CN102712920A - 缺氧调节的条件沉默性aav表达血管生成诱导因子 - Google Patents

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Abstract

由定向血管发生/动脉发生治疗缺氧相关疾病的方法和组合物。在缺氧条件下表达治疗分子的条件沉默载体避免了混乱的血管形成，并且使得新血管向受伤组织有序生长。

Description

缺氧调节的条件沉默性AAV表达血管生成诱导因子
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年10月39日提交的美国临时申请第61/256,381号的优先权，其通过引用全文纳入本文。
发明领域
本发明的实施方式包括治疗组织缺氧和相关情况。具体地，通过表达所需因子的条件沉默载体表达在患者中诱导定向治疗性血管生成。
背景技术
治疗血管生成是开发用于治疗缺血的方法，其中在缺血组织中响应由基因或者细胞递送的外源血管生成因子而诱导新血管生长。主要的临床目标是由冠状和外周动脉疾病分别造成的心肌和重症下肢缺血。基因和前体干细胞的有说服力的临床结果产生一系列的II/III期临床试验。这些只是适度成功，显示了程序的安全性，但疗效最小。
发明内容
此总结提供本发明的概要以简要说明发明的性质和物质。应当理解的是，它不会用于解释或限制所附权利要求的范围或意义。
优选实施方式包括促进选择性定向动脉发生的载体，其在一些实施方式中由缺氧调节的条件沉默性AAV载体来专门驱动。这些组合物由强烈组织缺氧调控的NRSE和TOAD/FROG沉默元件组合的生长因子表达来提供更快、更高效血管重生和组织恢复。提供了方法，其中，生长因子基因表达的条件沉默提供以条件沉默程度决定的定向动脉发生。这产生缺血组织的高效血管重生，其也由条件沉默的程度来决定。
在其他优选实施方式中，包含FROG/TOAD和NRSE沉默子的载体赋予组织缺氧的强烈调控和由三个沉默元件(NRSE/FROG/TOAD)组合影响的最大反应的更迅速血管重生。这三个异源沉默元件的意外属性可能归因于相较单独NRSE相的多种不同细胞基因表达的沉默，其中沉默限于非神经细胞，并且在干细胞中功能弱或者没有。
在其他优选实施方式中，使用基因调控元件组合在包含永久递送基因治疗载体的骨骼肌和心肌缺血组织中选择性表达促血管生成基因，从而基因的调控表达促进引起肌肉再灌注的稳定成熟血管的生长。
在另一优选实施方式中，调控系统递送基因到靶细胞，包括骨骼和心脏肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、干细胞等。
其他方面在下文描述。
附图简要说明
图1A-1E：组织缺氧调控的转基因表达。图1A的示意图显示基因表达的条件沉默由NRSE组蛋白去乙酰化酶活性和HIF-1组蛋白乙酰化酶活性间的相互作用操作。图1B-1D显示条件沉默的基因调控。图1B-1C：心肌细胞，HeLa细胞或者C2-C12骨骼肌细胞用所示AAV穿梭载体和内部对照Renilla荧光素酶共同转染。转染后24小时，培养物在有氧或缺氧(0.5％-1％氧气)空气下再孵育24小时，并收集以检测荧光素酶表达。图1D：C2C12肌细胞用PGK或CS-PGK引导的AAV-GFP转染，并如所示暴露于空气或缺氧情况下。图1E：C2C12肌细胞用PGK或CS-PGK引导的AAV-VEGF转染，并暴露于空气或缺氧情况下，分泌的VEGF通过ELISA在24小时的培养基中检测。
图2A的示意图显示如图2C所示的FROG，TOAD，和FROG+TOAD元件的序列。IRE是炎症反应元件(NFκ-B)。构建体的其他成分与图1A-1E中描述的NRSE构建体相同。图2B：C2C12细胞用由包含FROG/TOAD元件+HRE的PGK启动子引导的荧光素酶表达质粒转染。如图1A-1E所述，细胞暴露于有氧或缺氧情况下孵育48小时。
图3A-3C显示CS-AAV对比腺病毒的后肢缺血再灌注。图3A：在小鼠后肢中诱导局部缺血并且在手术后由肌肉注射递送指定载体。对所述每组12只小鼠肢体进行多至12周的每周多普勒(Doppler)扫描，然后每月扫描。每个时间点杀死小鼠，肌肉用RT-PCR来定量hVEGF或固定和石蜡包埋以用于免疫染色。正方形(上部曲线)AAV-CS-VEGF：圆和三角形(下部曲线)腺病毒(Ad)低和高剂量。Ad-VEGF自动切除的所有肢体；黄色箭头指示6月康复的AAV肢体的流。图3B：在指定次数(n＝3)肢体肌肉中用RT-PCR定量VEGF表达。图3C：对比AAV-CS-VEGF(绿色)，AAV-PGK-VEGF(红色)和PBS(低曲线)的后肢再灌注。方法如图3A所示；两个AAV载体都恢复流，但是流在CS-VEGF上恢复更快。
图4显示使用平滑肌肌动蛋白抗体对石蜡包埋组织部分的免疫染色，揭示12周后，AAV9-CS-VEGF处理相较AAV9-PGK-VEGF载体在后肢有显著更大的血管(AAV9-PGK-VEGF通过组织缺氧经内源HRE调控，但是没有条件沉默，调控降低)。
图5A-5D显示体内条件沉默的基因调控。一日龄小鼠(图5A)两眼间注射AAV9-PGK-VEGF或AAV9-CS-VEGF(图5B)。在图5A，4周龄小鼠的一个后肢由结扎和解剖股动脉造成缺血，组织从缺血的和非缺血对侧肢体收集，并且用RT-PCR测量VEGF。图5D中，大鼠足垫用表达PGK-VEGF或者CS-PGK-VEGF的质粒载体注射，4周后检查新血管的生长。黑色箭头指示递送DNA时标记感兴趣区域的缝合位置。白色箭头指示响应PGK而不是CS载体反应生成的新血管。
图6显示早期血管发生中的VEGF∶HEY2比例的图。缺血后肢用低调控(PGK)或者条件沉默(CS)启动子驱动的AAV9-VEGF处理。人体VEGF和小鼠HEY2表达用指定时间点(n＝2)收集的肌肉的RT-PCR测量。此阶段内PGK处理的肌肉的平均VEGF表达比CS载体高6.2倍，指示基础的和诱导表达在CS载体中更低。
图7A-7C显示在Ad或者AAV9-CS-VEGF处理中血管的定位和密度。图7A显示后肢肌肉部分的DiI染色和双光子共焦荧光显微镜图片。有X的红色圆圈指示用来结扎股骨动脉和标记缺血区域的缝合位置。在12周Ad处理组中，毛细管优选向股骨动脉平面垂直生长，如绿色双箭头指示。黄色双箭头描述AAV-CS-VEGF组中缺血区域的大动脉。图7B显示SMA抗体和Dapi染色的动脉区域。血管面积用Area Trace软件对每个情况下＞50SMA阳性血管来定量。图7C：毛细管密度用Volocity Image软件对DiI染色血管共焦部分定量。
图8A-8C显示股骨束的定向动脉发生。图8A显示用指定处理缺血后在指定时间取得的代表性DiI染色肌肉部分。每一个时间点代表每组至少3个小鼠。白十字指示装入股骨切除区域的股骨缝合位置；黄色箭头指示股骨束的位置(切除股骨动脉但是保留股骨神经)。在1年AAV-CS-VEGF处理但不是Ad-CMV-VEGF，AAV-PGK-VEGF或者AAV-CMV处理(AAV-CMV未显示)的股骨束内可见与正常股骨动脉尺寸相似的大动脉。图8B和8C显示血流，局部缺血和后肢血管生长(图8B)和皮瓣(图8C)模型的关系。图8B：左图显示再灌注后肢的多普勒扫描，相连的黑色叉号标记切除股骨位置，右图显示位于股骨束的重生的动脉。图8C：左图显示在缺血恢复中有基因治疗载体递送到缺血区域的皮瓣多普勒扫描；右图显示沿着该模型中最大缺血区域的组织缺氧梯度向下生长的平行DiI染色血管。
图9A-9D显示条件沉默VEGF的治疗性动脉发生。图9A和9D：小鼠后肢用108AAV-CS-VEGF或AAV-unreg/PGK-VEGF基因组注射，并且16周后收集肌肉。肌肉部分用抗平滑肌肌动蛋白(以确定细动脉和动脉)和Dapi(图9A)染色，定量平均血管体积(图9B)。简单说，每4个玻片的10个最大血管面积各用追踪工具Axiovision软件来测量。每一个肢体的血管面积用至少3个大腿区域横截面不同部分来计数，以得到每个动物的平均值(p＜0.01)。图9C和9D：使用Volocity软件在共焦图像上定量血管密度。血管体积数据用每个视场的均一感兴趣区域获得。采用3只不同小鼠的10个视场评价各处理的平均血管密度(总DiI染色血管的体积)(图9B：p＜0.05)。血管密度通过计数CD31+染色部分确定。
图10A-10C显示用FROG/TOAD/NRSE组合调控的条件沉默的最佳组织康复和血管再生。图10A是一个最优载体的实施方式的示意图。图10B显示局部缺血和基因治疗后第14天用AAV载体的脚趾康复的对比。AAV-NRSE-VEGF处理肢体，12个中有3个坏死的脚趾；AAV-CMV-VEGF处理肢体在2周内失去所有脚趾，并显示高级自身断离；FROG/TOAD/NRSE-VEGF处理的肢体没有坏死，和100％脚趾和肢体康复。图10C：7天多普勒分析显示在AAV-NRSE-VEGF处理的缺血肢体中的最小血流，AAV-CMV-VEGF处理的肢体中没有流动且开始自身断离，但是AAV-FROG/TOAD/NRSE-VEGF处理的肢体上有明显恢复的流动(p＜0.05；n＝3)。方法：在小鼠后肢中诱导局部缺血并且手术后i.m.递送指定载体。每天对脚趾进行检查和拍照；每周两次执行多普勒扫描。AAV-CMV-VEGF处理的所有肢体在1月内自身断离；其他AAV组中没有观察到自身断离。图10C的箭头指示缺血的肢体。
发明详述
