PL215285B1 - Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza, obejmujacy ja koniugat glikol polietylenowy-urykaza, sposób jej wytwarzania, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna i jej zastosowanie oraz kodujacy urykaze wyizolowany kwas nukleinowy, jego wektor i obejmujaca go komórka gospodarza - Google Patents

Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza, obejmujacy ja koniugat glikol polietylenowy-urykaza, sposób jej wytwarzania, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna i jej zastosowanie oraz kodujacy urykaze wyizolowany kwas nukleinowy, jego wektor i obejmujaca go komórka gospodarza

Info

Publication number
PL215285B1
PL215285B1 PL387691A PL38769106A PL215285B1 PL 215285 B1 PL215285 B1 PL 215285B1 PL 387691 A PL387691 A PL 387691A PL 38769106 A PL38769106 A PL 38769106A PL 215285 B1 PL215285 B1 PL 215285B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
uricase
lys
nucleic acid
amino acid
val
Prior art date
Application number
PL387691A
Other languages
English (en)
Other versions
PL387691A1 (pl
Inventor
Jacob Hartman
Simona Mendelovitz
Original Assignee
Savient Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Savient Pharmaceuticals Inc filed Critical Savient Pharmaceuticals Inc
Publication of PL387691A1 publication Critical patent/PL387691A1/pl
Publication of PL215285B1 publication Critical patent/PL215285B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej, skróconej ssaczej urykazy, obejmującego ją koniugatu glikol polietylenowy-urykaza, sposobu jej wytwarzania, zawierającej ją kompozycji farmaceutycznej i jej zastosowania oraz kodującego urykazę wyizolowanego kwasu nukleinowego, jego wektora i obejmującej go komórki gospodarza.
Termin oksydaza moczanowa i urykaza są stosowane w niniejszym opisie wymiennie. Oksydazy moczanowe (urykazy E.C. 1.7.3.3) są enzymami, które katalizują utlenianie kwasu moczowego do bardziej rozpuszczalnego produktu, alantoiny, metabolitu puryny, który jest łatwiej wydalany z organizmu. Na skutek kilku mutacji w genie, nabytych w trakcie ewolucji wyższych naczelnych ludzie nie wytwarzają enzymatycznie aktywnej urykazy. (Patrz Wu, X, i wsp., (1992) J Mol Evol 34:78-84, które wlacza sie w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy). W konsekwencji, u wrażliwych osobników, nadmierne steżenia kwasu moczowego we krwi (hiperurykemia) może prowadzić do bolesnego zapalenia stawów (dna), zniekształcających złogów moczanu (guzki dnawe) i niewydolności nerek. Użyteczne do stosowania u niektórych dotkniętych zaburzeniami osobników dostępne leki, takie jak allopurinol (inhibitor syntezy kwasu moczowego), okazują się posiadać istotne ograniczenia takie jak ograniczenie czasu leczenia czy efekty uboczne i nie łagodzą one w odpowiednim stopniu tych stanów. Patrz przykładowo Hande, KR, i wsp., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe. Zastrzyki z urykazy mogą zmniejszyć hiperurykemię i hiperurykozurię co najmniej przejściowo. Ponieważ urykaza jest dla ludzi obcym białkiem, nawet pierwsze wstrzykniecie niezmodyfikowanego białka z Aspergillus flavus indukuje reakcje anafilaktyczne u kilku procent leczonych pacjentów (Pui, C-H, i wsp., (1997) Leukemia 11:1813-1816, które włącza sie w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy) i odpowiedzi immunologiczne ograniczają jej przydatność do leczenia długotrwałego lub przerywanego. Patrz przykładowo Donadio, D, i wsp., (1981) Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic, M, i wsp., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554, które włacza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe.
Suboptymalny charakter dostępnych sposobów leczenia hiperurykemii jest znany od kilku dekad. Patrz przykładowo Kissel, P, i wsp., (1968) Nature 217:72-74, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy. Podobnie jest znana specjalistom od wielu lat możliwość, że pewne grupy pacjentów z poważną dną mogą odnieść korzyść z bezpiecznej i skutecznej postaci wstrzykiwanej urykazy. Patrz przykładowo Davis, FF, i wsp., (1978) w GB Broun, i wsp., (Wyd.) Enzyme Engineering, Tom. 4 (str. 169-173) New York, Plenum Press; Nishimura, H, i wsp., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, i wsp., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, i wsp., (1981) Lancet 2(8241):281-283; Abuchowski, A, i wsp., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219:352-354; Chen, RH-L, i wsp., (1981) Biochim Biophys Acta 660:293-298; Chua, CC, i wsp., (1988) Ann Int Med 109:114-117; Greenberg, ML, i wsp., (1989) Anal Biochem 176:290-293, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe. Urykazy pochodzące z narządów zwierzęcych są prawie nierozpuszczalne w rozpuszczalnikach, które są odpowiednie do bezpiecznego podawania leków na drodze iniekcji. Patrz przykładowo opis patentowy USA nr 3,616,231, który włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy. Niektóre urykazy pochodzące z roślin albo z mikroorganizmów są bardziej rozpuszczalne w dopuszczalnych do zastosowań medycznych rozpuszczalnikach. Jednakże wstrzykiwanie enzymów z mikroorganizmów szybko indukuje odpowiedzi immunologiczne, które mogą prowadzić do zagrażających życiu reakcji alergicznych albo do inaktywacji i/lub przyspieszonego klirensu urykazy z obiegu. Donadio, i wsp., (1981); Leaustic, i wsp., (1983). Enzymy w oparciu o wydedukowane sekwencje aminokwasowe urykaz z ssaków, włączając w to świnie i pawiana, albo z owadów, na przykład Drosophila melanogaster lub Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, i wsp., (1990) Mol Cell Biol 10:5114-5127, włączone tu w całości jako odniesienie), nie są odpowiednimi kandydatami do zastosowań klinicznych na skutek problemów immunogenności I nierozpuszczalności w fizjologicznym pH.
