DE3588225T2 - Anti-Lymphotoxin-Antikörper, Herstellung und Verwendung - Google Patents

Description

• Die vorliegende Anmeldung betrifft Antikörper gegen Lymphotoxin sowie Derivate davon. Es handelt sich dabei um eine Ausscheidunganmeldung aus der EP-A-164.965 (85303818.0), die hierin als Patentbeschreibung bezeichnet wird.
• Lymphotoxin wurde erstmals als biologischer Faktor mit antizellulärer Aktivität gegenüber neoplastischen Zelllinien identifiziert. Eine Aktivität, die als Lymphotoxin identifiziert wurde und von Mitogen-stimulierten Lymphozyten erhalten wird, ist mit einem Spektrum zytotoxischer Aktivitäten verbunden, die von der Zytostase bestimmter Tumorzellinien bis hin zu ausgeprägter Zytolyse anderer transformierter Zellen reicht. Lymphotoxin-Aktivität ist jedoch durch geringe oder keine antizelluläre Aktivität gegenüber getesteten primären Zellkulturen und normalen Zelllinien gekennzeichnet. Diese mutmaßliche unterscheidungskräftige antizelluläre Eigenschaft von Lymphotoxin hat zu Untersuchungen in vivo geführt, die darauf hinweisen, dass Lymphotoxin starke Antitumor-Aktivität entwickeln kann.
• Lymphotoxin ist ein Begriff, der für etwas verwendet wird, das als Familie von Molekülen beschrieben worden ist. Lymphotoxin-Moleküle sind als Glykoproteine identifiziert worden, die in 5 Molekulargewichtsklassen unterteilt werden, die allesamt in Bezug auf die Ladung wiederum heterogen sind. Die α- (Molekulargewicht 70-90.000) und β- (Molekulargewicht 25-50.000) Klassen beim Menschen scheinen in den meisten Lymphozyten-Überständen zu dominieren. Die α-Molekulargewichtsklassen können anhand der Ladung in zumindest sieben Unterklassen unterteilt werden, während die β-Unterklasse in zwei unterschiedliche Unterklassen unterteilt worden ist (G. Granger et al., "Cellular Responses to Molecular Modulators", Mozes et al. (Hrsg.), S. 287-310 [1981]). Ebenfalls identifiziert wurden komplexe (Molekulargewicht > 200.000) und γ- (Molekulargewicht 10-20.000) Lymphotoxin-Formen. Die verschiedenen Lymphotoxin-Formen und -Klassen unterscheiden sich voneinander in ihrer Stabilität und Kinetik des Auftretens in Kultur. Weiters können sie sich unter Bedingungen niedriger Ionenstärke mit der komplexen Klasse zusammen anhäufen. Es ist geoffenbart worden, dass die Lymphotoxin-Klassen mit niedrigem Molekulargewicht im Vergleich zu Klassen mit höherem Mo lekulargewicht relativ instabil und schwach Zell-lytisch sind. (Histerodt et al., Cell. Immun. 26, 211 (1976); Granger et al., "Biochemical Characterisation of Lymphokines", De Weck et al. (Hrsg.), S. 279-283 [1980]). γ-Klassen-Aktivität ist aufgrund ihrer Instabilität nicht umfassend untersucht worden (G. Granger et al., Cellufar Immunology 38, 388-402 [1978]). Auch von der β-Klasse ist berichtet worden, dass sie instabil ist (Walker et al.,). of Immun. 116[3], 807-815 [März 1976]).
• Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die Lymphokin-Terminologie nicht einheitlich ist. Heute sind die Namen, die Zellkultur-Produkten gegeben werden, weitgehend von den Zellen, von denen angenommen wird, dass sie das Produkt ergeben, und der Leistungsfähigkeit der Produkte in biologischen Tests bestimmt. Diese Produkte bleiben jedoch weitgehend schlecht charakterisiert, weil viele Untersuchungen mit teilweise reinen Präparaten durchgeführt worden sind und weil die zur Charakterisierung der Produkte angewandten Tests nicht Molekül-spezifisch sind und jedenfalls beträchtlichen Schwankungen unterliegen. Die wahre Identität der verschiedenen zytotoxischen Faktoren bleibt ohne Standard-Terminologie auf Basis klar testbarer unterscheidender Charakteristika, wie z. B. Aminosäuresequenzen oder Immunepitopen, unbekannt. Beispiele für andere Namen, die zytotoxischen Zellkultur-Produkten gegeben werden, sind Tumornekrosefaktor, zytotoxischer NK-Zellen-Faktor, hämorrhagischer Nekrosefaktor und Makrophagen-Zytotoxin oder zytotoxischer Faktor.
• In der Literatur ist Kaninchen-Antiserum beschrieben worden, das in der Lage ist, die zytolytische Aktivität verschiedener Zytotoxine zu neutralisieren, einschließlich von Substanzen, die als Lymphotoxin identifiziert wurden (Yamamoto et al., Cell. Immun. 38, 403-416 (1978); Gately et al., Cell. Immun. 27, 82-93 (1976); Hiserodt et al., J. Of Immun. 119(2), 374-380 (1977); Zacaharchuk et al., P. N. A. S. USA 80, 6341-6345 (Oktober 1983); Ruddle et al., Lymphokine Research 2(1), 23-31 (1983); Mannel et al., Infection and Immunity 33(1), 156-164 (1981); Wallach et al., "The Biology of the Interferon System", S. 293-302 (veröffentlicht September 1983); und Stone-Wolffet al., J. Exp. Med. 159, 828-843 (März 1984). Da dieses Antiserum polyklonal ist, enthält es eine Vielzahl von Antikörpern, die gegen das Immunogen Lymphotoxin gerichtet sind. Einer oder mehrere dieser Antikörper bewirkt/bewirken ein Neutralisieren der "Lymphotoxin"- Aktivität. Weiters sind die Berichte in der Literatur allgemein unklar, was die Molekülidentität der Substanz betrifft, die für die Lymphotoxin-Aktivität verantwortlich ist, die als Immunogen eingesetzt wurde. Was für Diagnose- und Immunaffinitätsreinigungsverfahren erforderlich wäre, ist ein monospezifischer Antikörper, der gegen ein präzise und eindeutig identifiziertes Lymphotoxin-Molekül gerichtet ist. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen solchen Antikörper bereitzustellen.
