JPH11511181A - 骨形態形成タンパク質および繊維芽細胞増殖因子組成物と心臓発生の誘導方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質および繊維芽細胞増殖因子の精製混合物を含む、心臓遺伝子の組成物を開示する。別の実施態様で、本発明は非心臓系細胞において、細胞を組成物にさらし、心細胞の発生を観察することを特徴とする、心臓発生を誘導する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 骨形態形成タンパク質および繊維芽細胞増殖因子組成物と心臓発生の誘導方法 発明の分野 本発明の分野は非心臓組織において心臓発生（カルジオジェネシス）を誘発さ せることができる治療組成物に関する。特に本発明の分野はトランスフォーミン グ増殖因子−βタンパク質および繊維芽細胞増殖因子タンパク質を含む試薬に関 する。 発明の背景 ドクター ジョン ラウ（Dr．John Lough）の研究室において、ニワトリ６期 胚の心臓形成部（ＨＦＲ）からの前外側板内胚葉細胞が外植心臓前方中胚葉で心 臓発生を特異的に誘導することを認めた。サルコメアα−アクチンを発現する律 動的な収縮性細胞の多層小胞形成で特徴づけられるプロセスである（ワイ．スギ とジェイ．ラウ(Sugi，Y．and Lough，J.)、Dev. Dvn. 200:155-162，1994）。 ワイ．スギとジェイ．ラウの最近の報告によると、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ １、２および４）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリ ー（アクチビンＡ）を含む内胚葉関連因子は心臓前中胚葉上でＨＲＦ内胚葉の擬 態的な心臓遺伝子の効果を示す(ワイ．スギとジェイ．ラウ、Dev. Biol. 169:56 7-574，1995)。現状の技術では、非心臓組織において心臓発生を誘導可能な組成 物はない。 発明の開示 本発明はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質および繊維芽細胞増殖 因子の精製混合物を含む心臓遺伝子の（cardiogenic）組成物である。特にトラ ンスフォーミング増殖因子−βタンパク質は骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、 ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、 ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ −１３およびＢＭＰ−１５からなる群からなる。トランスフォーミング増殖因子 −βタンパク質は、もっとも好ましくは、ＢＭＰ−２である。 繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、好ましくは、ＦＧＦ１〜１５からなる群か ら選ばれる。もっとも好ましいＦＧＦはＦＧＦ−４もしくはＦＧＦ−２のいずれ かである。 別の実施態様において、本発明は骨形態形成タンパク質２および繊維芽細胞増 殖因子（ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−４）の精製混合物に細胞をさらし、サルコメ アα−アクチンを発現する律動的な収縮性細胞の発生を観察する段階を含んでな る、非心臓系細胞における心臓発生を誘導する方法に関する。このさらしを行う のは生体内(in vivo)でも試験管内(in vitro)でも良い。 本発明の１実施態様では、タンパク質混合物を外因的に試験管内で細胞に適用 した。別の実施態様では、細胞を骨形態形成タンパク質および繊維芽細胞増殖因 子をエンコードする遺伝構成物で形質転換した。次に、遺伝構成物に心臓遺伝子 のタンパク質を発現させた。 本発明の重要な特徴は心臓細胞が非心臓組織から誘導されることにある。 本発明のほかの目的、特徴および長所は明細書、図面および請求の範囲を検討 することで明らかになろう。 図面の簡単な説明 図１ＡおよびＢはＢＭＰ−２およびＦＧＦ−４で処理した非心臓前中胚葉細胞 で心臓発生が起きることを示す。図１Ａは鳥類６期胚の心臓形成部（前心臓組織 ）および非心臓前組織部を示す。