Uprzednio, badacze zastosowali wstrzykiwaną urykazę do katalizowania przekształcenia kwasu moczowego w alantoinę in vivo. Patrz przykładowo Pui, i wsp., (1997). Jest to podstawą stosowania we Francji i Włoszech dla zapobiegania albo czasowej korekcji hiperurykemii związanej z cytotoksyczną terapią hematologicznych chorób nowotworowych albo przejściowego zmniejszenia poważnej hiperurykemii u pacjentów z dną urykazy z grzyba Aspergillus flavus (Uricozyme®). Patrz przykładowo Potaux, L, i wsp., (1975) Nouv Presse Med 4:1109-1112; Legoux, R, i wsp., (1992) J Biol Chem
PL 215 285 B1
267:8565-8570; patenty USA nr 5,382,518 i 5,541,098, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe. Z powodu krótkiego czasu rozpadu w obiegu, Uricozyme® wymaga dokonywania codziennych zastrzyków. Ponadto, nie jest on odpowiedni do stosowania w długotrwałej terapii z powodu immunogenności.
Niektóre urykazy są przydatne do wytwarzania koniugatów z glikolem polietylenowym albo tlenkiem polietylenowym (obydwa określanie jako PEG) do wytwarzania skutecznych terapeutycznie postaci urykazy, mających zwiększony okres półtrwania i zmniejszoną immunogenność. Patrz przykładowo opisy patentowe USA nr 4,179,337, 4,766,106, 4,847,325 i 6,576,235; publikacja zgłoszenia patentowego USA US2003/0082786A1, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe. Opisane w stanie techniki zostały także koniugaty urykazy z polimerami innymi niż PEG. Patrz przykładowo opis patentowy USA 4,460,683, który włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy.
W przypadku prawie wszystkich prób PEGylowania urykazy (tj. kowalencyjnego łączenia PEG z urykazą) PEG jest przyłączony przede wszystkim do grup aminowych, włączając w to resztę aminokohcowa i dostępne reszty lizynowe. W stosowanych powszechnie urykazach, całkowita liczba lizyn w każdej z czterech identycznych podjednostek wynosi pomiędzy 25 (Aspergillus flavus (Patent USA nr 5,382,518, włączony tu w całości jako odniesienie)) a 29 (Wu, X, i wsp., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416, włączone tu w całości jako odniesienie). Niektóre inne lizyny są niedostępne dla PEGylacji przy natywnej konformacji enzymu. Najbardziej powszechnym podejściem do zmniejszania immunogenności urykazy było przyłączanie dużej liczby nici PEG o niskiej masie cząsteczkowej. To niezmiennie prowadzi do ogromnego zmniejszenia aktywności enzymatycznej otrzymanych w rezultacie koniugatów.
Pojedyncze dożylne wstrzyknięcie preparatu urykazy połączonej z PEG 5 kDa zmniejsza obecność kwasu moczowego w surowicy do niewykrywalnych poziomów u osób, u których średnie stężenie kwasu moczowego w surowicy przez zastrzykiem wynosiło 6,2 mg/dl, co jest w normalnym zakresie. Davis, i wsp., (1981). Osobom tym podawano dodatkowe zastrzyki cztery tygodnie później, ale ich odpowiedzi nie były przedstawione. Nie wykrywano przeciwciał wobec urykazy po drugim (ostatnim) zastrzyku, stosując stosunkowo mało czuły test dyfuzji w żelu. W odnośniku tym nie przedstawiono wyników dla leczenia długotrwałego albo przewlekłego pacjentów-ludzi lub zwierząt eksperymentalnych.
Preparat urykazy z Arthrobacter protoformiae połączonej z PEG 5 kDa zastosowano do czasowej kontroli hiperurykemii u jednego pacjenta z chłoniakiem, u którego steżenie kwasu moczowego w surowicy przez zastrzykiem wynosiło 15 mg/dl. Patrz przykładowo Chua, i wsp., (1988). Z powodu krytycznego stanu pacjenta i krótkiego czasu leczenia (cztery zastrzyki w czasie 14 dni) nie jest możliwa ocena długotrwałej skuteczności ani bezpieczeństwa koniugatu.
Zwiększona ochrona przed rozpoznaniem immunologicznym jest możliwa poprzez modyfikowanie każdej podjednostki urykazy 2-10 nićmi PEG o wysokiej masie cząsteczkowej (>5 kD - 120 kD) Saifer, i wsp. (Patent USA nr 6,576,235; (1994) Adv Exp Med Biol 366:377-387, każdy włączony tu w całości jako odniesienie. Ta strategia umożliwia zatrzymanie >75% aktywności enzymatycznej urykazy z różnych gatunków po PEGylacji, zwiększony czas trwania w obiegu i umożliwia powtarzane wstrzyknięcia enzymu bez wzbudzania przeciwciał u myszy i królików.
