ２Ａ１、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＣＯＭＰおよびＳｏｘ−９のｍＲＮＡレベルを、β２−ミクログロブリンとの正規化によりＲＮＡ負荷について較正した。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるＣｏｌ２ＡＩ遺伝子発現の検出に関して、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）による２〜３の溶解ビーズから単離した細胞から調製した。ＲＴ−ＰＣＲを、テンプレートとしての総ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮＡ ＰＣＲコアキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＣＴ）を使用して行った。増幅産物を、１．２％ Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で分析した。
【００５９】
【表１】
ＴＧＦ−βの存在下で培養した間葉幹細胞および前駆体細胞を、軟骨形成性分化させる［Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４，４１５−４２８（１９９８）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｊｅｒｙ ８０（１２），１７４５−１７５７（１９９８）］。アルギン酸中で培養し、ＴＧＦ−β３により刺激したＭＭＣは、Ｃｏｌ２Ａ１を発現し、軟骨形成性系統に沿って分化する［Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８５（１），９８−１０６（２０００）］。ＢＭＰの軟骨形成性分化に対する効果を試験するために、３名のドナー由来の、単層培養により拡張させたＭＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２またはｒｈＢＭＰ−９の存在下で３次元アルギン酸マトリクス中にてさらに培養した。ＲＴ−ＰＣＲを、種々の時間間隔で細胞から抽出したＲＮＡに対して行い、Ｃｏｌ２Ａ１の発現を検出した。この結果は、Ｃｏｌ２Ａ１発現が、８日目〜１４日目に３名のドナー全ての細胞において誘導されることを示した。１４日目に、総ＲＮＡを培養中の細胞から調製し、ノーザンブロット分析を行った。この結果は、３名のドナー全てが、ＢＭＰおよび発現されたＣｏｌ２Ａｌの両方による刺激に応答する一方、その発現は、非処理細胞において検出されないことを示した。この結果はまた、ＢＭＰ−９処置が、ＢＭＰ−２より高いレベルのＣｏｌ２Ａｌ発現を誘導することを示した。
【００６０】
これは、ＢＭＰ−２が軟骨形成関連転写因子Ｓｏｘ−９の発現をアップレギュレートし、続いてＣｏｌ２Ａｌおよびアグリカンの発現を調節するというマウス研究において示された［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８２−Ａ（２），１５１−１６０（２０００）］。ヒトＭＭＣにおけるこの観察を評価し、軟骨形成性系統の進行の状態をさらに分析するために、軟骨形成性特異的マーカー（アグリカン、軟骨オリゴマータンパク質（ＣＯＭＰ）およびＳｏｘ−９）の発現を調査した。複数のドナー由来のＭＭＣを分析した。結果は、この群の代表的な１名のドナーからのものである。アグリカンおよびＣＯＭＰの両方の発現は、Ｃｏｌ２Ａｌ発現に類似の様式で、ＢＭＰに応答して増大した。Ｓｏｘ−９は、未処理細胞における発現の基底レベルを示したが、ＢＭＰで処理した細胞において、観察可能なアップレギュレーションを受けた。従って、アルギン酸培養におけるＭＭＣを、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９により軟骨形成性系統に沿って分化するように誘導することが意図される。
【００６１】
ＩＬ−１１およびＢＭＰ−９研究において、ＩＬ−１１もＢＭＰ−９も非含有およびＩＬ−１１単独のみ含有させて培養した細胞は、Ｃｏｌ２Ａｌを発現しなかった。漸増濃度のＢＭＰ−９とともに培養した細胞は、未処理細胞と比較した場合、有意なレベルのＣｏｌ２Ａｌ発現を示した。ＩＬ−１１とＢＭＰ−９を組み合わせて培養した細胞は、ＢＭＰ−９単独より高いレベルのＣｏｌ２Ａｌ発現を示した。ＩＬ−１１とＢＭＰ−９の相乗効果は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１１の濃度にて最適であった。この濃度にて、Ｃｏｌ２Ａｌ発現がＢＭＰ−９単独より５倍超高かった。
【００６２】
（実施例５：ＭＭＣにおける軟骨形成マーカーの時間依存的様式での発現において安定して増加するＢＭＰ誘導）
アルギネートビーズ中で培養したＭＭＣから、５日、１０日および１５日目に単離したＲＮＡを、ノーザン分析に供した。結果（図１）は、Ｃｏｌ２Ａ１遺伝子発現は、１０日目に検出され１５日目まで連続して増加することを示した。アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）発現は、５日目に検出され、培養物中で日ごと進行性の増加を示した。また、ＢＭＰ−９処理細胞は、Ｃｏｌ２Ａ１およびアグリカン両方の、ＢＭＰ−２処理細胞より高い発現を示した。この結果は、ＭＭＣがＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９で処理される場合、アグリカン発現が、Ｃｏｌ２Ａ１発現より早く応答することを示す。
【００６３】
（実施例６：ＢＭＰは、ＩＬ−１の炎症性効果を克服する）