図１ＢはＦＧＦ−４、ＢＭＰ−２、またはＦＧ Ｆ−４とＢＭＰ−２の組み合わせ処理に対し、得られた収縮性外植片率のグラウ である。 発明を実施するための最良の形態 本発明は非心臓前組織、好ましくはヒト組織で心臓発生を誘導するための組成 物および方法に関する。ここで「心臓発生」は非心臓系部分細胞からサルコメア α−アクチンを発現する律動的、同調的な収縮性細胞の発生を言う。細胞は顕微 鏡観察によって心臓細胞として確認できることが好ましい。以下の例はサルコメ アα−アクチンを認識するモノクローナル抗体が、細胞がα−アクチンを発現し ていることを、確認できることを実証する。 「非心臓前組織」は心臓系でない組織を意味する。たとえば、次の組織は非心 臓前組織で、繊維芽細胞、これは結合組織、骨格筋などのようにほかの中胚葉派 生体になる細胞もある。 １実施態様において、組成物はトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ− β）ファミリーの骨形態形成タンパク質のサブファミ リーメンバーおよび繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む。試薬は、好ましくは 、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）およびＦＧＦ−４を含む。 組成物はタンパク質の「精製」混合物を含む。ここで「精製」は、該当タンパ ク質が天然または組換え細菌源から精製されたことを言う。たとえば、細胞粗抽 出物は、個別にほとんど１００％均質に精製されたタンパク質の組み合わせとし て「精製」されている。 以下の実験項に記述する実験はＢＭＰ−２およびＦＧＦ−４の組み合わせが、 ただしいずれの因子も単独ではなく、鳥類胚の非心臓前中胚葉で心臓発生を誘導 することを実証する。このタンパク質分子の組み合わせが、ＴＧＦ−βおよびＦ ＧＦファミリーメンバーの別の組み合わせもおそらく、ヒト非心臓組織などのほ かの非心臓前組織に心臓発生を誘導するものと予見される。 ＢＭＰ−２の代表的起源は細菌に発現している骨または組換えヒトＢＭＰ−２ である。 ＢＭＰ−２に加えまたは代わりに、本発明の組成物はタンパク質のＴＧＦ−β スーパーファミリーのメンバーである１種以上のほかのタンパク質、特にＢＭＰ −２を含む骨形態形成タンパク質サブファミリーに特徴的な高度に保存された７ - システイン構造を維持するタンパク質を含み得る。したがって本発明の組成物 は治療に有用な薬剤、たとえば米国特許第５，０１３，６４９号、５，１１６， ７３８号、５，１０６号，７４８、５号，１８７，０７６号および５，１４１， ９０５号に開示されたＢＭＰタンパク質、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５ 、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７、国際特許公開ＷＯ９１／１８０９８に開示され たＢＭＰ−８、国際特許公 開ＷＯ９３／００４３２に開示されたＢＭＰ−９、国際特許出願ＷＯ９４／２６ ８９３に開示されたＢＭＰ−１０、国際特許出願ＷＯ９４／２６８９２に開示さ れたＢＭＰ−１１、国際特許出願ＷＯ９５／１６０３５に開示されたＢＭＰ−１ ２またはＢＭＰ−１３、１９９５年５月１８日に提出された同時係属特許出願、 出願番号０８／４４６，９２４に開示されたＢＭＰ−１５を含んでも良い。 そのほかに有用な組成物には、ジョーンズら（Jones et al.）が、Mol. Endoc rinol. 6:1961-1968（1992）に記述したＶｇｒ−２および国際特許出願ＷＯ９４ ／１５９６５、ＷＯ９４／１５９４９、ＷＯ９５／０１８０１、ＷＯ９５／１８ ０２、ＷＯ９４／２１６８１、ＷＯ９４／１５９６６ほかに記述されたものを含 む、増殖分化因子ＧＤＦｓのいずれかが含まれる。 本発明のそのほかに有用な組成物は国際特許出願ＷＯ９４／０１５５７に開示 されたＢＩＰおよびＷＯ９３／１６０９９に開示されたＭＰ５２でも良い。 ＦＧＦ−４の好ましい起源はヒトタンパク質を発現している組換え細菌である 。 ＦＧＦ−４はｋ−ＦＧＦとして公知でありまた米国特許第５，４３０，０１９ 号に記述されているが、これに加えまたは代わりに、本発明の組成物はタンパク 質のＦＧＦファミリーのメンバーである１種以上のほかのタンパク質、たとえば 塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ−１）および米国特許番号５ ，４３０，０１９に記述されているほかのＦＧＦを含み得る。