DE2016274C3

DE2016274C3 - Verfahren zur Abtrennung von Leukozyten vom Gesamtblut

Info

Publication number: DE2016274C3
Application number: DE2016274A
Authority: DE
Inventors: Lester P. Los Angeles Calif. Shepherd (V.St.A.)
Original assignee: Baxter Travenol Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1969-04-10
Filing date: 1970-04-06
Publication date: 1980-01-24
Also published as: US3594276A; FR2060492A5; GB1300850A; BE748701A; IL34196A0; DE2016274B2; SE365712B; IL34196A; DE2016274A1; CH552377A

Description

Die vorligende Erfindung bezieht sich auf das im Patentansprach im einzelnen gekennzeichnete Verfahren zur Abtrennung von Leukozyten vom Gesamtblut.

Die Fraktionierung von Blut und die Konservierung der abgetrennten Komponenten für therapeutische und andere medizinische Zwecke ist, insbesondere seit den Zeiten von Cohn und seinen Mitarbeitern an der Harvard University Medical School, üblich. Es wurde gefunden, daß die Erythrozyten, Leukozyten und Blutplättchen länger lebensfähig bleiben, wenn sie vom Plasma und voneinander getrennt werden, und daß die isolierten Plasmaproteine bei getrennter Behandlung sehr stabil sind.

Von allen Blutkomponenten sind die Leukozyten metabolisch am wirksamsten. Die metabolische Wirksamkeit ist so groß, daß sie normalerweise nicht mehr als weniger Stunden nach der Entfernung aus dem Körper überleben. Weiterhin werden die Leukozyten durch übermäßiges mechanisches Trauma oder Handhabung im Laboratorium leicht beschädigt. Daher ist die Abtrennung und Konservierung von Leukozyten seit Jahren ein schwieriges Problem.

Die meisten Verfahren zur Isolierung von Leukozyten von Erythrozyten und Blutplättchen bedienen sich der Unterschiede in der Dichte dieser zellularen oder gebildeten Blutelemente. Andere Verfahren verwenden die Reinigung der Leukozyten durch Zerstörung der anderen gebildeten Elemente. Verschiedene neuerlich entwickelte Verfahren verwenden die Prinzipien der Sedimentierung und Zentrifugierung. In diesen neueren Verfahren haben sich die üblichen Expandierungsmittel für das Plasmavolumen, wie Dextran und Polyvinylpyrrolidon, als ausgzeichnete Sedimentierungsmittel erwiesen.

Nach der Isolierung der Leukozyten von den anderen gebildeten Blutelementen müssen sie zur Aufrechterhaltung oder Verlängerung ihrer Lebensfähigkeit behandelt werden, wenn sie gelagert und für medizinische Forschung und andere Zwecke verfügbar gemacht werden sollen. Zu diesem Zweck sind verschiedene Gewebekulturnä'hrmedien vorgeschlagen worden. Andere Konservierungsmaßnahmen der abgetrennten Leukozyten verwenden ein gelatinehaltiges Medium; dieses bildet beim Abkühlen ein Gel, das die einzelnen Zellen voneinander getrennt hält.

Die Entwicklung und Verwendung der obigen und verschiedener anderer Verfahren zur Abtrennung und Konservierung von Leukozyten wird weiter in »Blood«, Bd. 7, Seite 891-6 (1952) und Bd. 8, Seite 563-75 (1953) von Tullis beschrieben; diese Veröffentlichungen werden als Grundlage für den Stand der Technik hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.

Ein zweckmäßiges, einfaches Verfahren zur Abtrennung und Konservierung von Leukozyten wäre auf verschiedenen Gebieten der medizinischen, gerichtsmedizinischen und anthropologischen Forschung von großem Interesse. Insbesondere eine verlängerte Lebensfähigkeit in vitro von menschlichen peripheren Lymphozyten wäre sehr gut anwendbar bei der Gewebetypisierung für die Organtransplantation.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen und verbesserten Verfahrens zur Abtrennung von Leukozyten vom Gesamtblut und jo zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphozyten für die Verwendung bei Verfahren der Gewebetypisierung und anderen medizinischen Forschungen.

