JPS60126298A - リンフオトキシンまたはリンフオトキシン−ｍＲＮＡの調製方法 - Google Patents
リンフオトキシンまたはリンフオトキシン−ｍＲＮＡの調製方法Info
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- JPS60126298A JPS60126298A JP59181617A JP18161784A JPS60126298A JP S60126298 A JPS60126298 A JP S60126298A JP 59181617 A JP59181617 A JP 59181617A JP 18161784 A JP18161784 A JP 18161784A JP S60126298 A JPS60126298 A JP S60126298A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
イン ビトロ−で適当な刺激を与えてやると、哺乳動物
のある種の細胞は、いわゆるリンフォトキシンを産生し
うる状態になることが文献に記されている（たとえば、
ＩＥｖａｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ工ｍｍｕｎ０１゜工
ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、１２＋ １８１−１９０ （１９
８５）およびＧｒａｎｇｅｒ等、ＢＬｏｌｏｇｙ ｏｆ
ｔｈｅ Ｉ＋ｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓｐｐ、１４１−１
８０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９７９ ）。
のある種の細胞は、いわゆるリンフォトキシンを産生し
うる状態になることが文献に記されている（たとえば、
ＩＥｖａｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ工ｍｍｕｎ０１゜工
ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、１２＋ １８１−１９０ （１９
８５）およびＧｒａｎｇｅｒ等、ＢＬｏｌｏｇｙ ｏｆ
ｔｈｅ Ｉ＋ｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓｐｐ、１４１−１
８０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９７９ ）。
生物種のリンクオドキシンは、イン ビトロ−で均一な
蛋白質でなく、分子量、荷電および安定性で異なる１連
のサブタイプより成立つ（Ｇｒａｎｇｅｒ等、Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ １４
１−１８０頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓθ１９７９
）、たとえば、ヒトのシステムでは、４群のリンクオド
キシンが識別でき、分子量は、αＩ、Ｔ／ｌ”−１０，
０００から２０．［） ００、βＬＴが３５，０００か
ら５０，０００そしてαＬＴが７０．０００から９０，
０００でＬＴ複合物が２００．０００から６００，００
０である。
蛋白質でなく、分子量、荷電および安定性で異なる１連
のサブタイプより成立つ（Ｇｒａｎｇｅｒ等、Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ １４
１−１８０頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓθ１９７９
）、たとえば、ヒトのシステムでは、４群のリンクオド
キシンが識別でき、分子量は、αＩ、Ｔ／ｌ”−１０，
０００から２０．［） ００、βＬＴが３５，０００か
ら５０，０００そしてαＬＴが７０．０００から９０，
０００でＬＴ複合物が２００．０００から６００，００
０である。
リンフォトキシンはイン ビトロ−でつぎの能力な有す
る。
る。
ａ）細胞の悪性への転換を防ぐ（Ｋｖａｎｓ等、工ｎｔ
。
。
Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ 、 ’ｌ ７ ｅ ４５−４９
（１９８１）および Ｒａｎｓｏｍ 等、Ｊ、Ｎａｔｌ
Ｃａｎｃｅｒ 工ｎｅｔ−１６９ｅ７４１−７４４
（１９８２））、 ｂ）腫瘍細胞に対し、静細胞にまたは細胞混純的にさえ
作用する（ Ｋｖａｎｓ等、工ｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａ
ｃｓｌｏｇｙ ３ 。
（１９８１）および Ｒａｎｓｏｍ 等、Ｊ、Ｎａｔｌ
Ｃａｎｃｅｒ 工ｎｅｔ−１６９ｅ７４１−７４４
（１９８２））、 ｂ）腫瘍細胞に対し、静細胞にまたは細胞混純的にさえ
作用する（ Ｋｖａｎｓ等、工ｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａ
ｃｓｌｏｇｙ ３ 。
３４７−ｓｓ’？（１９８１））、およびＣ）生体の免
疫防御システムに対する＃Ｍ編細胞の感受性を増加させ
る（ Ｋｖａｎｓ等、Ｃｅ１ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ。
疫防御システムに対する＃Ｍ編細胞の感受性を増加させ
る（ Ｋｖａｎｓ等、Ｃｅ１ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ。
６３．１−１５（１９８１）およびＲａｎｓｏｍ等工ｎ
ｔ。
ｔ。
Ｊ、０ａｎｃｅｔ２９ ．４ｊ１ −４５８ （１９８
２））。
２））。
さらに動物モデルにおいてリンフォトキシン８周製物が
＃瘍を退行さすことも知られている（ Ｋｈａｎ等、Ｐ
ｒ ＯＣ＊ Ｓ ＯＣ、ＩＤＸｐｔｌ −Ｂｉ ０１
− Ｍｅｄ −１６９＋２９１−２９４ （１９８２）
）、それで悪性月中り秘の予防および治療においてリン
フォトキシンの意義は大きい。
＃瘍を退行さすことも知られている（ Ｋｈａｎ等、Ｐ
ｒ ＯＣ＊ Ｓ ＯＣ、ＩＤＸｐｔｌ −Ｂｉ ０１
− Ｍｅｄ −１６９＋２９１−２９４ （１９８２）
）、それで悪性月中り秘の予防および治療においてリン
フォトキシンの意義は大きい。
これまでに知られているリンフォトキシンをうる方法で
は、大部分において１次１１ｆ１１胞たとえば末梢血液
の白血球調製物またはヒトの扁桃よりの細胞（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｅ等、Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．１３０ 、５１８−
５２０（１９８３））、マウスの１１１１！細胞（Ａｋ
