JP2001507354A - 局所的モルフォゲンまたは形態形成処理された筋形成前駆体細胞による哺乳動物心筋層の処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、心筋層組織の欠損または損傷の危険にある、または羅患している哺乳動物被験体の処置の方法、および処置における使用のための方法を提供する。この方法は、特定のモルフォゲン、これらのモルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプターに対応するアゴニスト、または低分子形態形成的アクチベーターの投与、またはこれら薬剤で誘導されたする細胞の移植を包含する。本発明で有用なモルフォゲンには、OP1、CBMP-2A(BMP-2)、CBMP-2B(BMP-4)、および成長因子および分化因子のTGFβスーパーファミリーのモルフォゲンファミリーの他のメンバーが含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 局所的モルフォゲンまたは形態形成処理された筋形成前駆体細胞による 哺乳動物心筋層の処置 発明の分野 本発明は一般に、心筋層の損失若しくはそれに対する損傷の危険のある、また は罹患している、ヒトを含む哺乳動物の処置のための方法および調製物に関する 。この方法は、特定のモルフォゲン、これらモルフォゲンのインデューサー、対 応するモルフォゲンレセプターのアゴニストで、または低分子の筋形成アクチベ ーターで処理された哺乳動物筋形成前駆体細胞の移植を含む。 発明の背景 骨格筋または平滑筋とは異なり、成体哺乳動物の心筋は、増殖および再生力が 極端に限られている。発生の間、心筋層は、筋形成前駆体細胞の端と端との融合 により生じて分岐した筋原繊維を形成し、ここでは、個々の心筋細胞が、介在し た層板により接続される。心筋層になる筋形成前駆体細胞は臓側板に由来し、こ れは側方中胚葉の間葉に由来し、これはまた嚢胚形成の後に形成される中胚葉か ら生じる。成体哺乳動物心筋層には残存する筋形成前駆体細胞はなく、そしてそ れ故、一般に、失われたかまたは損傷した心筋層は、代表的には、新たな心筋層 よりはむしろ線維症組織または瘢痕組織で置き換わると考えられている。総説と して、B.M．Carlson編集(1981)Patten's Foundations of Embryology、第４版、 McGraw-Hill，New Yorkを参照のこと。その結果、例えば、心筋梗塞形成、うっ 血性心不全、物理的外傷(例えば自動車事故)、または感染に起因する心筋層の損 傷または損失は、代表的には機能的心筋層の永久的かつしばしば進行性の損失を もたらす。 これに対して、哺乳動物の骨格筋は、成体期においてさえ、かなり大きな増殖 および再生能力を有している。心筋層のように、骨格筋は、中胚葉の誘導の後に その最初の起源を有している。中胚葉の、背側、中間、および側方中胚葉への分 化の後、背側中胚葉の間葉は分化して筋分節を形成し、これは次に分化して筋形 成前駆体細胞を形成し、これは最後に骨格筋を形成する。心臓の筋形成前駆体細 胞とは異なり、骨格筋前駆体は、側面と側面が融合して未分岐多核筋原繊維を形 成する。重要なことには、骨格筋前駆体細胞のある部分は、筋細胞に分化せず、 むしろ筋細胞の細胞膜に付着する。これらの細胞は、成体期を通じて、大部分が 未分化の静止骨格筋「衛星細胞」として残存し得る。しかし、骨格筋の損傷に際 し、これらの衛星細胞は、筋形成前駆体細胞、または筋肉「幹細胞」になり、そ れらは増殖して新たなかつ機能的な骨格筋に分化する。しかし、損傷の後でさえ 、増殖した衛星細胞の一部分は、未分化のままであり、そして新たに形成された 筋原繊維に付着している。従って、骨格筋の衛星細胞は、哺乳動物の生涯を通じ て骨格筋の修復および再生を可能にする筋形成前駆体細胞の一定かつ再生可能な 供給源を提供する。 骨格筋衛星細胞の増殖および分化は、インビトロで広範に研究されている。例 えば、骨格筋の単純な生理食塩水抽出物は、衛星細胞を、培養で増殖させること が示されている(Myoblast Transfer Therapy，GriggsおよびKarpati編中の147-1 58頁、Bischoff(1989))。同様に、ニワトリ胚抽出物、または若いマウスからの 分化した筋管の馴化培地は、衛星細胞に強い分裂促進効果を示すが、年取ったマ ウスの筋管からの馴化培地は効果がより少ない(Mezzogiornoら(1993)Mech．Agei ng & Develop．70:35-44)。さらに、多くのホルモンおよび成長因子が、衛星細 胞増殖を増大することが見出されており、FGF、PDGF、ACTH、LIF、およびIGFを 含む(Bischoff(1989)；Mezzogiornoら(1993))。反対に、TGF-β₁は、基底膜では なく、筋原繊維細胞膜と接触するとき、衛星細胞増殖を阻害すると広く考えられ ている(Bischoff(1989)；Hathawayら(1991)J．Cell Physiol．146:435-441もま た参照のこと)。 興味深いことに、骨格筋損傷のラットモデルでは、衛星細胞増殖の徴候がある 前に、衛星細胞分化の徴候があったことが見出された(Rantanenら(1995)Lab．In vest．72:341-347)。このことは、骨格筋衛星細胞の２つの集団があるという可 能性を示唆している：迅速に分化して損傷組織に置き換わることにより損傷に応 答する「方向づけられた衛星細胞」、および増殖することによってより遅く応答 し、そしておそらく方向づけられた衛星細胞集団を新生する「幹衛星細胞」であ る。このシナリオでは、幹衛星細胞は、有糸分裂を行い、幹衛星細胞のままであ る１つの娘細胞、および方向づけられた衛星細胞になる別の細胞を生じ得る。 別の動物モデルでは、自己のマウス骨格筋細胞が、健康な筋肉から外植され、 インビトロで増殖され、そして次に壊死した骨格筋部位中に移植された(Myoblas t Transfer Therapy，GriggsおよびKarpati編中の159-166頁、Alameddineおよび Fardeau(1989))。これらの実験では、移植された衛星細胞が、壊死領域に定着し 、そして機能的筋管に分化し得たことが示された。同様に、PCT公開WO 96/28541 は、組織適合性ドナーマウス筋芽細胞が筋ジストロフィーのマウスモデルの弱ま った筋肉中に移植され、そして筋原繊維に分化し得ることを開示する。さらに、 bFGF中の筋芽細胞の増殖が、移植部位において有意により多い新たな筋原繊維を 生ずることが示されている。従って、インビトロで増殖させた骨格筋衛星細胞は 、筋肉回復または再生治療のための筋形成前駆体細胞の供給源として作用し得る 。 骨格筋衛星細胞の損傷した骨格筋を回復または再生する能力は、幾人かの研究 者を、筋形成前駆体細胞を用いて、損失または損傷した心筋筋肉を置換し得るか 否かを試験することに導いた。例えば、末端まで分化しておらずそして分裂する 能力を保持するマウス胎児心筋細胞が、同系の成体マウスの心筋層中に直接注入 され、そして新たなかつ明らかに機能的な心筋層を形成することが示された(Soo npaaら(1994)Science 264:98-101)。重要なことに、成体イヌ骨格筋から外植さ れた骨格筋衛星細胞をインビトロで増殖させ、そして心筋層低温損傷の部位中に 移植し得、そこで、それらが、おそらく心筋層中に存在する筋形成シグナルに応 答して「心臓様」筋肉細胞に分化するようである(Chiuら(1995)Ann．Thorac．Su rg．60:12-18)。モルフォゲンおよび成長因子 細胞増殖および/または分化を調節する形態形成因子または成長因子として作 用するように見える非常に多くのタンパク質が同定されている。代表的には、こ れらの成長因子は、特定のサブセットの細胞および/または組織に対してそれら の効果を奏する。従って、例えば、上皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成 長因子、種々のホルモン、および細胞増殖または分化を誘導または阻害する多く の他のタンパク質が同定され、そして特定のサブセットの細胞または組織に影響 することが示されている。 本明細書で「モルフォゲン」と呼ばれる、形態形成タンパク質の１つのグルー プは、異所性の、軟骨内の骨形態形成を誘導する能力によって最初に同定された 骨形態形成タンパク質(BMP)のファミリーのメンバーを含む。BMPの核酸およびア ミノ酸配列の引き続く特徴付けは、それらが成長および分化因子のTGFβスーパ ーファミリーのサブグループであることを示した。モルフォゲンファミリーのメ ンバーは、現在、哺乳動物骨形成タンパク質１(OP１、BMP７としても知られる) 、骨形成タンパク質２(OP２)、骨形成タンパク質３(OP３)、BMP２(BMP２Ａまた はCBMP２Ａとしてもまた知られる)、BMP３、BMP４(BMP２ＢまたはCBMP２Ｂとし ても知られる)、BMP５、BMP６、Vgr１、およびGDF１、ならびにXenopusのホモロ グVglおよびDrosophilaのホモログDPPおよび60Ａを含むことが示されている。こ のファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴を共有する分泌ポリペプチドをコ ードし、そしてそれらはプロタンパク質から同様にプロセッシングされて約100- 110アミノ酸のカルボキシ末端成熟タンパク質を生じる。すべてのメンバーは、 このドメインにシステインの保存されたパターンを共有し、そしてこれらタンパ ク質の活性形態は、単一ファミリーメンバーのジスルフィド結合ホモダイマーで あるか、または２つの異なるメンバーのヘテロダイマーのいずれかである(例え ば、Massague(1990)Annu．Rev．Cell．Biol．6:597；Sampathら(1990)J．Biol． Chem．265:13198)。 モルフォゲンファミリーのタンパク質のメンバーは、発生の間、種々の組織で 天然に発現される。例えば、BMP-2(即ちBMP-２Ａ)は、マウス胚の毛小胞、軟骨 および骨で発現する(Lyonsら(1989)Genes & Develop．3:1657-1668)；BMP３は、 ヒト胎児の肺および腎臓で最も高度に発現され、腸粘膜、ならびに軟骨膜および 骨膜のような骨格組織で高度に発現され、脳で発現されるが、胚の心臓および肝 臓では検出されないことが示されている(Vukicevicら(1994)J．Histochem．Cyto chem．42:869-875)；BMP４は、マウス胚において、発生中の四肢、心臓、顔面プ ロセスおよび初期のひげ小胞にともなう填塞された間葉において発現されること が示されている(Jonesら(1991)Development 111:531-542)；そしてOP１(BMP ７)は、ヒト胚において、免疫組織化学的に、硬節、肥厚軟骨細胞、骨芽細胞、 骨膜、副腎皮質、腎曲尿細管、胎盤、平滑筋、心筋および骨格筋、髄膜および神 経細胞、ならびに肺の基底膜、膵臓および皮膚に存在することが示されている(V ukicevicら(1994)Biochem．Biophys．Res．Commun．198:693-700)。幾つかのモ ルフォゲン(例えば、OP２およびBMP２)は、成体組織の分析では検出されず、こ のことはこれらモルフォゲンについては初期発生役割のみを示唆した(Ozkaynak ら(1992)J．Biol．Chem．267:25220-25227)。 上記のように、幾つかのモルフォゲンは、胚または成体哺乳動物心臓組織で発 現されることが示され、そしてモルフォゲンの種々の有用性が提案されかつ開発 されているが、筋形成前駆体細胞の、モルフォゲン、モルフォゲンインデューサ ー、モルフォゲンレセプターのアゴニスト、または低分子の形態形成アクチベー ターを用いた処置が、筋形成前駆体細胞の、形態形成を許容し得る環境下で、新 たなかつ機能的心筋層への増殖および/または分化を促進することで有用である ことを、先に、示されたまたは教示されたことはない。また、形態形成処理され た筋形成前駆体細胞が、損失または損傷した哺乳動物心筋層の処置に有用である ことも、先に、示されたまたは教示されたことはない。 発明の要旨 本発明は、心筋層の損失若しくはそれに対する損傷の危険にある、または罹患 している哺乳動物被験体の処置における使用のための処置方法および薬学的調製 物に関する。このような被験体は、心筋梗塞、心臓への物理的外傷(例えば自動 車事故で)を既に患った被験体、またはうっ血性心不全を既に患った被験体、お よび心筋梗塞またはうっ血性心不全を患うことが合理的に予想される被験体のよ うな、心筋層組織の損失を既に罹患した被験体を含む。特定の患者が危険にある か否かは、関連する医療または獣医学分野の当業者によって日常的になされ得る 決定である。 これらの処置方法では、筋形成前駆体細胞が、心筋層の損失若しくはその損傷 の危険にある、または罹患している哺乳動物に移植され、そしてこの筋形成前駆 体細胞は、移植前に、移植と同時に、または移植後に形態形成処理される。従っ て、例えば、形態形成処理された哺乳動物筋形成前駆体細胞は、心筋梗塞の部位 の哺乳動物心臓中に、またはうっ血性心臓疾患を有する被験体の損傷または弱っ た心筋層中に移植され得る。哺乳動物筋形成前駆体細胞は、骨格筋(例えば、骨 格筋衛星細胞)由来、胚組織(例えば、胚中胚葉の間葉)由来、またはインビトロ で維持された筋形成前駆体細胞株由来であり得る。従って、筋形成前駆体細胞は ドナー(例えば、組織型適合ドナー、兄弟、一卵性双生児、または胎児)由来であ り得、組織培養(例えば、培養中の未分化または部分的に未分化の筋形成細胞； 胚組織培養)由来であり得、または被験体から外植され、そしてモルフォゲン誘 導増殖および/または分化の後再移植され得る。最後に、移植細胞の形態形成処 理は、細胞の、モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセ プターのアゴニスト、または低分子形態形成アクチベーターによる、移植前、移 植と同時、または移植後の処置を含み得る。 本発明はさらに、インビボまたはインビトロにおける哺乳動物筋形成前駆体細 胞の増殖および分化を促進する方法に関する。従って、例えば、哺乳動物骨格筋 組織、胚筋形成前駆体細胞、または筋形成前駆体細胞株から単離された筋形成前 駆体細胞は、モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプ ターのアゴニスト、または低分子形態形成アクチベーターを用いた処置により刺 激されて増殖され得る。あるいは、またはさらに、哺乳動物筋形成前駆体細胞は 、形態形成的に許容可能な環境下で、刺激されて、筋細胞、特に心筋組織のマー カーを発現する筋細胞に分化する。 本発明はさらに、単離された哺乳動物筋形成前駆体細胞、および形態形成的に 許容可能な環境下で、筋形成前駆体細胞の増殖または分化を促進するに十分な量 のモルフォゲン、モルフォゲンのインデューサー、モルフォゲンレセプターのア ゴニスト、または低分子形態形成アクチベーターを含む治療調製物に関する。 本発明の方法および組成物は、本明細書でモルフォゲンとして規定される、真 核生物起源の特定タンパク質を用いて、筋形成前駆体細胞を、これらの形態形成 処理された筋形成前駆体細胞が形態形成的に許容可能な環境下に存在する場合、 それらが新たなかつ機能的な心筋層を形成するように移動、増殖および/または 分化するように処理し得るという事実を部分的に利用する。特に、本発明は、筋 形成前駆体細胞のこれらモルフォゲンを用いた処理が、これら細胞が形態形成的 に許容可能な環境下で新たなかつ機能的な心筋層に移動、増殖および/または分 化する確率、速度、または効率を増大または増加させるという事実に一部基づく 。従って、本発明によれば、形態形成処理筋形成前駆体細胞を用いて、哺乳動物 中の損失または損傷した心筋層を回復または再生し、またはこのような損失また は損傷の危険にある哺乳動物を予防的に処理し得る。本発明は、心筋組織が、損 失または損傷した組織の適切な再生または修復に十分な数の筋形成前駆体細胞を 欠いていると考えられ、そしてそれ故、モルフォゲンの、筋形成前駆体細胞(例 えば、骨格筋衛星細胞)を機能的心筋層に移動、増殖および/または分化させる能 力は予期されないという点で新規である。 好適な実施態様では、モルフォゲンは、一対の折り畳まれたポリペプチドを含 むダイマータンパク質であり、各々は、参照モルフォゲンのアミノ酸配列と規定 された関係を共有するアミノ酸配列をもつ。好適なモルフォゲンホリペプチドは 、形態形成活性のヒトOP-１(配列番号４)中に存在する配列と規定された関係を 共有する。しかし、本明細書に開示される、天然に存在するかまたは生合成の配 列の任意の１つ以上が、参照配列としてとして同様に用いられ得る。好適なモル フォゲンポリペプチドは、ヒトOP-１の少なくともＣ末端の６のシステインドメ イン(配列番号４の残基43-139)と規定された関係を共有する。好ましくは、モル フォゲンポリペプチドは、ヒトOP-１の少なくともＣ末端の７のシステインドメ イン(配列番号４の残基38-139)と規定された関係を共有する。即ち、好適なモル フォゲンポリペプチドは、筋形成活性をもつダイマータンパク質であり、各々が 参照配列に対応するか、またはそれに機能的に等価である配列を含む。好適なモ ルフォゲンの例は、哺乳動物、そして特にヒトのOP-1、CBMP-２Ａ(BMP-２)およ びCBMP-２Ｂ(BMP-４)を含む。 