DE2016269B2 - Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit von Lymphocyten, die vom Blut abgetrennt worden sind - Google Patents

Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit von Lymphocyten, die vom Blut abgetrennt worden sind

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DE2016269B2 DE702016269A DE2016269A DE2016269B2 DE 2016269 B2 DE2016269 B2 DE 2016269B2 DE 702016269 A DE702016269 A DE 702016269A DE 2016269 A DE2016269 A DE 2016269A DE 2016269 B2 DE2016269 B2 DE 2016269B2
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit von Lymphocyten, die vom Blut abgetrennt worden sind.
Die Fraktionierung von Blut und die Konservierung der abgetrennten Komponenten für therapeutische und andere medizinische Zwecke ist, insbesondere seit den Zeiten von Cohn und seinen Mitarbeitern an der Harvard University Medical School, üblich. Es wurde gefunden, daß die Erythrocytes Leukocyten und Blutplättchen länger lebensfähig bleiben, wenn sie vom Plasma und voneinander getrennt werden, und daß die isolierten Plasmaproteine bei getrennter Behandlung ^ sehr stabil sind.
Von allen Blutkomponenten sind die Leukocyten metabolisch am wirksamsten. Die metabolische Wirksamkeit ist so groß, daß sie normalerweise nicht mehr als wenige Stunden nach der Entfernung aus dem -,n Körper überleben. Weiterhin werden die Leukocyten durch übermäßiges mechanisches Trauma oder Handhabung im Laboratorium leicht beschädigt. Daher ist die Abtrennung und Konservierung von Leukocyten seit Jahren ein schwieriges Problem.
Die meisten Verfahren zur isolierung von Leukocyten von Erythrocyten und Blutplättchen bedienen sich der Unterschiede in der Dichte dieser zellularen oder gebildeten Blutelemente. Andere Verfahren verwenden die Reinigung der Leukocyten durch Zerstörung der m anderen gebildeten Elemente. Verschiedene neuerlich entwickelte Verfahren verwenden die Prinzipien der Sedimentierung und Zentrifugierung. In diesen neueren Verfahren haben sich die üblichen Expandierungsmittel für das Plasmavolumen, wie Dextran und Polyvinyl- ^ pyrrolidon, als ausgezeichnete Sedimentierungsmittel erwiesen.
Nach der Isolierung der Leukocyten von den anderen
gebildeten Blutelementen müssen sie zur Aufrechterhaltung oder Verlängerung ihrer-Lebensfähigkeit behandelt werden, wenn sie gelagert und für medizinische Forschung und andere Zwecke verfügbar gemacht werden sollen. Zu diesem Zweck sind verschiedene Gewebekulturnährmedien vorgeschlagen worden. Andere Konservierungsmaßnahmen der abgetrennten Leukocyten verwenden ein gelatinehaltiges Medium; dieses bildet beim Abkühlen ein Gel, das die einzelnen Zellen voneinander getrennt hält
Die Entwicklung und Verwendung der obigen und verschiedener anderer Verfahreü zur Abtrennung und Konservierung von Leukocyten wird weiter in »Blood«, Bd. 7, Seite 891-6 (1952) und Bd. 8, Seite 563 - 75 (1953) von TuI I is beschrieben; diese Veröffentlichungen werden als Grundlage für den Stand der Technik hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.
Ein zweckmäßiges, einfaches Verfahren zur Konservierung von Leukocyten wäre auf verschiedenen Gebieten der medizinischen, gerichtsmedizinischen und anthropologischen Forschung von großem Interesse. Insbesondere eine verlängerte Lebensfähigkeit in vitro von menschlichen peripheren Lymphocyten wäre sehr gut anwendbar bei der Gewebetypisierung für die Organtransplantation.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen und verbesserten Verfahrens zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten für ihre Verwendung bei Verfahren der Gewebetypisierung und anderen medizinischen Forschungen.