本发明的几个方面在下面根据实施例应用描述以说明。应理解，提出大量的具体细节、关系和方式来提供对本发明的充分理解。然而，相关领域的普通技术人员容易认识到，本发明能在没有一个或多个具体细节或有其他方法时实施。本发明不受所述行为或事件顺序的限制，因为一些行为可能以不同的顺序和/或同时与其他行为或事件发生。另外，不是所有说明的行为或事件对执行本发明所述方法都是必须的。
相似的，本文公开的所有基因、基因名称和基因产物旨在对应于本文公开的组合物和方法可应用的任何物种的同源物。因此，术语包括但不限于人和小鼠的基因和基因产物。应理解，当公开一个具体物种的基因或基因产物时，该公开仅用于示例而不应解释为限制，除非上下文明确指出。因此，例如，对于本文公开的基因，在一些实施方式中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列，旨在包括其他动物的同源的和/或垂直同源基因和基因产物，所述动物包括但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖类、爬行类和鸟类。在优选实施方式中，所述基因或核酸序列是人类的。
定义
本文所用的术语仅仅用来描述具体的实施方式，而不是用于限制本发明。如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。而且，在发明详述和/或权利要求中使用术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“带有”或它们的变体时，这些术语旨在以类似术语“包含”的方式具有包括性。
术语“约”或“大约”表示本领域普遍技术人员所测定的特定数值的可接受误差范围内，这部分取决于该数值的测量或测定方式，即测量体系的界限。例如，“约”能表示该领域实践中在1之内或大于1的标准偏差。或者，“约”能表示多至20％的范围，优选多至10％，更优选多至5％，并在给定值中更优选多至1％。或者，在特定生物系统或过程中，术语能表示数量级内，优选数值的5倍内，更优选2倍内。特定值在应用和权利要求中描述时，除非另有说明，假定术语“约”表示特定值的可接受误差范围内。
局部缺血定义为对特定器官和组织的供血不足。持续组织缺氧可以造成受影响器官或者组织的损伤。供血减少的后果是器官或组织的氧供应不充足(组织缺氧)。“缺氧症”指器官或组织中几乎完全没有氧，其若延长会导致器官或组织死亡。
“缺氧情况”定义为特定器官或组织接受不充足氧供给的情况。
“厌氧情况”指特定器官或组织的供氧被切断的情况。
“再灌注”指组织中局部缺血期后血流的恢复。
“局部缺血损伤”指局部缺血和/或局部缺血然后再灌注阶段对器官或组织造成的细胞和/或分子损伤。
本文使用的术语“损伤”广义理解为包括对细胞、组织或者器官的任何影响，所述影响造成对该细胞，组织或者器官不需要的结果。一些实施方式中，损伤来自可观察或另外可定义的损害，但是鉴定损伤来源的能力不受限制。因此，在一些实施方式中，损伤包括局部缺血损伤。然而，在一些实施方式中，损伤包括之后细胞、组织和/或器官显示受损功能的任何损伤，其次于一个或者多个原因，能否鉴定，不同于局部缺血损伤。
“促血管生成”指刺激直径小于100μM的微脉管、或更大和更多的肌肉血管的新血管生长。
本文使用的术语“异常血管形成”或者“异常血管发生”或者“无序生长”将理解为包括异常的新血管形成，包含新血管、更大血管，更多分支血管(肠套叠)的形成，以及任何和所有导致患病组织或者位点的血液携带容量不适当或者增加的的机理。
如本文所用，“定向生长”指血管的生长采用从一个需要点到一个需要点的受控方向。例如，组织缺氧通过产生提供EPC归巢和推测内皮细胞向梯度生长的生长因子(VEGF，SDF-1)的梯度，确定软组织局部缺血模型中的血管定向生长。本文数据也显示定向血管生长和可能涉及产生的切应力，因为血管网可连接切除的股骨动脉上游和下游区域并且血液恢复从臀部流向踝部。
本文所用术语“安全和有效量”或者“治疗量”指足以产生所需的治疗反应而不产生过度不良副作用(如毒性、刺激或变态反应)的某组分用量，用于本发明方时该用量应与合理的效益/风险比相称。“治疗有效量”指的是有效产生期望治疗反应的本发明组合物的含量。具体的安全和有效量或治疗有效量取决于多种因素而变化，例如所治疗的具体病症、患者身体状况、治疗的哺乳动物或动物类型、治疗持续时间、同时进行的治疗(如果有)的性质和采用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构。
本文所用术语“动物”或“患者”旨在包括，例如，人、绵羊、麇鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形纲动物。
“哺乳动物”涵盖通常在医疗护理下的恒温哺乳动物(例如，人和驯养动物)。示例包括猫科，犬科，马科，牛科动物和人类，以及仅仅是人。
“治疗”或“处理”涵盖哺乳动物疾病状态的治疗，包括：(a)预防哺乳动物发生疾病状态，具体是当所述哺乳动物易患该疾病状态但尚未诊断患有该疾病时；(b)抑制疾病状态，即阻滞其发展；和/或(c)缓解疾病状态，即引起该疾病状态消退直到达到所需终点。治疗也包括疾病症状的改善(即减轻疼痛或不适)，其中，这种改善可直接或不直接影响疾病(例如，原因，转移，表达，体内量等)。
本文所用术语“细胞渗透性DNA或RNA载体”是使用或者不使用转染试剂进入细胞的载体。例如，很多病毒序列编码细胞结合糖蛋白，或者具有用于胞内靶标的区域。其他示例包括可使载体细胞间有效转化的核酸序列。
疾病或紊乱的治疗
潜伏期的基因和细胞治疗模型专门关注血管发生，因此有术语“治疗性血管发生”。这些研究有两个主要缺陷(1)不充分运输载体过早结束基因表达，(2)递送未调控的、组成型活性基因不能提供新血管生长的定向信号。这些缺陷被过短的治疗时程和局限在毛细管密度单向定量的血管生长分析所大量掩盖。
在优选实施方式中，提高体内定向血管发生的方法包括给予患者含有腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中促血管生成基因表达由启动子例如磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，与组织缺氧反应元件(HRE)和沉默元件的组合盒联合调控，所述盒使得在有氧情况下基因表达沉默而缺血下表达激活。该载体在美国专利号5,834,306中描述，其通过引用全文纳入本文。
在优选实施方式中，给予在由组织缺氧调控启动子驱动的半渗透、组织特异性(例如，肌肉趋向性)AAV9载体中的促血管生成因子基因(例如，血管内皮细胞生长因子(VEGF))，可诱导或提高定向血管发生，继而动脉形成并用稳定组织重灌注再建功能性毛细管网络。促血管发生因子示例包括以下至少一种：内皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)，肝细胞生长因子，多育曲菌素，血管营养素，促血管生成素，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β(TGF-β)，或红细胞生成素(EPO)。
其他能从条件沉默载体表达的因子示例包括：例如c-kit配体/干细胞因子，胰岛素，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，神经生长因子(NGF)，骨形态发生蛋白(BMP)，白血病抑制因子(LIF)，flt-1配体，脑源性神经营养因子(BDNF)，白细胞介素，例如但不限于白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)和白细胞介素13(IL-13)，基质细胞衍生因子(SDF)，干细胞因子(SCF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。
如本文所用，“条件沉默”指“基因沉默元件”的使用，包括但不限于NRSE、FROG、TOAD和条件诱导型元件，所述元件包括但不限于缺氧反应元件(HRE)、炎症反应元件(IRE)和切应力激活元件(SSAE)。
在优选实施方式中，条件沉默子包括NRSE，FROG，TOAD，FROG/TOAD，NRSE/FROG/TOAD，FROG/TOAD或其组合。示例包括：
TOAD/PGK(正义)
5’-CCGGCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGACCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGACCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGAC-3’(SEQ ID NO：1)
(反义)
3’-GAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGGAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGGAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGGGCC-5’(SEQ ID NO：2)
FROG/PGK(正义)
5’-CCGGGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGACGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGACGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGAC-3’(SEQID NO：3).