機能的に等価な配列は、参照配列内に配置されるシステイン残基の機能的に等 価な配置を含み、これらの複数のシステインの直線的な配置を改変するが、ダイ マーモルフォゲンタンパク質の折り畳まれた構造中のそれらの関係を実質的に損 なわないアミノ酸挿入または欠失を含み、形態形成活性に必要であり得るような 鎖内または鎖間ジスルフィド結合を形成するそれらの能力を含む。機能的に等価 な配列は、参照モルフォゲン配列(例えば、ヒトOP-１のＣ末端の７システインド メイン(本明細書では保存された７システイン骨格とも呼ばれる))の対応する残 基と１つ以上のアミノ酸残基が異なる配列を、この差異が、形態形成活性を破壊 しないことを条件に、含む。従って、参照配列中の対応するアミノ酸の保存的置 換が好適である。参照配列中の対応する残基に対して「保存的置換」であるアミ ノ酸残基は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似であるアミノ酸残基 であり、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成す る能力を含む化学的性質などを有する。特に好ましい保存的置換は、その教示が 本明細書に参考として援用される、Dayhoffら(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure、5:補遺3、ch.22(354-352頁)、Natl．Biomed．Res．Found.、Wa shington、D.C．20007にある「受容される点変異」について規定される規準を満 たすものである。 特定の実施態様では、参照モルフォゲンポリペプチドに機能的に等価であると 考えられるポリペプチドは、Needlemanら(1970)J．Mol．Biol．48:443-453の方 法を用い、Align program(DNAstar，Inc.)のようなコンピュータープログラムに より都合良く実施されて、それらとともに整列される。上記のように、規定され た関係を計算する目的には、候補配列中の内部ギャップおよびアミノ酸挿入は無 視され、慣習的に、候補配列と参照配列との間のアミノ酸配列相同性または同一 性のレベルとして表現される。本明細書では「アミノ酸配列相同性」は、アミノ 酸配列同一性および類似性の両方を含むと理解される。相同配列は、同一および /または類似アミノ酸残基を共有し、ここで類似残基とは、整列された参照配列 中の対応するアミノ酸残基に対する保存的置換、またはその「許可された点変異 」である。従って、参照配列と70％アミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド 配列は、整列された残基の任意の70％が、参照配列中の対応する残基と同一であ るか、またはその保存的置換であるかのいずれかである配列である。 本発明は、モルフォゲンの代わりにモルフォゲンインデューサーを含む方法お よび組成物を用いて代替え的に実施され得る。「モルフォゲンインデューサー」 は、細胞のゲノム内にコードされるモルフォゲンを産生および/または分泌する 能力のある細胞によるモルフォゲンの産生(即ち、転写、翻訳、および/または分 泌)を刺激する化合物である。内因性または投与されたモルフォゲンは、内分泌 因子、パラクリン因子またはオートクライン因子として作用し得る。従って、モ ルフォゲンのインデューサーは、細胞による内因性モルフォゲン合成を刺激し得 、そこでは、形態形成応答が、インビボまたはインビトロ(例えば、組織培養物 中)で近接する細胞により、またたインビボで離れた組織の細胞により(この場合 、分泌されたモルフォゲンが、例えば、個体の血流により、形態形成の部位に輸 送される)誘導される。好適な実施態様では、インデューサーは、モルフォゲン の発現および/または分泌を、インビボまたはインビトロで哺乳動物筋形成前駆 体細胞に利用可能なその量が増大するように刺激する。従って、インビボで筋形 成前駆体細胞の移動、増殖および/または分化を促進するために、モルフォゲン のインデューサーが、筋形成前駆体細胞それ自身による、または筋形成前駆体細 胞と同時培養されるその他の細胞によるモルフォゲンの産生を誘導するために投 与され得る。同様に、インビボで筋形成前駆体細胞の増殖および/または分化を 促進するために、モルフォゲンのインデューサーが、筋形成前駆体細胞自身によ る、または哺乳動物体内中の近接する若しくは離れた細胞によるモルフォゲン産 生を誘導するために局所的にまたは全身的に投与され得る。 なお別の実施態様において、モルフォゲンレセプターのアゴニストとして作用 する薬剤は、モルフォゲン自体の代わりに投与され得る。レセプターの「アゴニ スト」は、レセプターに結合し、そしてそれについてこのような結合の結果が、 レセプターの天然の内因性リガンドに結合する結果と類似する化合物である。す なわち、化合物は、レセプターとの相互作用の際に、内因性リガンドと同一かま たは実質的に類似の膜貫通および/または細胞内効果を生成しなければならない 。従って、モルフォゲンレセプターのアゴニストはレセプターに結合し、そして このような結合は、モルフォゲン結合と同一かまたは機能的に類似の結果を有す る（すなわち、形態形成の誘導）。アゴニストの活性または効力は、天然のリガ ンドのそれ未満であり得、その場合、アゴニストは、「部分的アゴニスト」であ ると言われるか、または天然のリガンドのそれと等しいかもしくはより大きくあ り得、この場合、「完全アゴニスト」であると言われる。従って、例えば、モル フォゲンのレセプターへの結合およびその活性化におけるモルフォゲンの活性を 模倣し得る小さなペプチドまたは他の分子は、モルフォゲンの等価物として利用 さ れ得る。好ましくは、アゴニストは、完全アゴニストであるが、部分的モルフォ ゲンレセプターアゴニストもまた、有利に利用され得る。このようなアゴニスト を同定する方法は、当該分野で公知であり、そしてモルフォゲン媒介応答を誘導 （例えば、後腎間葉の分化の誘導、軟骨内性骨の形成の誘導など）する化合物の ためのアッセイを含む。このようなアゴニストはまた、モルフォゲン「模倣物(m imic)」、「模倣物(mimetic)」、または「アナログ」として言及され得る。 あるいは、本明細書中に記載される低分子形態形成性アクチベーターは、心筋 表現型と関連するタンパク質の発現のレベルを増大することによって、筋形成前 駆体細胞の移動、増殖、および/または分化を促進するために、モルフォゲン自 体のかわりに投与され得る。例示的な方法は、モルフォゲン誘導性調節経路のい くつかの部分を調節する低分子形態形成性アクチベーターを導入する工程を包含 し、心筋層特異的タンパク質の発現または活性の効果的な増大を生じる。これは 、このようなタンパク質の内因性発現の増大を刺激するか、またはこのようなタ ンパク質の正常な発現の阻害の減少からのいずれかから生じ得る。例えば、低分 子形態形成性アクチベーターは、Ｉ型またはII型モルフォゲンレセプターにおい て；またはこれらのレセプターのセリン/スレオニンキナーゼ、もしくは他のキ ナーゼドメインにおいて作用し得る。経路活性化の別の標的は、Smadタンパク質 （単量体形態、二量体形態（ヘテロおよびホモ複合体を含む）、または三量体形 態（ヘテロおよびホモ複合体を含む）を含む）である。あるいは、低分子形態形 成アクチベーターが、表現型特異的遺伝子発現（すなわち、心筋層に特徴的なタ ンパク質の発現）を引き起こす転写因子（例えば、図２に示すＸタンパク質）の 活性化を導き得る。 好ましくは、モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセ プターのアゴニスト、または低分子形態形成アクチベーターが、移植前にインビ トロで、移植時にインビボで、または移植後にインビボでのいずれかで溶液中の 筋形成前駆体細胞と直接接触される。しかし、あるいは、モルフォゲン、モルフ ォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプターのアゴニストは、選択された薬 剤と適合性の任意の経路で投与され得、そして投与の経路に適切な任意の薬学的 に受容可能なキャリアとともに処方され得る。投与の好ましい全身性経路は、経 口、そして特に静脈内および腹腔内である。 さらなる実施態様において、本発明は、モルフォゲン、またはモルフォゲンイ ンデューサー、モルフォゲンレセプターのアゴニスト、または低分子形態形成性 アクチベーターを、一つ以上の「筋肉抽出物」、培養において増殖させた分化し た筋管由来の馴化培地、bFGF、IGF、PDGF、LIF、ACTH、MSH、またはG-CSFと組み 合わせて含む薬学的組成物を提供する。これらの組成物は、筋形成前駆体細胞の 増殖および/または分化を促進することにおいて有用である。 図面の簡単な説明 図１．この図のパネル1-1から1-12は、種々の天然に生じるモルフォゲンのア ミノ酸配列の表形式の配置である。好ましい参照配列は、配列番号４のヒトOP1 残基38〜139である。この図に示されるモルフォゲンポリペプチドはまた、配列 表において同定される。 図２．図２は、表現型特異的遺伝子の発現のためのモルフォゲン活性化調節経 路の模式図である。 発明の詳細な説明 Ｉ．定義 請求の範囲に記載される発明の主題をより明確にそしてより簡潔に指摘するた めに、以下の定義を、以下に記載される説明および添付の請求の範囲に使用され る特定の用語について提供する。 心筋層に対する損失または損傷の危険にある、または罹患している被験体。本 明細書中で使用されるように、被験体（好ましくは、哺乳動物（例えば、ヒト） ）は、その被験体が、低減されたかまたは変更された心臓機能に関して臨床的に 検出可能な機能的な心筋組織の損失を患っている場合、またはその被験体が、こ のような損失を患うことが合理的に予測され得る場合、心筋層に対する損失また は損傷の危険にある、または罹患していると言われる。心筋層に対する損失また は損傷の危険にあるかまたは罹患している被験体には、心筋梗塞をすでに患って いる被験体、低減した心臓機能を有する心臓に対する物理的な外傷（例えば、 自動車事故において）を患っている被験体、またはすでに鬱血性心不全と診断さ れている被験体；ならびに心筋梗塞もしくは鬱血性心不全を患うことが合理的に 予想され得る被験体が含まれるが、これらに限定されない。特定の被験体が危険 にさらされているか否かは、関連する医学または獣医学の分野の当業者によって 日常的になされ得る決定である。 筋形成前駆体細胞。本明細書中で使用されるように、用語「筋形成前駆体細胞 」は、筋形成し得る細胞、または形態形成的に許容可能な環境に存在する場合、 新しくかつ機能的な筋肉への増殖および分化のプロセスをいう。筋形成前駆体細 胞は、文献において「筋芽細胞」、「筋幹細胞」、または「衛星細胞」として様 々に言及される。 形態形成的に許容可能な環境。本明細書中で使用される「形態形成的に許容可 能な環境」は、特定の細胞型への細胞の分化を可能にするかまたは促進する環境 である。「形態形成的に許容可能な環境」は、それゆえ、細胞の分化を可能にす るかまたは促進するのに充分なほど、細胞分化のインヒビターを含まない。さら に、形態形成的に許容可能な環境は、多能性の細胞が特定の形態形成性経路に従 うことを可能にするかまたは促進するシグナルを（例えば、細胞-細胞接触、細 胞-細胞外マトリックス接触、または拡散性の因子を介して）提供する環境であ る。特に、心筋層分化に関して、形態形成的に許容可能な環境には、これらの細 胞の新しくかつ機能的な心筋層への分化を可能にするかまたは促進する筋形成前 駆体細胞に対するシグナルを提供する無傷のまたは損傷を受けた心筋層組織を含 む環境が含まれる。例えば、筋形成前駆体細胞は、筋繊維の原形質膜への接触に 応答して、少なくとも部分的に筋細胞に分化することが公知である。筋繊維原形 質膜の存在は、それゆえ、筋形成についての形態形成的に許容可能な環境の１つ のエレメントであり得る。同様に、神経からの電気的または生化学的な刺激、お よび種々の成長因子（以下を参照）は、筋形成にとって形態形成的に許容可能な 環境のエレメントであるようである。従って、形態学的に許容可能な環境は、一 つ以上のこれらのエレメントを含み得る。 II．好ましい実施態様の説明 Ａ．概説 本発明は、形態形成的に処置された哺乳動物筋形成前駆体細胞が、インビボで 哺乳動物心筋層の損失したかまたは損傷した部位で移植された場合に、新しくか つ機能的な哺乳動物心筋層を生成するための増殖および/または分化のプロセス を経て、それにより損失したかまたは損傷した組織を全部かまたは部分的に復元 または再生するという、驚くべき発見に部分的に依存する。この結果は、哺乳動 物心筋組織が、損失したかまたは損傷を受けた組織の適切な再生または修復のた めに充分な数の筋形成前駆体細胞を欠失していると考えられ、それゆえ哺乳動物 心筋層は、組織が損失するかまたは損傷を受けた後の機能的な復元または再生の ための不良な応答者であると以前には考えられていたという事実に鑑みて特に予 想外である。さらに、本発明は、非心筋細胞（例えば、哺乳動物骨格筋または胚 筋形成前駆体細胞に由来するもの）は、形態形成的に許容可能な環境において、 心筋層への増殖および分化を誘導され得るという驚くべき発見に部分的に依存す る。本明細書中に記載されるモルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モル フォゲンレセプターのアゴニスト、および低分子筋形成アクチベーターは、これ らが、成体哺乳動物において、心筋組織復元または再生において公知の役割を有 さないという事実にも関わらず、このような復元または再生を促進し得ることは さらに驚くべきことである。 発明のいかなる特定の理論に結びつけられることなく、モルフォゲン、モルフ ォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプターのアゴニスト、または低分子形 態形成アクチベーターは、形態形成的に許容可能な環境に移植された場合、筋形 成前駆体細胞の増殖を促進し、そしてそれらを新しくかつ機能的な心筋層への分 化に対してより感受性にし得ると考えられる。従って、モルフォゲン、モルフォ ゲンインデューサー、モルフォゲンレセプターのアゴニスト、または低分子形態 形成アクチベーターは、「運命を変える」ことが可能なように、そしてこれらが 平滑筋または骨格筋にのみ分化するのではなく、これらが増殖し、次いで新しく かつ機能的な心筋層に分化することが可能なように、これらの筋形成前駆体細胞 の多能性を増大させ得ると考えられる。 Ｂ．哺乳動物筋形成前駆体細胞の単離および培養 哺乳動物筋形成前駆体細胞を単離および培養する方法は、当該分野でよく確立 されている。例えば、筋形成前駆体細胞は、以下の実施例にさらに記載されるよ うに、骨格筋の解離および衛星細胞のその後の培養によって得られ得る。あるい は、筋形成前駆体細胞は、胚組織から得られ得る。ここで、これらは、中胚葉の 誘導後に、体節の筋分節由来の胚筋芽細胞として生じる。筋形成前駆体細胞はま た、形態形成学的に許容可能な環境に移植した後に筋芽細胞に分化するように誘 導させ得る細胞株（例えば、多能性中胚葉間葉細胞株または部分的に脱分化した 研究室細胞株）から得られ得る。一般には、Hathawayら(1991)J．Cell．Physiol ．146:435-441;Mezzogiornoら(1993)Mech．Ageing & Develop．70:35-44;Alamed dineおよびFardeau(1989);Chiuら、(1995)Ann．Thorac．Surg．60:12-18を参照 のこと。 １．骨格筋からの筋形成前駆体細胞の単離 好ましい実施態様において、筋形成前駆体細胞は、骨格筋から得られる。骨格 筋ドナーは、組織適合性および可能な組織拒絶の問題を回避するために、好まし くは、心筋処置の被験体であるか、または一卵性双生児である。あるいは、他の ファミリーメンバーまたは組織適合性ドナー（臓器移植の目的で産生したトラン スジェニック哺乳動物（例えば、MHCマーカーを欠失するか、またはヒト化MHCタ ンパク質を発現するもの）を含む）は、骨格筋組織のドナーとして利用され得る 。組織適合性の程度に依存して、免疫抑制の標準的な方法が、移植された細胞の 拒絶を防止するために本発明と組み合わせて必要とされ得る。 簡単には、骨格筋のサンプルは、局所麻酔または全身麻酔下で、被験体の一つ 以上の骨格筋から切り出される。任意の過剰な結合組織および筋膜は切除され、 筋肉は、滅菌溶液中でリンスされ、そして筋肉は、例えば、ハサミで、または肉 挽き器を介して実質的に均一になるまでミンチすることによって解離される。切 り出される筋肉の量は、当然に、処置に必要とされる筋形成前駆体細胞の量、お よびインビトロで促進されるべき筋形成前駆体細胞増殖の程度に依存する。しか し、代表的には、１〜100グラム、より好ましくは10〜50グラムの量の骨格筋組 織が除去される。このような量は、一つ以上のより大きな、比較的表層性の四肢 の筋肉（例えば、上腕二頭筋、上腕三頭筋、上腕筋、腕撓骨筋、大腿部直筋、大 腿部二頭筋、半腱様筋、薄筋、外側広筋、腓腹筋、前方脛骨）、胸および肩（例 えば、胸筋、三角筋）、骨盤および臀部（例えば、中臀筋、大臀筋）、背（例え ば、僧帽筋、広背筋）、または腹部（例えば、腹部外側斜筋(obliquus abdomini s extrnus）、腹直筋）から都合よく除去され得るが、任意の利用可能な骨格筋 から得られ得る。 好ましくは、次いで、解離した筋肉をタンパク質分解酵素（例えば、プロナー ゼ（Sigma，St．Louis，MO）、コラゲナーゼ（Sigma，St．Loius，MO）、ヒアル ロニダーゼ（Sigma，St．Loius，MO）、またはトリプシン（Difco Laboratories ，Inc.，Detroit，MI）とともに、37℃で15分〜１時間インキュベートして、残 存する結合組織を除去する。