ｅａｍｉｔ等、工ｎ ｆｌｌｌ Ｃｔ＊工ｍｍｕｎ、
３６ 、１０２８−１０５５（１９８２）およびＴｒｉ
ｖｅｒｓ等、Ｊ、工ｍｍｕｎｏｌ。
は、大部分において１次１１ｆ１１胞たとえば末梢血液
の白血球調製物またはヒトの扁桃よりの細胞（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｅ等、Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．１３０ 、５１８−
５２０（１９８３））、マウスの１１１１！細胞（Ａｋ
ｅａｍｉｔ等、工ｎ ｆｌｌｌ Ｃｔ＊工ｍｍｕｎ、
３６ 、１０２８−１０５５（１９８２）およびＴｒｉ
ｖｅｒｓ等、Ｊ、工ｍｍｕｎｏｌ。
１１．７，１３０−１３５（１９７６））または１３ｙ
ｒｉａｎハムスターまたはモルモットの腹腔よりの白血
球（たとえば、ｌ１ｉｖａｎｓ等、工ｎｔ、 Ｊ、 Ｃ
ａｎｃｅｒ−≧ｉ−；ど１．４５−４９（１９８１ン）
より得られている。これらの細胞は、まず、それらをフ
ィトヘマグルチニンのような高分子量のマイトジェン（
分裂促進物質）とインキュベートしてリンフォトキシン
な産生するように刺激せねばならない。それでこれまで
のところ、Ｂ−淋巴球セルラインの培養上清にはほんの
わづかのリンフォトキシン活性が見出されたのみであっ
た（ Ｇｒａｎｇｅｒ 等、：Ｌ工ｍｍｕｎｏＬ １０
４ 、１４７６ （１９７０）およびＡｍ１ｎｏ等、Ｊ
、工ｍｍｕｎｏ１．１１３ ＋ １３３４−１３４５（
１９７４））。
ｒｉａｎハムスターまたはモルモットの腹腔よりの白血
球（たとえば、ｌ１ｉｖａｎｓ等、工ｎｔ、 Ｊ、 Ｃ
ａｎｃｅｒ−≧ｉ−；ど１．４５−４９（１９８１ン）
より得られている。これらの細胞は、まず、それらをフ
ィトヘマグルチニンのような高分子量のマイトジェン（
分裂促進物質）とインキュベートしてリンフォトキシン
な産生するように刺激せねばならない。それでこれまで
のところ、Ｂ−淋巴球セルラインの培養上清にはほんの
わづかのリンフォトキシン活性が見出されたのみであっ
た（ Ｇｒａｎｇｅｒ 等、：Ｌ工ｍｍｕｎｏＬ １０
４ 、１４７６ （１９７０）およびＡｍ１ｎｏ等、Ｊ
、工ｍｍｕｎｏ１．１１３ ＋ １３３４−１３４５（
１９７４））。
既知の製造方法では、純度の低いリンフォトキシンがほ
んの夕景産生されただけなので、これまでに産生された
リンフォトキシンは動物モデルについて抗腫瘍効果をよ
り広く試験してゆくには、均質でなく、最も不十分であ
った。さらに、これまでのところ、生物活性のあるリン
フォトキシン−ｍＲ，ＮＡを発見することもできなかっ
た。しかし、このことは遺伝子工学の方法でリンフォト
キシン遺伝子を分子クローニングするには不可欠の条件
なのである。
んの夕景産生されただけなので、これまでに産生された
リンフォトキシンは動物モデルについて抗腫瘍効果をよ
り広く試験してゆくには、均質でなく、最も不十分であ
った。さらに、これまでのところ、生物活性のあるリン
フォトキシン−ｍＲ，ＮＡを発見することもできなかっ
た。しかし、このことは遺伝子工学の方法でリンフォト
キシン遺伝子を分子クローニングするには不可欠の条件
なのである。
そこで、本発明は、十分１ｉｊ″のそして十分の純度の
リンフォトキシンおよびリンフォトキシン−ｍＲＮＡを
調製することを目的としている。
リンフォトキシンおよびリンフォトキシン−ｍＲＮＡを
調製することを目的としている。
本発明によれば、今や、ウィルス、なるべくは、ヘルペ
スウィルスｓａｉｍｉｒｉまたはヘルペスウィルスａｔ
θｌｅｅのようなヘルペスウィルスでインビトロ−また
はイン ビボーで形層転換されそして永久に培養発育す
るようになった、いわゆる、ザル、特にＳａｇｕｉｎｕ
日属のザルよりのいわゆるＴ−淋巴球タイブの＆、ｌＩ
Ｉ胞、たとえばセルラインＬ−７７１５、Ａ６５１、Ａ
２５４３．７ＯＮ２．１０２２および１６７０、しかし
、有利にはセルライン１０２２および１６７０が、適当
な培地中で、さらに誘導を加えることなり著量のリンフ
ォトキシンを産生することが発見されたのである。
スウィルスｓａｉｍｉｒｉまたはヘルペスウィルスａｔ
θｌｅｅのようなヘルペスウィルスでインビトロ−また
はイン ビボーで形層転換されそして永久に培養発育す
るようになった、いわゆる、ザル、特にＳａｇｕｉｎｕ
日属のザルよりのいわゆるＴ−淋巴球タイブの＆、ｌＩ
Ｉ胞、たとえばセルラインＬ−７７１５、Ａ６５１、Ａ
２５４３．７ＯＮ２．１０２２および１６７０、しかし
、有利にはセルライン１０２２および１６７０が、適当
な培地中で、さらに誘導を加えることなり著量のリンフ
ォトキシンを産生することが発見されたのである。
さらに、いわゆるステイミュレータ−
（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ） 、たとえば、文献におい
て腫瘍ブロモ−ターとして知られている、なるべくはチ
グリアン（ｔｉｇ’１ｉａｎｅ ）またはダフナン（ｄ
ａｐｈｎａｎｅ）タイプのジテルペン訪導体のようなも
の、たとえばメゼレイン（ｍｅｚｅｒθｉｎ ）または
フォルボールのエステルなるべくは１２−０−テトラデ
カノイルフオ、ｎｙ ｆ −／Ｌ／−１３−アセテート
（Ｄｉａｍａｎｄ等、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｖｏｌ ３ ２ ＋ １
−７４頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８０お
よびＷｅａｋｅｒ。
て腫瘍ブロモ−ターとして知られている、なるべくはチ
グリアン（ｔｉｇ’１ｉａｎｅ ）またはダフナン（ｄ
ａｐｈｎａｎｅ）タイプのジテルペン訪導体のようなも
の、たとえばメゼレイン（ｍｅｚｅｒθｉｎ ）または
フォルボールのエステルなるべくは１２−０−テトラデ
カノイルフオ、ｎｙ ｆ −／Ｌ／−１３−アセテート
（Ｄｉａｍａｎｄ等、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｖｏｌ ３ ２ ＋ １
−７４頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８０お
よびＷｅａｋｅｒ。
Ｏａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｅｉｓ Ｖｏｌ、エエ、 Ｍｅ
ｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ＴｕｍｏｒＰｒｏｍｏｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｃｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ＊ １
