JP2021527397A - 造血幹細胞を生成するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2018年6月7日に出願された米国仮特許出願番号第62/681,982号の利益を請求する。当該出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された登録番号HL131645、DK085217、およびDK100672の下での政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
不偏のゼブラフィッシュエチルニトロソウレア(ENU)突然変異生成のスクリーニングによって、カドヘリン−5(cdh5、ve−cdh)のゼブラフィッシュ突然変異体であるmalbec(bw209mlb)を得た。malbec胚およびcdh5−モルファント(MO)胚は、循環不全にもかかわらず、正常な一次造血および二次造血を示す。
生体力学的力は、細胞の形状および運命の転換を刺激するため、造血性内皮細胞の脈動介在性の周期的伸展がHSC形成を刺激すると仮定した。
繰り返しひずみまたはピエゾ1の活性化が長期自己再生HSC(LT−HSC)を生産するかを分析するために、連続移植アッセイを行った。繰り返しひずみまたはピエゾ1のアクチベーターで処置されたAGMの一次移植体は、より高い生着および正常な多細胞系の再構成を示した(図2A、図2B)。また、繰り返しひずみまたはピエゾ1のアクチベーターで処置されたAGMを移植された一次レシピエントの骨髄は、2倍から3倍多い量のLin−Sca1+c−Kit+Cd48−Cd150+HSCを示した。免疫不全の二次レシピエントへの一次レシピエント由来の選別されたLin−Sca1+c−Kit+HSPCの移植もまた、より高い生着および正常な多細胞系の再構成をもたらした(図2C、図2D)。したがって、繰り返しひずみおよび/またはピエゾ1の活性化の両方が、より多い量の正常なLT−HSCを生産することが予想された。この仮説を試験するために、限界希釈アッセイを、段階的な量のLin−Sca1+c−Kit+HSPCを免疫不全の三次レシピエントに移植することによって行った。三次移植体の分析は、繰り返しひずみが2倍から3倍多い量のLT−HSCを生産したことを実証した。
AGMは異種組織であるため、伸展が介在するピエゾ1の活性化がいかにしてHSCへの大動脈内皮細胞の運命の転換を刺激するかは不明であった。E10.5 AGM選別型内皮細胞、造血性内皮細胞、およびHSCからの変動遺伝子発現シグネチャーが得られた。AGMに由来する内皮細胞、造血性内皮細胞、およびHSCの状況における、AGMの繰り返しひずみまたはピエゾ1の活性化で誘発される遺伝子シグネチャーの階層的クラスタリングは、さらに、過剰発現した生物学的プロセス、分子経路、遺伝子発現クラスター、およびこれらの遺伝子オントロジー(GO)タームについての定量的概要を示した。内皮からHSCへの転換の間に上方調節された、周期的伸展および/またはピエゾ1の活性化が介在する遺伝子の、ベン図分析は、Dnmt3bを、HSC形成に必要な内皮機構のサイレンシングに関与する潜在的候補メカニズムとして同定した(図4)。加えて、Gimap6もまた、HSC形成に必要な内皮機構のサイレンシングに関与する潜在的候補メカニズムとして同定された。
胚様体および造血性内皮細胞の分化を、(Sugimura et al. 2017、Ditadi et al. 2015)において記載されているように行った。簡潔に述べると、hiPSCコロニーを0.05%トリプシンで5分間、37℃で解離し、PBS+2%FBSで洗浄し、そして、L−グルタミン(2mM)、ペニシリン/ストレプトマイシン(10ng/ml)、アスコルビン酸(1mM)、ヒトホロ−トランスフェリン(150μg/ml、Sigma T0665)、モノチオグリセロール(MTG、0.4mM)、BMP4(10ng/ml)、およびY−27632(10μM)を添加したStemPro−34(Invitrogen、10639−011)中に再懸濁した。500万個の細胞を、10cmのディッシュ(Ezsphere、旭硝子株式会社)に播種して、スフェロイドを形成させた。1日目に、bFGF(5ng/ml)およびBMP4(10ng/ml)を培地に添加した。2日目に、培地を、SB431542(6μM)、CHIR99021(3μM)、bFGF(5ng/ml)、およびBMP4(10ng/ml)を添加したStemPro−34で交換した。3日目に、培地を、VEGF(15ng/ml)およびbFGF(10ng/ml)を添加したStemPro−34で置き換えた。6日目に、培地を、bFGF(5ng/ml)、VEGF(15ng/ml)、インターロイキン(IL)−6(10ng/ml)、IGF−1(25ng/ml)、IL−11(5ng/ml)、SCF(50ng/ml)、およびEPO(2IU)を添加したStemPro−34に交換した。細胞を、5%CO2、5%O2、および95%湿度のインキュベーター内で維持した。全てのサイトカインは、Peprotechから購入した。
長期HSCの発生、増殖、および維持は、幹細胞の生物学および造血において、非常に求められていたものであった。ゼブラフィッシュにおける低速度撮影共焦点、ライトシート、およびフーリエ変換分析に基づいて、血管内の脈動を刺激するスケーラブルバイオリアクターが確立されただけではなく、ピエゾ1の活性化が、内皮細胞をLT−HSCに変換するための薬理学的な標的として同定された。この研究は、連続移植の際に生着し得、自己再生し得、および多細胞系の機能的な成人血液に再構成し得るLT−HSCを開発するための、導入遺伝子フリーの新規なアプローチを提供する。