以前の研究は、ＩＬ−１が、Ｃｏｌ２Ａ１およびアグリカンを含む軟骨形成特異的遺伝子を、転写因子Ｓｏｘ−９のダウンレギュレーションによって阻害することを示した（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０５２（３），３６６−７８（１９９０）；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６６（２），３５１−９（１９９６）；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（５），３６８７−９２（２０００））。これら３つの遺伝子の発現を分析することによって、軟骨形成に分化したＭＭＣに対するＩＬ−１の効果を試験した。結果は、１４日目に、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９が、Ｃｏｌ２Ａ１およびアグリカンの発現を誘導し、以前に言及したように、ＢＭＰ−９処理が、ＢＭＰ−２処理よりも高レベルの発現を生じさせることを示した（図２、レーン１〜３）。ＢＭＰの除去およびＩＬ−１の７２時間にわたる添加は、Ｃｏｌ２Ａ１、アグリカンおよびＳｏｘ−９の減少したレベルの発現を導いた（レーン４〜６）。ＩＬ−１の除去およびＢＭＰのさらなる９６時間の期間にわたる添加は、２１日間にわたってＢＭＰに連続して曝露した細胞（レーン１０〜１２）に類似した発現レベルを有する３つの遺伝子の発現回復を生じた（レーン７〜９）。
【００６４】
次いで、ＩＬ−１の存在下でのＢＭＰの効果を、試験した。細胞を、軟骨形成系統にそって１４日間分化させ、続いて、ＩＬ−１単独、ＢＭＰ単独，ならびにＩＬ−１およびＢＭＰを一緒に、７日間存在させた。結果（図３）は、未処理細胞（レーン１）および漸増濃度のＩＬ−１にさらに７日間曝露した１４日目の未処理細胞が、予想通り、Ｃｏｌ２Ａ１の発現はなく、測定可能なＳｏｘ−９の発現はない（レーン２〜４）ことを示した。ＢＭＰで処理した細胞は、Ｃｏｌ２Ａ１発現によって例証されるように、最初の１４日間、軟骨形成性分化を介して進行した（レーン５および１８）。軟骨形成性に分化した細胞を漸増濃度のＢＭＰ−２にさらに７日間曝露したことによって、Ｃｏｌ２Ａ１およびＳｏｘ−９の発現が増加した（レーン６〜８）。同様の効果を、ＢＭＰ−９処理で観察した（レーン１９〜２１）が、ＢＭＰ−９に対する最大応答は、１００ｎｇ／ｍｌの最低用量で達成された。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の両方は、ＩＬ−１誘導性のＣｏｌ２Ａ１およびＳｏｘ−９の抑制を、特に、使用したＩＬ−１の最低濃度（２０ｐｇ／ｍｌ）で部分的に妨げ得た（それぞれ、レーン９〜１７および２２〜３０）。さらに、ＢＭＰ−９は、全ての濃度のＩＬ−１でより高いレベルのＣｏｌ２Ａ１発現を維持し得た。これらの観察は、ＢＭＰが、炎症性サイトカインを含む環境において同化因子として機能する能力を有する潜在的分子であることを示した。
【００６５】
（実施例７：ＣＤ１０５＋細胞の単離および培養拡張）
ヒトＭＭＣを、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１８５：９８−１０６（２０００））に従って単離した。単核細胞（ＭＮＣ）を、ヒト骨髄より単離し、０．５％ ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）からなる磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）緩衝液で洗浄した。これらの細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、１×１０８個のＭＮＣを、０．２ｍｌの抗ヒトＣＤ１０５抗体−微小ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）とともに、４℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、製造業者の推薦に従って、磁気カラムＭＳ＋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で分離した。カラム溶出物は、ＣＤ１０５＋細胞からなる。磁石からカラムを回収して、ＭＡＣＳ緩衝液で細胞をフラッシュすることによって、付着したＣＤ１０５＋細胞を回収した。小画分のＣＤ１０５＋細胞（５〜７．５×１０５個）を、１８５ｃｍ２ Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｏｌｏフラスコ（Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）および１％抗真菌性抗生物質（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充したα−ＭＥＭからなる完全培地中で、空気中５％ＣＯ２中３７℃にてプレートして、細胞のプレーティング効率について分析した。１４日目、細胞を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）処理によって剥がし、将来の使用のために、液体窒素中で９０％ ＦＢＳおよび１０％ジメチルスルホキシド中で貯蔵した。
【００６６】
（実施例８：フローサイトメトリー）
