JPS62185027A - 組換えインタ−ロイキン−２組成物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は組換えインターロイキン−２組成物およびその
製造方法に関する。

参考文献 インターロイキン−２（工Ｌ−２）は、リン’原反応性
を調節しそして抗原特異的エフェクターである’ｌ’　
＋　１７７２球の長期試験管内培養を促進することので
きる可溶性タンパク質であり、従来はマウス、ラットま
たはヒトリンパ球細胞をマイトジェンで刺激することに
よって生産されている。ヒト１Ｌ−２は分子内ジスルフ
ィド橋を１個含む１３６個のアミノ酸より成るポリにプ
チドから構成されている。

米国特許第４，４０１，７３６号明細書には、ヒト白血
病またはリンパ唾細胞を各種添加剤を補給した血清含有
培地中で培養することにより悪性細胞から工Ｌ−２を製
造する方法が開示されている。

その培養物を至適濃度のＴ−細胞マイトジェンで刺激す
ると工Ｌ−２を含む上澄みが得られる。所定時間の後、
上澄みを集めそしてＩＬ−２の精製処理を施す。この特
許は、　　Ｊｕｒｋａｔ−Ｆ’ＨＣＲＣと表示される細
胞系統が好ましい白血病ヒ）Ｔ−細胞源であることと開
示している。

米国特許第４，４９０，２８９号明細書には、誘導され
たヒト悪性細胞に由来するヒト１Ｌ−２の精製方法が開
示されている。工Ｌ−２は多数の逆相高速液体クロマト
グラフィ工程を用いることによって均質と表るまで精製
される。この特許は、精製された工Ｌ−２が抗原特異的
エフェクターチーリン・ぞ球の長期試験管内培養を促進
し、リン／ぞ原酒性を調節する上で強力な活性を示すこ
とを開示している。Ｊｕｒｋａｔ−ＩＰＨＯＲＯ白血病
ヒトＴ細胞系統が好ましい細胞系統であるとされ、そし
て得られる精製物質は、−例においては２０５，０００
単位／−１そして他の一例においては９８５．０４０単
位／ｌｎｔの活性を有するものとして開示されている。

この特許は、−７０℃においてさえ不安定であって活性
の保持に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）またはポリエチレ
ングリコールを要するところの正常細胞よりの工Ｉｔ−
２の従来の調製物を記載している。この特許では１単位
の活性は、最大チミジン取込みの５（ｌを誘導するＴ細
胞培養ウェルに存在するマイクロリットル数として定義
されている。

Ｕｒｄａ１氏等（、Ｔｏｕｒｎａｘ　ｏｆＣｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ。

里、１７１〜１７９　（ｂ９８４）　）は、ピリジン−
アセテート−プロパノール中の０８逆粕カラムでヒト１
ｘ、−２（Ｊｕｒｋａｔ）を精製した後トリフルオロ酢
酸−ア七トニトリル中の０１８逆相カラムでのクロマト
グラフィにかけることを開示している。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ氏等（Ｎａｔｕｒｅ、　３０２，３
０５　（ｂ９８５）　）はＪｕｒｋａｔ細胞系統よυの
ヒトエＩ、−２相補ＤＮＡクローンの単離、およびその
ヌクレオチド配列の決定を開示している。

Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ氏等（８ｃｉｅｎｃｅ、　２２３．
１４１２〜１４１５゜（ｂ９８４））は、　Ｊｕｒｋａ
ｔ細胞系統および正常末梢血液リンパ球からのインター
ロイキン−２遺伝子の単紙その遺伝子の大腸菌（Ｋｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ヘの挿入、および得ら
れる形質転換微生物によるその遺伝子の発現を開示して
いる。工Ｌ−２は明らかに均質になるまで精製された。

ここでは天然および組換えｘＩＩ−２分子の間に機能上
の差異は検出されないと報告されている。

欧州特許出願第８４３０４９９２．５号（欧州公開番号
第０１３！１７６７Ａ２）　　明細書は、ヒト白血球カ
ラ得られるガンマインターフェロ／（これは凍結乾燥お
よび固体状態で貯蔵を行っている間でさえ不安定である
）が、アルブミンおよび／または糖の添加により安定化
され得ることを開示している。使用可能麦糠には、単糖
類、二糖類、糖アルコールおよびそれらの混合物が含ま
れるとされている。特記されているのはグルコース、マ
ンノース、ガンクトース、フ２／ドース、シュークロー
ス、マルトース、ラクトース。