Es wurde nun gefunden, daß der flüssige Extrakt der Samen der Pflanze Trigonella foenum graecum fähig ist, Leukozyten ohne Agglutination der Erythrozyten vom Gesamtblut abzutrennen und ein wertvolles Grundmedium zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphozyten während der Lagerung ergibt.

Trigonella foenum graecum oder »Fenugreek« ist eine Gemüsepflanze der Alten Welt aus der Familie Papilionaceae, Stamm Trifolieae, genus Trigonella; (vgl. z. B. Hutchinson »The Genera for Flowering Plants«, Bd. 1, Seite 456 [1964]; erschienen bei der Oxford University Press). Diese Pflanze wurde bereits als Nahrungsmittel und Medizin verwendet.

Es ist seit langem bekannt, daß bestimmte Pflanzen Hämagglutinine für spezifische Bluttypen besitzen, die sie potentiell als Bluttypisierungsreagenzien verwendbar machen. Tatsächlich wurden Tausende von Pflanzen der gesamten Welt auf ihre Hämagglutinisierungseigenschaften untersucht. Die getesteten Substanzen bestanden gewöhnlich aus wäßrigen oder Kochsalzextrakten der vermahlenen Samen dieser Pflanzen. (Vgl. z. B. Schertz et al, »Economic Botony«, Bd. 14, Seite 232-40 [1960], der die Hämagglutinisierungswirksamkeit bestimmter Trifolieae-Samenextrakte beschreibt; Boyd, »J. Immunol« Bd. 62,Seite338-9[1949] und Krüpe, »Bioi. Zblt.«, Bd. 72, Seite 424-31 [1953], die berichten, daß insbesondere die Kochsalzlösungsextrakte von Trigonella foenum graecum keine Hämagglutinisierungswirksamkeit für menschliche Blutzellen besitzen.) Dennoch war bisher nicht bekannt, daß Extrakte der Samen der letztgenannten Pflanzenspezies als Abtrennungsmittel für Leukozyten verwendet werden könnten und als Grundmedium zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphozyten während der Lagerung in der hier beschriebenen Weise geeignet wären.

Erfindungsgemäß werden die getrockneten Samen von Trigonella foenum graecum (im folgenden als Trigonella f. g. abgekürzt) auf eine kleine, fein zerteilte Form reduziert, und zwar z. B. durch mechanisches Zerreiben durch Zerkleinerung, Vermählen oder Pulverisieren. Die Samenteilchen von Trigonella f. g. waren dann mit einer wäßrigen Flüssigkeit oder einem

organischen Lösungsmittel, wie einem niedrigen Keton, z. B. Aceton und Methyläthyketon, oder einem niedrigen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol und Isopropanol, extrahiert. Die normale physiologische Kochsalzlösung wird als Extraktionsflüssigkeit bevorzugt, da die meisten serologischen Reaktionen in diesem Medium durchgeführt werden. Aus den flüssigen Extrakten erhält man z. B. durch Zugabe von weiteren Salz- oder Lösungsmittelfraktionierungen Rohextrakte oder weiter gereinigte Konzentrate.

Die Löslichmachung der aktiven Komponente aus den Samen von Trigonella f. g. in der wäßrigen Flüssigkeit oder dem organischen Lösungsmittel wird durch Behandlung bei niedrigen Temperaturen, wie z. B. zwischen 0° C bis etwa 10° C, während der Extraktion erleichtert.

Die Extraktion erfolgt für mindestens etwa I Stunde, vorzugsweise für etwa 24 Stunden oder mehr. Der flüssige, die aktive Komponente enthaltende Extrakt kann vom übrigen Material durch Zentrifugieren, Filtrieren usw. abgetrennt werden.