Es wurde nun gefunden, daß der flüssige Extrakt der Samen der Pflanze Trigonella foenum graecum fähig ist, Leukocyten ohne Agglutination der Erythrocyten vom Gesamtblut abzutrennen und ein wertvolles Grundmedium zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten während der Lagerung ergibt
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit von Lymphocyten, die vom Blut abgetrennt worden sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die abgetrennten Lymphocyten mit einem flüssigen Extrakt der Samen von Trigonella foenum graecum mischt
Trigonella foenum graecum oder »Fenugreek« ist eine Gemüsepflanze der alten Welt aus der Familie Papilionaceae, Stamm Trifolieae, genus Trigonella; (vergleiche z.B. Hutchinson »The Genera of Flowering Plants«, Bd. 1, Seite 456 [1964}j erschienen bei der Oxford University Press). Diese Pflanze wurde bereiu als Nahrungsmittel und Medizin verwendet
Es ist seit langem bekannt, daß bestimmte Pflanzen Hämaggiutinine für spezifische Bluttypen besitzen, die sie potentiell als Bluttypiaierungsreagenzien verwendbar machen. Tatsächlich wurden Tausende von Pflanzen der gesamten Welt auf ihre Hämagglutinisierungseigenschaften untersucht Die getesteten Substanzen bestanden gewöhnlich aus wäßrigen oder Kochsalzextrakten der vermahlenen Samen dieser Pflanzen (vergleiche z. B. S c h e r t ζ et al, »Economic Botony«, Bd. 14, Seite 232 — 40 [I960], der die Hämagglutinisierungswirksamkeit bestimmter Trifolieae-Samenextrakte beschreibt; Boyd, »J. Immunol« Bd.62, Seite 338-9 [1949] und Krüpe, »Biol.Zblt.« Bd. 72, Seite 424-31 [1953], die berichten, daß insbesondere die Kochsalzlösungsextrakte von Trigonella foenum graecum keine Hämagglutinisierungswirksamkeit für menschliche Blutzellen besitzen.) Dennoch war bisher nicht bekannt,
daß Extrakte der Samen der letztgenannten Pflanzenspezies als Abtrennungsmittel für Leukocyten verwendet werden könnten und als Grundmedium zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten während der Lagerung in der hier beschriebenen Weise geeignet wären.
Erfindungsgemäß werden die getrockneten Samen vor Trigonella foenum graecum auf eine kleine, fein zerteilte Form reduziert, und zwar z. B. durch mechanisches Zerreiben durch Zerkleinerung, Vermahlen oder Pulverisieren. Die Samenteilchen von Trigonella foenum graecum (im folgenden als Trigonella f.g. abgekürzt) werden dann mit einer wäßrigen Flüssigkeit oder einem organischen Lösungsmittel, wie einem niedrigen Keton, z. B. Aceton und Methyläthylketon, oder einem niedrigen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol und Isopropanol, extrahiert Die normale physiologische Kochsalzlösung wird als Extraktionsflüssigkeit bevorzugt, da die meisten serologischen Reaktionen in diesem Medium durchgeführt werden. Aus den flüssigen Extrakten erhält man z. B. durch Zugabe von weiteren Salz- oder Lösungsmittelfraktionierungen Rohextrakte oder weiter gereinigte Konzentrate.
Die Löslichmachung der aktiven Komponente aus den Samen von Trigonella f.g. irr der wäßrigen Flüssigkeit oder dem organischen Lösungsmittel wird durch Behandlung bei niedrigen Temperaturen, wie z. B. zwischen 00C bis etwa !00C während der Extraktion erleichtert.
Die Extraktion erfolgt für mindestens etwa 1 Stunde, vorzugsweise für etwa 24 Stunden uder mehr. Der flüssige, die aktive Komponente enthaltende Extrakt kann vom übrigen Material durch !entrifugieren, Filtrieren usw. abgetrennt werden.
Geeignete Extrakte erhält man durch Zerkleinerung der getrockneten Samen von Trigonella f.g. auf eine kleine Teilchengröße, wie z.B. zwischen etwa 1 — 100 Micron, z. B. mit einem Waring-Mischer oder einer elektrischen Kaffeemühle usw. und Extrahieren mit etwa 2-20 Gew.-Teilen normaler Kochsalzlösung (0,9%ig NaCl) sowie Einstellung des pH-Wertes des erhaltenen Extrakts auf etwa 6,5 — 7,2.
