DE602004008438T2

DE602004008438T2 - Verfahren zur isolierung von hämocyanin

Info

Publication number: DE602004008438T2
Application number: DE602004008438T
Authority: DE
Inventors: Bhanu Chapel Hill MANICKAVASAGAM
Original assignee: NORIKA HOLDINGS Pty Ltd; Norika Holdings Pty Ltd Kedron
Current assignee: NORIKA HOLDINGS Pty Ltd; Norika Holdings Pty Ltd Kedron
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2024-03-27
Also published as: WO2004085467A1; EP1608678A4; EP1608678B1; ATE370965T1; AU2003901507A0; JP2007525424A; US20060160212A1; DE602004008438D1; EP1608678A1; CA2517836A1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines pharmazeutischen Produkts, speziell eines Serumproteins, welches als Hämocyanin identifiziert worden ist, aus dem Blut von Abalone.
Hintergrund der Erfindung
Es ist festgestellt worden, dass Abalone die Quelle für verschiedene nützliche Materialien ist, die als Ersatz für ähnliche Materialien aus anderen Quellen dienen oder neue Produkte sind, wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 02/102851 beschrieben.
Hämocyanin (Hc) ist das blaue, Kupfer enthaltende respiratorische Protein von vielen Mollusken und Arthropoden. Hämocyanine werden stets frei gelöst im Blut (oder in der Hämolymphe) gefunden. Die Mollusken-Hämocyanine haben eine verglichen mit Arthropoden-Hämocyaninen vollständig unterschiedliche Struktur und Anordnung von Untereinheiten. Der aerobe Stoffwechsel von Mollusken, wie Abalone, wird durch Gasaustausch durch Kiemen unterstützt, die in der Atemhöhle gefunden werden. Das Blut, das durch die Kiemen über ein mit niedrigem Druck funktionierendes offenes Kreislaufsystem gepumpt wird, enthält Hämocyanin, welches Sauerstoff zu respiratorischen Geweben transportiert. In offenen Systemen strömt Blut ausgehend von Arterien in die Geweberäume und schließlich in venöse Sinusse, bevor es in Venen gesammelt und zum Herzen zurückgeführt wird. Oxygeniertes Blut reicht von blass bis intensiv blau, abhängig von dem Oxygenierungsausmaß, der Hämocyanin-Konzentration und der Tierspezies. Dimere Kupferpaare in dem Hämocyanin stellen reversible Stellen für das Binden eines Sauerstoffmoleküls bereit. Hämocyanin ist auch eine Quelle für Kupfer, das zu anorganischen und organischen Bläuungsreaktionen bei der Abalone-Nahrungsmittelverarbeitung führen kann.
Hämocyanine sind zu eine Mehrzahl von Untereinheiten umfassenden Proteinen angeordnet, die lediglich sechs oder bis zu mehrere Hundert Sauerstoffmoleküle tragen. Mollusken-Hämocyanine sind extrem große Makromoleküle mit Molekülmassen von etwa 4 Millionen Dalton (Da). Mollusken-Hämocyanine haben Untereinheiten, welche sieben oder acht Sauerstoff-bindende funktionale Einheiten enthalten. Jede globuläre funktionale Einheit besteht aus etwa 50 kDa und sie sind wie eine Perlenschnur angeordnet. Zehn von solchen Untereinheiten lagern sich zusammen unter Bildung von zylindrischen dekameren vollständigen Molekülen und in Gastropoden können multiple Strukturen aus zwei oder mehreren Dekameren gefunden werden. Die Wand des Dekamers weist sechzig Sauerstoff-bindende Einheiten auf und die verbleibenden Einheiten bilden den sogenannten Kragen („collar"), der im Zentrum des Zylinders liegt und im Falle von Gastropoden-Hämocyanin zu einem Ende hin einen Absatz bildet. Die Assoziation von Hämocyanin-Untereinheiten erfordert zweiwertige Kationen, entweder Mg²⁺ oder Ca²⁺, wie auch kompetente Monomere (Mangum, 1983). Abalone-Hämocyanine weisen eine ähnliche Struktur zu anderen Mollusken-Hämocyaninen auf, es ist aber darüber berichtet worden, dass sie sich von anderen Hämocyaninen (und von Hämoglobulin) unterscheiden, indem die Sauerstoffbindung einen allosterischen Mechanismus (Behrens et al., 2002), der sowohl von Mg²⁺ als auch Ca²⁺ abhängig ist, aufweist.
