DE2016269A1 - Verfahren zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut und Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten - Google Patents

Verfahren zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut und Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten

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DE2016269A1 DE19702016269 DE2016269A DE2016269A1 DE 2016269 A1 DE2016269 A1 DE 2016269A1 DE 19702016269 DE19702016269 DE 19702016269 DE 2016269 A DE2016269 A DE 2016269A DE 2016269 A1 DE2016269 A1 DE 2016269A1
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Description

dr. W. Schalk · dipl.-ing. p. Wirtii · di pl.-ing. q. Dannenberg D R. V. SCHMIED-KOWARZIK · DR. P. W E I NHO LD · DR. D. G U DEL
6 FRANKTURT AM MAIN
CR. CSCIlENIIlIMm STRAS'.!. 09 , ίΐΚ/SK
H-139
Baxter Laboratories, Inc.
Morton Grove, 111. όϋ 053
UbA
Verfahren zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut und Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut und auf ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der'abgetrennten Lyraphocyterio
Die Fraktionierung von Blut und die Konservierung der abgetrennten Komponenten für therapeutische und andere medizinische Zwecke ist, insbesondere seit den Zeiten von Cohn und seinen Mitarbeitern an der Harvard University Medical School, üblich. Es wurde gdunden, daß die Erythrocyten, Leukocyten und Blutplättchen langer lebensfähig bleiben, wenn sie vom Plasma und voneinander getrennt werden, und daß die isolierten Plasmaproteine bei getrennter Behandlung sehr stabil sind.
Von allen Blutkomponenten sind die Leukocyten metabolisch am wirksamsten. Die metabolische Wirksamkeit ist so groß, daß sie normalerweise nicht mehr als wenige Stunden nach der Entfernung aus dem Körper überleben. Weiterhin werden die Leukocyten durch übermäßiges mechanisches Trauma oder Handhabung im Laboratorium leicht beschädigt. Daher ist die Abtrennung und Konservierung von Leukocyten seit Jahren ein schwieriges Problem.
009842/1821
BAD
Die meisten Verfahren zur Isolierung von Leukocyton von Erythrocyten und Blutplättchen bedienen sich der Unterschiede in αor Dichte dieser zellularen oder gebildeten Blutelemente. Andere Verfahren verwenden die Reinigung der Leukocyten durch Zerstörung dor anderen gebildeten elemente. Verschiedene neuerlich entwickelte Verfahren verwenden die Prinzipien der Sedimentierung und Zentrifugierung. In diesen neueren Verfahren haben sich die üblichen Expandierungsmittel für das Plasmavolumen, wie Dextran und Polyvinylpyrrolidon, als ausgezeichnete Sedimentierungsmittel erwiesen.
Nach der Isolierung der Leukocyten von den anderen gebildeten Blutelementen müssen sie zur Aufrechterhaltung oder Verlängerung ihrer Lebensfähigkeit behandelt werden, wenn sie gelagert und für medizinische Forschung und andere Zwecke verfügbar gemacht werden sollen. Zu diesem ZwecK sind verschiedene Gev/öbekulturnährmedien vorgeschlagen worden. Andere Konservierung smai3n ahm en der abgetrennten Leukocyten verwenden ein gelatinehalt iges Medium; dieses bildet beim Abkühlen ein Gel, das die einzelnen Zellen voneinander getrennt hält.
Die Entwicklung und Verwend-ung der obigen und verschiedener anderer Ver- ^ fahren zur Abtrennung und Konservierung von LeuKocyten wird weiter in
"Blood", Bd9 7, Seite 891-6 (1952) und Bd. 8, beite 563-75 (lry53) von TuIlis beschrieben; diese Veröffentlichungen werden als Grundlage für den Stand der Technik hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenoinmeno
Ein zweckmäßiges, einfaches Verfahren zur Abtrennung und Konservierung von Leukocyten wäre auf verschiedenen Gebieten der medizinischen, gerichtsmedizinischen und anthropologischen Forschung von groiSem Irteresse. Insbesondere eine verlängerte Lebensfähigkeit in vitro von menschlichen peripheren Lymphocyten wäre sehr gut anwendbar bei der üewebetypisierung für die Organ-
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BAD ORIGINAL
transplantat ion,
der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen und ; verbesserten Verfahrens zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut undzur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten für ihre Verwendung bei Verfahren der Gewebetypisierung und anderen medizinischen Forschungen.