マンニトールおよび中シリトールなどの化合物である。

上記公報は、安定な凍結乾燥ガンマインターフェロン組
成物がこの安定剤を含むその水性溶液をその活性を低下
させることなく凍結乾燥することによって調製されるこ
とをも開示している。

Ｇｅｋｋｏ氏等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０．４
６７７〜４６８６（ｂ９８１））はグリセロールによる
タンパク質安定化の熱力学的および動態研究を論じてい
る。関与した特定のタン、Ｊり質はキモトリプシノゲン
およびリボヌクレアーゼであった。

組換え工Ｌ−２（ｒＩＬ−２）を形質転換大腸菌Ｑｃ、
ｃｏ１１）から生産する場合、そのｒＩＬ−２は発酵後
過程。

即ち、細胞ペーストを音波処理し、有用タンパク質を抽
出し、逆相高速液体クロマドグ２フイ（ｆＩＰｔｏ　）
の使用により抽出ｒ工Ｌ−２を精製し、そして得られる
精製ｒ工Ｌ−２をしばしばヒト血清アルブミンなどの担
体と共に水に再懸濁することにより回収および精製され
る。ｒ工Ｉ、−２が直ちに使用されない場合、一般にそ
れはＨＰＸａＯ精製後凍結乾燥されそして必！！忙応じ
再懸濁される。この再懸濁ｒ　ＩＬ−２組成物の比活性
は典型的には約５α０００単位／ｍｇタン／４り質（こ
れは純粋ヒトＪｕｒｋａｔ工Ｉ、−２のそれの約１４７
１である）より低いが、約９０，０００単位／ｍｇに及
ぶこともあり得る。

工Ｌ−２−＆どのタン・ぞり質を治療目的に用いる場合
、比活性をなるべく高くシ、それによって不活性タン・
ぞり質が有害な影響を及ぼす可能性を最小限に抑えるの
が望ましい。更にまた。最近。

人血に由来する成分を有する生物学的製品を用いること
についてはかな）公的な関心をもたれている。この関心
は、極く最近では、血漿由来第■因子および天然ヒト成
長ホルモンに集中しているが、これらはヒト血清アルブ
ミンのような成分を含有し得る。従って、高い比活性を
有し、そして人血に由来するキャリアーを全く欠いてい
るｒＩＬ−２組成物が極めて望ましい。

発明の概要 本発明は本質的に水、組換えヒトＩＬ−２および場合に
よりポリオールより成シ、その比活性が精製Ｊｕｒｋａ
ｔ工Ｌ−２の比活性の少くとも約４０俤である少くとも
約１２０，０００単位／ｍｇタン／ぞりによる精製後に
凍結乾燥されたヒトｒ工Ｉ、−２を水、および所望によ
りポリオールと混合して懸濁液を形成し、そして得られ
た懸濁液を約２５℃〜約９５℃の温度で少くとも約２時
間加熱することより成る前記組換えヒ）　ＩＬ−２の製
造方法をも提供するものである。

発明の詳細 な説明の組成物は１本質的に水、ｒＩＬ−２，および場
合により担体としてのポリオールより成る。本明細書で
用いる［本質的に・・・・・・より成るの）」という表
現は１組成物が当該組成物の基本的かつ新規な特徴、例
えばその高い比活性を実質的に変えないのであればその
他の成分を含むことができることを意味している。

ｒ工Ｌ−２は、そのｒ工Ｌ−２遺伝子を有するプラスミ
ドによって形質転換された大腸菌（Ｋ、　ｃｏｌｙ）な
どの微生物の発現によって製造される。かかる微生物の
製造方法は、既述のＲｏａｅｎｂｅｒｇ氏等およびＤｅ
ｖｏｓ氏等による論文（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１５Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ　１１．４３０７〜４３２３　（ｂ９８！
１）　）に記載されている。好ましくは、ｒ工Ｌ−２は
同時係属している米国特許出願第６２８．ｆ４５号明細
書（その関連記載部分を本明細書の記載の一部として含
める）に示された手順により、そして大腸菌（ｍ。