上記のすべての出 願、特許および文献に開示された事項は引用としてここに取り込まれる。繊維芽 細胞増殖因子は、好ましくはＦＧＦ１〜１５からなる 群から選択する。もっとも好ましいＦＧＦはＦＧＦ−２もしくはＦＧＦ−４であ る。 本発明の組成物は、ＴＧＦ−βタンパク質およびＦＧＦタンパク質に加え、表 皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧ Ｆ−β）、アクチビン類、インヒビン類およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ） のような増殖因子を含むほかの治療に有用な薬剤を含み得る。 ある組成物が本発明に適格であるかを決定する場合は、以下に記述する鳥類の 非心臓前中胚葉を評価する方法で、試験組成物を評価できるはずである。本発明 に適格な組成物は鳥類の試験非心臓前中胚葉に、以下に実証する少なくとも５０ ％程度の心臓発生を誘導する。 本発明の組成物はまた適切なマトリックスを含み得る。たとえば、組成物を支 持し、心筋細胞の増殖および／またはほかの組織の増殖のために表面を提供する マトリックスを求めても良い。マトリックスはタンパク質の緩徐な放出および／ またはその状態に適切な環境、細胞浸潤に適切な環境を提供する。かかるマトリ ックスは、医療用に移植して使用されるほかの材料で形成され得る。 マトリックス材の選択は生体適合性、生分解性、機械的性質、整形上の外見お よび界面の性状による。組成物の特定の用途によって適切な配合が定まる。組成 物に対し可能なマトリックスは生物分解性で、かつポリ乳酸、ポリグリコールポ リオルトエステル類およびポリ無水物などの化学的重合物である。ほかに可能な 材料は生分解性で、かつコラーゲンなどのように生物的によく明らかにされたも のがある。マトリックスは、さらに純粋なタンパク質または細胞外 マトリックス要素を含み得る。そのほかに可能なマトリックスは生分解性でない 、かつ化学的に明らかにされた焼成ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アル ミン酸塩またはほかのセラミックスである。マトリックスは上記物質およびその ほかの適切な種類の材料とのいかなる組み合わせを含んでも良く、細孔径、粒径 、粒子形状および生分解性を変えるために組成および処理を変更し得る。 骨形態形成タンパク質および繊維芽細胞増殖因子タンパク質は、好ましくはモ ル比で１：１に混合する。ここで、「１：１」は少なくとも２０％のばらつきを 許容する。しかし、ほかの比率でも心臓発生がみられ、適切な比率であると思わ れる。 用量処方計画は医師の立ち会いのもとに、タンパク質組成物の作用を修飾する 種々な因子、たとえば形成させる組織量、組織の損傷部位、損傷組織の状態、傷 の大きさ、損傷組織の種類、患者の年齢、性別および食餌、感染の程度、投与時 期およびそのほかの臨床的要因を考慮して決定する。投与量は再構成に使用され るマトリックスの種類および組成物中のタンパク質の種類によって変えても良い 。他の既知な増殖因子、ＩＧＦ Ｉ（インスリン様成長因子Ｉ）などを最終組成 物に追加すると、用量に影響することもある。 本発明の組成物の潜在的な利用には、心臓組織損傷患者またはストレス患者の 処置が含まれる。組成物は損傷またはストレスを受けた組織に直接適用する外科 的処置の付加物として使用しても良い。本実施態様においては、組成物はそれ自 体でまたは心臓系細胞または心筋細胞系に分化可能な培養細胞とともに使用され る。かかる実施態様に有用な細胞には、培養心細胞または培養心筋細胞、心細胞 または心筋細胞の前駆体、繊維芽細胞、胎児性中胚葉細胞または中 胚葉に分化可能な早期胚幹細胞がある。 また、組成物は、オートロガスまたは異種（ヘテロロガス）であろうと、心臓 系細胞または心筋細胞系細胞の処置、成長促進、増殖、分化および／または維持 のいずれかに使用できる。このように処理された細胞は次に、単独または本発明 のタンパク質組成物と一緒に、損傷またはストレスを受けた組織に適用される。 ほかの実施態様においては、本組成物のタンパク質をエンコードするＤＮＡ配 列が細胞内に移入し、細胞にＢＭＰおよびＦＧＦタンパク質を産生させる。移入 細胞はＢＭＰおよびＦＧＦタンパク質を産生することができ、次に損傷またはス トレスを受けた組織部位に移植される。 