NO179075B - Fremgangsmåte for fremstilling av human lymfotoksin samt antistoff mot dette - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av human lymfotoksin og antistoff mot dette. Lymfotoksin ble først identifisert som en biologisk faktor med anticellulaer aktivitet på neoplastiske cellelinjer. En aktivitet identifisert som lymfotoksin og oppnådd fra mitogen-stimulerte lymfocytter er forbundet med et spektrum av lymfotoksiske aktiviteter varierende fra cytostase av visse tumor-cellelinjer til markert cytolyse av andre transformerte celler. Lymfotoksinaktivitet er imidlertid kjennetegnet ved liten eller ingen anticellulaer aktivitet på primære cellekulturer og normale cellelinjer som er testet. Denne antatte kjennetegnende anticellulære egenskap for lymfotoksin ledet til in vivo studier som foreslår at lymfotoksin kan ha en potent antitumor-aktivitet.

Lymfotoksin er betegnelsen benyttet på det som har blitt beskrevet som en familie av molekyler. Lymfotoksinmolekyler har blitt identifisert som glykoproteiner oppdelt i fem molekylvektklasser hver av hvilke igjen er heterogene med hensyn til ladning. De humane alfa-(MW 70-90.000) og beta-(MW 25-50.000) klassene synes å dominere i de fleste lymfocytt-supernatanter. Alfa MW-klassene kan separeres ved ladning til minst syv underklasser, mens beta-underklassen har blitt separert i to adskilte underklasser (G. Granger et al. in Mozes et al., Ed., 1981, Cellular Responses to Molekular Modulators sidene 287-310). Man har også identifisert komplekset (MW 200.000) og gamma(MW 10-20.000) lymfotoksin-former. De forskjellige lymfotoksinformene og -klassene adskiller seg fra hverandre med hensyn til deres stabilitet og kinetikk med hensyn til tilsynekomst i kultur. Videre kan de aggregere sammen med den komplekse klassen under be-tingelse med lav ionisk styrke. Klassene av lymfotoksiner med lav molekylvekt har blitt beskrevet for å være relativt ustabile og svakt cellelytiske sammenlignet med klassene av høyere molekylvekt (Hiserodt et al., 1976, "Cell. Immun." 26: 211; Granger et al. in De Weck et al. Ed., 1980 Biochemical Characterization of Lymphokines sidene 279-283). Aktivitet av gammaklassen har ikke blitt studert i særlig grad p.g.a. dens ustabilitet (G. Granger et al., 1978 "Cellular Immunology" 38: 388-402). Beta-klassen har også blitt rapportert som ustabil ]Walker et al., "J. ofImmun." 116(3): 807-815 (mars 1976)§.

Det skal forstås at lymfokin-terminologi ikke er ensartet. I øyeblikket er navnene som er gitt cellekulturprodukter, stort sett en funksjon av de celler som antas å utforme produktet og ytelsesevnen til produktene i biologiske analyser. Disse produktene forblir imidlertid dårlig karakterisert i stor utstrekning, fordi mange studier har blitt utført med delvis dårlige preparater, og fordi analysene som er benyttet for å karakterisere produktene, ikke er molekylspesif ikke og ihvertfall er utsatt for betydelig variasjon. Den virkelige identiteten til de forskjellige cytotoksiske faktorene vil forbli ukjent i fravær av standard terminologi basert på klart analyserbare, skjeldnelige karakteristika slik som aminosyresekvenser eller immun-epitoper. Som eksempler på andre navn gitt til cytotoksiske cellekulturprodukter er tumor-nekrosefaktor, NK celle-cytotoksisk faktor, nekrose-blødningsfaktor og makro-fag cytotoksin- eller cytotoksisk faktor.

US patentsøknad 608.316, inngitt 7. mai 1984 og EP 100.641A (publisert 15. februar 1984) beskriver aminosyresekvenser for et humant lymfotoksin isolert fra den humane lymfoblastoide cellelinjen RPMI-1788.

Hayashi et al., EP 132.125A (publisert 23. januar 1985) beskriver utvikling av et protein fra en kanin fulgt av stimulering av dens reticuloendotelsystem. Proteinet ble rapportert å ha antitumor-aktivitet og den N-terminaleamino-syresekvensen Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu--Ala-His-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Seu-Gln-Trp-Leu. US patentsøknad 628.059 inngitt 5. juli 1984 beskriver rensing og rekombinant syntese av et cytotoksisk human-polypeptid identifisert som tumor-nekrosefaktor og med den N-terminale aminosyresekvensen Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro.

Onishi et al. (US patent 4.481.137) beskriver oppnåelse av et 7-9.000 MW stoff betegnet CBx3 fra BALL-1 cellekultur som undertrykker veksten av tumorceller og som har en Ala-Ala N-terminus.

Ifølge Toth og Granger, "Mol. Immun." 16: 671-679 (1979), hadde hverken fjerningen av sialinsyre fra lymfotoksin-holdige lymfocytt-supernatanter ved neuraminodase-behandling eller tilsetning av N-acetylglukosamin, galaktose, laktose, mannose, alfa-metylmannosid eller fukose til supernatantene, noen innvirkning på den in vitro lytiske aktivitet. Toth et al. konkluderte dermed med at enkle sukkere ikke synes å spille en rolle i aktiviteten til deres lymfotoksin. Toth et al. observerte imidlertid også at sakkarider spiller en viktig rolle i virkningen av andre lymfokiner, og konkluderte at de ikke kunne utelukke deltagelsen av mer kompli-serte former av oligosakkarider i den cytotoksiske aktivitet til lymfotoksin.

Deretter rapporterte Proctor, Klostergaard og Granger ("Clinical Research", 1982, 30(1): 55) at humanlymfocytter, når de var aktivert av PHA i nærvær av tunikamycin (for å inhibere addisjonen av N-bundede karbohydratgrupper til lymfotoksinmolekyler) frigjorde biologisk inert lymfotoksin. Ifølge disse forfattere viste immunokjemiske studier at mens karbohydratdelen av lymfotoksin ikke var nødvendig for dets transport og frigjøring av den aktiverte lymfocytt til supernatanten, var karbohydratet nødvendig for å ha effektiv målcellenedbrytning fordi karbohydratet var ansvarlig for den riktige konformasjon av lymfotoksinmolekylet (moleky-lene ).

Annen litteratur som bør studeres i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, innbefatter Evans, "Cancer Immunol. Immunother." 12: 181-190 (1982); Lee et al., "Cell. Immun." 48: 166.181 (1979); De Weck et al. Ed.,(1980) Biochemical Characterization of Lymphokines sidene 279-312; Khan et al. Ed. (30. juni 1982) Human Lymphokines sidene 459-477; Aggarwal et al., presentasjon ved tredje internasjonale lymfokinseminar i Haverford, PA, 1.-5- august 1982; Ramson et al., "Cancer Research" 43: 5222-5227 (nov.1983); Kull et al., J. of Immun." 126(4 ): 1279-1283); J. Sawada, et al., "Jpn. J. Exp. Med." 46: 263-267 (1976); G. Granger et al., "Cell. Immunol." 38: 388-402 (1978); J. Rundell et al., "Immunopharmacology" 3: 9-18 (1981); G. Granger et al., "J. Lymphokine Res." 1: 45-49 (1982); N. Ruddle et al. "Lymphokine Res." 2: 23-31 (1983); M. Mitsuhashi et al., britisk patentsøknad 2.106.117; H. Enomoto, europeisk patentsøknad 87.087A; B. Williamson et al., "P.N.A.S. USA" 80:5397-5401

(1983) og S. Wright et al., "J. Immunol." 126: 1516-1521

(1981).

Lymfotoksinet (eller andre stoffer identifisert som lymfotoksin) som hittil er oppnådd fra lymfocyttkultur, er til stede i lave konsentrasjoner, av størrelsesorden 0,05-2x10^ enheter/l i supernatanter av RPMI-1788 celler eller primære lymfocytter. De høstede mengdene varierer ofte betydelig, og primære lymfocytter er dyre. En økonomisk metode for fremstilling av lymfotoksin er nødvendig (Yamamoto et al., "J. of Biological Response Modifiers" 3:(1) 76-87 (1984)).

Tidligere metoder kan heller ikke fremstille lymfotoksin som er homogent med hensyn til aminosyresekvens, et viktig trekk for legemiddelanvendelser. Lymfotoksin utvunnet fra celle-linjekultur utviser aminoterminal-heterogenitet, sannsynlig-vis p.g.a. proteolytisk behandling (se ovenfor angitte US søknad 608.316). Kulturer av primære lymfocytter, f.eks. fra denoider eller perifert blod, må nødvendigvis inneholde cellene til mange donorer av økonomiske grunner. Produktene fra disse cellene vil imidlertid reflektere genetisk variasjon blant donorene slik at det resulterende "lymfotoksin" faktisk kan være en blanding av alleliske arter. Andelene og identitetene av slike alleler vil åpenbart være ukjent fra porsjon til porsjon. Det er nødvendig med en metode for fremstilling av lymfotoksin som er ensartet med hensyn til dets aminosyresekvens.

Tidligere metoder er også begrenset til fremstilling av lymfotoksin som har primære aminosyresekvenser tilsvarende de som finnes i naturen. Erstatning, utelatelse eller innføring av forskjellige aminosyrer i disse sekvenser ville kreve omfattende og kostbare kjemiske modifikasjoner, hvis slike i det hele tatt kunne oppnåd. Det er nødvenduig med fremgangsmåter for lett innføring av variasjoner i aminosyresekvensene i lymfotoksin.

Selv om antitumoreffektene og den tilsynelatende terapeutiske verdi av lymfotoksinaktivitet har blitt rapportert i litteraturen siden 1968, har lymfotoksin ikke blitt studert i omfattende kliniske protokoller eller kommersialisert p.g.a. de små mengdene og den heterogene naturen til lymfotoksinet gjort tilgjengelig gjennom tidligere metoder. Metodene er nødvendige for på økonomisk måte å fremstille mengder av lymfotoksin som er tilstrekkelig for kliniske studier.

Det har i litteraturen blitt beskrevet kanin-antisera som kan nøytralisere den cytolytiske aktivitet til forskjellige cytotoksiner, inkludert stoffer identifisert som lymfotoksin (Yamamoto et al. "Cell. Immun." 38: 403-416 (1978); Gately et al., "Cell. Immun." 27: 82-93 (1976) Eiserodt et al., "J. og Immun." 119(2): 374-380 (1977); Zacharchuk et al., "P.N.A.S. USA" 80: 6341-6345 (oktober 1983); Ruddle et al., "Lymphokine Research" 2(1) 23-31 (1983); Mannel et al., "Infection and Immunity" 33(1): 156-164 (1981); Wallach et al. E. de Maeyer et al. Ed. The Biology of the Interferon System sidene 293-302 (publisert semptember 1983) og Stone-Wolff et al., "J. Exp. Med." 159: 828-843 (mars 1984). Siden dette antisera er polyklonalt, inneholder det flere antistoffer rettet mot immunogene lymfotoksin. Ethvert eller flere av disse antistoffene virker slik at "lymfotoksin"-aktiviteten nøytraliseres. Videre er litteraturen generelt uklar med hensyn til den molekylare identitet til det stoff som er ansvarlig for lymfotoksinaktivitet som ble benyttet som immunogen. Det som er nødvendig for diagnosemetoder og immunoaffinitet-rensings-metoder, er et monospesifikt antistoff rettet mot et klart og entydig identifisert lymfotoksinmolekyl. Det er et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et slikt antistoff.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av human lymfotoksin, kjennetegnet ved å uttrykke i en rekombinant vertscelle en rekombinant nukleinsyrekonstruksjon omfattende: (i) nukleinsyre kodende for lymfotoksin som angitt i fig. 2A eller (ii) nukleinsyre som er oppnåelig ved hybridisering med det som er angitt i fig. 2A og som koder for et

polypeptid med lymfotoksinaktivitet; eller

(iii) nukleinsyre som koder for et lymfotoksinpolypeptid som har vesentlig strukturell homologi med minst en del av lymfotoksinaminosyresekvensen angitt i fig. 2A; i det nevnte lymf otoksinpolypeptid i (ii) eller (iii) utviser cytotoksisk aktivitet til, og/eller immunologisk kryss-reaktivitet med, og/eller evne til å konkurrere for lymfotoksin celleoverflatereseptorer med, cytotoksisk lymfotoksin.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det beskrevet et antistoff for in vitro anvendelse kjennetegnet ved at det nøytraliserer den cytolytiske aktiviteten til (i) human lymfotoksin omfattende aminosyrene 24-171 ifølge 2A eller (ii) et humant lymfotoksin som har evne til enten cytotoksisk aktivitet overfor tumorceller in vitro eller tumorceller in vivo og som har en region som demonstrerer vesentlig strukturell aminosyrehomologi med minst en del av lymfotoksinaminosyresekvensen angitt i figur 2A, og som er fri for ikke-nøytrali-serende antistoffer.

Formålene i foreliggende oppfinnelse har blitt oppnådd ved den vellykkede rekombinante ekspresjon av protein som har lymfotoksinaktivitet. Denne lymfotoksintype, som er beskrevet heri med hensyn til dens aktivitet og naturlige eller varierende aminosyresekvens, er således i det følgende referert til som lymfotoksin. Det DNA-kodende lymfotoksin har overraskende blitt identifisert til tross for de meget små nivåer av lymfotoksin som uttrykkes i homologe celler og usikkerheten med hensyn til det tidspunkt ved hvilket meddeler-RNA som koder lymfotoksin, dukker opp i homologe celler. Videre, biologisk aktivt lymfotoksin uttrykkes overraskende i rekombinante celler som ikke glykosylerer lymfotoksinet (eller som ikke ville forventes å gjøre dette på samme måte som homologe celler) og det således uttrykte lymfotoksin utvinnes med en vesentlig ensartet aminosyresekvens uten N-terminal enzymatisk hydrolyse. DNA som koder lymfotoksin, uttrykkes i cellekulturer i rikelige mengder over 0.1-1x1011 enheter/liter av kulturlysat.

Lymfotoksinet som er uttrykt av en rekombinant vertcelle, vil avhenge av det DNA som benyttes for å kode lymfotoksinet eller dets forløpere, samt av den valgte vertcelle. Nuklein-syresekvensene som benyttes heri for lymfotoksinsyntese, er nye. De er kjennetegnet ved nukleotidsekvenser som adskiller seg fra den native eller naturlige sekvens i en eller flere av følgende henseender: DNA-materialet er fritt for intro-ner, i tilfellet for human lymfotoksin er intronet til stede mellom mikleotider 284 og 285 (Fig. 2a); DNA-materialet er fritt for nukleinsyre som koder andre proteiner i organismen hvorfra DNA-materialet skriver seg; nukleinsyren som koder for lymfotoksin, er ligert inn i en vektor; og/eller nukleinsyren kan hybridisere til nukleinsyre som koder for lymfotoksin, men forutsatt at slik hybridiserende nukleinsyre ikke har nukleotidsekvensen til naturlig DNA eller RNA som koder lymfotoksin.