消化した筋肉組織の塊は、必要に応じて、例えば、 反復的にピペットするかまたは混合することによってさらに解離され得る。さら に、消化した塊は、必要に応じて、消化された結合組織および酵素を除去するた めに、洗浄、ペレット化、および再懸濁され得、そして任意の残存する細片は、 濾過によって除去され得る。次いで、細胞を滅菌緩衝液（例えば、リン酸緩衝化 生理食塩水溶液）中で懸濁し、そして約500〜550gで、約10分間遠心分離し、よ り大きな多核骨格筋繊維および筋細胞を沈降させ、一方で衛星細胞を上清に残す 。遠心分離の前または後のいずれかで、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS，GIB CO BRL，Grand Island，NY）を、混合物中に添加し、酵素的切断プロセスを停止 させ得、そして抗生物質を微生物の増殖を予防するために添加し得る。所望なら ば、衛星細胞は、繊維芽細胞および他の残存する細胞から、密度遠心分離法を使 用して分離され得る(例えば、Yablonka-ReuveniおよびNameroff(1987)Histochem istry 87:27-38を参照のこと)。 ２．胚からの筋形成前駆体細胞の単離 筋形成前駆体細胞は、中胚葉の誘導後に発達の種々の段階で、哺乳動物胚また は胎児（合わせて「胚」）組織から単離され得る。従って、例えば、筋形成前駆 体細胞は、背側、中間、および側方中胚葉間葉へのそのさらなる分化の前に胚中 胚葉から得られ得る。分化のこの段階の後、任意の中胚葉細胞は、利用され得る が、好ましくは、骨格筋または心筋に向かう分化の経路に沿って生じる細胞が利 用される。例えば、背側中胚葉間葉は、筋分節を形成するように分化し、筋分節 は次いで分化して、胴および肢芽の両方の骨格筋を形成する。肢芽の中胚葉間葉 は、さらに分化して外肢（および四肢骨）の骨格筋を形成する。同様に、側方中 胚葉間葉は、分化して、部分的に臓側板を形成し、これは次いで分化して心筋層 および内臓（および、生殖腺、循環系、および他の内臓の一次エレメント）の平 滑筋を形成する。当業者は、それゆえ、本発明における使用のための適切な胚細 胞を容易に選択し得る(例えば、Soonpaaら、（1994）Science 264:98-101を参照 のこと;また一般には、B.M．Carlson編（1981）Patten's Foundations of Embry ology、第四版、McGraw-Hill，New Yorkもまた参照のこと)。一旦切り出される と、胚組織は、骨格筋に関して本質的に上記のように処置され、筋形成前駆体細 胞が単離され得る。 成人哺乳動物の骨格筋から得られる細胞に関して、組織適合性の問題は、胚筋 形成前駆体細胞の移植に際して生じ得る。それゆえ、組織適合性の程度に依存し て、免疫抑制の標準的な方法が、本発明に関連して、移植された細胞の拒絶を防 止するために必要とされ得る。 ３．樹立された細胞株からの筋形成前駆体細胞の単離 樹立された細胞株（筋形成前駆体細胞株、筋芽細胞細胞株、または間葉細胞株 を含む）はまた、筋形成前駆体細胞を成人組織または胚組織から単離する必要な しに、本発明において利用され得る。例えば、樹立されたマウス筋芽細胞株C₂C_{1 2} (ATCC CRL 1772)は、マウス心臓に移植されており、そして機能的な心筋層に分 化し、そして天然の心筋層と融合することが示されている(Kohら（1993）J．Cli n．Invest．92:1548-54)。あるいは、多能性の中胚葉幹細胞株（一次真皮繊維芽 細胞株、平滑筋細胞株、または軟骨芽細胞系統を含む）は、筋肉細胞に分化する ようにされ得る(例えば、Choiら(1990)Proc．Nat．Acad．Sci.（USA）87:7988-7 992を参照のこと)。最後に、種々の樹立された哺乳動物筋形成細胞株（例えば、 ヒト細胞株HISM（ATCC CRL 1692）、マウス細胞株C2C12（ATCC CRL 1772）、NOR -10（ATCC CRL 197）、およびG-8(ATCC CRL 1456)、およびラット細胞株A7r5(AT CC CRL 1444)、A10(ATCC CRL 1476)、H9c2(2-1)(ATCC CRL 1446)、L 6(ATCC CRL 1458)およびL8(ATCC CRL 1769)を含む）が、本発明に従う使用のた めに市販されている。これらの細胞株の元の報告に記載されるものと本質的に同 一のプロトコルに従って（引用については、ATCC Catalogue of Cell Lines & H ybridomasを参照のこと）、当業者は、匹敵する細胞株を任意の哺乳動物種から 容易に産生し得る。 ４．筋形成前駆体細胞の培養 筋形成前駆体細胞は、固体または液体培地上で培養され得る。従って、例えば 、筋形成前駆体細胞を、穏やかなまたは定期的な撹拌を維持しながら、液体培地 のフラスコ中に懸濁し得る。あるいは、細胞は、固体基質上にプレートされ得、 そして液体培地で育成し得る。適切な液体培地は、当該分野で周知であり、そし てMcCoy's、M119、最小必須培地(MEM)、Dulbecco改変イーグル培地（例えば、GI BCO BRL，Grand Island，NY、またはSigma Chemical Company，St．Louis，MOか ら市販されている）などが含まれるがこれらに限定されない。これらの培地は、 当然に、さらなる緩衝液または栄養素溶液（例えば、10％ウシ胎児血清、３％ウ マ血清）、または抗糸状菌剤および/または抗生物質（例えば、50〜5,000IU/ml ペニシリン、50-5,000μg/mlストレプトマイシン、5-50μg/mlゲンタマイシン） を補充され得る。好ましくは、液体培地は、24〜48時間毎に交換され、そして培 養物は、約37℃の比較的一定の温度で、通常のまたは５％CO₂富化湿潤雰囲気下 で維持される。固体基質上での培養のために、細胞は、好ましくは、60mmのプレ ートあたり約10⁴〜10⁶細胞の密度で播種される。固体基質への細胞の接着を促進 するために、プレートを必要に応じて、例えば、基底膜マトリゲルまたはラミニ ン（Sigma Chemical Company，St．Louis，MO）でコートし得るが、以下に記載 のように、接着および/またはコンフルエンスは、増殖を阻害し得る。 成熟前分化を阻害する間、インビトロでの筋形成前駆体細胞の増殖を可能にす るまたは促進するために、多数の工程が採用され得る。例えば、筋形成前駆体細 胞増殖は、TGF-βによって阻害され（AllenおよびBoxhorn(1989)J．Cell Physio l．138:311-315）、そして筋原線維原形質膜と接触する（Bischoff(1989)）こと が示されており；そして、生理食塩水「筋抽出物」（Bischoff（1986）Dev．Bio l．115:140）、培養物中で増殖した分化した筋管（Mezzogiornoら(1993)Mech. Ageing & Develop．70:35-44）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）（Cleggら （1987）J．Cell．Biol．105:949-56）、インスリン様増殖因子（IGF）（Ewton およびFlorini(1977)Endocrinology 106:577-587；Tollfsenら(1989)Proc.Nat． Acad．Sci.（USA）1543-1547）、血小板由来増殖因子（PDGF）（Yablonka-Reuve niら(1990)J．Cell．Biol．111:1623-1629）、白血球阻害因子（LIF）（Austin およびBurgess（1991）J．Neuro．Sci 101:193-197）、副腎皮質ホルモン（ACTH ）（Cossuら(1989)Devolop．Biol 131:331-336；De Angelisら(1992)Dev．Biol ．151:446-458）、メラノサイト刺激因子（MSH）（Cossuら(1989)Develop．Biol ．131:331-336）、および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）（AustinおよびBurg ess（1991）J．Neuro．Sci．101:193-197）由来の馴化培地によって促進される ことが示されている。従って、移植前のインビトロでのおよび／または移植後の インビボでの筋形成前駆体細胞の増殖を促進するために、細胞を、１つ以上のこ れらの因子または他の公知の分裂促進因子の存在下で増殖させ得る。さらに、当 該分野において一般に公知であるように、このような細胞の増殖は、継代の繰り 返し（例えば、培養プレートからの接着細胞の取り出すための希薄トリプシンで の処理、そして２〜３日間毎日、より低い密度での再プレーティング）、液体培 地中での増殖、細胞接着のエンハンサーの非存在下での増殖、細胞接着のインヒ ビターの存在下での増殖、および／またはコンフルエンスより低い密度での増殖 によって、促進され得る。 本発明の筋形成前駆体細胞が、移植の前にインビトロで培養されることが必要 ということは全くない。実際、治療有効数の筋形成前駆体細胞が、培養なしに、 都合良くおよび商業的に入手され得る場合、この工程は省略され得る。一方、こ のような細胞の供給（例えば、胎児組織から）が希であるか、または侵襲性手段 （例えば、ドナーまたはドナー／被験体由来の筋の実質的な部分の切除）を介し てのみ得られ得る場合、より少数の細胞を最初に入手し、次いでインビトロで増 殖することが好ましい。細胞の供給源、培地、および他の増殖因子の存在または 非存在に依存して、倍加時間は変化するが、およそ12時間の倍加時間が、筋抽出 物の存在下で増殖させた筋原細胞（satellite cell）について文献に報告されて いる（Bischoff，(1989)）。従って、移植前の筋形成前駆体細胞集団を増殖する ために、数日間から一週間の培養時間が、本発明の方法において使用され得るこ とが意図される。 培養プレートまたは容器に付着した、いかなる細胞をも取り出すために、筋形 成前駆体細胞は短期間のトリプシン処理および遠心分離（例えば、10から15分間 、500〜1000gで）によって収集される。次いで細胞は、生理学的に利用可能な緩 衝液（例えば、ＰＢＳ、リンゲル生理食塩水）中に、適切な密度（例えば、10³ 〜10⁷細胞／ml）で再懸濁され得る。 最後に、モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプタ ーアゴニスト、および低分子形態形成アクチベーターが、増殖および／または続 く分化を補助するために、培養中で筋形成前駆体細胞（もしあれば）を処理する ために使用され得ることが留意されるべきである。あるいは、筋形成前駆体細胞 は、モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプターアゴ ニスト、または低分子のモルフォゲンのアクチベーターで（移植と同時、または 移植後に）処理され得る。モルフォゲンインデューサーの場合、筋形成前駆体細 胞は、モルフォゲンを産生することによって、これらのモルフォゲンインデュー サーに応答する補助細胞とともに同時培養され得る。次いで筋形成前駆体細胞を 、これらの補助細胞とともに移植し得るか、または標準的な細胞分離技術（これ は、当業者に公知であるが、使用される補助細胞の型によって変化する）（例え ば、密度遠心分離、細胞型特異性細胞毒素）によって同時培養物から単離される 。 Ｃ．心筋層部位での筋形成前駆体細胞の移植 筋形成前駆細胞は、当該分野で公知の任意の種々の外科的技術によって哺乳動 物心筋層の欠失または損傷の部位で移植され得る。これらの技術は、最小の浸潤 （例えば、胸壁を通す針による注入）から実質的な浸潤（例えば、心筋層の開胸 および切開、続いて移植、移植部位の縫合、および胸の閉鎖）までの範囲である 。いかなる所定の場合にも使用されるこの技術は、処置されるべき心筋層部位の サイズ、部位の接触性、および被験者の年齢ならびに体力のような要因に依存す る。 一般に、筋形成前駆体細胞は、生理学的に受容可能な緩衝液において移植され る。処置部位に投与される液量を最小化するために、細胞はこの溶液内で比較的 高力価であり得る（例えば、10⁵〜10⁷細胞／ml）。溶液は、上記のように増殖因 子を含み、移植部位内での筋形成前駆体細胞の増殖をさらに促進し得るか、また はこのような因子を含まず、その結果、心筋層移植部位の形態学的に任意の環境 における新規および機能的心筋層への分化を促進し得る。さらに、上記のように 、筋形成前駆体細胞は、モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォ ゲンレセプターアゴニスト、または低分子形態形成アクチベーターを用いて、同 時に移植し得るか、またはモルフォゲン処置が、移植の後に行われ得るかのいず れかである。 従って、例えば、筋形成前駆体細胞、ならびにモルフォゲン、形態形成アクチ ベーター、モルフォゲンレセプターアゴニスト、または低分子の形態形成アクチ ベーターの溶液は、以下の様式で本質的に心筋梗塞部位に移植され得る。例えば 、左心室の前壁に対する心筋梗塞を処置するために、左開胸を、肋間腔における （例えば、第六肋間隙）全身麻酔下で行い、そして梗塞の部位を、観察によって 決定する。外科医の判断で、心臓を止めても止めなくてもよく、そして心臓肺機 構へ全血流をバイパスさせ得る。次いで筋形成前駆体細胞を、静脈内カテーテル （例えば、Criticon，Tampa，FLからの16ゲージテフロンカテーテル）を使用し て、梗塞内の１つ以上の部位に直接注入し得る。最初の注入は、モルフォゲン、 モルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプターアゴニスト、または低分 子形態形成アクチベーターを含み得るか、またはこれらは梗塞部位への１つ以上 のさらなる注入に含まれ得る。あるいは、多数の非経壁切開は、心筋線維の方向 と並行に「チャンネル」を作製するために、梗塞の部位でなされ得る。筋形成前 駆体細胞の懸濁液（モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォゲン レセプターアゴニスト有りまたは無しで）は、次いで、これらのチャンネルおよ び縫合によって閉鎖されるチャンネル内に導入され得る。最終的に、心膜を縫合 し、そして胸壁を標準的な外科的技術によって閉鎖する（使用する場合、心肺機 械からの心臓への全身循環を再開始および復帰後）。慢性的に悪化した哺乳動物 心筋層の処置は、移植部位が一般化された心筋悪化の領域に対応して選択され、 従って、より拡散し得ることを除いて、同様に行われ得る。 移植された筋形成前駆体細胞の数は、回復または再生される心筋層組織の量に 従って変化する。回復または再生される細胞の用量は、心臓画像の標準的な技術 によって確認され得る。一般には、ほぼ約10⁴〜10⁵の筋形成前駆細胞が１mgの心 筋層組織を回復または再生させるのに必要であることが予期される（例えば、Al ameddineおよびFardeau(1989)を参照のこと）。Ｄ．モルフォゲン、インデューサー、アゴニスト、および低分子形態形成アクチ ベーター 本発明において有用なモルフォゲンとして、もともと骨形成タンパク質(米国 特許第5,011,691号を参照のこと（これは、本明細書中に参考として援用される ）)として同定された真核生物タンパク質が挙げられる。例えば、OP1、OP2、OP3 、CBMP2A(BMP-2)、CBMP-2B（BMP-4）、およびBMP3タンパク質（配列番号４〜９ 、15〜22、25〜27）、ならびにDPP(配列番号10、Drosophila由来）、Vgl(配列番 号11、Xenopus由来)、Vgrl(配列番号12、マウス由来)、GDFI(配列番号13、30、 および31、ヒト由来、Lee(1991),PNAS:88 4250-4254を参照のこと)、60A(配列番 号23および24、Drosophila由来、Whartonら(1991)、PNAS:88 9214-9218を参照の こと)、ドーサリン-1(ニワトリ由来、Baslerら(1993)、Cell:73 687-702およびG enBank登録番号L12032を参照のこと)、およびGDF5(マウス由来、Stormら(1994) ，Nature 368:639-643を参照のこと)のようなアミノ酸配列の関連したタンパク 質である。さらに有用なモルフォゲンとして、米国特許第5,011,691号に開示さ れる生合成モルフォゲン構築物が挙げられる(例えば、COP１、３〜５、７および 16、ならびにdor3、NODAL、UNIVIN、BMP9、BMP10、GDF3、GDF6、GDF7、CDMP2、 およびSCREWを含む当該分野で公知の他のもの)。米国特許第4,968,590号もまた 参照のこと（これは、本明細書中で参考として援用される）。 本明細書中でモルフォゲンと同定および/または認識された天然に存在するタ ンパク質は、TGFβスーパーファミリーまたはスーパー遺伝子ファミリーとして 知られる配列関連タンパク質の緩やかな進化的グループ分け内に異なるサブグル ープを形成する。天然に存在するモルフォゲンは、それらのＣ末端領域(ドメイ ン)において実質的なアミノ酸配列相同性を共有している。代表的には、前述の 天然に存在するモルフォゲンは、Ｎ末端シグナルペプチド配列(代表的には約30 残基未満)、それに続く成熟Ｃ末端ドメインを生じるように切断される「プロ」 ドメインを有する前駆体として翻訳される。