適切なマトリックスは上記実施態様のいずれとも、組成物および／または細胞 を、損傷またはストレスを受けた組織部位に維持するために使用できる。または 、組成物を注入可能にした処方は、タンパク質および／または細胞組成物のいず れかの投与に使用できる。前記処方は組織の損傷またはストレスを防止または縮 小するための予防処置に使用できる。 例 １．全般的 ＨＦＲ中胚葉に付加したＴＧＦ−βファミリー増殖因子を検出するための染色 で、ショウジョウバエ、デカペンタプレジック（decapentaplegic（ｄｐｐ）） 様タンパク質の刺激的な発現パターンが現れたので、これらの細胞によって発現 される脊椎動物のｄｐｐ様因子を同定するために、縮重逆転写／ポリメラーゼ連 鎖反応（ＲＴ ／ＰＣＲ）スクリーンを実施した。これまでの５０を超えるＰＣＲ配列産生物う ち、半数以上が骨形態形成因子２（ＢＭＰ−２）と確認された。 次に、ＢＭＰ−２が心臓前中胚葉上でＨＦＲ内胚様の心臓遺伝子の効果を擬態 するかを、非心臓前中胚葉を心臓系に再特異化する能力とともに調査した。規定 媒体中に単に補助体として存在する場合には、ＢＭＰ−２は心臓前または非心臓 前中胚葉の生存率のいずれも支持できないことを報告する。ＦＧＦ−４は心臓前 中胚葉で心臓発生を支持するが、この因子は外植片の増殖を維持したけれども、 非心臓前中胚葉での心臓発生を誘導しなかった。しかし、ＦＧＦ−４およびＢＭ Ｐ−２の組み合わせで非心臓前中胚葉を処理すると、外植片の高い発生率におい て、心臓発生を著しく誘導した。このことは、この増殖因子の組み合わせが胎児 性細胞を心臓系に再特異化できることを示している。 ２．材料および方法 胎児性中胚葉の外植と培養： ニワトリの胚をハンブルガーとハミルトン（Hamburger and Hamilton）の基準 （ブイ．ハンブルガーとエッチ．エル．ハミルトン（Hamburger,V．and H．L．H amilton)、J. Morphol. 38:49-92，1951）にしたがって段階付けした。前方外側 板心臓前中胚葉および６期胚の後半部からの非心臓前中胚葉を顕微解剖し、ラブ −テク（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）チャンバースライドに外植し、前記のようにＭ１９９ 中で培養した（ワイ．スギとジェイ．ラウ、前掲、1994; ワイ．スギとジェイ． ラウ、前掲、1995）。移植片がフィブロネクチン基質に付着した後、成長因子の 指示最終濃度を加えた。ヒト組換えＦ ＧＦ−４はアールアンドディーシステム社（Ｒ＆ＤSystem）から購入した。ヒト 組換えＢＭＰ−２はジェネティックインスティチュート社（(Genetic Institute )ケンブリッジ、マサチューセット州）によって提供された。増殖因子を含む媒 体は毎日取り替えた。 免疫組織化学： 生化学的分化を免疫組織化学的に、サルコメアα−アクチンを認識するモノク ローナル抗体（シグマ(Sigma)、Cat．No．A-2172）を使用して観察（モニター） した。２次抗体は蛍光イソチオシアネート（FITC）で標識した山羊抗マウスＩｇ Ｍ（Cappel）を使用した。ドクター エフ．ミカエルホフマン（Dr．F．Michael Hoffman）によって提供されたショウジョウバエデカペンタプレジックを認識す るポリクローナル抗体（1:1,000）（ウィスコンシン大学、ジー．イー．エフ． パンガニバンら(Panganiban，G．E．F.，et al.)、Mol. Cell. Biol. 10:2669-2 677，1990)を使用してデカペンタプレジック様タンパク質を局所化した。１次抗 体として使用した正常ウサギの血清を同濃度に希釈したものおよび１次抗体を省 いたものを対照群とした。ＦＩＴＣ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５００）を２ 次抗体とした。免疫組織化学手順のすべては、５’−ブロモデオキシウリジン取 り込みの決定を含め、既に記述した（ワイ．スギとジェイ．ラウ、前掲、1995） 。 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）： 顕微解剖したＨＦＲ６期中胚葉のＲＮＡを５μｇの鎖状ポリアクリルアミドを キャリアとし、ＲＮＡスタット（ｓｔａｔ）（テル−テスト社（Ｔｅｌ−Ｔｅｓ ｔ））を使用して精製した。