KR20080009111A - 유레이트 옥시다아제의 변이형 및 이의 용도 - Google Patents

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새비언트 파마수티컬즈 인크.
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Abstract

본 발명은 요산분해 활성을 갖는 유전적으로 변형된 단백질에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 절두된 유레이트 옥시다아제를 포함하는 페길화된 단백질을 포함하는, 절두된 유레이트 옥시다아제를 포함하는 단백질 및 이의 생성 방법에 관한 것이다.

Description

유레이트 옥시다아제의 변이형 및 이의 용도 {VARIANT FORMS OF URATE OXIDASE AND USE THEREOF}
본 발명은 요산분해 활성을 갖는 유전적으로 변형된 단백질에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 절두된 유레이트 옥시다아제를 포함하는 단백질 및 이를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
본원에서 용어 유레이트 옥시다아제 및 유리카아제는 상호교환적으로 사용된다. 유레이트 옥시다아제 (유리카아제; E.C. 1.7.3.3)는 요산을 더욱 가용성인 생성물 즉, 더욱 용이하게 분비되는 푸린 대사물인 알라토인으로의 산화를 촉매하는 효소이다. 인간은 더욱 고등의 영장류로의 진화동안 후천적인 유리카아제에 대한 유전자의 여러 변이의 결과로서, 효소적으로 활성인 유리카아제를 생성하지 못한다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Wu, X, et al., 91992) J Mol Evol 34:78-84] 참조). 그 결과, 민감한 개체에서, 혈중의 과도한 요산 농도 (고요산혈증)로 인해 고통스러운 관절염 (통풍), 미관이 손상되는 유레이트 침착 (토피; tophi) 및 신장 손상을 초래한다. 일부 영향을 받은 개체에서, 입수가능한 약물 예컨대, 알로푸리놀 (요산 합성 억제제)은 치료 제한적인 부작용을 초래하거나 이들 질환을 충분히 경감시키지 못한다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192]). 유리카아제의 주입은 적어도 일시적으로 고요산혈증 및 고요산뇨증을 경감시킬 수 있다. 유리카아제는 인간에서 이종 단백질이기 때문에, 아스페르길루스 플라부스 (Aspergillus flavus)로부터의 비변형된 단백질의 첫 번째 주입으로 처리된 환자중 수 %로 과민 반응을 초래할 수 있으며 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Pui, C-H, et al., (1997) Leukemai 11:1813-1816]), 면역학적 반응이 만성 또는 간헐적 처리에 대한 이의 사용을 제한한다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Donadio, D, et al, (1981) Nouv Presse Med 19:711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554]).
고요산혈증에 대한 이용가능한 준최적의 치료법이 수십년동안 공지되었다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Kissel, P, et al., (1968) Nature 217:72-74]. 유사하게는, 주입될 수 있는 안전하고 유효한 형태의 유리카아제가 중증 응혈을 갖는 특정 환자군에 이로울 수 있다는 가능성이 수년 동안 공지되었다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Davis, FF, et al., (1987) in GB Broun, et al., (Eds.) Enzyme Engineering, Vol. 4 (pp. 169-173) New York, Plenum Press; Nishimura, H, et al., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, et al., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, et al., (1981) Lancet 2 (8241):281-283; Abuchowski, A, et al., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219:352-354; Chen, RH-L, et al., (1981) Biochim Biophys Acta 660:293-298; chua, CC, et al., (1988) Ann Int Med 109:114-117; Greenberg, ML, et al., (1989) Anal Biochem 176:290-293]. 동물 기관으로부터 유래된 유리카아제는 주입되기에 안전한 투여물과 양립가능한 용매에 거의 불용성이다. 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 3,616,231. 식물 또는 미생물로부터 유래된 특정 유리카아제는 의약적으로 허용되는 용매중에 더욱 용해가능하다. 그러나, 미생물 효소의 주입은 생명에 위협적인 알레르기 반응 또는 순환계로부터 유리카아제의 불활성화 및/또는 가속화된 제거를 초래할 수 있는 면역 반응을 급속하게 유도한다 [Donadio, et al., (1981); Leaustic, et al., (1983)]. 피그 및 비비를 포함하는 포유동물, 또는 곤충 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) 또는 드로소필라 슈도오브스쿠라 (Drosophila pseudoobscura)로부터의 유리카아제의 추론된 아미노산 서열에 기초한 효소는 생리학적 pH에서의 불안정성 및 면역원성의 문제로 인해 임상용으로 적합한 후보가 못되었다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Wallrath, LL, et al., (1990) Mol Cell Biol 10:5114-5127]).
종래에는, 생체내에서 요산이 알랄토인으로의 전환을 촉매하기 위해 유리카아제를 주입하였다 (문헌 [Pui, et al, (1997)] 참조). 이는 혈액종양에 대한 세폭 독성 치료법과 관련된 고요산혈증을 예방하거나 일시적으로 교정하고, 응혈 환자의 중증 고요산혈증을 일시적으로 경감시키기 위해 진균류 아스페르길루스 플라부스 (Aspergillus flavus) (유리코자임®: Uricozyme®) 로부터의 유리카아제가 프랑스 및 이탈리아에서 사용된 것에 기초한다. 본원에 참고 문헌으로 인용된 문헌 [Potaux, L, et al., (1975) Nouv Presse Med 4:1109-1112; Legoux, R, et al., (1992) J Biol Chem 267:8565-8570; U.S. Patents 5,382,518 and 5,541,098]. 이의 짧은 순환 수명으로 인해, 유리코자임®은 매일 투여되어야 한다. 또한, 이의 면역원성으로 인해 장기간 치료에는 적합하지 않다.
특정 유리카아제는, 증가된 단백질 반감기 및 감소된 면역원성을 갖는 치료학적으로 유효한 형태의 유리카아제를 생성하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리(에틸렌 옥시드) (둘 모두 PEG로서 칭해짐)와의 컨쥬게이트를 제조하는데 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. 특허 4,179,337, 4,766,106, 4,847,325 및 6,576,235; U.S. 특허 출원 US2003/0082786A1. PEG 이외의 다른 중합체와 유리카아제의 컨쥬게이트 또한 공지되어 있다. 본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. 특허 4,460,683.
유리카아제를 페길화 (즉, PEG를 유리카아제에 공유 결합) 시키기 위한 보고된 거의 모든 시도에서, PEG는 아미노-말단 잔기 및 이용가능한 리신 잔기를 포함하는 아미노기에 우선적으로 부착된다. 일반적으로 사용되는 유리카아제에서, 4개의 동일한 서브유닛 각각에서 리신의 총 수는 25 (아스퍼길루스 플라부스 (본원에 참고문헌으로 인용된 미국특허 5,382,518)) 내지 29 (피그 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Wu, x, et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416]))개이다. 리신중 일부는 천연 구조의 효소에서 페길화에 이용불가능하다. 유리카아제의 면역원성을 저하시키기 위한 가장 일반적인 방법은 다량의 저분자량 PEG 스트랜드를 결합시키는 것이다. 이는 항상 생성된 컨쥬게이트의 효소 활성을 크게 감소 시켰다.
5kDa PEG에 결합된 캔디다 우틸리스 (Candida utilis) 유리카아제의 제조물을 단일 정맥내 주입하면, 주입전 혈청 유레이트 평균 농도가 일반적인 범위인 5명의 인간 피검체에서 혈청 유레이트를 검출불가능한 수준으로 저하시켰다 (Davis, et al., (1981)). 4주후에 피검체에 추가적으로 주입하였으며, 이들의 반응은 보고되지 않았다. 이차 (및 마지막) 주입 후, 비교적 민감하지 않은 겔 확산법을 사용한 경우 유리카아제에 대한 항체는 검출되지 않았다. 상기 참고문헌은 인간 환자 및 실험 동물의 만성 또는 준만성 처리에 대한 결과를 보고하지 않았다.
5kDa PEG에 결합된 아르트로박터 프로토포르미애로부터의 유리카아제의 제조물을 사용하여, 주입전 혈청 유레이트 농도가 15mg/dL인 림프종 단일 환자의 고요산혈증을 일시적으로 제어하는데 사용하였다 (Chua, et al., (1988)). 환자의 임상 상태 및 짧은 치료 기간 (14일동안 4회 주입)으로 인해, 컨쥬게이트의 장기간 효율 또는 안정도를 평가하는 것이 불가능하였다.
면역 인지으로부터의 향상된 보호는, 각 유리카아제 서브유닛이 고분자량 PEG (> 5kD - 120kD) 2개 내지 10개 스트랜드를 갖도록 변형시킴으로써 가능해진다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Saifer, et al. (미국특허 6,576,235; (1994) Adv Exp Med Biol 366:377-387)]). 이러한 방법에 의해, 페길화 후 다양한 종으로부터의 효소 활성을 75% 초과로 유지시키는 것이 가능해 졌으며, 유리카아제의 순환 수명이 향상되었으며, 마우스 및 래빗에서 항체의 유도 없이 효소의 반복된 주입이 가능하였다.
허쉴필드 및 켈리 (Hershfield and Kelly (본원에 참고문헌으로 인용된 국제특허출원 WO 00/08196; U.S. 출원 60/095,489))는 최적 수의 페길화 부위를 갖는 포유동물 종의 유리카아제 단백질 재조합체를 제공하는 수단을 개발하였다. 이들은 PCR 기법을 사용하여, 페길화 후 면역 시스템에 의한 인지가 감소되면서, 효소의 요산분해 활성은 실질적으로 유지되도록 설계된 효소의 선택된 지점에서 이용가능한 리신 잔기의 수를 증가시켰다. 이의 유리카아제 단백질의 일부는 카르복시 및/또는 아미노 말단에서 절두된다. 그러나, 이들은 단백질에서 기타 특이적인 유전적으로 유도된 변형을 유도하지는 못하였다.
본 출원에서, 용어 "면역원성"은 PEG-변형되거나 비변형된 유리카아제 (항원)의 주입된 제조물에 의한 면역반응의 유도를 나타내며, "항원성"은 이미 존재하는 항체와 항원의 반응을 의미한다. 종합적으로, 항원성 및 면역원성은 "면역반응성"으로 나타낼 수 있다. PEG-유리카아제의 종래 연구에서, 면역활성은 1) 이미 형성된 항체와 PEG-유리카아제의 실험관내 반응; 2) 유도된 항체 합성 측정; 및 3) 반복된 주입후 가속화된 제거 속도를 포함하는 다양한 방법에 의해 평가된다.
다양한 링커를 통해 다양한 수의 PEG 스트랜드에 결합시킴으로써 여러 공급원으로부터의 유리카아제의 면역원성을 제거하고자 하는 종래 시도는 제한된 성공만을 충족시켰다. PEG-유리카아제는 먼저 FF 데이비스 (Davis) 및 Y 이나다 (Inada)와 이들의 동료에 의해 최조로 밝혀졌다 (본원에 참고문헌으로 인용된 [Davis, et al., (1978); U.S. 특허 4,179,337; Nishimura, et al., (1979); 일본 특허 55-99189 및 62-55079]). 미국특허 4,179,337에 기재된 컨쥬게이트는 비특이 적 오리진의 유리카아제를 2,000배 초과 몰의 750달톤 PEG와 반응시킴으로써 합성되며, 이는 대량의 중합체 분자가 각 유리카아제 서브유닛에 부착할 것을 시사한다. 미국특허 4,179,337는 분자량이 500 내지 20,000달톤, 바람직하게는 약 500 내지 5,000 달톤의 PEG 또는 폴리(프로필렌 글리콜)와 결합시켜, 다양한 폴리펩티드 호르몬 및 옥시도환원효소를 포함하는 효소의 불수용성의 비면역원성 활성 컨쥬게이트를 제공하였으며, 이들중 유리카아제는 세가지 예중 하나에 속한다. 또한, 미국특허 4,179,337은 효소 분자당 10 내지 100개 중합체 스트랜드의 결합 및 40% 이상의 효소 활성의 보유를 강조하였다. 어떠한 시험 결과에서도 유리카아제의 이용가능한 아미노기와 PEG 결합 범위, 나머지 요산분해 비활성, 또는 컨쥬게이트의 면역활성에 대해 보고하지 않았다.
종래 문헌에서, 다양한 수의 PEG 스트랜드를 캔디다 우틸리스로부터의 유리카아제에 결합시킴으로써 실험관내 측정된 요산분해 활성의 현저한 감소가 초래되었다. 다수의 5kDa PEG 스트랜드를 프로신 간 유리카아제에 결합시키면 첸 문헌 및 동일한 그룹에 의해 보고된 심포지엄에서 공개된 바와 같이 유사한 결과를 제공하였다 (Chen, et al. (1981); Davis, et al., (1978)).
7개의 종래 연구에서, 유리카아제의 면역활성은 페길화에 의해 감소되는 것으로 보고되었으며, 5개의 다른 연구에서는 제거되었다. 이러한 5개 연구중 3개 연구에서, 면역활성의 제거는 요산분해 활성의 현저한 감소 - 최대 15%, 28% 또는 45%의 초기 활성의 감소와 관련이 있다. 니쉬무라 등, (1979) (15% 활성); 첸 등 (1981) (28% 활성); 니쉬무라 등 (1981) (45% 활성). 4개의 보고에서, PEG는 이용 가능한 리신 잔기의 61%에 결합하는 것으로 보고되었으며, 나머지 비활성에 대해서는 언급되지 않았다 (Abuchowski, et al., (1981). 그러나, 두명의 동일한 과학자를 포함하며, 동일한 방법을 이용한 연구에서는, 나머지 잔여 활성 결합 범위가 단지 23-28%인 것으로 보고하였다 (Chen, et al., (1981)). 아부초브스키 등 및 첸 등의 1981년 문헌은, 유리카아제의 면역원성을 실질적으로 감소시키기 위해, PEG가 이용가능한 리신 잔기의 약 60%에 결합해야 하는 것으로 나타낸다. 유리카아제의 면역활성이 제거된 것으로 보고된 다섯번째 문헌에는 PEG 결합 범위, 잔여 요산분해 활성, 또는 PEG-단백질 결합 특성을 기재하지 않았다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Veronese, FM, et al., 91997) in JM Harris, et al., (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 182-192) Washington, DC: American Chemical Society].