１−４８頁、Ｒａｖｓｎ Ｐｒｅｓｓ 、 Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ １９７３ ）を１から１０００ ｎｇＡｎｌの
濃度に加えると、リンスオドキシンおよびリンフォトキ
シン−ｍＲＮＡの産生がさらに増加することが分る。
ｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ＴｕｍｏｒＰｒｏｍｏｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｃｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ＊ １
１−４８頁、Ｒａｖｓｎ Ｐｒｅｓｓ 、 Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ １９７３ ）を１から１０００ ｎｇＡｎｌの
濃度に加えると、リンスオドキシンおよびリンフォトキ
シン−ｍＲＮＡの産生がさらに増加することが分る。
用いる培地はふつうの血清不含および血清含有培地たと
えばＥａｇｌｅノｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓ５ｅｎｔｉ
ａｌ ＭｅｄｉｕｍまたはＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ
Ｍｅｍｏｒｉａｌ工ｎｅｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｄｉｕｍｌ
６４０ （ＲＰＭ工１６４０）であり得、これに牛脂
児庇清および抗生物質、なるべくは１０％牛脂児血清、
ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加しうる。
えばＥａｇｌｅノｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓ５ｅｎｔｉ
ａｌ ＭｅｄｉｕｍまたはＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ
Ｍｅｍｏｒｉａｌ工ｎｅｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｄｉｕｍｌ
６４０ （ＲＰＭ工１６４０）であり得、これに牛脂
児庇清および抗生物質、なるべくは１０％牛脂児血清、
ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加しうる。
リンスオドキシン蛋白質の産生において、本発明に準す
る方法の有利な場合として、血清含有培地、または場合
により血清不含培地、たとえばＲＰＭ工１６４０に、１
０からＩ Ｄ Ｏｎｇ／ｍｌの１２−〇−テトラデカノ
イルフォルボール−１６−アセテートまたはメゼレイン
をステイミュレータ−として加えたあと、形質転換細胞
な１から７日、なるべくは６から４日培養し、ついで生
成したリンフォトキシンを既知の方法で培養上清より生
成リンフォトキシンな分け、ついでそれを濃縮しそして
精製する。しかし、血清含有培地中でまず増殖させたあ
と、細胞を、血清含量の低い、なるべくは血ｉ′ａ不含
培地に移してこの操作を実施するのが特に有利である。
る方法の有利な場合として、血清含有培地、または場合
により血清不含培地、たとえばＲＰＭ工１６４０に、１
０からＩ Ｄ Ｏｎｇ／ｍｌの１２−〇−テトラデカノ
イルフォルボール−１６−アセテートまたはメゼレイン
をステイミュレータ−として加えたあと、形質転換細胞
な１から７日、なるべくは６から４日培養し、ついで生
成したリンフォトキシンを既知の方法で培養上清より生
成リンフォトキシンな分け、ついでそれを濃縮しそして
精製する。しかし、血清含有培地中でまず増殖させたあ
と、細胞を、血清含量の低い、なるべくは血ｉ′ａ不含
培地に移してこの操作を実施するのが特に有利である。
リンフォトキシン−ｍＲＮＡを産生するために、本発明
に準する方法はなるべくはつぎのように実施する。ステ
イミュレータ−としての１２−０−テトラデカノイルフ
ォルボール−１６−アセテートまたはメゼレインの１０
から１００ ｎｇ／ｍ１を添加したあと、血清含有培地
、たとえばＲＰＭ工１６４０および１０％牛脂児血清中
に６から４８時間、なるべくは１２から２４時間インキ
ュベートし、ついで細胞を分は破壊してから、ｍＲＮＡ
を既知の方法で分離する。
に準する方法はなるべくはつぎのように実施する。ステ
イミュレータ−としての１２−０−テトラデカノイルフ
ォルボール−１６−アセテートまたはメゼレインの１０
から１００ ｎｇ／ｍ１を添加したあと、血清含有培地
、たとえばＲＰＭ工１６４０および１０％牛脂児血清中
に６から４８時間、なるべくは１２から２４時間インキ
ュベートし、ついで細胞を分は破壊してから、ｍＲＮＡ
を既知の方法で分離する。
生成した細胞培養生成物を分離する時に、得られたリン
フォトキシンの￥Ｗ製に際して、孔度の調整されたガラ
スを用いるクロマトグラフィーなまず実施し、そして、
細胞膜を破壊し核を除いたあと、たとえばフェノールで
リンフォトキシン−ｍＲ）ＪＡを抽出するのが特に適当
であると分った。
フォトキシンの￥Ｗ製に際して、孔度の調整されたガラ
スを用いるクロマトグラフィーなまず実施し、そして、
細胞膜を破壊し核を除いたあと、たとえばフェノールで
リンフォトキシン−ｍＲ）ＪＡを抽出するのが特に適当
であると分った。
リンクオドキシンのそれ以上の精製はたとえばＨＰＬＣ
を用いる。
を用いる。
分子量６０，０００±１５％のそのように得られたリン
クオドキシンは、たとえば等張水溶液として腫瘍細胞の
予防および抑制に用いうる。
クオドキシンは、たとえば等張水溶液として腫瘍細胞の
予防および抑制に用いうる。
本発明方法は、従来法に比してつぎの利点を有する。
１、 望むに応じて増殖されうる無限の寿命の均質の細
胞集団を用いる。
胞集団を用いる。
２、 これらの培養中でのリンフォトキシンの生成は自
然におこる。つまり、高分子鼠マイトジェンをなんら加
える必要がない。
然におこる。つまり、高分子鼠マイトジェンをなんら加
える必要がない。
６、低分子量のステイミュレータ−を用いてリンフォト
キシンの産生なさらに増加させうる。
キシンの産生なさらに増加させうる。
４、血清不含の培地中で高収量でリンフォトキシンの産
生な実施しうる。それで、蛋白負のそれ以上の化学的ｆ
＃製のためのすぐれた出発材料が得られる。
生な実施しうる。それで、蛋白負のそれ以上の化学的ｆ
＃製のためのすぐれた出発材料が得られる。
５、、ｉｌｌ胞より分離されたＲＮＡは、直接的に証明
しうるリンフオドキシ−ｍＲＮＡ ｆｉ性を示し、かく
してこのｍＲＮＡをさらに濃縮するためのすぐれた出発
材料となる。そして、この−ｍＲＮＡ ＋ＸついでｍＲ
ＮＡの分子的クローニングのための不可欠の必要材料と
なる。クローン化されたリンスオドキシン−ｍＲＮＡは