ｃｏｌｉ　）　Ｋ１２　ＨＢ１０１株を用いることによ
り製造される。それらの手順に従って大腸菌（Ｋ、ｃｏ
ｌｉ　）をプラスミドｐＴｒｐＫ工Ｌ−２（これは受託
番号３９７５０を有するＡＴＣＣ寄託から入手すること
ができ°る）で形質転換し、そして得られた形質転換大
腸菌（ｂ！、ｃｏｌｉ　）を３７℃で適当な培地で増殖
させる。

ｒＸＸ、−’ｌを形質転換微生物の培養物から回収しそ
して実質的に均質となるまで精製する。培養物から集菌
して得られる菌体に一ストよりｒ工Ｌ−２を抽出する。

好ましくは、ｒ工Ｌ−２は約ｏ℃〜約２５℃で、　０１
−０５カルボン酸より成る群より選択される有機酸を用
いることにより抽出される。最も好ましくは、このカル
ボン酸は酢酸である。適当なカルボン酸濃度は約６ｏチ
〜約１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約６０’Ａ〜約８
０チ（ｖ／Ｖ）　、最も好ましくは約ｓ　ｏ　ｅＡ　（
ｖ／ｖ）である。

ｒ工Ｌ−２の抽出方法は、更に、同時係属出願である米
国特許出願第７５９．１８０号明細書（その記載を本明
細書の記載として含める）に記載されている。カルボン
酸の菌体ペーストに対する適当な比は湿潤菌体ペースト
１　ｆ、ｌたシ少くとも約８−である。菌体ば一ストと
カルボン酸を約３０分間以上混合し、次いで得られた懸
濁液を遠心分離すると組換えタンパクの酸抽出液である
上澄みが得られる。

クロマトグラフィによるタンパク質の精製手順は周知で
ある。好ましくは、抽出ｒ工Ｌ−２はＨＰＬＯにより精
製される。ｒ工Ｌ−２の酸抽出液は。

場合によりＣＬ１容量チドリフルオロ酢酸溶液で希釈し
、適当な酸安定フィルター、例えば０．４５μｍナイロ
ンフィルターを通して濾過した後、カラム、平衡溶媒お
よび溶出溶媒より成るＨＰＬＯ系にかけることができる
。適当なカラムは、例えばＣ３または０４など低分子量
アルキル鎖またはフェニル部分で誘導体化されたシリケ
ート系支持体（いずれの場合も約５〜約３００　ｐｍの
平均粒度および約３０　ｎｍ以上の細孔径を有する）を
含む。適当な平衡溶媒は、アセトニトリルまたはプロパ
ツ−ルを約０〜１５％（Ｖ、ＡＩ　）の量にて含むトリ
フルオロ酢酸（ＴＩＦＡ）の０．１１水性溶液である。

適当な溶出溶媒はアセトニトリルまたはプロパツールを
約７０％（Ｖ／Ｆ）以下の量で含むトリフルオロ酢酸の
０．１チ水性溶液である。

ｒ工Ｌ−２に対しては、一般に最初にアルキルカラムの
方が使われた後フェニルカラムが用いられる。

ＨＰＬＯ処理からの溶出溶媒中のタンパク質は高速凍結
されそして凍結乾燥される。場合により、凍結乾燥に先
立って、タン・ぞり質含有溶出溶媒を担体タン・（り質
またはポリオールまたはいずれかの希溶液と組合せるこ
ともできる。ポリオ−ルの希溶液を用いると大量のＨＰ
ＬＯ溶出溶媒中の希組換えタンパク質の凍結が容品とな
る。希溶液中のポリオール濃度は約２ｍＭ〜約１５ｍＭ
とするヒとができ、また希釈剤の容量は、ＨＰＬＯ溶出
溶媒１容量あたり約１〜約３容量とすることができる。

