KR20210018437A - 조혈 줄기 세포를 생산하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

일부 양태 및 구현예에서, 본 발명은 HSCT용을 포함하여 조혈 줄기 세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은, 동형유전자 내피 (HE) 또는 내피 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하고, HSC의 형성을 자극하기에 충분한 조건 하에 HE 및/또는 내피 세포에서 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스페라제 3 베타(Dnmt3b) 및/또는 GTPase IMAP 패밀리 구성원 6(Gimap6)의 활성 또는 발현을 증가시키는 것을 포함한다.

Description

조혈 줄기 세포를 생산하기 위한 방법

우선권 청구

본 출원은 2018년 6월 7일자 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제62/681,982호의 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

연방 후원 연구

본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부여된 허가번호 HL131645 DK085217, 및 DK100672 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.

조혈 줄기 세포 (Hematopoietic stem cell: HSC)는 특정한 유도성 이벤트가 중배엽을 혈액 줄기 세포 및 전구 세포로 전환하는 별개의 영역에서 배아 발생 중에 유래된다. HSC는 조혈이라고 불리는 과정에서 혈액 세포의 골수와 림프 계통 둘 모두를 야기할 수 있다.

HSC 이식 (HSC transplantation: HSCT)은 혈액, 골수, 대사 및 면역 질환이 있는 환자를 치료하는 데 널리 사용된다. 탯줄과 일 배체-동일 줄기 세포 이식의 발전에도 불구하고, HSC 이식의 치료적 사용은 특히 소수 민족이 있고 국가적 비혈연 공여자 등록이 부족한 국가에서 시기 적절하게 적합한 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen: HLA)-매칭 공여자를 찾기 어렵기 때문에 종종 제한된다. 혼혈인이 미국 인구의 1.6% (970 만명)를 차지하지만, 다인종 기증자는 등록된 700 만명 중 3% (21,000 명)에 불과하여 골수가 매칭하지 않는 6,000 명의 환자가 남아 있다. 적합한 매칭을 찾더라도, 이식편 대 숙주 병 (graft-versus-host disease: GVHD), 공여자 거부, 및 높은 치료-관련 사망률과 같은 면역학적 합병증은 환자의 생존을 위협할 수 있다. 그러나, 이러한 합병증은 자가 이식으로 없어진다. 자가 HSC가 특히 혈액 악성종양의 맥락에서 동종 HSC를 완전히 대체하지는 않더라도, 이들은 광범위한 악성 및 비-악성 혈액, 면역, 및 대사 장애가 있는 환자에서 공여자 이용률 및 GVHD의 부족을 포함하여 HSCT의 주요 장애요인들을 극복할 것이다.

따라서, HSCT를 위한, 자가 HSC를 비롯한 HSC를 생산할 필요가 있다.

개요

본 개시는, 적어도 부분적으로, 기계감응형 수용체 (예를 들어, Piezo1)의 생체역학적 및/또는 약리학적 활성화가 조혈 줄기 세포 (HSC) 형성을 위한 Dnmt3b 발현을 향상시킨다는 발견에 기초한다. 본원에서 입증되는 바와 같이, cdh5-몰판트 (cdh5-MO) 배아는 심박출 및 활성 혈류 없이 혈관에서 심박동-매개 맥동을 갖는다. 맥동-유래 신장은 Piezo1 기계감응형 채널을 활성화키는데, 채널은 대동맥-생식선-중신 (aorta-gonad-mesonephros: AGM) 영역에서 Dnmt3b 발현을 더욱 향상시켜 혈액 내피에서 HSC로의 전환을 자극한다. Piezo1의 맥동 또는 약리학적 활성화의 시뮬레이션은 또한 연속 이식 시에 정상적인 기능성 다계통 성인 혈액으로 재구성하는 3 배 더 많은 양의 HSC를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따라 생성된 조혈 줄기 세포는, 우수한 생착을 나타내고 수여자에서 기능성 다계통 성인 혈액으로 재구성하는 장기 조혈 줄기 세포(long term hematopoietic stem cell: LT-HSC)를 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은 HSC를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 내피 세포(예를 들어, 동형유전자 내피(HE) 세포)를 포함하는 집단을 제공하고, HSC의 형성을 자극하기에 충분한 조건 하에 세포에서 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스페라제 3 베타(Dnmt3b) 및/또는 GTPase IMAP 패밀리 구성원 6(Gimap6)의 활성 또는 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 방법을 제공한다. HSC는 환자에게 투여하기 위해 회수될 수 있다.

일부 구현예에서, 내피 세포는 Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키는 유효량의 효능제와 접촉된다. 일부 구현예에서, 효능제는 기계감응형 수용체 또는 기계감응형 채널의 효능제이다. 일부 구현예에서, 기계감응형 수용체는 Piezo1이다. 예시적인 Piezo1 효능제는 Yoda1이다. 일부 구현예에서, 유효량의 Yoda1 효능제는 약 5 μM 내지 약 200 μM, 또는 약 5 μM 내지 약 100 μM, 또는 일부 구현예에서, 약 25 μM 내지 약 100 μM 또는 약 25 μM 내지 약 50 μM의 범위 내에 있다.

대안적으로, Dnmt3b의 활성 또는 발현은 직접적으로 내피 세포에서 증가될 수 있다. 예를 들어, Dnmt3b의 mRNA 발현은 mRNA 전사물을 세포에 전달함으로써, 또는 활성을 증가시키거나 변형시키는 하나 이상의 이에 대한 변형을 가질 수 있는 Dnmt3b 전이유전자 및/또는 에피솜을 도입함으로써 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집은 내피 또는 HE 세포에서 Dnmt3b 발현 요소에 유전적 변형을 도입하기 위해, 예컨대, 프로모터 강도, 리보솜 결합, 또는 RNA 안정성을 증가시키기 위해 사용된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 단독으로 또는 Dnmt3b와 조합하여 내피 세포에서 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키는 것을 포함한다. Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키기 위해, Gimap6 mRNA 전사물, 또는 대안적으로 Gimap6 전이유전자 및/또는 에피솜, 및/또는 세포에서 Gimap6 발현 요소의 유전적 변형(예컨대, 프로모터 강도, 리보솜 결합, 또는 RNA 안정성을 증가시키는 하나 이상의 변형)을 도입하는 것이 세포에 도입될 수 있다.

다양한 구현예에서, 내피 세포(예를 들어, 동형유전자 내피(HE) 세포)를 포함하는 세포 집단이 생물반응기에 도입된다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 사이클릭-스트레인 생체역학적 신장(cyclic-strain biomechanical stretching)을 제공한다. 사이클릭-스트레인 생체역학적 신장은 Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시킨다. 예를 들어, 가요성-하부 배양 플레이트의 나일론, PDMS, 또는 유사한 생체적합성 생체모방성 막에 부착된 컴퓨터 제어 진공 펌프 시스템(예를 들어, FlexCell™ Tension System, Cytostretcher System, 또는 유사물)은 규정된 및 제어된 사이클릭 스트레인 조건 하에 HE 세포에 생체외 2D 또는 3D 원주형 신장을 적용하기 위해 사용될 수 있다.

다양한 구현예에서, HSC 전이는 Piezo1 활성화; 기계적 신장; Dnmt3b에 대한 전이유전자의 존재 또는 부재(즉, 전이유전자 비함유)의 mRNA, 에피솜, 또는 유전적 변형의 도입; 및/또는 Gimap6에 대한 전이유전자의 존재 또는 부재(즉, 전이유전자 비함유)의 mRNA, 에피솜, 또는 유전적 변형의 도입으로부터 선택된 하나 이상에 의해 유도된다.

일부 구현예에서, HE 세포는 유도 다분화능 줄기 세포(iPSC), 비-조혈 줄기 세포, 또는 체세포, 예컨대, 섬유아세포 또는 내피 세포로부터 얻어지거나 유래된다. 일부 구현예에서, HE 세포는 HLA-눌 세포, HLA-변형 세포, 및/또는 전이유전자-비함유 세포로부터, 또는 HE 세포에 대한 내피 세포의 유전자 유도로부터 얻어지거나 유래된다. 동형유전자 내피 세포(예를 들어, Flkl+CD45+ 세포, Flkl+CD41+ 세포 또는 CD31+CD43+ 세포)는 동종 공여자의 공급 세포로부터 또는 HSC로 치료할 대상체로부터의 유도(즉, 동형유전자 내피 세포에 자가 또는 동종 세포의 화학적, 유전적, mRNA, 전이유전자-비함유, 또는 에피솜 유도에 의해)를 포함하여 임의의 방식으로 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, HE 세포는 수여자 또는 만능 적합 공여자로부터의 세포를 사용하여 형성된 iPSC로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 발달학적으로 가소성인 내피 세포가 사용된다.

다양한 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 HSC의 집단, 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 세포 요법을 위한 약제학적 조성물이 제조된다. 약제학적 조성물은 적어도 약 10² 개의 HSC, 또는 적어도 약 10³ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁴ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁵ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁶ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁷ 개의 HSC, 또는 적어도 10⁸ 개의 HSC를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 수여자의 체중 킬로그램 당 약 100,000 개 내지 약 400,000 개의 HSC(예를 들어, 약 200,000 개의 세포/kg)를 포함하는 약제학적 조성물이 투여된다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조되는 HSC의 집단을 포함하는 세포 요법제가 제조된다. 일부 구현예에서, 세포 요법제는 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 세포 요법제는 적어도 약 10² 개의 HSC, 또는 적어도 약 10³ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁴ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁵ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁶ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁷ 개의 HSC, 또는 적어도 10⁸ 개의 HSC를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 수여자의 체중 킬로그램 당 약 100,000 개 내지 약 400,000 개의 HSC(예를 들어, 약 200,000 개의 세포/kg)를 포함하는 약제학적 조성물이 투여된다. HSC 세포의 수는 환자의 연령 및 체중을 기초로 변형될 수 있다.

이식을 위한 HSC는 일부 구현예에서 약 2 개월 미만, 또는 약 1 개월 미만(예를 들어, 약 4 주) 또는 약 2 주 미만, 또는 약 1 주 미만, 또는 약 6 일 미만, 또는 약 5 일 미만, 또는 약 4 일 미만, 또는 약 3 일 미만과 같은 비교적 짧은 기간 내에 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 발달학적으로 가소성인 내피 또는 HE 세포는 1 내지 4 주 동안 증가된 Dnmt3b 및/또는 Gimap6 활성 또는 발현으로 배양된다.

본원에 기재된 방법에 의해 제조된 HSC는, 예를 들어, 정맥내 주입 또는 골수내 이식에 의해 대상체(수여자)에게 투여된다. 방법은 골수파괴, 비-골수파괴 또는 면역독소 기반 (예를 들어, 항-c-키트, 항-CD45 등) 컨디셔닝 요법 후에 수행될 수 있다.

본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 혈액 (악성 및 비-악성), 골수, 대사 및 면역 질환을 치료하기 위해 이식 프로토콜에 사용하기 위한 HSC의 집단을 생산하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, HSC 집단은 자가 세포로부터 유래된다. 예를 들어, 수여 대상체로부터의 세포를 사용하여 형성된 iPSC로부터 생산된다. 일부 구현예에서, HSC 집단은 만능 적합 공여자 세포 또는 HLA-눌 동형유전자 내피 세포 또는 정상 HSC가 되도록 기증되는 유사한 세포로부터 유래된다.

본 발명의 이러한 및 다른 양태 그리고 구현예는 본 발명의 하기 상세한 설명에 의해 기술된다.