Geeignete Extrakte erhält man durch Zerkleinerung der getrockneten Samen von Trigonella f. g. auf eine kleine Teilchengröße, wie z. B. zwischen etwa 1—100 um, z. B. mit einem intensiven Schnellaufmischer oder auch einer elektrischen Kaffeemühle usw., und Extrahieren mit etwa 2-20 Gew.-Teilen normaler Kochsalzlösung (0,9 %ig. NaCl) sowie Einstellung des pH-Wertes des erhaltenen Extraktes auf etwa 6,5-7,2.

Der obengenannte flüssige Extrakt der Samen von Trigonella f. g. stellt ein geeignetes Grundmedium für die Lagerung der vom Blut abgetrennten Lymphozyten dar. Unter der übiichen Lagerung in vitro, z. B. nur in einem Gewebenährmedium, überleben 95% der Lymphozyten normalerweise nur eine Dauer von etwa 24-48 Stunden. Es wurde festgestellt, daß die abgetrennten Lymphozyten in Mischung mit dem erfindungsgemäß hergestellten flüssigen Extrakt zusammen mit einem geeigneten Gewebenährmedium bis zu 14 Tagen bei Zimmertemperatur (etwa 25° C) lebensfähig und unverändert bleiben.

Als Abtrennungsmittel für Leukozyten wird der hier definierte Extrakt der Samen von Trigonella f. g. dem defibrinierten Gesamtblut zugefügt und gründlich gemischt. Es wurde gefunden, daß sich die Erythrozyten nach diesem Verfahren ohne Agglutination abscheiden und daß man ein mit Lymphozyten angereichertes Konzentrat zusammen mit dem Samenextrakt in der mit Leukozyten angereicherten, überstehenden Flüssigkeit erhält.

In bevorzugter Weise wird das Gesamtblut in eine sterile, evakuierte Flasche abgezogen und durch mildes Bewegen oder Verwirbeln mit kleinen Glasperlen oder einem anderen, inerten fein zerteilten Material defibriniert, bis sich ein Fibrinknoten bildet. Dann wird eine geeignete Menge des flüssigen Extraktes der Samen von Trigonella f. g., z. B. etwa 0,1-2 Vol.-Teilen Extrakt pro Vol.-Teil des defibrinierten Gesamtblutes, zugefügt und gründlich gemischt. Die Erythrozyten werden sich absetzen gelassen, und eine mit Leukozyten angereicherte, überstehende Plasmaflüssigkeit wird durch eine Plasmaabziehvorrichtung entfernt, die einen geeigneten Filter zur Entfernung der Granulozyten enthält. Anschließend werden die im Trigonella-f.-g.-Grundmedium verbleibenden Lymphozyten in einer sterilen, evakuierten Flasche ge

sammelt, die ein geeignetes Gewebekulturnährmedium enthält.

Es wurde gefunden, daß man dem obigen Verfahren bei Zugabe von etwa 40 Vol.-% flüssigem Extrakt der Samen von Trigonella f, g. zum defibrinierten Gesamtblut eine schnelle Sedimentierung der Erythrozyten innerhalb von etwa 15-45 Minuten erfolgt. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit enthält etwa 50-85% Lymphozyten, was anzeigt, daß die nktive Komponente im flüssigen Extrakt Granulozyten sowie Erythrozyten absetzt. Durch Verwendung eines geeigneten Filters werden etwa 95-98 % der verbleibenden Granulozyten von der mit Leukozyten angereicherten, überstehenden Plasmaflüssigkeit entfernt.

Zur Entfernung der verbleibenden Granulozyten ven den Lymphozyten kann ein geeigneter Filter, wie z. B. siliconisierte Glaswolle, Glasperlen, Baumwollfasern oder synthetische Kunststoffasern, wie Polyacrylnitril-, Polyester-, Polytetrafluoräthylen- oder Polyamidfasern verwendet werden. Vorzugsweise wird eine mit einem Waschmittel gewaschene Polyamidfaser verwendet. Dieses Waschen entfernt die auf handelsüblicher Polyamid-Stapelfaser anwesende Appretur. Die Verwendung eines solchen gewaschenen Filters zur Abtrennung von Lymphozyten von Granulozyten ist weiter von Greenwait et al in »Transfusion«, Bd. 2, Seite 221-9 (1962) beschrieben.