• Die Stamm-Anmeldung EP-A-164.965 offenbart die Herstellung eines bestimmten Lymphotoxins sowie von Varianten und Homologen davon durch DNA-Rekombinationstechnologie. Fig. 1 der vorliegenden Anmeldung (die Fig. 2a der Stammanmeldung entspricht) zeigt die vollständige Aminosäuresequenz für Prä-Lymphotoxin, seine kodierende DNA plus untranslatierter 5'- und 3'-Flankierungsregionen.
• Ein solches Lymphotoxin kann aus Kulturüberständen oder Lysaten durch Immunaffinitätsadsorption unter Verwendung von insolubilisiertem Lymphotoxin-neutralisierendem Antikörper gereinigt werden. Dieser Antikörper, der am effizientesten in monoklonaler Zellkultur erzeugt wird, wird in Mäusen durch Immunisierung mit Alaun-adsorbiertem Lymphotoxin gezüchtet. Daher stellt die vorliegende Erfindung unter anderem für diesen Zweck geeignete Antikörper bereit.
Detaillierte Beschreibung
• Lymphotoxin ist für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung als biologisch aktives Polypeptid definiert, das eine Region aufweist, die weitgehende strukturelle Aminosäure- Homologie mit zumindest einem Abschnitt der in Fig. 1 gezeigten Lymphotoxin-Aminosäuresequenz aufweist. Biologische Aktivität ist als preferentielle zytotoxische Aktivität wie nachstehend definiert, als immunologische Kreuzreaktivität mit einem zytotoxischen Lymphotoxin oder als die Fähigkeit zum Konkurrieren mit zytotoxischem Lymphotoxin um Lymphotoxin-Zelloberflächenrezeptoren definiert. In den letzteren beiden Fällen braucht das Lymphotoxin als solches nicht zytotoxisch zu sein. Immunologisch kreuzreative Mutanten sind als Immunogene zum Züchten von Anti-Lymphotoxin in Tieren nützlich, z. B. zur Herstellung von Immuntest-Reagenzien, während nicht-zytotoxische kompetitive Mutanten als markierte Reagenzien in kompetitiven Immuntests auf biologisch aktives Lymphotoxin zur Anwendung kommen.
• Preferentielle zytotoxische Aktivität ist als preferentielle Zerstörung oder Wachstumshemmung von Tumorzellen in vivo oder im vitro im Vergleich zu normalen Zellen unter denselben Bedingungen definiert. Die Zerstörung von Tumorzellen in vitro oder Nekrose in vivo ist der bevorzugte Test-Endpunkt, obwohl auch Zytostase oder antiproliferative Aktivität zufriedenstellend eingesetzt werden.
• Geeignete Tests zum Detektieren der antizellulären Aktivitäten von Lymphotoxin werden von B. Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 259 (1), 686-691 (1984), und E. Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3866-3670 (1975), beschrieben.
• Lymphotoxin-spezifische Aktivität ist in der vorliegenden Beschreibung in Bezug auf die Ziel-Zelllyse und nicht auf die Zytostase definiert. Eine Lymphotoxin-Einheit ist als jene Menge definiert, die für 50% Lyse von in jedem Napfausplattierten Zielzellen erforderlich ist, wie in Beispiel 1 der EP-A-164.965 näher beschrieben. Es sind jedoch auch andere Verfahren zum Bestimmen der zytotoxischen Aktivität akzeptabel.
• Weitgehende strukturelle Homologie bedeutet, dass mehr als 60 Prozent, üblicherweise mehr als 70 Prozent, der Aminosäurereste im Polypeptid dieselben oder konservative Substitutionen des/der entsprechenden Rests/Reste in der Sequenz aus Fig. 1 sind.
• Es braucht nicht die gesamte Sequenz eines Lymphotoxin-Polypeptids mit der Sequenz aus Fig. 1 homolog zu sein. Nur ein Abschnitt davon muss mit einem beliebigen Abschnitt der Sequenz aus Fig. 1 homolog sein, solange der Kandidat die erforderliche biologische Aktivität aufweist. Im Allgemeinen sollte Homologie für Regionen mit etwa 20 bis 100 Aminosäureresten nachweisbar sein, wobei zu berücksichtigen ist, dass gegebenenfalls gelegentliche Zwischenräume vorgesehen werden müssen, um die Homologie zu maximieren.
• Geringere Homologie ist erforderlich, damit Polypeptide in die Definition fallen, wenn die Region mit Homologie zur Sequenz aus Fig. 1 nicht eine der Lymphotoxin-Schlüsselregionen ist, d. h. der Regionen, die für die zytotoxische Aktivität wichtig sind. Es wird angenommen, dass die Schlüsselregionen der Sequenz aus Fig. 1 etwa die Reste 162-171, 52-83 und 127-148 sind.
• Lymphotoxin ist so definiert, dass es Human-Tumornekrosefaktor oder seine natürlichen Tier-Analoge spezifisch ausschließt (D. Pennica et al., Nature 312, 724-729 [20./27. Dezember 1984], und B. Aggarwal et al.,). Biol. Chem. 260[4], 2345-2354 [1985]).
• Strukturell ähnlich bezieht sich auf dominante Charakteristika der Aminosäure-Seitenketten, wie z. B. basisch, neutral oder sauer, hydrophil oder hydrophob, oder das Vorliegen oder Fehlen von sterischer Sperrigkeit. Die Substitution einer strukturell ähnlichen Aminosäure für eine andere ist nach dem Stand der Technik allgemein als konservative Substitution bekannt.