Hershfield i Kelly (międzynarodowa publikacja WO 00/08196; zgłoszenie patentowe USA nr 60/095,489, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe) opracowali sposoby dostarczania białek rekombinowanych urykaz z różnych gatunków ssaków z optymalnymi liczbami miejsc PEGylacji. Zastosowali oni techniki PCR dla zwiększenia liczby dostępnych reszt lizynowych w wybranych miejscach enzymu, co miałoby służyć zmniejszaniu rozpoznawania przez układ immunologiczny, po następującej po tym PEGylacji, zachowując jednocześnie aktywność enzymu rozkładania kwasu moczowego. Niektóre ich białka urykaz są skrócone na końcu karboksylowym i/lub aminowym. Nie dostarczają one wskazań innych genetycznie indukowanych zmian białek.
W niniejszym zgłoszeniu, termin „immunogenność dotyczy indukcji odpowiedzi immunologicznej przez wstrzyknięty preparat zmodyfikowanej przez PEG albo niezmodyfikowanej urykazy (antygenu), podczas gdy „antygenowość dotyczy reakcji antygenu z istniejącymi wcześniej - przeciwciałami. We wcześniejszych badaniach nad PEG-urykazą, immunoreaktywncść badano rozmaitymi metodami, właczając w to: 1) reakcję in vitro PEG-urykazy z wytworzonymi uprzednio przeciwciałami; 2) pomiary indukowanej syntezy przeciwciał; i 3) przyspieszonego tempa klirensu po powtarzanych zastrzykach.
PL 215 285 B1
Wcześniejsze próby eliminacji immunogenności urykaz z różnych źródeł poprzez łączenie różnych nici PEG poprzez rozmaite łączniki zakończyły się ograniczonym sukcesem. PEG-urykazy były najpierw ujawnione przez F.E. Davis i przez Y. Inada i ich kolegów. Davis, i wsp., (1978); patent USA nr 4,179,337; Nishimura, i wsp., (1979); patenty japońskie 55-99189 i 62-55079, każdy włączony tu w całości jako odniesienie. Koniugat ujawniony w opisie patentowym USA nr 4,179,337 został syntetyzowany na drodze reakcji urykazy z niezdefiniowanego źródła z 2000-krotnym nadmiarem molowym PEG 750 daltonów, co wskazuje, ze prawdopodobnie duża liczba cząsteczek polimeru przyłączyła się do każdej podjednostki urykazy. Opis patentowy USA nr 4,179,337 ujawnia przyłączanie PEG bądź też glikolu polipropylenowego o masie cząsteczkowej 500 do 20000 daltonów, korzystnie o masie 500 do 5000 daltonów w celu dostarczania aktywnych, rozpuszczalnych w wodzie, nieimmunogennych koniugatów różnych hormonów peptydowych i enzymów, włączając w to oksydoreduktazy, których urykaza jest jednym z trzech przykładów. Dodatkowo, opis patentowy USA 4,179,337 ujawnia dołączanie od 10 do 100 nici polimeru na cząsteczkę enzymu i zachowanie co najmniej 40% aktywności enzymatycznej. Nie przedstawiono wyników testów dla stopnia łączenia się PEG z dostępnymi grupami aminowymi urykazy, pozostającej specyficznej aktywności rozkładania kwasu moczowego lub immunoreakiywności koniugatu.
W poprzednich publikacjach doniesiono, że znaczace zmniejszenie aktywności rozkładania kwasu moczowego in vitro było powodowane przez dołączanie do urykazy z Candida utilis różnej liczby nici PEG. Dołączanie dużej liczby nici PEG 5 kD do urykazy z wątroby świni dawało podobne wyniki, co zostało opisane zarówno w publikacji Chen, jak i doniesieniu z sympozjum przez tą samą grupę. Patrz Chen, i wsp., (1981); Davis, i wsp., (1978).
W siedmiu publikacjach ze stanu techniki opisano, że immunoreaktywność urykazy jest zmniejszana przez PEGylację, przy czym w pięciu innych badaniach była ona eliminowana. W trzech z tych ostatnich pięciu badań, eliminacja immunoreaktywności jest związana z istotnym zmniejszeniem aktywności rozkładania kwasu moczowego - do co najmniej 15%, 28% lub 45% wyjściowej aktywności. Patrz Nishimura, i wsp., (1979) (15% aktywności); Chen, i wsp., (1981) (28% aktywności); Nishimura, i wsp., (1981) (45% aktywności). W czwartym doniesieniu napisano, że PEG jest dołączony do 61% dostępnych reszt Iizynowych, ale pozostająca aktywność specyficzna nie była wspomniana. Abuchowski, i wsp., (1981). Jednakże zespół badawczy, w skład którego wchodzi dwóch tych samych naukowców i stosujący te same metody doniósł gdzie indziej, że ten stopień łączenia pozostawia jedynie 23-28% resztkowej aktywności. Chen, i wsp., (1981). Publikacje z 1981 Abuchowski i wsp. oraz Chen i wsp., wskazuja, że aby zasadniczo zmniejszyć immunogenność urykazy, PEG musi być przyłączony do około 60% dostępnych reszt lizynowych. Piąta publikacja, która donosi, że immunoreaktywność urykazy została wyeliminowana, dla odmiany nie ujawnia stopnia dołączania PEG, pozostającej aktywności rozkładania kwasu moczowego ani natury wiązania PEG-białko. Veronese, FM, i wsp., (1997) w JM Harris, i wsp., (Wyd.), Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (str. 182-192) Washington, DC: American Chemical Society, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe.