도 1a는 26 내지 42 hpf의 전이유전자 배아에서 flk1:mCherry⁺ 내피 세포로부터 생성된 cd41:eGFP⁺ HSC의 시간 경과 공초점 이미지를 보여주고 있는데; 데이터는 Piezo1의 침묵이 내피에서 HSC로의 전이를 약화시키는 반면, Piezo1 (Yoda1)의 약리학적 활성화가 대조 배아에서 HSC 형성을 자극할 뿐만 아니라 sih-MO 배아에서 HSC 형성을 구조한다는 것을 입증한다. 그룹 당 n= 5. 대조 대비 ^*P<0.05; sih-MO 대비 ^$P<0.05.
도 1b는 사이클릭 스트레인, 및 Piezo1 활성화제 (Yoda1)로 처리한 E11.5 AGM 세포에서 차등 발현된 유전자의 열지도인데; 이는 사이클릭 스트레인 및 Piezo1 활성화가 내피에서 조혈로의 전이 동안 AGM에서 유사한 유전자 발현 패턴을 갖는다는 것을 지시한다. 그룹 당 n= 3.
도 1c는 E11.5 AGM 세포에 대한 조혈 집락 형성 단위 (CFU) 검정의 그래프를 보여주고 있는데, 이는 Piezo1의 Yoda1-매개 약리학적 활성화가 내피에서 조혈로의 전이를 자극한다는 것을 입증한다. 그룹 당 n≥6. 대조 대비 ^*P<0.05. 약어: GEMM (과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵구); GM (과립구 대식세포); G (과립구); M (대식세포); E (적혈구).
도 1d는 E11.5 AGM 세포에 대한 조혈 CFU 검정의 그래프를 보여주고 있는데, 이는 Piezo1의 GsMtX4-매개 약리학적 억제가 내피에서 HSC로의 전이에 대한 사이클릭 스트레인의 유도 영향을 약화시킨다는 것을 입증한다. 그룹 당 n≥6. 대조 대비 ^*P<0.05. 약어: GEMM (과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵구); GM (과립구 대식세포); G (과립구); M (대식세포); E (적혈구).
도 2a는 실험적 개요(상단)와 선 그래프(하단)를 보여주는 것이다. 실험 개요 (상단)는 E11.5 마우스 AGM에서 유래한 HSC의 연속 이식 후 골수파괴 면역손상 마우스에 10% 사이클릭 스트레인 또는 Yoda1로 처리하는 것을 나타내는 도식을 보여주는 것이다. 선 그래프 (하단)는 8 내지 16 주 사이에 4 주 간격으로 1 차 이식 (수여자)에서 E11.5 AGM (공여자; 3 개의 배아 등가물)-유래 HSC의 재구성으로부터의 말초 혈액 키메라증의 백분율을 보여주고 있는데; 이는 E11.5 AGM에 대한 Piezo1 (Yoda1 처리)의 사이클릭 스트레인 또는 약리학적 활성화가 HSC의 형성을 자극한다는 것을 지시한다. 그룹 당 1차 수여자 n≥5. 대조 대비 ^*P<0.05; 8 주 키메라증 대비 ^$P<0.05. 세 개의 배아 등가물 (e.e.) AGM 공여자 세포가 각 수여자에 주사되었다.
도 2b는 16 주에 1차 이식자(수여자)에서 E11.5 AGM (공여자; 세 개의 배아 등가물)-유래 HSC의 Mac1⁺Gr1⁺ 골수 세포, Cd8⁺Cd3⁺ T-세포, 및 B220⁺Cd19⁺ B-세포로의 재구성 백분율을 보여주는 그래프인데; 이는 Piezo1 (Yoda1)의 E11.5 AGM으로의 사이클릭 스트레인 또는 약리학적 활성화가 혈액으로 재구성하는 HSC의 형성을 자극한다는 것을 지시한다. 그룹 당 1차 수여자 n≥5.
도 2c는 8 내지 12 주 사이에 4 주 간격으로 2차 이식 (수여자)에서 1차 이식 (공여자)-유래 유동-분류 Lin-Sca1⁺ c-Kit⁺ HSPC (n = 2000)의 재구성으로부터 말초 혈액 키메라증의 백분율을 보여주는 선 그래프인데; 이는 E11.5 AGM의 사이클릭 스트레인 또는 Yoda1 처리가 연속 생착 및 자가 재생 능력을 갖는 HSC를 생성시킨다는 것을 지시한다. 그룹 당 2차 수여자 n≥5. 대조 대비 ^*P<0.05.
도 2d는 12 주에 2차 이식 (수여자)에서 1차 이식 (공여자)-유래 HSC의 Mac1⁺Gr1⁺ 골수 세포, Cd8⁺Cd3⁺ T-세포, 및 B220⁺Cd19⁺ B-세포로의 재구성 백분율을 보여주는 그래프인데; 이는 E11.5 AGM의 사이클릭 스트레인 또는 Yoda1 처리가 혈액으로 연속 재구성할 수 있는 HSC를 생성시킨다는 것을 지시한다. 그룹 당 2차 수여자 n≥5.
도 3a는 실험적 개요(상단)와 그래프(하단)를 보여주는 것이다. 실험 개요 (상단)는 1차 이식 (수여 마우스)의 조혈 조직에서 공여자-유래 혈액 계통의 기능 및 표현형 분석을 위한 전략을 보여주는 것이다. 그래프 (하단)는 골수-유래 Cd71⁺Ter119⁺분류 (공여자) 적혈구 세포에서 β-Major (성인), εγ (배아), 및 β-H1 (배아) 유형의 헤모글로빈의 발현 백분율을 보여주는 것이고; 데이터는 E11.5 AGM의 생체역학적 신장 또는 Yoda1 처리 후 생성된 공여자 HSC가 성인 헤모글로빈을 함유하는 적혈구로 재구성된다는 것을 지시한다. 그룹 당 n≥6.
도 3b는 골수-유래 Gr1⁺Mac1⁺분류 (공여자) 호중구의 하룻밤 배양 (O/N), 그리고 이어서 골수세포형과산화효소 (MPO) 단백질의 ELISA-기반 정량화를 보여주는 그래프인데; 데이터는 공여자 HSC가 E11.5 AGM의 생체역학적 신장 또는 Yoda1 처리 후에 생성되었고 충분한 MPO 수준을 나타내는 기능성 골수 세포로 재구성한다는 것을 입증한다. 그룹 당 n≥5.
도 3c는 1차 이식 (수여자) 마우스의 말초 혈액에서 사전-면역화된 면역글로불린 (Ig) 이소형의 ELISA 분석을 보여주는 그래프인데; 데이터는 1차 이식이 면역글로불린의 완전 레퍼토리를 갖는 B 세포를 생성시킨다는 것을 지시한다. 그룹 당 n≥6.
도 3d는 비장-분류 Cd3⁺ T 세포 (공여자) (상단) 또는 Mac1⁺ 골수 세포 (공여자, 음성 대조군) (하단)의 T-세포 수용체 (TCR_β) 유전자좌 분석을 보여주는 두 개의 겔 사진의 이미지인데; 데이터는 공여자 HSC가 E11.5 AGM의 생체역학적 신장 또는 Yoda1 처리 후 T-세포를 생성시키고, T-세포 수용체 β (TCR β) 재배열을 나타내고 비장으로 이동하고 TCR_β 유전자좌를 재배열하기에 충분한 기능성 재조합 기관을 지니는 T-세포로 재구성한다는 것을 지시한다.
도 3e는 지연형 과민성 검정을 보여주는 도트 플롯인데, 이는 생체역학적 신장 또는 Yoda1-처리된 E11.5 AGM-유래 공여자 HSC로 재구성된 1차 이식 (수여자) 마우스가 T-세포 매개 면역 반응을 지닌다는 것을 입증한다. 그룹 당 n≥6. 우측 발바닥(음성 대조군) 대비 ^*P <0.05.
도 4는 EC 대 HSC (①), EC 대 HEC (②) 및 HEC 대 HSC (③) 동안 상향조절된 유전자의 맥락에서 사이클릭 스트레인 및/또는 Yoda1로 처리된 E11.5 AGM 세포에서 상향조절된 유전자의 벤 다이어그램을 보여주는 것이다. 상기 분석 (① 대 ② 대 ③)에서 일반적으로 상향조절된 유전자의 벤 비교는 원주형 신장과 Piezo1 활성화 둘 모두가 내피에서 HSC로의 전이 동안 Dnmt3b 전사물 발현 및 Gimap6 전사물 발현을 특이적으로 자극한다는 것을 입증한다.
도 5a는 사이클릭 스트레인 또는 Yoda1로 처리된 E11.5 마우스 AGM 세포의 핵 분획에서 Dnmt3b 및 Dnmt3a의 단백질 수준에 대한 두 개의 그래프를 보여주고 있는데; 데이터는 원주형 신장 또는 Piezo1 활성화가 Dnmt3a의 발현에 영향을 미치지 않으면서 Dnmt3b 단백질 발현 수준을 특이적으로 자극한다는 것을 입증한다. 그룹 당 n≥3. 대조 대비 ^*P<0.05.
도 5b는 나나오마이신 (Nana)의 존재에서 사이클릭 스트레인 또는 Yoda1로 처리한 E11.5 마우스 AGM 세포의 조혈 CFU 검정의 그래프를 보여주고 있는데; 데이터는 Dnmt3b의 약리학적 억제가 원주형 신장 또는 Piezo1 활성화에 의해 자극된 내피에서 HSC로의 전이를 약화시킨다는 것을 지시한다. 그룹 당 배아 n≥6. 대조 대비 ^*P<0.05; 신장 대비 ^$P<0.05; Yoda1 대비 ⁺P<0.05.
도 5c는 26 내지 42 hpf 사이의 전이유전자 배아에서 flk1:mCherry⁺ 내피 세포로부터 생성된 cd41:eGFP⁺ HSC의 시간-경과 공초점 이미징의 결과를 보여주는 그래프인데; 데이터는 dnmt3bb.1의 사일런싱이 Piezo1 활성화에 의해 자극된 내피에서 HSC로의 전이, 및 Dnmt3a와 대비되는 Dnmt3b에 대한 나나오마이신의 특이성을 약화시킨다는 것을 입증한다. 그룹 당 n≥5. 대조 대비 ^*P<0.05; Yoda1 대비 ^$P<0.05.

상세한 설명

태아가 발달하는 동안 대동맥-생식선-중신 (AGM)에서 내피 세포의 서브세트는 동형유전자 내피 세포인데, 이는 태아 간 및 골수를 궁극적으로 집락화하는 HSC가 되는 이들의 운명을 변화시킨다. 그러나, 동형유전자 내피 세포를 자극하는 요인의 정체는 아직 알기 어려워, 기능성 HSC의 잠재적 공급원으로서 동형유전자 내피 세포의 유용성이 제한된다. 내피 내막 상의 혈류-매개 전단 응력은 HSC의 내피 출현을 자극한다. 그러나, Cdh5-눌 제브라피쉬 및 뮤린 모델을 사용하여, 조기 순환 정지에도 불구하고 기능성 HSC가 출현한다는 것은 확립되어 있다(Anderson H, et al., Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood 2015). 이러한 cdh5-침묵 모델은 맥압-매개 원주형 신장이 HSC 출현을 유도하는 추가 기전을 조사하기 위해 기능성 HSC 출현을 촉발하는 전단 응력 및/또는 산화질소 신타제 (NOS)-독립적 생체역학적 힘의 연구를 위한 피벗으로서 본 개시에 따라 사용되었다.

실험실에서 동형유전자 내피 세포로부터 HSC를 생산하려는 시도는 부분적으로 동형유전자 내피 세포로부터 HSC 출현을 자극하는 요인에 대한 지식이 부족하기 때문에 대부분 실패했다. 심박동으로부터의 맥동으로 인한 원주 혈관 신장은 동형유전자 내피 세포로부터 기능성 HSC가 출현하는 것을 촉발시키는데, 이것이 궁극적으로 결정적 계통으로 생착하고 분화할 수 있다는 것이 이제 확립된다. 또한, 신장-감응형 일시적 수용체 전위 양이온 채널-서브패밀리 바닐로이드 구성원 4 (Trpv4) 채널의 활성화는 심박동 및 혈류의 부재에서 침묵 심장 (tnnt2; sih)-침묵된 배아에서 HSC 형성을 구조하였다. 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/096215호를 참조하라.

본 개시는 기계감응형 수용체 (예를 들어, Piezo1)의 생체역학적 및/또는 약리학적 활성화가 조혈 줄기 세포 (HSC) 형성을위한 Dnmt3b 발현을 향상시킨다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 본원에서 입증되는 바와 같이, cdh5-몰판트 (cdh5-MO) 배아는 심장 출력 및 활성 혈류 없이 혈관에서 심박동-매개 맥동을 갖는다. 맥동-유래 신장은 Piezo1 기계감응형 채널을 활성화키는데, 이는 AGM에서 Dnmt3b 발현을 더욱 향상시켜 내피에서 HSC로의 전환을 자극한다. Piezo1의 맥동 또는 약리학적 활성화의 시뮬레이션은 또한 연속 이식 시에 정상적인 기능성 다계통 성인 혈액으로 재구성하는 적어도 3 배 더 많은 양의 LT-HSC를 생성시킨다.