• Ein wesentlicher Faktor beim Bestimmen der Identität eines Polypeptids als Lymphotoxin ist die Fähigkeit von Antiseren, die in der Lage sind, die zytolytische Aktivität von im Wesentlichen homogenem Lymphoblastoid- (oder natürlichem) Lymphotoxin im Wesentlichen zu neutralisieren, auch die zytolytische Aktivität des fraglichen Polypeptids im Wesentlichen zu neutralisieren. Es versteht sich jedoch, dass immunologische Identität und zytotoxische Identität nicht notwendigerweise Hand in Hand gehen. Ein neutralisierender Antikörper für das Lymphotoxin aus Fig. 1 bindet möglicherweise ein Kandidaten-Protein nicht, weil der neutralisierende Antikörper zufällig auf eine Stelle auf dem Lymphotoxin gerichtet ist, die lediglich in der Nähe einer für die zytotoxische Lymphotoxin-Aktivität entscheidenden Region liegt, aber durch sterische Hinderung der aktiven Lymphotoxin-Stelle dennoch als neutralisierender Antikörper wirkt. Ein Kandidaten-Protein, das in dieser harmlosen Region mutiert ist, kann den neutralisierenden Antikörper möglicherweise nicht mehr binden, wäre aber, was weitgehende Homologie und biologische Aktivität betrifft, dennoch ein Lymphotoxin.
• Von Lymphotoxin, das durch Kultivierung von Lymphoblastoid-Zelllinien erhalten worden ist, sind die folgenden Eigenschaften ermittelt worden: Ein Molekulargewicht von 20.000 oder 25.000, je nach Glykosylierungsgrad und N-terminaler Heterogenität; Glykosylierung bei Asn+62 (Fig. 1); eine Tendenz zur Aggregation, insbesondere zur Organisation zu Multimeren; einen isoelektrischen Punkt von etwa 5,8; pH-Labilität (einen Verlust von > 50% der zytolytischen Aktivität, wenn es für 25 h in Ammoniumbicarbonatpuffer mit einer Konzentration von 10 pg/ml mit pH-Werten von unter etwa 5 oder über etwa 10 gelagert worden ist); und beträchtliche Verluste der Aktivität bei Inkubation in wässriger Lösung für 5 min bei 80ºC. Es sind zwei Lymphoblastoid-Lymphotoxin-Molekulargewichtsspezies identifiziert worden. Die Lymphoblastoid-Lymphotoxin- Spezies mit 25.000 Dalton weist einen aminoterminalen Leucinrest auf. Polypeptide, welche die primäre Aminosäuresequenz der Lymphoblastoid-Lymphotoxin-Spezies mit 25.000 Dalton aufweisen, werden als aminoterminale Leucyl-Lymphotoxine bezeichnet. Die Lymphoblastoid-Lymphotoxin-Spezies mit 20.000 Dalton ist durch ein aminoterminales Histidin gekennzeichnet, und entsprechende Sequenzen werden als aminoterminale Histidyl-Lymphotoxine bezeichnet. Es ist festzuhalten, dass diese Eigenschaften das native oder Wildform-Human-Lymphotoxin beschreiben, das aus Lymphoblastoid-Zellkulturen erhalten wird. Während Lymphotoxin, wie hierin definiert, natives, glykosyliertes Lymphotoxin umfasst, können auch andere verwandte zytotoxische Polypeptide in den Umfang der Definition fallen. Beispielsweise kann die Glykosylierung, die üblicherweise bei Tier-Lymphotoxinen gegeben ist, bei der Expression in eine heterologe rekombinante eukaryotische Wirtszelle modifiziert werden, wodurch das modifizierte Lymphotoxin außerhalb des Molekulargewichtsbereichs oder isoelektrischen Punkts gebracht wird, der für Human-Lymphoblastoid-Lymphotoxin festgelegt ist. Lymphotoxin, das vollständig unglykosyliert ist, wird in rekombinanter bakterieller Kultur erzeugt, wo bei sein Molekulargewicht, sein isoelektrischer Punkt oder andere Eigenschaften entsprechend modifiziert werden. Außerdem kann post-translationelle Verarbeitung von Prä-Lymphotoxin aus einer ersten Tierspezies in einer Zelllinie, die von einer anderen Tierspezies stammt, zu einem anderen aminoterminalen Rest führen, als das normalerweise bei der ersten Tierspezies der Fall ist. Auf ähnliche Weise ermöglichen es die hierin bereitgestellten Mutageneseverfahren beispielsweise, die Aminosäuresequenz und den N-Terminus von Lymphotoxin zu variieren, wodurch die pH-Stabilität, der isoelektrische Punkt und dergleichen modifiziert werden.
• Die translatierte Aminosäuresequenz für Human-Lymphotoxin wird in Fig. 1 beschrieben. Es ist anzumerken, dass diese Sequenz eine 34-Reste-Präsequenz umfasst, von der angenommen wird, dass sie während der normalen Verarbeitung des translatierten Transkripts in Humanzellen entfernt wird (hierin gemeinsam mit seinen Mutanten als "Prä-Lymphotoxin" bezeichnet), was zur aminoterminalen Leucylspezies führt. Die aminoterminale Histidylspezies ist zur aminoterminalen Leucylspezies mit der Ausnahme homolog, dass die ersten 23 Aminosäuren der aminoterminalen Leucylspezies fehlen. Alle drei Spezies, d. h. Prä-Lymphotoxin, aminoterminales Leucyl-Lymphotoxin und aminoterminales Histidyl-Lymphotoxin sowie ihre Methionyl-, modifizierten Methionyl-, mutierten und unglykosylierten Formen sind im Schutzumfang von "Lymphotoxin" enthalten. Die unglykosylierte Leucyl- und die aminoterminale Histidylspezies weisen ein geringeres Molekulargewicht auf, als oben für homologe Spezies von Lymphoblastoidzellen angegeben wurde.