Es wurde nun gefunden, daß der flüssige Extrakt der Samen der Pflanze Trigonella foenum graecum fähig ist, Leukocyten ohne Agglutination der Erythrooyten vom Gesamtblut abzutrennen und ein-wertvolles Grundmedium zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten während der Lagerung ergibt.
Trigonella foenum graecum oder "Fenu/rreeK"
ist eine Gemüsepflanze der alten Welt aus der Familie Papilionaceae, Statun Trifolieae, genus Trigonella> (vgl. z.B. Hutchinson "The,Genera of FloweringPlants", Bd. 1, Seite ^56 (196*0; erschienen bei der Oxford University Press). Diese Pflanze wurde bereits als Nahrungsmittel und Medizin verwendet.
Es ist seit langem bekannt, daü bestimmte Pflanzen Hämagglutinine für spezifische Bluttypen besitzen, die sie potentiell als Bluttypisierungsreagenzien verwendbar machen. Tatsächlich wurden Tausende von Pflanzen der gesamten Welt auf ihre Hämagglutinisierungseigenschaften untiersucht. Die getesteten Substanzen bestanden gewöhnlich aus wässrigen oder Kochsalzextrakten der vermahlenen Samen dieser Pflanzen. (Vgl. z.B. Schertz et al, "Economic Botony", Bd. IA, Seite 232-40 (i960), der die Hämagglutinisierungswirksamkeit bestimmter Trifolieae-Samenextrakte beschreibt; Boyd, "J.Immunol" . - 3a -
1 0098 42/1821
BAD QRiSSNAL
Bd. 62, Seite 338-9 (19^9) und Kriipe, "Biol.Zblt." Bd. ?2, Seite (1953)ι die berichten, daJ3 insbesondere die Kochsalzlösungsextrakte von Trigonella foenum graecum keine Hämagglutinisierungswirksameit für menschliche Blutzellen besitzen.) Dennoch war bisher nicht bekannt, daß Extrakte der Samen der letztgenannten Pflanzenspezies als Abtrennungsmittel für Leukocyten verwendet werden könnten und als Grundmedium zur \fcrlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten wä-hrend der Lagerung in der hier beschriebenen Weise geeignet wären.
. Erfindungsgem,äi3 werden die getrockneten Samen vor Tri^onelün .'Ό«· )γ·-ιγ graeeum auf eine kleine, fein zerteilte Form reduziert, und zwar z.B. durch mechanisches Zerreiben durch Zerkleinerung, Vermählen oder Pulverisieren. Die Samenteilchen von Trigonella foenum graecum (im folgenden als Trigonella f. g. abgekürzt) werden dann mit einer wässrigen Flüssigkeit oder einem organischen Lösungsmittel, wie einem niedrigen Keton, z.B. Aceton und Methylethylketon, oder einem niedrigen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol und Isopropanol, extrahiert. Die normale physiologische Kochsalzlösung wird als Extraktionsflüssigkeit bevorzugt, da die meisten serologischen Reaktionen in diesem Medium durchgefihrt werden. Aus den flüssigen
Extrakten erhält man z.B. durch Zugabe von weiteren Salz-oder Lösungsmittelen
fraktionierung' Rohextrakte oder weiter gereinigte Konzentrate.
Die Löslichmachung der aktiven Komponente aus den Samen von Tjjgonella f «g. in der wässrigen Flüssigkeit oder dem organischen Lösungsmittel wird durch Behandlung bei niedrigen T' r^turen, wie z.B. zwischen O0C. bis etwa 10°C, während der Extraktion erleichtert.
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BAD ORIGINAL
Die Extraktion erfolgt für mindestens etwa 1 Stunde, vorzugsweise für etwa Zk Stunden oder mehr· Dar flüssige, die aktive Komponente enthaltende Extrakt kann vom übrigen Material durch Zentrifugieren, Filtrieren usw. abgetrennt werden.
Geeignete Extrakte erhält man durch. Zerkleinerung der getrockneten Samen von Trigonella f .g. auf eine kleine Teilchengröße, wie z.B. zwischen etwa 1-1ÖO Micron, z.B. mit einem Waring-Mischer oder einer elektrischen Kaffeemühle usw. und Extrahieren mit etwa 2-20 Gew.-Teüen normaler Kochsalzlösung (0,9 #ig,. NaCl) sowie Einstellung des pH-Wertes des erhaltenen Extraktes auf etwa 6,5-7*2.