、ついで相同性のヒトリンフォトキシン−ｍＲＮＡ ｔ
ｔ：は相当する遺伝子を既知の方法で分離′１−るた
めの試料に用いうる。
しうるリンフオドキシ−ｍＲＮＡ ｆｉ性を示し、かく
してこのｍＲＮＡをさらに濃縮するためのすぐれた出発
材料となる。そして、この−ｍＲＮＡ ＋ＸついでｍＲ
ＮＡの分子的クローニングのための不可欠の必要材料と
なる。クローン化されたリンスオドキシン−ｍＲＮＡは
、ついで相同性のヒトリンフォトキシン−ｍＲＮＡ ｔ
ｔ：は相当する遺伝子を既知の方法で分離′１−るた
めの試料に用いうる。
本発明をつぎの非限定的実施例で説明する。
例１
ヘルペスウィルス−形雀転換ザルＴ−淋巴球セルライン
によるリンフオドキシの産生 用いる淋巴球セルラインは、１０％牛脂児血清、ペニシ
リンおよびストレプトマイシンを加えたＲｏｓｗｅｌｌ
Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ 工ｎ５ｔｉｔｕｔ−ｅ
Ｍｅｄｉｕｍｌ ６４０ （ＲＰＭ工１６４０）中９
．５％空匁および５％２酸化炭素の気相中で６７℃で静
止培養し、１週に６度、新しい培地で希釈した。すべて
の実験で濃厚培養物は、ル［鮮培地で１＝２から１：６
に希釈し、ついで翌８１：６にふたたび希釈した。そし
て、すべての場会において１本のびんのなかにそれぞれ
５ ｍｌを入れた。６日後培養上清を遠心し凍結させマ
イナス２０℃で貯蔵しておき、試験時に用いた。
によるリンフオドキシの産生 用いる淋巴球セルラインは、１０％牛脂児血清、ペニシ
リンおよびストレプトマイシンを加えたＲｏｓｗｅｌｌ
Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ 工ｎ５ｔｉｔｕｔ−ｅ
Ｍｅｄｉｕｍｌ ６４０ （ＲＰＭ工１６４０）中９
．５％空匁および５％２酸化炭素の気相中で６７℃で静
止培養し、１週に６度、新しい培地で希釈した。すべて
の実験で濃厚培養物は、ル［鮮培地で１＝２から１：６
に希釈し、ついで翌８１：６にふたたび希釈した。そし
て、すべての場会において１本のびんのなかにそれぞれ
５ ｍｌを入れた。６日後培養上清を遠心し凍結させマ
イナス２０℃で貯蔵しておき、試験時に用いた。
各セルラインよりの３個の別々の培養物の上清中に見出
されたリンフォトキシン活性を次表に示す。
されたリンフォトキシン活性を次表に示す。
参考文献
Ａ ＝Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ、、■ｎ
ｔ、Ｊ、Ｃ！ａｎｃｅｒ １９゜５４６−５５４（１９
７７） ３３ ＝ Ａｂｂ ｅｔ ａｌ、、 Ｃａｎｃｅｒ工ｌ
ｎｍｕｎ ０１．工ｎｎｕｍｏｔｈｅｒ。
ｔ、Ｊ、Ｃ！ａｎｃｅｒ １９゜５４６−５５４（１９
７７） ３３ ＝ Ａｂｂ ｅｔ ａｌ、、 Ｃａｎｃｅｒ工ｌ
ｎｍｕｎ ０１．工ｎｎｕｍｏｔｈｅｒ。
９．２１９−２２６（１９８０）
ｏ ＝ Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ、、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ＊ ｐｒｏｃ、 ３８ ＊１９１ （１９７２） Ｄ ＝ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ｌ＊ ｐｒｏｃ、 ３８ ＊１９１ （１９７２） Ｄ ＝ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ７８ 、６３９１−６５９５ （１９８１）ｗ
＝ Ｋａｓｃｈｋａ−Ｄｉｅｒｉｃｈ ａｔ ａｌｌ
：ｒ、 Ｖｉｒｏ’１．４４＋２９５−６１０（１９８
２） 総説： Ｆ’１ｅｃｋｅｎｅｔｅｉｎ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ５６０．３０１−３
４２ （１９７９）より大ｍの、ｒ＃１１胞を生成さす
ためには、静止培養でなく振とう培養を用いた。そのた
めには、細胞（たとえばライン１６７０）は、１または
２リツトルのエルシンマイヤーフラスコ中１０％牛脂児
血清添加ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。１リツ
トルフラスコで０．５リツトル培養物、２リツトルフラ
スコで１リツトル培養物、毎分４０回転、大気圧３，７
°Ｃとした。１週間に６度１：２から１：乙に新鮮培地
で希釈した。このようにして１週に１０から１００リツ
トル程度の１１ンの培養上清なうろことができる。
＝ Ｋａｓｃｈｋａ−Ｄｉｅｒｉｃｈ ａｔ ａｌｌ
：ｒ、 Ｖｉｒｏ’１．４４＋２９５−６１０（１９８
２） 総説： Ｆ’１ｅｃｋｅｎｅｔｅｉｎ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ５６０．３０１−３
４２ （１９７９）より大ｍの、ｒ＃１１胞を生成さす
ためには、静止培養でなく振とう培養を用いた。そのた
めには、細胞（たとえばライン１６７０）は、１または
２リツトルのエルシンマイヤーフラスコ中１０％牛脂児
血清添加ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。１リツ
トルフラスコで０．５リツトル培養物、２リツトルフラ
スコで１リツトル培養物、毎分４０回転、大気圧３，７
°Ｃとした。１週間に６度１：２から１：乙に新鮮培地
で希釈した。このようにして１週に１０から１００リツ
トル程度の１１ンの培養上清なうろことができる。
１６’７０ ＩＩＩ胞中のリンフォトキシンの産生は長
期間に及んで安定化しており、連続培養で９ヶ月経鍋し
ても、培養上清中のリンフォトキシン活性はほとんど不
変である。
期間に及んで安定化しており、連続培養で９ヶ月経鍋し
ても、培養上清中のリンフォトキシン活性はほとんど不
変である。
リンフォトキシンの特徴付け
ａ）つぎに示す方法をリンスオドキシン活性の生物学的
検出に用いた。（Ｔｒｉｖｅｒθ等、Ｊ・工ｍｍｕｎｏ
ｌ・１１７．１３０−１３５およびＥｖａｎｓ Ｃｅ１
ｌ工ｍｍｕｎｏｌ 、 ６ろ、１−１５ （１９８１）
の方法の変法〕。
検出に用いた。（Ｔｒｉｖｅｒθ等、Ｊ・工ｍｍｕｎｏ
ｌ・１１７．１３０−１３５およびＥｖａｎｓ Ｃｅ１
ｌ工ｍｍｕｎｏｌ 、 ６ろ、１−１５ （１９８１）
の方法の変法〕。
１マイクロキユリーのろＨ−チミジン／ｍ１含有培地（
なるべくはＥａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅ
ｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ、 １０％牛脂児血清添加）と
でセルラインＬ９２９の形質転換マゲス細胞１夜培誉し
た。
なるべくはＥａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅ
ｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ、 １０％牛脂児血清添加）と
でセルラインＬ９２９の形質転換マゲス細胞１夜培誉し
た。
ついでトリプシン処理し５％牛脂児崩７Ｎ含有鞠鮮培地
中に懸濁させた。約３０．０００ 、Ｙｉｌｌ胞含有股
２濁液のＱ、５ ｍｌを培養皿（１６ｍｍ）にピペット
で加え３から６時間インキュベートした。試料の系列希
釈液を加え３日間インキュベートした。インキュベーシ
ョン温度はすべて６７℃である。培養上清の放射活性を
液体シンチレーションカウンターで測定した。
中に懸濁させた。約３０．０００ 、Ｙｉｌｌ胞含有股
２濁液のＱ、５ ｍｌを培養皿（１６ｍｍ）にピペット
で加え３から６時間インキュベートした。試料の系列希
釈液を加え３日間インキュベートした。インキュベーシ
ョン温度はすべて６７℃である。培養上清の放射活性を
液体シンチレーションカウンターで測定した。
１６７０細胞の培養上清のリンフォトキシン活性の検出
例を第１図に示した。各希釈液には４個の培養皿を用い
て試験した。平均値のみが与えである。標準偏差は最初
の６つの希釈段階で６から４％、量大希釈で６％である
。この実験に用いた培養上清は数百のアンプル中に入れ
て凍らせ、リンフォトキシン試験のすべてにおいて標準
対照とした。その活性を任意的に、１ｏｏ標準単位／ｍ
／１（ＲＥ／１１１１ ）とした。
例を第１図に示した。各希釈液には４個の培養皿を用い
て試験した。平均値のみが与えである。標準偏差は最初
の６つの希釈段階で６から４％、量大希釈で６％である
。この実験に用いた培養上清は数百のアンプル中に入れ
て凍らせ、リンフォトキシン試験のすべてにおいて標準
対照とした。その活性を任意的に、１ｏｏ標準単位／ｍ
／１（ＲＥ／１１１１ ）とした。
比較のために、１連のヒトＴ−淋巴球セルライン（ＭＯ
ＬＴ −４，１６ｏ１１．ｒ’ＵＲＫＡＴ 、 Ｋａｒ
ｐａｓ −４５，０ＣＲＦ −Ｃ！ＫＭおよびｃｃＲｙ
−Ｈ８Ｂ −２）培養上清を、上記の生物学的リンフ
ォトキシン試験で試験した。未処理対照に比して遊１１
３Ｈ−チミジンの有意の増加はいずれの例でもなかった
。
ＬＴ −４，１６ｏ１１．ｒ’ＵＲＫＡＴ 、 Ｋａｒ
ｐａｓ −４５，０ＣＲＦ −Ｃ！ＫＭおよびｃｃＲｙ
−Ｈ８Ｂ −２）培養上清を、上記の生物学的リンフ
ォトキシン試験で試験した。未処理対照に比して遊１１
３Ｈ−チミジンの有意の増加はいずれの例でもなかった
。
ｂ） セルライン１６７ｏの培養土泊中のリンフォトキ
シン活性の物理−化学的特徴づけをっぎの実験により実
施した。
シン活性の物理−化学的特徴づけをっぎの実験により実
施した。
加熱安定性
酸性ＰＨ安定性
凍結／融解安定性
ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ ） 安定性
還元剤（２−メルカプトエタノール）安定性高速液体ク
ロマトグラフィー（）ＩＰＬＯ）による分子に測定 結果を下記に示す。
還元剤（２−メルカプトエタノール）安定性高速液体ク
ロマトグラフィー（）ＩＰＬＯ）による分子に測定 結果を下記に示す。
対照に対１−るリンフ
処理 オドキシン活性
５６°０．５時間 ６８％
凍結／融解５サイク／Ｉ／ １０８％
ｐＨ２，０，４℃、２４時間 １％
０．１％５ＤＳ−３７°Ｃ１時１ｋｌ １５％０．１Ｍ
の２−メルヵニＰトエ ９８％タノール、６７°Ｃ１時
間 活性は、メルカプトエタノール、加熱および数サイクル
の凍結融解に安定で、Ｐｌ（２では２４時間で完全に破
壊される。
の２−メルヵニＰトエ ９８％タノール、６７°Ｃ１時
間 活性は、メルカプトエタノール、加熱および数サイクル
の凍結融解に安定で、Ｐｌ（２では２４時間で完全に破
壊される。
未処理１６７０細胞の１０％牛脂児血清の存在での標準
培養上清についても加熱およびｉ］安定性および凍結／
融解についての実験を行なった。残りの２つの実験では
、メゼレイン処理（２０ｍｇ／ｍ１、例４をみよ）１６
７０細胞の、孔度調整ガラス上で製綿された培養上清（
例４をみよ）を、ＳＤＳまたはメルカプトエタノールと
インキュベートしてから、完全培地（１０％牛血清）で
５０倍希釈した。
培養上清についても加熱およびｉ］安定性および凍結／
融解についての実験を行なった。残りの２つの実験では
、メゼレイン処理（２０ｍｇ／ｍ１、例４をみよ）１６
７０細胞の、孔度調整ガラス上で製綿された培養上清（
例４をみよ）を、ＳＤＳまたはメルカプトエタノールと
インキュベートしてから、完全培地（１０％牛血清）で
５０倍希釈した。
１６７０細胞よりのリンフォトキシンの分子量は、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＩＪ（！ ）で測定した
（第２図）。
液体クロマトグラフィー（ＨＰＩＪ（！ ）で測定した
（第２図）。
孔度調整ガラス上でａ縮した、未処理１６７Ｄ細胞の培
養上１ｎの２００マイクロリツトルは、ＷＡＴＫＲ８で
製造した装置（２カラムニー１２５；２０ｍＭリン酸ナ
トリウムｐｉ（７，１ＭＮａＣ１，０，１％Ｔｗθｅｎ
２０（ポリオキシエチレンーンルビタｙ−モノラウレー
ト、ｎ−２０、分子ｆｉ）約１２０［））、２５％（ｖ
／ｖ ）プロピレングリ＝＋ −Ａ／ ； ０．５ ｍ
ｌ／分〕を用いるＨＰＬＯで分けた。
養上１ｎの２００マイクロリツトルは、ＷＡＴＫＲ８で
製造した装置（２カラムニー１２５；２０ｍＭリン酸ナ
トリウムｐｉ（７，１ＭＮａＣ１，０，１％Ｔｗθｅｎ
２０（ポリオキシエチレンーンルビタｙ−モノラウレー
ト、ｎ−２０、分子ｆｉ）約１２０［））、２５％（ｖ
／ｖ ）プロピレングリ＝＋ −Ａ／ ； ０．５ ｍ
ｌ／分〕を用いるＨＰＬＯで分けた。
３．５ ｍｌ宛分画を集め試験した。分子量を決定する
だめの比較のための蛋白質として、血清アルブミン、卵
アルブミン、トリプシノーゲンおよびり・７チームを同
じシステムで分けた。分析してみると、６０，０００±
１５％の分子酸に単一活性ピークを示した。
だめの比較のための蛋白質として、血清アルブミン、卵
アルブミン、トリプシノーゲンおよびり・７チームを同
じシステムで分けた。分析してみると、６０，０００±
１５％の分子酸に単一活性ピークを示した。
Ｃ）セルライン１６７０の培養上宿のい（つかの形質転
換（ＩｉＩ！ｊ瘍化）セルラインについての発育阻害活
性を調べた。これらの試験で、胛嶋、１１１胞（１０％
牛脂児血清、ペニシリンオ６よひストレプトマイシン添
加Ｆａｇｌθ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａ
１Ｍｅｄｉｕｍ中で培養）を培養皿（直径３ ｃｌｎの
皿について５０．［Ｊ ００細胞）に入れた。数時間し
てから、培地またはセルライン１６７０の標準培養上清
を加えて最終濃度１６ ＲＢ：／ｍ１．３ ｒｎ１／
