CZ20012782A3

CZ20012782A3 - Prostředek pro hojení a náhradu kloubní chrupavky

Info

Publication number: CZ20012782A3
Application number: CZ20012782A
Authority: CZ
Inventors: Renwen Zhang; Diane Peluso; Elisabeth Morris
Original assignee: Genetics Institute, Inc.
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2002-01-16
Also published as: HUP0105312A3; BR0007892A; JP2002535378A; NO323630B1; PT1148897E; IL144523A0; NO20013744L; WO2000044413A1; EP1148897A1; ATE255920T1; EP1148897B1; HUP0105312A2; NO20013744D0

Description

Oblast techniky

Vynález se týká náhrady tkáně, specificky se týká regenerace funkční kloubní chrupavky. Prostředek podle vynálezu je možno využít při rekonstruktivních chirurgických zákrocích nebo jiných postupech, při nichž je nutno dosáhnout regenerace nebo náhrady kloubních chrupavek.

Dosavadní stav techniky

Hojení nebo náhrada poraněných kloubních chrupavek naráží i v současné době v ortopedii na značné obtíže. Několik léčebných postupů je založeno na použití štěpů chrupavčité a osteochondrální tkáně. Autologní štěpy těchto tkání jsou nejvýhodnějším fyziologickým materiálem. Tkáň dárce je však omezena a často je zapotřebí chirurgického zákroku na sekundárním místě k získání příslušné tkáně, vhodné pro transplantaci. Přes nesporné úspěchy je tedy stále ještě zapotřebí mít k dispozici účinný prostředek pro hojení defektů kloubní chrupavky tak, aby bylo možno při poraněních dosáhnout fyziologického hojení bez nutnosti odebírat nemocnému autologní tkáň.

Podstata vynálezu

Vynález se týká prostředku pro regeneraci funkční a fyziologicky odpovídající tkáně, zejména kloubní chrupavky při jejích poraněních a defektech. Jde zejména o léčení nemocných, kteří trpí uvedenými defekty.

····· · ·♦ ·· • · · ···· ··· • ······ • · · · · · · · · ·

Prostředek podle vynálezu využívá kostních morfogenetických proteinů BMP, o nichž je známo, že mají osteogenní a/nebo chondrogenní vlastnosti a které je možno získat technologií s použitím rekombinantní DNA, takže jde o potenciálně neomezený zdroj. Prostředek podle vynálezu je dále výhodný v tom smyslu, že regenerace funkční kloubní chrupavky může být urychlena nebo je možno dosáhnout vyšší konečné pevnosti a stability, přičemž tkáň, vytvořená v místě defektu nebo poranění, je fyziologicky odpovídající tkáň.

Použití BMP k dosažení hojení a regenerace defektů kloubní chrupavky může vést k dosažení lepších výsledků při léčení osteoarthritidy, čímž bude možno předejít nutnosti použití umělých kloubů nebo bude možno oddálit toto použití. Předklinická hodnocení prokazují, že například rhBMP-2 zlepšuje rychlé hojení defektů kloubní chrupavky u králíka až do plné tloušťky chrupavky.

Prostředek podle vynálezu je tedy možno použít k léčení nemocných, kteří trpí některými formami poranění nebo defektů kloubních chrupavek. Poranění může být výsledkem akutního traumatu nebo příliš vysokého tlaku, například při atletických výkonech nebo může jít o důsledek poškození, při němž dochází ke zhmoždění nebo roztržení kloubní chrupavky.

Při použití prostředku podle vynálezu je výhodné, že vzniklé defekty je možno nahradit až do plné tloušťky původní kloubní chrupavky. Uvedeným způsobem je možno také léčit další typy defektů, například v případě, že defekty jsou již tak značné, že zasahují i do kostní tkáně, uložené pod chrupavkou.