細胞表面分子の分析を、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１７６：５７−６６（１９９８））に従って行った。カラムで単離したＣＤ１０５＋細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）中で洗浄し、細胞のアリコート（１×１０５〜１×１０６個）を、抗ヒトＣＤ４５蛍光色素結合体化モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、細胞ペレットを、１％パラホルムアルデヒドを含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。非特異的蛍光を、マウスアイソタイプモノクローナル抗体とともにインキュベートした細胞調製物の等量のアリコートを使用して決定した。Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ装置（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で１０，０００〜５０，０００回の事象を分析することによって、データを収集した。
【００６７】
（実施例９：アルギネートでのＣＤ１０５＋細胞の培養）
ＣＤ１０５＋細胞を、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）の改変によって、アルギネート中にカプセル化した。細胞を、洗浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０））で洗浄し、１０〜２０×１０６個／ｍｌの細胞密度で、洗浄緩衝液中１．２％アルギネート中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁物の個々のビーズを、２０ゲージの注射針を通して、１０２ｍＭ ＣａＣｌ２および２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）を含有する溶液中に徐々に搾り出した。ビーズを１０分間重合させ、洗浄緩衝液で１回、完全培地で３回洗浄し、空気中５％ＣＯ２中３７℃にて同一の培地中で一晩培養した。次の日、培地を、化学的に規定された培地（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）に交換した。アルギネートビーズを、上記の培地（未処理）または１００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−９で補充した培地（処理）中で培養した。培地を、次の３週間にわたって、週に２回交換した。ＭＮＣおよびＣＤ１０５−細胞をまた、アルギネートビーズ中に同一濃度でカプセル化し、同様に培養した。
【００６８】
（実施例１０：ＲＮＡ調製および分析）
複数のドナー由来のＣＤ１０５＋細胞を、アルギネートビーズ中にカプセル化し、３週間培養した。培養期間の最後に、細胞をビーズから回収し、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって細胞ペレットより抽出し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）−ｅｌｉｓａを、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）に従って行った。簡単には、ＲＴ−ＰＣＲを、テンプレートとしての総ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー（表ＩＩ）、ＲＮＡ ＰＣＲコアキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＣＴ）を使用して行い、そしてデオキシヌクレオチドをジゴキシゲニン標識ヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と置換して増幅産物を標識した。Ｅｌｉｓａを製造業者（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって推奨されるように行った。各ドナー由来の各未処理サンプルおよび処理サンプルについてのデータを、ｂ２−ミクログロブリンに対して正規化した。軟骨特異的マーカー（ＩＩ型コラーゲン、アグリコンおよび連結タンパク質が挙げられる）によって、進行を決定した。各ドナーについて、ＩＩ型コラーゲン、アグリコンおよび連結タンパク質の発現を、未処理に対する倍数増加（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）として見積もった。結果は、３人のドナーについての平均倍数増加である。ＲＴ−ＰＣＲ ｅｌｉｓａ分析（図４）は、未処理細胞と比較して、ＢＭＰ−２処理細胞およびＢＭＰ−９処理細胞が、Ｃｏｌ２Ａ１、アグリコンおよび連結タンパク質を含む軟骨形成特異的遺伝子についての遺伝子発現における有意な増加を有したことを示した。このことは、ＣＤ１０５＋細胞が軟骨形成性分化を行うことを示唆する。対照的に、ＭＮＣおよびＣＤ１０５−細胞は、軟骨形成性の分化の証拠を示さなかった。
【００６９】
【表２】
免疫組織化学を、アルギネート中のＩＩ型コラーゲンタンパク質の存在を検出するために、以前に報告された手順（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）に従って行った。培養物からのアルギネートビーズを、水で洗浄し、そして、不可逆的な重合のために１００ｍＭ塩化バリウム中で１０分間インキュベートした。次いで、ビーズを水で再度洗浄し、１０％緩衝化ホルマリン中で固定化し、パラフィン中に包埋した。アルギネートビーズの切片を、ヤギ抗ＩＩ型コラーゲン抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）とともにインキュベートした。切片を、ビオチン化抗ヤギ抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼＨ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともにインキュベートすることによって、免疫反応性を検出した。