• Prä-Lymphotoxin ist eine Lymphotoxin-Spezies, die in der obigen Definition enthalten ist. Sie ist durch die Gegenwart eines Signal- (oder Leader-) Polypeptids am Aminoterminus des Moleküls gekennzeichnet. Im Allgemeinen wird das native Signalpolypeptid von Lymphotoxin als Teil des Sekretionsvorgangs proteolytisch von Lymphotoxin gespalten, wobei das Protein aus der Zelle ausgeschieden wird. Das Signalpeptid kann von Mikroben oder Säugetieren stammen (einschließlich der nativen 34-Reste-Präsequenz), ist aber vorzugsweise ein Signal, das zur Wirtszelle homolog ist. Einige Signal-Lympho toxin-Fusionen werden nicht erkannt oder von der Wirtszelle zu N-terminalem metfreiem Lymphototoxin "verarbeitet". Derartige Fusionen, die mikrobielle Signale enthalten, finden beispielsweise als Lympotoxin-Immunogene Anwendung.
• Es ist anzumerken, dass der Ausdruck "in der Lage" zu zytotoxischer Aktivität bedeutet, dass Lymphotoxin auch Polypeptide umfasst, die etwa durch enzymatische Hydrolyse aus einem Analog zu einem Zymogen in inaktivem Zustand in ein Polypeptidfragment übergeführt werden können, das die gewünschte biologische Aktivität aufweist. Der Ausdruck "in der Lage" zu zytotoxischer Aktivität in vitro oder in vivo soll auch nichtzytotoxische Polypeptide umfassen, die etwa durch enzymatische Hydrolyse aus einem inaktiven Zustand analog zu einem Zymogen in ein Polypeptid-Fragment übergeführt werden können, das die definitionsgemäße biologische Aktivität aufweist. Typischerweise sind inaktive Vorläufer Fusionsproteine, bei denen Lymphotoxin über eine Peptidbindung an seinem Carboxylterminus an ein anderes Protein oder Polypeptid gebunden ist. Die Sequenz an dieser Peptidbindung oder in der Nähe ist so gewählt, dass sie für proteolytische Hydrolyse anfällig ist, um Lymphotoxin entweder in vivo oder als Teil einer Herstellungsvorschrift in vitro freizusetzen. Typische Bindesequenzen sind lys-lys oder arg-lys. Die Nicht-Lymphotoxin-Komponente für ein solches Prolymphotoxin ist vorzugsweise ein homologes Protein, um die Immunogenität der Fusion zu minimieren.
• Das homologe Protein sollte unschädlich sein und sich nicht an Zelloberflächen binden. Das Lymphotoxin, das so erzeugt wird, weist dann die definitionsgemäß erforderliche zytotoxische Aktivität auf.
• Obwohl mit Lymphotoxin üblicherweise Human-Lymphotoxin gemeint ist, umfasst die Definition von Lymphotoxin auch Lymphotoxin aus Quellen wie Maus, Schwein, Pferd oder Rind, solange es ansonsten den oben beschriebenen Normen für homologe Regionen und biologische Aktivität entspricht. Beispielsweise haben sich Rinder- und Mäuse- Lymphotoxine als in hohem Maße (zu etwa 80%) homolog mit Human-Lymphotoxin erwiesen. Lymphotoxin ist nicht Spezies-spezifisch, z. B. wirkt Human-Lymphotoxin auf Tumoren und neoplastische Zelllinien bei Mäusen. Daher kann Lymphotoxin aus einer Spezies zur Therapie einer anderen verwendet werden.
• Lymphotoxin umfasst auch multimere Formen. Lymphotoxin aggregiert spontan zu Multimeren, üblicherweise zu Dimeren oder höheren Multimeren. Multimere sind zytotoxisch und eignen sich demgemäß zur Verwendung bei der in vivo-Therapie. Lymphotoxin wird in rekombinanten Wirten als Monomer exprimiert. Lymphotoxin tendiert jedoch daraufhin dazu, spontan Multimere zu bilden. Homogene Multimere oder Gemische verschiedener Multimere sind therapeutisch einsetzbar.
• Lymphotoxin-Varianten umfassen vorbestimmte oder zielgerichtete, d. h. stellenspezifische, Mutationen des Moleküls aus Fig. 1 oder seiner Fragmente. Lymphotoxin-Varianten sind als Polypeptide definiert, die ansonsten den definierten Eigenschaften von Lymphotoxin entsprechen, aber durch eine Aminosäuresequenz charakterisiert sind, die sich von jener in Fig. 1 durch Auslassung, Substititution oder Insertion/Einfügung von Resten unterscheidet. Die hierin beschriebenen Nichthuman-Lymphotoxine und Allelen von Human-Lymphotoxin sind als Lymphotoxin-Varianten zu betrachten, ebenso wie stellengerichtete Mutanten, die kein natürliches Gegenstück besitzen. Das Ziel der Mutagenese besteht darin, DNA zu konstruieren, die für Lymphotoxin wie oben definiert kodiert, aber Eigenschaften aufweist, welche die biologische Aktivität von natürlichem Lymphotoxin modifizieren oder die Herstellung von Lymphotoxin erleichtern. Beispielsweise wird das Lysin +89-Codon mutiert, um anstelle des Lysinrests einen Histindrest zu exprimieren. Das Histidin +89 wird nicht mehr durch Trypsin hydrolysiert (das Proteine normalerweise an einer arg-X oder lys-X-Bindung spaltet). Es wird erwartet, dass Protease-Resistenz der Mutante größere biologische Halbwertszeit verleiht als das bei Lymphotoxin mit der Sequenz aus Fig. 1 (oder einem Fragment davon) der Fall ist. Andere Lysin- oder Arginin-Reste von Lymphotoxinen können zu Histidin mutiert werden, beispielsweise Lysin +28, Lysin + 19 oder Arginin + 15.