相補的ＤＮＡをオリゴ−ｄＴ−プライムＲＮＡのＭ −ＭＬＶ逆転写酵素仲介エ クステンションによって合成した。ゲノムＤＮＡの混入をなくするために、非逆 転写ＲＮＡを同時に処理した。縮重したプライマーはＴＦＧ- βｄｐｐサブファ ミリーの保存ドメインを認識するために設計した。上流プライマーは 5'- TGGAATTCGGITGGVAIGAYTGGAT-3' （９６重縮重） (SEQ ID NO:1)、下流側標的の逆相補配列は 5'-GAGGATCCGGIACRCARCAIGCYTT-3' （１２８重縮重） (SEQ ID NO:2)であった。 相補的ＤＮＡをサーマス アクアチクス（Thermus aquaticus（Tag））ＤＮＡ ポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を使用し、４０サイクル変成（９４℃、 １分）、プライマー・アニーリング（４５℃、1.5 分）およびエクステンション （７２℃、２分）で増殖した。予想２００塩基対産生物中の相補的ＤＮＡをピー シーアールエスクリプト（pCRScript(Stratagene)）中にクローン化した。クロ ーン化した挿入断片の同定はジーンバンク／イーエムビーオー（GeneBank/EMBO ）データベースとのシーケンシングおよび比較によって決定した。 ３．結果 ＨＦＲ内胚様におけるＤＰＰ様タンパク質の免疫組織化学的局所化： ショウジョウバエデカペンタプレジック（ｄｐｐ）様タンパク質がＨＦＲ内胚 様と関連があるか確認するために、培養ＨＦＲ内胚葉の抗ｄｐｐ染色パターンを 外植心臓前中胚葉と比較して決定した。ＨＲＦ内胚葉細胞の末梢は強い染色を示 し、心臓前中胚葉または正常なウサギ血清で染色した対照外植片では観察されな かった。 ＨＦＲ内胚葉におけるＢＭＰ−２のＲＴ／ＰＣＲ実証： ｄｐｐはＢＭＰ−２および４と７５％が相同であるので、上述した抗原はこれ らの因子またはＴＧＦ−βｄｐｐサブグループのほかのメンバーを代表すると考 えられた。ＨＲＦ内胚葉が発現するｄｐｐｍＲＮＡを同定するために、このサブ グループの保存ドメインを標的にした縮重プライマーを用いて、ＲＴ／ＰＣＲス クリーンを実施した。ｄｐｐｃＤＮＡの予想サイズである単一２００塩基対ＰＣ Ｒ産生物をクローン化し、ＨＦＲ内胚葉が発現したｄｐｐ様因子を個別に同定す るために配列決定した。現在まで配列したｃＤＮＡ約５０のうち、半数以上が１ ６２塩基伸長にわたってＢＭＰ−２と同ーであった。この１６２塩基伸長はニワ トリ相同体のヌクレオチド８００−９６２、プライマー特異化ドメインに対応す るピー．エッチ．フランシスら(Francis，P．H．et al.)、Development 120:209 -218，1994）。そのほかの既知なまたは新規なｄｐｐサブグループのメンバーは 確認されなかった。残存のクローンｃＤＮＡには相互に類似な配列がみられたが 、データベースエントリーのいずれとも相同ではない。この事実は、ＢＭＰ−２ がＨＦＲ内胚葉が発現するｄｐｐグループの主要なメンバーであることを示唆し ている。 非心臓前中胚葉におけるＢＭＰ−２およびＦＧＦ−４の心臓発生誘導： 上記の結果に基づき、ＢＭＰ−２が、特定媒体中に単独で存在するとき、心臓 前中胚葉上でＨＦＲ内胚葉の心臓遺伝子の効果を擬態するかどうかを決定するこ とが関心事であった。ＦＧＦと異なり（ワイ．スギとジェイ．ラウ、前掲、1995 ; エックス．ツーら(Zhu，X.，et al.)「胎児の心臓発育を制御する自己分泌お よびパラ分泌 機構に、繊維芽細胞増殖因子１および４が参画する根拠」、提出文献）、ＢＭＰ −２は心臓前中胚葉の生存も分化も支持しなかった。しかし、予想されるように ＦＧＦ−４をＢＭＰ−２に含ませると心臓前中胚葉に末期心臓発生を誘導した。 図１ＡおよびＢはＢＭＰ−２およびＦＧＦ−４で処理した非心臓前中胚葉での 心臓発生の発生率を示す。非心臓前中胚葉は６期杯の後半部位から外植しＦＧＦ −４および／またはＢＭＰ−２の存在のもとに指定濃度で培養した。ＦＧＦ−４ もＢＭＰ−２のいずれも単独では外植片に心臓の分化を誘導しなかったが、両増 殖因子で処理した外植片の大部分が１又は２日以内に細胞多層化および律動的な 収縮性を示した。図１Ｂを参照して説明すると、括弧内の数字は５つの実験集合 で行った実験の反復数を示し、実験集合のそれぞれは約５複製外植片を含む。分 化の発生率（４０〜６０％）は各反復実験において同様であった。 