유리카아제중의 리신 잔기의 더 작은 분획으로의 PEG의 결합은 실험 동물에서 면역활성을 감소시키나 제거시키진 못하였다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Tsuji, J, et al, 91985) Int J Immunopharmcol 7:725-730] (결합된 아미노기의 28-45%); 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Yasuda, Y, et al., (1990) Chem pharm Bull 38:2053-2056] (결합된 아미노기의 38%). 상응하는 부산물의 나머지 요산분해 활성은 이의 초기 값의 33% 초과 (Tsuji, et al.) 내지 60% (Yasuda, et al.)이다. 트수지 등은 5kDa PEG 이외에, 7.5kDa 및 10kDa PEG와의 PEG-유리카아제 컨쥬게이트를 합성하였다. 생성된 컨쥬게이트 모두는 다소 면역원성 및 항원성을 띠면서, 효소 활성은 현저하게 감소되었다.
5명의 인간 각각에 안전하게 2회 투여된 캔디다 우틸리스로부터의 유리카아제의 페길화된 제조물은 초기 활성의 단지 11%만 유지되는 것으로 보고되었다 (Davis, et al. (1981)). 수년 후, 아르트로박터 프로토로프미애로부터의 PEG-변형된 유리카아제를 진행된 림프종 및 중증 고요산혈증을 갖는 한 환자에 4회 투여하였다 (Chua, et al., (1988). 효소 제조물의 잔여 활성이 측정되지 않았지만, 추아 (Chua) 등은 효소결합 면역흡착 측정법 (ELISA)을 이용하여 일차 PEG-유리카아제 주입 후 26일에 환자 혈청중의 항-유리카아제 항체의 부재를 입증하였다.
페길화된 유리카아제의 종래 연구는, 촉매 활성이 충분한 수의 PEG 스트랜드와 결합함으로써 현저하게 저하되어, 실질적으로 이의 면역활성을 감소시킴을 보여준다. 또한, PEG-유리카아제의 대부분의 종래 제조물은, 신규한 항원성 결정인자이며 래빗에서 항체의 형성을 유도하는 것으로 입증된 시아누르산 클로라이드 즉, 트리아진 유도체 (2,4,6-트리클로로-1,3,5-트리아진)으로 활성화된 PEG를 사용하여 합성된다 (Tsuji, et al., (1985)).
본원에 참고문헌으로 인용된 일본 특허 3-148298 (A Sano, et al.)에는 1-12kDa의 분자량을 갖는 PEG와 유도체화된 유리카아제를 포함하는 개질된 단백질로서, 감소된 항원성 및 "향상된 장기간" 활성을 나타내는 단백질 및 이러한 유도체화된 펩티드를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 여기에는 스트랜드 수, 효소 검정, 생물학적 시험 또는 "향상된 장기간"의 의미에 대해서는 기재되어 있지 않다. 본원에 참고문헌으로 인용된 일본 특허 55-99189 및 62-55079 (둘 모두 Y Inada)에는, 각각 PEG-트리아진 또는 비스-PEG-트리아진 (PEG2로서 언급됨)과 제조된 유리카아제 컨쥬게이트가 기재되어 있다. 문헌 [Nishimura, et al., (1979 and 1981)] 참조. 첫번째 유형의 컨쥬게이트에서, PEG의 분자량은 2kDa 및 5kDa인 반면, 두번째 유형에서는, 단지 5kDa PEG가 사용되었다. 니쉬무라 등 (1979)은 이용가능한 리신의 43%를 선형 5kDa PEG로 변형시킨 후 요산분해 활성이 15% 복구된 것으로 보고하였으며, 니쉬무라 등 (1981)은 PEG2로 각각 리신의 46% 또는 36%를 변형시킨 후 요산분해 활성이 31% 또는 45% 복구된 것으로 보고하였다.
종래 연구된 유리카아제 단백질은 천연 또는 재조합 단백질이다. 그러나, SDS-PAGE 및/또는 웨스턴 기법을 이용한 연구에 의해 예상치못한 저분자량의 펩티드가 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 분해 생성물인 것으로 보이며, 시간에 따라 그 빈도가 증가하였다. 본 발명은 절두되고, 향상된 구조 안정도를 갖는 변이된 재조합 유리카아제 단백질에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 신규한 유리카아제 단백질 재조합체를 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 단백질은 절두되며, 천연 발생 유리카아제 단백질과 비교하여 변이된 아미노산을 갖는다. 특정 구체예에서, 변이는 아미노산 7번, 46번, 291번 및 301번의 영역에서 또는 그 주변에서 발생한다. 펩티드내의 보존적 변이는 본 발명의 일부로서 고려된다.
본 발명은 변이된 재조합체 유리카아제를 제공하며, 여기서 유리카아제는 1 - 20개 아미노산이 절두되었으며, 천연 발생 유리카아제의 요산분해 활성을 보유한다. 절두는, 단백질이 최종 아미노산을 함유할 수 있도록 서열 말단 또는 이 주변에서 발생한다. 이러한 변이 및 절두는 이러한 변이체를 포함하는 단백질의 안정도를 향상시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 요산분해 활성을 갖는 신규한 유리카아제 단백질 재조합체를 포함하는 요산 대사 수단을 제공한다. 본원에 사용된 요산분해 활성은 요산의 알란토인으로의 효소적 전환을 의미한다.
본 발명은 또한, 1 - 20개 아미노산이 절두되며, 변이된 아미노산을 가지며, 요산분해 활성을 보유한 유리카아제를 생성시킬 수 있는 숙주 세포를 제공한다.
한 구체예에서, 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 아미노 및 카르복시 말단 두 곳에서 약 1 - 13개의 아미노산이 절두되고, 약 46번 위치에서 아미노산이 치환된 포유동물 유리카아제 아미노산 서열을 포함하는, 포유동물의 분리된 절두 유리카아제가 제공된다. 특정 구체예에서, 유리카아제는 아미노 말단 아미노산을 포함하며, 여기서 아미노 말단 아미노산은 알라닌, 글리신, 프롤린, 세린 또는 트레오닌이다. 특정 구체예에서, 아미노 말단 아미노산은 메티오닌이다. 또한, 약 46번 위치에서 트리오닌 또는 알라닌으로 치환된 유리카아제가 제공된다. 한 구체예에서, 유리카아제는 SEQ ID NO. 8의 아미노산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 유리카아제는 중합체와 컨쥬게이팅되어 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 - 유리카아제 컨쥬게이트를 형성한다. 특정 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 - 유리카아제 컨쥬게이트는 각 유리카아제 서브유닛상에 2 내지 12개 폴이에틸렌 글리콜 분자를 포함 하며, 바람직하게는 유리카아제 서브유닛당 3 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 - 유리카아제 컨쥬게이트의 각 폴리에틸렌 글리콜 분자의 분자량은 약 1kD 내지 100kD; 약 1kD 내지 50kD; 약 5kD 내지 20kD; 또는 약 10kD이다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜 - 유리카아제 컨쥬게이트를 포함하는 본 발명의 유리카아제를 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 약제 조성물은 반복 투여에 적합하다.
또한, 본 발명의 유리카아제를 포함하는 약제 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 체액중의 요산 수준을 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 체액은 혈액이다.
한 구체예에서, 유리카아제는 Pig-KS-ΔN의 44번 내지 56번 위치의 서열 (SEQ ID NO. 14)을 갖는 펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, 유리카아제 단백질은 N-말단 메티오닌을 포함한다. 특정 구체예에서, 유리카아제는 SEQ ID NO. 7의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명의 유리카아제 예를 들어, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO. 12 또는 SEQ ID NO.13의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 유리카아제를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 한 구체예에서, 분리된 핵산은 이종성 프로모터 예를 들어, osmB 프로모터에 작동적으로 연결된다. 또한, 핵산을 엔코딩하는 유리카아제를 포함하는 벡터, 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 핵산은 SEQ ID NO.7의 서열을 갖는다. 또한, 유리카아제가 숙주 세포에 의해 발현되는 조건하에 숙주 세포를 배양시키는 단계 및 발현된 유리카아제를 분리하는 단계를 포함하여, 유리카아제를 생성시키는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 플라스미드 pOUR-P-ΔN-ks-1의 구조를 예시한다. 제한 부위 옆의 숫자는 1로서 나타낸 HaeII 부위에 대한 누클레오티드 위치를 나타낸다. 클로닝 동안 손실되는 제한 부위는 괄호로 표시하였다.
도 2는 Pig-KS-ΔN 유리카아제의 DNA 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸다 (각각 SEQ ID NO 9 및 SEQ ID NO 7). 도 2의 아미노산 넘버링은 피그의 완전한 유리카아제 서열에 상대적인 것이다. 개시제인 메티오닌 잔기 이후, 트레오닌이 피그 유리카아제 서열의 아스파르트산 7을 대체한다. 다양한 단계의 서브클로닝에 사용된 제한 부위를 나타내었다. 3' 비번역된 서열은 소문자로 표시하였다. 번역 정지 코돈은 별표로 표시하였다.
도 3은 다양한 재조합 피그 (SEQ ID NO 11), PBC-ΔNC (SEQ ID NO 12) 및 Pig-KS-ΔN (SEQ ID NO 7)의 추출된 아미노산 서열의 상대적 정렬을 나타낸다. 별표는 공개된 피그 유리카아제 서열과 비교하여 Pig-KS-ΔN의 상이한 아미노산의 위치를 나타내며; 동그라미는 PBC-ΔN과 비교하여 Pig-KS-ΔN의 상이한 아미노산 위치를 나타낸다. 점선은 아미노산 결실을 나타낸다.
도 4는 피그 유리카아제 및 실시예 1-3에 따라 생성된 고도로 정제된 유리카아제 변이체의 SDS-PAGE를 나타낸다. 각 샘플에 대한 생성 데이타 (달/년) 및 관련 레인 넘버는 아래의 키(key)에 나타내었다. Y 축은 분자량 마커의 중량으로 표 시한 것이며, 도면의 상단은 레인 넘버이다. 레인은 다음과 같다: 레인 1 - 분자량 마커; 레인 2 - Pig KS-ΔN (7/98); 레인 3 - Pig (9/98); 레인 4 - Pig KS (6/99); 레인 5 - Pkg KS (6/99); 레인 6 - Pig-ΔN (6/99); 레인 7 - Pig-KS-ΔN (7/99); 레인 8 - Pig KS-ΔN (8/99).
도 5는 혈액 샘플중의 효소 활성을 모니터링함으로써 측정된, IM (근내), SC (피하내) 및 IV (정맥내) 주입 후 래트에서 페길화된 (9x10 kD) Pig-KS-ΔN 유리카아제의 약동학 프로파일을 나타낸다. 기재된 시점에서 수집된 혈장 샘플에서의 유리카아제 활성은 비색 분석법을 이용하여 측정하였다. 활성값 (mAU = 밀리-흡광도 유닛)은 혈장 샘플 1㎕ 당 효소 반응 속도를 나타낸다. 생체이용율 (IV 주입과 관련하여 순환에 도달하는 약물의 양)을 그래프 곡선 아래의 영역으로부터 계산하였다.
도 6은 혈액 샘플중의 효소 활성을 모니터링함으로써 측정된, IM (근내), SC (피하내) 및 IV (정맥내) 주입 후 래빗에서 페길화된 (9x10 kD) Pig-KS-ΔN 유리카아제의 약동학 프로파일을 나타낸다. 기재된 시점에서 수집된 혈장 샘플에서의 유리카아제 활성은 비색 분석법을 이용하여 측정하였다. 활성값 (mAU = 밀리-흡광도 유닛)은 혈장 샘플 1㎕ 당 효소 반응 속도를 나타낸다. 생체이용율 (IV 주입과 관련하여 순환에 도달하는 약물의 양)을 그래프 곡선 아래의 영역으로부터 계산하였다.
도 7은 혈액 샘플중의 효소 활성을 모니터링함으로써 측정된, IM (근내), SC (피하내) 및 IV (정맥내) 주입 후 도그에서 페길화된 (9x10 kD) Pig-KS-ΔN 유리카 아제의 약동학 프로파일을 나타낸다. 기재된 시점에서 수집된 혈장 샘플에서의 유리카아제 활성은 비색 분석법을 이용하여 측정하였다. 활성값 (mAU = 밀리-흡광도 단위)은 혈장 샘플 1㎕ 당 효소 반응 속도를 나타낸다. 생체이용율 (IV 주입과 관련하여 순환에 도달하는 약물의 양)을 그래프 곡선 아래의 영역으로부터 계산하였다.
도 8은 혈액 샘플중의 효소 활성을 모니터링함으로써 측정된, IM (근내), SC (피하내) 및 IV (정맥내) 주입 후 피그에서 페길화된 (9x10 kD) Pig-KS-ΔN 유리카아제의 약동학 프로파일을 나타낸다. 기재된 시점에서 수집된 혈장 샘플에서의 유리카아제 활성은 비색 분석법을 이용하여 측정하였다. 활성값 (mAU = 밀리-흡광도 유닛)은 혈장 샘플 1㎕ 당 효소 반응 속도를 나타낸다. 생체이용율 (IV 주입과 관련하여 순환에 도달하는 약물의 양)을 그래프 곡선 아래의 영역으로부터 계산하였다.