• Wie oben erörtert, weisen bestimmte Regionen des Lymphotoxin-Moleküls weitgehende Homologie mit einem ähnlich aktiven Protein auf, das als Tumornekrosefaktor bezeichnet wird. Aminosäurereste in und unmittelbar neben diesen im Wesentlichen homologen Regionen werden für die Mutagenese bevorzugt, die darauf abzielt, Lymphotoxin- Mutanten zu identifizieren, die biologische oder zytotoxische Aktivitätsvarianten aufweisen. Derartige Mutanten werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt und dann auf die gewünschte biologische Aktivität gescreent, z. B. auf erhöhte Zytotoxizität gegenüber dem jeweils behandelten Neoplasma oder, im Fall von Lymphotoxin-Spezies, die zur Immunisierung von Tieren bestimmt sind, auf die Fähigkeit, eine stärkere Immunreaktion hervorzurufen. Beispiele für solche Lymphotoxin-Varianten sind folgende: Ala&spplus; 168 wird zu einer Aminosäure mit verzweigter Kette mutiert (Val, Ile oder leu); eine hydrophobe Aminosäure (z. B. phe, val, Ile oder leu) wird zwischen thr+ 163 und Val+ 164 insertiert; Tyrosin für thr+ 163 substituiert; Lysin für ser+82 substituiert; Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Valin oder Histidin für ser+42 substituiert; Glutamin, Tryptophan, Serin oder Histidin für lys+84 substituiert; ser+82 gelöscht; ein hydrophobes Di- oder Tripeptid an leu+ 171 fusioniert, Asparaginsäure oder Lysin für thr+ 163 substituiert; ala-lys zwischen glu+ 127 und pro+ 128 insertiert; Lysin oder Glycin für ser+70 substituiert; Tyrosin für thr+69 substituiert; Arginin oder Histidin für lys+28 substituiert; Arginin oder Lysin für his+32 substituiert; Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Glutaminsäure für asp+36 substituiert; Tyrosin, Methionin oder Glutaminsäure für ser+38 substituiert; Threonin, Tyrosin, Histidin oder Lysin für ser+61 substituiert; Asparaginsäure, Serin oder Tyrosin für gly+ 124 substituiert; Arginin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan oder Prolin für his+ 135 substituiert; Asparaginsäure für thr+ 142 substituiert; und Lysin oder Threonin für gln+ 146 substituiert.
• Eine besonders wünschenswerte Gruppe von Mutanten sind jene, bei denen die Methioninreste an den Human-Lymphotoxinresten +20, + 120 und + 133 gelöscht oder vorzugsweise durch die entsprechenden Reste substituiert sind, die in den Lymphotoxinen anderer Spezies zu finden sind, wie z. B. den an anderer Stelle hierin beschriebenen. Beispielsweise sind met+20, + 120 und + 133 durch Threonin, Serin bzw. Valin substi tuiert. Dabei handelt es sich um entsprechende Reste in Rinder-Lymphotoxin. Die Substitution wird auf die in Beispiel 9 der EP-A-164.965 beschriebene Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dass met+ 133 durch einen weiteren Mutageneseschritt unter Verwendung des M13 Mp8-Phagen nach an sich bekannten Verfahren zu val mutiert wird. Diese mutierte Tierspezies-Hybrid-Lymphotoxin-DNA wird anstelle der aminoterminalen Leucyl-DNA aus Beispiel 7 der Stammanmeldung eingesetzt und als Fusion exprimiert. Nach bekannten Verfahren wird Bromcyan verwendet, um das STII-Signal vom Hybrid-Lymphotoxin abzuspalten, und die reife aminoterminale Leucyl-Lymphotoxin- Variante gewonnen.
• Andere geeignete Lymphotoxin-Varianten sind jene, bei denen Reste von Tumornekrosefaktor für entsprechende Lymphotoxin-Reste substituiert werden, um Hybrid-Tumornekrosefaktor-Lymphotoxin-Varianten zu erzeugen. Ein repräsentatives Beispiel ist die Substitution der ersten 8, 9 oder 10 Reste von reifem Tumornekrosefaktor (z. B. val-argser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-asp-) für die ersten 27 Reste von aminoterminalem Leucyl-Lymphotoxin. Es ist wahrscheinlicher, dass diese Variante bei direkter Expression in E.coli N-terminal demethionyliert wird.
• Während die Mutationsstelle vorbestimmt ist, ist es nicht notwendig, dass die Mutation als solche vorbestimmt ist. Beispielsweise wird Zufallsmutagenese am Codon für Lysin +89 durchgeführt, um die Leistung des mutierten Histidin +89-Lymphotoxins zu optimieren, und die exprimierten Lymphotoxin-Mutanten werden auf die optimale Kombination von zytotoxischer Aktivität und Protease-Resistenz gescreent.
• Lymphotoxin kann auch Insertionen, üblicherweise in der Größenordnung etwa von 1 bis 10 Aminosäureresten, oder Deletionen von etwa 1 bis 30 Resten enthalten. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder beliebige Kombinationen davon können kombiniert werden, um ein Endkonstrukt zu erhalten. Insertionen umfassen amino- oder carboxylterminale Fusionen, z. B. eine hydrophobe Verlängerung, die dem Carboxylterminus hinzugefügt wird. Vorzugsweise wird jedoch nur Substitutionsmutagenese durchge führt. Natürlich dürfen die Mutationen in der kodierenden DNA die Sequenz nicht aus dem Leserahmen bringen und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Regionen, die eine mRNA-Sekundärstruktur erzeugen könnten. Extrakte von E.coli, die mit Vektoren transformiert wurden, die DNA enthalten, die für Lymphtoxin-Mutanten mit einer Deletion von zumindest 16 carboxyterminalen Aminosäuren oder Deletion der ersten etwa 33 aminoterminalen Reste aus dem aminoterminalem Leucyl-Lymphotoxin aufweisen, zeigten keine zytotoxische Aktivität. Die Gründe für den Mangel an Aktivität sind jedoch nicht bekannt und könnten jeder der in Beispiel 1 der Stammanmeldung EP-A- 164.965 genannten sein.