따라서, 본 개시의 결과는 심박동-매개 생체역학적 힘이 기계감응형 채널뿐만 아니라 후성유전학적 기관을 활성화시킴으로써 세포-운명 전이 및 줄기 세포 형성을 어떻게 자극하는 지를 입증한다. LT-HSC의 발생, 확장, 및 줄기 유지는 혈액 및 골수 질환의 치료를 위한 HSC 이식 및 세포 요법에서 주요 난제이다. 본 개시는 LT-HSC를 발생시키기 위한 유전적 및 약리학적 표적을 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명은 HSC를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 내피 세포(예를 들어, HE 세포)를 포함하는 집단을 제공하고, HSC의 형성을 자극하기에 충분한 조건 하에 내피 세포에서 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스페라제 3 베타(Dnmt3b) 및/또는 GTPase IMAP 패밀리 구성원 6(Gimap6)의 활성 또는 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 방법을 제공한다. HSC는 환자에게 투여하기 위해 회수될 수 있다.

Dnmt3b (DNA (시토신-5-)-메틸트랜스페라제 3 베타)는 DNA 메틸트랜스페라제이다. Dnmt3b는 주로 핵으로 국소화되고, 이의 발현은 발생학적으로 조절된다. Gimap6은 면역-관련 단백질 (GIMAP) 패밀리의 GTPase의 구성원이다. GIMAP 단백질은 GTP-결합 및 코일링된-코일 모티프를 함유한다.

일부 구현예에서, 내피 세포는 Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키는 유효량의 기계감응형 수용체 또는 기계감응형 채널 효능제와 접촉된다. 일부 구현예에서, 기계감응형 수용체는 Piezo1이다. 예시적인 Piezo1 효능제는 Yoda1이다.

Yoda1 (2-[5-[[(2,6-디클로로페닐)메틸]티올]-1,3,4-티아디아졸-2-일]-피라진)은 기계감응형 이온 채널 Piezo1를 위해 개발된 소분자 효능제이다(Syeda R, Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezo1. eLife (2015)). Yoda 1은 하기 구조를 갖는다:

Yoda1의 유도체는 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 2,6-디클로로페닐 코어를 포함하는 유도체가 일부 구현예에서 사용된다. 예시적인 효능제는 문헌[Evans EL, et al., Yoda1 analogue (Dooku1) which antagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation, British J. of Pharmacology 175(1744-1759): 2018]에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, Yoda1 효능제 또는 유도체의 유효량은 약 5 μM 내지 약 500 μM, 또는 약 5 μM 내지 약 200 μM, 또는 약 5 μM 내지 약 100 μM의 범위, 또는 일부 구현예에서 약 25 μM 내지 약 150 μM, 또는 약 25 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 25 μM 내지 약 50 μM의 범위 내에 있다.

대안적으로, Dnmt3b의 활성 또는 발현은 직접적으로 내피 또는 HE 세포에서 증가될 수 있다. 예를 들어, Dnmt3b의 mRNA 발현은 Dnmt3b-인코딩 전사물을 세포에 전달함으로써, 또는 에피솜을 세포에 도입하는 것으로 제한되지 않는, Dnmt3b-인코딩 전이유전자, 또는 전이유전자-비함유 방법을 도입함으로써 증가될 수 있는데, 이들은 활성을 증가시키거나 변형시키도록 이에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드 변형(또는 인코딩된 아미노산 변형)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집은 내피 세포에서 Dnmt3b 발현 요소에 유전적 변형을 도입하기 위해, 예컨대, 프로모터 강도, 리보솜 결합, RNA 안정성을 증가시키거나, RNA 스플라이싱에 영향을 주기 위해 사용된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 단독으로 또는 사이클릭 스트레인 또는 Piezo1 활성화 시 Dnmt3b 및/또는 다른 변형된 유전자와 조합하여 내피 세포에서 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키는 것을 포함한다. Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키기 위해, Gimap6-인코딩 mRNA 전사물이 세포에 도입될 수 있고, 세포에 에피솜을 도입하는 것; 또는 대안적으로 활성을 증가시키거나 변형시키도록 이에 하나 이상의 뉴클레오티드 변형(또는 인코딩된 아미노산 변형)을 가질 수 있는 Gimap6-인코딩 전이유전자를 도입하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 전이유전자-비함유 접근법이 또한 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집은 내피 세포에서 Gimap6 발현 요소에 유전적 변형(예컨대, 프로모터 강도, 리보솜 결합, RNA 안정성을 증가시키거나, RNA 스플라이싱에 영향을 주는 하나 이상의 변형을 도입하기 위해 사용된다.

일부 구현예에서, mRNA 및/또는 에피솜(들) (예를 들어, 인코딩 Dnmt3b 또는 Gimap6)은 합성적으로, 예컨대, 직접 화학적 합성 또는 시험관내 전사에 의해 생성되고, 내피 세포에 도입된다. 공지된 화학적 변형이 세포에서 선천성-면역 반응을 막기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 표준 뉴클레오티드만을 포함하는 합성 RNA는 인식 수용체를 패턴화하기 위해 결합할 수 있고, 세포에서 강력한 면역 반응을 촉발시킬 수 있다. 이러한 반응은 번역 차단, 염증성 사이토카인의 분비, 및 세포 사멸을 초래할 수 있다. 특정 비표준 뉴클레오티드를 포함하는 RNA는 선천성 면역계에 의한 검출을 회피할 수 있으며, 고효율로 단백질에 번역될 수 있다. 특히 선천성 면역 반응을 방지하는 뉴클레오티드 변형과 관련하여, 본원에 참조로 포함되는 US 9,181,319호를 참조하라. mRNA는 HSC 생성 동안 1 회 또는 주기적으로 공지된 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다.

일부 구현예에서, Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 발현은 세포에 전이유전자를 도입함으로써 증가되는데, 이는 요망되는 수준의 과발현을 유도할 수 있다(다양한 프로모터 강도 또는 발현 제어 요소의 다른 선택으로). 전이유전자는 당업자에 공지된 다양한 바이러스 벡터 또는 트랜스펙션 시약을 이용하여 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 발현은 전이유전자-비함유 방법(예를 들어, 에피솜 전달)에 의해 증가된다.

일부 구현예에서, Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 발현 또는 활성은, 예를 들어, 프로모터 강도, 리보솜 결합, 또는 RNA 안정성을 증가시키는 하나 이상의 변형을 도입하기 위해 유전자 편집 기술을 이용하여 증가된다. 다양한 편집 기술이 공지되어 있고, CRISPR, 징크 핑거 (ZF) 및 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)를 포함한다. 일부 구현예에서, Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 발현 또는 활성은 전이유전자-비함유 방법(예를 들어, 에피솜 전달)에 의해 증가된다. 이러한 DNA-결합 도메인 및 Fokl 엔도뉴클레아제의 절단 도메인 중 하나 이상을 함유하는 융합 단백질이 세포에서 DNA의 요망되는 영역에 이중-가닥 파괴를 형성시키기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 출원 모두의 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제US 2012/0064620호, 미국 특허 출원 공개 제US 2011/0239315호, 미국 특허 제8,470,973호, 미국 특허 출원 공개 제US 2013/0217119호, 미국 특허 제8,420,782호, 미국 특허 출원 공개 제US 2011/0301073호, 미국 특허 출원 공개 제US 2011/0145940호, 미국 특허 제8,450,471호, 미국 특허 제8,440,431호, 미국 특허 제8,440,432호, 및 미국 특허 출원 공개 제2013/0122581호 참조). 일부 구현예에서, 유전자 편집은 당업계에 공지된 바와 같이 CRISPR 결합 Cas 시스템을 이용하여 실시된다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 제US 8,697,359호, 제US 8,906,616호, 및 제US 8,999,641호를 참조하라.

다양한 구현예에서, 발달학적으로 가소성인 내피 세포 또는 HE 세포를 포함하는 세포 집단이 생물반응기에 도입된다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO 2017/096215호에 기재된 바와 같은 사이클릭-스트레인 생체역학적 신장을 제공한다. 사이클릭-스트레인 생체역학적 신장은 Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시킨다. 이러한 구현예에서, 기계적 수단은 세포에 신장력을 가한다. 예를 들어, 가요성-하부 배양 플레이트의 나일론, 또는 유사한 생체적합성 및 생체모방성 막에 부착된 컴퓨터 제어 진공 펌프 시스템(예를 들어, FlexCell™ Tension System, Cytostretcher System, 또는 유사물)은 규정된 및 제어된 사이클릭 스트레인 조건 하에 HE 세포에 생체외 2D 또는 3D 원주형 신장을 적용하기 위해 사용될 수 있다.

다양한 구현예에서, HSC 전이는 Piezo1 활성화, 기계적 신장, Dnmt3b에 대한 mRNA, 전이유전자, 전이유전자-비함유 (예를 들어, 에피솜), 또는 유전적 변형 도입, 및/또는 Gimap6에 대한 mRNA, 전이유전자, 전이유전자-비함유 (예를 들어, 에피솜), 또는 유전적 변형 도입으로부터 적어도 선택된 수단에 의해 유도된다.

HE 세포는 혈액, 골수, 대사, 또는 면역 질환을 갖는 대상체로부터 얻어지거나 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 혈액 악성종양을 갖지 않는다. HSC의 집단은 수여자에게 투여될 수 있다. 자가 HSC 이식의 경우, HE 세포는 수여자로부터 유래되었을 것이다.

일부 구현예에서, HE 세포는 유도된 섬유아세포 또는 내피 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 유도 다분화능 줄기 세포(iPSC), 비-조혈 줄기 세포, 또는 체세포로부터 얻어지거나 유래된다. 일부 구현예에서, HE 세포는 HLA-눌 세포, HLA-변형 세포, 및/또는 전이유전자-비함유 세포로부터, 또는 HE 세포에 대한 내피 세포의 유전자 유도로부터 얻어지거나 유래된다. 동형유전자 내피 세포(예를 들어, Flkl+CD45+ 세포, Flkl+CD41+ 세포 또는 CD31+CD43+ 세포)는 동종 공여자의 공급 세포 또는 HSC로 치료할 대상체로부터를 포함하여 임의의 방식으로 얻어질 수 있다. 예를 들어, HE 세포는 자가 또는 동종 세포의 동형유전자 내피 세포로의 화학적, 유전적, 전이유전자-비함유, 또는 에피솜 유도에 의해 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, HE 세포는 수여자의 세포로부터, 또는 HLA-변형된 세포로부터, 또는 HLA-눌 세포인 세포로부터 형성된 iPSC로부터 생산된다. 일부 구현예에서, HE 세포는 대상체의 세포로부터 얻어지거나 유래되고, 여기서 대상체는 만능 적합 공여자이다. 동형유전자 내피 세포를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 인간 만능 줄기 세포로부터의 생산을 포함한다. 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO 2017/096215호 및 제US 2019/0119643호를 참조하라. 또한, 문헌[Ditadi et al., Nature Cell Biol. 17(5) 580-591 (2015); Sugimura et al., Nature 2017; 545(7655):432-438; Nakajima-Takagi et al, Blood. 2013; 121(3):447-458; Zambidis et al., Blood. 2008 Nov 1; 112(9):3601-14 및 Park et al, Cytometry A. 2013 Jan; 83(1): 114-126 (human embryoid body (hEB)-based hemato-endothelial differentiation methods for efficient hiPSC differentiation); Choi et al., Cell Rep. 2012 Sep 27; 2(3): 553-567 (hPSC differentiation in coculture with OP9); Sandler et al, 2014 July 17; 511(17509):312-318 (endothelial cells to hematopoietic cells)]을 참조하고; 또한, 문헌[Sluvkin, Blood 2013 122:4035-4046]을 참조하라. 일부 구현예에서, HSC의 생성을 개시하는 HE 세포의 수는 적어도 약 10⁶ 개의 세포, 약 10⁷ 개의 세포, 또는 적어도 10⁸ 개의 세포이다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따라 생성된 조혈 줄기 세포는, 우수한 생착을 나타내고 수여자에서 기능성 다계통 성인 혈액으로 재구성하는 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC)를 포함한다. 일부 구현예에서, HSC는 Lin- / Sca1+/ c-kit+ 세포를 포함한다.

다양한 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 HSC 집단, 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 세포 요법을 위한 약제학적 조성물이 제조된다. 약제학적 조성물은 적어도 약 10² 개의 HSC, 또는 적어도 약 10³ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁴ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁵ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁶ 개의 HSC, 또는 적어도 약 10⁷ 개의 HSC, 또는 적어도 10⁸ 개의 HSC를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 수여자의 체중 킬로그램 당 약 100,000 개 내지 약 400,000 개의 (CD34+) HSC(예를 들어, 약 200,000 개의 세포/kg)를 포함하는 약제학적 조성물이 투여된다.