종래 연구는 유리카아제의 면역원성 및/또는 항원성에 대한 현저한 감소가 페길화에 의해 달성되는 경우, 요산분해 활성의 현저한 손실과 항상 결부되어 있음을 교시한다. 생의약의 안전성, 편리성 및 비용 효과는 이들의 효능 및 결과가 저하되면 투여되는 투여량이 증가되어야 하기 때문에 모두 불리한 영향을 받는다. 따라서, 혈액을 포함하는 체액에서 요산의 증가 수준을 저하시키기 위한 안전하고 효과적인 대체 수단이 요구된다. 본 발명은 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 이 둘 말단에서 1 - 20개 아미노산이 절두되고, 실질적으로 천연 발생 유리카아제의 요산분해 활성을 보유하는 변이된 유리카아제 재조합체를 제공한다.
본원에 기술된 바와 같은 유리카아제는 특별히 언급되어 있지 않으면, 테트라머 뿐만 아니라 개개의 서브유닛을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 변이된 유리카아제는 다른 아미노산과 교환된 아미노산을 갖는 유리카아제 분자를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 보존성 변이는 실질적으로 단백질 성향을 변형시키지 않는 위치 또는 이 주변에서의 하나 이상의 아미노산의 변이를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 보존성 변이를 포함하는 유리카아제는 이러한 변이체가 없는 유리카아제와 동일한 유리카아제 활성을 갖는다. 대안적인 구체예에서, 하나 이상의 보존성 변이를 포함하는 유리카아제는 이러한 변이가 발생하지 않은 유리카아제의 활성의 5%, 10%, 또는 30% 내의 실질적으로 동일한 유리카아제 활성을 갖는다.
보존성 아미노산 치환은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단편직, 또는 이의 단편의 아미노산을 변화시키는 방식으로 아미노산 조성을 변화시키는 것으로 정의된다. 특정 구체예에서, 유리카아제는 1, 2, 3 또는 4개의 보존성 변이를 포함한다. 치환은, 치환이 실질적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 특징 (예를 들어, 전하, IEF, 친화도, 접착능, 구조, 용해도) 또는 활성을 변화시키지 않도록 일반적으로 유사한 특성 (예를 들어, 산성, 염기성, 방향족, 크기, 파지티브 또는 네거티브 하전, 극성, 비극성)을 갖는 아미노산의 치환이다. 이러한 보존성 아미노산 치환에 대해 수행될 수 있는 전형적인 치환은 하기와 같이 아미노산 그룹중에 발생할 수 있다:
글리신 (G), 알라닌 (A), 발린 (V), 류신 (L) 및 이소류신 (I)
아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)
알라닌 (A), 세린 (S) 및 트레오닌 (T)
히스티딘 (H), 리신 (K) 및 아르기닌 (R)
아스파라긴 (N) 및 글루타민 (Q)
페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)
하나 이상의 보존성 치환을 갖는 단백질은 이의 구조적 안정도를 보유하고 있으며, 이의 DNA 서열이 원래의 단백질 서열과 동일하지 않더라도 반응을 촉매할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 절두된 유리카아제는 짧아진 일차 아미노산 서열을 갖는 유리카아제 분자를 의미한다. 가능한 절두로는 아미노 및/또는 카르복시 말단에서 또는 이 주변에서의 절두이다. 이러한 유형의 특정 절두는, 천연 발생 단백질의 최종 아미노산 (아미노 및/또는 카르복시 말단의 아미노산)이 절두된 단백질에 존재하도록 발생할 수 있다. 아미노 말단 절두는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6번 위치에서 시작될 수 있다. 바람직하게는, 아미노 말단 절두는 2번 위치에서 시작되어, 아미노 말단 메티오닌은 남겨둔다. 이러한 메티오닌은 번역후 변형에 의해 제거된다. 특정 구체예에서, 아미노 말단 메티오닌은 유리카아제가 생성된 후 제거된다. 특정 구체예에서, 메티오닌은 내인성 박테리아 아미노펩티드에 의해 제거된다.
전장 서열과 관련하여 절두된 유리카아제는 하나 이상의 아미노산 서열이 배제된다. 절두된 유리카아제를 포함하는 단백질은 절두된 유리카아제 서열 이외의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 추가적인 연속적인 야생형 아미노산 서열을 함유하는 유리카아제 서열을 포함하는 단백질을 포함하지 않는다. 즉, 절두가 6번 위치에서 시작된 (즉, 절두된 유리카아제는 7번 위치부터 시작됨) 절두된 유리카아제를 포함하는 단백질은 절두된 유리카아제로부터의 바로 가까이에 있는 업스트림은 갖지 않으며, 야생형 유리카아제는 6번 위치에서 어떠한 아미노산도 가질 수 있다.
다른 서열 또는 특정 SEQ ID NO.에 대한 특정 기준이 다르게 언급되어 있지 않는 한, 본원에 기술된 유리카아제의 아미노산 위치의 번호는 피그 유리카아제 서열의 아미노산의 넘버링에 관련하여 매겨졌다. 피그 유리카아제의 아미노산 서열 및 이러한 서열을 포함하는 아미노산의 위치는 도 3에서 발견할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산에 대한 기준 "위치 X 내지 위치 Y"는 위치 X에서 시작하여 위치 Y에서 종결되는 연속 서열을 의미하며, 양 위치 X 및 Y에서의 아미노산 또는 핵산을 포함한다.
유리카아제 유전자 및 단백질은 여러 포유동물 예를 들어, 피그, 비비, 래트, 래빗, 마우스 및 리러스 멍키에서 확인되었다. 다양한 유리카아제 단백질의 서열은 하기와 같이 이들의 공개된 데이타 염기 수탁 번호를 참조로 기술되었다:
Figure 112007080520848-PCT00001
더 내셔널 센터 퍼 바이오테크놀로지 인포메이션 (the National Center for Biotechnology Information: NCBI)를 통해 입수가능한 공개 데이타베이스중의 이들 서열 및 이들의 아난토인화물 각각이 본원에 참조로 인용되었다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 이의 아미노 말단에서 4 - 13개 아미노산이 절두된다. 본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 이의 카르복시 말단에서 4 - 13개 아미노산이 절두된다. 본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 이의 카르복시 및 아미노 말단 양측에서 4-13개 아미노산이 절두된다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 이의 아미노 말단에서 6개 아미노산이 절두된다. 본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 이의 카르복시 말단에서 6개 아미노산이 절두된다. 본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 이의 카르복시 및 아미노 말단 양측에서 6개 아미노산이 절두된다.
특정 구체예에서, 유리카아제 단백질은 피그 유리카아제의 아미노산 서열의 13번 위치 내지 292번 위치의 아미노산 서열 (SEQ ID NO. 11)을 포함한다. 특정 구체예에서, 유리카아제 단백질은 PBC-ΔNC의 아미노산 서열의 8번 위치 내지 287번 위치의 아미노산 서열 (SEQ ID NO. 12)을 포함한다. 특정 구체예에서, 유리카아제 단백질은 Pig-KS-ΔN의 아미노산 서열의 8번 위치 내지 287번 위치의 아미노산 서열 (SEQ ID NO. 7)을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 유리카아제 단백질은 Pig-KS-ΔN의 44번 위치 내지 56번 위치의 아미노산 서열 (SEQ ID NO. 14)을 포함한다. 유리카아제의 이러한 영역은 유리카아제의 터널링 폴드 (T-폴드) 도메인내의 서열과 상동성을 띠며, 천연 피그 유리카아제 서열과 비교하여 46번 위치에서 변이된다. 이러한 변이는 놀랍게도 단백질의 유리카아제 활성을 현저하게 변형시키지 못한다.
본 발명의 구체예에서, 아미노산 7, 46 및 291, 및 301번 또는 이 주위의 아미노산이 변이된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 아미노산 7, 46 및 291, 및 301번 자체가 변이된다.
특정 구체예에서, 단백질은 N-말단 메티오닌을 엔코딩하는 핵산에 의해 엔코딩된다. 바람직하게는, N-말단 메티오닌에 이어서 박테리아 메티오닌 아미노펩티다아제 (MAP)에 의한 N-말단 메티오닌의 제거를 허용하는 코돈이 존재한다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Ben-Bassat and Bauer (1987) Nature 326:315]). N-말단 메티오닌의 가장 완전한 제거를 허용하는 아미노산은 알라닌, 글리신, 프롤린, 세린 및 트레오닌이다.
본 발명의 구체예에서, 7번 및/또는 46번의 아미노산 또는 이 주위의 아미노산이 트레오닌에 의해 치환된다. 놀랍게도, 이러한 변이에 의해 제조된 절두된 유리카아제의 효소 활성은 비절두된 효소의 활성과 유사하다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 아미노산 변이체는 7번, 46번, 291번 및 301번에서 각각 트레오닌, 리신 및 세린을 포함한다.
본원에 기술된 절두된 포유동물 유리카아제는 추가로 아미노 말단에 메티오닌을 포함할 수 있다. 끝에서 두번째 아미노산은 박테리아 메티오닌 아미노펩티아다제 (MAP)에 의해 N-말단 메티오닌이 제거되게 할 수 있는 아미노산이다. N-말단 메티오닌의 가장 완전한 제거를 가능하게 하는 아미노산으로는 알라닌, 글리신, 프롤린, 세린 및 트레오닌이 있다. 특정 구체예에서, 유리카아제는 두개의 아미노 말단 아미노산을 포함하며, 여기서 2개의 아미노 말단 아미노산은 메티오닌, 이어서 알라닌, 글리신, 프롤린, 세린 및 트레오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 치환된 아미노산은 트레오닌에 의해 대체된다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 포유동물 유리카아제이다.
본 발명의 구체예에서, 포유동물 유리카아제는 돼지, 소, 양 및 비비 간 유리카아제의 서열을 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 2개 이상의 포유동물 유리카아제의 키메라 유리카아제이다.
본 발명의 구체예에서, 포유동물 유리카아제는 돼지, 소, 양, 또는 비비 간 유리카아제로부터 선택된다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 SEQ ID NO.8의 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 유리카아제는 SEQ IN NO.13의 서열을 포함한다.
본 발명은 SEQ ID NO. 10의 서열을 포함하는 핵산을 엔코딩하는 유리카아제를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 진균류 또는 미생물 유리카아제를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 진균류 또는 미생물 유리카아제는 아스퍼길루스 플라부스, 아르트로박터 글로비포르미스 또는 캔디다 우틸리스 유리카아제이다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 무척추동물 유리카아제를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 무척추동물 유리카아제는 드로소필라 멜라노가스터 또는 드로소필라 슈도오브스쿠라 유리카아제를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제는 식물 유리카아제를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 식물 유리카아제는 뿌리혹의 글리신 맥스 유리카아제이다.
본 발명은 이러한 유리카아제를 엔코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명은 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
특정 구체예에서, 유리카아제가 분리된다. 특정 구체예에서, 유리카아제가 정제된다. 특정 구체예에서, 유리카아제는 분리되고 정제된다.
본 발명은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 비절두된 유리카아제를 엔코딩하는 핵산 서열을 PCR (중합효소 연쇄 반응) 기법에 의해 변형시키는 것을 포함하여, 핵산 서열을 생성시키는 방법을 제공한다. 해당 핵산 서열이 증폭하려는 표적 DNA의 영역 (각 스트랜드에 대해 하나)에 상보적인 합성 올리고누클레오티드 프라이머에 의해 PCR에 의해 제조된다는 것은 당업자에게 자명하다. 프라이머를 과다 데옥시누클레오티드 및 Taq 중합효소 즉, 내열성 DNA 중합효소의 존재하에 표적 DNA (순수한 필요는 없음)에 첨가된다. 일련의 온도 순환 (전형적으로 30회)시, 표적 DNA는 반복적으로 변성되고 (약 90℃), 프라이머로 어닐링되고 (전형적으로, 50-60℃), 프라이머로부터 도터 스트랜드가 연장된다 (72℃). 도터 스트랜드 자체가 후속 순환시 주형으로서 작용하기 때문에, 양 프라이머에 매칭되는 DNA 단편이 선형이 아니라 기하급수적으로 증폭된다.
본 발명은 유리카아제를 발현하는 숙주 세포를 벡터로 트랜스펙션시키고, 숙주 세포로부터 재조합 유리카아제 변이체를 분리하고, 정제된 재조합 유리카아제 변이체를 예를 들어, 크로마토그래피에 의해 분리하고, 재조합 유리카아제 변이체를 정제하는 것을 포함하여, 재조합 유리카아제 변이체를 생성시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 유리카아제는 본원에 참고문헌으로 인용된 국제 특허 출원 WO 00/08196에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다.
유리카아제는 당업자에게 자명한 방법에 의해 분리되고/거나 정제될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 형태로 분리된다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 80중량% 이상, 더욱 바람직하게는 95 중량% 이상, 가장 바람직하게는 99중량% 이상의 순도로 분리된다. 일반적으로, 이러한 정제는 예를 들어, 암모늄 설페이트 분별화, SDS-PAGE 전기영도 및 친화성 크로마토그래피의 표준 기법에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 유리카아제는 본원에 참고문헌으로 인용된 2005년 4월 11일 출원된 공동 계류중인 미국특허 출원 제 60/670,520호 (attorney docket number 103864.146644, entitled Purification Of Proteins With Cationic Surfactant)에 기술된 방법에 따라 양이온 계면활성제 예를 들어, 세틸 피리디늄 클로라이드를 사용하여 분리된다.