• Nicht alle Mutationen in der DNA, die für das Lymphotoxin kodiert, werden im Endprodukt der rekombinanten Zellkultur exprimiert. Beispielsweise sind eine Hauptklasse von DNA-Substitutionsmutationen jene DNAs, bei denen ein anderer Sekretionsleader für den Sekretionsleader in Fig. 1 substituiert worden ist, entweder durch Deletionen innerhalb des 34-Reste-Leaders oder durch Substitutionen, wobei ein Großteils des oder der gesamte native Leader(s) gegen einen Leader ausgetauscht wird, mit höherer Wahrscheinlichkeit vom beabsichtigten Wirt erkannt wird. Beispielsweise wird bei der Konstruktion eines prokaryotischen Expressionsvektors der Sekretionsleader aus Fig. 1 zugunsten der bakteriellen Alkalischen Phosphatase- oder wärmestabilen Enterotoxin II- Leader deletiert, und für Hefe ist der Leader aus Fig. 1 zugunsten der Hefe-Invertase-, α- Faktor- oder Saure Phosphatase-Leader substituiert. Das impliziert jedoch nicht, dass der Human-Sekretionsleader nicht von anderen Wirten als der Humän-Zelllinie erkannt wird. Wenn der Sekretionsleader vom Wirt "erkannt" wird, werden das Fusionsprotein, das aus Lymphotoxin und dem Leader besteht, üblicherweise während des gleichen Ereignis, das zur Sekretion des Lymphotoxins führt, an der Leader-Lymphotoxin-Peptidbindung gespalten. Daher kann, selbst wenn eine mutierte DNA verwendet wird, um den Wirt zu transformieren, das resultierende Produkt-Lymphotoxin entweder ein fusioniertes oder natives Lymphotoxin sein, je nach der Wirksamkeit der Wirtszelle bei der Verarbeitung der Fusion.
• Eine weitere Hauptklasse von DNA-Mutanten, die nicht als Lymphotoxin-Varianten exprimiert werden, sind Nukleotidsubstitutionen, die vorgenommen werden, um die Expression zu verstärken; primär, indem Stamm-Schleifen-Strukturen in der transkribierten mRNA vermieden werden (siehe die parallele US-Anmeldung SN 303.687, EP-A- 75.444), oder um Codons bereitzustellen, die leichter vom jeweiligen Wirt transkribiert werden, z. B. die allgemein bekannten E.coli-Präferenzcodons für E.coli-Expression. Die mutierte Nukleinsäure wird nach an sich bekannten Verfahren hergestellt (A. Hui et al., EMBO 3(3), 623-629 [1984]; ]. Adelman et al., DNA 2(3), 183-193 [1983]; GB-A- 2.130.219; G. Winter et al., Nature 299, 756-758 [1982]; und R. Wallace et al., Nucl. Acids Res. 9(15), 3647-3656 [1981]). Diese Verfahren umfassen M13-Phagen-Mutagenese, die Synthese von mutiertem Lymphotoxin-Gen, wie in Beispiel 1 ff. Der EP-A- 164.965 beschrieben, wie sie nach dem Stand der Technik bekannt sind oder sein werden.
• Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um Lymphotoxin neutralisierenden Antikörper zu erhalten. Neutralisierender Antikörper ist als Antikörper definiert, der in der Lage ist, Lymphotoxin, wie gemäß vorliegender Erfindung definiert, auf solche Weise immunologisch zu binden, dass seine Aktivität bei zytostatischen oder zytolytischen Lymphotoxin-Aktivitätstests, wie dem nachstehend beschriebenen Mäuse- L929-Test, beträchtlich verringert wird. Die Tatsache, dass der Antikörper in der Lage ist, Lymphotoxinaktivität zu neutralisieren, bedeutet nicht, dass sich der Antikörper direkt an die aktive oder Rezeptorbindungs-Stelle von Lymphotoxin binden muss. Der Antikörper kann immer noch im Wesentlichen die Lymphotoxin-Aktivität neutralisieren, wenn er sich sterisch an einen Bereich bindet, der zur entscheidende Stelle benachbart ist, d. h. benachbart, was die Konformation und nicht unbedingt die Aminosäuresequenz anbelangt.
• Bei dem Versuch, einen neutralisierenden monoklonalen Antikörper gegen Lymphotoxin herzustellen, hat es sich als schwierig erwiesen, Mäuse auf solche Weise zu immu nisieren, dass in den Tieren Lymphotoxin neutralisierender Antikörper erzeugt oder hervorgerufen wird. Weder Immunisierung mit Lymphoblastoid-Lymphotoxin noch Glutaraldehyd-vernetztem Lymphotoxin führte zu nachweisbaren neutralisierenden Antikörpern im Serum immunisierter Mäuse, obwohl die Mäuse sehr wohl nichtneutralisierenden Anti-Lymphotoxin-Antikörper bildeten, der durch Enzym-Immuntest nachweisbar war. Allerdings werden durch Immunisierung mit einem Lymphotoxin-Alaun- (Aluminiumhydroxid- oder Tonerde-, Al&sub2;O&sub3;.3H&sub2;O-) Adsorptionskomplex neutralisierende Antikörper auch in Tieren hervorgerufen, welche die Aktivität vor der Immunisierung mit dem Alaunkomplex nicht gebildet hatten. Die Herstellung von Alaun und seine Verwendung zur Herstellung von Antiserum werden von C. Williams et al. (Hrsg.), "Methods in Immunology and Immunochemistry I", S. 197-229 (1967), geoffenbart.
• Es werden Fusionen von Milzzellen von Tieren, die neutralisierenden Antikörper produzieren, mit Mäuse-Myleomzellen erzeugt. Im Durchschnitt müssen etwa 50 bis 100 Klone gescreent werden, um einen zu identifizieren, der neutralisierenden Antikörper synthetisiert. Das Verfahren zum Screenen der Klone auf die gewünschte Aktivität ist ein Routineverfahren, wird von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung beherrscht und kann mit minimalem Versuchsaufwand reproduziert werden.
• Serum-, Plasma- oder IgG-Fraktionen von immunisierten Tieren sowie Immunglobuline, die von Hybridomen ausgeschieden werden, die von den Milz- oder Lymphzellen immunisierter Tiere erzeugt werden, sind zur Verwendung hierin allesamt zufriedenstellend. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die neutralisierenden Antikörper im Wesentlichen frei von anderen Anti-Lymphotoxin-Antikörpern in Hybridomkultur erhalten.