適当力担体タン・（り質としては、ヒト、牛またはモル
モット血清アルブミン壜どが挙げられる。担体タンノモ
ク質を凍結乾燥に先立って用いる場合には、その使用量
は本発明方法において高活性をもたらす再懸濁および加
熱工程の障害となる程の量であってはなら危い。ヒト血
清アルブミンを凍結乾燥に先立ち担体タンパク質として
用いる場合には、それはｒ工Ｉ、−２１η当り２岬以下
の濃度で存在するのが好ましい。

血液に由来する担体を含まない最終組成物が得られるよ
うに担体タンパク質を用いないのが好ましい。適当なポ
リオールは後述のとおシである。

本発明方法において、凍結乾燥ｒ工Ｔ、＋−２の再懸濁
は凍結乾燥タン・ぞり質ケーキを水または場合によりポ
リオールの希求性溶液に添加しそして得られる混合物を
約２５℃〜約９５℃の温度で少くとも約２時間加熱する
ことによって行われる。最高レベルの比活性を得るには
前記混合物を好ましくは約２５℃〜約７５℃そして最も
好ましくは約り０℃〜約６０℃の温度に加熱する。

好ましくは混合物中のｒＩＬ−２の濃度は少くとも約α
５ＭＩ／−とする。本発明の好ましい一態様においては
加熱工程から得られるｒＩＬ−２の懸濁液を約０℃に急
冷する。本発明方法は、本発明方法によって処理される
前のｒＩＬ−２に比ベニＬ−２比活性が実質的に増大し
たｒＩＬ−２組成物を提供する。

好ましくは、本発明方法にポリオールが用いられ、また
好ましくは本発明の組成物にはポリオールが存在する。

本発明に適したポリオールは一般に水混和性であるか水
溶性である。ポリオールの使用ならびに存在はｒＸＬ−
２の活性に最大の増大をもたらす。ポリオールは多価ア
ルコール、単糖類および二糖類より成る群より選択され
る。適当な多価アルコールとしてはマンニトール、グリ
セロールおよびグリコール例えばエチレンクリコール、
フロピレンクリコールおよびトリメチレングリコールな
どが挙げられるがグリセロールおよびエチレングリコー
ルが好ましく、そしてグリセロールが最も好ましい。

本発明の方法および組成物に用いるのに適した単糖類と
しては例えばグルコース、フック）−ス、アラビノース
およびマンノースが挙げられるがグルコースが好ましい
。適当な二糖類としては例えばマルトースおよびシュー
クロースが挙げられるがシェークロースが好ましい。

ポリオールは凍結乾燥の際かあるいは加熱の際のいずれ
でも添加することができ、おるいは両方の工程で添加す
ることもできる。ポリオールは再懸濁の際Ｋｔｉ、加熱
すべき組成物中のポリオール濃度を約α０３Ｍ〜約ＡＯ
Ｍとするのに十分な量で用いられる。好ましい態様では
溶液１−あた２５０１１Ｆのポリオールを有する２０パ
の溶液を各１１１１１のＨＰＬＣ！精製ｒ工Ｌ−２（ｒ
ＩＬ−２０，２＋１１９／−）に対して用いる。得られ
る溶液を凍結乾燥乾固し、そして得られた物質を１００
パのポリオール溶液に添加する。この場合のポリオール
は、ヒトを治療するための注射可能な組成物に用いるの
に許容し得るポリオールであるのが最も好ましい。

工Ｌ−２がＡ、ＢおよびＣと称される３個のシスティン
を有していることは知られている。Ｊｕｒｋａｔ（天然
ヒト）工Ｌ−２はＡＢジスルフイＶ橋を有スル。

組換えポリはプチドの発現の結果は実際上すべてのシス
ティンが還元されている。それらシスティンは空気に晒
すことにより、あるいはエージングにより再酸化してラ
ンダムなジスルフィド橋を形成することができる。ｒＩ
Ｌ−２の場合、ＡＢ　、　ＢＯおよびＡＣという３８！
類の連鎖間橋が可能である。ＡＢ：）スルフィＶ橋を有
する形のみが生物学的に活性であるとされている。本発
明は理論により制約を受けるものではカいが、本発明の
加熱工程はｒＩＬ−２分子が実質上比較的高い度合で正
常ＡＢジスルフィド橋を採用することを可能にするもの
と思われる。