Dołączanie PEG do mniejszej frakcji reszt lizynowycn w urykazie zmniejsza, ale nie eliminuje jej immunoreaktywności u zwierząt doświadczalnych. Patrz przykładowo Tsuji, J, i wsp., (1985) Int J Immunopharmacol 7:725-730, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy (28-45% związanych grup aminowych); Yasuda, Y, i wsp., (1990) Chem Pharm Bull 38:2053-2056, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy (38% związanych grup aminowych). Pozostałe aktywności rozkładania kwasu moczowego odpowiednich adduktów zawierały się w zakresie od <33% (Tsuji, i wsp.) do 60% (Yasuda, i wsp.) ich wyjściowych wartości. Tsuji, i wsp. syntetyzował koniugaty z PEG 7,7 kD i 10 kD, oprócz PEG 5 kD. Wszystkie otrzymane w rezultacie koniugaty były do pewnego stopnia immunogenne i antygenowe, jednakże wykazując znacząco zmniejszone aktywności enzymatyczne.
Doniesiono, że PEGylowane preparaty urykazy z Candida utilis, które są bezpiecznie podawane dwukrotnie każdej z pięciu osób, zachowały jedynie 11% swojej wyjściowej aktywności. Patrz Davis, i wsp., (1981). Kilka lat później modyfikowana PEG urykaza z Arthrobacter protoformiae była podawana cztery razy pacjentowi z zaawansowanym chłoniakiem i poważną hiperurykemią. Chua, i wsp., (1988). Jakkolwiek pozostające aktywności tego preparatu enzymatycznego nie były mierzone, Chaa, i wsp. wykazali nieobecność przeciwciał anty-urykaza w surowicy pacjenta 26 dni po pierwszym wstrzyknięciu przy zastosowaniu enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA).
PL 215 285 B1
Poprzednie badania PEGylowanej urykazy pokazały, że aktywność katalityczna ulega znacznemu zmniejszeniu poprzez przyłączenie dostatecznej liczby nici PEG w celu zasadniczego zmniejszenia jej immunoreaktywności. Ponadto, większość poprzednich preparatów PEG-urykazy była syntetyzowana przy użyciu PEG aktywowanego chlorkiem cyjanurowym, pochodną triazynową (2,4,6-trichloro-1,3,5-triazyna), dla której wykazano, że wprowadza nowe determinanty antygenowe i indukuje tworzenie przeciwciał u królików. Tsuji, i wsp., (1985).
Japoński opis patentowy nr 3-148298, A Sano, i wsp., który włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy, ujawnia zmodyfikowane białka, włączając w to urykazy, derywatyzowane PEG mającym masę cząsteczkową 1-12 kD, które wykazują zmniejszoną antygenowość i „ polepszone wydłużone działanie oraz sposoby wytwarzania takich derywatyzowanych peptydów. Jednakże nie ma ujawnień odnośnie liczby nici, testów enzymatycznych, testów biologicznych albo znaczenia „polepszone wydłużone. Japońskie opisy patentowe nr 55-99189 i 62-55079, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe, Y. Inada, ujawniają koniugaty urykazy wytworzone z PEG-triazyną lub bis-PEG-triazyną (oznaczony jako PEG2), odpowiednio. Patrz Nishimura, i wsp., (1979 i 1981). W pierwszym typie koniugatu, masy cząsteczkowe PEG wynoszą 2 kDa i 5 kDa, podczas gdy w drugim stosuje się jedynie PEG 5 kDa. Nishimura, i wsp., (1979) donieśli o odzyskaniu 15% aktywności rozkładania kwasu moczowego po modyfikacji 43% dostępnych lizyn liniowym PEG 5 kDa, podczas gdy Nishimura, i wsp., (1981) donieśli o odzyskaniu 31% lub 45% aktywności rozkładania kwasu moczowego po modyfikacji, odpowiednio, 46% lub 36% lizyn PEG2.
Badane uprzednio białka urykazy były białkami bądź naturalnymi, bądź rekombinowanymi. Jednakże badania z zastosowaniem technik SDS-PAGE i/lub Western wykazały obecność peptydów o nieoczekiwanie niskiej masie cząsteczkowej, które okazały się być produktami degradacji i których częstość zwiększała się z czasem. Niniejszy wynalazek jest związany ze białkami zmutowanej rekombinowanej urykazy mającymi skrócenia i zwiększoną stabilność strukturalną.