Mutante nukleinsyrer som koder for lymfotoksin, er produktet av rekombinante manipulasjoner. Stille mutasjoner i 5' utranslatert eller translatert nukleinsyre for lymfotoksin tilveiebringes for å fremme ekspresjonsnivåer i valgte verter, f.eks. ved å redusere sannsynligheten for hårnål-struktur i mRNA i 5'-områdene i nukleinsyren, eller ved å innsette vert-foretrukne kodoner istedenfor de som finnes i naturlige nukelinsyreisolater.

Mutasjoner i nukleinsyrene som uttrykkes istedenfor å være stille, muliggjør fremstilling av lymfotoksintyper som har aminosyresekvensen til nativt lymfotoksin eller primære sekvensvarianter derav med aminosyresekvenser som adskiller seg fra det native lymfotoksin. Det mutante lymfotoksin utvinnes som sådant, eller behandles ytterligere av vertcellen for oppnåelse av de ønskede lymfotoksintypene.

Disse nukleinsyrene eller nukleinsyrer som hybridiserer dermed, eller fragmenter derav, merkes og benyttes i hybridiseringsanalyser for identifikasjon eller bestemmelse av genetisk materiale som koder lymfotoksin.

I fremgangsmåter for syntese av lymfotoksin blir DNA som koder for lymfotoksin, ligert inn i en vektor, vektoren benyttet for å omdanne vertceller, vertcellene dyrkes, og lymfotoksin utvinnes fra kulturen. Denne generelle prosess anvendes for å syntetisere lymfotoksin som har aminosyresekvensen til nativt lymfotoksin eller for å konstruere nye lymfotoksinvarianter, avhengig av vektorkonstruksjon og den vertcelle som velges for transformasjon. Lymfotoksintypene som her er i stand til syntese, innbefatter leucocylamino-terminal lymfotoksin, histidylamino-terminal lymfotoksin, pre-lymfotoksin og lymfotoksinvarianter innbefattende (a) fusjonsproteiner hvori et heterologt protein eller polypeptid er bundet med en peptidbinding til amino- og/eller karboksyl-terminalaminosyrene i lymfotoksin, (b) lymfotoksin-fragmenter, spesielt fragmenter av pre-lymfotoksin hvori enhver aminosyre mellom -34 og +23 er amino-terminal-aminosyren i fragmentet, (c) lymfotoksin-mutanter hvori en eller flere aminosyrerester er substituert, innført eller sløyfet, (d) metionyl- eller modifisert metionyl- (slik som formylmetionyl eller andre blokkerte metionylarter) amino--terminalderivater, og/eller (e) uglykosylerte eller variert glykosylerte arter av alle de foregående.

Dersom en pattedyrcelle transformeres med nukleinsyre som koder lymfotoksin operativt ligert til en eukaryotisk sekretorisk leder (inkludert den native lymfotoksin-sekretoriske leder), eller dersom nukleinsyre som koder for lymfotoksin operativt ligeres i en vektor til en prokaryotisk eller gjærsekretorisk leder som er gjenkjent av vertcellen som skal transformeres (vanligvis den organisme fra hvilken ledersekvensen ble oppnådd), verten transformeres med vektoren og dyrkes, så utvinnes ikke-metionylert aminoterminal-lymfotoksinarter vanligvis fra kulturen.

Dersom DNA som koder lymfotoksin operativt ligeres i en vektor uten en sekretorisk ledersekvens og deretter benyttes for å transformere en vertcelle, så blir lymfotoksinartene eller -enhetene som syntetiseres, vanligvis substituert med en amino-terminal metionyl- eller modifisert metionylrest slik som formylmetionyl.

In vitro mutagenese av nukleinsyren som koder fior lymfotoksin fører til ekspresjon av lymfotoksinvarianter. For det første blir N-terminal metionyl- eller modifisert metionyl-lymfotoksin uttrykt av vertcellene transformert med nukleinsyre som koder for lymfotoksin som uttrykkes direkte, dvs. som ikke er operativt bundet til en sekretorisk ledersekvens.

For det annet blir in vitro, sete-spesifikk, bestemt eller vilkårlig mutagenese benyttet for å introdusere utelatelser, substitusjoner og/eller innskudd nukleinsyren som koder lymfotoksin. Lymfotoksinfusjoner fremstilles på denne måten. Lymfotoksinderivatene som oppnås ved ekspresjon av mutant nukleinsyre, utviser modifiserte egenskaper.

Sluttlig tilveiebringes uglykosylerte eller varierende glykosylerte lymfotoksiner som nye lymfotoksinenheter. Uglykosylert lymfotoksin fremstilles ved prokaryotisk ekspresjon av DNA som koder lymfotoksin. Varierende glykosylerte lymfotoksinenheter er produktet av rekombinant dyrking i transformerte høyere eukaryotiske, vanlige pattedyrceller.

Lymfotoksinet som her fremstilles, renses fra kultur-supernatanter eller -lysater ved immunoaffinitetsadsorpsjon ved bruk av uoppløseliggjort lymfotoksin-nøytraliserende antistoff. Dette antistoff, som på mest effektiv måte fremstilles i monoklonal cellekultur, oppnås i mus ved immunisering med alun-adsorbert lymfotoksin.

Lymfotoksinet kombineres for terapeutisk anvendelse med fysiologisk uskadelige stabilisatorer og eksipienser og fremstilles i steril doseringsform som ved lyofilisering i doseringsampuller eller lagring i stabiliserte vandige preparater. Alternativt blir lymfotoksinet inkorporert i en polymermatrise for implantering i tumorer eller kirurgiske steder fra hvilke tumorer har blitt utskåret, og bevirker derved en tidsberegnet frigjøring av lymfotoksinet i en lokalisert høy gradientkonsentrasjon.

De her omtalte terapeutiske preparater administreres i terapeutisk effektive doser ved implantering, injeksjon eller infusjon i dyr, spesielt menneskepasienter som har ondartede svulster. Fig. la viser en DNA-sekvens og dens antatte aminosyresekvens som koder et lymfotoksinfragment. Fig. lb demonstrerer konstruksjonen av syntetisk DNA som koder fragmentet i fig. la. Fig. 2a viser den komplette aminosyresekvensen for pre-lymf otoksin, dens kodende DNA pluss 5'- og 3'-flankerende utranslaterte områder. Fig. 2b illustrerer en fremgangsmåte for konstruksjon av en ekspresjonsvektor for metionylleucylamino-terminal lymfotoksin og dets aminoterminal-metionylderivater. Fig. 3 viser en fremgangsmåte for konstruksjon av en ekspresjonsvektor for metionylhistidylamino-terminal lymfotoksin . Fig. 4 viser aminosyresekvensene for lymfotoksin hos mennesker, mus og storfe, og de gjengse pattetyr-lymfo-toksinrestene. Fig. 5a og 5b viser konstruksjonen av et plasmid som koder en fusjon av lymfotoksin og en bakteriell signalsekvens.

Lymfotoksin er definert som et biologisk aktivt polypeptid som har et område som demonstrerer vesentlig strukturell aminosyrehomologi med i det minste en del av lymfotoksinaminosyresekvensen vist på fig. 2a. Biologisk aktivitet er definert som selektiv, cytotoksisk aktivitet som definert nedenfor, immunologisk kryssreaktivitet med et cytotoksisk lymfotoksin eller evnen til å konkurrere med cytotoksisk lymfotoksin for lymfotoksin-celleoverflatereseptorer. I de sistnevnte to tilfeller behøver lymfotoksinet ikke være cytotoksisk per se. Immunologisk kryssreaktive mutanter er nyttige som immunogener for oppnåelse av anti-lymfotoksin i dyr, f.eks. for fremstillingen aminoanalysereagenser, mens ikke-cytotoksiske, kokurrerende mutanter finner anvendelse som merkede reagenser i immunoanalyser av konkurransetypen for biologisk aktivt lymfotoksin.

Selektiv cytotoksisk aktivitet er definert som den selektive nedbrytning eller vekstinhibering av tumorceller in vivo eller in vitro, sammenlignet med normale celler under de samme betingelser. Nedbrytning av tumorceller ved lyse in vitro eller nekrose in vivo er det foretrukne analyseende-punkt, skjønt cytostase eller antiproliferativ aktivitet også er benyttet på tilfredsstillende måte.

Egnede analyser for detektering av de anticellulære aktivi-tetene til lymfotoksin er beskrevet i B. Aggarwal, et al., 1984, "J. Biol. Chem." 259(1), 686-691 og E. Carswell, et al.,1975, "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 72, 3666-3670.

Lymfotoksin-spesifikk aktivitet er definert heri i forbindelse med målcellelyse i stedet for cytostase. En enhet av lymfotoksin er definert som den mengde som skal til for 50$ lyse av målceller utplatet i hver brønn som ytterligere beskrevet i eksempel 1. Andre metoder for bestemmelse av cytotoksisk aktivitet er imidlertid akseptable.

Vesentlig strukturell homologi betyr generelt at mer enn ca. 60$ og vanligvis mer enn ca. 70$ av aminosyrerestene i polypeptidet er de samme eller bevarende erstatninger for den tilsvarende rest(er) i sekvensen på fig. 2a.

Ikke hele sekvensen i et lymfotoksin-polypeptid behøver å være homolog med fig. 2a sekvensen. Bare en del derav behøver å være homolog med noen del i fig. 2a sekvensen så lenge som kandidaten utviser den nødvendige biologiske aktivitet. Generelt bør homologi være demonstrerbar for områder med fra ca. 20 til 100 aminosyrerester, idet det erkjennes at det kan være nødvendig å introdusere tilfeldige mellomrom for å maksimere homologien.

Mindre homologi er nødvendig for at polypeptider skal falle innenfor definisjonen dersom homologiområdet med fig. 2a sekvensen ikke er i et av lymfotoksin-nøkkelområdene, dvs. områder som er viktige for cytotoksisk aktivitet. Nøkkel-områdene i fig. 2a sekvensen antas å være omkring rester 162-171, 52-83 og 127-148.

Lymfotoksin er definert til spesifikt å ekskludere human tumornekrosefaktor eller dets naturlige analoger hos dyr (D. Pennica et al., "Nature" 312:20/27 desember 1984, sidene 724-729 og B. Åggarwal et al., "J. Biol. Chem." 260]4§: 2345-2354 ]1985§).

Strukturelt lignende refererer til dominante egenskaper til aminosyrekjedene slik som basisk, nøytral eller sur, hydro-fil eller hydrofob, eller tilstedeværelsen eller fraværet av sterisk fylde. Erstatning av en strukturelt lignende aminosyre med en annen er generelt kjent innen teknikken som en konservativ eller bevarende substitusjon.

En signifikant faktor ved bestemmelse av identiteten til et polypeptid som lymfotoksin, er evnen til antisera ,som er i stand til vesentlig å nøytralisere den cytolytiske aktivitet til vesentlig homogent, lymfoblastoid (eller naturlig) lymfotoksin, til også vesentlig å nøytralisere den cytolytiske aktivitet til det angjeldende polypeptid. Det vil imidlertid forstås at immunologisk identitet og cytotoksisk identitet ikke nødvendigvis er sammenfallende. Det kan være at et nøytraliserende antistoff for lymfotoksinet på fig. 2a ikke binder et kandidatprotein fordi det nøytraliserende antistoff tilfeldigvis er rettet mot et sete på lymfotoksin som kun tilstøter et område om er kritisk for lymf otoksin-cytotoksisk aktivitet, men som virker som et nøytraliserende antistoff ved sterisk hindring av det lymfotoksin-aktive sete. Det kan være at et kandidatprotein mutert i dette uskadelige området, ikke lenger binder det nøytraliserende antistoff, men det ville ikke desto mindre være lymfotoksin hva angår vesentlig homologi og biologisk aktivitet.

Lymfotoksin oppnådd ved dyrking av lymfoblastoide cellelinjer har blitt bestemt til å ha følgende egenskaper: En molekylvekt på 20.000 eller 25.000, avhengig av graden av glykosylering og N-terminal heterogenitet; glykosylering ved ASN+62 (fig. 2a); en tendens til å aggregere, spesielt å organiseres til multimerer; et isoelektrisk punkt på ca. 5,8; pH-labilitet (et tap på > 50% cytolytisk aktivitet ved lagring i 24 timer i ammoniumbikarbonatbuffer med 10 pg/ml konsentrasjon med pH-nivåer mindre enn ca. 5 eller større enn ca. 10); et vesentlig tap av aktivitet ved inkubering i vandig oppløsning i 5 min. ved 80°C. To lymfoblastoide, lymfotoksin-molekylvektenheter har blitt identifisert. 25.000 Da i lymfoblastoid lymfotoksin har en amino-terminal leucinrest. Polypeptidene som har den primære aminosyresekvensen på 25.000 Da, betegnes glykosylaminoterminalt lymfotoksin. 20.000 Da i lymfoblastoid lymfotoksin er kjennetegnet ved en amino-terminal histidin, og tilsvarende sekvenser er betegnet histidyl amino-terminaltlymfotoksin. Det er viktig å observere at disse egenskapene beskriver det native eller vi11type-human lymfotoksin oppnådd fra lymfoblastoid-cellekulturer. Mens lymfotoksin som definert heri innbefatter nativt, glykosylert lymfotoksin, kan andre relaterte cytotoksiske polypeptider falle innenfor rammen av denne definisjon. F.eks. kan glykosyleringen som vanligvis er forbundet med et animalsk lymfotoksin modifiseres ved ekspresjon i en heterolog rekombinant eukaryotisk vertcelle og derved bringe det modifiserte lymfotoksin utenfor molekylvektene eller det isoelektriske punkt som er fastslått for humant lymfoblastoid lymfotoksin. Lymfotoksin som er fullstendig uglykosylert, fremstilles i rekombinant bakterie-kultur med dets molekylvekt, isoelektriskepunkt og andre egenskaper tilsvarende modifisert. I tillegg kan post-translasjonal behandling av pre-lymfotoksin fra en første animalsk type i en cellelinje avledet fra en annen animalsk type resultere i en forskjellig amino-terminal rest enn det som vanligvis er tilfelle for den første animalske typen. Likeledes vil mutagenese-metodene som tilveiebringes heri, f.eks. gjøre det mulig å variere aminosyresekvensen og N-terminusen i lymfotoksin og derved modifisere pH-stabili-teten, det isoelektriske punkt og lignende.