本発明の組成物はタンパク質１〜当シ少くとも約１２０
，０００単位、好ましくは少くとも約１４０．０００、
そして最も好ましくは約１７０，０００〜約２２０．０
００単位の比活性を有する。本発明組成物の比活性はタ
ンパク質１〜当り約３００，０００単位の比活性を有す
る純粋Ｊｕｒｋａｔ　（天然ヒト）工Ｌ−２のそれの少
くとも約４０％である。本明細書に用いられるところの
比活性は、　Ｇｉ’１ｌｉｓ氏等による工ｍ！ｎｕｎｏ
１０ｇｙ　１２旦、　２０２７〜２０３２　（ｂ９７８
）に記載のｒ工Ｉ、−２検定法によって測定されるが、
次のような変更がなされる。すなわち、　（ａ）　Ｄｕ
ｌｂｅｃｃ。

の変性ＫａｇｌＪ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ａ　Ｍｏｄ
ｉｆｉｅｃＬ　ＥｈｇｌｅＭｅｄｉｕｍ　：略称Ｄ）Ｊ
ＲｊＭ　）十高グルコース培地をＣ１１ｃｋｓ培地に代
えて用いる、（ｂ）ハニシリンおよびＮ−２−ヒｒｏ＄
シーピＡ　９　ｕ　ｙ　−Ｎ′−２−エタンスルホン１
１　（ＨＩＰＭ！日）緩衝剤を省略する、（ｃ）　０．
　Ｉ　Ｍピルビン酸ナトリウムを添加し、そして（ａ）
Ｊｕｒｋａｔ　（天然ヒト）工Ｌ−２をスタンダードと
して用いる。以上の検定法において、工Ｌ−２検体の活
性はクローンされた工Ｌ−２依存性マウスＴリンパ球２
イン内への３Ｈ−チミジンの濃度依存性取込みを測定す
ることによって決定される。未知検体により誘起される
取込みを既知スタンダーＶのそれと比較すれば未知検体
の相対活性が得られる。

前述の検定法に従い、セして３０Ｑ、０００単位／ＩＩ
ｖノ比活性を有するＪｕｒｋａｔ　ＩＬ−２をスタンゲ
ートとして用いると、少くとも５００単位／−であるべ
き国際スタンダードは１α７±２．５単位／ｄ（ｎ−６
）の活性を有する。国際スタンダーＶはＢｅｒｔｏｇｘ
ｔｏ氏等のＬ７ｍｐｈＯｋｉｌｌｌｅＲｅＢ、上、１２
１〜１２７　（ｂ９８２）に記載の基準検体である。従
ってＩＬ−２調製物を本明細書に記載のＪｕｒｋａｔ　
ＩＬ−２スタンダードを用いて検定すると、その工Ｉ、
−２調製物は国際スタンダードを用いた場合に得られる
であろう値の約５０分の１（ｂ１５０）にｉｂたる活性
値を有することになる。本明細書に記載の比活性測定値
は約±２０俤の精度を有する。本発明方法では最終活性
がタン・ξり質１１Ｎｉ当り１２０．０００単位を下回
った場合ですら比活性の増大したｒＩＬ−２組成物を提
供することができることは理解されるべきである。

ＩＬ−２は免疫応答を高めそして免疫不全Ｔ細胞集団を
回復させるのに有用であると考えられている。Ｂｙｌｉ
ｎｓｋｙ氏はＦｏｒｔｕｎｅ、　Ｎｏｖ、　２５．１９
８５゜ｐｐ１６〜２１　において日、ム、　Ｒｏｓｅｎ
’ｂｅｒｇ氏による癌研究を報じている。Ｒｏａｅｎｂ
ｅｒｇ氏は患者を多量のインターロイキン−２と患者自
身の活性化膜癌細胞で処理した。まず患者の白血球の約
ＩＣ１をとシ取しそして工Ｌ−２と混合した。それら細
胞と多量のＩＬ−２は注射により患者に戻した。この報
告によれは、　ＩＬ−２はキラー細胞を患者の体内で増
殖させそしてこれらの細胞が１１！ｔｌ瘍攻繋を開始す
るのである。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ氏は彼の最初の研究に
おいて６０名の重症患者の半分において寛解傾向を得た
ことを報じている。