Der Kupfergehalt von Mollusken-Hämocyaninen beträgt durchschnittlich etwa 0,25%, was 1 Grammatom pro 25000 Dalton Protein entspricht. Hämocyanine sind starke Immunogene, die die Synthese von großen Mengen von spezifischen Antikörpern induzieren. Das Hc kann in assoziierten oder dissoziierten Formen vorkommen (Bartell und Campbell, 1959). Zusätzlich dazu, dass sie assoziierte oder dissoziierte Hc-Moleküle enthalten, können verschiedene Präparationen eine Anzahl von anderen immunologisch unterschiedlichen Proteinen enthalten. Beispielsweise kann die Hämolymphe der Krabbe wenigstens 5 unterschiedliche Proteine wie auch zwei elektrophoretisch unterschiedliche Hc enthalten (Horn und Kerr, 1969), was zumindest auch für die Hämocyanine aus Abalone, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und Oktopus zutrifft (Miller et al., 1998).
Die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 02/102844 beschreibt ein im Labormaßstab ausgeführtes Verfahren zur Isolierung von Hämocyanin aus Abalone, in welchem eine auf Phenylgruppen basierende hydrophobe Wechselwirkungschromatographie („phenyl hydrophobic interaction chromatography"; phenyl HIC)-Säule verwendet wird, um Hämocyanin aus einer Hämocyanin enthaltenden Lösung abzutrennen. Die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie ist ein Trennverfahren, welches auf der Anziehung zwischen hydrophoben Gruppen an dem Protein und einem hydrophoben Liganden basiert. In diesem Falle wurde eine ausreichende Wechselwirkung zwischen der Phenylgruppe des Phenyl-HIC-Harzes und Hämocyanin, so dass das Hämocyanin auf der Säule in im Labormaßstab ausgeführten Experimenten zurückgehalten wurde, festgestellt; es ist aber festgestellt worden, dass dieses Verfahren ungeeignet ist, um maßstäblich vergrößert zu werden bis auf ein kommerziell sinnvolles Produktionsniveau. Weitere im Labormaßstab ausgeführte Versuche, um Hämocyanin zu isolieren, werden von Harris et al. und Lieb et al. beschrieben. Die Harris-Veröffentlichung beschreibt die Isolierung von Hämocyanin aus Haliotis tuberculata durch die Verwendung von Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines Q-Sepharose-Gels und eines Elutionspuffers mit pH 7,4. Lieb et al. beschreiben ebenfalls die Isolierung von Hämocyanin aus H. tuberculata-Hämolymphe unter Verwendung von Anionenaustauschchromatographie, diesmal mit einer Mono-Q-Säule, wobei die Elution unter Verwendung eines stufenweisen Natriumchlorid-Gradienten ausgeführt wird. Beide Veröffentlichungen befassen sich mit der Natur des Hämocyanin-Moleküls und es ist nur ausreichend Material, um eine Analyse des Moleküls vornehmen zu können, isoliert worden. Dementsprechend bleibt eine Notwendigkeit für eine Herstellung dieses Produkts in kommerziellem Maßstab.
Zusammenfassung der Erfindung Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung einer stabilen Lösung eines Mollusken-Hämocyanins bereitgestellt, welches die Schritte umfasst:

(1) Sammeln von Blut von einer Molluske;
(2) Zentrifugieren des gesammelten Bluts, um Zellmaterial und andere Schwebe- oder Feststoffteilchen zu entfernen, um eine Serumfraktion zu gewinnen;
(3) Diafiltration der Serumfraktion, um mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran Serumflüssigkeit durch einen Kationenaustausch-Äquilibrierungspuffer zu ersetzen;
(4) Inkontaktbringen der Serumfraktion mit einem Harz in Gegenwart eines Äquilibrierungspuffers mit einem pH zwischen 4,0 und 6,5, wodurch eine Proteinkomponente der Serumfraktion auf der Säule zurückgehalten wird;
(5) Eluieren der zurückgehaltenen Proteinkomponente aus der Säule mit einem stark salzhaltigen Elutionspuffer; und
(6) Einengen bzw. Aufkonzentrieren des Eluats und Austausch des Elutionspuffers gegen einen pH-neutralen/wenig salzhaltigen Diafiltrationspuffer durch Zurückführen des Eluats durch eine Ultrafiltrationsmembran in Gegenwart des Diafiltrationspuffers,

Das starke Kationenaustauscherharz wird als eine Säule gebildet, die mit einem sulfonsäurehaltigen Harz, wie dem Bio-Rad-Macro Prep High S-Harz, in welchem Sulfonatgruppen an einen festen Träger, in diesem Falle Methacrylat-Copolymerperlen, angeheftet sind, gepackt ist.