Der oben genannte flüssige Extrakt der Samen von Trigone-lla f .g* stellt
Lagerung der
ein geeignetes Grundmedium für die/vom Blut abgetrennten Lymphocyten dar. Unter der üblichen Lagerung in vitro, z.B. nur in einen Gewebenährmedium, überleben 95 $> der Lymphocyten normalerweise nur eine Dauer von etwa 2*1—28 Stunden. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die abgetrennten Lymphocyten in Mischung mit dem erfindungsgemäßen flüssigen Extrakt zusammen mit einem geigneten Gewebenährmedium bis zu 14 Tagen bei Zimmertemperatur (etwa 25°C0 lebensfähig und unverändert bleiben.
Als Abtrennungsmittel für Leukocyten wird der hier definierte Extrakt der Samen von Trigonella f.g. dem defibrinierten Gesamtblut zugefügt und gründlich gemischt. Es wurde gefunden, daß sich die Erythrocyten naßh diesem Verfahren ohne Agglutination abscheiden und daß man ein mit Lymphocyten angereichertes Konzentrat zusammen mit dem Samenextrakt in der mit Leukocyten angereicherten, überstehenden Flüssigkeit erhält.
0098 4271821
In ein«om bevorzugten, erfindww.cmuiion Abtrennun^sverfahron wird das Gesamtblut in eine sterile, evakuierte flasche abgezogen und durch mildes Bewegen oder Verwirbeln mit kleinen Glasperlen oder einem anderen, inerten, fein zerteilten Material defibriniert, bis sich ein Fibrinknoten bildet. Dann wird eine geeignete Menge des flüssigen i£xta.kte3 der Samen von Trigonella f.g., z.B. etwa 0,1-2 Vol.-Teile Extrakt pro Vol.-Teil des defibrinierten Gesamtblutes, zugefügt und gründlich gemischt. Die rirythrocyten werden sich absetzen gelassen, und eine mit Leukocyten angereicherte, überstehende Plasmaflüssigkeit wird durch eine Plasmaabziehvorrichtung entfernt, " die ein geeignetes Filter zur Entfernung der Granulocyten enthält. Anschließend werden die im Trigonella f.g. Grundmedium verbleibenden Lymphocyten in einer sterilen, evakuierten Flasche gesammelt, die ein geeignetes Gewebekulturaährmedium enthält.
Es wurde gefunden, daß nach dem obigen Verfahren bei Zugabe von etwa 1K) VoI.- % flüssigem Extrakt der Samen von Trigonella f.g. sum def ibrinierten Gesamtblut eine schnelle Sedimentierung der Erythrocyten innerhalb von etwa 15-^5 Minuten erfolgt. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit enthält etwa 50-85 # Lymphocyten, was anzeigt, daß die aktive Komponente im flüssigen Extrakt Granulocyten sowie Erythrocyten absetzt. Durch Verwendung eines geeigneten Filters werden etwa 95-98 /έ der verbleibenden Granulocyten von der mit Leukocyten angereicherten, überstehenden Plasmaflüssigkeit entfernt.
Zur Entfernung der verbleibenden Granulocyten von den Lymphocyten kann ein geeigneter Filter, wie z.B. siliconisierte Glaswolle, Glasperlen, Baumwollfasern oder synthetische Kunststoffasern, wie "Orion", "Dacron", "Teflon" und "Nylon" Fasern verwendet werden. Vorzugsweise wird eine mit einem Waschmittel gewaschene "Nylon" Polyamidfaser verwendet. Dieses Waschen entfernt
009842/1821 BADORiGlNAL
die auf handelsüblicher "Nylon" Stapelfaser anwesende Appretur. Die Verwendung eines solchen, gewaschenen "Nylon" Filters zur Abtrennung von Lymphocyten von Granulocyten ist weiter von Greenwalt et al "Transfusion", Bd. 2/ Seite1221-9 (1962) beschrieben; diese Veröffentlichung wird hiermit" in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.
Erfindungsgemä:3 können verschiedene geeignete Gewebekultumährmedien zusammen mit dem Grundmedium aus dem flüssigen extrakt der Trigonella f.g. Samen zur Konservierung der abgetrennten Lymphocyten verwend-et werden. Geeignete Gewebekultumährmedien sind z.B. die ausgeglichenen Salzlösungen von Hanks, "Proc.Soc'y iSxper.Biol.Med.", Bd. ?1, Seite 196-200 (19^-9) und Earle, "J.Nat.Cancer Inst." Bd. 4," Seite 165-212 (1943); die Basalmedien von ivagle, "Science" Bd. 122, Seite 501-504 (1955) und 11J.Bio!. Chem." Bd. 214, Seite 839-52 (1955); die synthetischen Medien von Puck, "J.iSxptl.Med.",-Bd. 108, Seite 945-55 (1958) und Bd. 109, Seite 649-60 (1959); und die Vitaminlösungen von iagle, " J.Blöl.Chem.", Bd, 226, Seite 191-206 (1957)· diese Veröffentlichungen werden hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.