V prostředku podle vynálezu je obsažen účinný růstový faktor, například BMP a vhodný zdroj tkáně. Zdrojem tkáně může být osteochondrální štěp, a to buď autologní štěp nemocného, nebo může jít o cizorodý štěp nebo o uměle připravenou tkáň. Ve výhodném provedení může být zdrojem tkáně kultura chondrocytů, může jít buď o chondrocyty nebo o kmenové kultury buněk, připravené pěstováním buněk ex vivo, popřípadě za přidání dalších růstových faktorů. Postupy pro přípravu takových tkání byly popsány například v patentových spisech US 5226914, US 5811094, US 5053050, US 5486359, US 5786217 a US 5723331.

Tkáně mohou být získány také tradičními postupy, při nichž se nevyužívá buněčných kultur, nýbrž se chrupavka získává při použití běžně dodávaných nástrojů, jako jsou například Acufex 7 (Smith and Nephew, lne., Andover MA), COR Systém (Innoavsive Technologies, Marlborough MA), nebo Arthrex 7 Osteochondral Autograft Transfer Systém (Arthrex, Mnichov, SRN). Odebraná tkáň může být přímo použita nebo může být míšena se systémy na bázi buněčných kultur, tak jak byly svrchu popsány.

Růstový faktor

Účinný růstový faktor, používaný v prostředku podle vynálezu s výhodou náleží do podskupiny proteinů, označovaných jako kostní morfogenetické proteiny, BMP, u nichž bylo prokázáno, že mají osteogenní, chondrogenní a další růstové a diferenciační účinky. BMP tohoto typu zahrnují rhBMP-2, rhBMP-3, rhBMP-4 (uvádí se také jako • ·«· ♦ ·· ·· · • ·· ♦ · ···· • ·· · · · · · · • · ·· · · · · · • ·»···· • · · · · · · · · · ··· rhBMP-2B), rhBMP-5, rhBMP-β, rhBMP-7 (rhOP-1), rhBMP-8, rhBMP-9, rhBMP-12, rhBMP-13, rhBMP-15, rhBMP-16, rhBMP-17, rhBMP-18, rhGDF-1, rhGDF-3, rhGDF-5, rhGDF-6, rhGDF-7, rhGDF-8, rhGDF-9, rhGDF-10, rhGDF-11, rhGDF-12, rhGDF-14. Například BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-β a BMP-7 byly popsány v US patentových spisech 5108922, 5013649, 5116738, 5106748, 5187076 a 5141905, BMP-8 byl popsán v mezinárodni přihlášce WO 91/18098, BMP-9 byl popsán v mezinárodní přihlášce WO 93/00432, BMP-10 byl popsán v US 5637480, BMP-11 byl popsán v US 5639638, BMP-12 a BMP-13 byly popsány v US 5658882, BMP-15 byl popsán v US 5635372 a BMP-16 je popsán v současně projednávané patentové přihlášce č. 08/715202. Dalšími prostředky, které je rovněž možno použít, zahrnují Vgr-2, použít je také možno kterýkoliv z růstových a diferenciačních faktorů GDF, tak jak byly popsány v mezinárodních patentových přihláškách WO 94/15965, WO 94/15949, WO 95/01801, WO 95/01802, WO 94/21681, WO 94/15966, WO 95/10539, WO 96/01845, WO 96/02559 a v dalších publikacích. Pro účely vynálezu je možno využit také BIP, popsaný v mezinárodni přihlášce WO 94/01557, dále HP00269, popsaný v japonské zveřejněné přihlášce číslo 7-250688 a MP52, popsaný v mezinárodní přihlášce WO 93/16099. Pro použití v prostředku podle vynálezu jsou vhodné také heterodimery svrchu uvedených látek a modifikované proteiny, například s částečným vypuštěním některých úseků. Uvedené proteiny mohou být použity jednotlivě nebo jako směs dvou nebo většího počtu těchto proteinů, velmi výhodnou látkou je rhBMP-2.