In vorteilhafter Weise umfasst der Elutionspuffer eine schwache Säure, vorzugsweise eine organische Säure, wie Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure, am meisten bevorzugt Essigsäure.
Der Elutionspuffer weist vorzugsweise einen pH zwischen 4,0 und 6,5, mehr bevorzugt zwischen 5,0 und 6,0 und am meisten bevorzugt 5,5 auf. Es versteht sich, dass der optimale pH für das Zurückhalten der Hämocyanine aus unterschiedlichen Mollusken innerhalb dieses Bereichs abhängig von dem Ladungsprofil des Proteins variieren kann. Folglich werden die Wahl des pHs des Puffers und die Pufferzusammensetzung von der Quelle des Hämocyanins abhängen, wie sich dies für den Fachmann auf diesem Gebiet versteht. Bei einem pH substantiell unter 4,0 muss möglicherweise damit gerechnet werden, dass Mollusken-Hämocyanin auf der Säule ausfallen wird und das Verfahren so nicht effektiv sein wird. Bei einem pH substantiell über 6,5 wird das Ionisationsausmaß des Proteins wahrscheinlich für ein Zurückhalten auf einer Kationenaustauschersäule ungeeignet sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Elutionspuffer Essigsäure, Magnesiumchlorid und Calciumchlorid bei pH 5,5.
Typischerweise ist der stark salzhaltige Elutionspuffer schwach sauer und weist vorzugsweise die gleiche Zusammensetzung wie der Äquilibrierungspuffer auf mit der Ausnahme, dass Natriumchlorid zu diesem hinzugesetzt ist. Insbesondere kann der Elutionspuffer die gleiche Zusammensetzung wie der Äquilibrierungspuffer haben mit der Maßgabe, dass er auch Natriumchlorid, typischerweise 1 M Natriumchlorid, enthält. Nichtsdestotrotz wird sich für den Fachmann auf diesem Gebiet verstehen, dass andere Elutionspuffer ersonnen werden können, die geeignet sind, und ein jeglicher derartiger Puffer wird mit in Betracht gezogen.
Typischerweise ist der Diafiltrationspuffer für eine Langzeitlagerung des Serumproteins geeignet. Er ist relativ pH-neutral und weist eine geringe Salzkonzentration auf und umfasst typischerweise Na₂HPO₄ + NaH₂PO₄ + Natriumchlorid bei pH 7,2, aber der Fachmann auf diesem Gebiet wird in der Lage sein, sich andere geeignete Puffer auszudenken.
Die Ultrafiltrationsmembran hat in vorteilhafter Weise ein Molekulargewichts-Rückhaltevermögen („cut-off") von 100 kD.
Das in dem Verfahren der Erfindung isolierte Serumprotein ist als Hämocyanin identifiziert worden. Es ist festgestellt worden, dass eine Verwendung eines starken Kationenaustauscherharzes bei einem schwach sauren pH geeignet ist für die Isolierung von Mollusken-Hämocyanin in einem Verfahren, welches mit guter Ausbeute maßstablich vergrößerbar ist und in welchem das Hämocyanin nicht in irgendeinem ausgeprägten Ausmaß abgebaut wird.
Es wird auch ein Hämocyanin bereitgestellt, wenn es durch das Verfahren des ersten Aspekts isoliert worden ist.
Die Molluske wird in vorteilhafter Weise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Abalone, Oktopus und Napfschnecke, vorzugsweise Abalone und mehr bevorzugt einer der kommerziellen Arten, wie der schwarzlippigen Abalone, Haliotis ruber, der braunlippigen Abalone, Haliotis conicopora, der grünlippigen Abalone, Haliotis laevigita, und der Roe-Abalone, Haliotis roei.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Jetzt werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung nur beispielhaft beschrieben unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren, in welchen:
1 ein Graph der Absorption gegenüber dem kumulativen Volumen ist und die Elution des Serumproteins der Erfindung zeigt; und
2 ein SDS-PAGE-Gel des sterilfiltrierten Endprodukts ist.