Den translaterte aminosyresekvensen for human lymfotoksin er beskrevet på fig. 2a. Det skal påpekes at denne sekvensen innbefatter en 34 rest-presekvens som antas å bli fjernet under normal behandling av det translaterte transkript i humanceller (heri, sammen med dets mutanter, betegnet pre-lymfotoksin") resulterende i leukocylamino-terminal-enhetene. Eistidylamino-terminalenhetene er homologe med leukocylamino-terminalenhetene med unntagelse for at de første 23 aminosyrene i leukocylamino-terminalenhetene er fraværende. Alle tre enheter, dvs. pre-lymfotoksin, leukocylamino-terminalt lymfotoksin og histidylaminoterminalt lymfotoksin, samt deres metionylformer, modifiserte metionylformer, mutante former og uglykosylerte former, innbefattes i rammen for lymfotoksin. De uglykosylerte leucylamino-terminalenhetene og histidylamino-terminal-enhetene vil ha lavere molekylvekter enn det som er beskrevet ovenfor for de homologe enhetene fra lymfoblastoidceller.

Pre-lymfotoksin er en enhet i lymfotoksin som er innbefattet i den ovenfor angitte definisjon. Det er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av et signal- (eller leder-)polypeptid ved aminoterminusen i molekylet. Generelt blir det native signalpolypeptidet i lymfotoksin proteolytisk spaltet fra lymfotoksin som en del av den sekretoriske prosess, hvori proteinet utskilles fra cellen. Signalpeptidet kan være mikrobielt eller ha pattedyropprinnelse (inkludert den native, 34-rest-presekvens), men det er fortrinnsvis et signal som er homologt med vertcellen. Noen signal-lymfotoksinfusjoner blir ikke gjenkjent eller "bearbeidet" av vertcellen til met-fritt N-terminallymfotoksin. Slike fusjoner inneholdende mikrobielle signaler har nyttevirkning f.eks. som lymfotoksin-immunogener.

Det skal bemerkes at språkbruken "er i stand til" cytotoksisk aktivitet betyr at lymfotoksin innbefatter polypeptider som kan omdannes, som ved enzymatisk hydrolyse, fra en inaktiv tilstand analogt med et zymogen, til et polypeptidfragment som viser den ønskede biologiske aktivitet. Språkbruken "er i stand til" in vitro eller in vivo cytotoksisk aktivitet er ment å omfatte ikke-cytotoksiske polypeptider som kan omdannes, som ved enzymatisk hydrolyse, fra en inaktiv tilstand analogt med et zymogen, til et polypeptidfragment som viser den definisjonsmessige biologiske aktivitet. Typisk vil inaktive forløpere være fusjonsproteiner hvori lymfotoksin er bundet med et peptidbånd ved dets karboksyl terminus til et annet protein eller polypeptid. Sekvensen ved denne peptidbinding eller i nærheten er valgt slik at den er mottagelig for proteolytisk hydrolyse for å frigjøre lymfotoksin, enten in vivo eller, som en del av en fremstillingsprotokoll, in vitro. Typiske bindingssekvenser er lys-lys eller arg-lys. Ikke-lymfotoksinkomponenten til et slikt prolymfotoksin er fortrinnsvis et homologt protein for derved å minimalisere fusjonens immunogenisitet. Det homologe protein bør være uskadelig og ikke binde til celleoverflater. Lymfotoksinet som utvikles på denne måten, vil derved utvise den definisjonsmessig nødvendige cytotoksiske aktivitet.

Mens lymfotoksin vanligvis betyr human lymfotoksin, er lymfotoksin fra kilder slik som mus, svin, hest eller storfe innbefattet i definisjonen av lymfotoksin så lenge det ellers tilfredsstiller de standarder som er beskrevet ovenfor for homologe områder og biologisk aktivitet. F.eks. er det funnet at lymfotoksiner fra storfe og mus er sterkt (ca. 80%) homologe med human-lymfotoksin. Lymfotoksin er ikke artsspesifikt, f.eks. er human-lymfotoksin aktivt på musetumorer og neoplastiske cellelinjer. Lymfotoksin fra en art kan derfor anvendes i terapi av en annen.

Lymfotoksin innbefatter også multimere former. Lymfotoksin aggregerer spontant til multimerer, vanligvis dimerer eller høyere multimerer. Multimerer er cytotoksiske og er følgelig egnet for bruk i in vivo terapi. Lymfotoksin uttrykkes i rekombinante verter som en monomer. Lymfotoksin har imidlertid deretter tilbøyelighet til på spontan måte å danne multimerer. Homogene multimerer eller en blanding av forskjellige multimerer er terapeutisk nyttige.

Variant-lymfotoksiner innbefatter bestemte eller målrettede, dvs. sete-spesifikke, mutasjoner av fig. 2a molekylet eller dets fragmenter. Variant-lymfotoksiner er definert som polypeptider som ellers tilfredsstiller de definerte egenskapene til lymfotoksin, men som er kjennetegnet ved en aminosyresekvens som adskiller seg fra den på fig. 2a, enten ved utelatelse, substitusjon eller innskudd av rester. De ikke-humane lymfotoksinene som her er beskrevet, og alleler av human-lymfotoksin, anses for å være variant-lymfotoksiner som er sete-rettede mutanter uten noen naturlig motpart. Formålet med mutagenese er å konstruere DNA som koder lymfotoksin som definert ovenfor, men utviser egenskaper som modifiserer den biologiske aktiviteten til naturlig lymfotoksin eller letter fremstillingen av lymfotoksin. F.eks. muteres lysin +89 kodonet for å uttrykke en histidinrest i stedet for lysinresten. Histidin +89 blir ikke lenger hydrolysert av trypsin (som i alminnelighet spalter proteiner ved en arg-X- eller lys-X-binding. Protease-resistens forventes å gi større biologisk halvliv til mutanten enn tilfellet er for lymfotoksin som har sekvensen på fig. 2a (eller et fragment derav). Andre lymfotoksin-lysin- eller -argininrester kan muteres til histidin, f.eks. lysin +28, lysin +19 eller arginin +15.

Som omtalt ovenfor utviser visse områder av lymfotoksinmolekylet vesentlig homologi med et likeledes aktivt protein betegnet tumor-nekrosefaktor. Åminosyrerester i og umiddelbart flankerende disse vesentlig homologe områdene er foretrukket for mutagenese rettet mot identifisering av lymfotoksinmutanter som utviser varierende biologisk eller cytotoksisk aktivitet. Slike mutanter fremstilles ved i og for seg kjente metoder og analyseres deretter med henblikk på den ønskede biologiske aktivitet, f.eks. forøket cyto-toksisitet mot det spesielle neoplasma som behandles eller, i tilfelle for lymfotoksin-arter beregnet for immunisering av dyr, evnen til å fremkalle en mer potent immunreaksjon. Eksempler på slike lymfotoksin-varianter er som følger: Ala+168 er mutert til en aminosyre med forgrenet kjede (val, ile, eller leu); en hydrofob aminosyre (f.eks. phe, val, ile eller leu) er innført mellom thr+163 og val+164; tyrosin er erstattet med thr+163; tyrosin erstatter thr+163; lysin erstatter ser+82; isoleucin, leucin, fenylalanin, valin eller histidin erstatter ser+42; glutamin, tryptofan, serin eller histidin erstatter lys+84; ser+82 er sløyfet; et hydrofobt di- eller tripeptid er bundet til leu+171; aspartinsyre eller lysin erstatter thr+163; ala-lys er innført mellom glu+127 og pro+128; lysin eller glycin erstatter ser+70; tyrosin erstatter thr+69; arginin eller histidin erstatter lys+28; arginin eller lysin erstatter his+32; prolin, serin, treonin, tyrosin, eller glutaminsyre erstatter asp+36; tyrosin, metionin eller glutaminsyre erstatter ser+38; treonin, tyrosin, histidin eller lysin erstatter ser+61; aspartinsyre, serin eller tyrosin erstatter gly+124; arginin, lysin, tyrosin, tryptofan eller prolin erstatter his+135; aspartinsyre erstatter thr+142; og lysin eller treonin erstatter gln+146.

En spesielt ønsket gruppe mutanter er de hvori metionin-restene ved human-lymf otoksinrestene +20, +120 og +133 er sløyfet eller, fortrinnsvis, erstattet med de tilsvarende rester som finnes i lymfotoksinene til andre arter slik som beskrevet annet steds heri. F.eks. er met+20, +120 og +133 erstattet med treonin, serin og valin, respektivt. Disse er i tilsvarende rester i storfe-lymfotoksin. Erstatningen be-virkes på den måte som er beskrevet i eksempel 9 med unntagelse for at met+133 er mutert til val ved et ytterligere trinn med mutagenese under anvendelse av M13 Mp8 fag ifølge i og for seg kjente metoder. Denne mutante animalske arts-hybridlymfotoksin DNA anvendes istedenfor leucylamino-terminal DNA i eksempel 7, og uttrykkes som en fusjon. Ved å følge kjente metoder anvendes cyanogenbromid for å spalte StII-signalet fra det hybride lymfotoksin, og den modne leucylamino-terminal-lymfotoksinvarianten utvinnes.

Andre nyttige variant-lymfotoksiner er de hvori rester fra tumor-nekrosefaktor erstatter tilsvarende lymfotoksinrester for fremstilling av hybride tumor-nekrosefaktor-lymfotoksin-varianter. Et representativt eksempel er at de første 8, 9 eller 10 restene i utviklet tumor-nekrosefaktor (f.eks. val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-asp-) erstatter de første 27 restene i leucylamino-terminal lymfotoksin. Det er mer sannsynlig at denne variant blir N-terminal-demetiony-lert ved direkte ekspresjon i E. coli.

Mens mutasjonssetet er bestemt på forhånd, er det unødvendig at mutasjonen per se er forutbestemt. For f.eks. å optimali-sere ytelsesevnen til det mutante histidin +89 lymfotoksin, utføres vilkårlig mutagenese ved kodonet for lysin +89 og de uttrykte lymfotoksin-mutantene analyseres med henblikk på optimal kombinasjon av cytotoksisk aktivitet og protease-resistens. Lymfotoksin kan også inneholde innskudd, vanligvis av størrelsesorden på fra ca. 1 til 10 aminosyrerester, eller utelatelser på fra ca. 1 til 30 rester. Substitusjoner, utelatelser, innskudd eller en hvilken som helst annen subkombinasjon kan kombineres for å oppnå en endelig konstruksjon. Innskudd innbefatter amino- eller karboksyl--terminalfusjoner, f.eks. en hydrofob forlengelse tilføyet til karboksyl-terminusen. Imidlertid blir fortrinnsvis kun substitusjonsmutagenese utført. Mutasjonene i den kodende DNA må åpenbart ikke sette sekvensen ut av leseramme og vil fortrinnsvis ikke skape komplementære områder som kunne produsere sekundær mRNA-struktur. Ekstrakter av E. coli transformert med vektorer inneholdende DNA som koder lymfotoksin-mutanter med en utelatelse av de siste 16 karboksy-terminalaminosyrene eller utelatelse av de første ca. 33 amino-terminalrestene i leucylamino-terminalt lymfotoksin, viste ingen cytotoksisk aktivitet. Grunnene for mangel på aktivitet er imidlertid ikke kjent å kunne ha vært enhver av de som er angitt i eksempel 1 infra.

Ikke alle mutasjoner i DNA-materialet som koder for lymfotoksinet, vil bli uttrykt i det endelige produkt av rekombinant cellekultur. F.eks. er en hovedklasse av DNA-sub-stitusjonsmutasjoner de DNA-materialer hvori en forskjellig sekretorisk leder har erstattet den sekretoriske leder representert på fig. 2a, enten ved utelatelser i 34 rest-lederen eller ved substitusjoner, som utveksler det meste av eller hele den native leder med en leder som det er mer sannsynlig vil gjenkjennes av den tilsiktede vert. Ved konstruksjon av en prokaryotisk ekspresjonsvektor blir f.eks. den sekretoriske leder på fig. 2a sløyfet til fordel for den bakterielle alkaliske fosfataseleder eller den varmestabile enterotoksin II-leder, og for gjæren blir fig. 2a lederen substituert til fordel for gjærinvertase-, alfa faktor- eller syrefosfataselederne. Dette skal imidlertid ikke innebære at den humane sekretoriske leder ikke gjenkjennes av andre verter enn humane cellelinjer. Når den sekretoriske lederen er "gjenkjent" av verten, blir fusjonsproteinet som består av lymfotoksin og lederen vanligvis spaltet ved leder-lymfotoksin-peptidbindingen i den samme hendelsen som leder til sekresjon av lymfotoksinet. Således, selv om en mutant-DNA anvendes for å transformere verten, kan det resulterende produkt-lymfotoksin enten være et fusjonert eller nativt lymfotoksin, avhengig av effektiviteten til vertcellen når det gjelder bearbeidelse av fusjonen.

En annen hovedklasse av DNA-mutanter som ikke uttrykkes som lymfotoksin-varianter, er nukleotid-substitusjoner fremstilt for å forbedre ekspresjon, hovedsakelig ved å unngå hårnål-strukturer i det transkriberte mRNA (se US patentsøknad 303.687) eller for å tilveiebringe kodoner som lettere transkriberes av den valgte vert, f.eks.de velkjente E. coli-preferansekodonene for E. coli-ekspresjon.

Den mutante nukleinsyren fremstilles ved i og for seg kjente metoder (A. Hui et al., 1984, "The EMBO Journal" 3(3): 623-629; J. Adelman et al., 1983, "DNA" 2(3): 183-193; britisk patentsøknad 2.130.219A; G. Winter et al., 1982, "Nature" 299: 756-758; og R. Wallace et al., 1981, "Nucleic Acids Research" 9(15): 3647-3656). Disse metoder innbefatter M13 fag-mutagenese, syntese av det mutante lymfotoksin-gen som beskrevet i eksempel 1 et seq. eller andre metoder som er eller vil bli kjent innen teknikken.

Nukleinsyre som koder lymfotoksin, er enhver DNA- eller RNA-sekvens som koder et polypeptid som faller innenfor definisjonen av lymfotoksin heri, enten nukleotidsekvensene derav tilsvarer sekvensene som finnes i naturen eller ikke. I tillegg omfatter foreliggende oppfinnelse nukleinsyre som kan hybridisere under i det minste lave stringensbetingelser til nukleinsyre som koder lymfotoksin, selv om den hybridiserende nukleinsyren ikke koder et protein som ellers tilfredsstiller de definisjonsmessige krav for lymfotoksin. Et eksempel på nevnte ville være en probe som, p.g.a. den korte polypeptidlengden som den koder, er ute av stand til å uttrykke et biologisk aktivt lymfotoksin. Nukleinsyren som koder lymfotoksin eller kan hybridisere dermed, fremstilles ved organisk syntese, i det vesentlige som vist i eksempel 1, eller oppnås fra naturlige kilder ved undersøkelse av genomiske eller cDNA-forråd som vist i eksemplene.