Die hier verwendten Gewebekultumährmedien enthalten vorzugsweise eine Mischung aus ausgeglichenen Salzlösungen, Puffersalzen, essentiellen Aminosäuren und NuklBotiden oder anderen proteinhalt igen Substanzen, Vitaminen oder Koenzymen, und Mönosaccharidzuckern. Im Gewebekulturnährmedium kann auch Blutserum oder eine Proteinfraktion desselben verwendet werden. Bestimmte Enzyme, wie Desoxyribonuklease, sind im Medium zur Verhütung der Bildung von Leukocyt-11 knoten" zweckmäßig. Dem Medium können geringe Mengen Antibiotika, wie Penicillin» Streptomycin, Mycostatin usw. ,aufgrund ihrer konservierenden Wirkung zugefügt werden. Geringe Mengen Phenolrot oder eines anderen pH-Wert-Indikators können zugefügt werden, um als sichtbare Kontrolle des pH-Wertes zu dienen.
.-. 009842/1821
BAD ORiQINAt
Andere geeignete Gewebekulturnährmodien enthalten z.B. Mischungen aus verschiedenen Komponenten und sind in der U.S-Patentschrift 3 122 lrf6t Beispiel I, Teil Λ und B, in der US-Patentschrift 3 128 228, Spalte k bis 6, und in der US-Patentsohrj ft 3 U3Ö 923» Spalte 2, unter der Überschrift "Culture Medium" beschrieben; diese Patentschriften werden hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.
Kür das erfindunf's;ruivÜJe Verfahren können verschiedene Vorrichtungen zur Hnndhabung von Blut verwendet werden. Die Vorrichtung besteht gewöhnlichaus einen DefibrinationsbehäLter, z.B. einer 5^-CCm sterilen, evakuierten F Flasche mit Glasperlen, einem Uberführungsbehälter, der eine evakuierte,
sterile 125-ccm-Flasche mit einem geeigneten Gewebekulturnährmedium sein kann, einer Vorrichtung zum Abziehen des Plasmas und einer Vorrichtung zum Sammeln des Blutes.
Kine erfindungsrjar.ii,.» verwendbare Vorrichtung zum Abziehen des Plasmas ist z.B. in der US-Patentschrift 2 9'J1V 069 beschrieben; erf indungsgemäJd verwendbare Vorrichtungen zum Sammeln des Blutes sind in den US-Patentschriften 2 702 034, 3 (λΛ 536, 3 127 892, 3 187 7%j sowie Reissue 25 129 und 25 171 besen rieben.
5elbstverständlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung irgendeiner besondercnVorrichtung beschränkt; die genannten Vorrichtungen waren nur eine Veranschaulichung.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken. I-'alls nicht anders angegeben, sind alle Teile und Pro· zehtangaben Gew.-Teile und Gew.->.
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BAD ORIGINAL
Beispiel 1 . " <
Getrocknete Samen von Trigonella f.g. wurden zweimal in einer Kaffeemühle mit sehr feiner Einstellung vermählen und in normaler Kochsalzlösung (0,9 $>\ 50-55 g/1) suspendiert. Die Mischung wurde 2k Stunden unter ständigem Rühren auf 5 C. abgekühlt, 3U Minuten bei hoher Geschwindigkeit zentrifug-iert und die überstehende Flüssigkeit abdekantiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einem gleichen Volumen normaler Kochsalzlösung verdünnt« Sowohl die konzentrierte als auch die verdünnte überstehende Flüssigkeit kann zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut ohne Agglutination der Erythrocyten verwendet werden; weiterhin können sie als Grundmedien zur Verlängerung der Lebenfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten während der Lagerung verwendet werden.