全ての手順は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院およびボストン小児病院の動物実験委員会によって承認された。
実験では、野生型AB、Casper、およびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統lcr:eGFP、flk1:mCherry、flk1:eGFP、cd41:eGFPを使用した。胚は、受精後4日間までを使用した。実験では、ジャクソン研究所のCd45.2(C57BL6/J)マウスおよびCd45.1(SJL)マウスを使用した。
モルフォリノアンチセンスオリゴを入手し(Gene Tools、以下の配列)、一細胞期のcasperゼブラフィッシュ胚に注射した。注射された胚および注射されていない胚を、固定するまで、E3培地において28℃でインキュベートした。
cdh5−MO(5’−TACAAGACCGTCTACCTTTCCAATC−3’、配列番号1)
sih−MO(5’−CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA−3’、配列番号2)
ピエゾ1−MO(5’−CAAAGTTCAGTTCAGCTCACCTCAT−3’、配列番号3)
dnmt3bb.1−MO1(5’−TTATTTCTTCCTTCCTCATCCTGTC−3’、配列番号4)
dnmt3bb.1−MO2(5’−CTCTCATCTGAAAGAATAGCAGAGT−3’、配列番号5)
ゼブラフィッシュの胚を、E3 fish培地中の以下の化学調節物質で処置した:100uMのL−NAME(Fisher Scientific)、50uMのジギトキシゲニン(Sigma)、25〜50uMのYoda1(Cayman Chemical)、1uMのナナオマイシン(Nana、Fisher Scientific)、100uMの塩化ガドリニウム(GdCl3、Sigma)、5〜10uMの4α−ホルボール12,13−ジデカン酸塩(4Αpdd、Sigma)、またはGSK205(10uM)。
蛍光色素標識したデキストランビーズを対照胚およびcdh5−MO胚の心房に注射し、リアルタイムな明視野ビデオを、Nikkon SMZ1500実体顕微鏡を使用して捕捉した。
生きたゼブラフィッシュ心臓の画像を、組み込み型の白熱照明を使用して、5×対物レンズを有するAxioplan(Zeiss)正立顕微鏡、および512×480ピクセルのグレースケールイメージセンサーを有するFastCam−PCIハイスピードデジタルカメラ(Photron)で得た。画像は1秒当たり250フレームで得られ、1088フレーム(8回の心周期)が条件ごとに得られた。カスタムソフトウェアを使用して(MATLAB(登録商標)において実装された)、連続イメージファイルから心拍数を決定した。心室の長軸および短軸を、各ビデオについての拡張期および収縮期の両方で、ImageJを使用して手動で測定し、これを使用して、標準的な幾何学的仮定を使用して心腔容積を推定した。モルフォリノ用量当たり少なくとも10個の胚について、心拍出量を、拡張期の心室容積から収縮期の心室容積を差し引き、そこに心拍数をかけたものとして測定した(Shin et al., 2010)。
ゼブラフィッシュCasperの胚を、トリカイン(Sigma)を有する0.8%低融点アガロースに包埋し、ペトリ皿に載せた。次に、NIS Elements(株式会社ニコン)ソフトウェアを備えたNikon SMZ1500実体顕微鏡を使用して、AGM領域における拍動する血管のリアルタイムな明視野ビデオを捕捉した。ビデオを使用して、血管内の脈動周波数を定量した。
明視野のライブイメージングを行うために、ゼブラフィッシュCasperの胚を、トリカイン(Sigma)を有する0.8%低融点アガロースに包埋し、ペトリ皿に載せた。NIS Elements(株式会社ニコン)ソフトウェアを備えたNikon SMZ1500実体顕微鏡を使用して、リアルタイムな明視野のビデオおよび静止画像を捕捉した。
cd41:eGFPをflk1:mCherryゼブラフィッシュと交配し、flk1:mCherryをlcr:eGFPゼブラフィッシュと交配し、モルフォリノをこれらのトランスジェニック胚に注射した。トランスジェニック胚を低融点アガロースに載せ、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、30から42hpfのflk1+内皮から生じるcd41:eGFP+HSCの低速度撮影共焦点イメージングを行った。lcr:eGFP+赤血球の相対的な動きを、flk1:mCherry+内皮の状況で分析した。本発明らは、Imaris(Bitplane)ソフトウェアを使用して画像分析を行った。
ホールマウントin situハイブリダイゼーションを、以前に記載されているように行った。
マイクロインジェクション針を使用して心膜を穿刺し、48hpfのcdh5−MOを注射したゼブラフィッシュ胚の心臓の周辺を構成する体液を放出させた。