Lymfotoksinet som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles ved en fremgangsmåte som generelt innebærer transformasjonen av en vert med en vektor som har nukleinsyren som koder for det ønskede lymfotoksin. En vektor er et replikerbart DNA-konstruksjonsprodukt. Vektorer anvendes her for å forsterke DNA eller for å uttrykke DNA som koder lymfotoksin. En ekspresjonsvektor er et DNA-konstruksjonsprodukt hvori en DNA-sekvens som koder lymfotoksin, er operativt bundet til en egnet kontrollsekvens som kan bevirke ekspresjonen av lymfotoksin i en egnet vert. Slike kontrollsekvenser innbefatter en transkripsjonal promotor, en eventuell operatorsekvens for å styre transkripsjon, en sekvens som koder egnede mRNA-ribosomale bindingsseter, og sekvenser som styrer terminering av transkripsjon og translasjon.

Vektoren kan være et plasmid, en virus (inkludert fag), eller et integrerbart DNA-fragment (dvs. integrerbart i vertgenomet ved rekombinasjon). Når den først er transformert i en egnet vert, replikerer vektoren og virker uavhengig av vertgenomet, eller kan, i noen tilfeller, integreres inn i selve genomet. I foreliggende sammenheng benyttes betegnelsene "plasmid" og "vektor" noen ganger om hverandre ettersom plasmidet er den mest vanlig benyttede form for vektor for nærværende. Alle andre former for vektorer som tjener en ekvivalent funksjon, og som er eller blir kjent innen teknikken, er imidlertid egnet for bruk heri .

Egnede vektorer vil inneholde replikon og kontrollsekvenser som er avledet fra enheter som er forenlige med den tilsiktede ekspresjonsvert. Transformerte vertceller er celler som har blitt transformert eller transfisert med lymfotoksin-vektorer konstruert ved bruk av rekombinante DNA-teknikker. Transformerte vertceller uttrykker vanligvis lymfotoksin. Det uttrykte lymfotoksin vil bli avsatt intracellulært eller utskilt i enten det periplasmiske rom eller kultur-supernatanten, avhengig av den valgte vertcelle.

DNA-områder er operativt bundet når de er funksjonelt relatert til hverandre. F.eks. er DNA for en presekvens eller sekretorisk leder operativt bundet til DNA for et polypeptid dersom det er uttrykt som et preprotein som deltar i utskillelsen av polypeptidet; en promotor er operativt bundet til en kodende sekvens dersom den styrer transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosom-bindingssete er operativt bundet til en kodende sekvens dersom det er plassert slik at det tillater translasjon. Generelt betyr operativt bundet tilstøtende og, i tilfelle for sekretoriske ledere, tilstøtende og i lesefase.

Egnede vertceller er prokaryoter, gjær eller høyere eukaryotiske celler. Prokaryoter innbefatter gram-negative eller gram-positive organismer, f.eks. E. coli eller Bacilli. Høyere eukaryotiske celler innbefatter etablerte cellelinjer av pattedyropprinnelse som beskrevet nedenfor. En foretrukken vertcelle er den fag-resistente E. coli W3110 (ATCC 27,325) stamme beskrevet i eksemplene, skjønt andre prokaryoter slik E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), E. coli 294 (ATCC 31,446), pseudomonas-arter, eller Serratia Marcesans er egnet.

Prokaryotiske vert-vektorsystemer er foretrukne for ekspresjon av lymfotoksin. En mengde egnede mikrobielle vektorer er tilgjengelig. Generelt vil en mikrobiell vektor inneholde en replikeringsopprinnelse som gjenkjennes av den tilsiktede vert, en promotor som vil fungere i verten og en fenotypt seleksjonsgen, f.eks. et gen som koder proteiner som gir antibiotisk resistens eller som tilfører et auxotroft behov. Lignende konstruksjonsprodukter vil bli fremstilt for andre verter. E. coli blir typisk transformert under anvendelse av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli art (Bolivar, et al., 1977, "Gene" 2: 95). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklinresistens, og tilveiebringer således et enkelt middel for identifikasjon av transformerte celler.

Ekspresjonsvektorer må inneholde en promotor som gjenkjennes av vektorganismen, men kloningsvektorer behøver ikke dette. Promotoren er vanligvis homolog med den tilsiktede vert. Promotorer som mest vanlig benyttes i rekombinant DNA-konstruksjon, innbefatter p<->laktamase (penicillinase)- og laktose-promotorsystemer (Chang et al., 1978, "Nature", 275: 615; og Goeddel et al.,1979, "Nature" 281: 544), et tryptofan (trp) promotorsystem (Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8: 4057 og europeisk publisert patentsøknad 36.776) og tac-promotoren ]Proc. Nat'l. Acad. Sei. U.S.A." 80:21-25 (1983)§. Mens disse er de mest vanlig benyttede, er andre kjente mikrobielle promotorer egnet. Detaljer angående deres nukleotidsekvenser har blitt publisert, hvilket gjør det mulig for en erfaren forsker på operativ måte å ligere dem til DNA-kodende lymfotoksin i plasmidvektorer (Sieben-list et al., 1980, "Cell" 20: 269 ) og det DNA-kodende lymfotoksin. I øyeblikket er den foretrukne vektor et pBR322-derivat inneholdende E. coli alkalisk fosfatase-promotoren med trp Shine-Dalgarno-sekvensen. Promotoren og Shine-Dalgarno-sekvensen er operativt bundet til det DNA-materiale som koder lymfotoksinet, dvs. de er posisjo-nert slik at de fremmer transkripsjon av lymfotoksin mRNA fra DNA-materialet.

I tillegg til prokaryoter blir eukaryotiske mikrober slik som gjærkulturer, transformert med lymfotoksin-kodende vektorer. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, er det mest vanlig benyttede blant lavere eukaryotiske vert-mikroorganismer, skjønt en rekke andre stammer er vanlig tilgjengelig. Gjærvektorer vil vanligvis inneholde en replikasjonsopprinnelse fra 2 pm gjærplasmidet eller en autonomt replikerende sekvens (ARS), en promotor, DNA-kodende lymfotoksin (inkludert spesielt humant pre-lymfotoksin), sekvenser for polyadenylering og transkripsjons-terminering og et seleksjonsgen. Et egnet plasmid for lymfotoksin-ekspresjon i gjær er YRp7, (Stinchcomb et al., 1979, "Nature", 282: 39; Kingsman et al., 1979, "Gene", 7: 141; Tschemper et al., 1980, "Gene", 10: 157). Dette plasmid inneholder allerede trpl-genet som tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant stamme av gjær som mangler evnen til å vokse i tryptofan, f.eks. ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, 1977, "Genetics", 85: 12). Tilstedeværelsen av trpl-lesjonen i gjær-vertcellegenomet tilveiebringer således et effektivt miljø for detektering av transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan.

Egnede promoterende sekvenser i gjærvektorer innbefatter promotorene for metallotionein, 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980, "J. Biol. Chem.", 255: 2073) eller andre glycolytiske enzymer (Hess et al.,1968, "J. Adv. Enzyme Reg." 7: 149; og Holland et al., 1978, "Biochemistry", 17: 4900), slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfo-fruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglycerat-mutase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glucokinase. Egnede vektorer og promotorer for bruk i gjærekspresjon er ytterligere beskrevet i T. Hitzeman et al., EPO-publikasjon nr. 73.657.

Andre promotorer som har den ytterligere fordel av transkripsjon regulert av vekstbetingelser, er promotorområder for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, syrefosfatase, nedbrytende enzymer forbundet med nitrogenmetabolisme og det tidligere nevnte metallotionein og glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, samt enzymer som er ansvarlig for maltose- og galaktose-utnyttelse. Ved konstruksjon av egnede ekspresjons-plasmider blir termineringssekvensene som er forbundet med disse genene, også ligert inn i ekspresjonsvektoren 3' i de lymfotoksin-kodende sekvenser for tilveiebringelse av polyadenylering av mRNÅ og terminering.

I tillegg til mikroorganismer kan også kulturer av celler avledet fra multicellulære organismer benyttes som verter. Dette er imidlertid ikke foretrukket p.g.a. de utmerkede resultater som så langt er oppnådd med lymfotoksin-ekspre-sjonsmikrober. I prinsippet virker enhver høyere eukaryotisk cellekultur, enten fra vertebrat- eller invertebratkultur. Interessen har imidlertid vært størst når det gjelder vertebratceller, og propagering av vertebratceller i kultur (vevskultur) har blitt en rutinemetode i de senere år ]Tissue Culture, Åcademic Press, Kru se and Patterson

(1973)§. Eksempler på nyttige vertcellelinjer er VERO- og HeLa-celler, eggstokk-cellelinjer fra kinesisk hamster (CHO), og WI38, BHK, COS-7 og MDCK-cellelinjer. Ekspresjonsvektorer for slike celler innbefatter vanligvis (om nødven-dig) en replikasjonsforbindelse, en promotor beliggende opp-strøms fra det gen som skal uttrykkes, sammen med et ribosom-bindingssete, RNA-spleisesete (dersom intron-holdig genomisk DNA benyttes), et polyadenyleringssete, og en transkripsjonal termineringssekvens.

De transkripsjonene og translasjonene kontrollsekvensene i ekspresjonsvektorer for anvendelse ved transformasjon av vertebratceller, tilveiebringer ofte virale kilder. F.eks. er vanlig benyttede promotorer avledet fra polyoma, Adenovirus 2, og mest foretrukket Simian Virus 40 (SV 40). Den tidlige og sene promotoren er særlig nyttig fordi begge oppnås lett fra virus som et fragment som også inneholder den virale SV 40-replikasjonsopprinnelsen (Fiers et al.,1978, "Nature", 273: 113). Mindre eller større SV 40--fragmenter kan også benyttes, forutsatt at den omtrentlige 250 bp-sekvensensom rager fra Hindlll-setet mot Bgll-setet som befinner seg i den virale replikasjonsopprinnelsen, er inkludert. Videre er det også mulig, og ofte ønskelig, å benytte den humane genomiske promotor, kontroll- og/eller signal sekvensene som normalt er forbundet med lymfotoksin, forutsatt at slike kontrollsekvenser er kompatible med vertcellesystemene.

En replikasjonsopprinnelse kan tilveiebringes enten ved konstruksjon av vektoren, slik at den inneholder en eksogen opprinnelse, slik det kan avledes fra SV-40 eller en annen viral (f.eks. Polyoma, Adenovirus, VSV, eller BPV) kilde, eller kan tilveiebringes av vertcellens kromosomale re-plikas j onsmekanisme . Dersom vektoren er integrert i vert-cellekromosomet, er det sistnevnte ofte tilstrekkelig. Lymfotoksin fremstilles uten en amino-terminal metionyl ved transformasjon av høyere eukaryotceller med det humane pre-lymfotoksin DNA.

Ved valg av en foretrukken pattedyr-vertcelle for transfeksjon med vektorer som omfatter DNA-sekvenser som koder både lymfotoksin og dihydrofolatreduktase (DHFR), er det hen-siktsmessig å velge verten i overensstemmelse med den type DHFR-protein som benyttes. Dersom villtype-DHFR-protein benyttes, er det foretrukket å velge en vertcelle som mangler DHFR, hvilket således tillater bruk av den DHFR-kodende sekvens som en markør for vellykket transfeksjon i selektivt medium som mangler hypoxantin, glycin og tymidin. En passende vertcelle i dette tilfelle er eggstokkcelle-linjen fra kinesisk hamster (CHO) som er mangelfull med henblikk på DHFR-aktivitet, fremstilt og propagert som beskrevet av Urlaub og Chasin, 1980, "Proe. Nati. Acad. Sei." (USA) 77: 4216.

På den annen side, dersom DNA-kodende DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for metotrexat (MTX) anvendes som regule-rende sekvens, er det ikke nødvendig å benytte DHFR-resistente celler. P.g.a. at det mutante DHFR er resistent overfor MTX, kan MTX-holdige media benyttes som et middel for seleksjon forutsatt at vertcellene i seg selv er MTX-sensitive. De fleste eukaryotceller som kan absorbere MTX, viser seg å være metotrexat-sensitive. En slik nyttig cellelinje er en CHO-linje, CH0-K1 (ATCC nr. CCL 61).

Transformerte vertceller er celler som har blitt transformert eller transfisert med lymfotoksin-vektorer konstruert ved bruk av rekombinante DNA-teknikker. Transformerte vertceller uttrykker vanligvis lymfotoksin. Det uttrykte lymfotoksin blir vanligvis avsatt intracellulært.

Lymfotoksin utvinnes fra rekombinant kultur i ikke-utskillende celler ved lysering av cellene og fjerning av partikkelformig materiale ved sentrifugering eller lignende. Lymfotoksin-utskillende celler separeres fra kultur-supernatanten ved sentrifugering. Den kontaminerte lymfotoksi-noppløsning renses deretter ved hjelp av fremgangsmåter som det er vist til ovenfor eller ved immunoaffinitet som beskrevet i eksempel 4 nedenfor. Lymfotoksinet renses til nivåer egnet for farmakologisk anvendelse, og anbringes i konvensjonelle doseringsformer, f.eks. ampuller eller sprøyter. Blandinger av lymfotoksinvarianter anvendes, f.eks. et forråd av cytotoksiske mutante lymfotoksinarter. Lymfotoksin blir optimalt lyofilisert for langtidslagring, eller kan anbringes i en vandig oppløsning med stabilisatorer og eksipienser, f.eks. isotonisk saltoppløsning, og administreres til pasienter som beskrevet av B. Aggarwal et al., europeisk patentsøknad 100641.

Lymfotoksin-preparater administreres til dyr med tumorer. Administrasjonsveien er i overensstemmelse med kjente metoder, f.eks. intravenøs, intraperitoneal, subkutan, intramuskulær, intralesjonal infusjon eller injeksjon av sterile lymfotoksinoppløsninger, eller ved tidsregulerte frigjøringssystemer som beskrevet nedenfor.

Lymfotoksin administreres intralesjonalt, dvs. ved direkte injeksjon i faste tumorer. I tilfelle for spredte tumorer slik som leukemi, er administrasjonen fortrinnsvis intrave-nøs eller inn i det lymfatiske system. Tumorer i underlivs-organen, slik som eggstokk-kreft, blir med fordel behandlet ved intraperitoneal infusjon ved bruk av peritonealt dialyse-utstyr og peritoneum-kompatible oppløsninger. Vanligvis blir imidlertid lymfotoksin administrert kontinuerlig ved infusjon, skjønt bolusinjeksjon er akseptabelt.

Lymfotoksin blir helst administrert fra en implanterbar anordning med tidsregulert frigjøring. Eksempler på egnede systemer forproteiner som har molekylvekten til lymfotoksin--dimerer eller -trimerer, innbefatter kopolymerer av L-glutaminsyre og gamma-etyl-L-glutamat (U- Sidman et al., 1983, "Biopolymers" 22 (1): 547-556), poly(2-hydroksyetyl-metakrylat) (R. Langer, 1982, "Chem. Tech." 12: 98-105) eller etylenvinylacetat (R. Langer et al., Id.). Lymfo-toksinholdige partikler implanteres ved kirurgiske steder hvorfra tumorer har blitt utskåret. Alternativt blir lymfotoksin innkapslet i semipermeable mikrokapsler eller liposomer for injeksjon i tumorer. Denne administrashjonsmåte er særlig nyttig for kirurgisk ikke-fjernbare tumorer, f.eks. hjernetumorer.