シグナルペプチドは、Von Heijne(1 986),14 Nucleic Acids Research 4683-4691に記載の方法を用い、所定の配列中 の予測され得る切断部位で、翻訳時に迅速に切断される。プロドメインは代表的 には、完全にプロセスされた成熟Ｃ末端ドメインの約３倍大きい。本明細書中で は、モルフォゲンの「プロ」形態は、モルフォゲンポリペプチドのプロおよび成 熟ドメインをそれぞれ有する折りたたまれた１組のポリペプチドを含むモルフォ ゲンをいう。代表的には、モルフォゲンのプロ形態は、生理的条件下では成熟型 よりも可溶性である。プロ形態が培養された哺乳動物宿主細胞から分泌される主 要な形態のようである。 表１(下)に、本明細書中で用いられているそれらの名称、それらの配列番号レ ファレンス、および配列表中には含まれていない全長タンパク質のアミノ酸配列 の出版物供給源を含む、現在までに同定された種々の天然に存在するモルフォゲ ンを要約する。表１に記載したそれぞれの一般的名称のそれぞれは、以下に言及 したおよび配列表に記載した同定配列をコードする核酸から発現された形態発生 的に活性なタンパク質、または形態発生的に活性なフラグメントもしくはその前 駆体(その天然に存在するおよび生合成的変異体のようなその機能的等価物を含 む)を含むことが意図され、そして理解されるべきである。天然に存在するこれ らの変異体は、単一の生物学的種の他の個体から単離された対立遺伝子的変異体 形態、および系統発生的に異なる生物学的種から単離された系統発生的対応物( 種)変異体形態（同種）を含む。下記の刊行物の開示は、本明細書中に参考とし て援用される。 表１ 「OP1」。一般的に、少なくとも、配列番号４に開示されるヒトOP1タンパク質( 「hOP1」)、および配列番号５に開示されるマウスOP1(「mOP1」)を含むOP1タン パク質をコードする核酸から発現される形態形成的に活性なタンパク質をいう。 ヒトおよびマウスOP1タンパク質のそれぞれにおいて、保存された７個のシステ イン骨格が、残基38から残基139により定義される。そこにコードされ、そして 全長タンパク質に相当する、cDNA配列およびアミノ酸配列が、配列番号15および 16(hOP1)ならびに配列番号17および18(mOP1)に提供される。成熟タンパク質は残 基293〜431(hOP1)および残基292〜430(mOP1)により定義される。切断されて成熟 な形態発生的に活性なタンパク質を生じるタンパク質の「プロ」領域は、残基30 〜292(hOP1)および残基30〜291(mOP1)により本質的に定義される。 「OP2」。一般的に、少なくとも、配列番号６に開示されるヒトOP2タンパク質( 「hOP2」)、および配列番号７に開示されるマウスOP2タンパク質(「mOP2」)を含 むOP2タンパク質をコードする核酸から発現される形態形成的に活性なタンパク 質をいう。ヒトおよびマウスOP2タンパク質のそれぞれにおいて、保存された７ 個のシステイン骨格が、配列番号６および７の残基38から残基139により定義さ れる。そこにコードされ、そして全長タンパク質に相当する、cDNA配列およびア ミノ酸配列が、配列番号19および20(hOP2)ならびに配列番号21および22(mOP2)に 提供される。成熟タンパク質は残基264〜402(hOP2)および残基261〜399(mOP2)に より本質的に定義される。切断されて成熟な形態発生的に活性なタンパク質を生 じるタンパク質の「プロ」領域は、残基18〜263(hOP2)および残基18-260(mOP1) により本質的に定義される。 「OP3」。一般的に、少なくとも、配列番号26(「mOP3」)に開示されるマウスOP3 タンパク質を含むOP3タンパク質をコードする核酸から発現される形態発生的に 活性なタンパク質をいう。その保存された７個のシステインドメインは、相当す るmOP2およびhOP2配列と79％より大きいアミノ酸同一性、および相当するOP1配 列と66％より高い同一性を共有する、配列番号26の残基298〜399により定義され る。上記のアミノ酸配列をコードするcDNA配列が、配列番号25に提供される。OP 3は、今日までに同定されたモルフォゲンの中で、保存された７個のシステイン ドメイン中の９位の残基(例えば、配列番号26の残基315)がセリンである点で(他 のモルフォゲンが代表的にはこの位置がトリプトファンであるのに対して)珍し い。 「CBMP2」。一般的に、CBMP2タンパク質(少なくともヒトCBMP2A(「hCBMP2A」、 配列番号８)およびヒトCBMP2B(「hCBMP2B」、配列番号９)を含む)をコードする 核酸から発現される形態形成的に活性なタンパク質をいう。BMP2AおよびBMP2B、 またはBMP2およびBMP4として文献中でいわれる、その全長タンパク質のアミノ酸 配列が、Wozneyら、(1988),242 Science 1528-1534中に明らかにされる。BMP2(B MP2A)のプロドメインは、公開された配列の残基25〜248を含むようである；成熟 タンパク質は残基249〜396を含むようである。BMP4(BMP2B)のプロドメインは公 開された配列の残基25〜256を含むようである；成熟タンパク質は残基257〜408 を含むようである。 「DPP」。一般的に、Drosophila DPP遺伝子によりコードされ、そして少なくと も配列番号10の保存された７個のシステイン骨格を規定するタンパク質をいう。 その全長タンパク質のアミノ酸配列はPadgettら(1987),Nature 325 81-84に明ら かにされる。そのプロドメインは公開された配列のシグナルペプチド切断部位か ら残基456へ伸びているようである；その成熟タンパク質は残基457〜588により 定義されるようである。 「Vgl」。一般的に、Xenopus Vgl遺伝子によりコードされ、そして少なくとも配 列番号11の保存された７個のシステイン骨格を規定するタンパク質をいう。その 全長タンパク質のアミノ酸配列はWeeks(1987),51 Cell 861-867に明らかにされ る。そのプロドメインは公開された配列のシグナルペプチド切断部位から残基24 6へ伸びているようである；その成熟タンパク質は残基247〜360により定義され るようである。 「Vgr1」。一般的に、マウスVgr-1遺伝子によりコードされ、そして少なくとも 配列番号12の保存された７個のシステイン骨格を規定するタンパク質をいう。そ の全長タンパク質のアミノ酸配列はLyonsら(1989),PNAS 86 4554-4558に明らか にされる。そのプロドメインは公開された配列のシグナルペプチド切断部位から 残基299へ伸びているようである；その成熟タンパク質は残基300〜438により定 義されるようである。 「GDF1」。一般的に、ヒトGDF-1遺伝子によりコードされ、そして少なくとも配 列番号13の保存された７個のシステイン骨格を規定するタンパク質をいう。その 全長タンパク質のcDNAおよびコードされたアミノ酸配列は、配列番号30および31 に提供される。そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基214へ伸 びているようである；その成熟タンパク質は残基215〜372により定義されるよう である。 「60A」。一般的に、60Aタンパク質または形態形成的に活性なそのフラグメント をコードする核酸(少なくとも、配列番号24に開示される、Drosophila 60Aタン パク質)から発現される形態形成的に活性なタンパク質をいう。Drosophila 60A cDNAは、配列番号23に開示されるcDNAである。そのプロドメインはシグナルペプ チド切断部位から残基324へ伸びているようである；その成熟タンパク質は残基3 25〜455により定義されるようである。60Aタンパク質の活性フラグメントは、配 列番号24の残基354-455の保存された７システイン骨格によって規定されるよう である。60Aタンパク質は、本明細書中ではヒトおよびマウスOP1遺伝子の系統形 態学的に対応する変異体であるようである；Sampathら(1993)、PNAS 90 6004-60 08。 「BMP3」。一般的に、ヒトBMP3遺伝子によりコードされ、そして少なくとも配列 番号27の保存された７個のシステイン骨格を規定するタンパク質をいう。その全 長タンパク質のアミノ酸配列は、Wozneyら(1988)，242 Science 1528-1534に明 らかにされる。そのプロドメインは公開された配列のシグナルペプチド切断部位 から残基290へ伸びているようである；その成熟タンパク質は残基291〜472によ り定義されるようである。 「BMP5」。一般的に、ヒトBMP5遺伝子によりコードされ、そして少なくとも配列 番号28の保存された７個のシステイン骨格を規定するタンパク質をいう。その全 長タンパク質のアミノ酸配列は、Celesteら(1991)，87 PNAS 9843-9847に明らか にされる。そのプロドメインは公開された配列のシグナルペプチド切断部位から 残基316へ伸びているようである；その成熟タンパク質は残基317〜454により定 義されるようである。 「BMP6」。一般的に、ヒトBMP6遺伝子によりコードされ、そして少なくとも配列 番号29の保存された７個のシステイン骨格を規定するタンパク質をいう。その全 長タンパク質のアミノ酸配列は、Celesteら(1990)，87 PNAS 9843-5847に明らか にされる。そのプロドメインは公開された配列のシグナルペプチド切断部位から 残基374へ伸びているようである；その成熟配列は残基375〜513により定義され るようである。 図１に示すように、OP2およびOP3タンパク質は、このファミリーの他の既知の タンパク質に共通の保存されたシステイン骨格またはドメインに加えて、保存さ れたＣ末端領域に付加的なシステイン残基(例えば、配列番号６および７の残基4 1を参照のこと)を有する。GDF1タンパク質は、保存された骨格内に４つのアミノ 酸挿入(配列番号13の残基44〜47)を有するが、この挿入物は、折りたたまれた構 造内でのシステイン残基の関係に干渉しないようである。さらに、CBMP2タンパ ク質は、システイン骨格内の１つのアミノ酸残基を欠いている。従って、これら のモルフォゲンポリペプチドは、ヒトOP1の好ましい参照モルフォゲン配列(配列 番号４の残基38〜139)について、本明細書中で用いられた整列の原理を例証する 。 特定の好ましい実施態様において、本明細書中で有用なモルフォゲンとして、 モルフォゲンポリペプチドのアミノ酸配列が、前述の配列または天然に存在する モルフォゲンから選択される参照モルフォゲン配列と、少なくとも70％のアミノ 酸配列相同性または「類似性」、そして好ましくは80％の相同性または類似性を 共有する配列を含むモルフォゲンが挙げられる。好ましくは、参照モルフォゲン はヒトOP1であり、そしてこの参照配列は、形態形成的に活性な形態のヒトOP1中 に存在するＣ末端の７システインドメイン(配列番号４の残基38-139)である。従 って、本明細書中で有用なモルフォゲンとして、好ましい参照配列の対立遺伝子 、系統発生的対応物、およびその他の変異体(天然に存在するものでも生合成的 に生産されたものでもいずれにしても(例えば、「ムテイン」または「変異タン パク質」を含む))、ならびに上で記載および同定されたモルフォゲン(例えば表 Ｉに関して)を含むタンパク質の形態形成ファミリーの新規のメンバーが挙げら れる。特定の特に好ましいモルフォゲンポリペプチドは、ヒトOP1の好ましい参 照配列と少なくとも60％のアミノ酸同一性、なおさらに好ましくはそれと少なく とも65％のアミノ酸同一性を共有する。 別の好ましい実施態様において、本発明において有用なモルフォゲンポリペプ チドのファミリー、およびそのメンバーは、一般的なアミノ酸配列により定義さ れる。例えば、下に開示した一般配列７(配列番号１)および一般配列８(配列番 号２)は、少なくともOP1、OP2、OP3、CBMP2A、CBMP2B、BMP3、BMP5、BMP6、DPP 、Vgl、Vgr1、60A、およびGDF-1を含む、現在までに同定された好ましいモルフ ォゲンタンパク質ファミリーのメンバー間で共有される相同性に適合する。これ らのタンパク質のアミノ酸配列は、本明細書中(配列表を参照のこと)および/ま たは当該分野で記載されている(上で要約したように)。この一般配列は、６個お よび７個のシステイン骨格(それぞれ一般配列７および８)により規定される、Ｃ 末端ドメイン中のこれらの配列により共有されるアミノ酸同一性、ならびにその 配列内の可変位置の別の残基の両方を含む。一般配列は、分子間または分子内ジ スルフィド結合が形成され得る適切なシステイン骨格を提供し、そして折りたた まれたタンパク質の三次元構造に影響を与えるようである特定の重要なアミノ酸 を含む。さらに、一般配列は、41位(一般配列７)または46位(一般配列８)のさら なるシステインを可能にし、それによりOP2および0P3の形態形成的に活性な配列 を含む。 一般配列７（配列番号１） ここで、各Xaaは、独立して、以下のように定義される１つ以上の特定のアミノ 酸の群から選択される：「res.」は「残基」を意味し、そして残基２のXaa＝(Ty rまたはLys)；残基３のXaa＝(ValまたはIle)；残基４のXaa＝(Ser,AspまたはGlu )；残基６のXaa＝(Arg，Gln，Ser，LysまたはAla)；残基７のXaa＝(AspまたはGl u)；残基８のXaa＝(Leu，ValまたはIle)；残基11のXaa＝(Gln，Leu，Asp，His,A snまたはSer)；残基12のXaa＝(Asp，Arg，AsnまたはGlu)；残基13のXaa＝(Trpま たはSer)；残基14のXaa＝(IleまたはVal)；残基15のXaa＝(IleまたはVal)；残基 16のXaa＝(AlaまたはSer)；残基18のXaa＝(Glu，Gln，Leu，Lys，ProまたはArg) ；残基19のXaa＝(GlyまたはSer)；残基20のXaa＝(TyrまたはPhe)；残基21のXaa ＝(Ala，Ser，Asp，Met，His，Gln，LeuまたはGly)；残基23のXaa＝(Tyr，Asnま たはPhe)；残基26のXaa＝(Glu，Hls，Tyr，Asp，Gln，AlaまたはSer)；残基28の Xaa＝(Glu，Lys，Asp，GlnまたはAla)；残基30のXaa＝(Ala，Ser，Pro，Gln, IleまたはAsn)；残基31のXaa＝(Phe，LeuまたはTyr)；残基33のXaa＝(Leu，Val またはMet)；残基34のXaa＝(Asn，Asp，Ala，ThrまたはPro)；残基35のXaa＝(Se r，Asp，Glu，Leu，AlaまたはLys)；残基36のXaa＝(Tyr，Cys，His，SerまたはI le)；残基37のXaa＝(Met，Phe，GlyまたはLeu)；残基38のXaa＝(Asn，Serまたは Lys)；残基39のXaa＝(Ala，Ser，GlyまたはPro)；残基40のXaa＝(Thr，Leuまた はSer)；残基44のXaa＝(Ile，ValまたはThr)；残基45のXaa＝(Val，Leu，Metま たはIle)；残基46のXaa＝(GlnまたはArg)；残基47のXaa＝(Thr，AlaまたはSer) ；残基48のXaa＝(LeuまたはIle)；残基49のXaa＝(ValまたはMet)；残基50のXaa ＝(His，AsnまたはArg)；残基51のXaa＝(Phe，Leu，Asn，Ser，AlaまたはVal)； 残基52のXaa＝(Ile，Met，Asn，Ala，Val，GlyまたはLeu)；残基53のXaa＝(Asn ，Lys，Ala，Glu，GlyまたはPhe)；残基54のXaa＝(Pro，SerまたはVal)；残基55 のXaa＝(Glu，Asp，Asn，Gly，Val，ProまたはLys)；残基56のXaa＝(Thr，Ala， Val，Lys，Asp，Tyr，Ser，Gly，IleまたはHis)；残基57のXaa＝(Val，Alaまた はIle)；残基58のXaa＝(ProまたはAsp)；残基59のXaa＝(Lys，LeuまたはGlu)； 残基60のXaa＝(Pro，ValまたはAla)；残基63のXaa＝(AlaまたはVal)；残基65のX aa＝(Thr，AlaまたはGlu)；残基66のXaa＝(Gln，Lys，ArgまたはGlu)；残基67の Xaa＝(Leu，MetまたはVal)；残基68のXaa＝(Asn，Ser，AspまたはGly)；残基69 のXaa＝(Ala，ProまたはSer)；残基70のXaa＝(Ile，Thr，ValまたはLeu)；残基7 1のXaa＝(Ser，AlaまたはPro)；残基72のXaa＝(Val，Leu，MetまたはIle)；残基 74のXaa＝(TyrまたはPhe)；残基75のXaa＝(Phe，Tyr，LeuまたはHis)；残基76の Xaa＝(Asp，AsnまたはLeu)；残基77のXaa＝(Asp，Glu，Asn，ArgまたはSer)；残 基78のXaa＝(Ser，Gln，Asn，TyrまたはAsp)；残基79のXaa＝(Ser，Asn，Asp，G luまたはLys)；残基80のXaa＝(Asn，ThrまたはLys)；残基82のXaa＝(Ile，Valま たはAsn)；残基84のXaa＝(LysまたはArg)：残基85のXaa＝(Lys，Asn，Gln，His ，ArgまたはVal)；残基86のXaa＝(Tyr，GluまたはHis)；残基87のXaa＝(Arg，Gl n，GluまたはPro)；残基88のXaa＝(Asn，Glu，TrpまたはAsp)；残基90のXaa＝(V al，Thr，AlaまたはIle)；残基92のXaa＝(Arg，Lys，Val，Asp，GlnまたはGlu) ；残基93のXaa＝(Ala，Gly，GluまたはSer)；残基95のXaa＝(GlyまたはAla)およ び残基97のXaa＝(HisまたはArg)。 