BMP mohou být získány rekombinantním způsobem nebo čištěny z přirozených zdrojů. Může jít o homodimerní nebo heterodimetní látky s dalšími BMP, může jít například o heterodimer, složený ze dvou monomerů BMP-2 a BMP-6, nebo může takový dimer obsahovat jinou látku ze skupiny TGFbeta, jako jsou aktiviny, inhibiny a TGF-betal, může tedy například jit o heterodimer, tvořený jedním monomerem ze skupiny BMP a příbuzným monomerem ze skupiny TGF-beta. Příklady takových heterodimerních proteinů byly popsány například v mezinárodní přihlášce WO 93/09229. Množství osteogenního proteinu v prostředku má být takové, aby došlo k účinné stimulaci osteogenni aktivity kmenových buněk a bude záviset na rozměru a povaze léčeného defektu a také na použitém nosiči. Obvykle se množství proteinu pohybuje v rozmezí 0,05 až 1,5 mg.

Ve výhodném provedení se osteogenni protein aplikuje společně s účinným množstvím proteinu, který je schopen vyvolat tvorbu tkáně typu šlachy nebo vazu. Tyto proteiny zahrnují BMP-12, BMP-13 a další členy podstkupiny BMP-12 a také MP52. Tyto proteiny a jejich použití pro regeneraci tkání typu vazů a šlach byly popsány v US patentové přihlášce 08/362670, podané 22. prosince 1994. Podle dalšího výhodného provedení je možno aplikovat heterodimer, v němž je jednou monomerní jednotkou osteogenni protein, například BMP-2 a druhou monomerní podjednotkou je protein, vyvolávající tvorbu šlach, jako BMP-12, čímž je možno dosáhnout tvorby funkčního spojení mezi pojivovou tkání a kostí.

Aplikace růstového faktoru

Růstový faktor může být na zdroj tkáně aplikován ve formě v roztoku v pufru. Jedním z výhodných pufrů je pufr, který obsahuje kromě účinného růstového faktoru také 1,0 až 10,0 g glycinu/100 ml, přibližně 0,1 až 5,0 g cukru, s výhodou sacharózy/100 ml, přibližně 1 až 20 mM hydrochloridu kyseliny glutamové a popřípadě ještě 0,01 až 0,1 g neiontového smáčedla, například polysorbátu 80 na 100 ml. Výhodnými roztoky jsou roztoky, které obsahují přibližně 1 až 20 g/100 ml celulózového nosiče, vztaženo na objem pufru. V případě potřeby je možno přidat sůl.

Dalšími materiály, které je možno použít spolu s růstovými faktory v prostředcích podle vynálezu jsou například kyselina hyaluranová, chirurgické sítě nebo šicí materiály, polyglykonát, polymery, citlivé na teplotu, demineralizovaná kost, minerální a keramické materiály, jako fosfát vápenatý, hydroxyapatit a podobně a také kombinace svrchu popsaných materiálů. Ve výhodném provedení vynálezu se však neužívá žádný nosič.

Růstový faktor podle vynálezu ve vhodném pufru, například ve svrchu popsaném pufru nebo v kombinaci s vhodným nosičem je možno aplikovat přímo na tkáň a/nebo na místo, na němž je zapotřebí dosáhnout regenerace tkáně. Růstový faktor je například možno fyzikálně nanášet na tkáně postřikem nebo máčením, použitím kartáčku nebo jiného vhodného nanášecího přístroje, například injekční stříkačky. Protein je také možno přímo nanést na místo poškození tkáně.

V následujících příkladech jsou popsána jednotlivá provedení při použití BMP-2. Je zřejmé, že vynález nemůže být omezen na popsaná provedení výhledem k tomu, že je možno uskutečnit řadu změn a modifikací v souladu se svrchu popsanými parametry.