Mengden av lymfotoksin som administreres, vil avhenge f.eks. av administrasjonsveien, den angjeldende tumor og pasientens tilstand. Det vil være nødvendig for terapeuten å titer-behandle dosen og modifisere administrasjonsveien etter behov for å oppnå optimal cytotoksisk aktivitet mot mål-tumoren, slik dette kan bestemmes f.eks. ved biopsi av tumoren eller diagnostisk analyse for antatte kreftmarkører slik som karsinoembryonisk antigen, i betraktning av eventuell rekombinant toksisitet som møtes ved forhøyet dose. Vanligvis er det funnet at doser av rekombinantlymfotoksin i mus ved fra ca. 50 til 200 pg/kg legemsvekt/dag ved intravenøs administrasjon, er vesentlig ikke-toksisk og effektivt in vivo. Doseringskuren vil naturligvis variere for forskjellige dyr.

Det er i foreliggende sammenheng tilveiebragt en fremgangsmåte for oppnåelse av lymfotoksin-nøytraliserende antistoff. Nøytraliserende antistoff er definert som antistoff som immunologisk kan binde lymfotoksin som definert heri på en slik måte at man vesentlig reduserer dets aktivitet i cytostatiske eller cytolytiske lymfotoksin-aktivitetsanaly-ser slik som L929-analysen i mus beskrevet nedenfor. Det faktum at antistoffet kan nøytralisere lymfotoksinaktivitet, betyr ikke at antistoffet må binde direkte til det lymfotoksin-aktive- eller reseptor-bindingssete. Antistoffet kan fremdeles vesentlig nøytralisere lymfotoksinaktivitet dersom det sterisk binder til et område som er beliggende tilstø-tende til det kritiske sete, dvs. tilstøtende i betydningen konformasjonsmessig tilstøtende, og ikke nødvendigvis tilstøtende med henblikk på aminosyresekvensen.

I forsøk på å fremstille et nøytraliserende monoklonalt antistoff mot lymfotoksin, viste det seg å være vanskelig å immunisere mus på en slik måte at lymfotoksin-nøytrali-serende antistoff utvikles eller oppstår i dyrene. Hverken immunisering med lymfoblastoid-lymfotoksin eller glutaraldehyd-kryssbundet lymfotoksin resulterte i noe detekterbart nøytraliserende antistoff i serumet fra immunisert mus, selv om musene fremkalte ikke-nøytraliserende anti-lymfotoksin-antistoff som kunne detekteres ved enzym-immuno-analyse. Immunisering med et lymfotoksin-alun (aluminiumhydroksyd eller aluminiumoksyd, AI2O3.3H2O)-adsorpsjons-kompleks vil imidlertid fremkalle nøytraliserende antistoff selv i dyr som ikke utviklet aktiviteten forut for immunisering med alunkomplekset. Fremstilling av alun og dets anvendelse ved fremstilling av antiserum er beskrevet i C. Williams, et al., eds.,1967, Methods in Immunology and Immunochemistry I", side 197-229.

Fusjoner av miltceller fra dyr som produserer nøytralise-rende antistoff med muse-myolomaceller, foretas. I gjennomsnitt vil ca. 50-100 kloner måtte undersøkes for å identifisere en som syntetiserer nøytraliserende antistoff. Under-søkelsen eller screeningen av klonene med henblikk på ønsket aktivitet er rutine, og velkjent for en fagmann, og kan lett reproduseres eksperimentelt.

Serum-, plasma- eller IgG-fraksjonene fra det immuniserte dyr, samt immunoglobiner utskilt av hybridoma utviklet fra milten eller lymfecelle hos immuniserte dyr, er alle tilfresstillende for bruk heri. I en foretrukken utførelse oppnås det nøytraliserende antistoffet vesentlig fritt for annet anti-lymfotoksin-antistoff i hybridomkultur.

Det nøytraliserende antistoffet immobiliseres ved adsorpsjon til overflater, f.eks. termoplaster slik som polystyren, eller bindes kovalent til matriser slik som cyanogenbromid— aktivert cefarose. Det anvendes deretter i immunoanalyser eller i immunoaffinitetsrensing. Siden antistoffet er et nøytraliserende antistoff, er det mest sannsynlig at det bare adsorberer eller detekterer biologisk aktivt lymfotoksin eller fragmenter derav. Antistoffet er særlig nyttig i immunoradiometriske ("sandwich") immunoanalyser sammen med et ikke-nøytraliserende anti-lymfotoksin monoklonalt antistoff eller et polyklonalt antiserum som inneholder ikke-nøytraliserende anti-lymfotoksin. Immunoanalysen utføres ved bruk enten av det nøytraliserende eller ikke--nøytraliserende antistoffet som den merkede komponenten, hvilken merking er effektiv med et detekterbart stoff slik som en fluorescerende, kjemiluminiserende eller radioisotopisk merking i overensstemmelse med metoder som er kjent innen teknikken. For lymfotoksin-immunoanalyser av den konkurrerende typen, blir lymfotoksin merket på samme måte. Kloramin-T-radioiodering er egnet for både lymfotoksin- og lymfotoksin-antistoff-sporpreparering, eller metoden beskrevet i J. Klostergaard et al., "Mol. Immun." 18: 455

(1980) anvendes.

For å forenkle eksemplene vil visse metoder som ofte fore-kommer, bli referert til på kortfattet måte.

Plasmider er betegnet med en liten p med forutgående og/eller etterfølgende store bokstaver og/eller tall. Utgangsplasmide-ne heri er kommersielt tilgjengelige, er ålment tilgjengelige på en ubegrenset basis, eller kan oppnås fra slike tilgjengelige plasmider i overensstemmelse med publiserte metoder. I tillegg er andre ekvivalente plasmider kjent innen teknikken, og vil være innlysende for en fagmann.

"Nedbrytning" av DNA refererer til katalytisk spalting av DNA-materialet med et enzym som virker bare ved bestemte steder i DNA-materialet. Slike enzymer betegnes restriksjonsenzymer, og setene for hvilke hvert er spesifikt, kalles et restriksjonssete. "Partiell" nedbrytning refererer til ufullstendig nedbrytning med et restrlksjonsenzym, dvs. det velges betingelser som resulterer i spalting av noen, men ikke alle setene for en gitt restriksjonsendonuklease i et DNA-substrat. De forskjellige restriksjonsenzymene som her benyttes, er kommersielt tilgjengelige, og deres reaksjons-betingelser, kofaktorer og andre behov som tilkjennegjort av enzymleverandørene, benyttes. Restriksjonsenzymer blir vanligvis betegnet med forkortelser bestående av en stor bokstav fulgt av andre bokstaver og deretter, vanligvis, et tall som representerer mikroorganismen fra hvilken hvert restriksjonsenzym opprinnelig ble oppnådd. Generelt benyttes ca. 1 jjg plasmid eller DNA-fragment med ca. en enhet enzym i ca. 20 jjI bufferoppløsning. Passende buffere og substrat-mengder for spesielle restriksjonsenzymer er spesifisert av produsenten. Inkuberingstider på ca. 1 time ved 37°C blir vanligvis benyttet, men kan variere i overensstemmelse med leverandørens instruksjoner. Etter inkubering fjernes protein ved ekstraksjon ved fenol og kloroform, og den nedbrutte nukleinsyren utvinnes fra den vandige fraksjonen ved utfelling med etanol. Nedbrytning med et restriksjonsenzym etterfølges sjelden av bakteriell alkalisk fosfatase--

hydrolyse av de terminale 5'-fosfatene for å hindre de to restriksjonsspaltede endene i et DNA-fragment i å "sirkula-risere" eller danne en lukket sløyfe som ville hindre innføring av et annet DNA-fragment ved restriksjonssetet. Med mindre annet er angitt, blir nedbrytning av plasmider ikke fulgt av 5'-terminal-defosforylering. Metoder og reagenser for defosforylering er konvensjonelle (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, side 133-134".

""Utvinning" eller "isolering" av et gitt fragment av DNA fra et restriksjonsnedbrytningsprodukt betyr separering av nedbrytningsproduktet ved polyakrylamidgel-elektroforese, identifikasjon av fragmentet av interesse ved sammenligning av dets mobilitet mot den til markør-DNA-fragmenter av kjent molekylvekt, fjerning av gelseksjonen inneholdende det ønskede fragment, og separering av gelen fra DNA. Denne metode er vanlig kjent. Se f.eks. R. Lawn et al., 1981, "Nucleic Acids Res." 9:6103-6114, og D- Goeddel et al.,1980, "Nucleic Acids Res." 8:4057.

"Southern-analyse" er en metode ved hjelp av hvilken tilstedeværelse av DNA-sekvenser i et nedbrytningsprodukt eller DNA-holdig sammensetning beskreftes ved hybridisering til et kjent, merket oligonukleotid- eller DNA-fragment. For foreliggende formål skal, med mindre annet er angitt, Southern-analyse bety separering av nedbrytningsprodukter på 1% agarose, denaturering og overføring til nitrocellulose ifølge metoden til E. Southern, 1975, "J. Mol. Biol." 98: 503-517, og hybridisering som beskrevet av T. Maniatis et al., 1978, "Cell" 15: 687-701.

"Transformasjon" betyr innføring av DNA i en organisme slik at DNA-materiale er replikerbart enten som et ekstra kromosomalt element eller kromosomal integrant. Med mindre annet er angitt, er metoden som benyttes i foreliggende sammenheng for transformasjon av E. coli CaClg-metoden ifølge Mandel et al.,1970, "J. Mol. Biol." 53:154.

"Ligering" refererer til prosessen for dannelse av fosfo-diester-bindinger mellom to dobbeltkjedede nukelinsyre-fragmenter (T. Maniatis et al.,Id., side 146). Med mindre annet er angitt, kan ligering oppnås ved bruk av kjente buffere og betingelser med 10 enheter T4 DNA-ligase ("ligase") pr. 0,5 jjg av omtrent ekvimolare mengder av DNA-fragmentene som skal ligeres.

"Fremstilling" av DNA fra transformanter betyr isolering av plasmid-DNA fra mikrobiell kultur. Med mindre annet er angitt, kan alkalisk/SDS-metoden ifølge Maniatis et al., Id., p. 90, anvendes.

"Oligonukleotider" er korte, enkelt- eller dobbeltkjedede polydeoksynukleotider som kjemisk syntiseres ved metoden som det er referert til i eksempel 1, og deretter renset på polyakrylamidgeler.

Eksempel 1

Rensing og sekvensering av lymfotoksin

Den humane lymfoblastoidcellelinjen RPMI-1788 (ATCC nr. CCL-156) ble dyrket i 15 liters spinnerkolber til en celle-densitet på 4xl0<5> celler pr. ml under anvendelse av et serumfritt kulturmedium (RPMI-1640). Lymfotoksin ble indusert 10-20 ganger (til 500-1000 lymfotoksinenheter/ml, bestemt som beskrevet nedenfor) over basalnivåer ved innbefatning av 20 mg/ml forbolmyristatacetat i serumfritt RPMI-1640-medium. Etter 65 timers dyrkning ble cellene høstet ved filtrering og lymfotoksinaktiviteten i filtratet ble absorbert til kontrollerte poreglasskuler (Elektronucleonics) i en kolonne (5 cm x 20 cm), ekvilibrert med 5 mM fosfatbuffer (pH 7,4) og eluert med 50% etylenglycol i 5 mM fosfatbuffer (pH 7,4). 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), en proteaseinhibitor og 1 mM natriumazid, for inhibering av mikrobiell vekst, ble inkubert i alle buffere gjennom hele rensingen. Eluatet fra glasskuler inneholdt 84.000 enheter lymfotoksin/mg protein. Dette ble fulgt av DEAE-cellulosekromatografi, lentin-lecitinsefarosekromatografi, og preparativ nativ PAGE som beskrevet i B. Aggarwal, et al., 1984, "J. Biol. Chem." 259(1): 686-691. Homogenitet til proteinet ansvarlig for cytotoksisk aktivitet ble bestemt ved SDS-PAGE, revers-fase HPLC på en Lichrosorp RP-18-kolonne og aminoterminal-sekvensering.

Dette lymfotoksinpreparat inneholdt mer enn 95 vekt-% av det leucilamino-terminale lymfotoksin med en omtrentlig molekylvekt på 25.000 på SDS-PAGE. Den teoretiske molekylvekten til proteinkomponenten i N-terminal-leucylenhetene er 18.664 dalton; de gjenværende omkring 6.500 dalton ble tillagt en glykocylsidekjede ved Asn+62, og muligens andre 0-bundede sukkerrester. Vevskultur-supernatanten inneholdt antatte multimerer av denne enhet (60.000 Da ved TSK-HPLC eller 64.000 Da ved Sephadex G-100 kromatografi).

De gjenværende 5% av lymfotoksinblandingen var N-terminal histidylenheten med en molekylvekt på ca 20.000. Begge enheter viser vesentlig den samme cytolytiske aktivitet, i det minste innen grensene for den variasjon som er egenartet for lyse-analysen av muse-fibroblastceller som beskrevet ovenfor.

Tryptisk nedbrytning av de intakte lymfotoksinmolekylene ga bare noen fragmenter. Histidylamino-terminalt lymfotoksin ble nedbrutt i to fragmenter mellom aminosyreposisjoner 89 og 90, mens den leukocylamino-terminale tryptiske nedbrytning ga fire fragmenter spaltet mellom posisjoner 15 og 16, 19 og 20, og 89 og 90.

Mikro-sekvensering ifølge Edman-nedbrytningsteknikken ga sekvensinformasjon om det intakte molekylet og også om fragmentene dannet ved tryptisk spalting.

Ytterligere sekvensinformasjon ble oppnådd fra fragmenter av lymfotoksin produsert ved karboksypeptidase P- og kymo-trypsin-nedbrytning, eddiksyrenedbrytning og cyanogenbromid-spalting. Nesten hele sekvensen i det humane lymfotoksin ble bestemt ved denne metoden. 156 tilstøtende rester ble bestemt fra aminoterminusen. Fra denne sekvenseringsinforma-sjonen var det klart at forskjellen mellom de to lymfo-toksinenhetene var tilstedeværelsen av 23 amino-terminal-rester i leukocylamino-terminalenheten som ikke ble funnet i histidylamino-terminalenheten. Karboksyl-terminalsekvensen utenfor de første tre restene viste seg å være vanskelig å bestemme p.g.a. visse peptidbindinger som er til stede i dette området og restenes hydrofobe natur.