Erfindungsgemäß können verschiedene geeignete Gewebekulturnährmedien zusammen mit dem Grundmedium aus dem flüssigen Extrakt der TrigoneIla-f.-g.-Samen zur Konservierung der abgetrennten Lymphozyten verwendet werden. Geeignete Gewebekulturnährmedien sind z. B. die ausgeglichenen Salzlösungen von Hanks, »Proc. Soc'y Exper. Biol. Med.«, Bd. 71, Seite 196-200 (1949) und Earle, »J. Nat. Cancer Inst.« Bd. 4, Seite 165-212 (1943); die Basalmedien von Eagle, »Science« Bd. 122, Seite 501-504 (1955) und »J. Biol. Chem.« Bd. 214, Seite 839-52 (1955); die synthetischen Medien von Puck, »J. Expt. Med.« Bd. 108, Seite 945-55 (1958) und Bd. 109, Seite 649-60 (1959); und die Vitaminlösungen von Eagle, »J. Biol. Chem.« Bd. 226, Seite 191-206 (1957); diese Veröffentlichungen werden hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.

Die hier verwendeten Gewebekulturnährmedien enthalten vorzugsweise eine Mischung aus ausgeglichenen Salzlösungen, Puffersalzen, essentiellen Aminosäuren und Nukleotiden oder anderen proteinhaltigen Substanzen, Vitaminen oder Koenzymen, und Monosaccharidzuckern. Im Gewebekulturnährmedium kann auch Blutserum oder eine Proteinfraktion desselben verwendet werden. Bestimmte Enzyme, wie Desoxyribonuklease, sind im Medium zur Verhütung der Bildung von Leukozyt-»knoten« zweckmäßig. Dem Medium können geringe Mengen Antibiotika, wie Penicillin, Streptomycin, Mycostatin usw., aufgrund ihrer konservierenden Wirkung zugefügt werden. Geringe Mengen Phenolrot oder eines anderen pH-Wert-Indikators können zugefügt werden, um als sichtbare Kontrolle des pH-Wertes zu dienen.

Andere geeignete Gewebekulturnährmedien enthalten z. B. Mischungen aus verschiedenen Komponenten und sind in der US-Patentschrift 3122476, Beispiel I, Teil A und B, in der US-Patentschrift 3128228, Spalte 4 bis 6, und in der US-Patentschrift 3038923, Spalte 2, unter der Überschrift »Culture Mediums beschrieben; diese Patentschriften werden

hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können verschiedene Vorrichtungen zur Handhabung von Blut verwendet werden. Die Vorrichtung besteht gewöhnlich aus einem Defibrinationsbehälter, z. B. einer 50-ccm sterilen evakuierten Flasche mit Glasperlen, einem Oberführungsbehälter, der eine evakuierte, sterile 125-ccm-FIasche mit einem geeigneten Gewebekulturnährmedium sein kann, einer Vorrichtung zum Abzieiien des Plasmas und einer Vorrichtung zum Sammeln des Blutes.

Eine geeignete Vorrichtung zum Abziehen des Plasmas ist z. B. in der US-Patentschrift 2934069 beschrieben; brauchbare Vorrichtungen zum Sammeln von Blut sind in den US-Patentschriften 2702034, 3004536, 3127892, 3187750 sowie Reissue 2512,9 und 25171 beschrieben.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung. Falls nicht anders angegeben, sind alle Teile und Prozentangaben Gew.-Teile und Gew.-%.

Beispiel 1

Getrocknete Samen von Trigonella f. g. wurden zweimal in einer Kaffeemühle mit sehr feiner Einstellung vermählen und in normaler Kochsalzlösung (0,9%; 50-55 g/l) suspendiert. Die Mischung wurde 24 Stunden unter ständigem Rühren auf 5 ° C abgekühlt, 30 Minuten bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit a'udekantiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einem gleichen Volumen normaler Kochsalzlösung verdünnt. Sowohl die konzentrierte als auch die verdünnte überstehende Flüssigkeit kann zur Abtrennung von Leukozyten vom Gesamtblut ohne Agglutination der Erythrozyten verwendet werden.