Příklady provedeni vynálezu

Přiklad 1

Cizorodý štěp králíka

Všechny postupy byly prováděny v souladu s povolením IACUC. Bylo použito 12 králičích samců bílého kmene New Zealand ve stáří 6 měsíců. 2 králíci byli použiti jako dárci, 10 králíků jako příjemci. Dárcům byly odebrány osteochondrální štěpy s průměrem 3,5 mm z trochleárního žlábku nebo mediálního femorálního kondylu a byly transportovány do defektu v trochleárním žlábku příjemce s hloubkou 3,5 mm. Štěp byl před implantací ponořen do rhBMP-2 v množství 0,5 mg/ml nebo do pufru jako kontrolního roztoku. Po čtyřech týdnech byli králíci usmrceni a transplantáty a okolní tkáň byly vyhodnoceny podle histologické a histochemické škály podle publikace Sellers a další J. Bone Joint Surg., 79-A: 1452-1463, 1997. Byla také provedena počítačová analýza histologického zobrazení úseků tkáně. Výsledky byly vyhodnoceny při použití nepárového Studentova t-testu.

Při povrchním pohledu nebylo možno na kloubech pozorovat žádné známky zánětu. Všechny defekty byly vyplněny náhradní tkání. Vzhled povrchu defektů byl variabilní, avšak přijatelný a nebyl v korelaci se způsobem ošetření. Osteofyty byly nalezeny na třech kloubech, u dvou pokusných králíků a u jednoho kontrolního králíka.

Nebylo možno prokázat žádnou korelaci mezi makroskopickým a histologickým vzhledem defektu. Přítomnost chondrocytů v lagunách a sporadický růst shluků buněk v chrupavce dárce prokazovaly přežití tkáně. Určitá místa degenerace v chrupavce tkáně bylo možno prokázat u všech kontrolních skupin, avšak pouze u jednoho králíka ze skupiny, ošetřené rhBMP-2. Hojení defektů u skupiny, jíž byl podáván rhBMP-2, bylo podstatně zlepšeno ve srovnání s kontrolní skupinou. V případě této skupiny bylo možno pozorovat zlepšenou integraci s kostí vzhledem k tomu, že se vytvořilo menší množství fibrózní tkáně v oblasti kosti pod chrupavkou. V případě použití rhBMP-2 se také vytvořilo větší množství chrupavky nad značkou na kosti, tato tkáň byla zjevně tvořena tkání dárce i nově regenerovanou chrupavkou příjemce. Nebylo možno pozorovat rozdíl v celkovém množství kostní tkáně u obou skupin.

Tabulka 1. Histologické hodnoceni a histomorfometrické měřeni regenerace chrupavky, uvedeny jsou průměrné hodnoty a směrodatná odchylka

Parametr	rhBMP-2	Kontrola
Průměrné hodnocení**	10,0 (5,42)*	20,6 (5,18)
% kosti pod značkou	73,26 (13,28)	62,88 (18,07)
%fibrózní tkáně pod značkou	2,19 (2,04)	15,81 (9,88)
% chrupavky nad značkou	74,70 (41,08)*	18,17 (26, 70)
% vyplnění defektu	96,53 (4,86)*	88,79 (8,04)

*Statisticky významný rozdíl proti kontrole (p < 0,05) **Škála má rozměr od 0 (normální chrupavka) do 31 (nedošlo k regeneraci)

Další histomorfometrická analýza také podporuje příznivé výsledky působení rhBMP-2 na hojení štěpu. Například vyplnění novou tkání v procentech nad značku ··«· • ·♦

99 999

9 9 9 999

9 9 9 99

99 9 9 99999 bylo možno prokázat pro léčenou skupinu při použiti rhBMP celkem v 81,52 %, u kontroly bylo možno toto hojení prokázat pouze v rozsahu 57,63 %. Bylo také možno pozorovat menší podíl degenerace použitého štěpu u skupiny, jíž byl aplikován rhBMP-2 (23,83 %) ve srovnání s kontrolní skupinou (44,52 %) . Integrace štěpu nebo nově vytvořené chrupavky se štěpem hostitele byla daleko lepší v případě aplikace rhBMP-2 (56,48 %) ve srovnání s kontrolní skupinou (21,89 %). Při působení rhBMP-2 se také vytvořilo větší množství nové chrupavky na okraji štěpu, takže byla vyplněna štěrbina mezi štěpem a hostitelem a také na horní části štěpu, takže štěp lépe splynul s povrchem kloubu.