本発明を更に以下の実施例によって説明する。

特段の断りがなければ実施例中チはすべて容量係であり
、温度はすべて摂氏温度であり、また比活性は前述の検
定法によ！り３００，０００単位／ｍｇの比活性を有す
るＪｕｒｋａｔ　ＸＸａ−２をスタンダードとして用い
て測定されたものである。

実施例　１〜６ プ２スミドｐＴｒｐ工Ｌ−２で形質転換された大腸菌（
ＩＩ！、ａｏｌｉ’・）　Ｋ１２　ＨＢ１０１株を用い
て米国特許出願第６２ａ１４５号明細書に記載の方法に
より組換えｌ−２を調製する。菌体を９．９ａの補給さ
れたＭ９培地で生育させる。遠心分離により菌体は−ス
トを集めそして一７０°で凍結保存する。そのは−スト
を解凍させそしてＣＬＯＩ　Ｍ　Ｔｒｉ８ａｌｌ、　ｐ
Ｈａｏ、０．００１Ｍエチレｙシフ　ミｙ四酢酸（ＩＤ
ＴＡ　）、α１５　Ｍ　ｍａｃＡ　（Ｔｌ１ｌ＋Ｎａ０
ｊｌ　）中にイースト１ｆＫつき２−の割合で再懸濁す
る。細胞を音波により破砕しそして１２，０００Ｘｆで
１５分間遠心分離する。得られる１チより少いＩＬ−２
を含む上澄みを捨て、そして得られるはレットを６７ｑ
ＩＪ酢酸中にイースト１２当シ１２−の割合で再懸濁す
る。その懸濁液を４１′で１時間攪拌し１次いで前述の
如く２時間遠心分離する。得られる酢酸上ｆｆｌミｔ−
１２μｍフィルタを通して一過する。

−過された上澄みをＶａｒｅｘ装置と直径５　ｃｍ　Ｘ
高さ３０５１であって（ａ）　Ｖｙｃｌａｃ　０４−誘
導体化シリカ（ｂ５〜２０　ａｍ粒子、細孔径３００Ｘ
）または（ｂ））Ｖｙｌａｃジフェニル−誘導化シリカ
（′５０μｍ粒子、細孔径５ｏｏ１＞を含有するカラム
を用いたＨＰＬＣにかける。平衡溶媒および溶出溶媒と
してアセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸（ＩＺ５／
８７．５／α１）およびアセトニトリル／水／トリフル
オロ酢酸（８７，５／１２．５／α１）を用いる。溶出
は溶出液のスプリット流れのＵＶ吸収によって監視する
。

−過された酢酸上澄みを６６−７分で０４カラムにかけ
基底線吸収に到達するまで平衡緩衝液で洗浄し、そして
１２．５ｑＡから５Ｏｔｓアセトニトリルおよび５０ｔ
ｓから７４１アセトニトリルを用いた二相濃度勾配によ
りそれぞれ１５分間および４５分間かけて溶出する。ｒ
ｘＬ−２を含む溶出液を希釈して１５−アセトニトリル
／α１ｔｌＩＩＴＩＦＡ・とし、そして６６−７分でジ
フェニルカラムＫかける。ｒＩＬ−２を６０’ｌＡから
８０１アセトニトリルを用いた直線濃度勾配により３０
分間かけて溶出する。ｒＸ′Ｌ−２ピークに対応する溶
出フックジョンを焼かれた滅菌１ｊ！ステンレススチー
ルビーカー内に集める。

α２Ｉｑ／ｌＩＩｇのｒ工Ｉ、−２濃度を有するＨＰＩ
Ｉａ精製ｒＩＬ−２を０．５−ずつ６個取る。これらの
うちの５個に溶液１−あた２５０ｖのポリオールを有す
る１０μＬのポリオール溶液を添加する。次に６個のｒ
ＩＬ−２混合物の各々を凍結乾燥乾固し、そして得られ
る物質をポリオールを添加した５個の各々については１
００μＬの前記ポリオール溶液に再懸濁する。ポリオー
ルを含まない試料は１００μｇの水に再懸濁する。各々
得られた懸濁液をプラスチック管中で３６℃で２時間加
熱し次いでその管を水中に入れることにより冷却する。