Der obengenannte flüssige Extrakt der Samen von Trigonella f. g. stellt ein geeignetes Grundmedium für die Lagerung der vom Blut abgetrennten Lymphocyten dar. Unter der üblichen Lagerung in vitro, z. B. nur in einem Gewebenärmedium, überleben 95% der Lymphocyten normalerweise nur eine Dauer von etwa 24-28 Stunden. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die abgetrennten Lymphocyten in Mischung mit dem erfindungsgemäßen flüssigen Extrakt zusammen mit einem geeigneten Gewebenährmedium bis zu 14 Tagen bei Zimmertemperatur (etwa 250C) lebensfähig und unverändert bleiben.
Als Abtrennungsmittel für Leukocyten wird der hier definierte Extrakt der Samen von Trigonella f. g. dem defibrinierten Gesamtblut zugefügt und gründlich gemischt. Es wurde gefunden, daß sich die Erythrocyten nach diesem Verfahren ohne Agglutination abscheiden und daß man ein mit Lymphocyten angereichertes Konzentrat zusammen mit dem Samenextrakt in der mit Leukocyten angereicherten, überstehenden Flüssigkeit erhält.
In einem bevorzugten Abtrennungsverfahren wird das Gesamtblut in eine sterile, evakuierte Flasche abgezogen und durch mildes Bewegen oder Verwirbeln mit kleinen Glasperlen oder einem anderen, inerten, fein zerteilten Material defibriniert, bis sich ein Fibrinknoten bildet Dann wird eine geeignete Menge des flüssigen Extraktes der Samen von Trigonella f.g, z.B. etwa 0,1 -2 Vol.-Teile Extrakt pro Vol.-Teil des defibrinierten Gesamtblutes, zugefügt und gründlich gemischt Die Erythrocyten werden sich absetzen gelassen, und eine mit Leukocyten angereicherte, überstehende Plasmaflüssigkeit wird durch eine Plasmaabziehvorricht-ing entfernt, die ein geeignetes Filter zur Entfernung der Granulocyten enthält Anschließend werden die im Trigonella f. g. Grundmedium verbleibenden Lymphocyten in einer sterilen, evakuierten Flasche gesammelt die ein geeignetes Gewebekuiturnährmedium enthält
Εϊ wurde gefunden, daß nach dem obigen Verfahren bei Zugabe von etwa 40 Vol.-% flüssigem Extrakt der Samen von Trigonella f. g. zum defibrinierten Gesamtblut eine schnelle Sedimentierung der Erythrocyten innerhalb von etwa 14—45 Minuten erfolgt Die erhaltene überstehende Flüssigkeit enthält etwa 50—85% Lymphocyten, was anzeigt, daß die aktive Komponente im flüssigen Extrakt Granulocyten sowie Erythrocyten absetzt Durch Verwendung eines geeigneten Filters werden etwa 95-98% der verbleibenden Granulocyten von der mit Leukocyten angereicherten, überstehenden Plasmaflüssigkeit entfernt
Zur Entfernung der verbleibenden Granuiocyten von den Lymphocyten kann ein geeigneter Filter, wie z. B. siliconisierte Glaswolle, Glasperlen, Baumwollfasern oder synthetische Kunstfasern, wie aus Polyacrylnitril, Polyäthylenterephthalat; Polytetrafluorethylen oder Polyamid 66, verwendet werden. Vorzugsweise wird eine mit einem Waschmittel gewaschene PoIyamid-66-faser (»Nylon«) verwendet Dieses Waschen entfernt die auf handelsüblicher »Nylon« Stapelfaser anwesende Appretur. Die Verwendung eines solchen gewaschenen »Nylon« Filters zur Abtrennung von Lymphocyten von Granulocyten ist weiter von G r e e η w a 11 et al. »Transfusion«, Bd. 2, Seite 221 - 9 (1962) beschrieben; diese Veröffentlichung wird hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.