Svrchu uvedené výsledky prokazují, že při použití rhBMP-2 je možno zlepšit hojení defektů kloubní chrupavky při použití allogenních osteochondrálních štěpů. Účinný růstový faktor pravděpodobně urychluje spojení s kostí, která se nachází pod chrupavkou a zlepšuje také výživu kloubní chrupavky. Přidáním růstového faktoru také zřejmě dochází ke stimulaci tvorby nové chrupavky z mesenchymálních kmenových buněk příjemce v kostní dřeni a/nebo v synoviální tkáni. Tyto výsledky prokazují, že kombinace účinného růstového faktoru, zvláště kostních mofrogenetických proteinů a osteochondrálních cizorodých štěpů může představovat velmi účinný postup pro léčení defektů kloubní chrupavky, zvláště je možno tímto způsobem dosáhnout obnovy chrupavky v plné tloušťce.

·♦··

Příklad 2

Autogenní štěpy u králíka

Osteochondrální štěpy s průměrem 2,7 mm a délkou

3,0 mm byly odebrány z trochleárního žlábku nebo femorálního kondylu a transplantovány do místa dárce se šířkou 2,7 mm a délkou 3,5 mm v trochleárním žlábku nebo femorálním kondylu kolenního kloubu u králíků. V případě poloviny zvířat byl nakapán před transplantací do místa transplantace pufr, pak byly štěpy ponořeny na 2 minuty do pufru a uloženy na místo. U druhé poloviny králíků bylo do místa transplantace aplikováno 5 mikrogramů rhBMP-2, načež byl štěp ponořen do pufru, obsahujícího 500 mikrogramů/ml rhBMP-2 na 2 minuty a pak byl uložen na místo. 4 týdny po tomto chirurgickém zákroku byla zvířata usmrcena a místo transplantace bylo vyhodnoceno při použití histologické a histochemické škály podle publikace Sellers a další, J. Bone Joint Surg., 79-A: 1452-63, 1997, výsledky byly kvantitativně zpracovány analýzou získaných vyobrazení pomocí počítače. Získané údaje prokazují, že při aplikaci rhBMP-2 bylo dosaženo zlepšeného hojení štěpu. Nejdramatičtějším účinkem bylo omezení degenerace chrupavkového štěpu (rhBMP-2 8,18 %, kontroly 36,25 %), mimo to se kolem hrany štěpu vytvořilo větší množství chrupavky (rhBMP-2 88,23 %, kontroly 50 %) .

Příklad 3

Autologní štěpy primátů

Primáty s výjimkou člověka, použitými pro odběr štěpů, byli kynomologní makakové. Osteochondrální štěpy s průměrem 3,5 mm a délkou 6 mm byly odebrány z • ···· ♦ ·· ·· »· · f · · φ · · · • ··· · · · ·· • ······ ··· · · · · «*· trochleárního žlábku šesti makaků a transplantovány na místo, vytvořené vyvrtáním v mediálním a laterálním femorálním kondylu téhož zvířete, to znamená, že bylo použito celkem 12 transplantátů. Před transplantací bylo do šesti míst transplantace nakapáno 25 mikrogramů rhBMP-2, štěpy, určené do těchto šesti míst, byly ponořeny na 2 minuty do roztoku, obsahujícího 1,25 mg/ml rhBMP-2. V případě ostatních šesti transplantátů byl na místo transplantace nakapán pouze pufr a transplantáty byly ponořeny před transplantací na 2 minuty pouze do pufru. Končetiny byly imobilizovány na 2 týdny po operativním zákroku, 9 týdnů po tomto zákroku byla všechna zvířata usmrcena.