Beispiel 2

1 g der getrockneten Samen von Trigonella f. g. wurden in einer elektrischen Kaffeemühle fein vermählen _und bei Zimmertemperatur 2 Stunden mit 10 ecm physiologischer Kochsalzlösung, die 0,1% Natriumazid enthielt, extrahiert. Nach Kühlung über Nacht wurde der erhaltene Extrakt zentrifugiert und durch Glaswolle filtriert. Zentrifugieren und Filtrieren wurden wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit klar war. Diese klare Flüssigkeit eignet sich zur Abtrennung von Leukozyten vom Gesamtblut.

Beispiel 3

Unter Verwendung einer sterilen Vorrichtung zum Sammeln von Blut wurden 25 ecm venöses Blut unmittelbar in eine sterile, evakuierte 50-ccm-Flasche gezogen und sofort durch mildes Schütteln mit kleinen Glasperlen von 5 mm Durchmesser in der Flasche für etwa 5-10 Minuten defibriniert. Mit einer sterilen Spritze wurden 25 ecm des verdünnten, überstehenden Produktes aus Beispiel 1 in die Flasche eingeführt und gründlich gemischt. Dann wurden die Erythrozyten abgesetzt, indem man die Flasche etwa 30-40 Minuten ungestört bei Zimmertemperatur stehen ließ. Die mit Leukozyten angereicherte überstehende Flüssigkeit wurde mit einer Plasmaabziehvorrichtung, die einen gewaschenen Nylon-Filter enthielt, entfernt. Die Abziehnadel der Abziehvorrichtung wurde durch den Stopfen aus der Flasche mit dem defibrinierten Blut eingeführt und die Stopfcnnadel durch den Stopfen der sterilen, evaViierten 1.25-ccm-Uberführungs-

flasche, die 25 ecm eines im folgenden definierten Gewebenährmediums enthielt, eingeführt. Eine Rollenklemme, wie sie z. B. in der LJS-Patentscnrift 3 099429 beschrieben ist, wurde geöffnet und das Abziehen des Plasmas begann. Der Fluß wurde auf etwa einen Tropfen alle 4-5 Sekunden eingestellt. Wie die überstehende Flüssigkeit durch den Filter läuft, entfernen die gewaschenen Nylon-Fasern praktisch alle verbliebenen Granulozyten. Anschließend wurden die im Trigonella-f.-g.-Grundmedium verbleibenden Lymphozyten in der Überführungsflasche, die das Gewebenährmedium enthielt, gesammelt Die gelagerten Lymphozyten waren in diesem Medium nach 14 Tagen bei Zimmertemperatur (etwa 25° C) lebensfähig und unverändert. Sie können mit der Post verschickt werden. Bei Gewebetypisierungsuntersuchungen unter Verwendung dieser gelagerten Lymphozyten erhielt man nach 14tägiger Lagerung eine 100%ige Übereinstimmung mit lymphozytotoxischen Testergebnissen, die früher mit frischen Zellen erzielt wurden. Diese gelagerten Zeller, eignen sich auch zur Karyotypisierung bei Chromosomaiuilysen, der Wahl von Transplantationsorganen und in cytogenen Untersuchungen.

Praktisch dieselben Abtrennungs- und Konservierungtergebnisse wurden erzielt, wenn man im Verfahren von Beispiel 3 das verdünnte, überstehende Produkt von Beispiel 1 durch das konzentrierte, überstehende Produkt von Beispiel 1 ersetzte.