(反义)
3’-CCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGCCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGCCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGGGCC-5’(SEQ ID NO：4).
FROG-TOAD/PGK(正义)
5’-CCGGCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGACGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGACCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGACGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGAC-3’(SEQ ID NO：5).
(反义)
3’-GAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGCCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGGAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGCCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGGGCC-5’(SEQ ID NO：6).
在一个优选实施方式中，条件沉默子包括至少一个SEQ ID NO：1-6所示核苷酸序列，其衍生物、变体、突变体或者同源体。
在另一个优选实施方式中，条件沉默子包括NRSE，FROG，TOAD，FROG/TOAD，或其组合。
已发现用于实施方式所述多种载体的条件沉默子优于任何现有载体。例如，(1)AAV9-PGK-VEGF不提高定向血管生长，尽管受缺氧调控-由于较高(未沉默)基本常氧表达-效果在AAV9-CMV-VEGF中更差；(2)AAV9-CMV-VEGF造成血管随机生长并且没有保肢，100％自身断离-比没有治疗还差；(3)FROG/TOAD的插入产生更紧的调控，提供更快血管发生和100％保脚趾率的最佳治疗，尽管基因表达相较AAV9-CS(NRSE)-VEGF更低(见例如，图10A-10C)。不希望受理论约束，这可能是由于更好的VEGF∶Notch比例。FROG/TOAD包含物和条件沉默的等级反应是意料之外的和令人惊讶的。例如，所得结果涉及脚趾康复，用FROG/TOAD不能预测更快的多普勒恢复。
在另一个优选实施方式中，条件诱导型元件包括：缺氧反应元件(HRE)，炎症反应元件(IRE)，切应力激活元件(SSAE)，金属反应元件(MRE)或其组合。
在另一个优选实施方式中，条件沉默载体有条件表达含有以下至少一个的因子：内皮生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)，肝细胞生长因子，多育曲菌素，血管营养素，促血管生成素，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β(TGF-β)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，神经生长因子(NGF)，基质细胞衍生因子(SDF)，干细胞因子(SCF)，或红细胞生成素(EPO)。
在另一个优选实施方式中，条件沉默载体包括：腺相关病毒(AAV)载体，促血管发生因子和/或生长因子和/或细胞迁移因子，启动子，缺氧反应原件(HRE)和沉默元件的组合盒。
在一个优选实施方式中，载体基因表达在有氧条件下被抑制(条件沉默)并且在局部缺血条件下被激活。
在一个优选实施方式中，治疗缺氧相关的疾病或紊乱的方法包括促血管生长因子的转移，例如，VEGF基因，使用半渗透基因递送载体，例如腺相关病毒(AAV)载体或者慢病毒载体，其中VEGF表达由启动子如磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，与组织缺氧反应元件(HRE)和沉默元件的结合盒联合调控，所述盒使得在有氧情况下基因表达沉默而缺血下表达激活(“条件沉默”)。
在优选实施方式中，将表达促血管发生因子和/或其他因子的条件沉默载体给予有发展以下疾病风险或患有疾病的患者：肌肉缺血，包括外周和心肌缺血，后肢缺血，视网膜缺血，癌症，心脏病，中风，黄斑变性，糖尿病视网膜病，关节炎，移植中增加头发移植的秃顶，等等。
在另一个优选实施方式中，产生新血管受控定向生长的方法包括：给予所需患者表达促血管生成和/或其他因子的条件沉默载体，其中，所述载体在靶组织生成治疗有效控制量的促血管生成生长因子。生成的受控量促血管生成因子防止血管无序生长到受伤组织中。
本发明的条件沉默载体有益地用于在多种不同医疗条件下治疗受损细胞或组织。无限制损伤列表包括结构组织损伤，例如软骨和半月板损伤，包括与中风相关的缺血损伤，心肌梗塞，心脏病发作，脊髓损伤，供体器官损伤，器官移植接受者，重灌注，血管支架植入，短暂性脑缺血，慢性和急性肠系膜缺血，跛行，重症下肢缺血，癌症，骨髓损伤和肾脏损伤。使用本发明组合物治疗或预防的疾病包括：糖尿病，癌症，心血管疾病或紊乱，自身免疫，神经疾病或紊乱，炎症等。
在另一个实施方式中，本发明的条件沉默载体可以在损伤和缺血损伤之前、之中或之后给予对象。缺血损伤一般由向组织供血的血管闭塞事件导致。当血管开放或者由于治疗干涉重新开放时，由于伤疤形成细胞和释放破坏性酶(重灌注损伤)的炎性细胞的流入，常造成对组织的进一步损伤。
表达促血管生成因子和/或其他因子的条件沉默载体可以给予中风、心脏病发作或者脊髓损伤患者，以利于降低缺血事件期后细胞和组织损失的严重性。该组合物可以在任何医疗过程之前、之中或之后给药，该过程在血管再生过程中，例如心肌缺血后放入支架，冠状动脉旁路移植，和心脏、肝脏、肺、胰腺和肾脏的器官移植，有重灌注的风险。在各病例中，组合物优选在血管再生位置的远端或者近端静脉内给药，并且引起血管定向生长。
缺血和重灌注的反复发作被认为是造成长期伤口的形成和治愈失败的因素，例如压疮和糖尿病足溃疡。因此，长期伤口可通过给予本发明组合物来治疗。
接受肠内手术的患者可以用本发明组合物在肠内恢复血流之前/同时和/或后进行治疗，以排除或降低重灌注损伤。
本发明组合物也用于进行移植准备的调节器官和组织。在一个实施方式中，可将供体与本发明组织修复组合物在移植之前、之中和/或之后接触，从而损伤在移植后的阶段降低，所述损伤包括但不限于重灌注损伤。移植接受者也可以用该组合物在移植之前、之中和/或之后治疗。
本发明的方法也用于防止由于多种组织中缺血和/或随后重灌注造成的组织损伤和/或死亡。一个示例性应用是心脏病发作后的复发性心肌缺血造成的损伤降低。心脏病发作患者心脏组织的治疗基因表达可以降低任何后续缺血发作中组织损伤的风险。
相似的，诊断有短暂大脑缺血、血凝块或其他中风风险因素的对象可受益于缺血诱导型脑特异性构建的应用。诊断为急性或慢性肾脏衰竭的患者的肾脏进一步缺血损伤的风险加大。这些对象可受益于肾脏特异性启动子控制下的治疗基因，其表达由缺血条件增强。诊断为有缺血“风险”的多种其他组织可以类似地加以保护，如同本领域技术人员从本说明书益处中所理解的。
在其他优选实施方式中，表达促血管生成和/或其他因子的条件沉默载体可以单独或者作为治疗方案的一部分联合使用。这些特别适用于在急性心肌梗塞或其他缺血损伤后降低缺血损伤的药物包括但不限于血管扩张剂，例如腺苷酸，潘生丁和西洛他唑；一氧化氮供体；前列腺素和其衍生物；抗氧化剂，包括羟基黄酮和二羟基；膜稳定剂；抗TNF组合物；抗感染药，包括地塞米松、阿司匹林、吡非尼酮、甲氯灭酸和曲尼司特；高血压药，包括β阻断剂；ACE抑制剂和钙离子通道阻断剂；抗代谢药，例如2-CdA，血管活性物质，包括肠血管活性肽(VIP)；胰岛素；蛋白质激酶；反义寡核苷酸，包括resten-NG；免疫抑制剂，包括西罗莫司、依维莫司、他克莫司、依托泊苷、环孢菌素例如环孢菌素A和米托蒽醌；抗凝血酶；抗血小板剂，包括替罗非班、埃替非巴肽和阿昔单抗；心脏保护剂，包括垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)，apoA-I milano，氨氯地平，尼可地尔，cilostaxone和噻吩并吡啶；抗白血球剂；环氧酶抑制剂，包括COX-1和COX-2抑制剂；增加酵解代谢的肽酶(peptidose)抑制剂，包括omnipatrilat；钙增敏剂，包括左西孟旦，semidan和匹莫苯丹。蛋白质或肽药物可以是人、非人、重组或者合成的，可以是全长天然形式或其活性片段。