各試料の比活性（Ｅｌｐ、Ａ、）を加熱の前後で測定す
る。結果を第１表に示すが１表中比活性は単位／ｗｅタ
ンノξり質で与えられる。

第１表 ６　　　　エチレングリコール　３へ０００　　　１５
へ０００実施例７〜１２および比較例Ａ 実施例１〜６に記載のものと同様の手順に従って調製さ
れたＨＰＬＣ精製ｒ工Ｌ−２を０．５　ｍｌずつ７個取
り、それらを実施例１〜６と同様の手順を用いてグルコ
ースと混合し１次いで種々の温度で２時間加熱する。結
果を第２表に示すが、表中比活性は単位／ｍｇタンパク
質で与えられる。

第２表 温　　度　　　　　　８ｐ、Ａ。

比較例Ａ４°　　　　　　２７．　ＯＯＯ実施例７　　
　　　３７°　　　　　９６，０００実施例８　　　　
　５０°　　　　　１６ム０００実施例９　　　　　　
３６’　　　　　１４１，７５０実施例１０　　　　　
６０’　　　　　　９へ０００実施例１１　　　　７０
°　　　　１３３，５００実施例１２　　　　９０°　
　　　１２２，２５０実施例　１３ グルコースをポリオールとして用いて実施例１〜６と同
様の手順に従ってｒ工Ｌ−２の１ｏｏμλずつの試料を
６個調製した。各試料を３６°で２時間加熱し、次いで
比活性を各試料につき２回測定した。その結果２２０，
０００単位／ｍｇタンパク質という平均比活性が得られ
た。

実施例　１４〜１７ 水中のｒ工Ｌ−２の１００μλずつの試料２０個をここ
で注記する以外は実施例１〜６と同様の手順に従って調
製した。これらの試料を各５個の試料より成る４セツト
（実施例１４〜１７）に分けた。各セット内で試料のう
ち１個は熱処理前に検定し、４個は熱処理後に検定した
。実施例１４では凍結乾燥前にも、熱処理前にもポリオ
ールを添加しなかった。実施例１７では両工程に先立っ
てグルコースを添加した。実施例１５では凍結乾燥に先
立ちグルコースを添加したが熱処理に先立っては付加的
なグルコースは添加しなかった。実施例１６では熱処理
の直前にグルコースを添加したのみであった。熱処理に
付した各試料は３６”で約２時間加熱した。各試料の比
活性を測定し、その結果を下記第３表に単位／ｍｙタン
／ぞり質、として示す。「加熱後」欄の値は各セットに
ついての４試料の平均値である。「凍結乾燥／加熱」で
表示されゐ欄はポリオールが凍結乾燥前におよび／ｉた
は熱処理直前に添加されたかどうかを示し、そしてｒｇ
ｌｕＪはグルコースを意味する。