Det ble konstruert et syntetisk gen som kunne kode for proteinsekvensen i den grad dette kunne bestemmes ved mikro-sekvensering. Genkonstruksjonen innbefattet en generell E. coli kodon-bias, dvs., sjelden benyttede E. coli kodoner ble ikke benyttet i sekvensen. Humane preferansekodoner ble substituert der ingen E. coli kodon-bias var tydelig. Denne bias ble valgt for å hjelpe ekspresjon i E. coli, og også slik at det syntetiske gen ville være nyttig som en probe for å identifisere den naturlige DNA-sekvensen fra humane cDNA- eller genomiske forråd. De unike restriksjonssetene Xbal, BamHI, Hindlll og Bglll ble anordnet i sekvensen for å hjelpe konstruksjonen av fragmentene og for å tillate fremtidig manipulasjon av genet.

De 58 opprinnelige oligomerene konstruert for det syntetiske lymfotoksin-genet, ble syntetisert ved fast fase-fosfitt-metoden ifølge M. Matteucci et al., 1981, "J. Amer. Chem. Soc." 103: 3185-3190 og S. Beaucage et al., 1981, "Tet. Letters"22: 1859-1862. Størrelsen på disse oligomerene varierte fra 16 baser til 20 baser, og er vist på fig. la. Overlappinger mellom oligomerer var 6 baser i lengde og formet til å være unikt. Hele genet ble sammensatt som vist på fig. lb.

Genet ble konstruert i tre separate deler eller stykker. Det første, segment A, var 117 basepar i lengde, og representerte 5'-kodingsområdet for amino-terminalenden av leucylamino--terminalenheten. Segment B representerte DNA-materialet som koder midten av lymfotoksinmolekylet og hadde en lengde på 145 basepar. Segment C, ved en lengde på 217 basepar, ble antatt å kode alle, unntatt 16 aminosyrerester ved lymfotoksin-karboksyterminusen. Oligomerene som skulle til for å syntetisere hvert av segmentene, ble renset ved elektroforese, og deretter oppsamlet. Den relativt lille størrelsen av hver oligomer (dvs. 16-20 baser) ble valgt for å redusere feil i syntesen.

Hver gruppe av oligomerer ble fosforylert i en reaksjon inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP, og 15 enheter av T4 polynukleotid-kinase i et volum på 50 ul; omkring 50 pmol av hver oligomer befant seg i reaksjonen. Etter 30 min. ved 37°C ble reaksjonsblandingen oppvarmet til 65°C for å ødelegge kinaseaktivitet, og fikk deretter langsomt avkjøles til 20°C over en tidsperiode på 1 time. De fosforylerte oligomerene ble deretter ligert ved tilsetning av 10 enheter T4 DNA-ligase, og reaksjonen fikk forløpe i 2 timer ved 20°C. DNA-ligasen ble varmeinaktivert, og deretter ble de ligerte oligomerene behandlet i 3 timer ved 37°C med retriksjons-endonukleaser som gjenkjente de konstruerte terminalsetene (f.eks. Xbal og BamHI for segment A). Fragmenter for hvert segment ble isolert ved elektroforese på en 7% polyakrylamidgel. Fragmenter av den korrekte mobiliteten ble identifisert for hvert segment ved hjelp av etidiumbromid-flekkdannelse og elektroeluert fra gelen. pFIFtrp69 (D. Goeddel et al.,1980, "Nature" 287: 411-416 eller Crea et al., europeisk patentsø-knad 0048970) ble nedbrutt med Xbal og BamHI, og det store vektorfragmentet isolert ved hjelp av b% polyakrylamid-gelelektroforese. Omkring 50 ng av segment A ble ligert til pFIFtrp69-fragmentet. Likeledes ble segment B ligert i BamHI og Hindlll nedbrutt pBR322, og segment C ble ligert inn i Hindlll og Bglll nedbrutt pLeIFA-125-1 (D. Goeddel et al., 1980, "Nuc. Acids Res." 8: 4057-4073). Ligeringsreaksjons-blandingene ble transformert inn i E. coli ATCC 31446, og de resulterende rekombinante plasmidene ble kjennetegnet ved restriksjonsendonukleasenalyse og DNA-sekvensering ved den kjemiske nedbrytningsmetoden ifølge Maxam og Gilbert. Fem av seks segment A-kloner inneholdt den planlagte eller konstruerte sekvensen. Fire segment B- og fire segment C-plasmider ble isolert, og alle disse innskuddene hadde korrekte sekvenser. Hvert segment ble isolert ved nedbrytning med restriksjonsendonukleaser som gjenkjente terminalsetene og deretter ligert inn i plasmidvektoren pFIFtrp69 nedbrutt med Xbal og Bglll. Det resulterende rekombinantplasmidet, pLTXBl ble kjennetegnet ved sekvensering av det innskutte Xbal-I-Bglll-fragmentet, som inneholdt sekvensen vist på fig. la.

For å bestemme om det syntetiske gen virkelig ville produsere biologisk aktivt lymfotoksin, ble E. coli pLTXBl-transformantene dyrket i minimale media under betingelser for oppheve undertrykkelsen av trp-promotoren, og tillate ekspresjon av det syntetiske lymfotoksingenet. Kulturer ble dyrket til en optisk densitet på 1,0 ved 550 nanometer og høstet ved sentrifugering. Cellepelleten ble suspendert i 1/10 volum, og deretter lysert ved sonikering.

Lymfotoksinaktivitet ble bestemt ved hjelp av den modifiserte celle-lytiske analysen ifølge B. Spofford, 1974, "J. Immunol." 112: 2111. Kort fortalt ble L-929 muse-fibroblastceller dyrket i mikrotiterplater i nærvær av actinomycin D. Etter 12-18 timer ble 0,125 ml av seriefortynnet prøve for analyse med henblikk på lymfotoksin, tilsatt til hver brønn. Etter 18 timer ble platene vasket, og lyseringen av cellene indusert av lymfotoksin ble detektert som adherende til platene ved farging av platene med en 1% oppløsning av krystallfiolett i metanolrvann (1:4 v/v). Fargeflekkintensi-teten ble observert både visuelt og spektrofotometrisk ved absorbans på 450 nm og 570 nm transmisjon ved bruk av et Dynatech-spektrofotometer. Cellene utstrøket i en mikroti-terbrønn med kulturmedium alene, ble satt ved 0% lysering, mens de med 3M guanidinhydrokloridoppløsning ga et endepunkt for 100% lysering. En enhet lymfotoksin er definert som den mengde som skal til for 50% cellelysering av 12.000 celler utstrøket i hver brønn. Det bemerkes at andre analyser av cytotoksisk aktivitet også kan anvendes. Se f.eks. B. Aggar-walet al. i "Thymic Hormones and Lymphokines", 1983, ed. A. Goldstein, Spring Symposium on Healt Sciences, George Washington University Medical Center (A549-cellelinjen referert til i dette materiale er tilgjengelig fra ATCC som CCL185). Kultur-lysater viste udetekterbar cytolytisk aktivitet i musecelleanalysen beskrevet ovenfor. Kontroll--lysater fra gammainterferon-uttrykkende kulturer inneholdt ikke gammainterferon-aktivitet. Dette resultat foreslo at det syntetiske gen ikke kodet et aktivt lymfotoksin. Det var flere mulige forklaringer på dette. F.eks.:(l) E. coli ga nedbrytning av lymfotoksinet, (2) lymfotoksingenet ble ikke transkribert i E. coli, (3) lymfotoksin-meddelelsen ble ikke translatert i E. coli, (4) proteinet hadde ikke den riktige sekvensen p.g.a. en protein-sekvenseringsfeil, eller (5) 16 rest-karboksyterminalsekvensen eller en del derav var faktisk nødvendig for aktivitet eller for riktig konfigurasjon av lymfotoksinmolekylet.

Eksempel 2

Fremgangsmåte for oppnåelse av cDNAsom koder lymfotoksin

RNA ble isolert fra en kultur av en ikke-adherende celle-fraksjon av humane, perifere blodlymfocytter (48 timer etter induksjon med forbolmyristatacetat (10 ng/ml), stafylokok-kisk enterotoksin B (1 jjg/ml) og tymosin a-1 (S. Berger et al., 1979, "Biochemistry" 18:5143-5149). Denne kultur produserte 4000 enheter lymfotoksinaktivitet/ml supernatant. mRNA ble konsentrert ved adsorpsjon til immobilisert oligo-dT, eluert og cDNA fremstilt ved revers-transkripsjon (P. gray et al., 1982, "Nature" 295: 503-508). Revers-transkriptase ble benyttet for oppnåelse av en cDNA-kopi av mRNA ved hjelp av standard metoder, en annen kjede ble fremstilt (også ved hjelp av standard metoder) ved Klenow-behandling, og cDNA-materialet ble behandlet med S-l nuklease for å fjerne hårnål-sløyfen. For å innføre i dette cDNA i en vektor ble endene ligert til en adaptor eller binder ("linker") for derved å skape 5'- og 3'-restriksjonsenzym-seter eller, fortrinnsvis, kohesive termini for et forutbestemt restriksjonsenzymsete. Oligonukleotidet

5' HO-AATTCATGCGTTCTTACAG

GTACGCAAGAATGTC-P 5'

ble benyttet for dette formål. Oligonukleotidet ble ligert til cDNA-materialet, og cDNA-materialet ble reisolert ved hjelp av polyakrylamidgel-elektroforese. XgtlO, en ålment tilgjengelig fag (eller dens vesentlige ekvivalent, Xgtll, som er tilgjengelig fra ATCC), ble nedbrutt med EcoRI, og det lineære fragmentet utvunnet (M. Wickens et al., 1978, "J. Biol. Chem." 253: 2483-2495). Det bundede revers— transkripet og XgtlO-nedbrytningsproduktet ble ligert og ligeringsblandingen benyttet for å transfisere E. coli C-600 eller en annen kjent vert mottagelig for \-faginfeksjon. Omkring 10.000 rekombinantfag ble plettert på en 15 cm plate, og underkastet screeing ved hjelp av en lavstringens--plaquehybridiseringsmetode ( T. Maniatis et al., 1978, "Cell" 15:687-701 og P. Gray et al. "PNAS" 80: 5842-5846) ved bruk av en 3<2>p<->merket probe fremstilt fra segment A på fig. la ved metoden ifølge J. Taylor et al., 1976, "Biochem. Biophys. Acta" 442:324-330, hvori kalvebrissel-DNA-primere ble benyttet (PL Biochemicals). Duplikat-nitrocellulose-filtere ble hybridisert ved lavstringensmetoden med 5xl0<7 >cpm av proben i 20% formamid. Filterne ble vasket to ganger

i 0,3 M natriumklorid, 0,03 M natriumcitrat og 0,1% natrium-dodecylsulfonat (SDS) ved 37°C.

To fag hybridiserte med proben og ble plaque-renset. Den rensede fag hybridiserte med både segment A-proben og en probe fremstilt fra segment B. cDNA-innskuddene i de to hybridiserende fag, XLT1 og XLT2, ble subklonet inn i M13mp8 og sekvensert ifølge dideoksy-kjedetermineringsmetoden (A. Smith, 1980, "Methods in Enzymology" 65:560-580). Innskuddet i XLT2 var bare ca. 600 bp og inneholdt ikke hele 3'-kodingsområdet for lymfotoksin. Innskuddet i XLT1 inneholdt hele kodingsområdet for leucylamino-terminalt lymfotoksin + et 650 bp 3'-utranslatert område (inneholdende et konsensus polyadenyleringssignal) og kodoner for 18 aminosyrers aminoterminal til leucylterminusen. Siden dette ikke utgjør hele det lymfotoksin-kodende området, ble en ytterligere ^ V- mer^ et probe fremstilt fra cDNA-innskuddet i XLT1 og benyttet for screening av en ytterligere 25.000 rekombinant XgtlO fag ved høy stringens (se T. Hyunh et al., 1984, Practical Approaches in Biochemistry IRL Press, Oxford). Tolv ytterligere hybridiserende fag ble isolert, og sekvensen for det lengste innskuddet, fra XLT11, er gitt på fig. 2a. Den lengste åpne leserammen ble translatert ved å starte ved den første observerte ATG. Tall over hver linje refererer til aminosyreposisjon, og tall under hver linje refererer til nukleotid-posisjon. Leucylresten merket "1" representerer den første sekvenserte resten i leucylamino-terminalt lymfotoksin (fig. la), og er antageligvis den første amino-terminalresten i den ferdige arten av lymfotoksin. De første 34 restene representerer en signalsekvens. Restene 156-171 hadde ikke kunnet bestemmes ved protein-sekvensering av lymfotoksin, men skrev seg i stedet fra nukleotidsekvensen.

Eksempel 3

Konstruks. i on av en hybridsyntetisk gen/ naturlig cDNA--ekspres. ionsvektor for leucylamino- terminalt lymfotoksin

Denne konstruksjon er vist på fig. 2b. pLTXBl (inneholdende det inaktive syntetiske gen) ble delvis nedbrutt med EcoRI og Pstl , og et 685 bp fragment inneholdende DNA som koder 125 N-terminale rester i lymfotoksin ble utvunnet. En partiell Pstl-nedbrytning ble foretatt p.g.a. tilstedeværelsen av et ytterligere Pstl-sete ved rest 10 (fig- la). Et 301 bp-fragment inneholdende DNA som koder de C-terminale 51 mino-syrene i lymfotoksin, ble isolert ved nedbrytning av det subklonede cDNA-materialet i XLT1 med EcoRI og Pstl (disse seter er vist ovenfor på fig. 2a ved nukleotidposisjoner 554 og 855). Disse fragmentene ble isolert ved elektroforese på 5% polyakrylamid og elektroeluering. Fragmentene ble ligert inn i pBR322 som hadde blitt nedbrutt med EcoRI og de-fosforylert med bakteriell alkalisk fosfatase for å redusere bakgrunns-transformanter.

Det resulterende ekspresjonsplasmid, pLTtrpl, ble karakterisert med henblikk på riktig orientering og sekvens ved restriksjonsendonuklease-nedbrytning og DNA-sekvensering. Leucylamino-terminalt lymfotoksin ble uttrykt ved trans-formering av E. coli 31446 med pLTtrpl og dyrking av transformantene i medium minneholdende tetracyklin ved 37°C i 4-6 timer inntil en OD.-verdi på 1,0 ble nådd. Celle-lysatene inneholdt cytotoksisk aktivitet. Leucylamino-terminusen i den uttrykte lymfotoksin-enheten ble funnet å være substituert med en blokkert metionylrest. Det antas at produktet av denne syntesen er formylmetionyl- snarere enn metionylarten.