바람직한 구체예에서, 숙주 세포를 재조합 유리카아제 변이체가 발현되도록 처리한다. 당업자에게는 벡터로의 세포의 트랜스펙션이 일반적으로 칼슘 이온으로 침전된 DNA를 사용하여 달성되며, 다양한 기타 방법 (예를 들어, 일렉트로포레이션)이 이용될 수 있음이 자명하다.
본 발명의 구체예에서, 벡터는 삼투압 민감성 프로모터의 조정하에 있다. 프로모터는 DNA의 RNA로의 전사 개시 전에 RNA 중합효소가 결합되는 DNA 영역이다. 삼투압 민감성 프로모터는 세포에 의해 감작되는 증가된 삼투압에 의해 전사를 개시한다.
본 발명의 구체예에서, 프로모터는 변형된 osmB 프로모터이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 유리카아제는 중합체와 컨쥬게이팅된 유리카아제이다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제를 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 조성물은 유리카아제의 용액이다. 바람직한 구체예에서, 용액은 멸균되고 주입하기에 적합하다. 한 구체예에서, 이러한 조성물은 인산염 완충된 염수중의 용액으로서 유리카아제를 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 선택적으로 고무 주입 스토퍼를 갖는 바이알에 제공된다. 특정 구체예에서, 조성물은 용액중에 용액 밀리리터당 2 내지 16 밀리그램, 4 내지 12 밀리그램, 또는 6 내지 10 밀리그램의 농도로 유리카아제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 밀리리터당 8 밀리그램의 농도로 유리카아제를 포함한다. 바람직하게는, 유리카아제의 양은 단백질 양과 관련되어 측정된다.
본 발명의 조성물의 효과적인 투여법은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 주어진 요법의 효율을 평가하는데 적합한 지시 인자는 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 지시 인자의 예로는 혈장 요산 수준 (PUA)의 정상화 또는 감소시키는 것을 포함하며, PUA의 6.8mg/dl 이하, 바람직하게는 6mg/dl 이하로 유지하거나 감소시키는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물로 처리될 피검체는 6mg/ml 이하의 PUA를 전체 처리 기간중 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 기간 동안 유지한다. 예를 들어, 24주 처리 기간에 있어서, 피검체는 바람직하게는, 24주 처리 기간중 80% 이상의 기간 동안 즉, 적어도 134.4일 ( 24 주 × 7일/주 × 0.8 = 134.4 일)에 해당하는 시간 동안 6mg/ml 이하의 PUA를 갖는다.
특정 구체예에서, 용액중의 0.5 내지 24mg의 유리카아제가 한번에 매 2 내지 4주에 투여된다. 유리카아제는 당업자에게 공지된 적당한 방식으로 예를 들어, 정맥내, 근내 또는 피하내 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여가 정맥내로 수행되는 경우, 0.5mg 내지 12mg의 유리카아제가 투여된다. 바람직하게는, 투여가 피하내로 수행되는 경우, 4 내지 24mg의 유리카아제가 투여된다. 바람직한 구체예에서, 유리카아제는 30 내지 240분 기간에 걸쳐 정맥내 투여된다. 한 구체예에서, 8mg의 유리카아제가 격주로 1회 투여된다. 특정 구체예에서, 주입은 100 내지 500mL 염수 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 용액중의 8mg의 유리카아제는 격주로 1회 또는 매 4주마다 1회 120분에 걸쳐 투여되며; 바람직하게는 유리카아제는 주입용 염수 250mL중에 용해된다. 특정 구체예에서, 유리카아제 투여는 3달, 6달, 8달 또는 12달의 처리 기간에 걸쳐 수행된다. 다른 구체예에서, 처리 기간은 12주, 24주, 36주 또는 48주이다. 특정 구체예에서, 처리 기간은 연장된 기간 예를 들어, 2년 이상 내지 처리될 피검체의 생존기까지일 수 있다. 또한, 비처리 기간이 삽입된 예를 들어, 6개월 처리 후 3개월 동안은 비처리, 이어서 6개월 처리 등과 같은 복합식 처리 기간이 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 항염증 화합물은 예방학적으로 투여되어 유리카아제 투여로 인한 주입 반응의 발생이 제거되거나 감소될 수 있다. 한 구체예에서, 하나 이상의 코르티코스테로이드, 하나 이상의 항히스타민, 하나 이상의 NSAID 또는 이들의 복합물이 투여될 수 있다. 유용한 코르티코스테로이드는 베타메타손, 부데소니드, 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손 및 트리암시놀론을 포함한다. 유용한 NSAID는 이부프로펜, 인도메타신, 나프록센, 아스프린, 아세토미노펜, 셀레콕시브 및 발데콕시브를 포함한다. 유용한 항히스타민은 아자타딘, 브롬페니르아민, 세티리진, 클로르페니라민, 클레마스틴, 시프로헵타딘, 데스롤라타딘, 덱스클로르페니르아민, 디멘히드리네이트, 디펜히드라민, 독실아민, 헥소펜아딘, 히드록시진, 로라타딘 및 페닌다민을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 항히스타민은 펙소펜아딘이며, NSAID는 아세트아미노펜이며, 코르티코스테로이드는 히드로코르티손 및/또는 프레드니손이다. 바람직하게는, 모두 세개의 복합물 (동시 투여될 필요는 없음)이 유리카아제 용액의 주입 전에 투여된다. 바람직한 구체예에서, NSAID 및 항히스타민은 유리카아제 주입 전 1 내지 4시간에 경구 투여된다. 펙소펜아딘의 적양합 투여량은 약 30 내지 약 180mg, 약 40 내지약 150mg, 약 50 내지 약 120mg, 약 60 내지 약 90mg, 약 60mg, 바람직하게는 60mg을 포함한다. 아세트아미노펜의 적합한 투여량은 약 500 내지 약 1500mg, 약 700 내지 약 1200mg, 약 800 내지 1100mg, 약 1000mg, 바람직하게는 1000mg을 포함한다. 히드로코르티손의 적합한 투여량은 약 100 내지 약 500mg, 약 150 내지 약 300mg, 약 200mg, 바람직하게는 200mg을 포함한다. 한 구체예에서, 항히스타민은 디펜히드라민이 아니다. 또 다른 구체예에서, NSAID는 아세트아미노펜이 아니다. 바람직한 구체예에서, 60mg의 펙소펜아딘은 유리카아제 주입 전날 밤에 경구 투여되며; 60mg의 펙소펜아딘 및 1000mg의 아세트아미노펜이 다음날 아침 경구 투여되고, 최종적으로 200mg의 히드로코르티손이 유리카아제 용액 주입 직전에 투여된다. 한 구체예에서, 프레드니손은 유리카아제 투여 전날 바람직하게는, 저녁에 투여된다. 프레디니손의 적합한 투여량은 5 내지 50mg, 바람직하게는 20mg을 포함한다. 특정 구체예에서, 주입 반응의 발생을 제거하거나 경감시키기 위한 이들의 예방학적 치료법이, 페길화된 유리카아제 및 비페길화된 유리카아제를 포함하는 유리카아제를 수용한 또는 수용하려는 피검체에 이용된다. 특정 구체예에서, 이러한 예방학적 치료법은 유리카아제 이외의 치료학적 펩티드를 수용한 또는 수용하려는 피검체에 대해 이용되며, 여기서 상기 치료학적 펩티디는 페길화되거나 비페길화된다.
본 발명의 구체예에서, 약제 조성물은 중합체에 컨쥬게이팅됨으로써 개질된 유리카아제를 포함하며, 상기 개질된 유리카아제는 요산분해 활성을 보유한다. 특정 구체예에서, 중합체-유리카아제 컨쥬게이트는 본원에 참고문헌으로 인용된 국제 특허 출원 WO 01/59078 및 U.S. 특허 09/501730에 기술된 바와 같이 제조된다.
본 발명의 구체예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 폴리프로필렌 글리콜, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 및 폴리비닐 알코올을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 구체예에서, 조성물은 각 유리카아제 서브유닛상에 2 내지 12개 중합체 분자, 바람직하게는, 유리카아제 서브유닛당 3 내지 10개의 중합체를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 각 중합체 분자는 약 1kD 내지 약 100kD의 분자량을 갖는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 각 중합체는 약 1kD 내지 약 50kD의 분자량을 갖는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 각 중합체는 약 5kD 내지 약 20kD, 약 8kD 내지 약 15kD, 약 10kD 내지 12kD, 바람직하게는 약 10kD의 분자량을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 각 중합체 분자는 약 5kD 또는 약 20kD의 분자량을 갖는다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 각 중합체 분자는 10kD의 분자량을 갖는다. 상이한 분자량의 혼합물이 또한 고려된다. 본 발명의 구체예에서, 조성물은 조성물의 반복된 투여에 적합하다.
특정 구체예에서, 유리카아제의 중합체로의 컨쥬게이션은 우레탄 결합, 이차 아민 결합 및 아미드 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 결합을 포함한다.
본 발명은 재조합 유리카아제의 아미노산 서열을 갖는 유리카아제를 생성할 수 있는 세포를 제공하며, 여기서 유리카아제는 1 - 20개 아미노산이 절두된 것이며, 변이된 아미노산 및 요산분해 활성을 갖는다.
본 발명은 유리카아제를 이용한 요산 대사 수단을 제공한다.
본 발명은 체액에서 요산 수준을 감소시키기 위한 유리카아제 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 유리카아제 조성물은 혈액을 포함하는 체액에서 요산을 저하시키는데 사용된다.
또한, 본 발명의 유리카아제를 엔코딩하는 신규한 핵산 분자가 제공된다. 이들의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유리카아제 핵산 서열은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 개질될 수 있다 (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). 이러한 서열은 실험관내에서 제한 엔도뉴클레아제에 의해 적합한 부위에서 절단된 후, 추가로 효소 개질화되고, 필요에 따라 분리되고 결찰될 수 있다. 유리카아제를 엔코딩하는 유전자의 생성시, 변형된 유전자가 번역 정지 시그날에 의해 중단되지 않도록 적합한 번역 리딩 프레임내에 유지되도록 주의를 기울여야 한다. 또한, 유리카아제-엔코딩 핵산 서열은 실험관내 또는 생체내에서 변이되어, 번역, 개시 및/또는 종료 서열을 생성시키고/거나 파괴하거나, 코딩 영역에서의 변이를 유도하고/거나 새로운 엔도누클레오제 부위를 형성하거나 이미 존재하는 부위를 파괴하고, 추가로 실험관내 변형을 촉진할 수 있다. 실험관내 부위 특이적 돌연변이원, TAB® 링커의 사용 (Pharmacia) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 당해분야에 공지된 변이원의 기법이 이용될 수 있다 (Hutchinoson, C., et al., 1978, J.Biol. Chem 253:6551).
유리카아제 단백질을 코딩하는 누클레오티드 서열은 적합한 박현 벡터 즉, 삽입된 단백질-코딩 서열을 전사 및 번역하는데 필요한 요소를 함유하는 벡터내로 삽입될 수 있다. 다양한 숙주-벡터 시스템이 사용되어 단백질-코딩 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들로는 바이러스 (예를 들어, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등) 감염된 포유동물 세포계; 바이러스 (예를 들어, 바쿨로바이러스) 감염된 곤충 세포계; 효모 벡터를 함유하는 효모와 같음 미생물 또는 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질변환된 박테리아를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이들 벡터의 발현 요소는 이들의 강도 및 특이성에 있어서 다양하다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라, 많은 적합한 전사 및 번역 요소중 하나가 사용될 수 있다.
DNA 단편을 벡터로 삽입하기 위한 공지된 임의의 방법이 이용되어 적합한 전사/번역 조절 시그널 및 단백질 코딩 서열로 이루어진 키메라 유전자를 함유하는 발현 벡터가 작제될 수 있다. 이들 방법은 실험관내 재조합 DNA 및 합성 기법 및 생체내 재조합 (유전자 재조합) 기법을 포함할 수 있다. 유리카아제 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열의 발현은, 유리카아제 단백질이 재조합 DNA 분자로 형질변형된 숙주에서 발현되도록 이차 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 유리카아제의 발현은 당해분야에 공지된 프로모터/인핸서 요소에 의해 조절될 수 있다. 유리카아제 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 로우스 사르코마 바이러스 (Rous sarcoma virus)의 3' 장쇄 말단 반복부에 함유된 프로모터 (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), 메탈로티오닌 유전자의 조정 서열 (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 원핵생물 발현 벡터 예컨대, β-락타마아제 프로모터 (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 75:3727-3731), tac 프로모터 (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 80:21-25), 및 osmB 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 핵산은 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된 유리카아제를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
핵산 서열 엔코딩을 포함하는 특정 재조합 DNA 분자가 제조되고 분리되면, 당해분야의 여러 공지된 방법을 이용하여 이를 증식시킬 수 있다. 적합한 숙주 시스템 및 성장 조건이 성립되면, 재조합 발현 벡터가 증식되고, 적량으로 제조될 수 있다. 이전에 설명된 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터는 하기 벡터 또는 이들의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 인간 또는 동물 바이러스 예컨대, 백시니아 바이러스 또는 아데노바이러스; 곤충 바이러스 예컨대, 바쿨로바이러스; 효모 벡터; 박테리오파아지 벡터 (예를 들어, 람다) 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 요망되는 특정 형태로 유전자 생성물을 개질하고 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 특정 프로모터로부터의 발현은 특정 유도제의 존재하에 상승될 수 있으며; 따라서 유전적으로 조작된 유리카아제 단백질의 발현이 조절될 수 있다. 또한, 여러 숙주 세포가 번역 및 후번역 프로세싱 및 단백질의 개질 (예를 들어, 글리코실화, 절단)을 위한 특이적 메카니즘 및 특징을 갖는다. 적합한 세포주 또는 숙주계가 발현된 외래 단백질의 요망되는 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다. 여러 벡터/숙주 발현 시스템이 여러 크기로의 단백질 분해 절단과 같은 프로세싱 반응을 수행할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 대장균에서 유리카아제의 발현은 바람직하게는, osmB 프로모터를 포함하는 벡터를 사용하여 수행된다.