この切片をペルオキシダーゼ基質３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびＨ２Ｏ２で処理することによって、シグナルを発色させた。画像を、３５ｍｍスライドフィルム上に記録し、そして多パネルの図を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて作成した。実験コントロールは、非免疫一次抗体、続く二次抗体で染色したアルギネート切片からなった。結果は、未処理細胞と比較して、ＢＭＰ−２処理細胞およびＢＭＰ−９処理細胞が、ＩＩ型コラーゲンタンパク質の有意な存在を示したことを、示す。ＩＩ型コラーゲンタンパク質は、分化する細胞によるこのタンパク質の分泌、続いてアルギネートマトリクス中へのエントラップメントに起因して、細胞間領域に存在した。非免疫一次抗体で染色したアルギネート切片は、免疫反応性を何ら示さなかった。
【００７０】
本発明は、詳細に示され、そしてその好ましい実施形態に対する参照とともに記載されるが、形態における種々の変更および詳細が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を逸脱することなく本明細書中でなされ得ることは、当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】図１は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９による、時間依存様式での、軟骨形成マーカーの発現の誘導に関する。図１Ａ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブ、アグリカンプローブ、およびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。図１Ｂ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナル、アグリカンシグナル、およびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。レーン１、４および７−未処理細胞；レーン２、５および８−ｒｈＢＭＰ−２処理細胞；レーン３，６および９−ｒｈＢＭＰ−９処理細胞。
【図１Ｂ】図１は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９による、時間依存様式での、軟骨形成マーカーの発現の誘導に関する。図１Ａ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブ、アグリカンプローブ、およびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。図１Ｂ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナル、アグリカンシグナル、およびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。レーン１、４および７−未処理細胞；レーン２、５および８−ｒｈＢＭＰ−２処理細胞；レーン３，６および９−ｒｈＢＭＰ−９処理細胞。
【図２Ａ】図２は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９が、ＩＬ−１撤退後の軟骨形成マーカーの発現を逆転し得ることを示す。図２Ａ、総ＲＮＡが単離され、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブ、アグリカンプローブ、およびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。培養の１４日後のＣｏｌ２Ａ１、アグリカンおよびＳｏｘ−９の発現を示す（レーン１〜３）。培養物由来の細胞のアリコートを、取り出し、洗浄し、そして２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１を有する培地中で７２時間培養した（レーン４〜６）。ＩＬ−１で処理した細胞の細胞アリコートを、取り出し、洗浄し、そしてさらに９６時間、ＢＭＰの有りまたは無しで培養した（レーン７〜９）。ＢＭＰの有りまたは無しでの並行培養はまた、２１日の総培養期間の間維持された（レーン１０〜１２）。図２Ｂ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナル、アグリカンシグナル、およびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図２Ｂ】図２は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９が、ＩＬ−１撤退後の軟骨形成マーカーの発現を逆転し得ることを示す。図２Ａ、総ＲＮＡが単離され、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブ、アグリカンプローブ、およびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。培養の１４日後のＣｏｌ２Ａ１、アグリカンおよびＳｏｘ−９の発現を実証する（レーン１〜３）。培養物由来の細胞のアリコートを、取り出し、洗浄し、そして２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１を有する培地中で７２時間培養した（レーン４〜６）。ＩＬ−１で処理した細胞の細胞アリコートを、取り出し、洗浄し、そしてさらに９６時間、ＢＭＰの有りまたは無しで培養した（レーン７〜９）。