요법 또는 이식을 위한 HSC는 일부 구현예에서 2 개월 미만, 또는 1 개월 미만, 또는 약 2 주 미만, 또는 약 1 주 미만, 또는 약 6 일 미만, 또는 약 5 일 미만, 또는 약 4 일 미만, 또는 약 3 일 미만과 같은 비교적 짧은 기간 내에 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 1 내지 4 주 동안 증가된 Dnmt3b 및/또는 Gimap6 활성 또는 발현으로 배양된다.

세포 조성물은 정맥내 주입 또는 다른 투여 경로에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 추가로 포함할 수 있고, 적합한 동결보호제를 포함할 수 있다. 예시적인 담체는 DMSO (예를 들어, 약 10% DMSO)이다. 세포 조성물은 단위 바이알 또는 백에 제공되고, 사용될 때까지 냉동 보관될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물의 부피는 약 1 액 온스 내지 1 파인트이다.

본원에 기재된 방법을 이용하여 생산된 HSC는, 예를 들어, 정맥내 주입 또는 골수내 이식에 의해 대상체(수여자)에게 투여된다. 방법은 골수파괴, 비-골수파괴 또는 면역독소 기반 (예를 들어, 항-c-키트, 항-CD45 등) 컨디셔닝 요법 후에 수행될 수 있다.

본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 혈액 (악성 및 비-악성), 골수, 대사 및 면역 질환을 치료하기 위해 이식 프로토콜에 사용하기 위한 HSC의 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, HSC 집단은 자가 세포 또는 만능-적합 공여자 세포 또는 HLA-변형 또는 HLA 눌 세포로부터 유래된다. 즉, HSC 집단은 HE 세포, 발달학적으로 가소성인 내피 세포로부터 유래된 HE 세포 또는 수여 대상체의 세포로부터 제조되거나 공여자 세포 (예를 들어, 만능 공여자 세포, HLA-매칭 세포, HLA-변형 세포, 또는 HLA-눌 세포)로부터 제조된 iPSC로부터 생산된다. 일부 구현예에서, 자가-유래 세포가 사용되고, 수여 대상체는 다발성 골수종 (multiple myeloma); 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma); 호지킨병 (Hodgkin disease); 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia); 신경모세포종 (neuroblastoma); 생식 세포 종양; 자가면역 장애 (전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus: SLE), 전신성 경화증 (systemic sclerosis)); 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome), 아밀로이드증 (amyloidosis)으로부터 선택된 병태; 또는 자가 HSC 이식을 사용하여 치료 가능한 다른 병태를 갖는다. 일부 구현예에서, 자가-유래 세포(예를 들어, HSC가 수여 대상체로부터의 세포로부터 생산됨)가 사용되고, 수여 대상체는 혈액 악성종양을 갖지 않는다.

일부 구현예에서, 수여 대상체는 급성 골수성 백혈병; 급성 림프모구성 백혈병 (Acute lymphoblastic leukemia); 만성 골수성 백혈병 (Chronic myeloid leukemia); 만성 림프구성 백혈병 (Chronic lymphocytic leukemia); 골수증식성 장애 (Myeloproliferative disorder); 골수이형성 증후군; 다발성 골수종; 비호지킨 림프종; 호지킨병; 재생불량성 빈혈 (Aplastic anemia); 순수 적혈구 무형성증 (Pure red-cell aplasia); 발작성 야행성 혈색소뇨증 (Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria); 판코니 빈혈 (Fanconi anemia); 종증성 지중해 빈혈 (Thalassemia major); 겸상 적혈구 빈혈 (Sickle cell anemia); 중증 복합 면역 결핍증 (Severe combined immunodeficiency: SCID); 비스코트-알드리치 증후군 (Wiskott-Aldrich syndrome); 혈구탐식성 핌프조죽구 증식성 (Hemophagocytic lymphohistiocytosis); 선천성 대사장애증 (Inborn errors of metabolism); 표피 수포증 (Epidermolysis bullosa); 중증 선천성 호중구 감소증 (Severe congenital neutropenia); 슈와크만-다이아몬드 증후군 (Shwachman-Diamond syndrome); 다이아몬드-블랙판 빈혈 (Diamond-Blackfan anemia); 및 백혈구 유착 결핍증 (Leukocyte adhesion deficiency)으로부터 선택된 병태를 갖는다. 일부 그러한 구현예에서, 동종-유래 또는 만능-적합 공여자 세포 또는 HLA-변형 또는 HLA-눌 세포는 HE 세포를 생산하는 데 사용된다. 예를 들어, HSC는 공여 대상체, 즉, 수여 대상체 이외의 대상체로부터의 세포로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 공여자 대상체는 혈액형 및 인간 백혈구 항원(HLA) 타이핑에 기초한 수여 대상체와 매칭된다.

본원에서 사용되는 용어 "약"은 관련된 수치의 ±10%을 의미한다.

본 발명의 이러한 및 다른 양태는 이제 하기 비-제한적 실시예로 기술될 것이다.

실시예

결정적 조혈 중에, 첫 번째 HSC 세트는 태아 발달 중 AGM에서 동형유전자 내피 세포로부터 유래된다. 따라서, 내피 및/또는 동형유전자 내피 세포는 AGM 미세환경에 존재하는 내인성 및 외인성 요인의 레퍼토리를 확립하는 경우 임상 용도를 위해 HSC를 발달시키거나 확장하기 위한 공급원이 될 수 있다.

7 개의 전사 인자 (ERG, HOXA5, HOXA9, HOXA10, LCOR, RUNX1 및 SPI1)의 유도, 뿐만 아니라 TGFβ 및 CXCR7의 억제 또는 BMP 및 CXCR4의 활성화는 인간 내피에서 HSPC로의 전이를 향상시킨다. 그러나, 이러한 접근법은 내피 또는 동형유전자 내피 세포에 LT-HSC 기능 및 특성을 부여하지 않는다. NOS의 후속 활성화에 따른 혈류-매개 전단 응력은 HSC 형성을 담당하는 유일한 공지된 생체역학적 요인이다. 그러나, cdh5-MO 배아는 혈류의 결함, 및 L-NAME 매개된 NOS 억제에도 불구하고 HSC를 생성시킨다. 따라서, HSC 형성을 조절하는 데 교차 작용할 뿐만 아니라 장기 (LT) 자가 재생 HSC를 발달시키는 데 효용을 갖는 생체역학적 힘, 기계감응형 경로, 및 후성유전학적 기전을 확인하는 것이 중요하다.

심박동은 혈관에 맥동을 발생시킴으로써 순환을 선행하고 촉발시킨다. 그러나, 순환의 부재에서 혈관의 대동맥 내피 내막으로부터의 HSC 형성에 있어서 심박동-매개 생체역학적 힘의 직접적인 역할은 여전히 알려지지 않았다. 맥동은 혈관의 생체역학적 신장을 일으키고, 기계감응형 수용체, 예컨대, 일시적 수용체 전위 (TRP) 채널, 피에조 채널, 데제네린/내피 나트륨 채널 (DEG/ENaC), 및 K1-패밀리 구성원을 활성화시킨다. 그러나, 맥동 또는 기계감응형 수용체 활성화가 HSC 형성을 자극할 수 있는 지는 알려져 있지 않다. Lis 등의 문헌[Lis R, et al. Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells Nature 2017] 및 Sugimura 등의 문헌[Sugimura et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells Nature 2017]에서 인간 동형유전자 내피 세포를 HSPC로 전환시키는 방법이 입증되어 있지만, 이들의 내피 후성유전적 지형을 영구적으로 지워 LT-HSC가 될 수 있는 기전은 알려져 있지 않다.

본원에 개시된 바와 같이, 본 개시는 Piezo1 기계감응형 경로의 심장박동 및/또는 맥동-매개 생체역학적 신장 및/또는 약리학적 활성화가 Dnmt3b 발현을 향상시키고, 이에 의해 내피 유전학적 지형을 지워 HSC (예를 들어, LT-HSC)를 형성시키는 방법을 입증한다. 또한, 맥동-유사 조건을 모사하는 생물반응기가 개발되었고, LT-HSC 형성을 자극하고 확장하기 위한 약리학적 표적으로 Piezo1이 확립되었다.

내피에서 HSC로의 전이를 자극하는 심박동-매개 맥동

비편향 제브라피쉬 에틸니트로소우레아 (ENU) 돌연변이유발 스크린은 카드헤린-5 (cdh5, ve-cdh)에 대한 제브라 피시돌연변이체인 말벡 (bw209^mlb)을 생성시켰다. 말벡 및 cdh5-몰판트 (MO) 배아는 순환계 결함에도 불구하고 정상의 원시적 및 결정적 조혈을 나타낸다.

내피에서 HSC로의 전이를 자극하는 혈류 및 전단 응력-독립적 생체역학적 힘을 확인하기 위해, cdh5-결핍 배아에서 혈관뿐만 아니라 심장의 기능과 해부학을 분석하였다.

먼저 제브라피쉬 배아의 2-챔버 심장의 심방에 형광 덱스트란 비드를 주입함으로써 미세혈관조영술을 수행하고, 덱스트란 비드를 이후 순환에서 추적하였다. 형광 덱스트란 비드가 방실 (AV) 판막 및 심실을 통과하여 대조 배아에서 일반 순환에 들어가는 동안, cdh5-몰판트 배아의 심방에서 이들을 포집하였다.

심장의 구조를 검사하기 위해, 대조군으로부터 심장을 분리하고, cdh5-침묵 배아 및 면역조직화학을 내피 내막 (gfp) 및 심근 세포 (mf20)에 대해 수행하였다. 심방 (A), 방실 (AV) 판막, 심실 (V) 및 유출관 (OT)이 cdh5-몰판트에서 형성되었지만, AV 판막은 길어지고 비틀어진 것으로 밝혀졌다.

cdh5-침묵 배아에서 순환이 손상된 이유를 조사하기 위해, 혈관 구조뿐만 아니라 cdh5-침묵 배아에서 혈액 순환, 심박수, 심장 박출량, 및 심장 눌림증을 분석하였다.

내피 내막의 온전성을 mlb x kdr:dsRED 배아에서 분석하였다. cdh5-결핍된 배아에서는 동맥과 정맥 둘 모두의 구조는 온전한 것으로 밝혀졌다.

심장, 심박동, 혈관, 혈액 순환, 및 HSC 형성의 시간적 발달은 제브라피시, 마우스, 및 사람에서 보존된다. 제브라피쉬 발달 동안, 심장은 수정 후 약 23 시간 (hpf)에 박동하기 시작하고, 혈액 순환은 약 24 내지 26 hpf에서 시작되며, 30 내지 48 hpf 사이의 AGM 영역에서 동형유전자 내피 세포로부터 결정적 HSC가 나타난다.

심박동이 시작되기 전 및 후의 혈관에서의 순환을 분석하기 위해, 대조군 및 cdh5-침묵 lcr:eGFP x flk1:mCherry 배아에서 시간-경과 공초점 영상화를 수행하였다.

lcr:eGFP⁺ 적혈구는 심장이 박동하기 시작한 후에도 cdh5-침묵 배아의 혈관에서 축적된 것으로 밝혀졌는데; 이는 심장박동의 개시 및 혈관의 형성에도 불구하여 cdh5-몰판트에서 활동적인 순환의 부재를 입증하는 것이다.

cdh5-침묵 배아에서 심장의 기능을 검사하기 위해, 전기생리학 및 심초음파 검사를 수행하였다. cdh5-MO 배아에서 심박수는 대조군과 비슷했지만, cdh5-MO 배아에서 박출량은 눌에 가까웠다. 따라서, cdh5-MO 배아에서 심박출량 (= 박출량 X 심박수)이 손상된 것으로 확립되었다.

cdh5-MO 배아는 심장 공동에 심낭 부종이 있었는데, 이는 심장에서 혈액의 역류에 기인할 수 있다. 심낭강에 체액이 축적되면 심실 운동의 감소 및 후속적인 혈역학적 손상이 초래된다. 심장 눌림증이 심낭강내 체액 축적의 인자인지 알아보기 위해, cdh5-MO 배아의 심강을 심낭천자에서와 같이 천공한 후, 심낭액을 흡인하여 심장의 체액압 축적을 감소시켰다. 그러나, cdh5-몰판트 심장의 심박출량 결핍은 구조할 수 없었다.

cdh5-몰판트에서 심장박동은 정상이었지만, 심장의 구조적 결함으로 인해 심박동이 손상되어 심낭강내 혈액 축적을 초래하였다. cdh5-MO 배아는 정상적인 조혈을 갖기 때문에, 심장박동-유래 생체역학적 힘은 활동적인 순환의 부재에서 HSC 형성에 영향을 미치는 것으로 가정되었다.

cdh5-MO 배아는 심박동이 있고 활동적인 순환이 없지만, 이들은 이들의 혈관의 대동맥 내피에 HSC가 형성된다. 대조군 제브라 피쉬 배아의 AGM을 확대했을 때, 혈관의 별개의 맥동이 주목되었다. 순환하는 혈액 세포 및 아마도 혈류와는 무관한 혈관의 맥동의 존재를 구별하기 위해, 혈관의 맥동 빈도를 순환 혈액 세포의 맥동 빈도 및 혈류로 인한 운동과 비교하였다. 특히, flk1:flk1:mCherry⁺ 혈관 내에서 순환하는 lcr:eGFP⁺ 적혈구가 있는 이중 전이유전자 라인의 시간-경과 공초점 영상화, 뿐만 아니라 혈관과 순환 혈액 세포 둘 모두로부터의 신호에 대한 푸리에 분석을 수행하였다. 혈관의 빈도 스펙트럼은 별개의 피크를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 혈관의 맥동과 혈류는 공존하지만, 이들의 존재 및 성질은 서로 무관하다.