Beispiel 2
getrockneten
1 g der/Samen von Trigonella f»go wurden in einer elektrischen Kaffeemühle fein vermählen und bei Zimmertemperatur 2 Stunden mit 10 ecm physiologischer Kochsalzlösung, die 0,1 $> Natriumazid enthielt, extrahiert. Nach Kühlung über Nacht wurde der erhaltene Ext-rakt zentrifugiert und durch Glaswolle filtriert. Zentrifugieren und Filtrieren wurden wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit klar war. Diese klare Flüssigkeit eignet sich zur Abtrennung von Leukocyten van Gesamtbiut und als Grundmedium für eine verlängerte Lagerung von Lymphocyten in lebensfähigem und unverändertem.. Zustand.
Beispiel 3 "
Unter Verwendung einer sterilen Vorrichtung zum Sammeln von Blut wurden 25 ecm venöses Blut unmittelbar in eine sterile, evakuierte 50-ccm-Flasche gezogen und sofort durch mildes Schütteln mit kleinen Glasperlen von 5 mm Durchmesser in der Flasche für etwa 5-10 Minuten defibriniert. Mit einer sterilen Spritze wurden 25 ecm des verdünnten, überstehenden
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BAD ORIGINAL
Produktes aus Beispiel 1 in die Flasche eingeführt und gründlich gemischt. Dann wurden die Erythrozyten abgesetzt, indem man die Flasche etwa 30-^ Minuten ungestört bei Zimmertemperatur stehen lieu. Die mit Leukocyten angereicherte überstehende Flüssigkeit wurde mit einer Plasmaabziehvor-
en
richtung, die ein/gewaschenen "Nylon" Filter enthielt, entfernt. Die Abziehnadel der Abziehvorrichtung wurde durch den Stopfen auf der Flasche mit defibriniertem Blut eingeführt und die Stopfennadel durch den Stopfen der sterilen, evakuierten 125-ccm-Üherfihrungsflasche, die 25 ecm eines im folgenden definierten Gewebenährmediums enthielt, eingeführt. i£ine k Rollenklemme, wie sie z.B. iri der US-Patentschrift 3 099 ^29 beschrieben ist, wurde geöffnet und das Abziehen des Plasmas begann. üer Fluid wurde auf etwa einen Tropfen alle 4-5 Sekunden eingestellt. Wie die überstehende Flüssigkeit durch den Filter läuft, entfernen die gewaschenen "Nylon" Fasern praktisch alle verbliebenen Granulpcyten. Anschließend wurden die im Trigonella f.g. Grundmedium verbleibenden Lynphocyten in der Überführungsflasche, die das Gewebenährmedium enthält, gesammelt. Die gelagerten Lymphocyten waren in diesem Medium nach Ik Tagen bei Zinmertemperatur (etwa 25°C.) lebensfähig und unverändert. Sie können mit der Post verschickt werden. Bei Gewebetypisierungsuntersuchungen unter Verwendung dieser gelagerten Lymphocyten erhielt man nach 14-tägiger Lagerung eine 100-^bige Übereinstimmung mit lymphocytotoxischen Testergebnissen, die früher mit frischen Zellen erzielt wurden. Diese gelagerten Zellen eignen sich auch zur Karyotypisierung bei Chromosomanalysen, der Wahl von Transplantationsorganen und in cytogenen Untersuchungen.
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. BAD ORIGINAL
■ - XT - .
Praktisch dieselben Abtrennung- und Konservierungsergebnisse* wurden
erzielt, wenn man im Vorfahren von Beinpiel 3 das verdünnte, überstehende Produkt von Beispiel 1 durch das konzentrie-rte, überstehende Produkt von Beispiel 1 ersetzteo
Die Zusammensetzung des üewebonährmediums, das ηit dem filtrierten, überstehenden Material von Beispiel 3 gemischt wurde, war wie folgt:
A) Salze Kpl/l
NaCl
KCl ·
.7H2O ' ' :
NaHCO
Dextrose
NaC2H O2.3H2O
B) Aminosäuren
dl-o(-Alanin 1-Arginin Asparagin 1-A s par tin säure 1-Cystin . HCl 1-Glutaminsäure 1-Glutamin Glycin
1-Histidin Hydroxyprolin 1-Isoleucin 1-LeucJiii
1-Lysin . a-Cl
ι, 53 ,05 X ίο-1
5, 36 ,00 X ίο-3
ö. 10 ,90 X ΙΟ"5
/j. ?o ,10 X iü-'f
70 ,20 X Iu-^
ι. 23 ,60 X ΐϋ-?'