Streszczenie wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej, skróconej ssaczej urykazy skróconej na końcu aminowym lub na końcu karboksylowym lub na obydwu końcach, aminowym i karboksylowym, o 1-6 aminokwasów i obejmującej dodatkowo podstawienie aminokwasowe treoniną w pozycji 7 (D7T), podstawienie aminokwasowe treoniną w pozycji 46 (S46T), podstawienie aminokwasowe lizyną w pozycji 291 (R291K) oraz podstawienie aminokwasowe seryną w pozycji 301 (T301S), a skrócenie i podstawienie aminokwasowe są określone w stosunku do urykazy świni o sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID. 11. Korzystnie, wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według wynalazku dodatkowo obejmuje aminokońcowy aminokwas, którym jest alanina, glicyna, prolina, seryna lub treoniną. Szczególnie korzystnym amino-końcowym aminokwasem jest treoniną, a zwłaszcza korzystnie obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 8. W szczególnie korzystnym wykonaniu wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według wynalazku jest połączona z polimerem.
W innej korzystnej postaci wykonania wynalazku wyizolowanej skróconej ssaczej urykazy N-końcowym aminokwasem jest metionina. Korzystnie, taka wyizolowana skrócona ssacza urykaza obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NF, ID: 7.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest koniugat glikol polietylenowy-urykaza obejmujący wyizolowaną, skróconą ssaczą urykazę według wynalazku. Korzystnie koniugat obejmuje od 2 do 12 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy, korzystniej od 3 do 10 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy. Zgodnie z korzystną postacią wykonania 3 wynalazku każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1*103 do
100*103 u, korzystniej od 1*103 do 50*103 u, jeszcze korzystniej od 5*103 do 20*103 u a najkorzystniej 3 ciężar cząsteczkowy wynosi 10*103 u.
Niniejszy wynalazek dostarcza również wyizolowany kwas nukleinowy, którego sekwencja koduje białko wyizolowanej skróconej ssaczej urykazy według wynalazku. Korzystnie, sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem, którym szczególnie korzystnie jest promotor osmB.
Wynalazek dotyczy także wektora kwasu nukleinowego, który obejmuje kwas nukleinowy według wynalazku.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również komórka gospodarza obejmująca wektor według wynalazku.
Wynalazek dostarcza również wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego kodującą urykazę obejmującą sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 7
PL 215 285 B1 lub SEK NR ID: 8, który korzystnie obejmuje także sekwencje przedstawioną na SEK NR ID: 9 lub SEK NR ID: 10. W szczególnie korzystnej postaci sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem, a w zwłaszcza korzystnym wykonaniu promotorem jest promotor osmB.
Przedmiotem wynalazku jest również wektor kwasu nukleinowego, obejmujący kwas nukleinowy według wynalazku.
W kolejnym z wykonań wynalazek dostarcza komórkę gospodarza obejmującą wektor według wynalazku.
W innym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania urykazy, który obejmuje etapy hodowania komórki gospodarza według wynalazku w takich warunkach, że sekwencja kwasu nukleinowego ulega ekspresji w komórce gospodarza, oraz izolowania wyrażonej urykazy.
Wynalazek ujawnia więc sposoby metabolizowania kwasu moczowego, obejmujące białko nowej rekombinowanej urykazy mające aktywność rozkładania kwasu moczowego. Aktywność rozkładania kwasu moczowego jest tu stosowana na określenie enzymatycznego przekształcania kwasu moczowego do alantiony.
W jednym z konkretnych przykładowych wykonań niniejszego wynalazku dostarczono wyizolowaną, skrócona urykazę zawierającą sekwencję aminokwasową ssaczej urykazy skróconej na końcu aminowym lub na końcu karboksylowym lub na obydwu końcacń, aminowym i karboksylowym, o około 1-13 aminokwasów i zawierającą dodatkowe podstawienie aminokwasowe około pozycji 46. W innym konkretnym wykonaniu urykaza zawiera aminokońcowy aminokwas, którym jest alanina, glicyna, prolina, seryna lub treonina. Opisana niniejszym została również urykaza, w której występuje podstawienie około pozycji 46 treoniną lub alaniną. W jednym z konkretnych przykładowych wykonań, urykaza obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 8. W jednym z wykonań, urykaza jest połączona z polimerem w celu wytworzenia na przykład koniugatu glikol polietylenowy-urykaza. W innym konkretnym wykonaniu, koniugaty glikol polietylenowy-urykaza zawierają 2 do 12 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdej podjednostce urykazy, korzystnie 3 do 10 cząsteczek glikolu polietylenowego na podjednostkę urykazy. W konkretnym wykonaniu, każda cząsteczka glikolu polietylenowego koniugatu glikol polietylenowy-urykaza ma masę cząsteczkową między około 1 kD a 100 kD; około 1 kD a 50 kD; około 5 kD a 20 kD; lub około 10 kD.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, która jako substancję aktywną zawiera urykazę według wynalazku.
W innej postaci wykonania kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera jako substancję aktywną zawiera koniugat glikol polietylenowy-urykaza według wynalazku.
Korzystnie, kompozycje według wynalazku są odpowiednie do powtarzalnego podawania.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie kompozycji według wynalazku do wytwarzania leku użytecznego do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych u wymagającego tego osobnika. Korzystnie, płynem biologicznym jest krew.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem ujawniony jest więc sposób zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych osobnika tego potrzebującego, obejmujący podawanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej urykazę według wynalazku. W konkretnym wykonaniu płynem biologicznym jest krew.