36 hpf에서 AGM에서 맥동의 시간적, 공간적, 기능적 존재를 조사하기 위해, 대조군 제브라피쉬 배아에서 혈관 영역의 광 시트 현미경 검사 그리고 이어서 푸리에 분석을 수행하였다. 데이터는 AGM이 36 hpf에서 별개의 맥동 빈도를 갖고 있다는 것을 더욱 확증했는데; 이는 flk1:eGFP⁺ 내피 세포에서 생성되는 runx1:mCherry⁺ HSPC의 시간-경과 공초점 영상화로 보여지는 바와 같이 내피에서 조혈로의 전이에 대한 시간 및 위치이다. 종합하면, AGM 영역은 맥동하는 것으로 밝혀졌으며, AGM의 맥동은 내피에서 조혈로의 전이와 동시에 발생한다.

혈관은 심장박동-매개 혈압 및 혈류로 인해 일정한 기계적 부하 하에 있는데, 이는 원주 벽 응력 및 내피 전단 응력을 일으킨다. 혈류가 내피 세포에 전단 응력을 가하고 혈관 확장을 유도하는 반면, 심장박동-매개 맥동은 원주형 신장을 발생시키고, 내피 세포와 평활근 세포 둘 모두에 기계적 팽창을 일으킨다.

cdh5-MO 배아가 혈류- 및 전단-응력 매개 NOS 활성화를 통해 HSC를 형성하는지 또는 이와는 무관한지를 분석하기 위해, 대조군 및 NOS 억제제인 L-NAME로 처리된 cdh5-MO 배아에서 HSPC 발현을 분석하였다. NOS의 억제는 대조군 배아에서 HSPC 형성을 약화시키지만, cdh5-MO 배아에서는 HSPC 형성에 영향을 미치지 않는 것으로 입증되었다. 따라서, cdh5-MO 배아는 NOS 활성화에 무관하게 HSC를 형성시킨다.

모두 종합하면, 심장박동-매개 맥동은 순환과 무관하게 내피에서 HSC로의 형성을 자극한다.

신장을 통해 HSC 형성을 위한 Piezo1 활성화

생체역학적 힘이 세포 모양 및 운명 전이를 자극하기 때문에, 동형유전자 내피의 맥동-매개 주기적 신장은 HSC 형성을 자극하는 것으로 가정되었다.

내피에서 HSC로의 형성에서 맥동의 기능을 시험하기 위해, E11.5 마우스 배아로부터 채취된 AGM 세포에 대한 사이클릭 스트레인을 가할 수 있는 생물반응기를 개발하였다(도 2a, 상단 패널). 조혈성 집락 형성 및 흐름 분석 검정에 따라, 10% 사이클릭 스트레인이 다분화능 조혈 전구 세포의 형성을 강화하는데, 이는 신장-활성화된 수용체 (SAR)의 GdCl₃-매개 팬-약리학적 억제에 의해 약화된다는 것이 입증되었다. GdCl₃은 또한 sih-MO 배아의 수준으로 제브라피쉬 배아의 HSPC 발현을 약화시켰다.

SAR 패밀리 구성원은 다음 네 개의 하위-카테고리를 갖는다: K1-패밀리 구성원뿐만 아니라 피에조, TRP, 및 DEG/ENaC 채널. 조직 발현 및 컴퓨터 분석은 내피 및 조혈 조직에서 Piezo1 및 Trpv4를 표시하고, 이에 따라 내피에서 HSC로의 전이에서 이들의 역할을 시험하였다.

trpv4 및 Piezo1의 기능 손실 분석 및 약리학적 억제는 HSPC 마커 발현 및 내피에서 HSC로의 전이를 없앴다(도 1a). 반대로, trpv4 또는 Piezo1의 약리학적 활성화는 대조군 배아에서 HSPC 마커 발현을 향상시키고, sih-배아에서 HSPC 발현을 구조하였다. 시간적 및 공간적 분석 시, 36 hpf에서 제브라피쉬 배아의 AGM 영역에서 trpv4가 검출되지 않은 반면, Piezo1은 E11.5 AGM에서 Cd31 (내피) 및 c-Kit (조혈)과 공동국소화되었다.

신장-매개 HSC 형성에 기초가 되는 분자 기전을 확실히 하기 위해, Piezo1의 사이클릭 스트레인 또는 약리학적 활성화제로 처리된 AGM의 전반적인 전사체 분석을 수행하였다. 사이클릭 스트레인 및 Piezo1 활성화는 유사한 유전자 서명을 생성시킨 것으로 밝혀졌다(도 1b).

Piezo1의 약리학적 활성화는 다분화능 조혈 전구 세포 형성을 더욱 강화한 반면(도 1c), Piezo1의 약리학적 억제는 HSPC 형성의 사이클릭 스트레인-매개 유도를 약화시켰다(도 1d). 종합하면, 사이클릭-스트레인-매개 생체역학적 신장은 Piezo1로 하여금 내피에서 HSC로의 전이를 자극하도록 활성화시킨다.

생체역학적 신장 또는 Piezo1 활성화에 의한 LT-HSC 생성

사이클릭 스트레인 또는 피에조1 활성화가 장기적인 자가-재생 HSC (LT-HSC)를 생성시키는 지를 분석하기 위해, 연속 이식 검정을 수행하였다. 사이클릭 스트레인 또는 Piezo1 활성화제 처리 AGM의 1 차 이식은 더 높은 생착 및 정상적인 다계통 재구성을 나타냈다(도 2a, 도 2b). 또한, 사이클릭 스트레인 또는 Piezo1 활성화제 처리 AGM으로 이식된 1차 수여자의 골수는 1- 내지 3-배 더 많은 양의 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺Cd48^-Cd150⁺ HSC를 나타냈다. 1차 수여자-유래 분류 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺ HSPC를 면역손상된 2차 수여자에게 이식하는 것은 또한 더 높은 생착 및 정상적인 다계통 재구성을 야기하였다(도 2c, 도 2d). 따라서, 사이클릭 스트레인 및/또는 Piezo1 활성화 둘 모두는 더 많은 양의 정상 LT-HSC를 생성시킨 것으로 예측되었다. 이러한 가정을 시험하기 위해, 등급이 지정된 양의 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺ HSPC를 면역손상된 3차 수여자에게 이식함으로써 한계 희석 검정을 수행하였다. 3차 이식 분석에 따라, 사이클릭-스트레인은 2-배 내지 3-배 더 많은 양의 LT-HSC를 생성시켰다는 것이 입증되었다.

AGM-HSC (공여자)가 성인 정상 혈액에 생착되고 재구성되는지 조사하기 위해, 재구성된 혈액 계통의 분자 특징 및 기능 특성을 이후 대조군, 사이클릭 스트레인 또는 피에조 1 활성화제 처리 AGM이 이식된 1차 수여자에서 분석하였다. 골수에서 공여자-유래 적혈구계 세포의 분석은 Cd71⁺/Ter119⁺ 발현뿐만 아니라 Bcl11a의 존재에서 배아 글로빈을 소비하면서 성인 글로빈 마커의 향상된 발현을 나타냈다(도 3a). 골수 및 혈청에서 공여자-유래 골수 세포에 대한 추가 분석은 충분한 양의 Gr1⁺/Mac1⁺ 골수 세포, 뿐만 아니라 이들의 골수세포형과산화효소 (MPO)의 생산을 나타냈다(도 3b). 다음으로, 림프절, 흉선, 및 비장에서 공여자-유래 키메라증, Mac1⁺ 골수 세포, Cd19⁺ B 세포, 뿐만 아니라 Cd4⁺/Cd8⁺ T-세포의 분석에 따라, 공여자 HSC-유래 전구 세포는 조혈 니치 (hematopoietic niche)에서 순환하고 집락화되어 성인 혈액 계통으로 재구성되었다는 것이 입증되었다. 1차 이식-유래 혈청의 분석 시, 또한 이들은 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgA 및 IgM과 같은 사전-면역화된 면역글로불린 (Ig)의 정상 레퍼토리를 생성시킨 것으로 밝혀졌다(도 3c). 비장으로부터의 공여자-유래 Cd3⁺ T 세포의 분류에 따라, 비장으로부터의 공여자-유래 Mac1⁺ 골수 세포 (음성 대조군)에는 없었던 T-세포 수용체 β (TCR β) 재배열이 입증되었다(도 3d). 1차 이식에서 T-세포의 기능적 특성을 분석하기 위해, 지연형 과민성 검정을 수행하였는데, 양 적혈구 주사로 1차 이식을 감작함으로써 발바닥에서 항원-특이적 기능 T-세포의 성공적인 모집을 입증되었다(도 3e). 따라서, AGM 또는 동형유전자 내피 세포의 사이클릭 스트레인 또는 Piezo1 활성화로 생성된 HSC는 조혈 니치에서 생착되고 기능성 다계통 성인 혈액으로 재구성되었다.

생체역학적 신장 및 Piezo1 활성화로 내피에서 HSC로의 전이를 위한 Dnmt3b를 상향조절.

AGM은 이질적인 조직이기 때문에, 신장-매개 Piezo1 활성화가 HSC로의 대동맥 내피 세포 운명을 어떻게 자극하는 지는 불분명했다. E10.5 AGM-분류 내피 세포, 동형유전자 내피 세포, 및 HSC의 차등적인 유전자 발현 서명이 생성되었다. AGM-유래 내피 세포, 동형유전자 내피 세포, 및 HSC의 맥락에서 AGM의 사이클릭 스트레인 또는 Piezo1 활성화 시 유래된 유전자 서명의 계층적 클러스터링은 과발현된 생물학적 과정, 분자 경로, 유전자 발현 클러스터, 및 이들의 유전자 온톨로지 (gene ontology: GO) 측면의 정량적 개요를 추가로 제공하였다. 내피에서 HSC로의 전이 동안 상향조절된 사이클릭 스트레인 및/또는 Piezo1 활성화-매개 유전자의 벤 다이어그램 분석으로 Dnmt3b를 HSC 형성에 필요한 내피 기관의 침묵을 담당하는 잠재적인 후보 기전으로 확인하였다(도 4). 추가로, Gimap6은 또한 HSC 형성에 필요한 내피 기관의 침묵을 담당하는 잠재적인 후보 기전으로 확인되었다.

생물정보학 및 컴퓨터 분석을 검증하기 위해, E11.5 AGM에서 Dnmt3b의 시간적 및 공간적 단백질 발현을 분석하였다. 면역조직화학 검정에 따라 Dnmt3b는 Cd31⁺ 내피 및 c-Kit⁺ 조혈 세포와 공존한다는 것이 입증되었다. 따라서, Dnmt3b는 내피에서 HSC로의 전이를 자극할 수 있는 것으로 가정되었다.

Dnmt3b 및 Dnmt3a는 매우 상동성이고 HSC 유지 또는 분화에서 별개의 기능을 갖고 있지만, AGM에서의 내피에서 HSC로의 잠재적 역할은 알려져 있지 않다. 유전자 서명 및 조직 발현 분석은 AGM에서 HSC 형성에 있어서 임의의 Dnmt3a 관여를 배제하였다. Dnmt3b 및 Dnmt3a의 별개 또는 중복 동형유전자 역할(들)을 구별하기 위해, Dnmt3b 및 Dnmt3a 단백질 수준을 사이클릭 스트레인- 또는 Yoda1-처리 AGM 세포의 핵 분획에서 분석하였는데, 사이클릭 스트레인 또는 Piezo1 활성화가 E11.5 AGM 세포에서 Dnmt3a가 아니라 Dnmt3b 단백질 발현을 자극한다는 것이 확립되었다(도 5a).