Die Zusammensetzung des Gewebenährmediums, das mit dem filtrierten, überstehenden Material von Beispiel 3 gemischt wurde, war wie folgt:

Mol/l

A) Salze NaCl KCl MgSO₄ 7H₂O

Na₂HPO₄^H₂O

KH₂PO₄

NaHCO₃

Dextrose

NaC₂H₃O₂-3H₂O Fe(NOj)₃-9H₂O

B) Aminosäuren dl-a-Alanin 1-Arginin

Asparagin

1-Aspartinsäure 1-Cystin ■ HCl

1-Glutaminsäure

1-GIutamin ς₅ Glycin

1-Histidin

Hydroxyprolin

!-Isoleucin

1-Leucin bo 1-LysinHCI

1-Methionin

i-Phenylalanin

I-Prolin

I-Serin _b.₃ !-Threonin

I-Trytophan

I-Tyrosin

!-Valin

1,53	χ	10'
5,36	χ	KT³
8,10	X	10"
4,70	X	ίο-⁴
4,70	X	ίο-⁵
1,23	X	KT²
2,22	X	ίο-²
7,30	X	KT⁵
4,3	X	1(H
4,30	X	KH
6,00	X	KH
1,10	X	10~*
3,40	X	ίο-⁴
1,30	X	ίο-⁴
7,50	X	ίο-³
2,05	X	Kr³
1,00	X	KT³
1,90	X	ΙΟ"⁴
140	X	ΙΟ"⁴
2,20	X	ΙΟ"⁴
6,60	X	KH
5,70	X	KH
1,70	X	KH
2,30	X	κΗ
2,50	X	KH
4.80	X	KH
3.80	X	ΙΟ"⁴
7,30	X	KH
3,30	X	KH
3.30	X	KH

Moll

C) Vitamine

Ascorbinsäure u-Tocopherolphosphat Biotin

Caiciferol Calciumpant-othenat Cholincliloritl Folinsiiurc Mesoinostil Mcnadion Nicotinamid Nicotinsäure Pyridoxal 'lydrochlorid Pyrido.xinhydrochlorid p-Aminobenzoesäure RÜHifhivin dl-Thioctinsäure Thiaminhydrochlorid Vitamin A

2.S0	X	10
4,60	X	10
K,10	X	10
5,00	X	10
2.10	X	10
S,30	X	10
2.1 1	X	10
4.70	X	10
1.10	X	10
4,10	X	10
4.(10	X	10
2.40	X	10
2.40	X	IO
7.20	X	10
5.3(1	X	IO
^l>.70	X	10
5.¹H)	X	10
(i.lO	X	10

Moll D) Niikleolide und andere Substanzen

Adeninhydrochlorid 5.50 χ 10	¹ 5.50 χ K)
Adenylsäure	5,40 x 10 ''
d-Ribose	^l>.3() X K) ⁵
Glutathion	3,30 x ΚΓ*
Guanin-hydrochlorid	3,30 x K) ⁵
Hypoxanthin	3.70 x ΚΓ⁵
Thymidin	2.10 x ΙΟ"⁵
Uracil	4.50 x 10 *
Xanthin	3.2 x K)■'
Natriumade nosintriphosphat	5.4 χ 10'
Natriumpyruvat	1.00 x K)■'
Heparin	1000 Einheiten
Phytohämcigglutin in P**	0.25 ecm I*
Penicillin Kalium G.	100 000 Hinh. I
Dihydrostreptomyeinsulfat	150000 jig. I

* = die Hestiimllcik· wurden nach ilvr Her Zcllsiispcnsion zugefügt: ** = »uf sein wieder eingestelltes, lyopnilicrtcs Produkt A Co.

slrll ι ιημ von Medium uikI ursprüngliches Volumen der Burroughs Wcllcomc

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Abtrennung von Leukozyten vom Gesamtblut ohne Agglutinierung der Erythrozyten,dadurch gekennzeichnet,daß man 1 Vol.-Teil defibriniertes Gesamtblut mit 0,1-2 Vol.-Teilen eines flüssigen Extrakts der Samen von Trigonella foenum graecum durch gründliches gemeinsames Mischen behandelt, die Sedimentation eintreten läßt und dann die mit Leukozyten angereicherte überstehende Flüssigkeit gewinnt, wobei die Extraktion der Samen mit etwa 2-20 Gew.-Teilen normaler physiologischer Kochsalzlösung erfolgt.