• Die neutralisierenden Antikörper werden durch Adsorption an Oberflächen, z. B. Thermoplasten wie Polystyrol, immobilisiert oder kovalent an Matrizen, wie z. B. Bromcyanaktivierte Sepharose, gebunden. Sie werden dann für Immuntests oder zur Immunaffinitätsreinigung verwendet. Da die Antikörper neutralisierende Antikörper sind, adsorbie ren oder detektieren sie am wahrscheinlichsten nur biologisch aktives Lymphotoxin oder Fragmente davon. Die Antikörper sind besonders nützlich bei immunradiometrischen ("Sandwich"-) Immuntests im Zusammenspiel mit nicht-neutralisierenden monoklonalen Anti-Lymphotoxin-Antikörpern oder polyklonalem Antiserum, das nichtneutralisierendes Anti-Lymphotoxin enthält. Der Immuntest wird durchgeführt, indem entweder die neutralisierenden oder die nicht-neutralisierenden Antikörper als markierte Komponente verwendet werden, wobei das Markieren mit einer nachweisbaren Substanz, wie z. B. Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder Radioisotopenmarkierung, nach Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, effizient erfolgt. Für Lymphotoxin-Immuntests vom kompetitiven Typ wird Lymphotoxin auf die gleiche Weise markiert. Chloramin-T-Radioiodierung eignet sich sowohl für die Lymphotoxin- als auch Lymphotoxin-Antikörper-Tracer-Herstellung, oder es wird das von J. Klostergaard et al., Mol. Immun. 18, 455 (1980), beschriebene Verfahren angewandt.
BEISPIEL 1 Verfahren zur Herstellung von Mäuse-Antikörper, der zum Neutralisieren von Lymphotoxin in der Lage ist
• Gereinigtes Lymphoblastoid-Lymphotoxin, das in Beispiel 1 der Stamm-Anmeldung EP- A-164.965 erhalten wurde, wurde gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) dialysiert. 200 ug Lymphotoxin/ml waren im Dialysat enthalten. Glutaraldehyd wurde dem Dialysat in einer Konzentration von 70 mM Glutaraldehyd zugegeben, das Gemisch 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, mehr Glutaraldehyd zugegeben, um die Gesamtzugabe- Konzentration auf 140 mM zu bringen, die Inkubation für weitere 6 h fortgesetzt und das Gemisch dann gegen PBS dialysiert. 50 ug der Glutaraldehyd-vernetzten Lymphotoxins (in der Folge "Polylymphotoxin") und 0,5 m) Freund'sches komplettes Adjuvans wurden subkutan in Mäuse (Stamm BALB/c) injiziert. Nach einer Woche erhielten die Mäuse eine Auffrischungs-lmmunisierung mit 50 ug Polylymphotoxin und 0,5 ml Freund'schem unkomplettem Adjuvans, zur Hälfte intramuskulär und zur Hälfte in die Bauchfellhöhle. Serum wurde nach 7 Tagen abgenommen und mittels ELISA-Test auf Anti-Lymphotoxin-Aktivität getestet.
• Der ELISA-Test wurde wie folgt durchgeführt: eine gepufferte Lösung von gereinigtem Lymphotoxin wurde in Mikrotiternäpfe gefüllt und die Näpfe mit jeweils etwa 100 ng Lymphotoxin beschichten gelassen. Die nicht-adsorbierte Lymphotoxin-Lösung wurde aus den Näpfen abgesaugt. 50 ul entsprechend verdünnte Testprobe wurde mit 100 ul PBS kombiniert, das 5 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt (PBS-BSA-Puffer), und jedem Napfzugegeben, für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt, 100 ul Meerrettichperoxidase-markiertes Ziegen-Anti-Mäuse-IgG in PBS-BSA-Puffer jedem Napfzugegeben und 1 h lang inkubiert. Jeder Napfwurde mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt, und dann wurde Zitrat-Phosphat-Puffer, pH 5, der 0,1 mg o-Phenylendiamin/ml (Substratlösung) und wässriges 30%iges H&sub2;O&sub2; (in einem Anteil von 4 ul 30 Vol.-%iges H&sub2;O&sub2; pro 10 ml Substratlösung) enthielt, jedem Napfzugegeben. Die Näpfe wurden für 30 min inkubiert, die Reaktion mit 50 ul 2,5M Schwefelsäure gestoppt und das Absorptionsvermögen bei 492 nm gemessen. Näpfe, die ein Absorptionsvermögen über 1. OD aufwiesen, wurden als Anti-Lymphotoxin-positiv angesehen.
• Testproben wurden auch auf die Fähigkeit untersucht, die zytolytische Aktivität von Lymphotoxin im Mäuse-L929-Test zu neutralisieren. Von immunisierten Tieren oder Hybridom-Überständen gewonnenes Serum wurde wie erforderlich in RPMI-16040-Medium verdünnt, das 10% fötales Rinderserum und etwa 100 Lymphtoxin-Einheiten/ml.
• enthielt, und in Mikrotiternäpfe plattiert, die kultivierte L929-Zellen enthielten, wie ansonsten bei Zytolyse-Tests üblich. Beim Vergleich wurden alle Zellen lysiert. Neutralisierender Antikörper wurde dadurch detektiert, dass das Lymphotoxin die L929-Zellen nicht lysierte.
• Das mit Glutaraldehyd-polymerisiertem Lymphotoxin immunisierte Tier produzierte Antikörper, die im ELISA-Test aktiv waren, aber es wurde keine serumneutralisierende Aktivität detektiert.
• Eine Suspension, die 100 ug Lymphotoxin und 1 ml einer Suspension von Aluminiumhydrid [(Al(OH)&sub3;] mit 1,64% (w/v) enthielt, wurde hergestellt und verwendet, um die gleiche Maus zu immunisieren. Der Maus wurden 100 ul der Suspension intramuskulär und 400 ul interperitoneal injiziert. Nach einer Woche wurden der Maus intravenös 10 ug nicht-polymerisiertes und nicht-adsorbiertes Lymphoblastoid-Lymphotoxin in 100 ul PBS injiziert. Ein Test einer 1/80-Verdünnung des Serums des Tieres drei Tage später zeigte die Gegenwart von Lymphotoxin-neutralisierendem Antikörper an.