W jednym z przykładowych wykonań, urykaza zawiera peptyd mający sekwencję od pozycji 44 do pozycji 56 Pig-KS-ΔΝ (SEK NR ID: 14).
W jednym z przykładowych wykonań, urykaza zawiera N-końcową metioninę. W konkretnym wykonaniu, urykaza zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 7.
Krótki opis Figur
Na Figurze 1 przedstawiono strukturę plazmidu pOUR-P^N-ks-1. Numery obok miejsc restrykcyjnych wskazują na pozycję nukleotydową względem miejsca HaeII, oznaczonego jako 1. Miejsca restrykcyjne, które zostały utracone w czasie klonowania są zaznaczone nawiasami.
Na Figurze 2 przedstawiono DNA i wydedukowaną sekwencję aminokwasową urykazy Pig-KS-ΔΝ (odpowiednio, SEK NR ID: 9 i SEK NR ID: 7). Numeracja aminokwasów na Fig. 2 odnosi się do pełnej sekwencji urykazy świni. Po reszcie inicjacyjnej metioniny, treoniną zastępuje kwas asparaginowy 7 w sekwencji urykazy świni. Wskazane są miejsca restrykcyjne, które są stosowane w różnych etapach subklonowania. Nie podlegająca translacji sekwencja 3' jest zaznaczona małymi literami. Kodon stop dla translacji jest zaznaczony gwiazdką.
PL 215 285 B1
Na Figurze 3 przedstawiono wzajemne dopasowanie wydedukowanych sekwencji aminokwasowych różnych rekombinowanych sekwencji urykazy, świni (SEK NR ID: 11), PBC-ΔΝΟ (SEK NR ID: 12) i Pig-KS-ΔΝ (SEK NR ID: 7). Gwiazdki wskazują pozycje, w których występują różnice aminokwasowe w Pig-KS-ΔΝ w porównaniu z opublikowaną sekwencją urykazy świni; kółka wskazują pozycje, w których występują różnice aminokwasowe w Pig-KS-ΔΝ w porównaniu do PBC-ANC. Linie przerywane wskazują delecję aminokwasową.
Na Figurze 4 przedstawiono SDS-PAGE urykazy świni i wysoce oczyszczonych wariantów urykazy wytwarzanych według przykładów 1-3. Data wytworzenia (miesiąc/rok) i odpowiedni numer ścieżki dla każdej próbki jest wskazany w legendzie poniżej. Na osi Y są zaznaczone masy cząsteczkowe markerów, a na górze rysunku zaznaczone są numery ścieżek. Ścieżki są następujące: Ścieżka 1 markery mas cząsteczkowego; Ścieżka 2 - Pig-KS-ΔΝ (7/98); Ścieżka 3 - Pig (9/98); Ścieżka 4 - Pig KS (6/99); Ścieżka 5 - Pig KS (6/99); Ścieżka 6 - Pig-ΔΝ (6/99); Ścieżka 7 - Pig KS-ΔΝ (7/99); Ścieżka 8 Pig KS-ΔΝ (8/99).
Na Figurze 5 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u szczurów po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określane poprzez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μl próbki osocza. Biodostępność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.
Na Figurze 6 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u królików po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określane poprzez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μl próbki osocza. Biodostepność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.
Na Figurze 7 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u psów po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV tuożylnym), określane poprzez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μl próbki osocza. Biodostepność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.
Na Figurze 8 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u świń po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określane poprzez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczna urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μl próbki osocza. Biodostepność (ilość leku osiągająca układ krażenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.
Szczegółowy opis wynalazku
Wcześniejsze badania pokazały, że kiedy uzyskuje się znaczące zmniejszenie immunogenności i/lub antygenowości urykazy poprzez PEGylację, wiaze sie z tym nieodmiennie istotna utrata aktywności rozkładania kwasu moczowego. Bezpieczeństwo, wygoda i stosunek koszty-skuteczność biofarmaceutyków, na wszystko to niekorzystny wpływ ma zmniejszenie ich mocy i w rezultacie potrzeba zwiększania podawanej dawki. A zatem, istnieje zapotrzebowanie na bezpieczne i skuteczne alternatywne sposoby zmniejszania podniesionych poziomów kwasu moczowego w płynach ciała, włączając w to krew. Niniejszy wynalazek dostarcza zmutowanej rekombinowanej urykazy, gdzie urykaza została skrócona o 1-20 aminokwasów na końcu aminowym albo na końcu karboksylowym lub na obydwu końcach, i zasadniczo zachowuje aktywność rozkładania kwasu moczowego występującej naturalnie urykazy.
Stosowany w niniejszym opisie termin „urykaza obejmuje poszczególne podjednostki, jak również tetrametr, o ile nie zaznaczono inaczej.
Stosowany w niniejszym opisie termin „zmutowana urykaza dotyczy cząsteczek urykazy mających aminokwasy zamienione na inne aminokwasy.
PL 215 285 B1
Stosowany w niniejszym opisie termin „konserwatywna mutacja to mutacja jednego albo większej liczby aminokwasów, w pewnej pozycji albo w jej okolicach, które nie zmieniają zasadniczo zachowania białka. W korzystnym wykonaniu urykaza zawierająca co najmniej jedną konserwatywną mutację ma taką samą aktywność urykazy co urykaza bez takiej mutacji. W innym wykonaniu, urykaza zawierajaca co najmniej jedną konserwatywną mutację ma zasadniczo taką samą aktywność urykazy, nie więcej niż 5% od aktywności, nie wiecej niż 10% od aktywności albo nie więcej niż 30% od aktywności urykazy bez takiej mutacji.