在一个实施方式中，适合于治疗缺血损伤的条件沉默载体在心肌梗塞或其他急性缺血综合病症后递送到重新开放的闭塞位点或其附近。在前面闭塞位点或其附近递送载体组合物使得药物可通过血流下游递送到重灌注组织。载体组合物可以通过在上述支架开口处含有药物的支架递送。载体组合物也可以通过药物包埋支架、灌输、微球、导管、线圈或者其他局部递送方式传递。例如，微球、线圈、脂质体或其他小药物运载体可以用导管或药物递送支架局部递送到上述闭塞位点或其附近。这些小药物运载体释放出来，通过下游进入心肌，在该处它们可以自身植入以直接递送药物到缺血组织。
组合物递送支架可以置于另一前面放置的支架内或其附近。支架移植位点可以在闭塞位点或其附近。植入位点也可以选择在斑块破裂位点或血管收缩位点或其附近。
在另一个实施方式中，定向控制血管生长载体的局部递送与另一治疗试剂例如抗缺血剂的全身递送联用。或者，局部递送载体和试剂。在另一些实施方式中，全身性递送载体和试剂。
细胞组合物
在另一优选实施方式中，将表达促血管生长因子的条件沉默载体给予细胞，例如成肌细胞，肌细胞，卫星成肌细胞，肌肉干细胞，心脏干细胞，间充质干细胞，造血干细胞，内皮祖干细胞，成纤维细胞，平滑肌细胞，干细胞(骨髓，外周血液，脂肪细胞，多种组织)。细胞可获自患者或供体，纯化和离体培养。一旦扩大，细胞可以转染、感染有表达促血管生成因子和/或其他因子(例如基质细胞衍生因子)的条件沉默载体[如病毒载体或质粒DNA]或与之混合，并且给予患者。例如，如果患者出现心肌缺血，细胞通过例如心脏内注射来给予患者。因此，缺血损伤提供能整合和/或分化成心肌细胞、血管等的细胞，促血管生成因子诱导或提高损伤组织的血管形成。
如本文所用，当细胞从其天然环境存在的所有其他细胞中分离出来时，以及当混合细胞中该细胞比例高于其天然环境时，细胞以“纯化形式”存在。另一种方面，当讨论的细胞群代表富集的感兴趣细胞群时，甚至如果其他细胞和细胞类型也存在于所述富集群体时，认为细胞是“纯化形式”。在一些实施方式中，当细胞包括至少约10％的混合细胞群时，认为细胞是纯化形式，在一些实施方式中，为至少约20％的混合细胞群，在一些实施方式中，为至少约25％的混合细胞群，在一些实施方式中，为至少约30％的混合细胞群，在一些实施方式中，为至少约40％的混合细胞群，在一些实施方式中，为至少约50％的混合细胞总体群，在一些实施方式中，为至少约60％的混合细胞群，在一些实施方式中，为至少约70％的混合细胞群，在一些实施方式中，为至少约75％的混合细胞群，在一些实施方式中，为至少约80％的混合细胞群，在一些实施方式中，为至少约90％的混合细胞群，在一些实施方式中，为至少约95％的混合细胞群，在一些实施方式中，为约100％的混合细胞群，前提是所述细胞在纯化前群体中，包括更大百分比的“纯化”群中的总细胞群。在这个方面，术语“纯化”和“富集”可以被认为是同义词。
如本文所用，短语“骨髓衍生粘附干细胞亚群”，“Sca-1+/CD45-/ckit-/CD90+/CD105-干细胞”，“CD34+/CD45-/ckit-/CD90+/CD105-干细胞”，“Sca-1+/CD45-/ckit-/CD90+/CD105-细胞(BMMSC)”，“Sca-1+/CD45-/c-kit-/Thy1+/CD105-和间充质干细胞亚群”可以互换使用，并且指用本文所述方法从混合骨髓衍生粘附干细胞分离的骨髓细胞亚群。在一些实施方式中，骨髓衍生粘附干细胞亚群通过从骨髓衍生粘附干细胞混合群中分离得到，所述细胞亚群是Sca-1+或CD34+以及CD45-/c-kit-/Thy1+/CD105-，取决于骨髓衍生粘附干细胞来源。例如，如果骨髓衍生粘附干细胞来源是小鼠，所述细胞亚群包括Sac-1+/CD45-/c-kit-/Thy1+/CD105-细胞。如果骨髓衍生粘附干细胞来源是人体，所述细胞分组包括CD34+/CD45-/c-kit-/Thy1+/CD105-细胞。
所述亚群分离可以用任何方法进行，包括附于塑料培养皿，然后在选择培养基中培养或者，和/，能基于表达或者不表达一个或多个CD133、CD45、CD34、CD31、Sca-1、c-kit、Thy1和CD105标记来分离细胞的方法，包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)。
根据本发明使用的干细胞以优选顺序是自体同源，同种异体或异种异体，并且选择可以很大程度取决于治疗需要的紧迫性。呈现立即危及生命病况的患者可以用心肺机维持，同时培养充足量的自体同源干细胞或最初治疗可以用自体同源以外的干细胞提供。
本发明的细胞治疗可通过数种给药途径提供，包括下文所述。首先，当干细胞采用可注射的液体悬浮液制品形式或者以可注射液体形式并在损伤心肌位点形成半固体的生物相容性培养基时，可以使用避免开腔手术过程的心脏内肌肉注射。只要针腔或口径有足够的直径(即30标准尺寸或更大)，切应力不会损伤干细胞，则可以使用常规心脏内注射器或者可控制的关节镜递送设备。可注射的液体悬浮干细胞制品也可以静脉内给予，通过持续滴注或者大丸药。期间，开腔手术过程包括对心脏直接物理进入，上述所有形式的干细胞递送制品皆可选。
剂量范围的代表性示例是包括约10-40×106细胞/ml的约20-50μl可注射悬浮液。无论载体培养基是液体还是固体，每单位体积细胞的浓度基本保持在同一范围内。当在开腔过程中使用固体、“贴片”类型应用时，递送的干细胞量往往更大，但是后续注射治疗方式如上所述。然而，治疗的频率和持续时间取决于组织受累的程度(百分比)而变化，如已有描述(例如5-40％左心室质量)。
如果有5-10％范围的组织受累，有可能只用一次给予含一百万个细胞的20-50μl注射制品来治疗。注射培养基可以是任何药物学可接受的等渗液体。示例包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，培养基例如DMEM(优选不含血清)，生理盐水，或含5％葡萄糖的水。
如果更多为约20％组织受累严重水平范围，可考虑多次20-50μl注射(10-40×106细胞/ml)。后续治疗可以使用其他剂量。
在很严重的病例中，即约40％组织受累严重水平范围，明确延长持续时间的多个相等剂量，用长期的(多至数个月)恢复期维持剂量。
在另一个实施方式中，分离的和培养扩增的细胞能用于植入多种假体装置。例如，使用填有经培养扩增人细胞的多孔性陶瓷结构并移植此结构到广泛组织损伤区域。
在其他实施方式中，不同干细胞可与间充质干细胞一起用于治疗心脏和周围疾病和紊乱。优选干细胞是全能或者多能干细胞。
体内有很多未分化细胞。干细胞是未分化、未成熟细胞，能够自我更新(无限制分裂)和分化(特异化)。这些早期细胞在发育中的胚胎内丰富，但是，随着发育进展而数量下降。相反，成年生物体包括限于某些体室的有限干细胞数量。
通常认为干细胞是单潜能，双潜能或者多潜能。单潜能和双潜能干细胞在发育中更受限，并分别产生一种或者两种专门细胞。相反，多潜能干细胞(PSC)能分化成多种不同类型的细胞，产生组织(其形成器官)或在全能干细胞情况下产生整个生物体。多潜能干细胞不同于单潜能或双潜能，能多向分化，产生由不同类型或谱系的细胞集合组成的组织。
根据现有理解，干细胞例如多能干细胞，具有以下四个特性：(i)它是未分化细胞，即没有最终分化；(ii)有不受限制分裂的能力；(iii)有产生分化后裔的能力；和(iv)当它分裂时，每一个子细胞有选择余地：可以保持为干细胞，如同亲代一样，或者能开始导向分化的过程。
造血干细胞是多能干细胞的一个示例，其在骨髓细胞中发现，并能产生所有各种血细胞(包括白血球和红血球)。造血干细胞可以从(i)骨髓，(ii)生长因子动员外周血或(iii)脐带血(胎盘)中分离提取。近来，造血干细胞从胚胎干细胞(ES)中准备，使用体外无菌技术从胚胎中提取。这些未分化细胞能多向分化和重建所有身体组织，即全能。
存在很多未分化的造血谱系干细胞。这些包括多能干细胞(PSC)，淋巴干细胞(LSC)和髓系干细胞，已知统称为淋巴造血祖细胞(LPC)。LSC和髓系干细胞都由PSC分化形成。因此，LSC和髓系干细胞比PSC更加定向。造血谱系分化细胞的示例包括T细胞，B细胞，嗜伊红血球，嗜碱性细胞，嗜中性细胞，巨核细胞，单核细胞，粒细胞，肥大细胞和淋巴细胞。
其他干细胞包括神经干细胞，多能干细胞，能产生神经元、星形胶质细胞(atrocyte)、少突细胞(Nakafuku和Nakamura，1995，J.Neurosci Res.，卷41(2)：153-68；Anderson，1994，FASEB J.，卷8(10)：707-13；Morshead等，1994，Neuron，卷13(5)：1071-82)。骨骼肌肉卫星细胞是另一类型的干细胞，更具体来说，在成年人中维持为静止干细胞和需要时能产生新肌肉细胞的一种不同肌生细胞类型(Bischoff，1986，Dev Biol.，卷115(1)：129-39)。其他干细胞类型是上皮干细胞，基底细胞的子集，和间充质干细胞。