E10.5キメラマウス胚を採取し、パラフィンブロックに包埋し、横断面を作製し、そして一次抗体であるピエゾ1(ウサギ抗マウスIgG、Abcam)、Cd31(ロバ抗マウスIgG、R&D Systems)、c−Kit(ウサギ抗マウスIgG、R&D Systems)、またはDnmt3b(ロバ抗マウスIgG、Abcam)、および4,6ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)抗体、ならびに二次抗体であるAlexa Fluor 488(ロバ抗ウサギIgG、Fisher Scientific)およびAlexa Fluor 647(ロバ抗ヤギIgG、Abcam)で免疫染色して、E10.5 AGM領域におけるこれらの発現を検出した。
E11.5 AGMをC57BL6/J Cd45.2マウス胚から採取し、細胞の3胚同等物の単一細胞懸濁液を、BioFlex 6ウェル培養プレート(FlexCell)の各ウェルに播種した。本発明らは、細胞を一晩、繰り返しひずみ(Flexcell(登録商標)FX−4000(商標)Tension System)、および/または化学調節物質(25〜50μMのYoda1、1μMのナナオマイシン、100μMのGdcl3、1uMのGsMTx4、5〜20μMの4αPDD、10uMのGSK205)での処置を適用して培養した。次に、採取した細胞を使用して、移植、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析、およびコロニー形成単位(CFU)アッセイを行った。
E11.5マウス胚を、タイミングを合わせて交配した(time−mated)妊娠したメスの子宮から採取し、FBS、1mMのグルコース、1%ペニシリン−ストレプトマイシン、および/または選択された化学調節物質(25〜50μMのYoda1、1μMのナナオマイシン、5〜20μMの4αPDD、もしくは10uMのGSK205)を含有する無菌のガラスバイアルに入れた。本発明らは、ガラスバイアルを、ローラー器具(≒30rpmで回転する)、一定のガス供給(21%O2、5%CO2、残部N2)、および37℃の一定温度で構成されるエクスビボインキュベーター(BTC Engineering、Cambridge、UK)内に置いた。24時間後、AGMを採取して、FACSアッセイおよびCFUアッセイによって造血細胞の形成を分析した。
一次移植では、未処置のまたは処置された(繰り返しひずみまたは25μMのYoda1)AGMの3胚同等物と、脾臓ヘルパー細胞(マウス当たり≒50万個)とを、致死線量照射した(分割線量10.5cGy)Cd45.1(SJL)マウスに、眼窩後注射によって注射した。二次移植および三次移植では、移植されたマウスから骨髄を単離した(脚、腕、骨盤骨、脊椎、胸骨)。骨髄をフィコール勾配(Histopaque(登録商標)−1083、Sigma−Aldrich)にロードし、バフィーコートから得た細胞を、ビオチンコンジュゲート型系統抗体およびストレプトアビジンマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)とインキュベートした。次に、細胞系陰性の(Lin−)細胞をMACS LSカラム(Miltenyi Biotec)で分離し、ドナーCd45.2のLin−Sca1+c−Kit+(LSK)細胞を、MoFlo Beckman Coulterソーターで選別した。その後、選別されたCd45.2 LSK細胞をCd45.1脾臓ヘルパー細胞(≒マウス当たり50万個)と混合し、放射線照射した(分割線量10.5cGy)Cd45.1 SJLマウスに、眼窩後注射によって移植した。
CFUアッセイでは、AGM外植片のまたはエクスビボの細胞を、MethoCult GF M3434培地(StemCell Technologies)において平板培養した。播種の7日後、本発明らは、顆粒球、赤血球系、マクロファージ、巨核球(GEMM)、顆粒球マクロファージ(GM)、顆粒球(G)、マクロファージ(M)、および赤血球系(E)コロニーを作るこれらの能力を分析した。
FACSを使用して、AGM移植マウスから単離された未溶解の骨髄から得た赤血球前駆体(Cd45.2+、Ter119+、Cd71+)を選別した。全RNAを、RNAeasy Minikit(QIAGEN)を使用して単離し、cDNA合成を、Superscript III(Invitrogen)を使用して行った。定量的リアルタイムPCRを、MX3000P機でSYBR Green(QuantaBio)を指示されたプライマー(Sankaran et al., 2009)と共に使用して行った。本発明らは、発現を、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapdh)の発現に対して正規化した(Ochida et al., 2010)。
好中球(Cd45.2+、Gr1+、Mac1+)を、16週齢の一次移植されたマウスの単離された骨髄からFACS選別し、10%FBSを有するIMDM中で一晩(50万個細胞/mL)、24ウェルプレートにおいて培養した。上清を回収し、MPO濃度を、マウスMPO/ミエロペルオキシダーゼPicoKine(商標)ELISAキット(Boster)を使用して測定した。MPO濃度はまた、血清においても測定した。