１１１１とした。
換（ＩｉＩ！ｊ瘍化）セルラインについての発育阻害活
性を調べた。これらの試験で、胛嶋、１１１胞（１０％
牛脂児血清、ペニシリンオ６よひストレプトマイシン添
加Ｆａｇｌθ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａ
１Ｍｅｄｉｕｍ中で培養）を培養皿（直径３ ｃｌｎの
皿について５０．［Ｊ ００細胞）に入れた。数時間し
てから、培地またはセルライン１６７０の標準培養上清
を加えて最終濃度１６ ＲＢ：／ｍ１．３ ｒｎ１／
１１１１とした。
３７°Ｃで６または４日インキュベートしてから、■当
たりの維１ｊ抱数を数えた。それぞれの実験で、リンフ
ォトキシン含有のものと、培地のみのものな平行して調
製した。６個のセルラインについて、細胞数を毎日測定
した。結果を次表および第６図に示す。
たりの維１ｊ抱数を数えた。それぞれの実験で、リンフ
ォトキシン含有のものと、培地のみのものな平行して調
製した。６個のセルラインについて、細胞数を毎日測定
した。結果を次表および第６図に示す。
これらの結果は、１６７０細胞よりの培養上清か、種々
の種類の腫瘍細胞の増殖を阻害しうろことを示している
。この性質はリンフォトキシンに特徴的である（ Ｅｖ
ａｎｓ ｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ。
の種類の腫瘍細胞の増殖を阻害しうろことを示している
。この性質はリンフォトキシンに特徴的である（ Ｅｖ
ａｎｓ ｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、１２．１８１−１９０ （１９
８３））。
８３））。
この点で、この群の蛋白質がインターフェロンと異なっ
ている。つまり、インターフェロンも腫瘍細胞の発育を
阻害するが、一般的に８１％異的で。
ている。つまり、インターフェロンも腫瘍細胞の発育を
阻害するが、一般的に８１％異的で。
ヒトインターフェロンはマウス細胞にはほとんど活性を
示さない。
示さない。
上記した形質変換ヒ）Ｔ−淋巴球セルラインおよび腫瘍
セルラインは文献に記載されている。
セルラインは文献に記載されている。
セルライン１６７０は、 ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ
ＰａｔｅｎｔＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎ （ヨーロッパ特許
協定）のＲｕ１ｅ ２８により、” Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄ
ｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉａｍｅｓ （Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ
、 ） Ｉｎ５ｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ 、 Ｐａｒ
ｉｓ”に１９８４年６月２８日にＮｕｍｂｅｒ Ｉ −
２９４として寄託された。
ＰａｔｅｎｔＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎ （ヨーロッパ特許
協定）のＲｕ１ｅ ２８により、” Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄ
ｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉａｍｅｓ （Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ
、 ） Ｉｎ５ｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ 、 Ｐａｒ
ｉｓ”に１９８４年６月２８日にＮｕｍｂｅｒ Ｉ −
２９４として寄託された。
例２
ジテルペン化合物によりもたらされるサルＴ−濃厚培養
物を新鮮培地で１：２から１：６の比に希釈し、翌日１
：乙に希釈し、同じ基本培養物の５ ｍｌを宛を６個の
びんに移した。ステイミュレータ−を加えた（基礎溶液
１００マイクログラム／ｍｌゾメテルスルホキサイド）
。そして培≠４勿は６日間インキュベートした。細胞を
遠心して集め、上清はマイナス２０℃で凍結保存し、リ
ンフォトキシン試験に用いた。
物を新鮮培地で１：２から１：６の比に希釈し、翌日１
：乙に希釈し、同じ基本培養物の５ ｍｌを宛を６個の
びんに移した。ステイミュレータ−を加えた（基礎溶液
１００マイクログラム／ｍｌゾメテルスルホキサイド）
。そして培≠４勿は６日間インキュベートした。細胞を
遠心して集め、上清はマイナス２０℃で凍結保存し、リ
ンフォトキシン試験に用いた。
次表は、２つの遇んだジテルペン原動プロモーター、つ
まり１２−０−？トラデカノイルーフォルボールー１６
−アセテート（ＴＰＡ ）およびメゼ、レインの、選択
されたサルチー淋巴球セルラインにおけるリンクオドキ
シン産生に及はす活性を示す。
まり１２−０−？トラデカノイルーフォルボールー１６
−アセテート（ＴＰＡ ）およびメゼ、レインの、選択
されたサルチー淋巴球セルラインにおけるリンクオドキ
シン産生に及はす活性を示す。
例３
血清不合培地におけるリンクオドキシンの産生血清含有
培地中で細胞を増殖させたあと（例２）、細胞は血清不
含培地に移した。
培地中で細胞を増殖させたあと（例２）、細胞は血清不
含培地に移した。
次表は、 ２０ ｎｇのメゼレイン／ｍｌの存在での血
清含有および血清不含培地中、例１の類似の１６７０細
胞中リンクオドキシン産生の比較を示す。
清含有および血清不含培地中、例１の類似の１６７０細
胞中リンクオドキシン産生の比較を示す。
Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法を用い蛋白質を測定した（ Ａ
ｎａｌ。
ｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ７２．２９８ （１９７６））。
例４
孔度調整カラム上のクロマトグラフィーによる１６７０
細胞よりのリンフォトキシンの濃縮および精製 廻転″エルノンマイヤーフラスコ中１０％牛脂児血清添
加ＲＰＭＩ １６４０培地中１６７０細胞を培養した。
細胞よりのリンフォトキシンの濃縮および精製 廻転″エルノンマイヤーフラスコ中１０％牛脂児血清添
加ＲＰＭＩ １６４０培地中１６７０細胞を培養した。
１リットルフラスコ中０．５リツトルの培養物、４０回
転／分。静止増殖培養物よりの細胞を遠心し、洗い２０
ｎｇ／ｍｌのメゼレイン副加血清不含ＲＰＭＩ １６
４０培地に再懸濁させた。懸濁液は、１５０ｃＩｒＬ”
プラスチック培養フラスコ（２００ｍ１／フラスコ）中