Erfindungsgemäß können verschiedene geeignete Gewebekulturnährmedien zusammen mit dem Grundmedium aus dem flüssigen Extrakt der Trigonella f. g. Samen zur Konservierung der abgetrennten Lymphocyten verwendet werden. Geeignete Gewebekulturnährmedien sind z. B. die ausgeglichenen Salzlösungen von Hanks, »Proc. Soc'y Exper. Med.«, Bd.71, Seite 196-200 (1949), und Ear le, »J. Nat. Cancer Inst«, Bd.4 Seite 165-212 (1943); die Basalmedien von Eagle, »Science«, Bd. 122, Seite 501 -504 (1955) und »J. Biol. Chem.«, Bd.214, Seite 839-52 (1955); die synthetischen Medien von Puck, »J. Exptl. Med.«, Bd. 108, Seite 945-55(1958)und Bd. 109, Seite 649-60 (1959); und die Vitaminlösungen von Eagle, »J. Biol. Chem.«, Bd. 226, Seite 191 -206 (1957); diese Veröffentlichungen werden hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.
Die hier verwendeten Gewebekulturnährmedien enthalten vorzugsweise eine Mischung aus ausgeglichenen Salzlösungen, Puffersalzen, essentiellen Aminosäuren und Nukleotiden oder anderen proteinhaltigen Substanzen, Vitaminen oder Koenzymen, und Monosaccharidzuckern. Im Gewebekulturnährmedium kann auch Blutserum oder eine Proteinfraktion desselben verwendet werden. Bestimmte Enzyme, wie Desoxyribonuklease, sind im Medium zur Verhütung der Bildung von Leukocyt-wknoten« zweckmäßig. Dem Medium können geringe Mengen Antibiotika, wie Penicillin,
Streptomycin, Mycostatjn usw, auf Grund ihrer konservierenden Wirkung zugefügt werden. Geringe Mengen Phenolrot oder eines anderen pH-Wert-Indikators können zugefügt werden, um als sichtbare Kontrolle des pH-Wertes zu dienen.
Andere geeignete Gewebekulturnährmedien enthalten z. B. Mischungen aus verschiedenen Komponenten und sind in der US-Patentschrift 31 22 476, Beispiel 1, Teil A und B, in der US-Patentschrift 31 28 228, Spalte 4 bis 6, und in der US-Patentschrift 30 38 923, Spalte 2, unter der Überschrift »Culture Medium« beschrieben; diese Patentschriften werden hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können verschiedene Vorrichtungen zur Handhabung von Blut verwendet werden. Die Vorrichtung besteht gewöhnlich aus einen Defibrinationsbehälter, z. B. einer 50-ccm sterilen, evakuierten Flasche mit Glasperlen, einem Überführungsbehälter, der eine evakuierte, sterile 125ccm-Flasche mit einem geeigneten Gewebekulturnährmedium sein kann, einer Vorrichtung zum Abziehen des Plasmas und einer Vorrichtung zvm Sammeln des Blutes.
Eine erfindungsgemäß verwendbare Vorrichtung zum Abziehen des Plasmas ist z. B. in der US-Patentschrift 29 34 069 beschrieben; erfindungsgemäß verwendbare Vorrichtungen zum Sammeln des Blutes sind in den US-Patentschriften 27 02 034, 30 04 536, 31 27 892, 31 87 750 sowie Reissue 25 129 und 25 171 beschrieben.
Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung irgendeiner besonderen Vorrichtung beschränkt; die genannten Vorrichtungen waren nur eine Veranschaulichung.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken. Falls nicht anders angegeben, sind alle Teile und Prozentangaben Gew.-Teile und Gew.-%.
Beispiel 1
Getrocknete Samen von Trigonella f. g. wurden zweimal in einer Kaffeemühle mit sehr reiner Einstellung vermählen und in normaler Kochsalzlösung (0,9%; 50—55 g/l) suspendiert. Die Mischung wurde 24 Stundei? unter ständigem Rühren auf 5° C abgekühlt, 30 Minuten bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abdekantiert Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einem gleichen Volumen normaler Kochsalzlösung verdünnt Sowohl die konzentrierte als auch die verdünnte überstehende Flüssigkeit kann zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut ohne Agglutination der Erythrocyten verwendet werden; weiterhin können sie als Grundmedien zur Verlängerung tier Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten während der Lagerung verwendet werden.