胚胎干细胞(ES)通常在转基因动物生产中使用。胚胎干细胞已显示在体外分化为几种细胞类型，包括淋巴样前体细胞(Potocnik等，1994，EMBO J.，卷13(22)：5274-83)和神经细胞。胚胎干细胞表征为有很多阶段特异性标记，例如阶段特异性胚胎标记3和4(SSEA-3和SSEA-4)、高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81以及碱性磷酸酶(Andrews等，1984，Hybridoma，卷3：347-361；Kannagi等.，1983，EMBO J.，卷2：2355-2361；Fox等，1984，Dev.Biol.，卷103：263-266；Ozawa等，1985，Cell.Differ.，卷16：169-173)。
多种抗原与未分化和分化细胞结合。此处术语“结合”指细胞表达或能表达，或出现或能诱导出现，或包括，各抗原。大部分未分化和已分化细胞包括主要组织相容性复合物(MHC)I型抗原和/或II型抗原。如果这些抗原与细胞结合，那么被称为I+型和/或II+型细胞。每一个与未分化细胞或者已分化细胞结合的特异性抗原能作为标记。因此，不同类型细胞可以基于其结合的具体抗原或基于具体结合抗原组合而彼此区分。这些标记抗原示例包括抗原CD34，CD19和CD3。如果这些抗原出现，则这些特定细胞分别称为CD34+，CD19+和CD3+。如果这些抗原不出现，则这些特定细胞分别称为CD34-，CD19-和CD3-。
一些髓系干细胞上鉴定的标记包括CD34+DR+，CD13+，CD33+，CD7+和TdT+细胞。PSC是CD34+DR-TdT-细胞(其他有用标记为CD38-和CD36+)。LSC是DR+，CD34+和TdT+细胞(以及CD38+)。胚胎干细胞表达SSEA-3和SSEA-4，高分子糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81和碱性磷酸酶。它们也不表达SSEA-1，其出现是分化的标记。已知其他干细胞类型的其他标记，例如神经干细胞的Nestein(J.Neurosci，1985，卷5：3310)。间充质干细胞对SH2，SH3，CD29，CD44，CD71，CD90，CD106，CD120a和CD124也为阳性，例如，对CD34，CD45和CD14为阴性。
干细胞可用已知方法进一步分离用于转化和分化。例如，通过杀死小鼠和用剪刀切下腿骨来分离小鼠骨髓细胞。干细胞也可通过骨髓细胞用结合不需要细胞的抗体筛选而从骨髓细胞中分离，所述细胞例如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(panB细胞)、GR-1(粒细胞)和lad(分化抗原呈递细胞)。所述操作方案的示例见Inaba等.，J.Exp.Med.176：1693-1702(1992)。
人体中，CD34+造血干细胞可获自多种来源，包括脐带血、骨髓和动员外周血。通过抗体亲和过程完成CD34+细胞的纯化。分离CD34+细胞的亲和柱分离过程描述于Ho等.，Stem Cells 13(增刊.3)：100-105(1995)。还参见Brenner，Journal of Hematotherapy 2：7-17(1993)。已知分离，纯化和培养扩增间充质干细胞的方法。
或者，或另外，很多细胞可由形态特性来鉴定。使用显微镜鉴定(可任选用染色技术)是充分发展的学科，术语组织学和其相关技术在本领域广泛使用。
多种技术可用来从最初去除专门谱系细胞来分离细胞。单克隆抗体对鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标记特别有用。
如果需要，大部分最终分化细胞可通过最初使用“相对粗”分离而除去。例如，磁性珠分离可最初用于移除大量定向细胞。理想地，至少约80％，通常至少70％的总体造血细胞被移除。
分离过程可以包括但不限于：磁性分离，使用抗体包被的磁珠，亲和层析，与单克隆抗体结合或与单克隆抗体联用的细胞毒性剂，包括但不限于补体和细胞毒素，和用结合固体基质如平板的抗体“筛选”，淘选或其他任何简便技术。
提供准确分离的技术包括但不限于，流式细胞仪，它可具有不同的复杂程度，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道等。
分离步骤可以逐步方式和/或同时操作。例如，每一个标记的存在与否可以单独评价，基于个体标记是否出现在每一步产生两个亚群。其后，选择感兴趣亚群并根据下一个标记存在与否而进一步分开。
也应理解，不同分离技术(例如亲和纯化和FACS)可在纯化过程的一个或多个步骤上共同使用。
给药
给予本发明组合物的合适方法，例如，条件沉默载体，含有载体的细胞等，包括但不限于静脉内给予和向靶组织或器官的直接递送。在一些实施方式中，给药方法包括组合物在需要治疗位点的局部递送或积累的特性。在一些实施方式中，组合物直接地送到需要治疗的组织或器官。在一些实施方式中，例如，细胞的选择性递送通过静脉注射细胞完成，其定位到靶组织或器官并在其中灌输。在一些实施方式中，本公开的细胞通过靶组织或器官产生的SDF-1梯度定位到靶组织或器官，所述梯度作为细胞趋化现象的引诱剂。
所述方法可以在需要治疗的任何动物上操作。优选动物是哺乳动物，更优选灵长类动物，更加优选人类。因此，虽然本文提供的药物组合物描述主要涉及在伦理上适合给予人的药物组合物，但本领域技术人员应理解这类组合物通常也适合给予所有种类的动物。改变适合给予人的药物组合物以使该组合物适合给予各种动物已众所周知，兽医药理学领域的普通技术人员可仅通过常规实验(如果需要)设计和进行这种改变。预期本发明药物组合物的给予对象包括但不限于：人类和其他灵长类，哺乳动物包括商业相关哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫和狗，禽类包括商业相关禽类，例如鸡、鸭、鹅和火鸡。
剂量：将本公开主题的有效剂量组合物给予需要的对象。“治疗有效量”或“治疗量”是足以产生可测量反应(例如治疗对象中的生物或临床相关反应)的治疗组合物量。本公开主题的组合物中活性成分的实际剂量水平可以不同，以使给予的活性化合物量就特定对象有效获得所需治疗反应。所选剂量水平取决于治疗组合物的活性，给药方式，与其他药物或治疗的组合，治疗病症的严重性，和治疗对象的病症及先前病史。然而，本领域技术人员了解，化合物的起始剂量水平低于获得理想治疗效果所需的剂量并逐步增加剂量直到获得理想效果。组合物的效力可以不同，并且因此“治疗有效量”可以不同。然而，使用本文所述分析方法，本领域技术人员能容易评估本公开主题的候选化合物的潜能和功效，并且相应调整治疗方案。
本文提供所公开主题的综述后，本领域普通技术人员能对个体对象调整剂量，考虑到特定制剂、组合物使用的给药方法和特定治疗疾病。进一步计算剂量要考虑对象身高和体重，症状严重性和阶段，其他有害物理条件的出现。这些调整或改变，和何时和如何作出这些调整或改变，为医学本领域普通技术人员所熟知。
除了上面讨论的效用，本发明的组合物(例如包含本发明嵌合基因的表达载体)和方法在动物医学中也有很多应用。尽管动物并不经常发生典型的动脉硬化症，但是心肌症很常见。很多物种发生局部缺血相关综合症，包括动脉炎、脉管炎和相关血管病变，导致细胞和组织的直接氧化还原作用损伤，特别是血管壁和心肌组织。这些病症可以通过给予本发明嵌合基因来缓解。
马和小马的常见和严重病症包括结肠局部缺血的上升，一般由肠梗阻造成。狗的相关疾病称为胃扩张-扭结。这些疾病的治疗通常包括手术去除阻塞。这类手术后的重灌注会造成重灌注组织的严重损伤，并通常引发伴有累进组织坏死的炎症反应。重灌注也可以造成动物因心脏休克死亡。本发明的组合物和方法可治疗性用于治疗这些病症，并在上述病症治疗中对脆弱组织提供保护，所述组织包括心脏和血管内皮。
本发明的另一个应用是猫和狗心脏病的治疗。猫和狗中都发现了心血管疾病的多种形式，包括扩张型心肌病，左心室肥厚和甲状腺机能亢进。Beagles描述了系统坏死脉管炎，可以与人体动脉硬化症相似的病症(就色斑形成和内膜增生而言)。每一个病症可以包括对心脏和脉管组织的局部缺血和氧化还原损伤的重新灌注，可以使用本发明的方法和组合物治疗。
虽然上面描述了本发明的各种实施方式，但应理解它们只是举例，不是为了限制。可根据本文公开内容对所述实施方式进行许多改变，而不背离所述发明的精神和范围。因此，本发明的宽度和范围不应受任何上述实施方式的限制。
本文提及的所有文献都通过引用纳入本文。该应用所引用的所有出版物和专利文献都通过引用纳入本文，以用于所有相同程度的目的，就好像每个单独出版物或专利文献都单独表示。在该文献中引用多种参考文献，应用并不承认任何特定文献对其发明为“优先技术”。发明组合物和方法的实施方式在下面实施例中阐述。
实施例
下述非限制性的实施例描述了本发明的选定实施方式。应该认识到，组分的比例变化和元件替代为该领域技术人员熟知并且在本发明实施方式范围内。