Weisen zum Ausführen der Erfindung
Beispiel 1
Das neue Verfahren der Erfindung wird in einer Ausführungsform ausgeführt in einer Pilotanlage, die mit einer Tangentialflussfiltrationsvorrichtung (Millipore Prep Scale^TM-TFF-6) mit einer Filterfläche von 0,557418 m² (6 Quadratfuß) ausgerüstet ist. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
Schritt 1. Ganze lebende Abalone werden erhalten und können unverzüglich verarbeitet oder in einem geeigneten Behälter aufbewahrt werden, bis sie benötigt werden.
Schritt 2. Abalone vor dem Aus-der-Schale-Nehmen unter fließendem Wasser spülen. Unter Arbeiten auf einem Schneidbrett das Tier aus der Schale nehmen und den Körper von der Schale trennen.
Schritt 3. Sorgfältig um die Oberseite des Fußes herum schneiden, um die Eingeweide zu entfernen.
Schritt 4. Den Fuß vor dem Ausbluten unter fließendem Wasser spülen. Unter Arbeiten in einem sauberen Behälter, um jegliches Blut aufzufangen, den Mundbereich abschneiden und für eine spätere Verwendung aufbewahren. Mehrere tiefe Einschnitte durch die Vorderseite des Fußes hindurch vornehmen. Das anfänglich gesammelte Blut in einem Kühlraum aufbewahren.
Schritt 5. Den Fuß schnell in eine Abtropfschale über einem Sammelgefäß transferieren. Die Abalone aufrecht in der Schale aufstellen und abdecken. Das Blut über Nacht in einem Kühlraum abtropfen lassen.
Schritt 6. Jegliches feste Material aus dem Blut durch Zentrifugation bei 12000 × g entfernen. Den Überstand in einem Kühlraum aufbewahren, bis er benötigt wird.
Schritt 7. 12 Säulenvolumen + 8 Überstandvolumen Äquilibrierungspuffer herstellen. Der Äquilibrierungspuffer besteht aus 18 mM Essigsäure + 1 mM MgCl₂ + 1 mM CaCl₂ bei pH 5,5.
Schritt 8. 5 Säulenvolumen Elutionspuffer pro Säulenlauf herstellen. Der Elutionspuffer besteht aus 18 mM Essigsäure + 1 M NaCl + 1 mM MgCl₂ + 1 mM CaCl₂ bei pH 5,5.
Schritt 9. Eine Säule geeigneter Größe (Pharmacia Index 140–500) mit 5 l Bio-Rad-Macro-Prep High S-Harz packen und mit Äquilibrierungspuffer für mindestens 7 Säulenvolumen und, bis der pH und die Leitfähigkeit des Säulenausflusses innerhalb von 0,05 pH-Einheiten und 0,5 mS des Puffers liegen, äquilibrieren. Die maximale Flussrate während eines Laufs betrug 500 ml/min.
Schritt 10. Der Pufferaustausch des Überstands gegen den Äquilibrierungspuffer erfolgt mit einer 100 kD-NMWCO-Ultrafiltrationskartusche.
Schritt 11. Den Überstand für wenigstens 6 Überstandsvolumen und, bis die Leitfähigkeit des Überstands innerhalb von 0,5 mS des Äquilibrierungspuffers liegt, diafiltrieren. Das Diafiltrationspermeat sammeln.
Schritt 12. Den diafiltrierten Überstand bis auf 3 Verweil- oder Ruheinhaltsvolumen des Systems weniger als das ursprüngliche Überstandsvolumen aufkonzentrieren. Das Verweil- oder Ruheinhaltsvolumen des Systems ablaufen lassen und zu dem Retentat hinzufügen. Die Kartusche durch Rezirkulieren oder Rückführen von 1,5 Verweil- oder Ruheinhaltsvolumen Äquilibrierungspuffer bei der Betriebsflussrate 10 min spülen. Das Verweil- oder Ruheinhaltsvolumen des Systems ablaufen lassen und zu dem Retentat hinzufügen.