혈류의 부재에서 혈관의 맥동이 Dnmt3b 활성화를 통해 HSC 형성을 자극하였는지의 여부를 분석하기 위해, 나나오마이신, Dnmt3b 억제제로 처리된 cdh5-MO 배아에서 HSPC 마커 발현을 측정하였다. Dnmt3b의 약리학적 억제는 대조군 및 cdh5-MO 배아에서 HSPC 마커 발현을 약화시켰다.

다음으로, 이러한 실시예의 실험으로 생체역학적 신장 또는 Piezo1 활성화가 Dnmt3b 활성화를 통해 내피에서 조혈로의 전이를 자극하였는지의 여부를 분석하였다. Dnmt3b의 억제는 다분화능 조혈 전구 세포 형성 (도 5b)뿐만 아니라 내피에서 조혈로의 전이 (도 5b)의 생체역학적 신장- 또는 Piezo1 활성화-매개 유도를 약화시킨 것으로 밝혀졌다. 나나오마이신 처리는 조혈 세포를 표현형 내피 세포로 복구시키지만, 그러한 내피 세포는 기능성이지 않았다. HSPC 마커의 홀 마운트 인 시튜 혼성화, 뿐만 아지라 Yoda1로의 병용 처리 또는 비처리와 함께 나나오마이신-처리 또는 dnmt3b-MO-주사 제브라피쉬 배아에서 내피에서 HSC로의 전이에 대한 시간-경과 영상화는 dnmt3b의 억제 또는 손실이 HSC 형성에서 Piezo1 활성화-매개 증가를 약화시켰다는 것을 추가로 입증하였다(도 5c). 종합하면, 맥동-매개 Piezo1 활성화는 AGM에서 Dnmt3b 발현을 향상시켜 내피에서 HSC로의 전환을 자극하였다.

인간 iPSC로부터 생산된 HE 세포로부터의 HSC 생성

배아체 및 동형유전자 내피 분화를 문헌[Sugimura et al. 2017; Ditadi et al. 2015]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, hiPSC 집락을 37℃에서 5 분 동안 0.05% 트립신으로 해리하고, PBS + 2% FBS로 세척하고, L-글루타민 (2mM), 페니실린/스트렙토마이신 (10ng/ml), 아스코르브산 (1mM), 인간 홀로-트랜스페린 (150 μg/ml, Sigma T0665), 모노티오글리세롤 (MTG, 0.4mM), BMP4 (10 ng/ml) 및 Y-27632 (10 μM)가 보충된 StemPro-34 (Invitrogen, 10639-011)에 재현탁시켰다. 스페로이드 형성을 위해 5 백만 개의 세포를 10 cm 접시 (Ezsphere, Asahi Glass)에 시딩하였다. 1 일에, bFGF (5 ng/ml) 및 BMP4 (10 ng/ml)를 배지에 첨가하였다. 2 일에, SB431542 (6 μM), CHIR99021 (3 μM), bFGF (5 ng/ml), 및 BMP4 (10 ng/ml)가 보충된 StemPro-34로 배지를 교체하였다. 3 일에, VEGF (15 ng/ml) 및 bFGF (10 ng/ml)가 보충된 StemPro-34로 배지를 교체하였다. 6 일에, bFGF (5 ng/ml), VEGF (15 ng/ml), 인터류킨 (IL)-6 (10 ng/ml), IGF-1 (25 ng/ml), IL-11 (5 ng/ml), SCF (50 ng/ml) 및 EPO (2IU)가 보충된 StemPro-34로 배지를 교체하였다. 세포를 5% CO₂, 5% O₂ 및 95% 습도 인큐베이터에서 유지하였다. 모든 사이토카인은 Peprotech로부터 구매하였다.

CD34+ 세포를 단리하기 위해, 배아체 (8 일부터)를 0.05% 트립신으로 해리하고, 70μm 스트레이너를 통해 여과하고, CD34⁺ 세포를 CD34 자기 비드 염색으로 분리하고, 후속하여 LS 컬럼 (Miltenyi)에 통과시켰다. 모든 배치의 샘플을 FACS에 의해 시험하여 패널로 이의 순도를 검증하였다. 다음 항체들을 사용하였다: CD34-PEcy7 (클론 581; Biolegend), FLK1-PE (클론 # 89106; BD), 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI).

단리된 CD34⁺ 세포를 Y-27632 (10 μM), TPO (30 ng/ml), IL-3 (10 ng/ml), SCF (50 ng/ml), IL-6 (10ng/ml), IL-11 (5 ng/ml), IGF-1 (25 ng/ml), VEGF (5 ng/ml), bFGF (5 ng/ml), BMP4 (10 ng/ml), 및 FLT3 (10 ng/ml)을 함유하는 StemPro-34 배지에 재현탁시켰다(Ferrel et al 2015). 세포를 박층 매트리겔-코팅 24-웰 플레이트 상에 웰 당 50,000 개 세포의 밀도로 시딩하였다. 시딩 1 일 후, Yoda1 (6.25 내지 100 μM)을 배양물에 첨가하였다. 7 일 후, 부유 세포를 수집하고, FACS 분석을 수행하였다. FACS 분석 후, 세포를 CD34-PEcy7 (클론 581; Biolegend) 및 CD45-APC (클론 2D1; Biolegend)로 염색하였다. 모든 사이토카인은 Peprotech로부터 구매하였다.

Yoda1은 인간 iPSC-유래 HE 세포에서 내피에서 조혈로의 전이를 유도하였다(데이터 미도시). 이러한 효과는 용량 의존적이었다.

결론

장기간 HSC의 발달, 확장, 및 유지는 줄기 세포 생물학 및 조혈에서 이루어지기 쉽지 않은 목표였다. 제브라피쉬의 시간-경과 공초점, 광 시트, 푸리에 변환 분석을 기초로 할 때, 혈관의 맥동을 시뮬레이션하는 확장 가능한 생물 반응기가 확립되었을뿐만 아니라, Piezo1 활성화가 내피 세포를 LT-HSC로 변환하는 약리학적 표적으로 확인되었다. 본 연구는 연속 이식 시 다계통, 기능성, 성인 혈액으로 생착하고, 자가-재생하고, 재구성할 수 있는 LT-HSC를 개발하는 새로운 전이유전자-비함유 접근법을 제공한다.

심장박동-매개 맥동은 원주형 신장을 생성시키고, 내피 세포와 평활근 세포 둘 모두에 기계적 팽창을 야기하였다. 그러나, Piezo1은 혈관의 혈관 평활근 세포가 아니라 E11.5 AGM에서 내피 세포와 조혈 세포 사이에 공동-발현되었는데, 이는 생체역학적 신장 및 Piezo1 활성화의 동형유전자 역할이 AGM-내피에 고유하다는 것을 시사하였다.

혈관의 생체역학적 신장은 Piezo1, Trpv4, K1-패밀리 구성원뿐만 아니라 DEG/ENaC 채널을 활성화할 수 있었다. Piezo1과 Trpv4 활성화 둘 모두는 내피에서 조혈로의 전이를 자극하였다. 그러나, Piezo1 억제는 신장-매개 동형유전자 효과를 약화시켰는데, 이는 Piezo1 및 Trpv4가 부분적으로 불필요한 역할을 할 수 있다는 것을 시시하였다.

Dmnt3b 활성화는 내피 기관을 침묵시켜 HSC에 자가-재생 및 다계통 재구성 능력을 부여하였다. Dnmt3b의 억제는 조혈 세포를 표현형 내피 세포로 복구시키지만, 이러한 세포들에는 기능적 내피 특성이 결여되었다. 이는 내피에서 조혈로의 전이에서 Dnmt3b의 시간적 및 공간적 역할이 비가역적이었다는 것을 시사하였다. 생체역학적 신장 또는 Piezo1 활성화는 Dnmt3a 발현에 영향을 미치지 않으면서 Dnmt3a의 시간적 및 공간적 발현을 향상시켰다. 데이터는 HSC 발달 및 분화 동안 Dnmt3b의 동형유전자 역할과 Dnmt3a의 백혈병 역할 사이의 차이를 입증해 주었다.

본원에 개시된 결과는 생체역학적 힘이 어떻게 세포 운명 전이를 자극하고 후성유전학적 기관을 호출함으로써 줄기 세포에 대한 자가-재생 능력을 부여하는 지를 입증한다. 본 연구는 또한 다능성 줄기 세포 (PSC) 또는 공여자 세포-유래 내피 세포 또는 동형유전자 내피 세포로부터 LT-HSC를 얻는 플랫폼을 제공한다. 목표는 만능 적합 HSC를 개발하는 것이지만, 본원에 개시된 생물학적영감 생물반응기는 만능 적합 전이유전자-비함유 공급 세포가 양성 및 악성 혈액, 대사, 면역, 및 골수 질환이 있는 환자를 치료하는 데 이용 가능한 경우에 디딤돌이 된다.

재료 및 방법

모든 절차는 브리검 및 여성 병원 및 보스톤 아동 병원의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인받았다.

구매한 마우스는 The Jackson Laboratory로부터 Cd45.2 (C57BL6/J) 및 Cd45.1 (SJL), 그리고 GeneTools로부터 제브라피쉬 모르폴리노였다. 제브라피쉬 심장의 심방에 형광-표지 덱스트란 염료를 주사함으로써 미세혈관조영술을 수행하고, 이의 통과를 라이브 영상화를 이용하여 기록하였다. 제브라피쉬 심장 및 마우스 AGM의 면역염색을 도립 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 제브라피쉬 배아에서 심장 눌림증, 심박수, 및 펄스 주파수를 명시야 영상화 또는 시간-경과 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다. 혈관에서 적혈구의 이동뿐만 아니라 시간-경과 공초점 영상화를 이용하여 제브라피쉬 전이유전자 배아에서 내피에서 HSC로의 전이를 분석하였다.

Flexcell FX-4000 기계를 사용하여 시험관내에서 맥동하는 혈관 유사 상태를 자극하였다. 내피에서 HSC로의 전이를 조절하는 데 있어서의 약리학적 표적의 역할을 분석하기 위해, 마우스 배아-유래 AGM 또는 전체 마우스 배아를 생체역학적 신장, 화학물질, 또는 약물로 생체외 노출시켰다. 다음으로, StemCell M3434 배지에서 7 일 동안 마우스 AGM-유래 세포를 인큐베이션함으로써 조혈 집락 형성 검정을 수행하였다. 치사량으로 조사된 SJL 마우스에서 AGM-유래 HSC의 연속 이식을 수행하였다. 생체역학적 신장 시 줄기 세포 빈도를 한계 희석 검정을 이용하여 분석하였다. 1차 이식에서 AGM-HSC-유래 혈액 세포의 특성을 특징화하기 위해, FACS를 사용하여 키메라증 및 재구성 비율을 측정하고, 정량적 역전사효소-PCR을 사용하여 글로빈 전사체를 분석하고, PicoKine ELISA 키트를 사용하여 골수세포형과산화효소 양을 측정하고, TCR-β 재배열을 TCR-β 유전자좌에 대한 PCR을 사용하여 분석하고, Thermo-Fisher 마우스 Ig 이소형화 키트를 사용하여 사전-면역 IG 검출을 분석하고, 사전감작된 마우스의 발바닥에 양 RBC (Rockland Immunochemicals)를 주사함으로써 지연형 과민성을 분석하였다.

사이클릭 스트레인 또는 약리학적 조절제로 처리된 마우스 AGM에서 유전자 발현 패턴을 측정하기 위해 RNA-시퀀싱 분석을 수행하였다. 연산 알고리즘을 사용하여, 차등 발현된 유전자의 계층적 클러스터링을 수행하고, 또한 이들의 과대표현된 생물학적 과정 및 경로를 측정하였다. 차등 발현된 유전자의 유전자 발현 클러스터를 분석하고, 세포 집단에 걸친 이들의 평균 발현 수준을 비교하였다. 다음으로, 사이클릭 스트레인- 또는 약리학적 조절자(들)-매개된 내피에서 HSC로의 전이에 중요한 후보(들)를 분석하도록 상위 및 하위 유전자의 벤 비교를 구성하였다. 또한, EqiQuick 검정 키트를 사용하여 마우스 AGM 세포의 핵 분획에서 Dnmt3b 및 Dnmt3a 단백질 발현을 분석하였다. 데이터는 달리 언급되지 않는 한 평균 ± s.d.로 제시된다. 대응표본 또는 비대응표본 스튜던트 t-검정에 의해 통계 분석을 수행하였다. 유의성은 P < 0.05로 설정되었다.