６日＋ｍＪ静１度した。ついで遠心し濾過し培養上清を
得た。
転／分。静止増殖培養物よりの細胞を遠心し、洗い２０
ｎｇ／ｍｌのメゼレイン副加血清不含ＲＰＭＩ １６
４０培地に再懸濁させた。懸濁液は、１５０ｃＩｒＬ”
プラスチック培養フラスコ（２００ｍ１／フラスコ）中
６日＋ｍＪ静１度した。ついで遠心し濾過し培養上清を
得た。
このように調製した培養物の上清は、孔度調整ガラス１
０ｍ１上でクロマトグラフした。孔直径＝６５０オング
ストローム、粒子の大きさ：１２０−２００メツシュ、
カラムの直径：９ｍＮ％流、速：１４０ｍ１／時。つい
でカラムはｉＱｍｌＪのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７，２／ １．５ Ｍ Ｎａｃｌで洗い、最後に５０％
（Ｖ／Ｖ ）エチレングリコール中同じ緩衝液で溶出し
た。
０ｍ１上でクロマトグラフした。孔直径＝６５０オング
ストローム、粒子の大きさ：１２０−２００メツシュ、
カラムの直径：９ｍＮ％流、速：１４０ｍ１／時。つい
でカラムはｉＱｍｌＪのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７，２／ １．５ Ｍ Ｎａｃｌで洗い、最後に５０％
（Ｖ／Ｖ ）エチレングリコール中同じ緩衝液で溶出し
た。
次表に２つの実験の結果を示す。
例５
１６７０および１０２２細胞よりのＲＮＡ調製物中リン
フォトキシン−ｍＲＮＡ活性の検出１０％牛脂児血清添
加細胞培養培地８００ ｍｌ中に約５Ｘ１０５細胞／ｍ
ｌに細胞を懸濁させ、２０ｎｇのメゼレイン／ ｍｌを
加えた。２０時間後、細胞を遠心採取し、適当な緩衝液
（たとえば’ｌＱｍＭのＴｒｉｓ ＨＣＩ、 ｐＨ７，
４，１４０ｍＭ ０）ＮａＣ１，１，５ｍＭのＭｇＣ１
２）で洗い、１ｌｍｌの細胞溶解用緩衝液（たとえば、
１０ ｍＭ Ｔｒ ｉｓ −ＨＣｌ、 ｐＨ８，４，１
４０ｍＭｆＪａｃｌ、 ｉ 、５ ｍＭＭｇｃ１２．０
．５％Ｎｏｎ１ｄｅｔ−Ｐ２Ｏ（非イオン性洗浄剤、Ｓ
Ｈ］３；ＬＬの商品名〕）に懸濁させた。
フォトキシン−ｍＲＮＡ活性の検出１０％牛脂児血清添
加細胞培養培地８００ ｍｌ中に約５Ｘ１０５細胞／ｍ
ｌに細胞を懸濁させ、２０ｎｇのメゼレイン／ ｍｌを
加えた。２０時間後、細胞を遠心採取し、適当な緩衝液
（たとえば’ｌＱｍＭのＴｒｉｓ ＨＣＩ、 ｐＨ７，
４，１４０ｍＭ ０）ＮａＣ１，１，５ｍＭのＭｇＣ１
２）で洗い、１ｌｍｌの細胞溶解用緩衝液（たとえば、
１０ ｍＭ Ｔｒ ｉｓ −ＨＣｌ、 ｐＨ８，４，１
４０ｍＭｆＪａｃｌ、 ｉ 、５ ｍＭＭｇｃ１２．０
．５％Ｎｏｎ１ｄｅｔ−Ｐ２Ｏ（非イオン性洗浄剤、Ｓ
Ｈ］３；ＬＬの商品名〕）に懸濁させた。
水浴中１０分インキュベートし、懸濁液を短時間振り、
細胞核を遠心除去した。既知の方法たとえばフェノール
抽出で遠心上清（細胞質）よりＲＮＡを分離した（ Ａ
ｖｉｖ等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ。
細胞核を遠心除去した。既知の方法たとえばフェノール
抽出で遠心上清（細胞質）よりＲＮＡを分離した（ Ａ
ｖｉｖ等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ。
ＵＳＡ ６９，１４０８−１４１２（１９７７）。最後
に、水に溶解（約３−５ ｍｇ／ｍｌ ） シ、既知の
方法でＸｅｎｏｐｕｓ １ａｅＶｉｓ （アフリカッメ
ガエル）の卵母細胞中に翻訳した（たとえばＣｏｌｍａ
ｎ等、Ｃｅ１ｌ １ ７ 、 ５１ ７−５２６ （１
９７９）、Ｈｌｔｃｈｃｏｃｋ等、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ 、 １０９ 、３３８’ −３４４（１９８
０）およびＣｏｎｔｒｅｒａｓ等、 Ａｎａｌ。
に、水に溶解（約３−５ ｍｇ／ｍｌ ） シ、既知の
方法でＸｅｎｏｐｕｓ １ａｅＶｉｓ （アフリカッメ
ガエル）の卵母細胞中に翻訳した（たとえばＣｏｌｍａ
ｎ等、Ｃｅ１ｌ １ ７ 、 ５１ ７−５２６ （１
９７９）、Ｈｌｔｃｈｃｏｃｋ等、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ 、 １０９ 、３３８’ −３４４（１９８
０）およびＣｏｎｔｒｅｒａｓ等、 Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１３．１８５−１８７（１９８１）
をみよ）。翻訳生成物のリンフォトキシン活性を生物学
的に調べた。
をみよ）。翻訳生成物のリンフォトキシン活性を生物学
的に調べた。
次表に、卵母細胞上清中に見出された細胞毒活性を、ヒ
トＴ−淋巴球セルラインであるＭＯＬＴ −４細胞より
のＲＮＡ調製物と比較した。ＭＯＬＴ −４細胞および
未処理卵母細胞の培養物の上清はなんらの検出され５る
リンフォトキシン活性を示さない。
トＴ−淋巴球セルラインであるＭＯＬＴ −４細胞より
のＲＮＡ調製物と比較した。ＭＯＬＴ −４細胞および
未処理卵母細胞の培養物の上清はなんらの検出され５る
リンフォトキシン活性を示さない。
表から分るように、イ６７０細胞および１０２２細胞の
ＲＮＡ調製物の３種共、１４７倍までの希釈で、遊離さ
れる放射活性著しい増加を与えた。しかし、ＭＯＬＴ
−４細胞よりの１（ＮＡはそのような活性を示さない。
ＲＮＡ調製物の３種共、１４７倍までの希釈で、遊離さ
れる放射活性著しい増加を与えた。しかし、ＭＯＬＴ
−４細胞よりの１（ＮＡはそのような活性を示さない。
これらの菜験は１６７０および１０２２細胞よりのＲＮ
Ａ調製物中に、生物活性リンクオドキシン−ＩＩＩＲＮ
Ａの存在を示す。
Ａ調製物中に、生物活性リンクオドキシン−ＩＩＩＲＮ
Ａの存在を示す。
第１図は、１６７０細胞の倍長上清のリンフォトキシン
活性の検出例を示す。 第２図は、１６７０細胞よりのリンフォトキシンの分子
′１Ｊｔｎ４１１定のための尚速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示す。 第６図は、セルライン１６７０の培養上清の６棟の形質
転換（腫瘍化）セルラインに対する・亀育阻害活性を示
す。 代理人 浅 村 皓 第１図 外イ尺 ・ １６７０ ＆１ｌｆｆ−Ｊ４．＋Ｊｔ★ １解 （
堵罠） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’ 識別記号 庁内整理番号Ｃ１２Ｒ
１：９υ
活性の検出例を示す。 第２図は、１６７０細胞よりのリンフォトキシンの分子
′１Ｊｔｎ４１１定のための尚速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示す。 第６図は、セルライン１６７０の培養上清の６棟の形質
転換（腫瘍化）セルラインに対する・亀育阻害活性を示
す。 代理人 浅 村 皓 第１図 外イ尺 ・ １６７０ ＆１ｌｆｆ−Ｊ４．＋Ｊｔ★ １解 （