U všech zvířat bylo možno pozorovat normální funkci kolenních kloubů. Při zběžné prohlídce nebylo na kloubech možno pozorovat žádné známky zánětu. V žádném z kloubů se nevytvořily osteofyty. Přestože při běžném pohledu byl povrch původních defektů v jedné rovině s chrupavkou, obklopující defekt, při mikroskopickém pozorování bylo možno ve většině případů pozorovat přežívající štěpy. Tkáň, kterou bylo možno pozorovat na povrchu původních defektů, byla nově vytvořená tkáň na povrchu štěpu. Byla provedena analýza obrazu počítače tak, aby bylo možno kvantitativně vyjádřit vyplnění defektu v procentech, určit typy nové tkáně, vytvořené nad původní značkou a odhadnout míru integrace štěpů do okolní chrupavky. V případě všech těchto parametrů bylo možno pozorovat příznivé výsledky u všech zvířat ze skupiny, ošetřené rhBMP-2. Vytvořilo se větší množství nové chrupavky mezi štěpem a chrupavkou hostitele, čímž došlo k vyplnění štěrbiny a dokonalejší integraci štěpu v obklopující chrupavce (rhBMP-2 88,59 %, kontroly 64,82 %) . Vyplnění • φφφφ φ φφ ·· • φ φ * φ φ φ · φ φ φ φφφ φφφ φφ defektu chrupavky bylo lepši u skupiny, ošetřené rhBMP-2 (95,02 %) než u kontrolní skupiny (86,68 %). U kontrolní skupiny bylo možno pozorovat větší množství fibrózní tkáně (11,90 % ve srovnání s 5,65 % u zvířat, ošetřených rhBMP-2), kdežto větší množství přechodných tkání bylo možno nalézt u skupiny, ošetřené rhBMP-2 (36,38 % proti 20,53 % u kontrol). Nebylo možno pozorovat žádný významný rozdíl v celkovém histologickém a histochemickém hodnocení obou skupin. Periferní kvantitativní počítačová tomografie pQCT prokázala, že hustota kosti se v průběhu času zvyšovala v místě uložení štěpu. Po šesti týdnech a po devíti týdnech po operaci byla hustota kostní tkáně u zvířat, ošetřených rhBMP-2 statisticky významně vyšší a postup hojení byl daleko pokročilejší ve srovnání se stavem u kontrolních zvířat. Histologicky bylo možno pozorovat na ošetřených místech regenerované kostní trámce s fibrózní tkání na povrchu.

Příklad 4

Retence rhBMP-2 ex vivo

Retence rhBMP-2 v osteochondrálním štěpu při použití této techniky byla vyhodnocena na štěpech primátů, odlišných od člověka. Štěp byl ponořen do roztoku směsi ¹²⁵I - značeného rhBMP-2 a neznačeného rhBMP-2. Výsledky prokázaly, že množství rhBMP-2, absorbovaného do štěpu bylo úměrné koncentraci proteinu a době ponoření. Dalšími faktory, které retenci ovlivňují byla velikost štěpu a přítomnost prvků kostní dřeně mezi kostními strámci.

Příklad 5

Retence rhBMP-2 v průběhu času in vivo ···« · *· *· • 4 4 ······· ···· ··· · · • ······ ··· ·· ·· ···

Průběh retence rhBMP-2 v průběhu času v osteochondrálních štěpech byl vyhodnocen u králíků. Před implantací byl štěp ponořen do roztoku směsi ¹²⁵I značeného rhBMP-2 a neznačeného rhBMP-2 s obsahem 5 mikrogramů rhBMP-2 a 20 mikroCi¹²⁵I. Zvířata byla 22 dnů po chirurgickém zákroku pozorována kamerou, zachycující gamma-záření. Ve srovnání s časovým průběhem v kolagenové houbě jako nosiči byl poločas rhBMP-2 v osteochondrálním štěpu prodloužen z jednoho dne na 3 dny. Radioaktivita v množství 10 % původního množství přetrvávala do 11. dne v případě kolagenové houby a 22 dnů v případě štěpu.