ＢＭＰの有りまたは無しでの並行培養はまた、２１日の総培養期間の間維持された（レーン１０〜１２）。図２Ｂ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナル、アグリカンシグナル、およびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図３Ａ】図３は、ＩＬ−１の阻害効果を克服するＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の能力を示す。図３Ａおよび３Ｃ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブおよびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。細胞を２１日間処理せず（レーン１）、そして１４日間培養した未処理の細胞を、続いて、７日間、ＩＬ−１で処理した（レーン２〜４）。細胞を、１４日間ＢＭＰ−２で処理し（レーン５）、ＢＭＰ−２処理細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−２（レーン６〜８）か、またはＢＭＰ−２とＩＬ−１を共に（レーン９〜１７）のいずれかで、さらに７日間培養した。細胞を、ＢＭＰ−９で１４日間処理した（レーン１８）、ＢＭＰ−９処理した細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−９（レーン１９〜２１）か、またはＢＭＰ−９とＩＬ−１を共に（レーン２２〜３０）のいずれかで、さらに７日間培養した。図３Ｂおよび３Ｄ、走査デンシトメトリーによるＣｏｌ２Ａ１シグナルおよびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図３Ｂ】図３は、ＩＬ−１の阻害効果を克服するＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の能力を示す。図３Ａおよび３Ｃ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブおよびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。細胞を２１日間処理せず（レーン１）、そして１４日間培養した未処理の細胞を、続いて、７日間、ＩＬ−１で処理した（レーン２〜４）。細胞を、１４日間ＢＭＰ−２で処理し（レーン５）、ＢＭＰ−２処理細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−２（レーン６〜８）か、またはＢＭＰ−２とＩＬ−１を共に（レーン９〜１７）のいずれかで、さらに７日間培養した。細胞を、ＢＭＰ−９で１４日間処理した（レーン１８）、ＢＭＰ−９処理した細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−９（レーン１９〜２１）か、またはＢＭＰ−９とＩＬ−１を共に（レーン２２〜３０）のいずれかで、さらに７日間培養した。図３Ｂおよび３Ｄ、走査デンシトメトリーによるｃｏｌ２Ａ１シグナルおよびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図３Ｃ】図３は、ＩＬ−１の阻害効果を克服するＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の能力を示す。図３Ａおよび３Ｃ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブおよびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。細胞を２１日間処理せず（レーン１）、そして１４日間培養した未処理の細胞を、続いて、７日間、ＩＬ−１で処理した（レーン２〜４）。細胞を、１４日間ＢＭＰ−２で処理し（レーン５）、ＢＭＰ−２処理細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−２（レーン６〜８）か、またはＢＭＰ−２とＩＬ−１を共に（レーン９〜１７）のいずれかで、さらに７日間培養した。細胞を、ＢＭＰ−９で１４日間処理した（レーン１８）、ＢＭＰ−９処理した細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−９（レーン１９〜２１）か、またはＢＭＰ−９とＩＬ−１を共に（レーン２２〜３０）のいずれかで、さらに７日間培養した。図３Ｂおよび３Ｄ、走査デンシトメトリーによるｃｏｌ２Ａ１シグナルおよびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図３Ｄ】図３は、ＩＬ−１の阻害効果を克服するＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９の能力を示す。図３Ａおよび３Ｃ、総ＲＮＡを単離し、そしてＣｏｌ２Ａ１プローブおよびＳｏｘ−９プローブ、ならびにローディングコントロールとしてβ２−ミクログロブリンプローブを用いるノーザン分析に供した。細胞を２１日間処理せず（レーン１）、そして１４日間培養した未処理の細胞を、続いて、７日間、ＩＬ−１で処理した（レーン２〜４）。細胞を、１４日間ＢＭＰ−２で処理し（レーン５）、ＢＭＰ−２処理細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−２（レーン６〜８）か、またはＢＭＰ−２とＩＬ−１を共に（レーン９〜１７）のいずれかで、さらに７日間培養した。細胞を、ＢＭＰ−９で１４日間処理した（レーン１８）、ＢＭＰ−９処理した細胞のアリコートを、漸増濃度のＢＭＰ−９（レーン１９〜２１）か、またはＢＭＰ−９とＩＬ−１を共に（レーン２２〜３０）のいずれかで、さらに７日間培養した。図３Ｂおよび３Ｄ、走査デンシトメトリーによるｃｏｌ２Ａ１シグナルおよびＳｏｘ−９シグナルの定量を示す。