一般配列８(配列番号２)は、一般配列７の全てを含み、そしてさらにそのＮ末 端に以下の配列(配列番号14)を含む。 従って、残基７で始まる一般配列８中の各「Xaa」は、一般配列７に関して定義 された特定のアミノ酸であり、その相違は、一般配列７について記載された各残 基番号が一般配列８では５個シフトされる。従って、一般配列７の「残基２のXa a＝(TyrまたはLys)」は、一般配列８の残基７のXaaをいう。一般配列８において は、残基２のXaa＝(Lys、Arg、Ala、またはGln)；残基３のXaa＝(Lys、Arg、ま たはMet)；残基４のXaa＝(His、Arg、またはGln)；および残基５のXaa＝(Glu、S er、His、Gly、Arg、Pro、Thr、またはTyr)。 上記のように、本発明において有用な特定の目下好ましいモルフォゲンポリペ プチド配列は、hOP1の保存された６または７システイン骨格を定義するアミノ酸 配列（例えば、配列番号４の残基43-139または38-139)と、60％より高い同一性 、好ましくは65％より高い同一性を有する。これらの特に好適な配列はOP1タン パク質およびOP2タンパク質(Drosophila 60Aタンパク質（配列番号２４）を含む )の対立遺伝子的および系統発生的対応改変体を含む。従って、特定の特に好ま しい実施態様において、有用なモルフォゲンとしては、７システイン骨格に対応 しそしてOP1およびOP2のいくつかの同定された改変体の間の相同性に適合する、 本明細書中で「OPX」(配列番号３)といわれる一般的アミノ酸配列中のポリペプ チド鎖の対を含む活性タンパク質が挙げられる。本明細書中に記載したように、 所定の位置の各Xaaは、マウスまたはヒトOP1またはOP2(配列番号４〜７および/ または配列番号15〜22を参照のこと)のＣ末端配列中の対応する位置に存在する 残基から独立して選択される。 さらに別の好適な実施態様において、有用なモルフォゲンポリペプチドは、ス トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照モルフォゲン配列(例え ば、OP1またはOP2の保存された７システインドメインで規定されるＣ末端配列 (例えば、それぞれ配列番号15および19のヌクレオチド1036〜1341およびヌクレ オチド1390〜1695))をコードするDNAまたはRNAにハイブリダイズする核酸により コードされる配列を含むアミノ酸配列を有する。本明細書中で使用されるように 、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、40%ホルムアミド、5×SS PE、5×Denhardt溶液、および0.1%SDS中に37℃で一晩、そして0.1×SSPE、0.1%S DS中で50℃で洗浄という公知の技術に従うハイブリダイゼーションとして定義さ れる。 上記のように、本発明において有用なモルフォゲンは、一般的に、折りたたま れた１対の上記のポリペプチドを含む二量体タンパク質である。モルフォゲンは 還元されると不活性であるが、酸化されたホモ二量体として、そして本発明の他 のモルフォゲンと組み合わせて酸化されてヘテロ二量体を生じた場合に活性であ る。従って、形態形成的に活性なタンパク質における折りたたまれた１対のモル フォゲンポリペプチドのメンバーは、上記の任意の特定のモルフォゲンポリペプ チドから独立して選択され得る。 本発明の方法、組成物、およびデバイスにおいて有用なモルフォゲンとしては 、上記のポリペプチド鎖のいずれかを含むタンパク質(天然に存在する供給源か ら単離されるか、または組換えDNAもしくはその他の合成技術により産生される かのいずれかである)、そしてこれらのタンパク質の対立遺伝子的および系統発 生的等価改変体、ならびにそれらの生合成的改変体(ムテイン)、および種々の短 縮化された構築物および融合構築物が挙げられる。欠失または付加変異体もまた 活性であると想起され、これは、保存されたＣ末端の６または７システインドメ インを改変し得るもの（但し、その改変が折りたたまれた生物学的に活性な構造 においてこれらのシステイン残基の関係を機能的に破壊しない）を含む。従って 、このような活性形態は、本明細書中に開示された特別に記載された構築物の等 価物と考えられる。このタンパク質は、変化するグリコシル化パターン、変化す るＮ末端、アミノ酸配列相同性領域を有する関連タンパク質のファミリー、およ び天然のタンパク質または生合成タンパク質の活性な短縮化されたまたは変異さ れた形態(宿主細胞中で組換えDNAの発現により産生)を含み得る。 形態形成タンパク質は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中でインタ クトなもしくは短縮化されたcDNAから、または合成DNAから発現され得、そして 精製、切断、リフォールディング、および二量体化され、形態形成的に活性な組 成物を形成し得る。現在好ましい宿主細胞として、E．coliまたは哺乳動物細胞( 例えば、CHO細胞、COS細胞、またはBSC細胞)が挙げられる。本発明の方法、組成 物、およびデバイスにおいて有用なモルフォゲンの詳細な記載は、公開出願WO 9 2/15323（その開示は、本明細書中に参考として援用される）)に開示されている 。 従って、本開示を考慮して、熟練した遺伝子工学技術者は、適切なアミノ酸配 列をコードするcDNAまたは種々の異なる生物種のゲノムライブラリーから遺伝子 を単離し得るか、またはオリゴヌクレオチドからDNAを構築し得、次いで、哺乳 動物の心筋組織の形態形成を刺激、および/または哺乳動物の心筋組織に対する 損傷およびその損失を阻止し得る大量の活性タンパク質を産生するために、種々 のタイプの宿主細胞中(原核生物および真核生物の両方を含む)でこれらを発現さ せ得る。 上記のように、タンパク質が、新しい、器官特異的な組織の形成を完結させる 細胞的事象および分子的事象の発生学的カスケードを誘導する場合、本明細書中 ではタンパク質は一般的に形態形成的である。好ましくは、モルフォゲンは、配 列番号４に含まれるヒトOP1の、少なくとも保存されたＣ末端の６または７シス テイン骨格に対応するかまたは機能的に等価である配列を有する１対のポリペプ チドを含む。そのモルフォゲンは、一般的に、形態形成的に許容可能な環境にお いて以下の全てを含む事象のカスケードを誘導する能力を有する：始原細胞の増 殖を刺激すること；始原細胞の分化を刺激すること；分化した細胞の増殖を刺激 すること；ならびに分化した細胞の増殖および維持を支持すること。本発明にお いて有用なモルフォゲンが最初にどのようにして同定されたかの詳細、ならびに どのようにして作製し、使用し、そしてそれらを形態形成活性に関して試験した かの記載は、公開出願WO92/15323に開示されている。本明細書中に開示するよう に、モルフォゲンは、天然に供給される材料から精製され得るかまたは、本明細 書中に開示する遺伝子配列を用いて、原核生物または真核生物宿主細胞から組換 え的に生産され得る。あるいは新規な形態形成配列は、本明細書中に開示する手 順に従って同定され得る。 例示的に有用なモルフォゲンとしては、そのアミノ酸配列が配列表および図１ に開示される配列から選択される配列を含む、１対のポリペプチドを含む天然由 来のタンパク質が挙げられる。他の有用な配列としては、天然由来のモルフォゲ ンであるドルサリン-1、SCREW、NODAL、UNIVINおよびGDF5(表１と関連して本明 細書中で考察した)の配列、ならびに米国特許第5,011,691号（その開示内容は、 本願明細書中で参考として援用される）に開示される生合成構築物(例えば、COP 1、COP3、COP4、COP5、COP7、およびCOP16)が挙げられる。 従って、本発明の方法および組成物において有用な特定の好ましいモルフォゲ ンは、上記の参照モルフォゲン配列(例えば、配列番号４の残基38〜139)と70％ 、または、好ましくは、80％の相同性を共有するアミノ酸配列を有する、形態形 成的に活性なタンパク質として記載され得る(ここで「相同性」は、本明細書中 で先に定義されるものと同じである)。あるいは、別の好ましい実施態様におい て、本明細書中に開示される方法および組成物において有用なモルフォゲンは、 一般配列７(配列番号１)、より好ましくは一般配列８(配列番号２)により記載さ れるポリペプチドのファミリー内に入る。 本明細書中の図１は、本明細書中でモルフォゲンとして同定または認識される 例示の天然に存在するタンパク質の活性領域のアミノ酸配列の整列を記載し、こ れは以下を含む：ヒトOP1(hOP1、配列番号４および15〜16)、マウスOP1(mOP1、 配列番号５および17〜18)、ヒトおよびマウスOP2(配列番号６、７および19〜22) 、マウスOP3(配列番号25〜26)、CBMP2A(配列番号８)、CBMP2B(配列番号９)、BMP 3(配列番号27)、DPP(Drosophila由来、配列番号10)、Vgl(Xenopus由来、配列番 号11)、Vgr1(マウス由来、配列番号12)、GDF1(マウスおよび/またはヒト由来、 配列番号13、30および31)、60Aタンパク質(Drosophila由来、配列番号23および2 4)、BMP5(配列番号28)、およびBMP6(配列番号29)。これらの配列は本質的には、 Needlemanら(1970)，J．Mol．Biol.，48:443-453の方法に従って整列され、Alig n Program(DNAstar，Inc.)を用いて計算される。図１において、３つの点は、そ の位置のアミノ酸が、hOP1における対応するアミノ酸と同一であることを示す。 ３つのダッシュ(-)は、その位置にはアミノ酸が存在しないことを示し、そして 相同性を示す目的のために含まれる。例えば、CBMP2AおよびCBMP2Bの両方のアミ ノ酸 残基60は「欠失」している。もちろん、この領域におけるこれらのアミノ酸配列 の両方は、Asn-Ser(残基58、59)を含む（次いで、CBMP-2AがLysおよびIleを含む ）、一方CBMP2BはSerおよびIleを含む。図１はまた、モルフォゲンアミノ酸配列 における挿入の操作を示す：BMP3の残基56と57との間に、Val残基が挿入される ；GDF1の残基43と44との間にアミノ酸配列、Gly-Gly-Pro-Proが挿入される。参 照モルフォゲン配列からのそのような偏向は、例えば、GDF1とhOP1との間の定義 された関係を計算する目的のためには無視される。図１に記載したアミノ酸配列 の比較から明らかなように、形態形成活性を保有する一方、有意なアミノ酸変化 が参照配列からなされ得る。例えば、図１に図示したGDF-1タンパク質配列は、 本明細書中に記載するhOP1配列と約50％のアミノ酸同一性しか共有しないが、そ のGDF1配列はhOP1配列と70％より大きいアミノ酸相同性を共有する(ここで「相 同性」とは上記定義の通りである)。 他の実施態様では、モルフォゲンタンパク質の投与の代替として、哺乳動物に おける内因性モルフォゲン発現の増大を刺激または誘導し得る有効量の因子が、 本明細書中に記載の任意の経路によって投与され得る。このようなモルフォゲン インデューサーは、例えば、哺乳動物への局所投与もしくは全身投与、または移 植される筋形成前駆細胞への直接投与によって、哺乳動物に提供され得るか、あ るいは筋形成前駆細胞と同時培養された補助細胞に提供され得る。所定の組織ま たは細胞型によるモルフォゲンの産生レベルを調節し得るインデューサー（刺激 剤）を同定および試験する方法は、公開出願WO93/05172およびWO93/05751（これ らの教示内容は、本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載される。簡 潔には、候補化合物は、インビトロで、試験組織もしくはそれらの細胞、または それに由来する培養細胞株と、化合物がその組織の細胞により産生されたモルフ ォゲンの産生（すなわち、発現および／または分泌）に影響し得るのに十分な時 間、インキュベートすることにより同定または試験し得る。適切な組織、または 適切な組織の培養細胞は、好ましくは、腎上皮、卵巣組織、線維芽細胞、および 骨芽細胞から選択され得る。 他の実施態様では、モルフォゲンレセプターのアゴニストとして作用する薬剤 が、モルフォゲン自身の代わりに投与され得る。このような薬剤は、モルフォゲ ン「模倣物」、「模倣物」または「アナログ」とも呼ばれ得る。従って、例えば 、モルフォゲンレセプターへの結合および活性化におけるモルフォゲンの活性を 模倣し得る小ペプチドまたは他の分子は、モルフォゲンの等価物として用いられ 得る。好ましくは、アゴニストは、完全アゴニストであるが、しかし部分的モル フォゲンレセプターアゴニストもまた、有利に用いられ得る。このようなアゴニ ストを同定する方法は、当該分野で公知であり、そしてモルフォゲン媒介性応答 （例えば、後腎間葉の分化の誘導、軟骨内骨形成の誘導）を誘導する化合物につ いてのアッセイを包含する。例えば、モルフォゲンインデューサーまたはモルフ ォゲンレセプターのアゴニストを同定する方法は、米国特許出願第08/478,097号 （1995年６月７日に出願）および米国特許出願第08/507,598号（1995年７月26日 に出願）（これらの開示内容は、本明細書中に参考として援用される）に見出さ れ得る。 なお他の実施態様では、低分子形態形成アクチベーターが、心筋表現型と関連 したタンパク質の発現のレベルを増大させることにより、筋形成前駆細胞の移動 、増殖、および／または分化を促進するために用いられ得る。例示の方法は、モ ルフォゲン誘導調節経路のいくらかの部分を調節する低分子形態形成アクチベー ターを誘導し、心筋特異的タンパク質の発現または活性の有効な増大を生じさせ る工程を包含する。これは、このようなタンパク質の内因性発現の増大を刺激す ること、またはこのようなタンパク質の正常な発現の阻害の減少のいずれかから 生じ得る。例えば、低分子形態形成アクチベーターは、Ｉ型もしくはII型モルフ ォゲンレセプター；またはセリン／トレオニンキナーゼ、もしくはそれらのレセ プターの他のキナーゼドメインで作用し得る。経路活性化の別の標的は、Smadタ ンパク質である。これは、単量体、二量体（ヘテロ量体およびホモ量体複合体を 包含する）または三量体（ヘテロ量体およびホモ量体複合体を包含する）形態を 包含する。Smadは、特徴づけられており、当該分野で公知である。例えば、Bake rら、Curr．Op．Genet．Develop.，7:467-473（1997）(本明細書中に参考として 援用される)を参照のこと。 あるいは、低分子形態形成アクチベーターが、表現型特異的遺伝子発現（すな わち、心筋に特徴的なタンパク質の発現）を引き起こす転写因子（例えば、図２ に示すＸタンパク質）の活性化を導き得る。低分子形態形成アクチベーターは、 以下の任意の１つまたはいくつかを容易にするか、模倣するか、または所望であ れば防止するように作用し得る：Ｉ型および／またはII型レセプター結合、Ｉ型 レセプターのリン酸化、Smad分子のリン酸化、Smad複合体形成、核へのSmad転位 、Smad複合体の核蓄積、またはSmad複合体の転写調整。さらに、低分子形態形成 アクチベーターは、三次構造を変化させ、それにより、レセプターキナーセドメ イン、他のSmad、DNA結合タンパク質、またはDNA自身とのSmadまたはSmad複合体 の相互作用を容易にするまたは阻害するようにSmadまたはSmad複合体に作用し得 る。 特に好ましい実施態様において、低分子形態形成アクチベーターは、インビボ もしくはインビトロで筋形成前駆体細胞と接触させられるか、または患者に投与 される。ここで、低分子形態形成アクチベーターは、移動、増殖、ならびに/ま たは心筋層組織表現型のマーカーを発現する細胞へ分化する筋形成前駆体細胞を 誘導するために、Smad複合体、特にSmad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5および/ もしくはSmad8の分子を含む複合体の形成を容易にする。また、好ましい実施態 様において、方法は、モルフォゲンＩ型またはモルフォゲンII型レセプターに会 合したセリン/スレオニンキナーゼドメインを活性化する低分子形態形成アクチ ベーター組成物を投与し、それによって、モルフォゲン誘導性遺伝子発現に関与 する経路を活性化する工程を包含する。別の実施態様においては、本発明の方法 は、Smad1でSmad4会合を活性化し、それによって、モルフォゲン応答性表現型を 誘導する工程を包含する。本発明の方法はまた、心筋層組織表現型特異的遺伝子 発現（すなわち、表現型タンパク質）；表現型の保存、修復、もしくは増強に関 連するタンパク質（例えば、特徴的な脂質もしくは糖質のような非タンパク質表 現型マーカーの産生に重要であるタンパク質を含む）；表現型機能もしくは形態 の能力に関連するタンパク質；またはモルフォゲンの遺伝子発現）のプロモータ ーのような特定の核酸とのSmad相互作用を容易にし得る。例えば、このような相 互作用は、遺伝子の調節部分に、そして同時にSmad複合体のような１つ以上の調 節タンパク質に結合し得る転写調節因子と関連し得る（図２を参照のこと）。 例示的なモルフォゲン活性化経路は、図２に示されている。モルフォゲンは、 Ｉ型レセプターおよびII型レセプターに対するリガンドである。II型レセプター によるＩ型レセプターのリン酸化に次いで、Ｉ型レセプターは、Smad1ホモダイ マーを特異的にリン酸化する。