实施例1：用表达人VEGF的条件沉默AAV9基因治疗载体治疗缺血骨骼肌的血管生成，血管发生和动脉发生。
假设：缺血调控启动子驱动的半渗透、肌肉趋向性AAV9载体递送VEGF基因会支持定向血管生成，然后动脉生成和重建立有稳定组织重灌注的功能脉管网络。
材料和方法：将含HIF-1a和NSF(沉默子)结合位点的串联阵列的PGK启动子驱动的人(h)VEGF基因克隆入AAV9载体。基因表达和调控在正常和有动脉硬化倾向的小鼠的缺氧骨骼肌细胞和缺血后肢中定量。动脉发生和血管发生治疗在小鼠后肢缺血模型通过肌肉内递送AAV9-CS-VEGF载体来评价。
结果：此处显示结果第一次指出通过缺氧调控载体启动子持续递送VEGF提高缺血组织的稳定重灌注。
该方法包括使用腺相关病毒(AAV)载体转移VEGF基因，其中，VEGF表达由含有缺血反应元件(HRE)和沉默子元件组合盒的磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子调控，该组合盒在有氧条件下使基因表达沉默，在缺血时激活表达。载体命名为AAV9-CS-VEGF。制造由PGK启动子介导表达VEGF而不含有沉默子调控元件的对照AAV9载体；对照命名为AAV9-PGK-VEGF。通过使用所述方法，证明血管发生之后是动脉发生，伴有当使用AAV9-CS-VEGF治疗时，稳定血管和重灌注组织的生成。
制造并且检测稳定血管生成和由缺血转基因调控的AAV9-CS-VEGF和AAV9-PGK-VEGF载体。Balb/C小鼠中，通过结扎和切除股骨动脉完成后肢缺血。1010pfu的AAV9-CS-VEGF或AAV9-PGK-VEGF注入肢体，并且腺病毒载体表达的VEGF或磷酸盐缓冲盐水与注入对照。激光多普勒技术对肢体血液灌注进行每两周扫描，并且在杀死小鼠后用Dil荧光和共焦显微镜或者荧光抗体染色成像血管。结果第一次显示，头2-4周过后，AAV9-CS-VEGF诱导血管发生，接着16周连续VEGF生成，有与最初切除股骨动脉相似大小的血管动脉生成，AAV9-CS-VEGF也产生从臀向脚纵向生长的血管，这个结果在腺病毒或AAV9-PGK-VEGF中没有观察到，尽管后一载体有缺氧调控。纵向方式生长新血管的能力可能是由于分级缺氧调节和肌肉正常含氧区域沉默结合产生的定向信号。该特征可能是定向血流的切向力引起动脉生成转化的原因。也显示动脉可以使用AAV2-CS-VEGF构建体产生，转入间充质干细胞和注入兔缺血后肢。
使用载体AAV9-CS-VEGF或AAV2-CS-VEGF和其他促血管生长因子治疗肌肉缺血，包括周边和心肌缺血。
小结：持续缺血调控VEGF表达支持早期血管生成，发展为有稳定血管生成，肌肉灌注和肢体康复的动脉生成。与治疗相符的转基因下调提供安全转换，使得所述策略的临床转化为治疗患者后肢缺血。
实施例2：治疗血管生成的模型
条件沉默基因治疗载体的表达分布：条件沉默是该实验室开发的新技术来提供更严格的缺血基因调控。HIF-1α结合元件(HRE)与沉默元件(神经元反应沉默元件(NRSE)和鼠Igβ启动子的非组织特异性沉默子)，在组织特异性和组成型启动子上游的串联阵列中结合。排列元件从而在生理学氧张力(常)情况下，沉默元件具有活性并且抑制基因表达。组织缺氧(或局部缺血)情况下，HRE位点被激活，造成HIF-1增强子的双重诱导和沉默元件的抑制。净作用是组织缺氧强烈诱导(＞100倍)的非常低的常氧基因表达。高度诱导性很大程度是由于基础基因表达的沉默，并且不包括活性过强的启动子。图1A，1B和1C描述组织特性启动子的条件沉默和缺血转录激活的强组成型启动子。心脏特异性α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子不是缺血诱导的。所示-86bp处的3X HRE元件插入和-164处含串联HRE和沉默元件的条件沉默转换元件(CSE)可逆地使表达沉默和赋予心肌细胞142±36倍缺血诱导。α-MHC启动子在非心肌细胞中不明显表达。磷酸甘油酸激酶(PDG)基因启动子有内源性HRE，位于转录起始位点上游-280和-365，并且在骨骼肌细胞缺血下诱导表达7.1±0.3倍。CSE在-495位点的插入造成由缺血逆转的有氧表达的＞90％沉默。CS-PGK启动子诱导倍数是116±26。图1D显示在C2C12骨骼肌细胞基因递送和缺氧下CS-PGK-GFP的表达示例。条件沉默机制包括沉默子结合蛋白HDAC活性和诱导型增强子HAT活性的对抗作用，和结合邻近DNA元件因子的别构干扰。两种活性都通过凝胶移位分析，沉默子蛋白的过量表达和显性负沉默子表达，以及曲古抑菌素A抑制HDAC来证明。
不期望受理论的束缚，衰老和疾病可以降低HIF-1活性。生成第二系列CS缺氧反应启动子，其中HIF-1结合元件由来自金属硫蛋白(MT2)基因启动子的缺氧反应金属反应元件(MRE)-共有序列TGCRCNC(R指A或G，N指四个碱基中的任何一个)取代。当与沉默子元件结合时，这些启动子保持与HIF-1盒相同的调控。
体内局部缺血的调节：将PGK-VEGF和CS-PGK-VEGF构建体克隆到AAV9，以用于体内表达和抗缺血治疗。当系统性递送时，AAV9有骨骼和心肌的趋向性。AAV9载体由1日龄小鼠眼睛内注射和8周小鼠尾静脉注射递送。图5A显示注射有AAV9和台盼蓝染色追踪剂的1日龄小鼠以确定递送成功。图5B显示注射后4周组织中的VEGF表达，AAV9递送的PGK-VEGF优选在骨骼心脏肌肉中表达。图5C显示股骨动脉切除1周以后，相较对侧不缺血的肢体，4周龄小鼠的后肢踝肌肉中条件沉默的CS-PGK-VEGF构建体表达。缺血诱导的表达是78±6倍(n＝3)。图5D，大鼠脂肪垫模型用来检测由非缺血组织中未调控和CS-AAV9-VEGF载体诱导的血管生成。中间图显示相较没有血管响应条件沉默载体，组织注射未调控PGK载体时有阳性血管生长。这些结果证明CS构建体的基因表达在非缺血组织中沉默。
动脉生成的小鼠后肢模型：在小鼠缺血后肢模型中对响应AAV9和腺病毒载体的治疗性血管生成定量。第一组AAV9-CS-PGK-VEGF递送效果实验与低和高剂量Ad-CMV-VEGF作比较。这些结果见图3A。所有治疗改善多普勒评分多至8-10周，但是之后，两个腺病毒治疗组中流动急剧下降，而AAV-CS-VEGF组流动维持超过6个月。如右图所示，有CS-VEGF的AAV治疗使得肢体康复，而所有用腺病毒治疗的肢体(6个中的6个)在6个月内自身断离。这些结果显示在兔后肢模型中，VEGF的腺病毒递送不支持血管持久生成。相反，AAV-CS-VEGF产生持久血管。图3B显示实时PCR(RT-PCR)测定的VEGF表达；第一周中，腺病毒表达强烈而随后8周内下降到接近基线。CS-AAV9驱动的VEGF表达在16周后仍然维持高于基线。图3C中CS-VEGF后肢重灌注与未调控(PGK)-VEGF作比较。箭头指示基因递送后2周的时间点，其中CS-VEGF治疗的肢体多普勒评分明显高于AAV9-PGK-VEGF治疗。这些结果证明更多VEGF调控表达产生更快重灌注，尽管CS载体介导VEGF的低表达。有序血管生成需要VEGF介导的内皮细胞活化和Notch介导的内皮细胞形成侧抑制之间的平衡。VEGF表达与Notch D114靶标HEY2作比较。图6所示结果比较AAV9-PGK-VEGF和AAV9-CS-PGK-VEGF驱动的血管生成。结果显示在VEGF由缺氧和条件沉默调控时，VEGF∶HEY2水平更加平衡。注意到，包括CS载体的后肢VEGF表达比表达未沉默载体的肌肉小＞6倍。图3A-3C和6所述实验中，更低VEGF表达更好支持组织重灌注。也发现，14-28天SDF-1表达峰值(3.1倍)只在CS-AAV-VEGF处理肢体中出现。
CS-AAV-VEGF的定向血管生长：治疗后10-16周，每2周通过DiI染色组织切片来显影血管。图7A显示由腺病毒或AAV-CS-VEGF递送VEGF后12周和AAV9-CS-VEGF后16周，肌肉中的血管示例。底部图显示切除前股骨静脉和动脉。Ad治疗切片的血管定向与股骨动脉方向呈对角线，而CS-VEGF治疗肌肉的较大血管(细动脉和动脉)定向与股骨动脉和静脉的臀向膝盖方向相同。AAV9-CS-VEGF治疗16周后，与股骨动脉相似大小的血管在缝合位置间可见，如箭头所示，该缝合部位描述股骨动脉切割区域的开始处。图7B显示平滑肌肌动蛋白(红色)和dappi(蓝色)染色的细动脉。16周时用NIH图像软件定量AAV9-CS-VEGFAAV9-PGK-VEGF治疗的后肢切片的血管面积；数据显示每一个情况至少50个血管。AAV9-CS-VEGF治疗组的血管明显大于AAV9-PGK-VEGF组(p＜0.02)。毛细管密度使用Volocity软件通过CD31和VWF染色切片来定量，如图7C所示。该过程中，通过双光子共焦显微镜以约200μm总垂直距离中的10μm步得到Z堆栈。二十个图片栈需要6分钟时间间隔。然后用Volocity观察以3D呈现Z堆栈。每一个图像单独用感兴趣区域(ROI)内的总血管网络体积分析。采用等于90％总场的ROI评价总血管网络体积。通过该方法，16周CS-AAV-VEGF治疗中的血管密度相较PGK-AAV-VEGF组高1.6倍(p＜0.05)。石蜡切片的CD31和VWF染色支持这些结果。