실시예 1. 유리카아제 발현을 위한 유전자 및 발현 플라스미드의 작제
재조합 포르신 유리카아제 (유레이트 옥시다아제) 즉, Pig-KS-ΔN (아미노산 291 및 301번이 각각 리신 및 세린으로 대체된 아미노 말단 절두된 피그 유리카아제 단백질)을 대장균 K-12 균주 W3110F-에서 발현시켰다. 일련의 플라스미드를 pOUR-P-ΔN-ks-1에 완결되도록 작제하고, 이는 대장균 숙주 세포의 형질변환시 유효한 유리카아제 발현을 유도할 수 있다.
피그 및 비비 간으로부터의 유리카아제 cDNA의 분리 및 서브글로닝
유리카아제 cDNA를 관련 RAN의 분리 및 서브클로닝에 의해 피그 및 비비 간으로부터 제조하였다. 전체 세포성 RNA를 피그 및 비비 간으로부터 추출하고 (Erlich, H.A. (1989). PCR Technology; Principles and Application for DNA Amplification; Sambrook, J., et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition; Ausubel, F. M. et al. (1998). Current protocols in molecular Biology), 퍼스트-스트랜드 cDNA 합성 키트 (First-Strand cDNA Synthesis Kit: Pharmacia Biotech)를 사용하여 역전사시켰다. Taq DNA 중합효소를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다 (Gibco BRL, Life Technologies).
피그 및 비비 유레이트 옥시다아제 (유리카아제)의 PCR 증폭에 사용된 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 표 1에 도시하였다.
표 1. 유리카아제 cDNA의 PCR 증폭을 위한 프라이머
피그 간 유리카아제: 센스
Figure 112007080520848-PCT00002
(SEQ ID NO. 1) 안티-센스
Figure 112007080520848-PCT00003
(SEQ ID NO. 2) 비비 (D3H) 간 유리카아제: 센스
Figure 112007080520848-PCT00004
(SEQ ID NO.3) 안티-센스
Figure 112007080520848-PCT00005
(SEQ ID NO. 4)
프라이머의 말단에 유입되고 표 1의 하단에 기재된 제한 효소 서열은 센스 EcoRI 및 NcoI (피그 및 비비) 및 안티-센스 NcoI, HindIII 및 XbaI (피그), XbaI 및 NcoI (비비)이다. 비비 센스 프라이머에서, 비비 유리카아제에 존재하는 세번 째 코돈 GAC (아스파르트산)를, 인간 유레이트 옥시다아제 의사유전자의 코딩 서열내 이 위치에 존재하는 코돈인 CAC (히스티딘)으로 대체시켰다. 이들 프라이머를 사용하여 생성된 재조합 비비 유리카아제 작제물을 D3H 비비 유리카아제로 명명하였다.
피그 유리카아제 PCR 생성물을 EcoRI 및 HindIII으로 분해하고, pUC18로 클로닝시켜 pUC18-피그 유리카아제를 생성시켰다. D3H 비비 유리카아제 PCR 생성물을 TA 클로닝 (TA CloningTM; Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 pCRTMII 벡터로 직접 클로닝시켜, pCRTMII-D3H 비비 유리카아제를 생성시켰다.
결찰된 cDNA를 사용하여 대장균 XL1-블루 (XL1-Blue: Stratagene, La Jolla, CA)를 형질변환시켰다. 클로닝된 유리카아제 cDNA를 함유하는 플라스미드 DNA를 제조하고, 공개된 유리카아제 DNA 코딩 서열 (비비 유리카아제에서 D3H 치환물 제외, 표 1에 도시됨)을 갖는 클론을 선택하고 분리하였다. 선택된 pCRTMII-D3H 비비 유리카아제 클론에서, pCRTMII 서열은 유리카아제 정지 코돈 옆에 존재하며, PCR에 의해 유입된 서열이 결실된 것이다. 그 결과, 3' 비번역된 영역으로부터의 XbaI 및 NcoI 제한 부위를 제거하고, PCR 생성물의 5' 말단에서 NcoI, 및 pCRTMII 벡터로부터 유래된 BamHI를 사용하여 직접 클로닝시켰다.
유리카아제 cDNA의 pET 발현 벡터로의 서브클로닝
비비 유리카아제 서브클로닝
전장 유리카아제 코딩 서열을 함유하는 D3H 비비 cDNA를 pET-3d 발현 벡터에 유입시켰다 (Novagen, Madison, WI). pCRTMII-D3H 비비 유리카아제를 NcoI 및 BamHI로 분해하고, 960bp 단편을 분리하였다. 발현 플라스미드 pET-3d를 NcoI 및 BamHI로 분해하고, 4600bp 단편을 분리하였다. 두 단편을 결찰시켜 pET-3d-D3H-비비를 생성시켰다.
피그-비비 키메라 유리카아제 서브클로닝
재조합 유전자의 더 높은 발현, 안정도 및 활성을 획득하기 위해 피그-비비 키메라 (PBC) 유리카아제를 작제하였다. pET-3d-D3H-비비 클론으로부터 4936bp NcoI-ApaI 단편을 분리하고, 분리된 단편을, pUC18-피그 유리카아제로부터 분리된 624bp NcoI-ApaI 단편과 결찰시켜, pET-3d-PBC를 형성시킴으로써 PBC를 작제하였다. PBC 유리카아제 cDNA는 인-프레임에 속한 피그 유리카아제 코돈 1-225 내지 비비 유리카아제의 코돈 226-304로 이루어진다.
피그-KS 유리카아제 서브클로닝
추가적인 페길화 부위를 제공할 수 있는 하나의 리신 잔기를 첨가하기 위해 피그-KS 유리카아제를 작제하였다. KS는 피그 유리카아제의 위치 291번에 아르기닌 대신 리신이 아미노산 삽입된 것을 의미한다 (R291K). 또한, 위치 301에서 트레오닌은 세린으로 대체된다 (T301S). PigKS 유리카아제 플라스미드는 pET-3d-D3H-비비의 4696bp NcoI-NdeI 단편을 분리함으로써 작제하고, 이를 pUC18-피그 유리카아제로부터 분리된 864bp NcoI-NdeI 단편과 결찰시켜 pET-3d-PigKS를 형성시켰 다. 생성된 PigKS 유리카아제 서열은 인-프레임에 속하는 피그 유리카아제 코돈 1-288 내지 비비 유리카아제의 코돈 289-304로 이루어진다.
osmB 프로모터의 조절하의 유리카아제 서열의 서브클로닝
유리카아제 유전자를 osmB 프로모터를 함유하는 발현 벡터내로 서브클로닝하였다 (본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 출원 5,795,776의 교시에 따라). 이러한 벡터는 높은 삼투압 또는 배양 숙성에 반응하여 단백질 발현을 유도할 수 있다. 발현 플라스미드 pMFOA-18은 osmB 프로모터, 리보좀 결합 부위 서열 (rbs) 및 전사 종결 서열 (ter)을 함유하였다. 이는 암피실린 내성을 부여하고 (AmpR), 재조합 인간 아세틸콜린 에스테라아제 (AChE)를 발현한다.
D3H-비비 유리카아제의 서브클로닝
플라스미드 pMFOA-18을 NcoI 및 BamHI로 분해하고, 큰 단편을 분리하였다. 작제물 pET-3d-D3H-비비를 NcoI 및 BamHI로 분리하고, D3H 비비 유리카아제 유전자를 포함하는 960bp 단편을 분리하였다. 이러한 두개의 단편을 결찰시켜 pMFOU18을 생성시켰다.
발현 플라스미드 pMFXT133은 osmB 프로모터, rbs (대장균 deo 오페론), ter (대장균 트립A), 재조합 인자 Xa 억제제 폴리펩티드 (FxaI)를 함유하며, 이는 테트라시클린 내성 유전자 (TetR)를 부여하였다. 항생제 내성 유전자를 교환하기 위해 비비 유리카아제 유전자를 이러한 플라스미드에 삽입하였다. 플라스미드 pMFOU18을 NcoI로 분해하고, 필드-인(filled-in)시키고, 이를 XhoI로 분해하고, 1030bp 단편을 분리하였다. 플라스미드 pMFXT133을 NdeI로 분해하고, 필드-인시키고, 이를 XhoI로 분해하고, 더 큰 단편을 분리하였다. 두개의 단편을 결찰시켜 비비 유리카아제 박현 벡터 pURBA16을 생성시켰다.
피그 비비 키메라 유리카아제의 서브클로닝
플라스미드 pURBA16을 ApaI 및 AlwNI로 분해하고, 2320bp 단편을 분리하였다. 플라스미드 pMFXT133을 NdeI로 분해하고, 필드-인시키고, 이를 AlwNI로 분해하고, 620bp 단편을 분리하였다. 작제물 pET-3d-PBC를 XbaI로 분해하고, 필드-인시키고, 이를 ApaI으로 분해하고, 710bp 단편을 분리하였다. 3개의 단편을 결찰시켜 pET-3d 벡터로부터 유래된, T7 rbs 뿐만 아니라 osmB 프로모터의 조절하에 PBC 유리카아제를 발현하는 플라스미드인 pUR-PB를 생성시켰다.
T7 rbs를 추가 단계에서 절제하였다. pUR-PB를 NcoI로 분해하고, 필드-인시키고, AlwNI로 분해하고, 3000bp 단편을 분리하였다. 플라스미드 pMFXT133을 NdeI로 분해하고, 필드-인시키고, AlwNI로 분해하고, 620bp 단편을 분리하였다. 두개의 단편을 결찰시켜 pDUR-PB를 형성시키고, 이는 osmB 프로모터의 조절하에 PBC를 발현한다.
pOUR-PB-ΔNC의 작제
유리카아제 cDNA에 여러 변화를 유도하여, 재조합 효소 안정도를 실질적으로 증가시켰다. 플라스미드 pOUR-PBC-ΔNC를 작제하고, 여기서 생체내 퍼옥시조말 표적 시그널로서 작용하는 N-말단 6개-변이 펩티드 및 C-말단에서의 트리-펩티드 모두를 제거하였다. 이는 표 2에 기술된 특이적 올리고누클레오티드 프라이머 및 플라스미드 pDUR-PB의 PBC 서열을 이용함으로써 PCR 증폭에 의해 수행하였다.
표 2. PBC-ΔNC 유리카아제의 PCR 증폭을 위한 프라이머
PBC-ΔNC 유리카아제: 센스
Figure 112007080520848-PCT00006
안티-센스
Figure 112007080520848-PCT00007
(SEQ ID NO 6)
제한 효소 서열을 굵게 표시한 프라이머의 말단에 유입시키고, 비코딩 영역을 표 2의 하단에 나타내었다. NdeI는 센스이며, XbaI는 안티-센스이다. 안티-센스 프라이머를 이용하여, 아미노산 서열에 영향을 끼치지 않는 점 돌연변이 (밑줄)를 유도함으로써 내부 NdeI 제한 부위를 제거하고, NdeI를 사용하여 서브클로닝을 촉진시켰다.
pDUR-PB의 PCR 증폭에 의해 생성된 900개 염기쌍 단편을 NdeI 및 XbaI로 절단하고 분리하였다. 그 후, 수득된 단편을, 대장균으로부터 유래된 rbs 및 deo-P1P2 프로모터를 잠복시키고 인간 재조합 인슐린 전구체를 구성적으로 발현하는 deo 발현 플라스미드 pDBAST-RAT-N으로 삽입시켰다. 플라스미드를 NdeI 및 XbaI로 분해하고, 4035bp 단편을 분리하고, PBC-유리카아제 PCR 생성물로 결찰시켰다. 생성된 작제물인 pDUR-PB-ΔNC를 사용하여, 활성의 절두된 유리카아제를 높은 수준으로 발현하는 대장균 K-12 SΦ733 (F-cytR strA)를 형질변형시켰다.
이중으로 절두된 PBC-ΔNC 서열을 또한, osmB 프로모터의 조절하에 발현시켰다. 플라스미드 pDUR-PB-ΔNC를 AlwNI-NdeI로 분해하고, 3459bp 단편을 분리하였다. 상기 기술된 pMFXT133을 NdeI-AlwNI로 분해하고, 660bp 단편을 분리하였다. 그 후, 단편을 결찰시켜 pOUR-PB-ΔNC를 생성시키고, 이를 대장균 K-12 균주 W3110 F-에 유입시키고, 이는 활성의 절두된 유리카아제를 높은 수준으로 발현하였다.