Ｉ型レセプターはまた、Smad5ホモダイマーを特 異的にリン酸化する。次いで、ホモダイマーは分離し、リン酸化Smad4分子と会 合して、少なくともSmad1およびSmad4を含むリン酸化ヘテロメリック複合体を形 成する。あるいは、リン酸化Smad1/Smad5/Smad4ヘテロトリマーが形成され得る 。次いで、ヘテロメリック複合体は核にトランスロケーションされ、そこに蓄積 される。核では、Smad複合体は、単独かまたは特定のDNA結合タンパク質（図２ のＸタンパク質）と会合してかのいずれかで、作動可能なDNAを結合して、DNA転 写を開始する。「Ｘタンパク質」は、DNA結合タンパク質として作用し、DNAにSm adヘテロメリック複合体を結合させる。Smad1、Smad2、Smad3、およびSmad5タン パク質は、Smadのうち、より分岐している領域により連結される、保存されたア ミノ末端ドメインおよびカルボキシ末端ドメインからなる。カルボキシ末端ドメ インは、エフェクター機能を有する。アミノ末端ドメインは、カルボキシ末端ド メインと物理的に相互作用し、そのエフェクター活性を阻害し、そしてDNA結合 に寄与する。カルボキシ末端ドメインの末端でのセリン残基のレセプター媒介リ ン酸化は、アミノ末端ドメインの阻害作用からカルボキシ末端ドメインを解放す る。リン酸化Smad分子は、少なくとも１つの他の特定のSmadファミリー分子とヘ テロメリック複合体を形成する。次いで、得られるSmad複合体は、細胞核内へト ランスロケーションされ、そして細胞核に蓄積する。そこで、ヘテロメリックSm ad複合体は、単独かまたはフォーク頭部型アクチビンシグナルトランスデューサ ー-1(FAST1)のようなDNA結合タンパク質と特異的に相互作用するかのいずれかに より転写応答を調節する。 他の細胞内経路はモルフォゲンにより誘導され、そして本明細書中に記載の様 式で、低分子形態形成アクチベーターを用いることにより影響を及ぼされ得る。 好ましい実施態様においては、本発明における使用のための低分子形態形成ア クチベーターは、通常はモルフォゲン調節下である１つ以上の細胞内経路に作用 する化合物である。このような低分子形態形成アクチベーターは、好ましくは、 細胞に進入し、そして１つ以上の細胞内経路の成分を標的化してそれらの活性を 刺激または阻害する能力を有する。例えば、Smad1とSmad4とSmad5との間でのSma d複合体形成を促進する低分子形態形成アクチベーターは、表現型特異的タンパ ク質をコードする遺伝子の発現を導く経路を刺激する。 候補低分子形態形成アクチベーターを同定する１つの方法は、モルフォゲンの 有効全身濃度またはモルフォゲンの有効局所濃度を調節する候補物の能力に関し てアッセイすることである。例えば、これは、モルフォゲンを産生する細胞培養 物において候補物をインキュベートし、そして米国特許出願番号第08/451,953号 および/または米国特許第5,650,276号の方法（この教示の各々は、本明細書中に 参考として援用される）に従って、モルフォゲンの産生レベルにおける変化の指 標であるパラメーターに関して培養物をアッセイすることにより行われ得る。あ るいは、候補化合物は、モルフォゲン活性が存在しない細胞培養物中の表現型特 異的タンパク質産生を誘導する能力についてスクリーニングされる。モルフォゲ ンまたは他の表現型特異的タンパク質の産生についてのそれらの影響に関してス クリーニングされ得る組成物の例は、以下を含むがそれらに限定されない：化学 物質、生物学的応答修飾因子（例えば、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン 、またはビタミン）、植物抽出物、微生物ブロス、および真核生物細胞により馴 化された抽出物培地、体液、または組織抽出物。次いで、適切な動物モデルにお けるインビボでの効力に関して、有用な候補組成物が試験され得る。次いで、こ れらの組成物をインビボで用いて、表現型特異的タンパク質発現のモルフォゲン 活性化調節経路をアップレギュレートし得る。 低分子組成物が、培養細胞中の表現型特異的タンパク質のレベルにおける変化 に影響を与えたかどうかの決定の単純な方法は、共有に係る同時係属中の特許出 願番号第08/451,953号に提供され、この開示は、本明細書中に参考として援用さ れる。低分子への曝露から生じる、細胞中の標的の表現型特異的タンパク質のレ ベルが、測定される。あるいは、細胞内経路の成分の活性または量における変化 は、候補低分子の適用に応じて測定される。タンパク質産生または経路調節につ いての所望の影響を有する候補物は、本発明の方法における使用に関して選択さ れる。例えば、組成物が腎臓細胞株によるOP-1の産生をアップレギュレートする ならば、動物モデルでこの化合物の全身投与を試験して、この化合物がインビボ でOP-1の産生をアップレギュレートするか否かを決定することが所望される。身 体のモルフォゲンレベルは、広範囲の身体的状態（例えば、関節炎、気腫、骨粗 鬆症、腎臓疾患、肺疾患、心筋症、および肝硬変を含む疾患で生じるような組織 変性）の結果であり得る。身体のモルフォゲンレベルの低減はまた、加齢の通常 のプロセスの結果としても生じ得る。同じストラテジーが、細胞内経路成分に影 響を及ぼす組成物のために用いられる。次いで、これらのスクリーニング法によ り選択される組成物は、処置または予防として用いられる。 適切な試験細胞は、検出可能な表現型特異的遺伝子産物をコードするレポータ ー遺伝子と作動可能に連結されたモルフォゲン応答性転写活性化エレメントを規 定するDNAを含む任意の細胞である。このようなDNAは、試験細胞中に天然に存在 し得るかまたはトランスフェクトされたDNAであり得る。誘導された細胞内効果 は、代表的には、モルフォゲンの生物学的活性（例えば、Smad活性化）または（ 例えば、上記に示されるような、または例えば、環状ヌクレオチド、ジアシルグ リセロール、および/または遺伝子発現の活性化もしくは抑制のような細胞内シ グナル伝達の他の指標に関与する）生化学的事象のカスケードの活性化（遺伝子 の転写から生じるmRNAの誘導および/または組織形態形成の指標であるmRNA転写 産物の翻訳から生じるタンパク質合成の誘導を含む）に特有である。例示的なモ ルフォゲン応答性細胞は、好ましくは哺乳動物起源の細胞であり、以下を含むが それらに限定されない：骨形成前駆細胞；頭蓋冠に由来する細胞；骨芽細胞；破 骨細胞；骨肉腫細胞および肝起源または神経起源の細胞。任意の、このようなモ ルフォゲン応答性細胞は、候補物質が低分子形態形成アクチベーターであるか否 かを評価することに関して適切な試験細胞であり得る。 好ましい同定方法は、試験細胞を少なくとも１つ候補物質に曝露すること、そ してこのような曝露により、モルフォゲン応答性転写活性化エレメントに作動可 能に会合している、検出可能な表現型特異的遺伝子産物の発現を誘導するか否か を検出することにより実施される。この遺伝子産物の発現は、この候補物質がモ ルフォゲン媒介生物学的効果を誘導することを示す。当業者は、本明細書中に提 供される手引きに照らして、モルフォゲン応答性細胞からの応答性エレメントお よび選り抜きのレポーター遺伝子を有する試験細胞を、当該分野で周知の組換え ベクターおよびトランスフェクション技術を用いて構築し得る。本明細書中にお いて、多くの周知の、有用なレポーター遺伝子が存在する。これらには、例えば 、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼ、 ヒト成長ホルモン(hGH)、βガラクトシダーゼ、ならびに市販されているアッセ イ系および試薬が挙げられる。当業者により理解されるように、列挙されたレポ ーター遺伝子は、本明細書中で使用され得る可能なレポーター遺伝子のうちのい くつかを示しているに過ぎない。このようなレポーター遺伝子の例は、Ausubel ら、編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New Y ork(1989)に見出され得る。広範には、検出可能な産物（例えば、検出可能な酵 素活性を有する任意の産物または特異的抗体が惹起され得る任意の産物）をコー ドする任意の遺伝子は、本同定方法においてレポーター遺伝子として用いられ得 る。 現在の好ましいレポーター遺伝子系は、ホタルルシフェラーゼレポーター系で ある。Gouldら、Anal．Biochem.，7:404〜408(1988)は、本明細書中に参考とし て援用される。ルシフェラーゼアッセイは、迅速かつ高感度である。このアッセ イ系において、試験細胞の溶解物を調製し、ATPおよび基質であるルシフェリン と組み合わせる。コードされた酵素であるルシフェラーゼは、基質の迅速なATP 依存性酸化を触媒し、発光産物を産生する。総光出力が測定され、これは、広範 な酵素濃度にわたって、ルシフェラーゼの存在量に比例する。CATは、別の頻繁 に使用されるレポーター遺伝子系である；この系の主な利点は、広範に確証され ていることおよびプロモーター活性の測定単位として広範に受け入れられている ことである。Gormanら、Mol．Cell．Biol．2:1044〜1051(1982)は、本明細書中 に参考として援用される。この系において、試験細胞は、CAT発現ベクターでト ランスフェクトされ、そして最初のトランスフェクションの２〜３日以内に候補 物質とともにインキュベートされる。その後、細胞抽出物が調製される。この抽 出物は、アセチルCoAおよび放射性クロラムフェニコールとともにインキュベー トされる。インキュベーションの後、アセチル化されたクロラムフェニコールは 、薄層クロマトグラフィーにより非アセチル化形態から分離される。このアッセ イにおいて、アセチル化の程度は、特定のプロモーターを有するCAT遺伝子活性 を反映する。 別の適切なレポーター遺伝子系は、hGHの免疫学的検出に基づく。この系はま た、使用するに迅速かつ平易である。Seldenら、Mol．Cell．Biol．6:3173〜317 9(1986)は、本明細書中に参考として援用される。hGH系は、発現されたhGHポリ ペプチドが、細胞抽出物中でアッセイされるのではなく、培地中でアッセイされ るという点で有利である。従って、この系は、試験細胞の破壊を必要としない。 このレポーター遺伝子系の原理は、hGHに限定されず、むしろ受容可能な特異性 の抗体が利用可能であるかまたは調整され得る任意のポリペプチドを伴う使用に 適応されることが認識される。 低分子形態形成アクチベーター組成物は、任意の１つ以上の点で作用すること によってモルフォゲン活性化経路をアップレギュレートし得る。例えば、この経 路の低分子形態形成アクチベーター相乗作用は、レセプターレベルで開始され得 る。経路に依存して、膜貫通レセプターは、Ｉ型および/またはII型であり得る か、またはＩ型レセプターもしくはII型レセプターのいずれかについての改変体 を含み得る。例えば、OP-1は、Ｉ型レセプターおよびII型レセプター両方の少な くとも２つの改変体（それぞれ、ActR-1およびBMPR-1B、ならびにActRIIおよびB MPR-II）を含む調節経路を活性化し得る。低分子形態形成アクチベーターは、リ ガンドとして作用し、そして任意のレセプターに結合し、それによって、Ｉ型レ セプターおよび/またはSmad分子のリン酸化を誘導することによって経路を刺激 し得る。同様に、低分子形態形成アクチベーターは、レセプターのセリン/スレ オニンキナーゼドメインのレベルで調節経路を活性化し、それによって、Ｉ型レ セプターおよび/またはSmad分子のリン酸化を刺激し得る。 さらに別には、低分子形態形成アクチベーターは、Smad複合体形成のレベルで 調節経路を活性化し得る。低分子形態形成アクチベーターは、Smadファミリーの ホモダイマー、ヘテロダイマー、または他のホモメリック複合体もしくはヘテロ メリック複合体の形成を刺激し得る。さらに、低分子形態形成アクチベーターは 、Smad分子またはSmad複合体と相互作用することにより経路を活性化し得る。そ れによって、３次構造を改変し得る。 あるいは、または加えて、低分子形態形成アクチベーターは、Smad分子もしく はSmad複合体のトランスロケーションを容易にすることにより、または細胞の核 内のSmad分子もしくはSmad複合体の蓄積を容易にすることによって調節経路を活 性化し得る。DNA結合タンパク質または転写アクチベーターとして作用すること により、低分子形態形成アクチベーターは、Smad分子またはSmad複合体により引 き起こされる転写活性の増加により調節経路を活性化し得る。 さらに、低分子形態形成アクチベーターが作用して、経路のインヒビターを妨 げることにより調節経路を刺激し得る。例えば、Smad6およびSmad7（これは、Sm ad1、Smad2、Smad3、およびSmad5とは構造的に異なる）は、所望の表現型特異的 タンパク質発現の特定の型のインヒビターとして作用する（例えば、瘢痕組織形 成を誘導するTGF-βを活性化することによる）。Smad6は、Ｉ型レセプターと安 定な会合を形成し、そして他のSmadタンパク質（Smad2およびSmad1を含む）のリ ン酸化、そして続くSmad4とのヘテロマー化を妨げる。Smad7はまた、活性化Ｉ型 レセプターと安定な会合を形成し、アクセスをブロックし、そして特定のSmad分 子のリン酸化をブロックし、それにより、特定のSmadヘテロメリック複合体の形 成を妨げる。Smad7はまた、Smadヘテロメリック複合体の核蓄積を阻害する。低 分子形態形成アクチベーターは、例えば、１つまたは両方のタンパク質のいずれ かに密接に結合し、そしていずれかのタンパク質をＩ型レセプターと安定に会合 し得ないようにすることによるか、またはモルフォゲン活性化膜貫通レセプター を競合的に結合および刺激することによって、これらのSmadタンパク質の阻害活 性を妨げ得る。あるいは、低分子形態形成アクチベーターは、所望されない効果 （例えば、TGFβ活性）を阻害するためにこれらのSmadの阻害効果を活性化し得 る。 Ｅ．処置のための被験体 一般的な問題として、本発明の方法は、心筋層の損失または損傷の危険性を有 するか、またはそれに罹患した任意の哺乳動物被験体に利用され得る。本発明の 方法により処置され得る哺乳動物被験体は、ヒト被験体または患者を含むが、そ れらに限定されない。しかし、さらに、本発明は、人間の伴侶として維持されて いる飼い慣らされた哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）、重要な商業的価値 を有する飼い慣らされた哺乳動物（例えば、乳牛、肉牛、スポーツ用の動物）、 重要な科学的価値を有する飼い慣らされた哺乳動物（例えば、絶滅の危機に瀕し た種の捕獲被験体または捕獲されていない被験体）、あるいは他に価値を有する 飼い慣らされた哺乳動物の処置にも用いられ得る。さらに、一般的な問題として 、本発明の方法で処置するための被験体は、心筋層の損失または損傷に関する指 標以外のモルフォゲン処置のための指標を提示する必要はない。すなわち、処置 のための被験体は、一般的に、モルフォゲン処置に関する指標を別に含まないこ とを期待される。しかし、いくつかの場合には、被験体は、モルフォゲン処置が また示されるような他の症状（例えば、骨粗鬆症、慢性腎不全）を提示し得る。 このような場合においては、従って、モルフォゲン処置は、過剰投薬を回避する ように調整されるべきである。 医学分野または獣医学分野の当業者は、心筋層の損失または損傷の危険を有す るか、またはそれに罹患した被験体を認識するように訓練される。特に、現在開 示された処置方法および他の処置方法に関連する、臨床的および非臨床的指標な らびに蓄積された経験が、所定の個体が、心筋層の損失または損傷の危険を有す る被験体またはそれに罹患した被験体であるか否か、および任意の特定の処置が 、本発明による処置を含む、被験体の必要性に最良に適するか否かを決定する際 に当業者に情報提供すると期待される。 一般的な問題として、哺乳動物被験体は、心筋層の損失または損傷の危険性を 有するかまたはそれに罹患していると既に診断されている場合、心筋層の損失ま たは損傷の危険を有するかまたはそれに罹患している被験体であるとみなされ得 る。このような被験体には、既に心筋梗塞に罹患した被験体、心臓に物理的外傷 を受けた被験体、または鬱血性心不全と診断された被験体が含まれるがこれらに 限定されない。 Ｅ．処方物および処置方法 本発明のモルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプタ ーのアゴニスト、または低分子形態形成アクチベーターは、筋形成前駆体細胞に 、任意の適切な手段により、好ましくは直接（例えば、培養培地への添加、組織 部位への注射もしくは局所的投与によるような、インビトロで、または移植後に 局所的に）または全身的（例えば、非経口的もしくは経口的に）に提供され得る 。 好ましくは、モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプ ターのアゴニスト、または低分子形態形成アクチベーターは、水性の生理学的に 受容可能な溶液の部分を含む。その結果、標的細胞に所望の薬剤を送達すること に加えて、溶液は、細胞のまたは被験体の電解質および/または容量バランスに 他に有害な影響を与えない。従って、薬剤の水性媒体は、通常の生理学的食塩水 （例えば、0.85％NaCl、0.15M、pH7〜7.4）を含み得る。薬剤を含むこのような 水溶液は、例えば、薬剤を0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)もしくは0.1％HCl中の50 ％エタノール含有アセトニトリル中に、または等価な溶媒中に溶解または分散す ることによって作製され得る。