図１Ａ簿ブロック図が示すように、これらの判定は６期杯の後半部位から外植 した非心臓前中胚葉で行った。この部位の細胞は、非心臓胚外中胚葉および外側 板中胚葉になるように運命づけられている（調査文献：ジー．ニコレット（Nico let，G．）、Adv. Morphogenesis 9:231-262，1971）。図１Ｂが示すように、Ｆ ＧＦ−４もＢＭＰ−２も単独では非心臓前中胚葉において収縮性外植片の形成を 誘導できなかった。ＢＭＰ−２単独で培養した細胞は培養皿から剥離し生存でき なかった。ＦＧＦ−４の単独処理では、５’−ブロモデオキシウリジン取り込み で示されるように、細胞増殖を支持したが、分化は観察できなかった。しかし、 ＦＧＦ−４およびＢＭＰ−２の組み合わせでは、非心臓前中胚葉外植片の半数以 上で、明らか に、律動的な収縮性およびサルコメアα−アクチン分化を示す多細胞性小胞形成 によって示される心臓遺伝子の分化を誘導した（図１Ｂ）。非心臓前中胚葉の分 化は通常試験管内では２日まで観察されないので（図１Ｂ）、分化が１日で観察 される心臓前中胚葉と異なり、非心臓前中胚葉外植片における再特異化段階の存 在が示唆される。これらの結果は増殖因子が相乗的に機能して、心臓系に定めら れていない細胞で心臓発生を誘導することを示す。 ４．考察 ＨＦＲ内胚葉が末期的分化を誘導する能力において特異的である（ワイ．スギ とジェイ．ラウ、前掲、1994）という前記結果を、さらに確認するのが、ティー ．エム．シュルティスら（Schultheiss，T．M.，et al.，Development 121:4203 -4214，1995）の報告で、ＨＦＲ内胚葉は胎児の細胞を心臓系に再特異化できる と報じている。後者に関し本例の観察では、ＨＦＲ内胚葉は後部非心臓前中胚葉 を再特異化しなかったが（ワイ．スギとジェイ．ラウ、前掲、1994）、これは明 らかに内胚葉因子の局所濃度が不適正なことを反映していて、外植片を隣接とい うより培養皿の反対側に置いたことが原因である。ここに報告した、ＢＭＰ−２ およびＦＧＦ−４の複合活性が、両者ともにＨＦＲ内胚葉に発現し、非心臓前中 胚葉で心臓発生を誘導した事実は、細胞を心臓遺伝子系に再特異化するＨＦＲ内 胚葉の能力と一致する。 我々は、ＨＦＲ内胚葉がＦＧＦファミリーの３メンバー（ＦＧＦ−１、２およ び４）を発現し、それぞれが心臓前中胚葉の分化を支持することを既に確めた（ ワイ．スギとジェイ．ラウ、前掲、1995; エックス．ツーら、前掲、Developmen tal Dynamics、印刷中）。 さらに、ＦＧＦの同族体レセプタへの結合を特異的に阻害する塩素酸ナトリウム を用いる実験で、ＦＧＦシグナルが内胚葉仲介心臓発生に必須であることを示し た（未公表観察）。しかし、ＦＧＦの主な役割は、明らかに、心臓前中胚葉の増 殖を制御することであり、ＢＭＰ−２などの「分化」因子との協力関係が心筋細 胞の分化誘導に必要と思われる。この解釈において、分離心臓前中胚葉がＦＧＦ 単独で培養中に分化できるというこの観察は、これら細胞が胚から体外培養され る以前にＢＰ−２によってシグナルを受けていたことを示唆する。アクチビンと ＦＧＦとの間の協力関係がアフリカツメガエルで中胚葉の誘導を制御することを 示された（アール．コルネルとキメルマン ディー．(Cornell，R．and D．Kime lman)、Development 120:453-462，1994; シー．ラボネとホワイトマン エム. （LaBonne C．and M．Whitman）、Development 120:463-472，1994）、従来の結 果が示すところによると、アクチビンは非心臓前中胚葉の分化を支持するＢＭＰ −２を代替できない。またＦＧＦ−４およびＢＭＰ−２はマウス肢芽の外胚葉頂 堤に発現し肢成長を、それぞれ促進および阻害するが（エル．ニスワンダーとマ ーチン ジー．アール.（Niswander L.and G．R．Martin）、Nature 361:68-71 ，1993）、ＢＭＰ−２の成長阻害効果はその分化機能の結果として考えることが できる。最後に、ＢＭＰが分化潜在能を有する可能性は最近、ＢＭＰ−４が筋節 を骨格ミオサイト系に特異化したことを実証したオー．ポールクイエらによって 報告された（Pourguie，O.，et al.，Cell 84:461-472，1995）。 ５．