堵罠） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’ 識別記号 庁内整理番号Ｃ１２Ｒ
１：９υ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） ウィルスで形質転換されたサルチー淋巴球を適
当な培地中で永久培養物として発育させそしてリンフォ
トキシンまたはリンクオドキシン−ｍＲＮＡを既知の方
法で分離することを特徴とするリンクオドキシンまたは
リン７オトキシンーｍＲＮＡを調製する方法。 （２） 用いるウィルスを、ヘルペスウィルス、なるべ
くハヘルペスウイルスｓａｉｍｉｒｉ マタハヘルヘス
ウイルスａｔθ１ｅ日とすることを特徴とする、上記（
１１項記載の方法。 （３） ｓａｇｕｉｎｕｓ属の細胞をサルチー淋巴球細
胞として用いることを特徴とする、上記（１１項記載の
方法。 （４） セルライン１０２２．１６７０．７０１Ｊ ２
、Ｌ７７−５、Ａ６５１またはＡ２５４３なＴ−淋巴球
セルラインに用いることを特徴とする、上記（３）項記
載の方法。 （５） セルライン１０２２または１６７０をＴ−淋巴
球セルラインとして用いることを特徴とする、上記（３
）項記載の方法。 （６１１０％までの牛胎児血清を培地に加えることを特
徴とする、上記（１１から（５）項までのいずれか一つ
に記載の方法。 （７）低分子量腫瘍プロモーター、なるべくはジテルペ
ンさらに特にｄａｐｈｎａｎｅ 、ｉｎｇｅｌａｎｅお
よびｔｉｇｌｉａｎθ型のジテルペンまたはインドール
アルカロイドをリンフォトキシンまたはリンフォトキシ
ン−ｍＲＮＡ産生な刺激するために加えることを特徴と
する、上記ｍから（６）項までのいずれか一つに記載の
方法。 （８） インキュベーション中のリンフォトキシンの産
生な刺激するために、腫瘍プロモーターとしてのフォル
ボール（ｐｈｏｒｂｏｌ ）またはメゼレイン（ｍｅｚ
ｅｒｅｉｎ ）を１から１０００ ｎｇ／ｍ４なるべく
ハ１０から１１００ｎ／ｍｌに濁加することを特徴とす
る、上記ｆｉｌから（７）項までのいずれか一つに記載
の方法。 （９）インキュベーション中のリンクオドキシン−ｍＲ
ＮＡの産生な刺激するために、腫瘍プロモーターとして
のフォルボールまたはメゼレインを１から１０００ ｎ
ｇ／ｍｌ 、なるべくは１０から１００ ｎｇ／ｍｌに
添加することを特徴とする、上記（１１から（７）項ま
でのいずれか一つに記載の方法。 （ｌＧ 血清含有培地中に細胞を増殖させたあと、細胞
を血清不含培地に移すことを特徴とする、上記（１）か
も（８）項までのいずれか一つに記載の方法。 圓 １から７日後、なるべくは２から４日後の培養物の
上清よりリンフォトキシンを採取することを％徴とｊる
、上記（ｉ）から（８）項までおよびｔｔｔｎ項のいず
れか一つに記載の方法。 ａｚ 孔度調整ガラスのカラム上でリンフォトキシンを
濃縮することを特徴とする、上記（１）から（８１Ｊｊ
ｌ、０（２）および（１１１項のいずれか一つに記載の
方法。 叫 牛胎児血清を含有する培地中で細胞をインキュベー
トしそして６から４８時間後、なるべくは６から２４時
間後の細胞よりリンフォトキシン−ｍＲＮＡを分離する
ことを特徴とする、上記（１）から（７）項までおよび
（９）項のいずれか一つに記載の方法。 （１４１上記（１）カらｆ８＋項ｔテオヨヒ１１０１カ
ラｌ１２項マチに記載のように産生されうるリンフォト
キシン。 （１５１６０，０００±１５％の分子量を有することな
特徴とする、上記α４項記載のリンスオドキシン。 （１６１” 上記（１）から（７１項およびＱ３項に記
４（のように調製し５るリンフォトキシン−ｍＲＮＡ
０鰭 上記（１４１または（１５１項記載のリンフォト
キシンを含有する薬剤組成物。 ０８１ 腫瘍細胞を抑制するだめの上記ａｎ珀記載の薬
剤組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3331108.0 | 1983-08-30 | ||
| DE19833331108 DE3331108A1 (de) | 1983-08-30 | 1983-08-30 | Verfahren zur herstellung von lymphotoxin und von lymphotoxin-mrna |
| DE3417277.7 | 1984-05-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60126298A true JPS60126298A (ja) | 1985-07-05 |
Family
ID=6207707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59181617A Pending JPS60126298A (ja) | 1983-08-30 | 1984-08-30 | リンフオトキシンまたはリンフオトキシン−ｍＲＮＡの調製方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60126298A (ja) |
| DE (1) | DE3331108A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA846732B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6156197A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-03-20 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 |
-
1983
- 1983-08-30 DE DE19833331108 patent/DE3331108A1/de not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-08-29 ZA ZA846732A patent/ZA846732B/xx unknown
- 1984-08-30 JP JP59181617A patent/JPS60126298A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6156197A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-03-20 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA846732B (en) | 1986-05-28 |
| DE3331108A1 (de) | 1985-05-02 |
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