Konserwatywne podstawienie aminokwasowe jest zdefiniowane jako zmiana w składzie aminokwasowym poprzez zmianę aminokwasów peptydu, polipeptydu albo białka lub fragmentu. W konkretnych wykonaniach, urykaza ma jedną, dwie, trzy lub cztery konserwatywne mutacje. Podstawienie jest aminokwasami o generalnie podobnych właściwościach (np. kwaśne, zasadowe, aromatyczne, o rozmiarze, dodatnio albo ujemnie naładowane, polarne, niepolarne), tak że podstawienia nie zmieniają zasadniczo charakteru (np. ładunku, IEF, powinowactwa, widności, konformacji, rozpuszczalności) albo aktywności peptydu, polipeptydu lub białka. Typowe podstawienia, których można dokonać jako takie konserwatywne podstawienia aminokwasowe mogą być w obrębię następujących grup aminokwasów:
glicyna (G), alanina (A), walina (V), leucyna (L) i izoleucyna (I) kwas asparaginowy (D) i kwas glutaminowy (E) alanina (A), seryna (S) i treoniną (T) histydyna (H), lizyna (K) i arginina (R) asparagina (N) i glutamina (Q) fenyloalanina (F), tyrozyna (Y) i tryptofan (W)
Białko mające jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień zachowuje swoją stabilność strukturalną i może katalizować reakcję nawet jeżeli jego sekwencja nie jest taka sama jak wyjściowego białka.
Stosowany w niniejszym opisie termin skrócona urykaza dotyczy cząsteczek urykazy mających skrócone pierwszorzędowe sekwencje aminokwasowe. Wśród możliwych skróceń są skrócenia na albo w pobliżu końców, aminowego i/lub karboksylowego. Konkretnymi skróceniami tego typu mogą być takie, że ostatnie aminokwasy (te na końcu aminowym i/lub karboksylowym) naturalnie występującego białka są obecne w skróconym białku. Skrócenia aminokońcowe mogą rozpoczynać się w pozycji 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. Korzystne jest, jeżeli aminokońcowe skrócenia rozpoczynają się w pozycji 2, pozostawiając w ten sposób aminokońcową metioninę. Ta metionina może zostać usunięta przez potranslacyjną modyfikację. W konkretnych wykonaniach, aminokońcowa metionina jest usuwana po wytworzeniu urykazy. W konkretnym wykonaniu metionina jest usuwana przez endogenną bakteryjną aminopeptydazę.
Skrócona urykaza, w odniesieniu do sekwencji pełnej długości ma wyeliminowaną jedną albo więcej sekwencji aminokwasowych. Białko zawierające skróconą urykazę może zawierać oprócz skróconej sekwencji urykazy dowolną sekwencję aminokwasową, ale nie obejmuje białka zawierającego sekwencję urykazy zawierającą jakąkolwiek dodatkową kolejną sekwencję aminokwasową typu dzikiego. Innymi słowy, białko zawierające skróconą urykazę, gdzie skrócenie rozpoczyna się w pozycji 6 (tj. skrócona urykaza rozpoczyna się w pozycji 7) nie ma bezpośrednio przed skróconą urykazą jakiegokolwiek aminokwasu, który urykaza typu dzikiego miała w pozycji 6.
O ile nie zaznaczono inaczej przez specjalne odniesienie się do innych sekwencji albo konkretnej SEK NR ID, odniesienie sie do numerowanych pozycji aminokwasów opisanych tu urykaz jest dokonywane w odniesieniu do numeracji aminokwasów w sekwencji urykazy świni. Sekwencja aminokwasowa urykazy świni i numerowane pozycje aminokwasów zawartych w tej sekwencji można znaleźć na Fig. 3. Stosowane tu odniesienie do aminokwasów lub kwasów nukleinowych „od pozycji X do pozycji Y oznacza ciągłą sekwencję rozpoczynającą się od pozycji X i kończącą się w pozycji Y, włączając w to aminokwasy albo kwasy nukleinowe w obydwu pozycjach, X i Y.
Geny i białka urykazy zostały zidentyfikowane u kilku gatunków ssaków, na przykład u świni, pawiana, szczura, królika, myszy i małpy rezus. Sekwencje białek różnych urykaz są tu opisane w odniesieniu do ich numerów dostępów w publicznych bazach danych, jak następuje:
gi|50403728|sp|P25689; gi|20513634|dbj|BAB91555.1; gi|176610|gb|AAA35395.1;
gi|20513654|dbj|BAB91557.1;
PL 215 285 B1 gi|47523606|ref|NP_999435.1;
gi|6678509|ref|NP_033500.1;
gi|57463|emb|CAA31490.1;
gi|20127395|ref|NP_446220.1;
gi|137107|sp|P11645;
gi|51458661|ref|XP_497688.1;
gi|207619|gb|AAA42318.1;
gi|26340770|dbj|BAC34047.1 oraz gi|57459|emb|CAA30378.1.