Eksempel 4

Immunoaffinitetsrensing av lymfotoksin

En monoklonal cellelinje fra mus som utskiller anti-lymfotoksin (eksempel 8) ble dyrket i mus og renset fra ascites-væske ved ioneutvekslingskromatografi. Anionutvekslings-eluatet ble koblet til cyanogenbromid-aktivert sefarose ved en konsentrasjon på 2 mg/ml harpiks. En 20 ml kolonne ble ekvilibrert fortløpende med TBS (inneholde 0,05 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,15 M natriumklorid, og 2 mM EDTA); deretter med elueringsbuffer (inneholdende 0,1 M eddiksyre, pH 4,5 natriumklorid); og sluttlig med TBS. Et 40% mettet ammonium-sulfatbunnfall av pLTtrpl-transformert E. coli sonikert lysat (på forhånd klaret ved sentrifugering) ble suspendert i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, og 5 mM EDTA og anbragt på kolonnen med en hastighet på et kolonnevolum pr. time. Etter omfattende vasking med TBS inneholdende 0,05% Tween-20 ble spesifikt bundet materiale eluert med elueringsbufferen, pH-verdien ble umiddelbart justert til 7,8 med 0.,1 volum IM Tris-HCl, pH 8,5, og lagret ved 4°C. Den spesifikke aktiviteten til dette rensede lymfotoksin var 2-10xl0<7> enheter/mg som målt i ovenstående L-929 museanalyse.

Eluatet inneholdt mesteparten av aktiviteten anbragt på kolonnen. Størsteparten av det totale eluatprotein migrerte som et enkelt bånd under både reduserende og ikke-reduserende betingelser i SDS-polyakrylamidgel-elektroforese. Mobiliteten til dette bånd tilsvarer omkring 18.000 MW, hvilket er i overensstemmelse med den forutsagte verdi på 18.664 MW for uglykosylert leucylamino-terminalt lymfotoksin basert på den deduserte aminosyresekvens. For ytterligere å karakterisere dets biologiske aktiviteter ble det rensede rekombinate lymfotoksin testet med henblikk på cytolytisk aktivitet in vitro og antitumoraktivitet in vivo.

Eksempel 5

In vivo biologisk aktivitet for rekombinantlymfotoksin

Rekombinant og lymfoblastoid lymfotoksin ble testet i en in vivo tumor-nekroseanalyse. MrthA(a) sarkom ble dyrket i 7-10 dager i mottagelige mus ]BALB/C x C57Bl/6fl eller CB6fl§, og tumorene ble deretter injesert direkte med eksempel 4 lymfotoksin, lymfoblastoid-lymfotoksin (fremstilt og renset som beskrevet ovenfor) eller kontrollprøver. Etter 20-24 timer ble musene avlivet, tumorene fjernet og bedømt histologisk med henblikk på grad av nekrose. Som vist i tabell 1, bevirket både rekombinant og lymfoblastoid lymfotoksin betydelig nekrose av MethA(a) sarkom in vivo. Kontrollprøver induserte ikke nekrose av MethA(a) sarkom.

Lymfoblastoid lymfotoksin ble injisert oppløst i buffer 1 (0,01 M Tris-HCl, 0,05 M (NH4)2HC03, pH 8,0) og rekombinant lymfotoksin ble injisert oppløst i buffer 2 (0.15M NaCl, 0,1 M natriumacetat og 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8).

Fraværet av karbohydrat på rekombinant lymfotoksin synes ikke å påvirke biologisk aktivitet fordi den spesifikke aktivitet til lymfotoksin produsert av rekombinant kultur (2-10xl0<7> enheter/mg) er omtrent den samme som den som er rapportert for lymfoblastoid lymfotoksin (4xl0<7> enheter/mg).

Aktiviteten til rekombinant lymfotoksin viste også termo-labilitet lik det til naturlig lymfotoksin, dvs. inaktive-ring i vandig oppløsning etter oppvarming i 1 time ved 80°C.

Eksempel 6

Konstruks. ion av en ekspresjonsvektor for metionylhistidylamino- terminalt lymfotoksin

Konstruksjon av et plasmid som retter ekspresjonen E. coli av metionylhistidylamino-terminalt lymfotoksin, er skissert på fig. 3. Et syntetisk oligonukleotid ble innført i ekspresjonsplasmidet for derved å kode et initiator-metionin-kodon tilstøtende histidylkodonet i histidylaminoterminalt lymfotoksin (rest 24 på fig. 2a). Dette ble foretatt ved isolasjon av et 4630 bp vektor-fragment fra pLTtrpl med Xbal og Clal-nedbrytning, preparativ 1% agarosegel-elektroforese, og elektroeluering. Et 570 bp BamHI-Clal-fragment inneholdende mesteparten av den lymfotoksinkodende sekvens ble også isolert fra pLTtrpl på samme måte. To syntetiske oligonukleotider ble syntetisert ved hjelp av metodene omtalt ovenfor, og blandet med oligonukleotider 6, 7, 52 og 53 på fig. la. Omkring 50 pmol av hvert oligonukleotid ble behandlet med polynukleotid-kinase som beskrevet i eksempel 1. Oligonukleotidene ble ført sammen og deretter ligert med en blanding av 570 bp BamHI-Clal-fragment og 4630 bp Xbal-Clal-vektorfragmentet. Ligeringsblandingen ble transformert inn i E. coli ATCC 31446, og rekombinanter ble valgt på basis av resistens overfor tetracyklin. Plasmid p20KLTble utvunnet fra en av transformantene. Plasmid p20KLT ble karakterisert ved restriksjonsenzymanalyse og DNA-sekvensanalyse.

Eksempel 7

Fremstilling av cytotoksisk lymfotoksin- fus. ionsvariant

Et plasmid inneholdende DNA som koder en fusjon av lymfotoksin med et bakterielt protein ble konstruert ved kloning av en sekvens som koder for en bakteriell signalsekvens tilstøtende det strukturelle gen for lymfotoksin. Sekvensen i genet for det varmestabile enterotoksin II (STII)i E. coli har blitt karakterisert (R.N. Picken et al., 1983, "Infection and Immunity" 42: 269-275) og koder en 23 aminosyre-signalsekvens som retter utskillingen av STII-materialet inn i det periplasmiske rom E. coli.

Plasmidet pWM501 (Picken et al.,198, "Infection and Immunity" 42]1§: 269-275) inneholder det varmestabile enterotoksin (STII) gen. En del av det DNA-materiale som koder STII-genet, ble utvunnet fra pWM501 under anvendelse av følgende trinn. pWM501 ble nedbrutt med Rsal, og 550 bp DNA-fragmentet ble isolert. Dette genfragmentet ble ligert til fagen M13mp8 (J. Messing et al., i The Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, Ed. A. Walton, Elsevier, Amsterdam ]1981 side 143-153) som på forhånd hadde blitt nedbrutt med Smal. Det ligerte DNA ble benyttet for å transformere E. coli JM101, en kommersielt tilgjengelig stamme for bruk med M13-fagen. Klare plaquer ble utvunnet. Det dobbeltkjedede M13mp8 STII Rsa derivatet ble isolert fra E. coli JM101 infisert med denne fag under anvendelse av standard metoder (J. Messing et al., op eit ). Ved bruk av M13mp8-subkloningsmetoden som nettopp er "beskrevet, er det omtrentlige 550 basepar-fragmentet inneholdende STII-leder-genet nå bundet av en rekke forskjellige restriksjons— endonukleaseseter tilveiebragt av fagen. M13mp8 STII Rsa-derivatet ble deretter nedbrutt med EcoRI og Pstl, og et DNA-fragment litt større enn 550 bp DNA-fragmentet ble isolert.

EcoRI -Pstl-fragmentet ble subklonet inn i pBR322. Dette ble oppnådd ved nedbrytning av pBR322 med EcoRI og Pstl og isolering av vektoren. Den isolerte vektoren ble ligert til EcoRI-PstI DNA-fragmentet. Denne DNA-blanding ble benyttet for å transformere E. coli ATCC 31446 og tetracyklinresi-stente kolonier ble utvalgt. Et plasmid ble isolert fra en resistent E. coli koloni, og betegnet pSTII-partial.

pSTII-partial ble nedbrutt med Mnll og BamHI og 180 bp--fragment inneholdende STII Shine-Dalgarno sekvensen, STII signalsekvensen, og de første 30 kodoner i det utviklede STII-gen ble isolert. 180 bp DNA-fragmentet ble ligert til et plasmid inneholde trp-promotoren. Et slikt plasmid, pHGH207-l, har tidligere blitt beskrevet (H. de Boer et al., 1982, i Promoters: Structure and Function, Eds. R. Rodreguez et al., Chamberlin, Praeger Pub., New York, NY, side 462-481). Et derivat av dette plasmid, pHGH207-l<*>. hvor EcoRi-setet 5' til trp-promotoren hadde blitt omdannet til EcoRi<*> ved ifylling med DNA-polymerase I (DNA pol I) og sammenføyning av de butte endene ved ligering (S. Cabilly et al., 1984, "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 3273-3277) ble benyttet i dette eksempelet. Det trp-promotor-holdige plasmid ble nedbrutt med Xbal og behandlet med DNA poll og alle fire dNTP-materialene for å utfylle den fremtredende sekvens. DNA-preparatet ble deretter nedbrutt med BamHI og det vektor-holdige fragment isolert. Dette vektor-fragmentet ble deretter ligert til det 180 bp STII signalholdige DNA-fragmentet isolert ovenfor. Ligeringsblandingen ble benyttet for å transformere E. coli ATCC 31446 til

ampicillin-restistens. Et plasmid betegnet STII-leder ble isolert fra en ampicillin-resistent koloni.

En M13-fag inneholdende STII-kodende sekvenser ble først konstruert ved ligering av 180 bp Xbal-BamHI-fragmentet i pSTII-lederen inn i Xbal og BamHI nedbrutt med M13mpl0. Den resulterende fag-DNA, pSTII-shuttle, ble karakterisert ved restriksjonsendonuklease-analyse og nukleotid-sekvensering. LT-kodende sekvenser ble deretter introdusert i denne vektoren ved ligering av Hpal-EcoRI 700 bp-fragmentet i pLTtrpl inn i Smal-EcoRI nedbrutt pSTII-shuttle DNA av replikativ form (RF, dobbeltkjedet); Smal og Hpal-seter blir både buttendede og ligert sammen, hvilket resulterer i tap av begge seter. Den resulterende fag DNA, M13-STII-LT, ble karakterisert, og deretter benyttet for mutagenese som følger: Primeren 5' p CAAATGCCTATGCACTGCCAGGCGTAGG ble kinasebehandlet og blandet med templatet (M13-STII-LT) i nærvær av ligase-buffer og Xbal-EcoRI-nedbrutt M13mpl0 RF DNA (for å fremme pr iming av DNA, som rapportert av J.P. Adelman et al.,1983, "DNA" 2: 183-193); blandingen ble oppvarmet til 95°C og fikk deretter stå ved romtemperatur i 30 min. og deretter anbragt på is i 30 min. Alle fire deoksynukleotidtrifosfatene ble deretter tilsatt sammen med ATP, T4 DNA-ligase, og det store fragmentet (Klenow) av E. coli DNA polymerase I. Blandingen ble inkubert en time ved 14°C og deretter benyttet for å transfisere kompetent E. coli JM101, en kommersielt tilgjengelig stamme, eller en hvilken som helst annen M13 fagvert. Korrekt mutert fag ble identifisert ved hybridiserings-screening under anvendelse av den 32p_ra(}iomerkede primer som en probe. Den resulterende fag ST-LT-mut ble karakterisert ved DNA-sekvensanalyse. Replikativ DNA-form ble fremstilt fra denne fag og benyttet for isolering av et 761 bp Xbal-EcoRI-fragment inneholde DNA for STII signalsekvensen tilstøtende kodingssekvensen i leukocylamino-terminalt lymfotoksin. Dette DNA ble ligert med Xbal-BamHI-nedbrutt p20KLT (det store 4285 bp vektor-fragmentet) og 375 bp EcoRI-BamHI-fragmentet i pBR322. Det resulterende plasmid, pST18LT, ble karakterisert ved restriksjonskartlegging og DNÅ-sekvensering. Det ble fremstilt en lignende konstruksjon som kodet en fusjon av STII signal-aminoterminalen til histidinresten i histidylamino-terminalt lymfotoksin. De resulterende plasmidene ble transformert i E. coli ATCC 31446. Plasmider pSTLT18 og pSTLT16 ble utvunnet. De ble bekreftet å kode STII-fusjonen ved restriksjonsenzymanalyse og dideoksy-sekvensering. E. coli transformert med plasmider pSTLT18 eller pSTLT16 syntetiserer STII-signalsekvensfujsoner med leukocylamino--terminalt og histidylamino-terminalt lymfotoksin som bestemt for å være i overensstemmelse med de beregnede molekylvektene ved gelelektroforese. E. coli-lysatene inneholdende disse fusjonsproteiner viste cytotoksisk aktivitet.

Eksempel 8

Fremgangsmåte for fremstilling av monoklonalt muse- antistoff som kan nøytralisere lymfotoksin

Renset lymfoblastoid lymfotoksin oppnådd i eksempel 1 ble dialysert mot fosfatbufret saltoppløsning (PBS). 200 pg lymfotoksin/ml befant seg i dialysatet. Glutaraldehyd ble tilsatt til dialysatet til en konsentrasjon på 70 mM glutaraldehyd, blandingenble inkubert i 2 timer ved romtemperatur, mer glutaraldehyd ble tilsatt for å bringe dets totale tilsatte konsentrasjon opp til 140 mM, inkubering ble fortsatt i ytterligere 6 timer, og blandingen ble deretter dialysert mot PBS. 50 jjg av det glutaraldehyd-kryssbundede lymfotoksin (i det følgende betegnet "polylymfotoksin") og 0,5 ml Freund's komplette hjelpemiddel ble injisert sub-kutant i mus (stamme BALB/c). Etter en uke ble musen booster--immunisert med 50 pg polylymfotoksin og 0,5 ml Freund's ukomplette hjelpemiddel, halvparten intramuskulært og halvparten i den peritoneale kavitet. Serum ble høstet etter 7 dager og analysert med henblikk på anti-lymfotoksinaktivitet ved en ELISA-analyse.

ELISA-analysen ble utført som følger. En bufret oppløsning av renset lymfotoksin ble anbragt i mikrotiterbrønner og fikk tildekke brønnene med ca. 100 ng lymfotoksin hver. Den uabsorberte lymfotoksinoppløsningen ble oppsuget fra brønnene. 50 pl av passende fortynnet testprøve ble kombi-nert med 100 pl PBS inneholdende 5 mg/ml storfe-serumalbumin (PBS-BSA-buffer) og tilsatt til hver brønn, inkubert i to timer ved romtemperatur, vasket med PBS inneholdende 0,05% "Tween 20" 100 pl pepperrotperoksydase-merket anti-mus IgG fra geit i PBS-BSA buffer tilsatt til hver brønn, og inkubert i en time. Hver brønn ble vasket med PBS inneholdende 0,05% "Tween 20", og deretter ble citratfosfat-buffer, pH 5, inneholdende 0,1 mg o-fenolendiamin/ml (substratoppløsning) og vandig 30% HgC^ (ved et mengdeforhold på 4 pl av 30% v/v H2O2 pr. 10 ml substratoppløsning) tilsatt til hver brønn. Brønnene ble inkubert i 30 min., deretter ble reaksjonen stoppet med 50 pl 2,5 M svovelsyre og adsorbans målt ved 492 nm. Brønner som viste adsorbans større enn 1 O.D. ble ansett som anti-lymfotoksin-positive.