次いで、得られる溶液の１容量は、例えば、10容 量のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に添加される。PBSはさらに、0.1〜0.2％ヒト 血清アルブミン(HSA)を含み得る。得られる溶液は、好ましくは充分にボルテッ クスされる。 全身投与のために、本発明のモルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モ ルフォゲンレセプターのアゴニスト、または低分子形態形成アクチベーターは、 使用される特定のモルフォゲン、インデューサー、またはアゴニストに適合可能 な任意の経路により投与され得る。薬剤が非経口的に（例えば、静脈内、皮下、 筋肉内、眼窩内、眼科的、心室内、頭蓋内、嚢内、脊髄内、槽内、腹腔内、頬内 、直腸的、膣内、鼻腔内、またはエアロゾル投与によって）提供される場合、薬 剤は、好ましくは水溶液の部分を含む。さらに、投与は、モルフォゲン、インデ ューサー、アゴニスト、もしくは低分子形態形成アクチベーターのボーラスの周 期的注入によってであり得るか、または外部（例えば、i.v.バッグ）もしくは体 内（例えば、生体侵食性インプラント、または移植されたモルフォゲン産生細胞 のコロニー）にあるリザーバーからの静脈内または腹腔内投与によって、より連 続的になされ得る。 所望であるならば、所定のモルフォゲンまたは他の薬剤は、適切な分子と会合 させることによってより可溶性にされ得る。例えば、成熟モルフォゲンダイマー のプロドメインとの会合は、モルフォゲンのプロ形態を生じる。このプロ形態は 、代表的には、対応する成熟形態より生理学的溶液中でより溶解性であるかまた はより分散性である。事実、内因性モルフォゲンは、この形態で哺乳動物の身体 に おいて輸送される（分泌または循環される）と考えられている。このタンパク質 の可溶性形態は、モルフォゲン分泌哺乳動物細胞（例えば、モルフォゲンをコー ドし、かつモルフォゲンを発現するのに適格な核酸でトランスフェクトされた細 胞）の培養培地から得られ得る。あるいは、可溶性種は、モルフォゲンプロドメ インまたはその溶解性を増強するフラグメントと成熟ダイマー（またはその活性 なフラグメント）を複合体化させることにより処方され得る（以下にさらに充分 に記載される）。溶解性を増強し得、かつ経口投与に特に有用である別の分子は 、カゼインである。例えば、0.2％カゼインを添加することにより、OP1の成熟活 性形態の溶解性は80％増加する。乳汁および/または種々の血清タンパク質中に 認められる他の成分もまた有用であり得る。 非経口投与について有用な溶液は、例えば、RemingtonのPharmaceutical Scie nces(Gennaro，A.編)、Mack Pub.，1990に記載される薬学的分野で周知の任意の 方法により調整され得る。例えば、本発明の治療剤の処方物は、例えばポリエチ レングリコールのようなポリアルキレングリコール、野菜由来の油、水素化ナフ タレンなどを含み得る。特に、直接投与のための処方物は、グリセロールおよび 所望の部位で薬剤を維持するのを補助するための高い粘性の他の組成物を含み得 る。例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三石灰、ポリブチレート、ラク チド、およびグリコリドポリマー、ならびにラクチド／グリコリドコポリマーを 含む生体適合性、好ましくは、生体再吸収性(bioresorbable)ポリマーは、イン ビボにおける薬剤の放出を制御するための有用な賦形剤であり得る。これらの薬 剤についての別の強力な有用な送達システムは、エチレンービニルアセテートコ ポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームを含 む。吸入投与についての処方物は、賦形剤（例えば、ラクトース）を含むか、ま たは、例えば、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸およ びデオキシコール酸、または経鼻ドロップ形態での投与のため、または鼻腔内へ 適用されるゲルとしての油性溶液を含む水溶液であり得る。非経口投与のための 処方物はまた、口内投与のためのグリココール酸、直腸投与のためのメトキシサ リチル酸、または膣投与のためのクエン酸(cutric acid)を含む。直腸投与のた めの坐剤はまた、モルフォゲン、インデューサー、アゴニスト、または室温 では固体でありそして体温では液体であるカカオバターまたは他の組成物のよう な非刺激性賦形剤を有する低分子形態形成アクチベーターを混合することにより 調製され得る。 組織または皮膚表面への部分的または局所的投与のための処方物は、モルフォ ゲン、インデューサー、アゴニスト、またはローション、クリーム、軟膏または 石鹸のような受容可能なキャリヤーを有する低分子形態形成アクチベーターを分 散させることにより調製され得る。特に有用なキャリヤーは、局所適用および移 動阻害のために、皮膚または組織にわたってフィルムまたは層を形成することが 可能であるキャリヤーである。内組織表面への部分的または局所的投与について 、この薬剤は、組織表面への吸収を増強することが公知である液体組織接着性ま たは他の物質中に分散され得る。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースまたは フィブリノーゲン／トロンビン溶液は、有用性のために使用され得る。あるいは 、ペクチンを含む処方物のような組織コート溶液が使用され得る。 あるいは、本明細書中に記載される薬剤は、経口的に投与され得る。一般的に 、治療剤としてのタンパク質の経口投与は、ほとんどのタンパク質が、血流中に 吸収され得る前に、消化酵素および哺乳動物消化系中の酸により容易に分解され るために実施されない。しかし、本明細書中に記載のモルフォゲンは、代表的に は安定でそしてタンパク質分解酵素抵抗性の酸である（米国特許第4,968,590号 を参照のこと）。さらに、少なくとも１つのモルフォゲンであるOP1は、哺乳動 物腺抽出物、初乳および57日ミルク中で同定されている。さらに、哺乳動物腺抽 出物から精製されたOP1は、形態形成的に活性でありそしてまた、血流中で検出 される。経口摂取ミルクを介した母乳投与はTGFβスーパーファミリータンパク 質の天然送達経路であり得る。Letterioら(1994)Science 264:1936-1938は、TGF βが、マウスミルク中に存在すること、および放射標識したTGFβが、乳幼児の 胃腸粘膜により吸収されることを報告している。標識され経口摂取されたTGFβ は、肺、心臓および肝臓を含む幼児の体組織中に、完全な形態で迅速に現れる。 最終的に、可溶性形態モルフォゲン（例えば、プロドメインと関連した成熟モル フォゲン）は、形態形成的に活性である。以下の実施例に開示される知見と同様 に、これらの発見は経口および非経口投与が、個々、モルフォゲンを含むTGFβ スーパーファミリータンパク質を投与することについて実施可能な手法であるこ とを示す。さらに、代表的には、本明細書中に記載される特定のモルフォゲンの 成熟型は低溶解性であり、ミルク中に見い出されるモルフォゲン形態は、完全配 列のプロドメインの部分または全体を有する成熟形態形成的活性形態との関連に より、および／または１つ以上のミルク成分との会合により、おそらく容易に溶 解する。従って、本明細書中で提供されるこの化合物はまた、インビトロまたは インビボにおけるそれらの溶解性を増強し得る分子と会合し得る。 本明細書中で提供される化合物はまた、モルフォゲン、インデューサー、アゴ ニストまたは所望される組織への低分子形態形成アクチベーターを標的とするこ とが可能な分子と会合し得る。例えば、抗体、抗体フラグメント、または所望さ れる組織の細胞における表面分子と特異的に相互作用する他の結合タンパク質が 使用され得る。例えば、有用な標的化分子が、例えば、米国特許第5,091,513号 で開示される単鎖結合部位技術を使用して、設計され得る。標的化分子は、モル フォゲン、インデューサー、アゴニスト、または低分子形態形成的アクチベータ ーと共有結合的にまたは非共有結合的に会合され得る。 当業者に理解されるように、処方された組成物は、モルフォゲン、モロフォゲ ンインディーサー、モルフォゲンレセプターのアゴニスト、または低分子形態形 成アクチベーターの治療有効量を含む。つまり、それらは、新規のおよび機能的 な心筋の形態形成を刺激するために、そして／または心筋のさらに重要な欠失ま たは心筋性機能のさらなる減少を予防、阻害または遅延するために十分な期間で 、哺乳動物筋形成前駆細胞に薬剤の適切な濃度を提供する量を含む。当業者に理 解されるように、本発明の治療組成物に記載される化合物の濃度は、選択された 薬剤の生物学的効果、使用された化合物の化学的特徴（例えば、疎水性）、化合 物賦形剤の処方、投与経路、および想像される処置を含み、活性成分がインビト ロにおいて細胞へ直接、組織部位へ直接、または全身性にのいずれで投与される かを含む、多くの因子に依存して変わる。投与されるための好ましい投与量はま た、羅患したまたは傷害を受けた組織の状態、および特定の被験体の全体的な健 康状態のような変数に依存するようである。 一般的な問題として、全身性投与に関して、モルフォゲンの0.00001〜1000mg の１日あたりまたは１週間あたりの投与量は十分であり、好ましくは0.0001〜10 Omgであり、さらにより好ましくは0.001〜10mgである。あるいは、体重１kgあた り0.01〜1000μgの１日あたりまたは１週間あたりの投与量、より好ましくは体 重１kgあたり0.1〜100μgの用量が、有利に使用され得る。投与量は、好ましく は、連続的に投与されるが、しかし、一日間、数週間、毎週または毎月の投与量 がまた、使用され得る。さらに、頻繁な注入を容易にするために、半永久的なス テント（例えば、静脈内の、腹腔内の、槽内のまたは藻内の）の移植は、賢明で あり得る。成熟モルフォゲン（例えば、OP1の20mg）が、継続的に21日間、正常 な成長ラットに毎日投与される場合、明白なモルフォゲン誘導病理学的病巣を生 じないことが示される。さらに、正常な新生仔マウスへ10日間毎日注射されたモ ルフォゲン(例えば、OP1)の10mgの全身性注射は、いかなる著しい異常も発生し ない。 もちろん、本発明のモルフォゲン、インデューサー、アゴニストまたは低分子 形態形成アクチベーターは、単独でまたは本明細書中に記載される状態の処置に 有益であることが公知である他の分子との組合せで投与され得る。従って、他の 実施態様では、本発明は、モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフ オゲンレセプターのアゴニスト、または、低分子形態形成アクチベーターが、新 しくそして機能的な心筋への筋形成前駆体細胞の増殖および分化を促進するかま たは増強する他の薬剤と組み合わされる薬学的組成物を提供する。従って、本発 明は、１つ以上の「筋抽出物」、培養物中で増殖する分化した筋管由来の馴化培 地、bFGF、IGF、PDGF、LIF、ACTH、MSH、またはG-CSFとの組合せで、モルフォゲ ン、またはモルフォゲンインデューサー、またはモルフォゲンレセプターのアゴ ニスト、または低分子形態形成アクチベーターを含む薬学的組成物を提供する。 個々のこのような組成物中で、この割合または形態形成的薬剤および分裂促進的 薬剤は、文献で開示されるようにまたは簡単な実験を通して決定されるように、 単一単位投与量中の各化合物の治療有効投与量を提供するために、それらの活性 に基づいて調整され得る。このような組成物中の形態形成的薬剤および分裂促進 的薬剤は、好ましくは少なくとも約１％、そしてより好ましくは５％または10％ を超える組成物の乾燥重量を含む。しかし、この組成物は、上で記載のように、 そして一般には、RemingtonのPharmaceutical Sciences(Gennaro，A編)、Mack P ub.，1990に記載のように、他の薬学的キャリヤーおよび活性薬剤を含み、そし てそのため、形態形成的薬剤および分裂促進的薬剤はそれぞれ、薬学的組成物の 最終重量の小さな割合を含む。 本発明のさらなる好ましい局面および実施態様を含む本発明の実施は、下記の 実施例からさらにより十分に理解され、この実施例は、本明細書中で例示のため にのみ示され、そして本発明をいかなるようにも限定するものとして解釈される べきではない。 実施例 可溶性モルフォゲン複合体の調製 水溶液において可溶性を改善した本明細書中で有用なモルフォゲンの本願にお いて好ましい形態は、二量体の形態形成タンパク質である。このタンパク質は、 モルフォゲンファミリーに特徴的なＣ末端の７個のシステインドメインを少なく とも含み、モルフォゲンファミリーのメンバーのプロ領域を含むペプチド、また はその可溶性増強フラグメント、またはその対立遺伝子、種もしくは他の配列の 変異体と複合体化する。好ましくは、二量体形態形成タンパク質は、２つのプロ 領域ペプチドと複合体化する。また、二量体形態形成タンパク質は、好ましくは 、プロ領域ペプチドと非共有的に複合体化する。プロ領域ペプチドは、好ましく は、所定の天然に存在するモルフォゲン、またはその対立遺伝子もしくは系統学 的に対応する変異体のプロドメインを規定するＮ末端の18アミノ酸を少なくとも 含む。他の好ましい実施態様において、全長プロドメインを実質的に規定するペ プチドが使用される。 他の可溶性形態のモルフォゲンは、「ヘミ二量体」と同様に、これらのタンパ ク質の切断されていないプロ形態の二量体を含む。ここで、二量体の１つのサブ ユニットは、タンパク質の切断されていないプロ形態であり、そしてもう一方の サブユニットはタンパク質の成熟形態を含む。この成熟形態は、その短縮型形態 、好ましくは、切断されたプロドメインペプチドと非共有的に会合する形態を含 む。 上記および公開出願WO94/03600（この教示は本明細書中で参考として援用され る）に記載されるように、有用なプロドメインは全長プロ領域、ならびにその種 々の短縮型形態、特にプロドメインポリペプチド内のタンパク質分解Arg-Xaa-Xa a-Arg切断部位で切断された短縮型形態を含む。例えば、OP-1において、可能な プロ配列は、残基30〜292(全長形態)；48〜292；および158〜292により規定され る配列を含む。可溶性OP-1複合体の安定性は、プロ領域が、残基48〜292の短縮 型形態のような短縮型形態ではなく、全長形態を含む場合、最も増強される。こ の点で、残基30〜47は、他のモルフォゲンのＮ末端部分と配列相同性を示し、そ して本願において全てのモルフォゲンについて複合体安定性を増強するに特に有 用であると考えられている。従って、本願において好ましいプロドメインは、少 なくともＮ末端フラグメント(例えば、天然に存在するモルフォゲンプロドメイ ンのアミノ酸残基30〜47、または天然に存在するペプチドの特性を増強する可溶 性および／または安定性を保持しているその生合成的変異体)を含有するペプチ ドを含む。 当業者に理解されるように、プロ領域をコードする有用な配列は、公知のモル フォゲンをコードする遺伝的配列から得られ得る。あるいは、キメラプロ領域は １つ以上の公知のモルフォゲンの配列から構築され得る。さらにもう１つの選択 肢は、１つ以上の公知のプロ領域配列の合成配列変異体を作製することである。 別の好ましい局面において、有用なプロ領域ペプチドは、少なくともOP1また はOP2のプロ領域配列のＮ末端の18アミノ酸をコードするDNAまたはRNA配列(例え ば、それぞれ配列番号15および19のヌクレオチド136〜192および152〜211)とス トリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ 酸配列を含有するポリペプチド鎖を含む。 Ａ．馴化培地または体液からの単離 モルフォゲンは哺乳動物細胞から可溶性複合体として発現される。しかし、代 表的には、複合体は、一般に精製溶液にしばしば添加される変性剤(例えば、界 面活性剤、アルコール、有機溶媒、カオトロピック剤および溶液のpHを下げるた めに添加される化合物)に曝すことにより、精製の間に解離される。以下に提供 するのは、非変性条件下で、馴化培地(または、必要に応じて、血清、脳脊髄ま たは腹膜液のような体液)から可溶性タンパク質を精製するための本願において 好ましいプロトコルである。この方法は、迅速で再現可能であり、そして、実質 的に純粋な形態の単離された可溶性モルフォゲン複合体をもたらす。 可溶性モルフォゲン複合体は、馴化培地から、変性剤の非存在下で行われる単 純な３工程のクロマトグラフィープロトコルを使用して単離され得る。プロトコ ルは、培地(または体液)をアフィニティーカラムに通すこと、その後イオン交換 およびゲル濾過クロマトグラフィーを行うことを含む。下記のアフィニティーカ ラムはZn-IMACカラムである。本プロトコルは種々のモルフォゲンの精製に対す る一般的な適用性を有し、それらの全ては下記のプロトコルを若干改変したもの を使用して単離され得ることが明らかである。有用性を有するとまた考えられる 別のプロトコルはイムノアフィニティーカラムを含み、このカラムは標準的な手 順、および、例えば、所定のモルフォゲンプロドメインに対して特異的な抗体( 例えば、プロテインＡ結合セファロースカラムに複合体化される)を使用して作 製される。イムノアフィニティーカラムを開発するプロトコルは、当該分野にお いてよく記載されている(例えば、Guide to Protein Purification，M．