동물

야생형 AB, 캐스퍼, 및 전이유전자 제브라피쉬 라인 lcr:eGFP, flk1:mCherry, flk1:eGFP, cd41:eGFP을 실험에 사용하였다. 배아를 4 일 pf까지 사용하였다. The Jackson Laboratory로부터의 Cd45.2 (C57BL6/J) 및 Cd45.1 (SJL) 마우스를 실험에 사용하였다.

모르폴리노

모르폴리노 안티센스 올리고를 입수하고(Gene Tools; 하기 서열), 1-세포 단계 캐스퍼 제브라피쉬 배아에 주사하였다. 주사 및 비주사 배아를 고정할 때까지 28℃에서 E3 배지에 인큐베이션하였다.

cdh5-MO (5'-TACAAGACCGTCTACCTTTCCAATC-3'; SEQ ID NO:1)

sih-MO (5'-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3'; SEQ ID NO:2)

Piezo1-MO (5'-CAAAGTTCAGTTCAGCTCACCTCAT-3'; SEQ ID NO:3)

dnmt3bb.1-MO1 (5'-TTATTTCTTCCTTCCTCATCCTGTC-3'; SEQ ID NO:4)

dnmt3bb.1-MO2 (5'-CTCTCATCTGAAAGAATAGCAGAGT-3'; SEQ ID NO:5)

배아의 화학적 처리

제브라피쉬 배아를 E3 피쉬 배지에서 다음 화학적 조절자로 처리하였다: 100 uM L-NAME (Fisher Scientific), 50 uM 디지톡시게닌 (Sigma), 25 내지 50 uM Yoda1 (Cayman Chemical), 1 uM 나나오마이신 (Nana; Fisher Scientific), 100 uM 가돌리늄 클로라이드 (GdCl₃; Sigma), 5 내지 10 uM 4α-포르볼 12, 13-디데카나오트 (4Αpdd; Sigma), 또는 GSK205 (10uM).

미세혈관조영술

형광 염료-표시 덱스트란 비드를 대조군과 cdh5-MO 배아의 심방에 주사하고, Nikkon SMZ1500 스테레오 현미경을 사용하여 실시간 명시야 비디오를 캡쳐하였다.

심박수 및 심박출량

라이브 제브라피쉬 심장의 이미지를 통합 백열등 및 512x480 픽셀 그레이스케일 이미지 센서가 구비된 FastCam-PCI 고속 디지털 카메라 (Photron)를 사용하는 5 배 대물 렌즈가 장착된 Axioplan (Zeiss) 직립 현미경에서 획득하였다. 이미지는 초당 250 프레임으로 얻고, 조건 당 1088 프레임 ('8 심장 주기)을 획득하였다. 사용자 지정 소프트웨어 (MATLAB에서 구현됨)를 사용하여 순차적 이미지 파일에서 심박수를 결정하였다. ImageJ를 사용하여 각 비디오에 대해 이완기와 수축기 둘 모두에서 심실 장축 및 단축을 수동으로 측정하고, 표준 기하학적 가정을 이용하여 챔버 부피를 추정하는 데 사용하였다. 심박출량을 모노폴리노 용량 당 적어도 10 개의 배아에 대해 이완기에서 수축기 심실 부피를 빼고 심박수를 곱하여 측정하였다(Shin et al., 2010).

주기성 분석

제브라피쉬 캐스퍼 배아를 트리카인 (Sigma)이 있는 0.8% 저융점 아가로즈에 포매하고, 페트리 디쉬에 마운팅하였다. 다음으로, NIS Elements (Nikon) 소프트웨어가 장착 된 Nikon SMZ1500 스테레오현미경을 사용하여 AGM 영역에서 맥동하는 혈관의 실시간 명시야 비디오를 캡쳐하였다. 비디오를 사용하여 혈관의 펄스 주파수를 정량화하였다.

명시야 라이브 영상화

명시야 라이브 영상화를 수행하기 위해, 제브라피쉬 캐스퍼 배아를 트리카인 (Sigma)이 있는 0.8% 저융점 아가로즈에 포매하고, 페트리 디쉬에 마운팅하였다. NIS Elements (Nikon) 소프트웨어가 장착된 Nikon SMZ1500 스테레오현미경을 사용하여 실시간 명시야 비디오 및 또한 이미지를 캡쳐하였다.

공초점 현미경

cd41:eGFP를 flk1:mCherry 제브라피쉬와 그리고 flk1:mCherry를 lcr:eGFP 제브라피쉬와 교배하고, 이들의 전이유전자 배아에서 모르폴리노를 주사하였다. 전이유전자 배아를 저융점 아가로스에 마운팅하고, 스피닝-디스크 공초점 현미경을 사용하여 30 내지 42 hpf에서 flk1⁺ 내피로부터 생성되는 cd41:eGFP⁺ HSC의 시간-경과 공초점 영상화를 수행하였다. lcr:eGFP⁺ 적혈구의 상대 이동을 flk1:mCherry⁺ 내피의 맥락에서 분석하였다. Imaris (Bitplane) 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행하였다.

홀-마운트 인 시튜 혼성화

홀 마운트 인 시튜 혼성화를 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다.

심장 눌림증

미세주사 니들을 사용하여 심낭을 천공하고, cdh5-MO-주사 제브라피쉬 배아의 심장 주위에 축적된 체액을 48 hpf로 방출하였다.

면역염색

E10.5 키메라 마우스 배아를 채취하고, 수행된 횡단면의 파라핀 블록에 포매하고, 1차 항체 Piezo1 (토끼 항-마우스 IgG; Abcam), Cd31 (당나귀 항-마우스 IgG; R&D Systems), c-키트 (토끼 항-마우스 IgG, R&D Systems) 또는 Dnmt3b (당나귀 항-마우스 IgG, Abcam), 및 4,6 디아미노-2-페닐인돌 (DAPI) 항체뿐만 아니라 2차 항체 Alexa Fluor 488 (당나귀 항-토끼 IgG; Fisher Scientific) 및 Alexa Fluor 647 (당나귀 항-염소 IgG; Abcam)으로 면역염색하여 E10.5 AGM 영역에서 이들의 발현을 검출하였다.

대조군 및 cdh5-MO 침묵 제브라피쉬 배아로부터 단리된 심장에서 flk1 (GFP), mf2 (mCherry), 밀 DAPI (보라색)의 발현을 측정하였다.

AGM 외식편

C57BL6/J Cd45.2 마우스 배아로부터 E11.5 AGM을 채취하고, 세포의 3-배아 등가물의 단일 세포 현탁액을 BioFlex 6-웰 배양 플레이트 (FlexCell)의 각 웰 상에 시딩하였다. 사이클릭 스트레인 (Flexcell® FX-4000™ Tension System)의 적용 및/또는 화학적 조절제 (25 내지 50 μM Yoda1, 1 μM 나나오마이신, 100 μM GdCl₃, 1 uM GsMTx4, 5 내지 20 μM 4αPDD, 10 uM GSK205)로의 처리와 함께 세포를 밤새 배양하였다. 다음으로, 채취된 세포를 사용하여 이식, 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석, 및 집락-형성 단위 (CFU) 검정을 수행하였다.

약물과 배아의 생체외 인큐베이션

FBS, 1 mM 글루코스, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 및/또는 선택된 화학적 조절제 (25 내지 50 μM Yoda1, 1 μM 나나오마이신, 5 내지 20 μM 4αPDD, 또는 10 uM GSK205)를 함유하는 멸균 유리 바이알에 시간-교배된 임신한 암컷의 자궁으로부터 E11.5 마우스 배아를 채취하였다. 롤러 장치 (약 30rpm 회전), 일정한 가스 공급 (21% 0₂, 5% CO₂, 균형 N₂) 및 37℃의 일정한 온도로 이루어진 생체외 인큐베이터(BTC Engineering, Cambridge, UK)에 유리 바이알을 넣었다. 24 시간 후, AGM을 채취하여 FACS 및 CFU 검정에 의해 조혈 세포의 형성을 분석하였다.

이식

1차 이식을 위해, 비처리 또는 처리 (사이클릭 스트레인 또는 25 μM Yoda1) AGM에 더하여 비장 헬퍼 세포 (마우스 당 약 500,000)의 3-배아 등가물을 레트로-오비탈 주사에 의해 치사량 조사된 (분할 용량 10.5 cGy) Cd45.1 (SJL) 마우스에 주사하였다. 2차 및 3차 이식을 위해, 이식된 마우스로부터 골수를 단리하였다(다리, 팔, 골반 뼈, 척추, 흉골). 골수를 피콜 구배 (Ficoll gradient) (Histopaque®-1083, Sigma-Aldrich) 상에 로딩하고, 버피 코트로부터의 세포를 비오틴-접합 계통 항체 및 스렙타비딘 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)와 인큐베이션하였다. 다음으로, 계통 음성 (Lin^-) 세포를 MACS LS 컬럼 (Miltenyi Biotec)으로 분리하고, 공여자 Cd45.2 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺ (LSK) 세포를 MoFlo Beckman Coulter 분류기로 분류하였다. 이어서, 분류된 Cd45.2 LSK 세포를 Cd45.1 비장 헬퍼 세포 (마우스 당 약 500,000 개)와 혼합하고, 레트로-오비탈 주사에 의해 Cd45.1 조사된 (분할 용량 10.5 cGy) SJL 마우스에 이식하였다.

생존 수여자를 한계 희석 검정에 대한 반응으로 계수하였다: 1/(줄기 세포 빈도)의 신뢰 구간은 푸아송 분포 (Poisson distribution)에 따라 ELDA에 의해 계산하였다.

CFU 및 FACS 검정

CFU 검정을 위해, AGM 외식편 또는 생체외 세포를 MethoCult GF M3434 배지 (StemCell Technologies)에 플레이팅하였다. 시딩 7 일 후, 과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵구 (GEMM), 과립구 대식세포 (GM), 과립구 (G), 대식세포 (M) 및 적혈구 (E) 집락을 만드는 이들의 능력을 분석하였다.

외식편 및 생체외 AGM 세포를 Sca1-파시픽-블루 (E13-161.7, Biolegend) 및 Flk1-APC-Cy7 (Avas 12α1, BD)로 염색하였다. 이식된 마우스로부터의 혈액을 다음 항체 칵테일로 염색했습니다: Cd45.2-파시픽-블루 (104, Biolegend), Cd45.1-FITC (A20, Biolegend), Cd3-PE (145-2C11, Biolegend), Cd8-PE (53-6.7, Biolegend), Mac1-APC (M1/70, Biolegend), Gr1-APC (108412, Biolegend), Cd19-APC-CY7(6D5, Biolegend), B220-APC-CY7 (RA3-6B2, Biolegend).

E11.5 AGM 세포가 이식된 마우스의 골수, 비장, 흉선 및 림프절로부터의 세포를 다음 항체 패널로 염색하였다: 골수 LT-HSC: Cd45.2-FITC (104, Biolegend), Ter119-비오틴 (TER-119 BD), Gr1-비오틴 (RB6-8C5, BD), Cd5-비오틴 (53-7.3, BD), Cd8a-비오틴 (53-6.7, BD), B220-비오틴 (RA3-6B2, BD), 스트렙타비딘-파시픽 블루 (eBioscience), Sca1-PE-CY7 (D7, eBioscience), cKit-APC (2B8, eBioscience), Cd48-APC-CY7 (HM48-1, BD), Cd150-PE-CY5 (TC15-12F12.2, Biolegend). 골수에서 적혈구 발달 RI-RV: Cd45.2-파시픽-블루 (104, Biolegend), Cd45.1-FITC (A20, Biolegend), Ter119-APC (TER-119, Biolegend), Cd71-PE (R17217, eBioscience). 골수 과립구: Cd45.2-파시픽-블루 (104, Biolegend), Cd45.1-FITC (A20, Biolegend), Gr1-PE, (RB6-8C5, BD); Mac1-APC (M1/70, Biolegend). 비장, 흉선 및 림프절 T 세포: Cd45.2-파시픽-블루 (104, Biolegend), Cd45.1-FITC (A20, Biolegend), Cd8-PE (53-6.7, Biolegend), Cd4-APC (RM4-5, eBioscience). 비장, 흉선 및 림프절 골수 및 B 세포: Cd45.2-파시픽-블루 (104, Biolegend), Cd45.1-FITC (A20, Biolegend), Cd19-APC-CY7(6D5, Biolegend), Mac1-APC (M1/70, Biolegend). BD Fortessa 세포 측정기에서 모든 FACS 분석을 수행하였다. 이식 16 주 후에 조혈 기관 분석을 수행하였다.