Schritt 13. 2 l Ultrafiltrationskartuschen-Reinigungslösung pro m² Membranfläche herstellen. Die Aufbewahrungslösung besteht aus 1 M NaOH bei 40°C. Die Kartusche durch Rezirkulieren oder Rückführen der Reinigungslösung für wenigstens 30 min reinigen. Die Kartusche mit entionisiertem Wasser spülen, bis die pHs des Retentats und Permeats < 7 sind.
Schritt 14. 2 l Ultrafiltrationskartuschen-Aufbewahrungslösung pro m² Membranfläche herstellen. Die Aufbewahrungslösung besteht aus 0,1 M NaOH oder 20% Ethanol. Die Kartusche mit Aufbewahrungslösung spülen, dann versiegeln und die Kartusche in einem Kühlraum aufbewahren.
Schritt 15. Mit dem Beladen der Säule bei der Flussrate während eines Laufs beginnen. Die Absorption des Säulenausflusses bei 280 nm messen und die UV-absorbierenden Durchfluss-Fraktionen sammeln. Die UV-Absorption der Fraktionen gegen das gesammelte kumulative Volumen graphisch auftragen.
Schritt 16. Die Säule mit wenigstens 3 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer und, bis die Absorption des Säulenausflusses bei 280 nm die Grundlinie erreicht hat, waschen. Fortfahren, die UV-absorbierenden Durchflussfraktionen zu sammeln, und auf dem Chromatogramm graphisch auftragen.
Schritt 17. Die Säule mit wenigstens 3 Säulenvolumen Elutionspuffer und, bis die Absorption des Säulenausflusses bei 280 nm die Grundlinie erreicht hat, eluieren. Die UV-absorbierenden Elutionsfraktionen sammeln und graphisch auf dem Chromatogramm auftragen.
Schritt 18. Wiederholung(en) ausgehend von dem Äquilibrierungsschritt (Schritt 9) für bis zu 2 zusätzliche Säulenläufe ausführen. Weitere Läufe werden ein Reinigen der Säule (Schritte 19 und 20) alle 3 Läufe erforderlich machen.
Schritt 19. 2 Säulenvolumen von Reinigung-an-Ort-und-Stelle- („cleaning in place")-Lösung herstellen. Die CIP-Lösung besteht aus 1 M NaOH. Die Säule beim Laufdruck reinigen. Die UV-absorbierenden CIP-Fraktionen sammeln und auf dem Chromatogramm graphisch auftragen.
Schritt 20. Die Säule mit wenigstens 2 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer und, bis die Absorption des Säulenausflusses bei 280 nm die Grundlinie erreicht hat und der pH des Säulenausflusses < 7 ist, waschen. Fortfahren, die UVabsorbierenden Fraktionen zu sammeln, und graphisch auf dem Chromatogramm auftragen.
Schritt 21. 1 Säulenvolumen Aufbewahrungslösung herstellen. Die Aufbewahrungslösung besteht aus 20% Ethanol. Die Säule bei der Flussrate während eines Laufs spülen. Die gepackte Säule versiegeln, beschriften und aufbewahren.
Schritt 22. Einen Proteinassay an den Chromatographieproben ausführen und die Flutionen vereinigen. Das für eine 20 mg/ml-Lösung von Endprodukt benötigte Volumen berechnen.
Schritt 23. 8 Produktvolumen Diafiltrationspuffer herstellen. Der Diafiltrationspuffer besteht aus 53 mM Na₂HPO₄ + 30 mM NaH₂PO₄ + 150 mM NaCl bei pH 7,2.
Schritt 24. Ein(e) abschließende(r) Aufkonzentrierung und Pufferaustausch des Produkts werden mit einer 100 kD-NMWCO-Ultrafiltrationskartusche ausgeführt.
Schritt 25. Die vereinigten Säulenelutionen auf das in Schritt 22 berechnete Volumen aufkonzentrieren. Das Ultrafiltrationspermeat sammeln.
Schritt 26. Das Ultrafiltrationsretentat für wenigstens 6 Retentatvolumen und, bis der Retentat-pH innerhalb von 0,03 pH-Einheiten des Diafiltrationspuffers liegt, diafiltrieren. Das Diafiltrationspermeat sammeln.