第３表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）本質的に水、組換えヒトインターロイキン−２およ
   び場合によりポリオールより成り、その比活性がＪｕｒ
   ｋａｔ　ＩＬ−２のそれの少くとも約４０％である少く
   とも約１２０，０００単位／ｍｇのインターロイキン−
   ２比活性を有する組換えヒトインターロイキン−２組成
   物。 ２）比活性が約１２０，０００単位／ｍｇ〜２２０，０
   ００単位／ｍｇである特許請求の範囲第１項記載の組成
   物。 ３）ポリオールが約０．０３Ｍ〜約３．０Ｍの濃度で存
   在する特許請求の範囲第２項記載の組成物。 ４）ポリオールが多価アルコール、単糖類および二糖類
   より成る群より選択される特許請求の範囲第３項記載の
   組成物。 ５）比活性が少くとも約１４０，０００単位／ｍｇであ
   る特許請求の範囲第４項記載の組成物。 ６）ポリオールが多価アルコールである特許請求の範囲
   第４項記載の組成物。 ７）多価アルコールがグリコールである特許請求の範囲
   第６項記載の組成物。 ８）グリコールがエチレングリコールである特許請求の
   範囲第７項記載の組成物。 ９）多価アルコールがグリセロールである特許請求の範
   囲第８項記載の組成物。 １０）ポリオールが二糖類である特許請求の範囲第４項
   記載の組成物。 １１）二糖類がシュークローズである特許請求の範囲第
   １０項記載の組成物。 １２）ポリオールが単糖類である特許請求の範囲第４項
   記載の組成物。 １３）単糖類がグルコースである特許請求の範囲第１２
   項記載の組成物。 １４）ポリオールがグリセロールまたはグルコースであ
   る特許請求の範囲第５項記載の組成物。 １５）ヒト血清アルブミンが２ｍｇ／ｍｇ組換えヒトイ
   ンターロイキン−２以下の濃度で存在する特許請求の範
   囲第１４項記載の組成物。 １６）ヒト血清アルブミンを含まない特許請求の範囲第
   １４項記載の組成物。 １７）ポリオールがグリセロールまたはグルコースであ
   り、そして組換えヒトインターロイキン−２が形質転換
   された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現により製造される
   特許請求の範囲第４項記載の組成物。 １８）大腸菌が大腸菌Ｋ１２である特許請求の範囲第１
   ７項記載の組成物。 １９）大腸菌が大腸菌Ｋ１２ＨＢ１０１株である特許請
   求の範囲第１８項記載の組成物。 ２０）（ａ）高速液体クロマトグラフィによる精製後に
   凍結乾燥した組換えヒトインターロイキン−２を水と混
   合してその懸濁液とし、そして（ｂ）得られた懸濁液を
   約２５℃〜約９５℃の温度で少くとも約２時間加熱する
   ことより成る、本質的に水、組換えヒトインターロイキ
   ン−２および場合によりポリオールより成る組換えヒト
   インターロイキン−２組成物の製造方法。 ２１）工程（ｂ）の温度が約３５°〜約７５℃である特
   許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２）温度が約５０°〜約６０℃である特許請求の範囲
   第２１項記載の方法。 ２３）組換えヒトインターロイキン−２が少くとも約０
   ．５ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する特許請求の
   範囲第２２項記載の方法。 ２４）工程（ａ）でポリオールを添加する特許請求の範
   囲第２３項記載の方法。 ２５）ポリオールが多価アルコール、単糖類および二糖
   類より成る群より選択される特許請求の範囲第２４項記
   載の方法。 ２６）ポリオールが約０．０３Ｍ〜約３．０Ｍの濃度で
   組成物中に存在する特許請求の範囲第２５項記載の方法
   。 ２７）ポリオールが多価アルコールである特許請求の範
   囲第２６項記載の方法。 ２８）多価アルコールがグリセロールである特許請求の
   範囲第２７項記載の方法。 ２９）ポリオールが二糖類である特許請求の範囲第２６
   項記載の方法。 ３０）二糖類がシュークローズである特許請求の範囲第
   ２９項記載の方法。 ３１）ポリオールが単糖類である特許請求の範囲第２６
   項記載の方法。 ３２）単糖類がグルコースである特許請求の範囲第３１
   項記載の方法。 ３３）ポリオールがグリセロールまたはグルコースであ
   り、組換えヒトインターロイキン−２が形質転換された
   大腸菌の発現により製造されそしてヒト血清アルブミン
   が組換えインターロイキン−２の１ｍｇ当り２ｍｇまた
   はそれ以下の濃度で存在する特許請求の範囲第２６項記
   載の方法。 ３４）特許請求の範囲第２６項記載の方法の生成物。 ３５）特許請求の範囲第２８項記載の方法の生成物。 ３６）特許請求の範囲第３２項記載の方法の生成物。 ３７）特許請求の範囲第３３項記載の方法の生成物。 ３８）ｒＩＬ−２を工程（ａ）に先立ちポリオールと共
   に凍結乾燥させる特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ３９）ｒＩＬ−２を工程（ａ）に先立ちポリオールと共
   に凍結乾燥させる特許請求の範囲第２５項記載の方法。