Beispiel 2
1 g der getrockenten Samen von Trigonella f. g. wurden in einer elektrischen Kaffeemühle fein vermählen und bei Zimmertemperatur 2 Stunden mit 10 ecm physiologischer Kochsalzlösung, die 0,1% Natriumazid enthielt, extrahiert. Nach Kühlung über Nacht wurde der erhaltene Extrakt zentrifugiert und durch Glaswolle filtriert Zentrifugieren und Filtrieren wurden wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit klar war. Diese
klare Flüssigkeit eignet sich zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut und als Grundmedium für eine verlängerte Lagerung von Lymphocyten in lebensfähigem und unverändertem Zustand.
Beispiel 3
Unter Verwendung einer sterilen Vorrichtung zum Sammeln von Blut wurden 25 ecm venöses Blut unmittelbar in eine sterile, evakuierte 50-ccm-Flasche gezogen und sofort durch mildes Schütteln mit kleinen Glasperlen von 5 mm Durchmesser in der Flasche für etwa 5—10 Minuten defibriniert Mit einer sterilen Spritze wurden 25 ecm des verdünnten, überstehenden Produktes aus Beispiel 1 in die Flasche eingeführt und gründlich gemischt Dann wurden die Erythrocyten abgesetzt, indem man die Flasche etwa 30—40 Minuten ungestört bei Zimmertemperatur stellen ließ. Die mit Leukocyten angereicherte überstehende Flüssigkeit wurde mit einer Plasmaabziehvorrichtung, die einen gewaschenen »Nylon« Filter c-ihielt, entfeimt Die Abziehnadel der Abziehvorrichtung wurde durch den Stopfen auf der Flasche mit defibriniertem Blut eingeführt und die Stopfennadel durch den Stopfen der sterilen, evakuierten 125-ccm-Überführungsflasche, die 25cc.n eines im folgenden definierten Gewebenährmediums enthielt, eingeführt Eine Rollenklemime, wie sie z. B. in der US-Patentschrift 30 99 429 beschrieben ist, wurde geöffnet und das Abziehen des Plasmas begann. Der Fluß wurde auf etwa einen Tropfen alle 4-5 Sekunden eingestellt Wie die überstehende Flüssigkeit durch den Filter läuft, entfernen die gewaschenen »Nylon« Fasern praktisch alle verbliebenen Granulocyten. Anschließend wurden die im Trigonella f. g. Grundmedium verbleibenden Lymphocyten in der ÜberführuniTsflasche, die das Gewebenährmedium enthält, gesammelt Die gelagerten Lymphocyten waren in diesem Medium nach 14 Tagen bei Zimmertemperatur (etwa 25° C) lebensfähig und unverändert Sie können mit der Post verschickt werden. Bei Gewebetypisierungsuntersuchungen unter Verwendung aieser gelagerten Lymphocyten erhielt man nach 14tägäger Lagerung eine 100%ige Übereinstimmung mit lymphocytotoxischen Testergebnissen, die früher mit frischen Zellen erzielt wurden. Diese .gelagerten Zellen eignen sich auch zur Karyotypisierung bei Chromosomanalysen, der Wahl von Transplantationsorganen und in cytogenen Untersuchungen.
Praktisch dieselben Abtrennungs- und Konservierungsergebnisse wurden erzielt, wenn man im Verfahren von Beispiel 3 das verdünnte, überstehende Produkt von Beispiel 1 durch das konzentrierte, überstehende Produkt von Beispiel 1 ersetzte.