Deutsch er編、Academic Press，San Diego，1990，特にその第VII節および第XI節を参照 のこと)。 本研究において、当該分野で記載されるようにOP-1は、哺乳動物(CHO、チャイ ニーズハムスター卵巣)細胞で発現された(例えば、国際出願US90/05903(WO91/05 802を参照のこと)。0.5％FBSを含むCHO細胞馴化培地を最初に固定化金属イオン アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を使用して精製した。馴化培地由来可 溶性OP-1複合体は、極めて選択的にZn-IMAC樹脂に結合し、そして高濃度のイミ ダゾール(50mMイミダゾール、pH8.0)は、結合した複合体の効果的な溶出に必要 とされる。Zn-IMAC工程により、大量の混入血清タンパク質(これは、通過画分お よび35mMイミダゾール洗浄画分中に溶出する)から可溶性OP-1が分離される。次 いで、Zn-IMAC精製可溶性OP-1を、50mM NaClとともに20mM NaPO₄(pH7.0)で平衡 化したＳ-Sepharose陽イオン交換カラムに適用した。このＳ-Sepharose工程は、 続くゲル濾過工程のための調製において、可溶性OP-1複合体をさらに精製および 濃縮するように作用する。このタンパク質を、TBSで平衡化したSephacryl S-200 HRカラムに適用した。実質的に同じプロトコルを使用して、可溶性モルフォゲン はまた、血清、脳脊髄液または腹膜液を含む１種以上の体液から単離され得る。 IMACを、カラム容積の３倍の0.2M ZnSO₄で帯電させたChelating-Sepharose(Ph armacia)を使用して行った。馴化培地をpH7.0まで滴定し、そして500mM NaClと ともに20mM HEPES(pH7.0)で平衡化したZn-IMAC樹脂に直接適用した。Zn-IMAC樹 脂に、樹脂１mlあたり80mLの出発馴化培地を充填した。充填後、カラムを平衡緩 衝液で洗浄し、そして混入タンパク質のほとんどを、平衡緩衝液中の35mMイミダ ゾール(pH7.0)で溶出した。可溶性OP-1複合体を、次いで、20mM HEPESおよび500 mM NaCl中の50mMイミダゾール(pH8.0)で溶出する。 可溶性OP-1複合体を含む50mMイミダゾール溶出液を、９倍量の20mM NaPO₄(pH7 .0)で希釈し、そして50mM NaClとともに20mM NaPO₄(pH7.0)で平衡化したS-Sepha rose(Pharmacia)カラムに適用した。Ｓ-Sepharose樹脂に、等量の樹脂１mlあた り800mLの出発馴化培地を充填した。充填後、Ｓ-Sepharoseカラムを平衡緩衝液 で洗浄し、そして20mM NaPO₄(pH7.0)中の100mM NaCl、次いで300mMおよび500mM NaClで溶出した。300mM NaClのプールを、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて さらに精製した。50mlの300mM NaCl溶出液を、Tris緩衝化生理食塩水(TBS)、50m MTris、150mM NaCl(pH7.4)で平衡化した5.0×90cmのSephacryl S-200HR(Pharmac ia)に適用した。カラムを流速５ml/分で溶出し、10mLの画分を集めた。可溶性OP -1の見かけの分子量を、タンパク質分子量標準(アルコールデヒドロゲナーゼ(AD H,150kDa))、ウシ血清アルブミン(BSA、68kDa)、カルボン酸アンヒドラーゼ(CA 、30kDa)およびシトクロムＣ(cytC、12.5kDa)と比較することにより決定した。S -200カラム画分の純度を、クマシーブルーで染色した標準15％ポリアクリルアミ ドSDSゲル上で分離することにより決定した。成熟OP-1およびプロドメインの同 一性を、成熟OP-1を標準逆相C18 HPLCを使用してプロドメインから分離した後、 Ｎ末端配列分析により決定した。 可溶性OP-1複合体は、見かけの分子量110kDaで溶出する。このことは、２つの プロドメイン(各39kDa)と会合する１つの成熟OP-1二量体(35〜36kDa)を含む可溶 性OP-1複合体の推定組成物とよく一致する。最終複合体の純度を、還元した15％ ポリアクリルアミドゲルにおいて適切な画分を泳動することで確認し得る。 複合体成分を、S-200またはS-200HRカラムからの複合体含有画分を逆相C18HP LCカラムにかけ、そしてアセトニトリル勾配(0.1％TFA中)で溶出することにより 、標準的な手順を用いて確認し得る。複合体をこの工程で分離し、そしてプロド メインおよび成熟種は、分離種として溶出する。これらの分離種は、次いで標準 的な手順(例えば、Guide to Protein Purification，M．Deutscher編、Academic Press，San Diego，1990，特に602〜613頁を参照のこと)を用いてＮ末端配列決 定に供され、そして、単離された36kDa、39kDaのタンパク質の正体は、成熟モル フォゲンおよび単離され切断されたプロドメインとしてそれぞれ確認され得る。 OP-1を産生した哺乳動物細胞由来の単離プロドメインのＮ末端配列決定は、２つ の形態のプロ領域、すなわちインタクトな形態(配列番号16の残基30から始まる) 、および短縮型形態(配列番号16の残基48から始まる)を示した。単離された成熟 種のポリペプチドサブユニットのＮ末端配列決定は、成熟配列についてのＮ末端 の範囲を示し、配列番号16の残基293、300、313、315、316および318から始まり 、それらの全ては公開出願WO92/15323（本明細書中で参考として援用される）に 記載される標準骨形態形成アッセイにより示されるように活性である。 Ｂ．インビトロでの可溶性モルフォゲン複合体形成 培養培地または体液から可溶性複合体を精製する別の方法として、可溶性複合 体を精製プロドメインおよび成熟二量体種から処方し得る。十分な複合体形成に は、明らかに、これらの分子の折り畳まれた構造を、ジスルフィド結合に作用せ ずに弛緩させるに十分な変性条件下での成分の会合を必要とする。好ましくは、 変性条件は、切断されたプロドメインが弛緩した折り畳み条件下で成熟二量体種 と会合する機会を有するように細胞内小胞の環境を十分に模倣する。次いで、溶 液中の変性剤の濃度を、プロドメインと二量体との会合を維持しながら二量体お よびプロ領域を適切に再折り畳みさせるｓように、制御された、好ましくは段階 的な様式で減少する。有用な変性剤は、pH４〜10、好ましくはpH６〜８の緩衝化 溶液中の４〜６Ｍ尿素またはグアニジン-ヒドロクロリド(GuHCl)を含む。可溶性 複合体を、次いで、最終変性剤濃度0.1〜2Ｍ未満の尿素またはGuHCl、好ましく は１〜２Ｍ尿素またはGuHClを有する溶液中で制御された透析または希釈により 形成し、これを、次いで、好ましくは生理学的緩衝液中で希釈し得る。タンパク 質精製／再生の手順および考察は当該分野でよく記載され、そして適切な再生プ ロトコルを容易に開発するための詳細は、当業者により決定され得る。この目的 における一つの有用なテキストは、Guide to Protein Purification，M．Deutsc her編、Academic Press，San Diego，1990，特に第Ｖ節である。複合体形成はま た、１つ以上のシャペロンタンパク質の添加により補助され得る。 Ｃ.可溶性モルフォゲン複合体の安定性 生理学的緩衝液、例えば、トリス緩衝化生理食塩水(TBS)およびリン酸緩衝化 生理食塩水(PBS)中の高度に精製された可溶性モルフォゲンの安定性は、任意の 多くの手段により増強され得る。本願の好ましい手段は、少なくともプロ配列の 最初の18アミノ酸(例えば、OP-1の配列番号16の残基30〜47)を含むプロ領域、そ して好ましくは全長のプロ領域を使用することである。残基30〜47は他のモルフ ォゲンのＮ末端部分に対して配列相同性を示し、そして全てのモルフォゲンにつ いて複合体の安定性を増強する特定の有用性を有すると考えられている。可溶性 モルフォゲン複合体の安定性を増強する他の有用な手段は、３つのクラスの添加 剤を含む。これらの添加剤は、塩基性アミノ酸(例えば、L-アルギニン、リジン およびベタイン)；非イオン性界面活性剤(例えば、Tween80またはNonIdet P-120 )；およびキャリアタンパク質(例えば、血清アルブミンおよびカゼイン)を含む 。これらの添加剤の有用な濃度は、1〜100mM、好ましくは10〜70mMの塩基性アミ ノ酸(50mM塩基性アミノ酸を含む)；0.01〜1.0％、好ましくは0.05〜0.2％の非イ オン性界面活性剤(0.1％(v/v)の非イオン性界面活性剤を含む)；そして0.01〜1. 0％、好ましくは0.05％〜0.2％のキャリアタンパク質(0.1％(w/v)キャリアタン パク質を含む)である。 等価物 本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態 において具体化され得る。従って、前述の実施態様は、本明細書中に記載される 本発明に限定されるのではなく例示的な全ての観点において考慮されるべきであ る。従って、本発明の範囲は、前記説明ではなく添付の請求の範囲により示され 、そして請求の範囲の等価の趣旨および範囲内に生じる全ての変化が、本明細書 に包含されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．心筋層の損失または損傷の危険にある、または羅患している哺乳動物の治療 の方法であって、該方法は、心筋層の損失または損傷の危険にある、または羅患 している該哺乳動物に筋形成前駆体細胞の調製物を移植する工程、および機能的 な心筋層への該筋形成前駆体細胞の増殖または分化を促進するために十分な量の モルフォゲンで該筋形成前駆体細胞を処置する工程、を包含する、方法。 ２．心筋層の損失または損傷の危険にある、または羅患している哺乳動物の治療 の方法であって、該方法は、心筋層の損失または損傷の危険にある、または羅患 している該哺乳動物に筋形成前駆体細胞の調製物を移植する工程、および該哺乳 動物の遺伝子によりコードされるモルフォゲンのインデューサーのある量で該哺 乳動物を処置する工程であって、該量が機能的な心筋層への該筋形成前駆体細胞 の増殖または分化を促進するために十分である、工程を包含する、方法。 ３．心筋層の損傷の危険にある、または羅患している哺乳動物の治療の方法であ って、該方法は、心筋層の損失または損傷の危険性にある、または羅患している 該哺乳動物に筋形成前駆体細胞の調製物を移植する工程、および該筋形成前駆体 細胞により発現されるモルフォゲンレセプターのアゴニストのある量で該筋形成 前駆体細胞を処置する工程であって、該量が機能的な心筋層への該筋形成前駆体 細胞の増殖または分化を促進するために十分である、工程を包含する、方法。 ４．心筋層の損失または損傷の危険にある、または羅患している哺乳動物の治療 の方法であって、該方法は、心筋層の損失または損傷の危険にある、または羅患 している該哺乳動物に筋形成前駆体細胞の調製物を移植する工程、および低分子 形態形成アクチベーターのある量で該筋形成前駆体細胞を処置する工程であって 、該量が機能的な心筋層への該筋形成前駆体細胞の増殖または分化を促進するた めに十分である、工程を包含する、方法。 ５．前記筋形成前駆体細胞が、哺乳動物骨格筋衛星細胞、胚筋形成前駆体細胞、 および組織適合性哺乳動物筋形成前駆体細胞株からなる群から選択される、請求 項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 ６．前記筋形成前駆体細胞が、自己骨格筋衛星細胞である、請求項１〜４のいず れか１項に記載の方法。 ７．前記哺乳動物が心筋梗塞およびうっ血性心不全からなる群から選択される状 態に羅患している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 ８．前記処置工程が、前記移植工程の前に行われる、請求項１〜４のいずれか１ 項に記載の方法。 ９．前記処置工程が、前記移植工程と同時に行われる、請求項１〜４のいずれか １項に記載の方法。 10．前記処置工程が、前記移植工程に続いて行われる、請求項１〜４のいずれか １項に記載の方法。 11．前記処置工程が、少なくとも４週の期間の間に少なくとも週に１回である、 請求項10に記載の方法。 12．前記処置工程が、少なくとも１年の期間の間に少なくとも月に１回である、 請求項10に記載の方法。 13．前記モルフォゲン処置工程が、約0.01〜1000ng/mlの濃度でモルフォゲンを 使用して行われる、請求項１に記載の方法。 14．前記モルフォゲン処置工程が、約0.1〜100ng/mlの濃度でモルフォゲンを使 用して行われる、請求項１に記載の方法。 15．筋形成前駆体細胞の増殖または機能的な心筋層への筋形成前駆体細胞の分化 を促進する方法であって、以下の工程： (a)該細胞を該増殖または分化を誘導するために効果的な量のモルフォゲンと接 触させる工程；および (b)形態形成的に許容可能な環境で該細胞を維持する工程、を包含する、方法。 16．前記モルフォゲンが、モルフォゲン、モルフォゲンの可溶性形態、成熟モル フォゲン、および該モルフォゲンの少なくとも７つのシステインドメインを包含 する該モルフォゲンのＣ末端フラグメントからなる群から選択される、請求項１ に記載の方法。 17．前記モルフォゲンが、骨形成タンパク質および骨形態形成タンパク質からな る群から選択される、請求項１に記載の方法。 18．該モルフォゲンが、機能的な哺乳動物心筋層の形成で終結する組織特異的形 態形成のカスケードを誘導し；そして １対の折り畳まれたポリペプチドであって、その各々のアミノ酸配列が、それぞ れ、配列番号５、６、７、または８の残基38〜139であるヒトOP-1、マウスOP-1 、ヒトOP-2、またはマウスOP-2のＣ末端７−システインドメインと少なくとも70 ％のアミノ酸配列相同性を有する配列を包含する、ポリペプチド、を包含する、 請求項１に記載の方法。 19．該モルフォゲンが、OP-1、CBMP-2A(BMP-2)、およびCBMP-2B(BMP-4)からなる 群から選択される、請求項１に記載の方法。 20．単離された哺乳動物筋形成前駆体細胞、および形態形成的に許容可能な環境 で機能的な心筋層への該筋形成前駆体細胞の増殖または分化を促進するために十 分な量のモルフォゲンを包含する、哺乳動物心筋層の修復または再生を促進する 治療組成物。 21．単離された哺乳動物筋形成前駆体細胞、および形態形成的に許容可能な環境 で機能的な心筋層への該筋形成前駆体細胞の増殖または分化を促進するために十 分な量のモルフォゲンのインデューサーを包含する、哺乳動物心筋層の修復また は再生を促進する治療組成物。 22．単離された哺乳動物筋形成前駆体細胞、および形態形成的に許容可能な環境 で機能的な心筋層への該筋形成前駆体細胞の増殖または分化を促進するために十 分な量のモルフォゲンレセプターのアゴニストを包含する、哺乳動物心筋層の修 復または再生を促進する治療組成物。 23．単離された哺乳動物筋形成前駆体細胞、および形態形成的に許容な環境で機 能的な心筋層への該筋形成前駆体細胞の増殖または分化を促進するために十分な 量の低分子筋形成アクチベーターを包含する、哺乳動物心筋層の修復または再生 を促進する治療組成物。 24．哺乳動物筋形成前駆体細胞を培養する方法であって、該筋形成前駆体細胞を 単離する工程、および形態形成的に許容可能な環境で機能的な心筋層への該筋形 成前駆体細胞の増殖または分化を促進するために十分な量のモルフォゲンを包含 する培地中で該筋形成前駆体細胞を培養する工程、を包含する、方法。 25．哺乳動物筋形成前駆体細胞を培養する方法であって、該筋形成前駆体細胞を 単離する工程、、および形態形成的に許容可能な環境で機能的な心筋層への該筋 形成前駆体細胞の増殖または分化を促進するために十分な量のモルフォゲンのイ ンデューサーを包含する培地中で該筋形成前駆体細胞を培養する工程を、包含す る、方法。 26．哺乳動物筋形成前駆体細胞を培養する方法であって、該筋形成前駆体細胞を 単離する工程、および形態形成的に許容可能な環境で機能的な心筋層への該筋形 成前駆体細胞の増殖または分化を促進するために十分な量のモルフォゲンレセプ ターのアゴニスト量を包含する培地中で該筋形成前駆体細胞を培養する工程、を 包含する、方法。 27．哺乳動物筋形成前駆体細胞を培養する方法であって、該筋形成前駆体細胞を 単離する工程、および形態形成的に許容可能な環境で機能的な心筋層への該筋形 成前駆体細胞の増殖または分化を促進するために十分な量の低分子形態形成アク チベーターを包含する培地中で該筋形成前駆体細胞を培養する工程、を包含する 、方法。 28．骨格筋または平滑筋へ分化することが本来可能である筋形成前駆体細胞の心 筋細胞への分化を誘導させる方法であって、該方法は (a)モルフォゲンと該筋形成前駆体細胞とを接触させる工程；および (b)心筋形成のために、形態形成的に許容可能な環境において(a)の産物を維持す る工程、を包含する、方法。 29．心筋細胞の置換を、それを必要とする哺乳動物において生成させる方法であ って、請求項28に記載の方法により誘導された該哺乳動物筋形成前駆体細胞への 移植の工程を包含する、方法。 30．モルフォゲン、モルフォゲンインデューサー、モルフォゲンレセプターのア ゴニスト、および低分子形態形成アクチベーターからなる群から選択される形態 形成薬剤、ならびにbFGF、IGF、PDGF、LIF、ACTH、MSH、およびG-CSFからなる群 から選択される分裂促進因子を包含する、薬学的組成物。