動物実験による予測結果 ウサギモデルを用いる継続中の実験で、骨形態形成タンパク質（ ＢＭＰ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の組み合わせが、それぞれの因子 単独ではいずれも逆であるが、実験的に誘導した一過性虚血の出現および再灌流 からの心臓防御を有意に増強させることが予想される。 理論的根拠：この実験の理論的根拠は以下の通りである。塩基性繊維芽細胞増 殖因子（ｂＦＧＦ；ＦＧＦ−２）は単独で、虚血および再灌流前に直ちに投与さ れた場合にラット分離心臓において機能回復を増進することが示された（アール ．アール．パドゥアら（Padua，R．R．et al.)、Mol. Cell Biochem. 143:129-1 35，1995）。この心臓防御効果は冠血管系に直接投与し、ラット心臓あたり１０ μｇのＦＧＦ−２投与で達成された。さらにイヌでは、ＦＧＦ−２処置は血行力 学の効果または新生血管を形成することなく再灌流後７日で、心筋梗塞の程度を 軽減することが最近示された。この心臓防御効果は再灌流前にＦＧＦ−２をイヌ 心臓あたり１０μｇ、歯冠内投与で達成された（エム．シー．ジー．ホリガンら （Horrigan，M.C.G.，et al.）、Circulation 94:1927-1933，1996）。 骨形成タンパク質１（ｈＯＰ−１）はＢＭＰに密接に関連するＴＧＦ−βスー パーファミリーのメンバーである。ｈＯＰ−１を再灌流前に動物あたり用量２０ μｇを静脈内投与すると、冠状動脈虚血および再灌流生体内ラットモデルにおい て、２４時間後に再灌流障害が軽減した（エー．エム．レファーら(Lefer，A．M ．et al.)、J. Mol ．Cell Cardiol. 24:585-493，1992）。 ＦＧＦ−４＋ＢＭＰ−２：ＦＧＦ−４またはＦＧＦ−２とＢＭＰ−２との組み 合わせが心臓系に運命づけられていない胎児性中胚葉細胞を、生体内で微視的な 心臓に類似な同調的に収縮する中空小胞 に誘導することが最近発見された。ＦＧＦ−４（またはＦＧＦ−２）単独、また はＢＭＰ−２単独では効果はなかった（ジェイ．ラウら、Developmental Biolog y 178:198-202，1996 ）。この結果から、ＢＭＰは胚において細胞を心臓遺伝子 系に補充するために機能し、ＦＧＦがこれら細胞を心臓分化の経路に沿って支持 することが予想される。胚における状況と異なり、成人心細胞は増殖も発育もし ない。その結果、心筋梗塞などの発作中に被った損傷は往々にして破局的な結果 を招く。成人心筋細胞が成長できず、再生できない理由は未知である。機能的に 有用な情況において、ＦＧＦおよびＢＭＰなどの増殖因子が利用できないことが 、成人心臓において細胞が再生できない主要な原因と予想される。 実験計画：一般的 心臓防御に関し、心臓バイパス手術、血管形成術などの随意的虚血および心臓 発作を患う患者にみられる状況である虚血または再灌流の作用に対して心機能を 維持する、または心筋を防御する際の、ＢＭＰ自体の役割を考察する研究は、単 独またはほかの増殖因子との関連のいずれにおいても、なされていない。ＢＭＰ −２およびＦＧＦ−２を組み合わせることによって、上記ＦＧＦ−２単独の心臓 防御効果が増大すると期待している。したがって、発明者の１人であるドクター ジョンベーカー研究室で定期的に用いられたプロトコルを使用して、虚血前好 気性心機能および虚血症に続く虚血後快復に関し、組み合わせ増殖因子での処置 の生理学的利点を確定することにする。実験モデルには、１サイクルの虚血およ び再灌流下においた分離ウサギ心臓を用いた。虚血／再灌流発作からの心機能の 快復は組み合わせた増殖因子処置が有効であることを決定するため の終点（エンドポイント）として用いられよう。この心臓防御効果の論拠は再生 した心筋増殖および分化が起きるかどうかの面から、ドクター ラウの研究室で ルーチンである技術を用い、細胞および分子的レベルで決定されよう。 実験計画：特定的 実験は４グループを使用し無作為に実施して、ＢＭＰ−２がＦＧＦ−２の心臓 防御効果を相乗作用的に改善するかどうかを測定する。実験の４グループを以下 に示す。 第１グループ：食塩賦形剤対照（増殖因子なし）−投与経路は静脈 第２グループ：ＢＰＭ−２のみ（８０μｇ／ｋｇ、静脈） 第３グループ：ＦＧＦ−２のみ（４０μｇ／ｋｇ、静脈） 第４グループ：ＢＭＰ−２（８０μｇ／ｋｇ、静脈）とＦＧＦ−２ （４０μｇ／ｋｇ、静脈）の組み合わせ。 