Die Zusammensetzung des Gewebenährmediums, das mit dem filtrierten, überstehenden Material von Beispiel 3 gemischt wurde, war wie folgt:
A) Salze Mol/l
NaCl 1,53 χ 10-'
KCI 5,36 X 10-3
MgSO4 ■ 7 H2O 8,10 χ iO-5
Na2HPO4 · 7 H2O 4,70 χ 10 -«
KH2PO4 4,70 χ IO-5
NaHCO3 1,23 χ IO-2
Dextrose 2,22 χ 10- 2
NaC2H3O2 · 3 H2O 730 χ IO-5
Fe(NO3)3 · 9 H2O 4,30 χ IO-6
B) Aminosäuren dl-a-Alanin I-Arginin Asparagin I-Aspartinsäure I-Cystin ■ HCI !-Glutaminsäure I-Glutamin Glycin
l-HLätidin Hydroxyprolin l-lsoleucin I-Leucin I-Lysin ■ HCI I-Methionin !-Phenylalanin I-Prolin I-Serin
I-Threonin I-Tryptophan I-Tyrosin I-Valin
C) Vitamine Ascorbinsäure α-Tocopherolphosphat Biotin
Calciferol Calciumpantothenat Cholinchlorid Folinsäure Mesoinosit
20 Mol/l 16269
8 		Mol/l 5.50 χ 10"
4,30 χ 10" 1,10 χ 5.40 χ 10"
6,00 χ 10" Menadion 4.10 χ 9.30 χ 10"
1,10 χ 10" Nicotinamid 4,00 χ 3,30 χ 10"
3,40 χ 10 4 Nicotinsäure 2,40 χ 3.30 χ 10-"
1.30 χ 10 4 r> Pyridoxalhydrochlorid 2,40 χ 3,70 χ 10"
7,50 χ 10 > Pyridoxinhydrochlorid 7,20 χ 2,10 χ 10-'
2,05 χ 10" p-Aminobenzoesäure 5,30 χ 4,50 χ 10"
1,00 χ 10" Riboflavin 9,70 χ 3,20 χ 10"
1.90 χ ΙΟ"4 dl-Thioctinsäure 5,90 χ 5,40 χ 10 "
1,10 χ 10" in Thiaminhydrochlorid 6,10 χ 1,00 χ
2.20 XiO" Vitamin A
6,60 χ 10" D) Nukleotide und andere Substanzen 10"
5,70 χ 10" Adeninhydrochlorid 10"
1,60 χ 10 " ι-, Adenylsäure 10"
2,30 χ 10 4 d-Ribose 10"
2,50 χ 10 ' Glutathion 10"
4,80 χ 10" Guaninhydrochlorid 10"
3,80 χ 10 Α Hypoxanthin 10"
7,30 χ 10" _ii> Thymidin 10"
3,30 χ IO 4 Uracil 10"
3.30 χ IO 4 Xanthin 10"
Natriumadenosintriphosphat 10"
Natriumpyruvat 1000 Einheiten/l*)
2,80 χ IO 4 >-, Heparin 0,25 ccm/l *)
4,60 χ 10 ' Phjtohämagglutinin P **) lOOOOOEinh./!*)
8,10 χ 10" Penicillin Kalium G 150(XX
5,00 χ 10" Dihydrostreptomycinsulfat , nachdem
2,10 χ 10" *) Die Bestandteile wurden zugefügt
8.30 χ 10" J" Zellsuspension hergestellt waren. Volumen
2.11 χ 10" ") Erneut auf das ursprüngliche tis Wclicorr
4.70 χ 10" Ivonholiertes Produkt der Burrouel > VgH *)
Medium und
gebrachtes.
ie & Co.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit von Lymphocyten, die vom Blut abgetrennt worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die abgetrennten Lymphocyten mit einem flüssigen Extrakt der Samen von Trigonella foenum graecum mischt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der flüssige Extrakt in ein Gewebekulturnährmedium einverleibt ist
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Abtrennung von Lymphocyten vom Gesamtblut 1,0 Vol.-Teil defibriniertes Gesamtblut mit 0,1 bis 2,0 Vol.-Teilen flüssigem Extrakt der Samen von Trigonella foenum graecum durch gründliches gemeinsames Mischen behandelt, eine Sedimentation zuläßt, die mit Leukocyten angereicherte überstehende Flüssigkeit gewinnt, die Granulocyten davon abfiltriert und dann das abgetrennte, mit Lymphocyten angereicherte Konzentrat in einem Gewebekulturnährmedium sammelt
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man filtriert, indem man die mit Leukocyten angereicherte, überstehende Flüssigkeit durch einen Filter aus synthetischen Polyamidfasern leitet
30
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