小鼠AMI模型：为确定AAV9载体表达的VEGF是否影响缺血-重灌注损伤和梗塞后重建，AAV9-VEGF载体如图5A-5D所述进行系统性递送，并且10周后完成AMI。梗塞大小在重灌注后24小时测定。AMI之前和AMI之后2周，用超声波心动描记术和MRI测定收缩性。这些结果示于表1。
表1：计算自Echo的心肌收缩性参数(n＝3)。
Figure BPA00001574935500271
伊文思蓝和TTC染色(WT：41％；AAV9-PGK-VEGF：43％；AAV9-CS-VEGF，39％；n＝3/组)测定的阻塞大小在载体转化和未转化(WT)小鼠中没有区别。AMI之前心脏收缩性参数和腔室体积(表1)在载体间或者在WT(未治疗)小鼠间没有区别。2周后，非转导(WT)小鼠和有AAV-PGK-VEGF的小鼠的射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)显示相似下降(表1；WT：EF 85-44，FS 52-29；AAV9-PGK-VEGF：EF 77-48，FS45-26)。然而，AAV9-CS-VEGF转化小鼠的心脏显示缺血后收缩性提高，平均EF从80下降到69，FS从46下降到39。MRI确认这些结果；ED体积相似但是AAV9-CS-VEGF转导心脏的ES体积更小，反映收缩更大。
小结：这些结果提供证据表明，使用缺氧调节的条件沉默AAV9载体递送VEGF在缺血后肢和AMI模型中都改善了缺血后的肌肉性能。后肢中AAV9-CS-VEGF的VEGF表达比非沉默载体的等同表达小10倍。这表明严格限制在缺氧区域的低表达优选更高无调控表达。至少一个可能的原因是前面条件下VEGF∶Notch的比例更平衡。后肢模型结果也证明CS调节的VEGF赋予血管生长的方向，这在腺病毒或AAV的组成型表达中没有见到，而且当包括NRSE、FROG、TOAS在内的所有3个沉默元件存在时，治疗程度由条件沉默水平确定。这些结果显示组织缺氧通过产生提供EPC归巢引导和可能的内皮细胞沿梯度向下形成的生长因子(VEGF，SDF-1)梯度来确定其软组织局部缺血模型上的定向血管生长。也发现，AAV-CS-VEGF治疗组在基因递送16周后肌肉内形成大动脉。不希望受理论的束缚，认为此为定向血管生长的第二反应且包括随着血管网络连接起切除的股骨动脉区域上游和下游和血液恢复从臀向踝流动而产生的切向力。
实施例3：多种促血管生长因子的年龄关联下降，降低缺氧调节基因的诱导，和抑制EPC迁移。
鼠BM-MSC血管新生生长因子基因表达的年龄介导下降：MSC可以从2月和26月龄小鼠的胫骨和股骨中分离，这是通过在有MSC补充物的MesenCult培养基(干细胞技术)中附着和培养，每个年龄组4只小鼠。细胞可以同样处理和传代来达到均一性，用细胞表面标记Sca-1、CD44、CD45和CD11b的FACS分析来确定。所有细胞接触合适诱导物时，有等同能力分化为软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞。RNA在同一培养条件下于11次传代时被纯化，并用微阵列分析转录物。RT-PCR确认选定生长因子相关基因转录物的改变。以下列有明显下降：血管生成素2(3倍)，Hgf(272倍)，Igf-1(26倍)，VEGFa(4.2倍)，VEGFc(3倍)和PI3激酶Pi3r1的p85亚基(3.5倍)。VEGF受体Flt1转录水平增加。2个月和26个月MSC的VEGF和SDF-1分泌水平在缺氧培养期间用ELISA和Western印迹分别测量。仅在2个月细胞中，48小时后缺氧使VEGF和SDF-1分别增加8和9.5倍，而26个月细胞中没有明显诱导。音猬因子(Sonic Hedgehog)中发现相似结果。为证明这些结果和指明生物学意义，48小时缺氧细胞的取样培养基用于HUVEC基质胶管试验和注射入缺血小鼠后肢。在2个试验中，2个月但不是26个月细胞的培养基支持基质胶试验中管形成指示的血管生成，和肢体康复，和后肢多普勒评分增加。
小结：小鼠MSC研究揭示多种生长因子表达中的显著年龄相关下降，特别是HGF、VEGF和IGF-1，和对造成VEGF、SDF-1和Shh诱导抑制的缺氧的低调反应。通过2个模型中在衰老MSC的条件培养基下没有血管生成，此生物学结果显而易见。这些结果支持VEGF在动物和人EPC中随衰老而下降，与衰老对象的自体同源MSC或EPC治疗益处下降相一致。这些研究还证明年龄降低骨髓中CXCR4+细胞的迁移性和激活，并且降低其向SDF-1的迁移，影响与受抑制归巢和血管再生相关联。
实施例4：软真皮组织缺血模型
该模型由小鼠背部表面上产生的侧面皮肤切口(2.5cm长且间隔1.25cm)组成，所述切口穿过皮肤、真皮和下层脂肪组织。破坏上方皮肤，并且插入一个0.13mm毫米厚硅胶片(Invotec国际有限公司(InvotecInternational)，佛罗里达州杰克逊维尔)来分开皮肤与下层组织床。然后皮肤用6-0尼龙缝线近接。组织中现存的血管被降解，新血管沿着缺氧梯度的方向纵向生成，此梯度也是纵向，因为组织仍与硅胶片任一端循环相连。重新制作该模型，以定量多种疾病中响应基因和干细胞治疗的血管新生和血管生成。结果表明血管再生过程中血管出现重新定向。在假手术作外侧切口，但是不插入硅胶片。手术后两小时在中线处有最小血流，与血管隔离一致。这些血管在第7天重建，并且向恢复血流的中线发展。缺血野生型小鼠中，右侧和左侧边缘的残留血流与手术后2小时假实验相似，但是在第7天灌注消失，与血管退化一致，并且由最可能源自远端和近端的中线流取代。1年龄ApoE-/-小鼠的相同手术饲食高脂肪，造成手术后2小时的弱循环，在7天后仅适度提高。两个时间点的这些小鼠多普勒比例明显低于野生型小鼠，证明血管衰亡更快和组织对缺血的缺陷型反应。这些缺陷可能涉及所述组织吸引BM干细胞的能力降低和BM细胞的功能降低的组合。ApoE-/-小鼠但不是野生型在7天后显示坏死区域。DiI染色指示实施缺血和新纵向血管生成之后毛细管快速衰亡。1年龄ApoE-/-小鼠在左后肢缺血3天和10天的多普勒图像显示接受AAV-GFP的肢体在10天显示坏死信号，但是被AAV9-CS-VEGF恢复，证明在这些小鼠中基因治疗的有效性。
人细胞研究：为了确定年龄和疾病是否影响人骨髓细胞分子遗传改变，从5个有CAD的病人，5个年龄相符、接受非CAD相关病症心胸手术的患者和2个健康志愿者的骨髓中分离CD34+/Lin-细胞。收集手术中从胸骨中骨髓抽取的细胞(5-20mL)。单核细胞用Histopaque分离，并且细胞在50％IMDM、40％FBS和10％DMSO中以107细胞/ml密度冻存。CD34+/Lin-细胞通过亲和结合磁珠来纯化，纯化细胞的基因表达用微阵列和rtPCR测量；VEGF表达在CAD患者细胞中降低＞2倍。分析前，冻存的细胞被解冻，用FACS重新分析。每一组恢复的细胞数示于表2。
  表2   细胞#   Lin-   存活率   Lin-/C34+   Lin-C34+
  商购   1.2x108   3.2x107   3.8x106   80％   0.5x105   76％
  志愿者   2.5x108   1.5x108   2.1x106   82   0.5x103   47
  非CAD   8.7x107   5x107   2.1x106   92   0.3x105   77
  CAD   1.1x108   6.3x107   5.4x107   87   0.5x105   79
每一个样品通过FACS得到类似CD34+/Lin-细胞模式，表3的结果指示各样品组的活CD34+/Lin-细胞相对于输入的相似产量。VEGF通常受缺氧调节，不希望受理论的束缚，假设是缺氧诱导的VEGF在CAD组中的减少类似于年老小鼠MSC。注意到两个患者组中的VEGF-A和D相较健康志愿者大幅降低，这可能与年龄相关。
小结：第一次揭示CAD患者CD34+/Lin-骨髓细胞的血管生成基因的重大改变。
尽管依据一个或多个实施方式对本发明进行了说明和描述，但是本领域技术人员在阅读和理解本说明书和附图的基础上，很容易想到等同的改变和改进。另外，虽然仅仅在几个实施方式中的一个公开了发明的某一具体特征，但是，如果对于给定的或特定的应用是所需的和有利的，这种特征可与其它实施方式中的一个或多个其它特征相组合。
本公开的摘要会使读者快速确定技术公开的本质。应当理解的是，它不会被用于解释或限制以下权利要求的范围或意义。

Claims (34)

1.诱导或者促进患者中定向血管发生的方法，所述方法包括：