유리카아제 발현 플라스미드 pOUR-P-ΔN-ks-1의 작제
재조합 효소의 활성 및 안정도를 증대시키기 위해 본 플라스미드를 작제하였다. Pig-KS-ΔN 유리카아제를 단지 N-말단에서 절두하였으며 (ΔN), 여기서 6개의 잔기 N-말단 변이 펩티드를 제거하였으며, 변이체 S46T, R291K 및 T301S를 함유하였다. 46번 위치에는 PCR 증폭 및 클로닝 동안 발생하는 보존적 변이로 인해 세린 대신에 트레오닌 잔기가 위치한다. 291번 위치에서, 리신이 아르기닌을 대체하고, 301번 위치에서 세린이 트레오닌을 대신 삽입되었다. 이 둘 모두는 비비 유리카아제 서열로부터 유래되었다. R291K 및 T301S를 변형시켜 KS를 설계하였으며, 상기 논의된 바와 같다. 여분의 리신 잔기를 추가의 잠재적인 페길화 부위에 제공하였다.
pOUR-P-ΔN-ks-1 (도 1)를 작제하기 위해, 플라스미드 pOUR-PB-ΔNC를 ApaI-XbaI으로 분해하고, 3873bp 단편을 분리하였다. 플라스미드 pET-3d-PKS (도 4에 도시된 바와 같은 구성)를 ApaI-SpeI로 분해하고, 270bp 단편을 분리하였다. SepI 절단은 5' CTAG 연장부를 방치시키며, 이는 XbaI에 의해 생성된 DNA 단편에 효과적으로 결찰된다. 두개의 단편을 결찰시켜 pOUR-P-ΔN-ks-1을 생성시켰다. 결찰 후, SpeI 및 XbaI 인지 부위가 손실되었다 (이들의 부위는 도 9의 괄호안에 나타냄). 작제물 pOUR-P-ΔN-ks-1을 대장균 K-12 균주 W3110F-인 자가영양적 ATCC #27325에 유입시켰다. osmB 프로모터의 조절하에 발현된 생성 Pig-KS-ΔN 유리카아제는 우수한 활성 및 안정도를 갖는 높은 수준의 재조합 효소를 생성시킨다.
도 1은 플라스미드 pOUR-P-ΔN-ks-1의 구조를 나타낸다. 제한 부위 옆의 숫자는 1로 나타낸 HaeII 위치에 대한 누클레오티드 위치를 나타내며; 클로닝 동안 손실된 제한 부위는 괄호안에 마킹하였다. Pig-KS-ΔN 유리카아제를 엔코딩하는 플라스미드 pOUR-P-ΔN-ks-1은 4143 염기쌍 (bp) 길이이며, 하기 요소를 포함한다:
1. 누클레오티드 1번부터 NdeI 부위 (위치 113번)에 이르는 113bp 길이의 DNA 단편으로서, osmB 프로모터 및 리보좀 결합 부위 (rbs)를 포함하는 단편.
2. NdeI (위치 113번) 내지 SpeI/XbaI 접합부 (위치 1045번)에 이르는 932bp 길이의 DNA 단편으로서, 900bp의 Pig-KS-ΔN (아미노산 291번 및 301번이 각각 리신 및 세린으로 대체된 아미노 말단 절두된 피그 유리카아제 단백질의 핵산 서열) 코딩 영역 및 TA 클로닝 부위 업스트림 내지 SpeI/XbaI 제한 부위에 이르는, pCRTMII으로부터 유래된 32bp 플랭킹 서열을 포함하는 단편.
3. SpeI/XbaI 접합부 (위치 1045) 내지 HindIII (위치 1070)에 이르는 25bp 다중 클로닝 부위 서열 (MCS).
4. HindIII (위치 1070) 및 AatII (위치 1110) 말단과 TrpA 전사 종결제 (ter)을 함유하는 합성 40bp 올리고누클레오티드.
5. 테트라시클린 내성 유전자 (TetR)를 포함하는 pBR322상의 AatII (위치 1110) 내지 MscI/ScaI (위치 2629) 부위에 이르는 1519bp 길이의 DNA 단편.
6. DNA 복제 오리진을 포함하는 pBR322상의 ScaI (위치 2629) 내지 HaeII (위치 4143) 부위에 이르는 1514bp 길이의 DNA 단편.
도 2는 Pig-KS-ΔN 유리카아제의 DNA 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 본 도면에서, 아미노산 넘버링은 완전 피그 유리카아제 서열에 따른 것이다. 개시제 메티오닌 잔기 이후, 트레오닌을 피그 유리카아제 서열의 아스파르트산 위치에 삽입하였다. 이러한 트레오닌 잔기는 박테리아 아미노펩티다아제에 의해 메티오닌의 제거를 가능하게 한다. 아미노산 서열중의 gap는 제거된 N-말단 변이 펩티드를 나타낸다. 다양한 유리카아제 서열의 서브클로닝의 다양한 단계에 사용되는 제한 부위 (ApaI, NdeI, BamHI, EcoRI 및 SpeI)를 나타내었다. 하단의 문자에 나타낸 3' 비번역된 서열은 pCRTMII 서열로부터 유래된다. 번역 정지 코돈은 별표로 나타내었다.
도 3은 다양한 재조합 유리카아제 서열의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 상위 라인은 피그 유리카아제이며, 전체 아미노산 서열을 포함한다. 두번째 라인은 이중으로 절두된 피그-비비 키메라 유리카아제 (PBC-ΔNC)의 서열이다. 세번째 라인은 Pig-KS-ΔN 유리카아제의 서열을 나타내며, 이는 N-말단에서만 절두되었으며, 변이부 S46T 및 아미노산 교체부 R291K 및 T301S를 함유하며, 이 둘은 유리카아제 코딩 서열의 카르복시 말단의 비비 오리진을 반영한다. 별표는 공개된 피그 유리카아제 서열과 비교하여 Pig-KS-ΔN의 상이한 아미노산의 위치를 나타낸다; 동그라미는 PBC-ΔN인 피그-비비 키메라와 비교하여 Pig-KS-ΔN의 상이한 아미노산의 위치를 나타낸다; 점선은 아미노산의 결실을 나타낸다.
Y97H 변이부를 갖는 천연 비비, 피그 및 래빗 유리카아제에 대한 cDNA, 및 피그/비비 키메라 (PBC)를 대장균으로 클로닝하기 위해 작제하였다. 높은 수준의 유리카아제 변이체를 발현하는 클론을 작제하고, 모두 W3110F- 대장균이며, 발현이 osmB에 의해 조절되는 방식으로 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고, DNA 시퀀싱 및 제한 효소 검정에 의해 확인하고, 세포를 배양하였다.
pig-ΔN 및 Pig-KS-ΔN를 포함하는 절두된 유리카아제의 작제는 PBC-ΔNC와 Pig-KS 간의 교차-결찰 이어서, 각각 제한 엔도누클레아제 ApaI와 XabI, 및 ApaI와 SpeI로 절단함으로써 수행하였다. 이러한 절두된 변이체는 N-말단의 6개 잔기 즉, "변이 펩티드" (1-2) 및 C-말단 트리-펩티드 "퍼옥시조말 표적 시그널" (3-5)이 효소 활성에 현저하게 영향을 끼치는 기능을 갖지 않기 때문에 활성을 보유하는 것이 타당하며, 이들 서열이 면역원성일 수 있음이 가능하다. 유리카아제 변이체를 매우 높은 수준으로 발현하는 클론을 선택하였다.
실시예 2. 발현 플라스미드의 A 박테리아 숙주 세포로의 형질변형
발현 플라스미드 pOUR-P-ΔN-ks-1을 대장균 K-12 균주 W3110F-로 유입시켰다. 루리아 브로쓰 (LB)에서 미드 로그 단계까지 성장한 박테리아 세포를 형질변환을 위해 준비하고, 세포를 원심분리에 의해 채취하고, 냉수로 세척하고, 물중의 10% 글리세롤중에 ml 당 약 3 x 1010 세포의 농도로 현탁시켰다. 세포를 나누어서 -70℃에 저장시켰다. 플라스미드 DNA를 에탄올중에 침전시키고, 물중에 용해시켰 다.
박테리아 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하고, BIO-RAD로부터의 진 펄서 II (Gene Pulser II)를 사용하여 고압 일렉트로포레이션에 의해 수행하였다 (Trevors et al (1992). Electrotransformation of bacteria by plasmid DNA, in Guide to Electroporation and Electrofusion (D.C. Chang, B.M. Chassy, J.A. Saunders and A.E. Sowers, eds.), pp. 265-290, Academic Press Inc., San Diego, Hanahan et al (1991) Meth. Enzymol., 204, 63-113). 형질변형된 세포를 SOC 배지 (2% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM 글루코오스)에 현탁시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 테트라시클린 내성에 대해 선택하였다. 높은 발현체 클론을 선택하였다.
실시예 3. 재조합 유리카아제 제조
형질변형된 박테리아 (상기 참조)와 같은 박테리아를 글루코오스 함유 배지에서 약 37℃에서 배양시키고; pH는 7.2±0.2로 유지시켰다.
배양 마지막 5-6시간에 있어서, 배지에 KCl를 0.3M의 최종 농도가 되도록 보충하였다. 배양을 계속하여 유리카아제가 축적되게 하였다.
재조합 유리카아제를 봉입체 (IB)와 유사한 불용성 침전물로서 박테리아 세포내에 축적시켰다. 세포 현탁물을 원심분리에 의해 세척하고, 50mM 트리스 완충제, pH8.0 및 10mM EDTA중에 현탁시키고, 최종 부피는 건조 세포 중량의 약 40배가 되게하였다.
재조합 유리카아제 함유 IB를 리소자임 및 고압을 이용하여 박테리아 세포의 분해후 원심분리에 의해 분리하였다. 리조자임 (2000-3000 유닛/ml)으로 16-20시간 동안 pH 8.0 및 7±3℃에서 처리하면서 혼합하였다. 펠렛을 물로 세척하고, 사용시까지 -20°에서 저장하였다.
50mM NaHCO3 완충제 pH 10.3±0.1에 현탁시킨 후 풍부 IB를 추가로 처리하였다. 현탁물을 밤새 실온에서 인큐베이션하여 IB-유래된 유리카아제를 용해시킨 후, 원심분리에 의해 정제하였다.
유리카아제를 여러 크로마토그래피 단계에 의해 추가로 정제하였다. 초기에는, Q-세파로오스 FF 칼럼상에서 크로마토그래피를 수행하였다. 로딩된 칼럼을 150mM NaCl을 함유하는 중탄산염 완충제로 세척하고, 유리카아제를 250mM NaCl을 함유하는 중탄산염 완충제로 용리시켰다. 그 후, 크산틴-아가로스 수지 (Sigma)를 사용하여 유리카아제 제조물로부터의 소량의 불순물을 제거하였다. Q-세파로오스 FF 용리물을 50mM 글리신 완충제 pH 10.3±0.1로 희석하여 단백질 농도가 약 0.25mg/ml가 되게하고 로딩하였다. 칼럼을 100mM NaCl을 함유하는 중탄산염 완충제 pH 10.3±0.1로 세척하고, 유리카아제를 60μM 크산틴으로 보충된 동일한 완충제로 용리시켰다. 본 단계에서, 유리카아제를 Q-세파로오스 크로마토그래피에 의해 재정제하여 응집된 형성물을 제거하였다.
각 유리카아제 제조물의 순도는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정한 경우 95%를 초과하였다. 0.5% 미만의 응집된 형성물을 수퍼덱스 200 칼럼을 사용하 여 각 제조물에서 검출하였다.
표 3은 25L 발효 브로쓰로부터 유래된 IB로부터의 Pig-KSΔN 유리카아제의 정제를 요약하였다.
표 3. Pig-KSΔN 유리카아제의 정제
정제 단계 단백질 (mg) 활성 (U) 비활성 (U/mg)
IB 용해 12,748 47,226 3.7
정화 용액 11,045 44,858 4.1
Q-세파로오스 I - 주요 풀 7,590 32,316 4.3
크산틴 아가로오스 - 주요 풀 4,860 26,361 5.4
Q-세파로오스 II - 주오 풀 4,439 22,982 5.2
30kD UF 보유액 4,262 27,556 6.5
실시예 4. 재조합 유리카아제의 특징
SDS-PAGE
고도로 정제된 유리카아제 변이체의 SDS-PAGE 분석 결과 (도 4) 다소 독특한 패턴이 나타났다. 샘플을 탄산염 완충제 pH 10.3중에 4℃에서 수개월 까지 저장시켰다. 전장 변이체인 피그, 피그-KS 및 PBC는 분자량이 약 20 내지 15kD인 두개의 주요 분해 생성물의 축적물을 나타낸다. 이러한 관찰은 적어도 단일 니크 (nick)가 유리카아제 서브유닛 분자를 분할하였음을 시사한다. 상이한 분해 패턴이 짧아진 아미노 말단 클론에서 검출되었으며, 래빗 유리카아제에서도 또한 더 낮은 빈도로 검출되었다. 래빗의 아미노 말단은 짧아진 클론의 아미노 말단과 유사하다. 정제 및 저장 동안 생성된 유리카아제 단편의 아미노 말단 서열을 측정하였다.
펩티드 시퀀싱
벌크 유리카아제 제조물의 N-말단 시퀀싱을 에드먼 분해 방법 (Edman degradation method)을 이용하여 수행하였다. 재조합체 피그 유리카아제 (전체 클 론 길이)가 Pig-KS-ΔN와 비교하여 더 많은 분해 단편을 생성시켰다. 분해 단편을 유도하는 추론된 절단 부위는 다음과 같다:
1) 하기 서열을 갖는 168번 위치에서의 메이저 부위:
-- QSG ↓ FEGFI --
2) 하기 서열을 갖는 142번 위치에서의 마이너 부위:
-- IRN ↓ GPPVI--
상기 서열은 임의의 공지된 단백질 분해 절단을 암시하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 단백질 분해 또는 특정 화학 반응으로부터 절단이 발생할 수 있다. 아미노-절두된 유리카아제는 놀랍게도 아미노 비절두된 유리카아제보다 더욱 안정적이었다. PBC-ΔNC는 기타 ΔN 분자와 유사한 안정도를 가지며, 아미노-비절두된 PBC 보다는 낮은 안정도를 갖는다.