【図４】図４は、アルギナート培養中のＣＤ１０５＋細胞による、軟骨特異的マーカーの遺伝子発現を示す。ヒト骨髄から単離されたＣＤ１０５＋細胞を、アルギナートにカプセル化し、そしてＢＭＰ−２またはＢＭＰ−９を補充した無血清培地（未処理）で、３週間培養した。ＩＩ型コラーゲン、アグリカンおよびリンクタンパク質についてのＲＴ−ＰＣＲ ｅｌｉｓａを、細胞から抽出したＲＮＡに対して実施した。バーは、３人のドナーの平均（＋ＳＥＭ）を示す。
Claims (31)
- ＢＭＰを含む、軟骨組織の形成および維持を誘導するための組成物。
- 軟骨細胞または軟骨組織の形成および／または維持の誘導を必要とする患者において、軟骨細胞または軟骨組織の形成および／または維持を誘導するための方法であって、該方法は、請求項１に記載の組成物の有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
- 関節炎または他の軟骨組織欠損の処置を必要とする患者において、関節炎または他の軟骨組織欠損を処置するための方法であって、該方法は、請求項１に記載の組成物の有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
- 関節軟骨欠損または関節軟骨損傷の処置を必要とする患者において、関節軟骨欠損または関節軟骨損傷を処置する方法であって、該方法は、請求項１に記載の組成物の有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
- 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
- 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
- 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
- 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
- ＢＭＰを含む、ＩＬ−１またはＴＮＦの阻害効果をブロックまたは抑制するための組成物。
- 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
- ＩＬ−１の阻害効果をブロックまたは抑制するための方法であって、該方法は、有効量のＢＭＰを投与する工程を包含する、方法。
- 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
- 関節軟骨修復における使用のためのＭＭＣおよびＢＭＰを含む組成物。
- ＩＬ−１１およびＢＭＰ−９を含む、軟骨形成を誘導するための組成物。
- 骨髄から単離され、組織培養で拡張されていない細胞を含む、軟骨形成を誘導するための組成物。
- 前記細胞が、ＣＤ１０５＋細胞である、請求項１５に記載の組成物。
- 適切なマトリクスをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
- 骨誘導因子および／または軟骨誘導因子をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
- 前記因子がＢＭＰである、請求項１８に記載の組成物。
- 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
- 軟骨形成の誘導を必要とする患者において、軟骨形成を誘導するための方法であって、該方法は、骨髄から単離され、組織培養で拡張されていない細胞を含む組成物の有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
- 前記細胞が、ＣＤ１０５＋細胞である、請求項２１に記載の方法。
- 骨誘導因子および／または軟骨誘導因子を投与する工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
- 前記因子がＢＭＰである、請求項２３に記載の方法。
- 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
- 関節炎または他の軟骨組織欠損の処置を必要とする患者において、関節炎または他の軟骨組織欠損を処置するための方法であって、該方法は、請求項１５に記載の組成物の有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
- 関節軟骨欠損または関節軟骨損傷の処置を必要とする患者において、関節軟骨欠損または関節軟骨損傷を処置する方法であって、該方法は、請求項１５に記載の組成物の有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
- 組織修復のための組成物であって、該組成物は、骨髄から単離され、組織培養で拡張されていない細胞ならびに骨誘導因子および／または軟骨誘導因子を含む、組成物。
- 前記単離された細胞がＣＤ１０５＋細胞であり、そして前記因子がＢＭＰである、請求項２８に記載の組成物。
- 適切なマトリクスをさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
- 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−９からなる群より選択される、請求項３０に記載の組成物。
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