给予患者含条件沉默载体的组合物，所述载体编码以下至少一种：促血管发生因子，生长因子，细胞保护/细胞存活、细胞迁移因子和/或抗炎症因子，其中，所述因子诱导组织或者器官在所需方向上形成血管；和，
诱导或者促进定向血管发生。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体包含：腺相关病毒(AAV)载体，促血管发生因子和/或生长因子和/或细胞迁移因子，启动子，缺氧反应元件(HRE)和沉默元件的组合盒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体的基因表达在有氧条件下被抑制(条件沉默)并且在局部缺血时被激活。
4.如权利要求2所的方法，其特征在于，所述条件沉默子包括NRSE，FROG，TOAD，FROG/TOAD，NRSE/FROG/TOAD或其组合。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述条件沉默子包括至少一个SEQ ID NO：1-6所示核苷序列，衍生物，变体，突变体或者其同源物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述条件诱导型元件包括：缺氧反应元件(HRE)，炎症反应元件(IRE)，切应力激活元件(SSAE)，金属反应元件(MRE)或其组合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体条件性表达含以下至少一种的因子：内皮生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)，肝细胞生长因子，多育曲菌素，血管营养素，促血管生成素，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β(TGF-β)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，神经生长因子(NGF)，基质衍生因子(SDF)，干细胞因子(SCF)，或红细胞生成素(EPO)。
8.一种治疗患者组织缺氧和/或炎症相关疾病和/或紊乱的方法，所述方法包括：给予患者含条件沉默载体的组合物，所述载体编码以下至少一种：促血管发生因子，生长因子，或细胞迁移因子，其中，所述因子诱导组织或者器官在所需方向上形成血管；
诱导或者促进定向血管发生；和治疗患者组织缺氧相关疾病和/或紊乱。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述载体包括腺相关病毒
(AAV)载体或其他细胞透过性DNA或RNA载体，促血管发生因子和/或生长因子和/或细胞迁移因子，启动子，缺氧反应元件(HRE)和沉默元件的组合盒。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基因表达在有氧条件下被抑制(条件沉默)并且在局部缺血条件下被激活。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述载体条件性表达以下至少一种：内皮生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)，肝细胞生长因子，多育曲菌素，血管营养素，促血管生成素，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β(TGF-β)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，神经生长因子(NGF)，基质衍生因子(SDF)，干细胞因子(SCF)，或红细胞生成素(EPO)。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述条件沉默子包括NRSE，FROG，TOAD，FROG/TOAD，或其组合。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述条件沉默子包括至少一个SEQ ID NO：1-6所示核苷序列，衍生物，变体，突变体或其同源物。
14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述条件诱导型元件包括：缺氧反应元件(HRE)，炎症反应元件(IRE)，切应力激活元件(SSAE)，金属反应元件(MRE)或其组合。
15.一种含载体的分离细胞，其中，所述载体包括：腺相关病毒(AAV)载体，促血管发生因子和/或生长因子和/或细胞迁移因子，启动子，缺氧反应元件(HRE)和沉默元件的组合盒。
16.如权利要求15所述的分离细胞，其特征在于，所述基因表达在有氧条件下被抑制(条件沉默)并且在局部缺血时被激活。
17.如权利要求15所述的分离细胞，其特征在于，所述载体条件性表达以下至少一种：内皮生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)，肝细胞生长因子，多育曲菌素，血管营养素，促血管生成素，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β(TGF-β)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，神经生长因子(NGF)，基质衍生因子(SDF)，干细胞因子(SCF)，或红细胞生成素(EPO)。
18.如权利要求15所述的分离细胞，其特征在于，所述细胞是肌肉细胞，成纤维细胞或干细胞。
19.如权利要求18所述的分离细胞，其特征在于，所述干细胞是自体同源，供体衍生，同系，同种异体或异种异体。
20.如权利要求15所述的分离细胞，其特征在于，所述条件沉默子包括NRSE，FROG，TOAD，FROG/TOAD，或其组合。
21.如权利要求15所述的分离细胞，其特征在于，所述条件沉默子包括至少一个SEQ ID NO：1-6所示核苷序列，衍生物，变体，突变体或其同源物。
22.如权利要求15所述的分离细胞，其特征在于，所述条件诱导型元件包括：缺氧反应元件(HRE)，炎症反应元件(IRE)，切应力激活元件(SSAE)，金属反应元件(MRE)或其组合。
23.一种条件沉默子，所述沉默子包括：NRSE，FROG，TOAD，FROG/TOAD，NRSE/FROG/TOAD或其组合。
24.如权利要求23所述的条件沉默子，其特征在于，所述条件沉寂子包括至少一个SEQ ID NO：1-6所示核苷序列，衍生物，变体，突变体或其同源物。
25.如权利要求23所述的条件沉默子，其特征在于，所述条件诱导型元件包括：缺氧反应元件(HRE)，炎症反应元件(IRE)，切应力激活元件(SSAE)，金属反应元件(MRE)或其组合。
26.一种载体，所述载体包含：启动子，缺氧反应元件(HRE)和沉默元件的组合盒。
27.如权利要求26所述的载体，其特征在于，所述基因表达在有氧条件下被抑制(条件沉默)并且在局部缺血时被激活。
28.如权利要求26所述的载体，其特征在于，所述载体条件性表达以下至少一种：内皮生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)，肝细胞生长因子，多育曲菌素，血管营养素，促血管生成素，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β(TGF-β)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，神经生长因子(NGF)，基质衍生因子(SDF)，干细胞因子(SCF)，或红细胞生成素(EPO)。
29.如权利要求26所述的载体，其特征在于，所述条件沉默子包括NRSE，FROG，TOAD，FROG/TOAD，或其组合。
30.如权利要求26所述的载体，其特征在于，所述条件沉默子包括至少一个SEQ ID NO：1-6所示核苷序列，衍生物，变体，突变体或其同源物。
31.如权利要求15所述的载体，其特征在于，所述条件诱导型元件包括：缺氧反应元件(HRE)，炎症反应元件(IRE)，切应力激活元件(SSAE)，金属反应元件(MRE)或其组合。
32.一种条件沉默子，所述沉默子包括：NRSE，FROG，TOAD，FROG/TOAD，或其组合。
33.如权利要求32所述的条件沉默子，其特征在于，所述条件沉默子包括至少一个SEQ ID NO：1-6所示核酸序列，衍生物，变体，突变体或其同源物。
34.如权利要求32所述的条件沉默子，其特征在于，所述条件诱导型元件包括：缺氧反应元件(HRE)，炎症反应元件(IRE)，切应力激活元件(SSAE)，金属反应元件(MRE)或其组合。
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