Příklad 6

Cizorodé štěpy primátů, odlišných od člověka

Štěpy s průměrem 3,5 mm a délkou 6 mm byly odebrány z trochleárních žlábků 12 dospělých kynomologních makaků a transplantovány do míst s průměrem 3,5 mm a délkou 6 mm v mediálním a laterálním femorálním kondylu nepříbuzných jedinců. Polovina transplantátů byla na 2 minuty před transplantací ponořena do roztoku s obsahem 1,25 mg/ml rhBMP-2, druhá polovina transplantátu byla ponořena do pufru. Stejný postup byl proveden na druhé končetině 7 týdnů po prvním chirurgickém zákroku. Končetina byla imobilizována 2 týdny po každém chirurgickém zákroku, 9 týdnů po druhém zákroku byla zvířata usmrcena a byla provedena histologická analýza.

Z výsledků vyplývá, že kombinace účinného růstového faktoru, zvláště kostních morfogenetických proteinů a osteochondrálních autologních štěpů může být účinným způsobem léčení defektů kloubní chrupavky, zvláště v případě, že je zapotřebí dosáhnout regenerace chrupavky

• · · · • 4

44

44 44 do její původní tloušťky. Podle jiných provedeni je možno nanášet BMP-2 také na zmrazené osteochondrální cizorodé štěpy, určené pro náhradu defektů kloubní chrupavky.

Vynález byl ilustrován na řadě svých výhodných provedení. Je však zřejmé, že každý odborník může uskutečnit celou řadu změn a variací, které budou rovněž spadat do rozsahu a smyslu vynálezu. Je proto zřejmé, že vynález nemůže být omezen na provedení, uvedená v příkladové části přihlášky.

Claims

2. Způsob regenerace kloubní chrupavky, vyznačující se tím, že se do místa, kde je zapotřebí regenerace dosáhnout, aplikuje vhodný zdroj tkáně v kombinaci s alespoň jedním čištěným kostním morfogenetickým proteinem BMP.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako BMP užije BMP-2.
4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako BMP užije BMP-2.
5. Způsob regenerace kloubní chrupavky, vyznačující se tím, že se do místa, kde je zapotřebí regenerace dosáhnout, aplikuje alespoň jeden čištěný protein ze skupiny Vgr-2, růstových a diferenciačních faktorů GDF a BIP.
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se dále použije protein, který vyvolává tvorbu tkáně typu šlachy nebo vazu.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se jako protein, který vyvolává tvorbu tkáně typu šlachy nebo vazu, použije protein ze skupiny BMP-12, BMP-13 z podskupiny BMP-12 a MP52.

• *·«· · w· 4*·

4· 4 44 · · · ··· • 4«β · 4 · 4 ··

4 · 4 ···*«·4 • · 4 4 4 4 44 «44 44« 444·· 9·999
8. Prostředek pro regeneraci kloubní chrupavky, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden čištěný kostní morfogenetický protein BMP.
9. Prostředek pro regeneraci kloubní chrupavky, vyznačující se tím, že obsahuje vhodný zdroj tkáně v kombinaci s alespoň jedním čištěným kostním morfogenetickým proteinem BMP.
10. Prostředek podle nároku 8, vyznačuj ící se t i m, že jako BMP obsahuje BMP-2.
11. Prostředek podle nároku 9, vyznačuj ící se t i m, že jako BMP obsahuje BMP-2.
12. Prostředek pro regeneraci kloubní chrupavky, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden čištěný protein ze skupiny, tvořený Vgr-2, růstovými a diferenciačními faktory GDF a BIP.
13. Prostředek podle nároku 8, vyznačuj ící se t i m, že dále obsahuje protein, vyvolávající tvorbu tkáně typu šlachy nebo vazu.
14. Prostředek podle nároku 13, vyznačuj ící se t i m, že jako protein, vyvolávající tvorbu tkáně typu šlachy nebo vazu obsahuje protein ze skupiny BMP-12, BMP-13 z podskupiny BMP-12 nebo MP52.