포텐시
유리카아제의 활성을 UV 방법에 의해 측정하였다. 292nm 흡광도에서 요산의 알란토인으로의 산화로부터 유도된 효소 반응 속도의 감소를 측정함으로써 효소 반응 속도를 측정하였다. 1 활성 유닛은 특정 조건하에서 25℃하에 분당 요산 1μmol을 산화하는데 요구되는 유리카아제의 적량으로서 규정된다. 유리카아제 포텐시는 단백질 mg 당 활성 유닛으로 나타내었다 (U/mg).
292nm에서의 1mM 요산의 흡광곁수는 12.2mM-1cm-1이다. 따라서, 반응 혼합물 ml당 요산 1μmol의 산화가 1.2mA292의 흡광도 감소를 초래하였다. 시간에 따른 흡 광도 변화 (분당 ΔA292)를 곡선의 선형 부분으로부터 유도하였다.
단백질 농도를 변형된 브래드포드 방법을 이용하여 측정하였다 (Macart and Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122:93-101). 유리카아제의 비활성 (포텐시)은, 활성 (U/ml)을 단백질 농도 (mg/ml)로 나눔으로써 계산하였다. 다양한 재조합체 유리카아제의 효소 활성 결과는 표 4에 요약되어 있다. 시중 제조물의 결과는 비교 값으로써 표에 포함되어 있다. 이들 결과로부터, 유리카아제 단백질의 절두가 이들의 효소 활성에 현저한 영향을 끼치지 않음이 자명하다.
표 4. 재조합체 및 천연 유리카아제의 동적 파라미터의 요약
유리카아제 스톡의 농도(1) (mg/ml) 비활성 (U/mg)(2) Km (μM 요산) Kcat(5)(1/min)
재조합체
Pig 0.49 7.41 4.37 905
Pig-ΔN 0.54 7.68 4.04 822
Pig-KS 0.33 7.16 5.27 1085
Pig-KS-ΔN 1.14 6.20 3.98 972
PBC 0.76 3.86 4.87 662
PBC-ΔNC 0.55 3.85 4.3 580
래빗 0.44 3.07 4.14 522
천연
Pig (시그마) 2.70 3.26(3) 5.85 901
A. 플라부스 (Merck) 1.95 0.97(3) 23.54 671
표 4 주해:
(1) 단백질 농도를 10mg/ml 유리카아제 용액에 대해 11.3의 흡광곁수를 이용하여 278nm에서 측정된 흡광도에 의해 결정하였다 (Mahler, 1963).
(2) 1 유닛의 유리카아제 활성은 25℃에서 분당 1μmole의 요산을 알란토인으로 산화시키는 효소의 양으로서 규정된다.
(3) 비활성 값은 60μM에 상응하는 기질의 농도에서 라인웨버-버크 플롯 (Lineweaver-Burk plot)으로부터 유래된다.
(4) 반응 혼합물은 하기 스톡 용액의 다양한 배합으로 이루어진다:
100mM 붕산나트륨 완충제, pH 9.2
50mM 붕산나트륨 완충제 (pH 9.2)중의 300μM 요산 완충제
50mM 붕산나트륨 완충제중 (pH 9.2)의 1mg/ml BSA
(5) Kcat는 Vmax (각각의 라인웨버-버크 플롯으로부터 계산)를 반응 혼합물중의 유리카아제의 농도 (유리카아제의 테트라머 분자량에 기초하여 mol 등가로 나타냄)로 나눔으로써 계산하였다.
실시예 5. 유리카아제와 m-PEG와의 컨쥬게이션 (페길화)
Pig-KS-ΔN 유리카아제를 m-PEG-NPC (모노메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-니트로페닐 카르보네이트)를 사용하여 컨쥬게이션시켰다. 유리카아제 서브유닛당 5, 10 또는 20k kD PEG의 2 - 12 스트랜드를 유도하는 상태를 확립시켰다. m-PEG-NPC를 단백질 용액에 점차적으로 첨가하였다. PEG 첨가를 완료시킨 후, 최대 비결합된 m-PEG 스트랜드가 유리카아제에 컨쥬게이션될 때 까지, 유리카아제/m-PEG-NPC 반응 혼합물을 16-18시간 동안 2-8℃에서 인큐베이션시켰다.
PEG-유리카아제 단량체당 PEG 스트랜드의 수를 PEG 및 유리카아제 스트랜드를 사용하여, 슈퍼로오스 6 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 측정하였다. 서브유닛당 결합된 PEG 스트랜드의 수를 하기 식으로 결정하였다:
Figure 112007080520848-PCT00008
PEG-유리카아제 샘플중의 PEG 및 단백질 부분의 농도를 일련의 정렬된 자외선 (UV) 및 굴절지수 (RI) 검출기를 사용함으로써 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정하였다 (Kunitani, et al., 1991). 3개의 검정 곡선을 유도하였다: 단백질 곡선 (220nm에서 측정된 흡수도); 단백질 곡선 (RI에 의해 측정); 및 PEG 곡선 (RI에 의해 측정). 그 후, PEG-유리카아제 샘플을 동일한 시스템을 이용하여 분석하였다. 실험 샘플의 생성된 UV 및 RI 피크 영역값을 사용하여 검정 곡선에 관련하여 PEG 및 단백질의 농도를 계산하였다. 3.42의 지수는 10kD PEG 분자량에 대한 유리카아제 단백질의 분자량 (34,192 달톤)의 비이다.
부착된 PEG는 생리학적 pH 값을 갖는 용액중의 유리카아제의 용해도를 향상시켰다. 표 5는 페길화된 Pig-KS-ΔN 유리카아제 생성물의 배치 간의 변화성을 나타낸다. 일반적으로, 부착된 PEG 스트랜드의 수와 효소의 보유된 비활성 (SA)은 역관계이다.
표 5. 페길화된 Pig-KS-ΔN 유리카아제 컨쥬게이트의 효소 활성
컨쥬게이트 배치 PEG MW (kD) 유리카아제 서브유닛당 PEG 스트랜드 유리카아제 SA (U/mg) 대조군의 SA %
ΔN-Pig-KS - - 8.2 100
1-17# 5 9.7 5.8 70.4
LP-17 10 2.3 7.8 94.6
1-15# 10 5.1 6.4 77.9
13# 10 6.4 6.3 76.9
14# 10 6.5 6.4 77.5
5-15# 10 8.8 5.4 65.3
5-17# 10 11.3 4.5 55.3
4-17# 10 11.8 4.4 53.9
1-18# 20 11.5 4.5 54.4
실시예 6. 유리카아제의 1000D 및 100,000D PEG로의 페길화
실시예 5에 기술된 바와 같이 1000D 및 100,000D m-PEG-NPC를 사용하여 Pig- KS-ΔN 유리카아제를 컨쥬게이션시켰다. 유리카아제 서브유닛당 2-11개 스트랜드의 PEG를 유도하는 조건을 이용하였다. PEG 첨가가 완료된 후, 최대 비결합된 m-PEG 스트랜드가 유리카아제에 컨쥬게이션될 때 까지 유리카아제/m-PEG-NPC 반응 혼합물을 2-8℃에서 16-18시간 동안 인큐베이션시켰다.
PEG-유리카아제 단량체 당 PEG 스트랜드의 수를 상기 기술된 바와 같이 측정하였다.
부착된 PEG는 생리학적 pH 값을 갖는 용액중의 유리카아제의 용해도를 증가시켰다.
실시예 7. PEG로 컨쥬게이션된 Pig-KS-ΔN 유리카아제의 약동학
치료학적 이점을 제공하는데 요구되는 페길화의 최적 범위 및 크기를 결정하기 위해 생물학적 실험을 수행하였다.
체중 kg 당 0.4mg (2U)의 비변형된 유리카아제를 1일 및 8일에 정맥내 주입한 래트에서의 약동학 연구 결과 약 10분의 순환 반감기를 유도하였다. 그러나, 9주마다 가능한 많은 양의 주입 후 2-11x 10kD PEG-Pig-KS-ΔN 유리카아제로의 래트에서의 제거 속도 연구 결과, 제거는 (이 범위내의) PEG 스트랜드 수에 의존적이지 않으며, 연구 과정에 결쳐 비교적 일정하게 유지되었다 (표 6 참조: 약 30시간의 반감기). 주간의 차이는 실험 오류에 속한다. 이러한 동일한 패턴은 10x5kD PEG 및 10x20kD PEG - 유리카아제 컨쥬게이트의 9회 주입후 확실해졌다. 이러한 결과는, 이러한 범위내에서 유리카아제 페길화의 정도에 상관없이, 유사한 생물학적 효과가 래트 모델에서 관찰되었음을 나타낸다.
표 6. 래트에서 페길화된 Pig-KS-ΔN 유리카아제 제조물의 반감기
Figure 112007080520848-PCT00009
표 6 주해: 결과는 시간 ± 평균의 표준 편차로 나타내었다. 괄호안의 숫자는 시험한 동물의 수를 나타낸다.
표에 기재된 바와 같이 체중 킬로그램당 변형된 Pig-KS-ΔN 유리카아제 0.4mg을 매주 래트의 정맥내 주입하였다. 각 군은 초기에 15마리의 래트로 이루어지며, 교대로 5마리의 하위군에서 채혈하였다. 여러 마리의 래트가 마취에 의해 연구 중에 치사하였다. 반감기는 주입후 5분, 6시간, 24시간 및 48시간에 수집된 혈장 샘플중의 유리카아제 활성 (비색계 검정)을 측정함으로써 결정하였다.
표 5는 연구에 사용된 페길화된 유리카아제 배치를 설명한다.
래빗에서 6x5kD PEG-Pig-KS-ΔN 유리카아제의 생체이용률 연구 결과, 일차 주입 후, 순환 반감기가 98.2±1.8시간 (정맥내)이며, 근내 및 피하내 주입 후 생체이용율은 각각 71% 및 52%었다. 그러나, 이차 근내 및 피하내 주입 후 모든 래빗에서 현저한 항-유리카아제 항체 역가가 검출되었으며, 후속 주입 후 제거가 가속화되었다. 동일한 컨쥬게이트를 래트에 주입한 경우, 반감기는 26±1.6시간 (정맥내)이며, 근내 및 피하내 주입후 생체이용률은 각각 33% 및 22%이었다.
9x10kD PEG-Pig-KS-ΔN 유리카아제의 래트에서의 연구 결과, 일차 주입 후 순환 반감기가 42.4시간 (정맥내)이며, 근내 및 피하내 주입 후 생체이용률은 각각 28.9% 및 14.5% 이었다 (도 5 및 표 7 참조). 4차 주입 후, 순환 반감기는 32.1±2.4시간이며, 근내 및 정맥내 주입 후 생체이용율은 각각 26.1% 및 14.9%이었다.
9x10kD PEG-Pig-KS-ΔN 유리카아제의 래빗에서의 유사한 약동학적 연구 결과, 상기 컨쥬게이션 주입 후 어떠한 가속화된 제거도 관찰되지 않았다 (격주로 4회 투여함). 이들 동물에서, 일차 주입 후 순환 반감기는 88.5 시간 (정맥내)이며, 근내 및 피하내 주입 후 생체이용률은 각각 98.3% 및 84.4%이다 (도 6 및 표 7 참조). 4차 주입 후, 순환 반감기는 141.1±15.4 시간이며, 근내 및 피하내 주입 후 생체이용률은 각각 85% 및 83%이다.
9x10kD PEG-Pig-KS-ΔN으로 유사한 연구를 수행하여 비글에서의 생체이용률을 평가하였다 (각 군은 수컷 2마리 및 암컷 2마리로 이루어짐). 일차 정맥내 주 입후 순환 반감기는 70±11.7시간이며, 근내 및 피하내 주입 후 생체이용율은 각각 69.5% 및 50.4% 이다 (도 7 및 표 7 참조).
9x10kD PEG-Pig-KS-ΔN 제조물의 연구를 피그에서 수행하였다. 군당 3마리의 동물을 이용하여 정맥내, 피하내 및 근내 경로로 투여하였다. 일차 정맥내 주입후 순환 반감기는 178±24시간이며, 근내 및 정맥내 주입 후 생체이용율은 각각 71.6% 및 76.8%이다 (도 8 및 표 7 참조).
표 7. 9x10kD PEG-Pig-KS-ΔN 유리카아제로의 약동학적 연구
주입 # 반감기 (시간) 생체이용율
정맥내 근내 피하내
래트
1 42.4±4.3 28.9% 14.5%
2 24.1±5.0 28.9% 14.5%
4 32.1±2.4 26.1% 14.9%
래빗
1 88.5±8.9 98.3% 84.4%
2 45.7±40.6 100% 100%
4 141.1±15.4 85% 83%
개
1 70.0±11.7 69.5% 50.4%
피그
1 178±24 71.6% 76.8%
흡수, 분포, 대사 및 배출 (ADME) 연구를 볼튼 및 헌터 방법 (Bolton & Hunter method)에 의해 125I로 9x10kD PEG-Pig-KS-ΔN 유리카아제로 요오드화시킨 후 수행하였다. 라벨링된 컨쥬게이트를 각 4마리 (수컷 2마리와 암컷 2마리)의 7군에 주입하였다. 방사능의 분포를 1시간후 매 24시간 마다 7일 동안 검정하였다 (5일은 제외). 차례로 각 군을 희생시키고, 여러 기관을 절제하여 분석하였다. 7번째 군을 대사상자에 놓고, 이로부터 소변 및 배설물을 수집하였다. 동물 몸체를 통과하는 물질의 분포를 각 기관 및 TCA (즉, 단백질 결합되어 기관 크기로 표준화 됨)로의 침전을 가능하게 하는 평가 분획 (신장, 간, 폐 및 비장)에서의 전체 방사능을 평가하였다. 절제된 기관중, 어느 것도 더 높은 견줌방사능을 나타내지 않았으며, 따라서, 예를 들어, 간 또는 신장에서 현저한 축적이 관찰되지 않았다. 70%의 방사능이 7일째에 분비되었다.