Schritt 27. Das diafiltrierte Produkt auf 3 System-Verweil- oder – Ruheinhaltsvolumen weniger als das benötigte Endproduktvolumen aufkonzentrieren. Das Verweil- oder Ruheinhaltsvolumen des Systems ablaufen lassen und zu dem Retentat hinzufügen. Die Kartusche durch Rezirkulieren oder Rückführen von 1,5 Verweil- oder Ruheinhaltsvolumen Diafiltrationspuffer bei der Betriebsflussrate für 10 min spülen. Das Verweil- oder Ruheinhaltsvolumen des Systems ablaufen lassen und zu dem Retentat hinzugeben.
Schritt 28. 2 l Ultrafiltrationskartuschen-Reinigungslösung pro m² Membranfläche herstellen. Die Reinigungslösung besteht aus 1 M NaOH bei 40°C. Die Kartusche durch Rezirkulieren oder Rückführen der Reinigungslösung für wenigstens 30 min reinigen. Die Kartusche mit entionisiertem Wasser spülen, bis die pHs des Retentats und des Permeats < 7 sind.
Schritt 29. 2 l Ultrafiltrationskartuschen-Aufbewahrungslösung pro m² Membranfläche herstellen. Die Aufbewahrungslösung besteht aus 0,1 M NaOH oder 20% Ethanol. Die Kartusche mit Aufbewahrungslösung spülen, dann versiegeln und die Kartusche in einem Kühlraum aufbewahren.
Schritt 30. Einen Proteinassay an den Ultrafiltrationsproben ausführen. Das für eine 20 mg/ml-Lösung von Endprodukt benötigte Volumen erneut berechnen. Das Retentatvolumen mit Diafiltrationspuffer auffüllen oder Schritte 25–27 wiederholen, soweit erforderlich.
Schritt 31. Eine Handschuhbox vorbereiten, indem das UV-Licht und der Filter für wenigstens 30 min angestellt werden. Unter Arbeiten in der Handschuhbox das Endprodukt durch einen 0,2 μm-Filter in einen oder mehrere sterile(n) Behälter sterilfiltrieren.
Schritt 32. Eine QA-Analyse des Endprodukts ausführen.
Ergebnisse
Das Verfahren im Pilotmaßstab war darin erfolgreich, ein Produkt von hoher Qualität herzustellen. Es wurden in einem Zeitraum von neun Tagen ungefähr 8 l Blut verarbeitet unter Herstellung von mehr als einem Liter Endprodukt.
Vorbehandlungsuntersuchungen zeigten einen Verlust an Protein weder bei der Zentrifugation noch bei der Filtration, was die Durchführbarkeit von jeder dieser Methoden anzeigt. Die Zentrifugation könnte unter Berücksichtigung des geringen Feststoffgehalts und der hohen Viskosität des Bluts die effiziente Option sein.
Der Säulenreinigungsschritt zeigte gute Flusseigenschaften und dementsprechend vernünftige Laufzeiten. Das Chromatogramm für den zweiten Chromatographielauf ist in 1 gezeigt. Der breite flache erste Peak ist der Durchfluss von ungebundenem Protein, der scharfe zweite Peak ist die Saizelution von gebundenem Protein und der geringfügig höhere letzte Peak ist das Protein, das durch den Reinigungsschritt entfernt worden ist.
Die Bindung von Protein über die beiden Chromatographieläufe betrug 61%. Dies konnte verbessert werden, indem das auf die Säule aufgeladene Blutvolumen verringert wurde. Die Ausbeute von gebundenem Protein, das durch die Salzelution rückgewonnen wurde, betrug etwa 88%. Dies konnte verbessert werden, indem die Salzkonzentration erhöht wurde.
Die Aufkonzentrierung und der Pufferaustausch des Proteins durch Ultrafiltration waren sehr effizient, wobei sie ungefähr 5 Stunden benötigten, ohne Proteinverluste an das Permeat.
Die SDS-PAGE-Analyse des sterilfiltrierten Endprodukts ist in dem Gel von 2 gezeigt. Die drei Filtrationschargen sind mit 1, 2, 3 bezeichnet und es kann festgestellt werden, dass sie hinsichtlich des Molekulargewichts und der Reinheit der einzelnen Banden ähnlich zu dem Standard sind.
Ein Ausstreichen der unverdünnten Endfiltrationschargen auf Agarplatten erzeugte kein mikrobielles Wachstum ausgehend von jeder der Proben, was anzeigt, dass Sterilität erzielt worden ist.