用量および意図した投与経路はＦＧＦおよびＢＭＰ関連増殖因子（１〜３）の 心臓防御効果を実証した公表された報告書によった。各グループは７〜１０日齢 の未成熟ウサギ８匹よりなる。この新生児発育期まで、心臓は完全に機能的であ り、最近に正常な増殖を終えた心筋細胞からなる。すべてのグループにつき、心 臓の切除および調査の２４時間前に処置を開始し、薬剤が心臓に（仮定上の）予 防効果を及ぼす時間を検討した。処置の２４時間後に大動脈にカニューレを挿入 し、分離心臓の灌流を一定圧ランゲンドルフ法による、３９℃の重炭酸塩バッフ ァーで直ちに開始する。食塩充満ラテックスバルーンを発生圧測定のために左右 心室に設置する。心臓を平衡化期間の３０分間灌流し、その間二心室機能および 冠流速を定常状態下で記録する。心臓を３０分間３９℃で完全なノーフロー虚血 下におく。虚血期間の後、心機能を再度定常状態下で測定する。こうして、それ ぞれの心臓は自己制御して働く。心機能の快復は虚血前値のパーセントで表す。 結果は増殖因子処理グループ（第２〜４グループ）内の虚血前および虚血後の機 能を、対照グループ（第１グループ）における快復と比較して評価する。産業上の利用可能性 本発明は非心臓組織に心臓発生を誘導できる治療組成物である。 組成物はトランスフォーミング増殖因子β−タンパク質と繊維芽細胞増殖因子の 精製混合物である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 バロン，マシユー アール. アメリカ合衆国 53226 ウイスコンシン ウオーワトーサ ウエスト ヴリート ストリート 12106 (72)発明者 ブログリー，マイケル エー. アメリカ合衆国 53219 ウイスコンシン ミルウオーキー ＃14 ウエスト アー サー コート 4416 (72)発明者 ツー，キシアオレイ アメリカ合衆国 53213 ウイスコンシン ミルウオーキー ノース 76ス ストリ ート ＃１ 170 (72)発明者 ベーカー，ジヨン イー. アメリカ合衆国 53213 ウイスコンシン ウオーワトーサ ウエスト ガーフイー ルド アベニユー 7126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．トランスフォーミング増殖因子−βタンパク質および繊維芽細胞増殖因子 の精製混合物を含む心臓遺伝子組成物。 ２．前記トランスフォーミング増殖因子−βタンパク質がＢＭＰ−２、ＢＭＰ −３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ −９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３およびＢＭＰ −１５からなる群から選択された請求項１記載の組成物。 ３．前記トランスフォーミング増殖因子−βが７−システイン構造ファミリー のメンバーからなる群から選択された請求項２記載の組成物。 ４．前記トランスフォーミング増殖因子−βタンパク質がＢＭＰ−２である請 求項３記載の組成物。 ５．前記繊維芽細胞増殖因子がＦＧＦ１〜１５からなる群から選択された請求 項１記載の組成物。 ６．前記繊維芽細胞増殖因子がＦＧＦ−４である請求項１記載の組成物。 ７．前記トランスフォーミング増殖因子−βタンパク質と繊維芽細胞増殖因子 の比率が１：１のモル比である請求項１記載の組成物。 ８．前記組成物がマトリックス材を付加的に含む請求項１記載の組成物。 ９．マトリックス材がコラーゲンである請求項１記載の組成物。 １０．非心臓系の細胞に心臓発生を誘導する方法において、 ａ）細胞をトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質および繊維芽 細胞増殖因子の精製混合物にさらす段階と、 ｂ）サルコメアα−アクチンを発現する律動的な同調的収縮性細胞の発 生を観察する段階とを含む方法。 １１．前記トランスフォーミング増殖因子−βタンパク質と繊維芽細胞増殖因 子との混合がタンパク質混合物を前記細胞に外因的に適用することによって達成 される請求項１０記載の方法。 １２．トランスフォーミング増殖因子−βタンパク質および繊維芽細胞増殖因 子をエンコードする遺伝構成物で前記細胞を形質転換することによって前記のさ らしを行う請求項１０記載の方法。 １３．前記のさらしが生体内で行われる請求項１０に記載の方法。 １４．前記のさらしが試験管内で行われる請求項１０に記載の方法。