실시예 8. 임상 실험 결과
무작위화된 개방-라벨, 다중중심, 평행 군 연구를 수행하여, 통상적인 치료법에 반응이 없거나 이러한 치료법이 허용되지 않는 고요산혈증 및 중증 울혈에 걸린 환자에서 유레이트 반응, 및 PEG-유리카아제 (푸리카아제 (Puricase®), Savient Pharmaceuticals)의 약동학 및 안정도 프로파일을 평가하였다. 질환의 평균 지속 기간은 14년 이었으며, 연구 집단의 70%는 하나 이상의 토피(tophi)를 갖는다.
연구에서, 41명의 환자 (평균 연령 58.1세)를 무작위로 4가지 투여 요법중 하나로 PEG-유리카아제를 12주 동안 정맥내 처리하였다: 격주로 4mg (7명 환자); 격주로 8mg (8명 환자); 4주마다 8mg (13명 환자); 또는 4주마다 12mg (13명 환자). 혈장 유리카아제 활성 및 유레이트 수준을 일정한 간격을 두고 측정하였다. 약동학 변수, 평균 혈장 유레이트 농도, 및 혈장 유레이트가 6mg/dL 이하가 되는 시간의 %는 유리카아제 활성 및 유레이트 수준의 분석으로부터 유래하였다.
격주로 8mg의 PEG-유리카아제가 투여된 환자는 가장 낮은 PUA 감소를 나타냈으며, 처리 기간중 92%에 해당하는 기간 동안 PUA 수준이 6mg/dL 미만이었다 (혈창 유레이트의 처리전 9.1mg/dL 대 12주에 걸친 평균 혈장 유레이트 1.4mg/dL).
실질적이고 지속된 더 낮은 혈장 유레이트 수준이 또한 다른 PEG-유레이트 처리 투여 군에서도 관찰되었다: 4주마다 8mg 투여한 군에서는 처리 기간중 86%에 해당하는 기간 동안 PUA가 6mg/ml 미만이었음 (처리전 혈장 유레이트 9.1mg/dL 대 12주에 걸친 평균 혈장 유레이트 2.6mg/dL); 4주마다 12mg 투여한 군에서 처리 기간중 84%에 해당하는 기간 동안 PUA는 6mg/ml 미만이었음 (처리전 혈장 유레이트 8.5mg/dL 대 12주에 걸친 평균 혈장 유레이트 2.6mg/dL); 및 격주로 4mg 투여한 군에서 처리 기간중 73%에 해당하는 기간 동안 PUA는 6mg/ml 미만이었음 (처리전 혈장 유레이트 7.6mg/dL 대 12주에 걸친 평균 혈장 유레이트 4.2mg/dL).
PEG-유리카아제 투약후 처음 24시간내에 기준선으로부터 혈장 요산의 최대 감소율이, 4mg/2주 처리 피검체에 있어서는, 72% (p는 .0002임); 8mg/2주 처리 피검체에 있어서는, 94% (p는 .0001 미만임); 8mg/4주 처리 피검체에 있어서는, 87% (p는 .0001 미만임); 12mg/4주 처리 피검체 있어서는, 93% (p는 .0001 미만임)이었다.
12주 처리 기간에 걸친 기준선으로부터의 혈장 요산의 감소율은, 4mg/2주 처리 피검체에 있어서는, 38% (p는 .0002임); 8mg/2주 처리 피검체에 있어서는, 86% (p는 .0001 미만임); 8mg/4주 처리 피검체에 있어서는, 58% (p는 .0003 미만임); 12mg/4주 처리 피검체 있어서는, 67% (p는 .0001 미만임)이었다.
놀랍게도, PEG-유리카아제 처리된 일부 피검체는 주입 관련 역작용 즉, 주입 반응을 경험하였다. 이들 반응은 전체 주입에 있어서 14%로 발생하였다.
각각의 개별적 문헌 또는 특허 문헌이 특이적이로 개별적으로 참조로 인용된 경우, 모든 인용된 문헌은 그 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 인용되었다.
본 발명의 많은 변형 및 변화가 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 가능하며, 이는 당업자에게 자명할 것이다. 본원에 기술된 특정 구체예는 단지 예를 위해 제공된 것이며, 본 발명은 청구범위와 청구범위에 해당하는 등가물의 전체 범위에 의해서 제한될 뿐이다.
SEQUENCE LISTING <110> Savient Pharmaceuticals, Inc. Hartman, Jacob Mendelovitz, Simona <120> VARIANT FORMS OF URATE OXIDASE AND USE THEREOF <130> 103864-146638 <150> US 60/670,573 <151> 2005-04-11 <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pig Liver Uricase (sense) <400> 1 gcgcgaattc catggctcat taccgtaatg actaca 36 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pig Liver Uricase (antisense) <400> 2 gcgctctaga agcttccatg gtcacagcct tgaagtcagc 40 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Baboon (D3H) Liver Uricase (sense) <400> 3 gcgcgaattc catggcccac taccataaca actat 35 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Baboon (D3H) Liver Uricase (antisense) <400> 4 gcgcccatgg tctagatcac agtcttgaag acaacttcct 40 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PBC-DeltaNC Uricase (sense) <400> 5 gcgcatatga cttacaaaaa gaatgatgag gtagag 36 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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gcgagtactc gccctctgtc cagaagacac tctatgacat ccaggtgctc 720 accctgggcc aggttcctga gatagaagat atggaaatca gcctgccaaa tattcactac 780 ttaaacatag acatgtccaa aatgggactg atcaacaagg aagaggtctt gctaccttta 840 gacaatccat atggaaaaat tactggtaca gtcaagagga agttgtcttc aagactg 897 <210> 10 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pig-KS-DeltaN without starting ATG <400> 10 acttacaaaa agaatgatga ggtagagttt gtccgaactg gctatgggaa ggatatgata 60 aaagttctcc atattcagcg agatggaaaa tatcacagca ttaaagaggt ggcaactaca 120 gtgcaactga ctttgagctc caaaaaagat tacctgcatg gagacaattc agatgtcatc 180 cctacagaca ccatcaagaa cacagttaat gtcctggcga agttcaaagg catcaaaagc 240 atagaaactt ttgctgtgac tatctgtgag catttccttt cttccttcaa gcatgtcatc 300 agagctcaag tctatgtgga agaagttcct tggaagcgtt ttgaaaagaa tggagttaag 360 catgtccatg catttattta tactcctact ggaacgcact tctgtgaggt tgaacagata 420 aggaatggac ctccagtcat tcattctgga atcaaagacc taaaagtctt gaaaacaacc 480 cagtctggct ttgaaggatt catcaaggac cagttcacca ccctccctga 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110 Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125 His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140 Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 150 155 160 Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln 180 185 190 Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205 Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly 210 215 220 Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255 Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270 Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285 Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu 290 295 300 <210> 12 <211> 296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PBC-DeltaNC <400> 12 Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr 1 5 10 15 Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr 20 25 30 His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser 35 40 45 Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp 50 55 60 Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys 65 70 75 80 Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser 85 90 95 Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp 100 105 110 Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr 115 120 125 Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly 130 135 140 Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr 145 150 155 160 Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu 165 170 175 Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp 180 185 190 Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr 195 200 205 Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly 210 215 220 Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu 225 230 235 240 Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro 245 250 255 Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn 260 265 270 Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr 275 280 285 Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser 290 295 <210> 13 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PBC-DeltaNC without starting Met <400> 13 Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly 1 5 10 15 Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His 20 25 30 Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys 35 40 45 Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp Thr 50 55 60 Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser 65 70 75 80 Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe 85 90 95 Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys 100 105 110 Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr 115 120 125 Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly Pro 130 135 140 Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr 145 150 155 160 Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro 165 170 175 Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp Arg 180 185 190 Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val 195 200 205 Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu 210 215 220 Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn 245 250 255 Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys 260 265 270 Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly 275 280 285 Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser 290 295 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PBC-DeltaNC (Fragment 44-56 of PBC-DeltaNC) <400> 14 Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 936 <212> DNA <213> Papio hamadryas (hamadryas baboon) <400> 15 ccagaagaaa atggccgact accataacaa ctataaaaag aatgatgaat tggagtttgt 60 ccgaactggc tatgggaagg atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata 120 tcacagcatt aaagaggtgg caacttcagt gcaacttact ctgagttcca aaaaagatta 180 cctgcatgga gataattcag atatcatccc tacagacacc atcaagaaca cagttcatgt 240 cttggcaaag tttaagggaa tcaaaagcat agaagccttt ggtgtgaata tttgtgagta 300 ttttctttct tcttttaacc atgtaatccg agctcaagtc tacgtggaag aaatcccttg 360 gaagcgtctt gaaaagaatg gagttaagca tgtccatgca tttattcaca ctcccactgg 420 aacacacttc tgtgaagttg aacaactgag aagtggaccc cccgtcatta cttctggaat 480 caaagacctc aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca 540 gttcaccacc ctccctgagg tgaaggaccg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg 600 gcgctaccac cagtgcaggg atgtggactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct 660 tgtcctggag aaatttgctg ggccctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa 720 gaccctctat gatatccagg tgctctccct gagccgagtt cctgagatag aagatatgga 780 aatcagcctg ccaaacattc actacttcaa tatagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa 840 caaggaagag gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa 900 gaggaagttg tcttcaagac tgtgacattg tggcca 936 <210> 16 <211> 304 <212> PRT <213> Papio hamadryas (hamadryas baboon) <400> 16 Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln 20 25 30 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu 85 90 95 Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val 100 105 110 Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125 His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140 Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile Thr Ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 150 155 160 Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln 180 185 190 Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205 Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly 210 215 220 Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255 Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270 Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285 Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300

Claims (37)

  1. 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 양 아미노 말단과 카르복시 말단에서 약 1 내지 13개의 아미노산이 절두된 포유동물 유리카아제 아미노산을 포함하며, 추가로 약 46번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 포유동물의 분리된 절두 유리카아제.
  2. 제 1항에 있어서, 알라닌, 글리신, 프롤린, 세린 또는 트레오닌인 아미노 말단 아미노산을 추가로 포함하는 유리카아제.
  3. 제 2항에 있어서, 아미노 말단 아미노산이 트레오닌인 유리카아제.
  4. 제 1항에 있어서, 트레오닌 또는 알라닌으로 치환된 유리카아제.
  5. 제 3항에 있어서, 트레오닌으로 치환된 유리카아제.
  6. 제 5항에 있어서, SEQ ID NO. 8의 아미노산 서열을 포함하는 유리카아제.
  7. 제 1항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, 중합체와 컨쥬게이팅된 유리카아제.
  8. 제 1항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 따른 유리카아제를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 - 유리카아제 컨쥬게이트.
  9. 제 8항에 있어서, 각각의 유리카아제 서브유닛상에 2 내지 12개의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 컨쥬게이트.
  10. 제 9항에 있어서, 유리카아제 서브유닛당 3 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 컨쥬게이트.
  11. 제 8항에 있어서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 분자의 분자량이 약 1kD 내지 100kD인 컨쥬게이트.
  12. 제 11항에 있어서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 분자의 분자량이 약 1kD 내지 50kD인 컨쥬게이트.
  13. 제 12항에 있어서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜의 분자의 분자량이 약 5kD 내지 약 20kD인 컨쥬게이트.
  14. 제 13항에 있어서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 분자의 분자량이 약 10kD인 컨 쥬게이트.
  15. 제 1항 내지 제 5항중의 어느 한 항에 따른 유리카아제를 포함하는 약제 조성물.
  16. 제 8항에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 약제 조성물.
  17. 제 15항에 있어서, 반복 투여에 적합한 약제 조성물.
  18. 제 16항에 있어서, 반복 투여에 적합한 약제 조성물.
  19. 제 15항에 따른 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 체액중의 요산 수준을 저하시키는 방법.
  20. 제 16항에 따른 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 체액중의 요산 수준을 저하시키는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 체액이 혈액인 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 체액이 혈액인 방법.
  23. SEQ ID NO. 14의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 유리카아제.
  24. 제 1항에 있어서, N-말단 아미노산이 메티오닌인, 포유동물의 분리된 절두 유리카아제 단백질.
  25. 제 24항에 있어서, SEQ ID NO.7의 아미노산 서열을 포함하는 유리카아제.
  26. 제 1항, 제 3항, 제 6항, 제 24항 또는 제 25항의 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  27. 제 26항에 있어서, 핵산 서열이 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된 분리된 핵산.
  28. 제 27항에 있어서, 프로모터가 osmB 프로모터인 핵산.
  29. 제 27항에 따른 핵산을 포함하는 핵산 벡터.
  30. 제 29항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  31. SEQ ID NO. 7 또는 SEQ ID NO. 8의 아미노산 서열을 포함하는 유리카아제를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  32. 제 31항에 있어서, 핵산 서열이 SEQ ID NO. 9 또는 SEQ ID NO. 10을 포함하는 분리된 핵산.
  33. 제 31항에 있어서, 핵산 서열이 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된 분리된 핵산.
  34. 제 33항에 있어서, 프로모터가 osmB 프로모터인 핵산.
  35. 제 33항에 따른 핵산을 포함하는 핵산 벡터.
  36. 제 35항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  37. 핵산 서열이 숙주 세포에 의해 발현되는 조건하에 제 30항 또는 제 36항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 발현된 유리카아제를 분리하는 단계를 포함하여, 유리카아제를 생성시키는 방법.
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