• Die Milz wurde diesem Tier entnommen. 3 · 10&sup7; Milzzellen wurden mit 5 · 10&sup7; Mäuse- Myelomzellen fusioniert und in Mikrotiternäpfe plattiert, die HAT-Medium und etwa 3.000 peritoneale Makrophagen pro Mikrotiternapfenthielten, nach dem Verfahren von S. Fazekas De St. Groth,). Immunol. Meth. 35, 1-21 (1980), enthielten. Hybridome von Näpfen, die Überstände enthielten, die im obigen ELISA-Test positiv waren, wurden in 1 ml Volumen DMEM-Medium mit 20% fötalem Kalbserum, 10% NCTC-135-Medium, 5 · 10&sup7; M β-Mercaptoethanol und HAT gezüchtet, in Mikrotiternäpfe mit einem statistischen Mittelwert von einer Zelle pro Napfverteilt und dann in einem Volumen von 1 ml oder 5 ml des gleichen Mediums kultiviert. Überstände wurden daraufhin auf neutralisierenden Antikörper getestet. Statistisch synthetisierten etwa 2% der im ELISA positiven Hybridome aus der Aluminiumhydroxid-Immunisierung neutralisierenden Antikörper. Lymphotoxin-Antikörper mit hoher Affinität wird gegebenenfalls aus dieser Gruppe von Hybridomen selektiert.
BEISPIEL 2 Immunaffinitätsreinigung von Lymphotoxin
• Eine monoklonale Mäuse-Zelllinie, die Anti-Lymphotoxin sekretiert (Beispiel 1), wurde in Mäusen gezüchtet und aus Bauchwasser durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Das Anionenaustausch-Eluat wurde an Bromcyanaktivierte Sepharose in einer Konzentration von 2 mg/ml Harz gebunden. Eine 20 ml-Säule wurde nacheinander mit TBS (das 0,05 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,15 M Natriumchlorid und 2 mM EDTA enthielt); danach mit Elutionspuffer (der 0,1 M Essigsäure, pH 4,5, 150 mM Natriumchlorid ent hielt); und schließlich mit TBS äquilibriert. Ein 40% gesättigter Ammoniumsulfat-Niederschlag von beschalltem pLTtrp1-transformiertem E.coli-Lysat (zuvor durch Zentrifugation geklärt) wurde in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, und 5 mM EDTA suspendiert und auf die Säule mit einer Rate vom einfachen Säulenvolumen pro Stunde geladen. Nach ausgiebigem Waschen mit TBS, das 0,05 Prozent Tween-20 enthielt, wurde spezifisch gebundenes Material mit dem Elutionspuffer eluiert, der pH mit 0,1 fachem Volumen 1 M Tris-HCl, pH 8,5, sofort auf 7, 8 eingestellt und bei 4ºC gelagert. Die spezifische Aktivität dieses gereinigten Lymphotoxins betrug 2-10 · 10&sup7; Einheiten/mg, gemessen im obigen Mäuse-L- 929-Test.
• Das Eluat enthielt einen Großteil der auf die Säule geladenen Aktivität. Der Großteil des Gesamteluat-Proteins wanderte sowohl unter reduzierenden als auch nichtreduzierenden Bedingungen nei SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese als einzelne Bande. Die Mobilität dieser Bande entspricht etwa einem MG von 18.000, was mit dem vorhergesagten Wert von MG = 18.664 für nicht-glykosyliertes Leucyl-aminoterminales Lymphotoxin auf Basis der abgeleiteten Aminosäuresequenz in Einklang steht. Um seine biologischen Aktivitäten näher zu charakterisieren, wurde das gereinigte rekombinante Lymphotoxin auf die zytolytische Aktivität in vitro und die Antitumor-Aktivität in vivo getestet.

Claims (8)

1. Antikörper, der die zytolytische Aktivität

(i) von Lymphotoxin mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz 1 bis 171 oder

(ii) eines Lymphotoxins, das zu zytotoxischer Aktivität gegenüber Tumorzellen in vitro oder Tumorzellen in vivo fähig ist und einen Bereich aufweist, der mehr als 60% Aminosäure-Strukturhomologie mit zumindest einem Abschnitt von zumindest 20 Aminosäuren der in Fig. 1 dargestellten Lymphotoxin-Aminosäuresequenz 1 bis 171 besitzt, neutralisiert, und der frei von nicht-neutralisierenden Antikörpern ist.

2. Antikörper nach Anspruch 1, der ein monoklonaler Antikörper ist.

3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, der mit einer detektierbaren Substanz markiert ist.

Verfahren nach Anspruch 3, worin die detektierbare Substanz eine Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder Radioisotopen-Markierung ist.

5. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der an einer Oberfläche oder Matrix immobilisiert ist.

6. Antikörper nach Anspruch 5, der durch Adsorption oder über eine kovalente Bindung an eine Oberfläche oder Matrix immobilisiert ist.

7. Verfahren zum Abtrennen von Lymphotoxin von einer Zusammensetzung, welches das In-Kontakt-Bringen eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der Zusammensetzung unter Bedingungen, durch die Lymphotoxin daran adsorbiert wird, das Abtrennen des Antikörper-adsorbierten Lymphotoxins von der Zusammensetzung, und das Abtrennen des Lymphotoxins vom Antikörper umfasst.

8. Nicht-therapeutisches Verfahren zum Züchten von Antikörpern gegen Lymphotoxin, welches das Immunisieren eines Tiers gegen Glutaraldehyd-polymerisiertes Lymphotoxin und das anschließende Immunisieren desselben Tiers gegen einen Lymphotoxin-Alaun-Adsorptionskomplex umfasst, worin das Lymphotoxin die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz 1-171 aufweist oder über eine Aminosäuresequenz verfügt, die mehr als 60% Strukturhomologie mit zumindest einem Abschnitt von zumindest 20 Aminosäuren der Sequenz 1-171 aufweist, und die preferentielle zytotoxische Aktivität von zytotoxischem Lymphotoxin und/oder immunologische Kreuzreaktivität damit und/ oder die Fähigkeit zum Konkurrieren um Lymphotoxin-Zelloberflächenrezeptoren damit aufweist.