2, ,22 ,70 X ίο"2
7, ,3υ 2 10-5
,30 X ίο"6
,30 X ιο-'+
6, ,00 X ΙΟ"*
I1 ,10 X ΙΟ"*
3, ,Mj X . -k
I1 ,30 X ίο"'4"
7,50 X -3
2 X ΙΟ""3
1, X ΙΟ"3
1 X -ίο?*
1. X
2 X 10~4
6 χ' ίο-*
5 X 10~*
BAD OR1ÖMAL 0 098. A 2/ 1821
b) A-'i ty säuren (Fortsetzung Mol/l
1-Methionin 1-Phenylalanin !-Prolin 1-oer in 1-Threonin 1-Tryptophan I-Tyrosin 1 -Valin
C) Vita-lino Ascorbinsäure <λ -Tocopherolphosphat Biotin
Calciferol Calciumpantothenat Cholinchlorid Kolinsäure Mesoinosit Menadion Nicotinamid Nicotinsäure PyridoxalhydroChlorid Pyridoxinhydrochlor id p-Aninobenzoesäure Riboflavin dl-Thioctinsäure Thiaiiinhydrochlorid Vitamin A
1,60 X 10^
2,30 X HT*
2,50 X IU^
4,80 X ΙΟ"*
3,bo X 1(Λ
7,30 X ICT*
3,30 X ίο"4
3,30 X ΙΟ"*
2,80 X 4
10
4,6o X io-7
8,10 X 10"?
5,00 X 10"V
2,10 X ίο"6
8,30 X 10"5
2,11 X ίο"6
4,70 X ΙΟ"5
1,10 X ΙΟ"6
4,10 X ίο"6
4,00 X ΙΟ"6
2,40 X ίο"6
2,40 X ΙΟ"6
7,20 X ίο"6
5,30 X 10"7
9,70 X ίο"6
5,90 X ΙΟ"7
6,10 X ίο'6
009842/ 1821
ü) "N-Ukl-co.tide und andere Substanzen Mol/l
Adeninhydrochlorid ~J
Adenylsäure _
d-Ribose
Glutathion
Guaninhydrochlorid
Hypoxanthin '
Thymidin " ' ■
Uracil '
Xanthin
Natriumadenosintriphosphat Natriu-rapyruvat
Heparin ., / ' . ..-.
Phytohäraagglutinin P .
Penicillin Kalium G ■
D-ihydrostreptomycinsulfat
+ = die Bestandteile wurden zugefügt, nachdem Medium) und Zellsuspension hergestellt waren
erneut auf das ursprüngliche Volumen gebrachtes, lyopholiertes Produkt der Burroughs Wellcome & Co. .-".-.-
5,50 χ IU
5, ^ χ ΙΟ"6
9,30 χ lü"5
3,30 XlU"6
3,30 χ ίο"5
3,70 χ lü"5
2,10 χ 1U~
^,50 χ 10
3,2 χ lü"-'
5A χ 10-5
1,00 χ lü"3
1000 Einheinten/l
0,25 ccm/1
100 000 üinh.../l+
150 000 /Ug/1+
BAD
098A2/1821

Claims (2)

Patent a η s ρ r ü c h e
1.- Verfahr_en zur Verlängerung eier Lebenfähigkeit von Lynphocyten, die vom Blut abgetrennt worden sind, dadurch gekennzeichnet, daJ man die abgetrennten Lynphocyten mit einem flüssigen Extrakt der Lernen von Tri£cnella foenum graecum mischt.
2.- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daü der flüssige Extrakt in ein Gewebekulturnährmedium ein verle-ibt ist.
J- Verfahren zur Abtrennung ναι Lymphocyten vom Gesamtblut und Verlängeerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten, dadurch gekennnzeichnet, dai'3 man def ibriniertes Gesamtblut mit einem flüssigen extrakt der S^men von Trigonella foenum graecum durch gründliches gemeinsames Mischen behandelt, eine Sedimentation zuläßt, die mit Leukocyten angereicherte überstehende Flüssiekeit gewinnt, die uranulocyten davon abfiltriert und dann das abgetrennte, mit Lymphocyten. angereicherte Konzentrat in einem Gewebekulturnährmedium sammelt.
4,- Verfahren nach Anspruch 3. dadurch gek-ennzeich net, daü man filtriert, indem man die mit Leukocyten angereicherte, überstehende Flüssigkeit durch ein Filter aus synthetischen "Nylon" Polyamidfasern leitet.
Der Patentanwalt:
009842/1821 BAD original
DE2016269A 1969-04-10 1970-04-06 Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit von Lymphocyten, die vom Blut abgetrennt worden sind Expired DE2016269C3 (de)

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