T細胞(Cd45.2+、Cd3+)および骨髄細胞(Cd45.2+、Mac1+)を、16週齢の一次移植されたマウスの脾細胞からFACS選別した。次に、ゲノムDNAを抽出し、PCRを、TCR−β遺伝子座内のDH β2.1−JH β2.7の再編成について行った。本発明らのサンプルは、変性させ(94℃、1分間)、アニーリングし(63℃、2分間)、そして35サイクル伸長させた(72℃、2分間)ものであった。プライマーの配列は以下の通りである:DH β2.1の5’:5’−GTAGGCACCTGTGGGGAAGAAACT−3’;配列番号6、およびJH β2.7の3’:5’TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT;配列番号7(Lu et al., 2017)。
血清を16週齢の一次移植されたマウスから単離し、免疫前Igのアイソタイプを、マウスIgアイソタイピングキット(Thermo Fisher)によって定量した。
移植体マウスを、皮下注射(腰背部)および皮内注射(右足蹠)を介して、ヒツジ赤血球(sRBC、109個細胞/mL、部位当たり50μL、Rockland Immunochemicals)で感作した。感作の6日後、感作前のマウスを、左足蹠では2×109個RBC/mLで、また右足蹠では等容積のPBSで(対照として)チャレンジした。チャレンジの48時間後、足蹠の厚みをマイクロキャリパーで測定した。本発明らは、6日目の変化のパーセントを、各足蹠のチャレンジ前の厚みで正規化した。
AGM外植片からの核抽出物を、EpiQuik Nuclear Extractionキット(Epigentek Group Inc.)を使用して採取した。Dnmt3bタンパク質およびDnmt3aタンパク質のレベルを、比色分析EpiQuikアッセイキット(Epigentek Group Inc.)を製造者の指示に従って使用して分析した。Dnmt3bおよびDnmt3aの濃度は、1μgの核抽出タンパク質と関連している。
E11.5マウスのAGM外植片培養物の全RNAを、RNAeasy MiniKit(QIAGEN)で単離した(対照条件、伸展条件、Yoda1条件、および4αPDD条件)。本発明らのcDNAライブラリーは、BGI Americas Corporationによって作製され、HiSeq4000装置(Illumina)でレーン当たり8つのサンプルでシーケンシングされた。本発明らは、本発明らのシーケンシングされた読み取り断片を、Genomic Short−Read Nucleotide Alignmentプログラム(バージョン2012−07−20)を使用して、マウス参照ゲノムGRCm38(ENSEMBLリリース69)に対してマッピングした。DESeq2およびDEXSeqを使用して、それぞれ発現変動(FDR=0.1)およびエキソン使用の変動について試験した。発現変動遺伝子の遺伝子発現クラスターを分析し、細胞集団ごとのこれらの平均発現レベルを比較した。次に、アップ遺伝子およびダウン遺伝子のベン図比較を行って、繰り返しひずみまたは薬理学的調節物質が介在する内皮からHSCへの転換に重要な候補を分析した。具体的には、本発明らは、R(R Development Core Team、2012)におけるgplotsパッケージ(Warners et al., 2017)を使用するブートストラップ分析で階層的クラスタリングを行った。GO分析では、本発明らは、GOカテゴリーまたはパスウェイでの本発明らの発現変動遺伝子の過剰な出現について、フィッシャーの正確確率検定を使用して試験し、ボンフェローニ法を使用して複数の試験について補正した。本発明らは、P値0.001を統計的に有意なエンリッチメントの最小として使用して、以前に記載されているように、GOタームエンリッチメント分析を行った。
データは、別段の記載がない限り、平均±平均の標準誤差(平均±SEM)として表されている。統計分析は、対応のあるまたは対応のないスチューデントt検定によって行った。有意性は、P<0.05で設定された。
Claims (32)
- 造血幹細胞(HSC)の集団を調製する方法であって、
HSCの形成を刺激するために十分な条件下で、
内皮細胞および/または造血性内皮(HE)細胞を含む集団を提供すること、ならびに、前記細胞におけるDNA(シトシン−5−)−メチルトランスフェラーゼ3ベータ(Dnmt3b)および/またはGTPase IMAPファミリーメンバー6(Gimap6)の活性または発現を増大させることを含む、方法。 - 前記HSCを回収することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記内皮細胞および/またはHE細胞を、有効量の、Dnmt3bの前記活性または発現を増大させるアゴニストと接触させることを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記アゴニストが、機械感受性受容体または機械感受性チャネルのアゴニストである、請求項3に記載の方法。
- 前記機械感受性受容体がピエゾ1である、請求項4に記載の方法。
- ピエゾ1のアゴニストがYoda1である、請求項5に記載の方法。
- 前記有効量の前記Yoda1アゴニストが、5から500uMの範囲、または5から100μMの範囲である、請求項6に記載の方法。