Innerhalb von dieser Beschreibung und den Ansprüchen werden die Begriffe „umfassen", „umfasst" und „umfassend" in einem nicht-ausschließlichen Sinne verwendet mit der Ausnahme, wo der Kontext dies anders erfordert.
Es wird sich eindeutig verstehen, dass, obwohl hier auf eine Anzahl von Veröffentlichungen des Standes der Technik Bezug genommen wird, diese Referenz kein Zugeständnis darstellt, dass ein jegliches von diesen Dokumenten einen Teil des üblichen allgemeinen Kenntnisstands auf diesem Gebiet in Australien oder in einem jeglichen anderen Land darstellt.
Industrielle Anwendbarkeit
Das Verfahren der Erfindung stellt ein in kommerziellem Maßstab ausführbares Verfahren zur Isolierung von Hämocyanin aus dem Blut von Mollusken, wie Abalone, bereit. Das Hämocyanin ist nützlich als ein pharmazeutisches Mittel, insbesondere als ein Antitumormittel, speziell für Blasenkrebs. Es ist auch nützlich als ein Bestandteil in kosmetischen Formulierungen. Zusätzlich ist es als ein Immunadjuvans nützlich. Es kann auch als ein Laborhilfsmittel im Bereich der Biowissenschaften verwendet werden, beispielsweise um ELISA-Platten zu beschichten, und in Chromatographiemedien.
Referenzen

Bartell, A.H., und Campbell, D.H. (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82, 232.
Behrens et al., J. Exp. Biol. 205, 253–263 (2002).
Harris, J.O., Maguire, G.B., Edwards, S., und Hindrum, S.M. (1998). Aquaculture 160, 3–4, 259.
Horn, B.C., und Kerr (1969). Corp. Biochem. Physiol. 29, 493.
Lieb et al., Eur. J. Biochem., 265, 134–144 (1999).
Mangum, C.P. (1983). Oxygen Transport in the blond. In: Mantel., L.H. (Hrsg.); Bliss, D.E. (Hrsg. der Reihe), The Biology of Crustacea. Band 5. Internal Anatomy and Physiological Regulation. Academic Press, New York, S. 373–429.
Miller et al., J. Mol. Biol. 278, 827–842 (1998).

Claims

Verfahren zur Gewinnung einer stabilen Lösung eines Mollusken-Hämocyanins mit den folgenden Schritten: (1) Sammeln von Blut von einer Molluske; (2) Zentrifugieren des gesammelten Bluts, um Zellmaterial und andere Schwebeteilchen zu entfernen und eine Serumfraktion zu gewinnen; (3) Diafiltration der Serumfraktion, um mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran Serumflüssigkeit durch einen Kationenaustausch-Äquilibrierungspuffer zu ersetzen; (4) Inkontaktbringen der Serumfraktion mit einem Harz in Gegenwart eines Äquilibrierungspuffers mit einem pH-Wert zwischen 4,0 und 6,5, wodurch eine Proteinkomponente der Serumfraktion auf der Säule zurückgehalten wird; (5) Eluieren der zurückgehaltenen Proteinkomponente aus der Säule mit einem stark salzhaltigen Elutionspuffer; und (6) Einengen des Eluats und Austausch des Elutionspuffers gegen einen pH-neutralen/wenig salzhaltigen Diafiltrationspuffer durch Zurückführen des Eluats durch eine Ultrafiltrationsmembran in Gegenwart des Diafiltrationspuffers, dadurch gekennzeichnet, dass das Harz ein sulfonsäurehaltiges starkes Kationenaustauscherharz ist und die Sulfonatgruppen an Methacrylat-Copolymerperlen immobilisiert sind.
Verfahren, nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert des Äquilibrierungspuffers zwischen 5,0 und 6,0 liegt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der pH-Wert des Äquilibrierungspuffers 5,5 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Elutionspuffer eine organische Säure aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die organische Säure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure besteht.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Elutionspuffer ferner Magnesiumchlorid und Calciumchlorid aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Elutionspuffer Natriumchlorid enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Elutionspuffer 1 M Natriumchlorid enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Molluske aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Abalone (Seeohr), Oktopus und Napfschnecke besteht.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Molluske Abalone ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Abalone aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der schwarzlippigen Abalone, Haliotis ruber, der braunlippigen Abalone, Haliotis conicopora, der grünlippigen Abalone, Haliotis laevigita, und der Roe-Abalone, Haliotis roei, besteht.