정량적 역전사효소-중합 효소 연쇄 반응 분석 (qRT-PCR)

FACS를 사용하여 AGM-이식 마우스에서 단리된 용해되지 않은 골수에서 적혈구 전구체 (Cd45.2⁺, Ter119⁺, Cd71⁺)를 분류하였다. RNAeasy 미니키트 (QIAGEN)을 사용하여 전체 RNA를 단리하고, Superscript III (Invitrogen)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 표시된 프라이머가 있는 MX3000P 기계에서 SYBR Green (QuantaBio)을 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다(Sankaran et al., 2009). 글리세르알데하이드-3-포스페이트-탈수소효소 (Gapdh)의 발현에 대해 발현을 정규화하였다(Ochida et al., 2010).

골수세포형과산화효소 (MPO) 발현

호중구 (Cd45.2⁺, Gr1⁺, Mac1⁺)는 16 주-1 차 이식 마우스의 분리된 골수로부터 분류된 FACS였고, 24-웰 플레이트에서 밤새 10% FBS (500,000 개의 세포/mL)와 IMDM에서 배양하였다. 상청액을 수집하고, 마우스 MPO/골수세포형과산화효소 PicoKine™ ELISA 키트 (Boster)를 사용하여 MPO 농도를 측정하였다. MPO 농도를 또한 혈청에서도 측정하였다.

TCR-β 재배열을 위한 PCR 검정

T 세포 (Cd45.2⁺, Cd3⁺) 및 골수 세포 (Cd45.2⁺, Mac1⁺)는 16 주-1차 이식된 마우스의 비장 세포로부터 분류된 FACS였다. 다음으로, 게놈 DNA를 추출하고, TCR-β 유전자좌 내의 DH β2.1-JH β2.7 재배열에 대해 PCR을 수행하였다. 본원의 샘플을 변성시키고(94℃, 1 분), 어닐링하고(63℃, 2 분), 35 회 사이클 동안 연장하였다(72℃, 2 분). 프라이머 서열은 다음과 같다: DH β2.1의 5': 5'- GTAGGCACCTGTGGGGAAGAAACT-3'; SEQ ID NO:6, 및 JH β2.7의 3': 5' TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT; SEQ ID NO:7(Lu et al., 2017).

사전-면역 Ig 검출

16 주-1차 이식된 마우스로부터 혈청을 분리하고, 사전-면역 Ig 이소형을 마우스 Ig 이소형화 키트 (Thermo Fisher)에 의해 정량화하였다.

지연형 과민증

이식 마우스를 피하 (등 아래) 및 진피내 주사 (오른쪽 발바닥)를 통해 양 적혈구 (sRBC, 10⁹ 개의 세포/mL, 부위 당 50 μL, Rockland Immunochemicals)로 감작하였다. 6 일간의 감작 후, 사전감작된 마우스를 왼쪽 발바닥에 2×10⁹ 개 sRBC/mL로, 오른쪽 발바닥 (대조군으로서)에 동일한 부피의 PBS로 도전하였다. 도전 48 시간 후, 마이크로-캘리퍼로 발바닥 두께를 측정하였다. 6 일 퍼센트 변화를 각 발바닥의 도전전 두께로 정규화하였다.

DNA 메틸트랜스페라제 발현

AGM 외식편의 핵 추출물을 EpiQuik 핵 추출 키트 (Epigentek Group Inc.)를 사용하여 수확하였다. Dnmt3b 및 Dnmt3a 단백질 수준을 제조업체의 지침에 따라 비색 EpiQuik 검정 키트 (Epigentek Group Inc.)를 사용하여 분석하였다. Dnmt3b 및 Dnmt3a의 농도는 1 μg의 핵 추출 단백질에 대한 것이었다.

RNAseq 및 컴퓨터 분석

RNAeasy 미니키트 (QIAGEN)로 E11.5 마우스 AGM 외식편 배양물로부터의 전체 RNA를 단리하였다(대조군, 신장, Yoda1 및 4αPDD 조건). 본원의 cDNA 라이브러리를 BGI Americas Corporation에 의해 생산하고, 레인 당 8 개의 샘플에서 HiSeq4000 장치 (Illumina)로 시퀀싱하였다. 게놈 단편-서열 뉴클레오티드 정렬 프로그램 (버전 2012-07-20)을 사용하여 본원의 시퀀싱된 서열 단편을 마우스 참조 게놈 GRCm38 (ENSEMBL 릴리스 69)에 매핑하였다. DESeq2 및 DEXSeq를 사용하여 차등 발현 (FDR = 0.1) 및 차등 엑손 사용에 대해 각각 시험하였다. 차등 발현된 유전자의 유전자 발현 클러스터를 분석하고, 세포 집단에 걸친 이들의 평균 발현 수준을 비교하였다. 다음으로, 사이클릭 스트레인- 또는 약리학적 조절자(들)-매개 내피에서 HSC로의 전이에 중요한 후보(들)를 분석하는 상위 및 하위 유전자의 벤 비교를 수행하였다. 특히, R (R Development Core Team, 2012)에서 gplots 패키지 (Warners et al., 2017)를 사용하여 부트 스트랩 분석으로 계층적 클러스터링을 수행하였다. GO 분석을 위해, 피셔의 정확 검정 (Fisher's exact test)을 사용하여 GO 카테고리 또는 경로에서 본원의 차등 발현된 유전자의 과다표현에 대하여 시험하고, 본페로니 방법을 이용하여 다중 시험에 대해 연관시켰다. 통계적으로 유의한 농축에 대해 최소로서 0.001의 P 값을 사용하여 앞서 기재된 바와 같이 GO 기간 농축 분석을 수행하였다.

통계 분석

데이터는 달리 언급되지 않는 한 평균 ± 평균의 표준 오차 (평균 ± SEM)로 제시된다. 대응표본 또는 비대응표본 스튜던트 t-검정에 의해 통계 분석을 수행하였다. 유의성은 P < 0.05로 설정되었다.

SEQUENCE LISTING <110> The Brigham and Women's Hospital, Inc. <120> METHODS FOR GENERATING HEMATOPOIETIC STEM CELLS <130> 40175-0015WO1 <140> PCT/US2019/035949 <141> 2019-06-07 <150> 62/681,982 <151> 2018-06-07 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> morpholino oligo cdh5-MO <400> 1 tacaagaccg tctacctttc caatc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> morpholino oligo sih-MO <400> 2 catgtttgct ctgatctgac acgca 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> morpholino oligo piezo1-MO <400> 3 caaagttcag ttcagctcac ctcat 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> morpholino oligo dnmt3bb.1-MO1 <400> 4 ttatttcttc cttcctcatc ctgtc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> morpholino oligo dnmt3bb.1-MO2 <400> 5 ctctcatctg aaagaatagc agagt 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer 5' of DH beta 2.1: 5' <400> 6 gtaggcacct gtggggaaga aact 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer 3' of JH beta 2.7: 5' <400> 7 tgagagctgt ctcctactat cgatt 25

Claims (32)

1. 조혈 줄기 세포 (hematopoietic stem cell: HSC)의 집단을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
   내피 및/또는 동형유전자 내피 (hemogenic endothelial: HE) 세포를 포함하는 집단을 제공하고,
   상기 HSC의 형성을 자극하기에 충분한 조건 하에 세포에서 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스페라제 3 베타 (Dnmt3b) 및/또는 GTPase IMAP 패밀리 구성원 6 (Gimap6)의 활성 또는 발현을 증가시킴을 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, HSC를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 내피 및/또는 HE 세포를 Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키는 유효량의 효능제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 효능제가 기계감응형 수용체 또는 기계감응형 채널인, 방법.
5. 제4항에 있어서, 기계감응형 수용체가 Piezo1인, 방법.
6. 제5항에 있어서, Piezo1 효능제가 Yoda1인, 방법.
7. 제6항에 있어서, Yoda1 효능제의 유효량이 5 내지 500 uM의 범위, 또는 5 내지 100 μM의 범위 내에 있는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키는 것이 Dnmt3b의 mRNA 발현을 증가시키고/거나, Dnmt3b 전이유전자 및/또는 에피솜을 도입하고/거나, 내피 및/또는 HE 세포에서 Dnmt3b 발현 요소의 유전적 변형을 도입하는 것을 포함하는, 방법.
9. 제1항에 있어서, 내피 및/또는 HE 세포가 HLA-변형 또는 HLA-눌 세포, 및/또는 전이유전자-비함유 세포로부터 유래되고, 임의로 iPS 세포 또는 체세포의 유전적 또는 화학적 유도에 의해 유래되는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 공급 세포가 대상체로부터 얻어지거나 유래되고, 상기 대상체가 임의로 만능 적합 공여자인, 방법.
11. 제10항에 있어서, 공급 세포가 혈액, 골수, 대사, 또는 면역 질환을 갖는 대상체로부터 얻어지거나 유래되는, 방법.
12. 제11항에 있어서, 대상체가 혈액 악성종양을 갖지 않는, 방법.
13. 제10항에 있어서, HSC의 집단이 수여자에게 투여되는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 공급 세포가 수여자로부터 유래된, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 장기 조혈 줄기 세포 (long term hematopoietic stem cell: LT-HSC)를 포함하는, 방법.
16. 제15항에 있어서, Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키도록 생체역학적 자극을 제공하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 세포에서 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
18. 제17항에 있어서, Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키는 것이 Gimap6의 mRNA 발현을 증가시키고/거나, Gimap6 전이유전자 및/또는 에피솜을 도입하고/거나, HE 세포에서 Gimap6 발현 요소의 유전적 변형을 도입하는 것을 포함하는, 방법.
19. 제1항에 있어서, 방법이 생물반응기에 동형유전자 내피 (HE) 세포를 포함하는 집단을 제공하는 것을 포함하는, 방법.
20. 제19항에 있어서, 생물반응기가 사이클릭-스트레인 생체역학적 신장 (cyclic-strain biomechanical stretching)을 제공하는, 방법.
21. 제20항에 있어서, 사이클릭-스트레인 생체역학적 신장이 Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키는, 방법.
22. 제20항에 있어서, 사이클릭-스트레인 생체역학적 신장이 Gimap6b의 활성 또는 발현을 증가시키는, 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, HSC가 조혈 니치 (hematopoietic niche)에 생착되고, 기능성 다계통 성인 혈액으로 재구성되는, 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, HE 세포가 유도 다분화능 줄기 세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC), 비-조혈 줄기 세포, 체세포, 또는 내피 세포로부터 얻어지는, 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 HSC의 집단, 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는, 약제학적 조성물.
26. 제25항에 있어서, 적어도 10² 개의 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
27. 조혈 줄기 세포 요법 또는 이식을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 치료적 유효량의 조혈 줄기 세포 (HSC) 또는 제25항 또는 제26항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
28. 제27항에 있어서, 대상체가 악성 또는 비-악성 형태의 혈액, 골수, 대사, 또는 면역 질환을 갖는, 방법.
29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 대상체가 다발성 골수종 (multiple myeloma); 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma); 호지킨병 (Hodgkin disease); 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia); 신경모세포종 (neuroblastoma); 생식 세포 종양 (germ cell tumor); 자가면역 장애 (전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus: SLE), 전신성 경화증 (systemic sclerosis)); 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome), 또는 아밀로이드증 (amyloidosis)을 갖는, 방법.
30. 조혈 줄기 세포 요법 또는 이식을 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 조혈 줄기 세포 (HSC), 또는 제25항 또는 제26항의 약제학적 조성물.
31. 제30항에 있어서, 대상체가 악성 또는 비-악성 형태의 혈액, 골수, 대사, 또는 면역 질환을 갖는, HSC 또는 약제학적 조성물.
32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 대상체가 다발성 골수종; 비호지킨 림프종; 호지킨병; 급성 골수성 백혈병; 신경모세포종; 생식 세포 종양; 자가면역 장애 (전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 전신성 경화증); 골수이형성 증후군, 또는 아밀로이드증을 갖는, HSC 또는 약제학적 조성물.

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