- Dnmt3bの活性または発現の前記増大が、前記内皮細胞および/またはHE細胞において、Dnmt3bのmRNA発現を増大させること、Dnmt3b導入遺伝子および/もしくはエピソームを導入すること、ならびに/またはDnmt3b発現エレメントの遺伝子修飾を導入することを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記内皮細胞および/またはHE細胞が、HLA修飾細胞もしくはHLAヌル細胞、および/または導入遺伝子フリーの細胞に由来する、および場合によって、iPS細胞または体細胞の遺伝的もしくは化学的誘導によって導出される、請求項1に記載の方法。
- 源細胞が、対象から得られるかまたはそれに由来し、前記対象は、場合によって万能適合ドナーである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記源細胞が、血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する対象から得られるかまたはそれに由来する、請求項10に記載の方法。
- 前記対象が血液の悪性腫瘍を有していない、請求項11に記載の方法。
- 前記HSCの集団がレシピエントに投与される、請求項10に記載の方法。
- 前記源細胞が前記レシピエントに由来していた、請求項13に記載の方法。
- 前記造血幹細胞が長期造血幹細胞(LT−HSC)を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 生体力学的な刺激を提供してDnmt3bの前記活性または発現を増大させることを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記内皮細胞におけるGimap6の前記活性または発現を増大させることをさらに含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- Gimap6の活性または発現の前記増大が、前記HE細胞において、Gimap6のmRNA発現を増大させること、Gimap6導入遺伝子を導入することおよび/もしくはエピソームを導入すること、ならびに/またはGimap6発現エレメントの遺伝子修飾を導入することを含む、請求項17に記載の方法。
- 造血性内皮(HE)細胞を含む集団をバイオリアクターに提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記バイオリアクターが、繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する、請求項19に記載の方法。
- 前記繰り返しひずみによる生体力学的伸展が、Dnmt3bの前記活性または発現を増大させる、請求項20に記載の方法。
- 前記繰り返しひずみによる生体力学的伸展が、Gimap6の前記活性または発現を増大させる、請求項20に記載の方法。
- 前記HSCが造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- HE細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)、非造血幹細胞、体細胞、または内皮細胞から得られる、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から24のいずれか一項に記載の方法によって調製されたHSCの集団、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
- 少なくとも102個の細胞を含む、請求項25に記載の医薬組成物。
- 造血幹細胞の治療法または移植を必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量の、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法によって調製された造血幹細胞(HSC)、または請求項25もしくは26に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象が、悪性形態のまたは非悪性形態の血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する、請求項27に記載の方法。
- 前記対象が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、自己免疫障害(全身性エリテマトーデス(SLE)もしくは全身性硬化症)、骨髄異形成症候群、またはアミロイドーシスを有する、請求項27または28に記載の方法。
- 造血幹細胞の治療法または移植を必要とする対象の処置における使用のための、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法によって調製された造血幹細胞(HSC)、または請求項25もしくは26に記載の医薬組成物。
- 前記対象が、悪性形態または非悪性形態の血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する、請求項30に記載の使用のためのHSCまたは医薬組成物。
- 前記対象が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、自己免疫障害(全身性エリテマトーデス(SLE)もしくは全身性硬化症)、骨髄異形成症候群、またはアミロイドーシスを有する、請求項30または31に記載の使用のためのHSCまたは医薬組成物。
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