Testprøver ble også analysert med henblikk på evnen til å nøytralisere den cytotoksiske aktiviteten til lymfotoksin i L929-museanalysen. Serum innhøstet fra immuniserte dyr eller hybridom-supernatanter ble fortynnet etter behov i EPMI-1640 medium inneholdende 10% storfefoster-serum, og ca. 100 lymfotoksin-enheter/ml og utstrøket i mikrotiterbrønner inneholdende dyrkede L929-celler som ellers er vanlig i cytolyseanalysen. I kontrollen ble alle celler lysert. Nøy-traliserende antistoff ble detektert når lymfotoksinet ikke lyserte L929-celler.

Dyret immunisert med glutaraldehyd-polymerisert lymfotoksin tilveiebragte antistoffer som var aktive i ELISA-analysen, men ingen serum-nøytraliserende aktivitet ble detektert.

En suspensjon inneholdende 100 pg lymfotoksin og 1 ml av en 1,64% vekt/vol. suspensjon av aluminiumhydroksyd ](A1(0H)3§ "ble fremstilt og "benyttet for å immunisere den samme musen. Musen hie injisert med 100 pl av supensjonen intramuskulært og 400 pl intraperitonealt. Etter en uke ble musen injisert intravenøst med 10 pg upolymerisert og uadsorbert lymfoblastoid lymfotoksin i 100 pl PBS. En test av 1/80 fortynning av dyrets serum tre dager senere indikerte tilstedeværelsen av lymfotoksin-nøytraliserende antistoff.

Milten fra dette dyret ble høstet. 3xl0<7> miltceller ble sammensmeltet med 5xl0<7> muse-myelomaceller og utstrøket i mikrotiterbrønner inneholdende EAT-medium og ca. 3.000 peritoneal-makrofager/mikrotiterbrønn ifølge metoden til S. Fazekas De St. Groth, 1980, "J. Immunol. Meth." 35: 1-21-Hybridomer fra brønner inneholdende supernatanter som var positive i den ovenfor angitte ELISA-analysen ble dyrket i 1 ml volum av DMEM medium med 20% kalvef osterserum, 10% NCTC-135 medium, 5xl0~<5> M beta-merkaptoetanol og HAT, fordelt i mikrotiterbrønner ved en statistisk gjennomsnitt av en celle pr. brønn og deretter dyrket i en eller 5 ml volum av samme medium. Supernatanter ble deretter analysert med henblikk på nøytraliserende antistoff. Statistisk syntetiserte ca. 2% av de ELISA-positive hybridomene fra aluminiumhydroksyd-immuniseringen, nøytraliserende antistoff. Høyaffinitet-lymfotoksinantistoff velges eventuelt fra denne gruppe hybridomer.

Eksempel 9

Sete- spesifikk mutagenese av lymfotoksin

Fremgangsmåten i eksempel 3 følges nøyaktig i dette eksempelet med den unntagelse at segment 6 i det syntetiske oligonukleotidet var modifisert til å ha sekvensen 5'CTCAACTCTGCACCCA3' og dens komplementære kjede (segment 53) modifisert til å ha sekvensen 3'AGACGTGGGTCGTCGT5'.

De modifiserte oligonukleotidene sammenføyes med de reste-rende oligonukleotidene og ligeres inn i ekspresjonsvektoren som beskrevet i eksempel 6. Denne vektor inneholder en 2 bp substitusjon som endret lysin +28 kodonet fra lysin til histidin. Histidinmutanten uttrykkes ved transformasjon E. coli ATCC 31446.

Andre sete-dirigerte mutanter fremstilles på samme måte, fortrinnsvis ved å velge kodoner slik at man ikke innfører et EcoRi-restriksjonssete som ville kreve bruken av et partielt EcoRI-restriksjonsnedbrytningsprodukt i nedbryt-ningen av pLTXBl slik det er nødvendig i eksempel 3. Heller ikke burde mutasjonene innføre Xbal- eller BamHI-seter i fragment (se fig. lb), BamHI-eller Hindlll-seter i fragment B eller Hindlll- eller Bglll-seter i fragment C. Ellers vil partielle nedbrytninger være nødvendig for på riktig måte å sammensette pLTXBl-mutanten; nedbrytning til full-endelse ville gi en utelatelsesmutant istedenfor substitu-sjonsmutanten som er formålet i dette tilfellet.

Eksempel 10

Identifikasjon av genomisk DNA som koder muse- og storfe-- lymfotoksin, aminosyresekvens i muse- og storfe- lymfotoksin

Muse- og storfe-lymfotoksingener ble isolert fra genomisk-X-forråd. Det humane lymfotoksin cDNA-fragmentet (PvuII-EcoRI, 600 bp) ble radiomerket med <32>p ve(j nick--translasjon og benyttet som en probe for å analysere en genomisk DNA-X forråd fra mus (M600 stamme genomisk DNA fra mus i XCharon4A, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, side 31, 1982) og, uavhengig, et genomisk DNA-forråd fra storfe

(EP 88622A). Hybridisering ble foretatt ved lav stringens i 20% formamid (Gray og Goeddel "P.N.Å.S." 80: 5842-5846 ]1983§» og filteret ble vasket to ganger i en vandig oppløs-ning av 0,3 M natriumklorid, 0,03 M natriumnitrat og 0,1% SDS. Flere fag som hybridiserte med den humane lymfotoksin--proben ble plaque-renset (T. Maniatis et al., "Cell" 15: 687-701 ]19781). Fag-DNA ble fremstilt (T. Maniatis et al., "Cell" 15: 687-701 ]1978§), nedbrutt med restriksjonsendonukleaser og analysert ved Southern-hybridisering. Et 3.500 bp EcoRI DNA-fragment fra mus, og et 2.200 bp EcoRI DNA-fragment fra storfe hybridiserte begge med den humane lymfotoksin-proben. Disse DNA-fragmentene ble subklonet inn i plasmid pBR322 og deretter sekvensert ved dideoksy-kjedetermineringsmetoden (A.J.H. Smith Methods in Enzymology 65: 560-580 ]1980§). Den deduserte proteinsekvensen i muse- og storfe-lymfotoksin, sammen med den til humant lymfotoksin for sammenligningsformål er gitt i fig. 4.

Eksempel 11

Ekspresjon av lymfotoksin i gjær under kontroll av ADH-- promotoren

Plasmid pLTtrpl nedbrytes med Xbal for å åpne plasmidet ved Xbal-setet like i nærheten av lymfotoksin-starkodonet. De Xbal-kohesive termini gjøres butte med Klenow-fragmentet i E. coli DNA polymerase I med fire dNTP-enheter. En EcoRI adaptor

OH

5' AATTCCCGGG 3'

GGGCCC-P 5'

3' OH

ligeres til det butte plasmid-fragmentet, de fremstikkende 5'-hydroksyltermini fosforyleres under anvendelse av poly-

nukleotidkinase, ligeringsblandingen anvendes for på transformere E. coli ATCC 31446, og et plasmid pLTtrplRl identifiseres ved restriksjonsanalyse og inneholder et ytterligere EcoRl-sete nærmest lymfotoksin-startkodonet. Plasmid pLTtrplRl isoleres, nedbrytes med -EcoRI og det lymfotoksin DNA-holdige fragment SP utvinnes.

Plasmid pFRPn (EP 60,057A) nedbrytes med EcoRI, behandles med alkalisk fosfatase for å hindre resirkularisering, ligeres til SP-lymfotoksinfragmentet under anvendelse av T4 DNA-ligase, og ligeringsblandingen anvendes deretter for å transformere E. coli ATCC 31.446. Ampicillin-resistente kolonier gir to serier av plasmider som har SP-innskuddet i motsatte orienteringer bestemt ved restriksjonsanalyse på agarose-elektroforesegeler. Plasmider renses fra E. coli--transformanter og anvendes for å transformere gjær som har trpl mutasjonen (f.eks. gjærstamme RE212, ubegrenset ATCC deponering nr. 44076) til trp+ fenotypen. Man finner at plasmider orientert på en slik måte at startkodonet i segment SP er beliggende tilstøtende til alkohol-dehydro-genase-promotorfragmentet, transformerer gjæren til lymfotoksin-ekspresjon. Lymfotoksin gjenvinnes fra ekstrakter av gjærtransformantene. Plasmidstabiliteten i fermenteringer i stor målestokk kan forbedres ved anvendelse av et ekspresjonsplasmid inneholdende 2 jj replikasjonsopprinnelsen istedenfor pFRn kromosomal-replikasjonsopprinnelsen (ars 1) og en kompatibel vertstamme (J. Beggs. 1978, "Nature" 275 :104-109 ).

Eksempel 12

Ekspresjon av lymfotoksin i pattedyrceller

XLT11 (eksempel 2) nedbrytes med EcoRI, og det lymfotoksin-holdige DNA-fragmentet (revers transkript) utvinnes. Plasmid pEHER (EP 117,060A) nedbrytes med EcoRI, behandles med kalvetarm-alkalifosfatase, og ligeres til det EcoRI-bundede reverse transkript i XLT11. De resulterende plasmidene dyrkes på E. coli ATCC 31446 (EP 117.060A) og betegnes pEHERLT I og pEHERLT II. De inneholdt lymfotoksin DNA i motsatte orienteringer som bestemt ved restriksjonsanalyse på polyakrylamidgeler. Disse plasmidene anvendes for å transfisere og utvelge CHO DHFR-DUX-B11, CHO 1 og Ltk~celler.

Vevskulturceller transfiseres ved blanding av 1 pg pEHERLT I eller pEHERLT II som fremstilt ovenfor med 10 pg rottebærer--DNA i et volum av 250 pl, 0,25 M CaClg, fulgt av dråpevis tilsetning av 250 pl HEPES-bufret saltoppløsning (280 mM MaCl, 1,5 mM Na2P04, 50 mM HEPES, pH 7,1). Etter 30 min. ved romtemperatur tilsettes oppløsningen til vevskulturceller som vokser i 60 mm vevskulturskåler av plast. CHO 1, CHO DHFR-DUX-B11- og Ltk"celler anvendes. Skålene inneholder 3 ml kulturmedium som passer for vertcellen.

For CHO I og CHO II DHFR-DUX-Bll-celler er mediet Ham F-12 media (Gibco) tilført 10% kalveserum, 100 pm/ml penicillin, 100 pg/ml streptomycin, og 2 pmML-glutamin. For Ltk"cellelinjen er mediet Dulbecco-modifisert Eagle's medium (DMEM) supplert som angitt ovenfor.

Etter 3-16 timer fjernes mediet, og cellene vaskes med 20% glycerol i fosfatbufret saltoppløsning. Friskt medium tilsettes til hver plate, og cellene inkuberes i ytterligere to dager.

Valg av transfiserte vertceller utføres ved trypsinisering av cellene etter to dagers vekst (hvilket innbefatter behandling av cellene med steril trypsin 0,5 mg/ml inneholdende 0,2 mg/ml EDTA) og tilsetning av ca. 3xl0<5> celler til 10 mm vevskulturplater med selektive media. For dhfr"celler er mediet en formulering av (F-12 GIBCO) medium som mangler glysin, hypoxantin, og tymidin (GHT" medium). For DHFR+--vertceller tilsettes metotrexat (100-1000 nm) til det normale vekstmediet. Kontroller foretas ved bruk av trans-feksjonsbetingelser uten plasmid og med plasmid pFD-11 (EP 117.060A) inneholdende normalt DHFR. Kolonier som oppstår fra celler som opptar og uttrykker DHFR-plasmidet, er synlige i løpet av 1-2 uker. Det identifiseres transformanter som uttrykker ferdigutviklet lymfotoksin.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av human lymfotoksin, karakterisert ved å uttrykke i en rekombinant vertscelle en rekombinant nukleinsyrekonstruksjon omfattende: (i) nukleinsyre kodende for lymfotoksin som angitt i fig. 2A eller (ii) nukleinsyre som er oppnåelig ved hybridisering med det som er angitt i fig. 2A og som koder for et polypeptid med lymfotoksinaktivitet; eller (iii) nukleinsyre som koder for et lymfotoksinpolypeptid som har vesentlig strukturell homologi med minst en del av lymfotoksinaminosyresekvensen angitt i fig. 2A; i det nevnte lymf otoksinpolypeptid i (ii) eller (iii) utviser cytotoksisk aktivitet til, og/eller immunologisk kryss-reaktivitet med, og/eller evne til å konkurrere for lymfotoksin celleoverflatereseptorer med, cytotoksisk lymfotoksin.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av human lymfotoksin ifølge krav 1, karakterisert ved at a) en vertscelle blir transformert med en replikerbar vektor omfattende en promoter operabelt koblet til DNA kodende for human lymfotoksin omfattende aminosyrene 24-171 ifølge fig. 2A; b) lymfotoksinet blir akkumulert i kulturen og c) lymfotoksinet blir isolert fra kulturen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA er fri for et intron til stede mellom nukleotidene 284 og 285.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA er cDNA.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved å anvende en vektor som er replikerbar i prokaryoter.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender en vektor som er replikerbar i eukaryoter.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender en vektor som omfatter en bakteriell promoter operabelt koblet til DNA kodende for lymfotoksin.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA koder for en fusjon av en bakteriell sekretorisk leder og lymfotoksin.

9. Antistoff for in vitro anvendelse, karakterisert ved at det nøytraliserer den cytolytiske aktiviteten til (i) human lymfotoksin omfattende aminosyrene 24-171 Ifølge 2A eller (ii) et humant lymfotoksin som har evne til enten cytotoksisk aktivitet overfor tumorceller in vitro eller tumorceller in vivo og som har en region som demonstrerer vesentlig strukturell aminosyrehomologi med minst en del av lymfotoksinaminosyresekvensen angitt i figur 2A, og som er fri for ikke-nøytral i-serende antistoffer.

10. Antistoff ifølge krav 9, karakterisert ved at det er merket med detekterbar forbindelse.

11. Antistoff ifølge krav 9, karakterisert ved at det er immobilisert.

12. Antistoff ifølge krav 9, karakterisert ved at det er et monoklonalt antistoff.

13. Antistoff ifølge krav 9, karakterisert ved at den detekterbare forbindelsen er et fluoreserende middel, et kjemiluminiserende middel eller en radioisotopisk markør.

14 . Antistoff ifølge krav 1i, karakterisert ved at det blir immobilisert ved adsorposjon eller ved en kovalent binding til en overflate eller en matrise.