Każda z tych sekwencji i przypisy do nich w publicznych bazach danych dostępne poprzez National Center for Biotechnology Information (NCBI) są tu włączone w całości jako odniesienie.
W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 4-13 aminokwasów na końcu aminowym. W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 4-13 aminokwasów na końcu karboksylowym. W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 4-13 aminokwasów na obydwu końcacń, aminowym i karboksylowym.
W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 6 aminokwasów na końcu aminowym. W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 6 aminokwasów na końcu karboksylowym. W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 6 aminokwasów na obydwu końcach, aminowym i karboksylowym.
W konkretnym wykonaniu białko urykazy zawiera sekwencję aminokwasową od pozycji 13 do pozycji 292 sekwencji aminokwasowej urykazy świni (SEK NR ID: 11). W konkretnym wykonaniu białko urykazy zawiera sekwencję aminokwasową od pozycji 8 do pozycji 287 sekwencji aminokwasowej
PBC-ANC (SEK NR ID: 12). W konkretnym wykonaniu białko urykazy zawiera sekwencję aminokwasową od pozycji 8 do pozycji 287 sekwencji aminokwasowej Pig-KS-ΔΝ (SEK NR ID: 7).
W innym wykonaniu, białko urykazy zawiera sekwencję aminokwasową od pozycji 44 do pozycji 56 Pig-KS-ΔΝ (SEK NR ID: 14). Ten region urykazy ma homologię sekwencji w obrębie domeny fałdu tunelowego (T-fold, od ang. tunneling fold) urykazy i ma w jej obrębie mutację w pozycji 46 w odniesieniu do natywnej sekwencji urykazy świni. Ta mutacja ku zaskoczeniu nie zmienia znacząco aktywności urykazy białka.
W pewnym wykonaniu wynalazku, aminokwasy w pozycji albo w pobliżu aminokwasów 7, 46 i 291 oraz 301 są zmutowane. W korzystnym wykonaniu wynalazku same aminokwasy 7, 46 i 291 oraz 301 są zmutowane.
W konkretnym wykonaniu, białko jest kodowane przez kwas nukleinowy, który koduje N-końcową metioninę. Korzystne jest, jeżeli po tej N-końcowej metioninie następuje kodon, który umożliwia usunięcie N-końcowej metioniny przez bakteryjną aminopeptydazę metioninową (MAP). (Ben-Bassat i Bauer (1987) Nature 326:315, włączone tu w całości jako odniesienie. Aminokwasami umożliwiającymi najbardziej kompletne usunięcie N-końcowej metioniny są alanina, glicyna, prolina, seryna i treonina.
W pewnym wykonaniu wynalazku aminokwasy w pozycji albo w pobliżu aminokwasów 7 i/lub 46 są zastąpione przez treoninę. Ku zaskoczeniu, aktywność enzymatyczna skróconych urykaz wytworzonych z tymi mutacjami jest podobna do enzymu nieskróconego. W dalszym wykonaniu wynalazku, mutacje aminokwasów obejmują treoninę, treoninę, lizynę i serynę w pozycjach, odpowiednio, 7, 46, 291 i 301.
Ujawnione w niniejszym opisie skrócone urykazy ssaków mogą ponadto zawierać metioninę na końcu aminowym. Przedostatni aminokwas może być tym, który umożliwia usunięcie N-końcowej metioniny przez bakteryjną aminopeptydazę metioninową (MAP). Aminokwasami umożliwiającymi najbardziej kompletne usuniecie N-końcowej metioniny są alanina, glicyna, prolina, seryna i treonina. W konkretnym wykonaniu urykaza zawiera dwa aminokońcowe aminokwasy, gdzie dwa aminokońcowe aminokwasy to metionina, po której następuje aminokwas wybrany z grupy składającej się z alaniny, glicyny, proliny, seryny i treoniny.
W innym wykonaniu wynalazku podstawione aminokwasy zostały zastąpione przez treoninę.
W pewnym wykonaniu wynalazku urykazą jest urykaza ssacza.
W kolejnym wykonaniu wynalazku urykaza ssacza obejmuje sekwencję urykazy z wątroby świńskiej, wołowej, owczej albo pawiana.
W jeszcze innym wykonaniu wynalazku urykazą jest urykaza chimerowa z dwóch albo większej liczby urykaz ssaczych.
PL 215 285 B1
W pewnym z wykonań wynalazku urykazy ssacze są wybrane spośród urykazy z wątroby świńskiej, wołowej, owczej albo pawiana .
W pewnym wykonaniu wynalazku urykaza zawiera sekwencję z SEK NR ID: 8.
W jeszcze innym wykonaniu wynalazku urykaza zawiera sekwencję z SEK NR ID: 13.
Wynalazek niniejszy dostarcza więc kwasów nukleinowych kodujących urykazę zawierającą sekwencję SEK NR ID: 10.
W pewnym wykonaniu wynalazku urykaza obejmuje urykazę grzybową albo z mikroorganizmu.
W pewnym wykonaniu wynalazku urykazą grzybową albo z mikroorganizmu jest urykaza Aspergillus flavus, Arthrobaeter globiformis lub Candida utilis.
W pewnym wykonaniu wynalazku urykaza obejmuje urykazę bezkręgowca.
W pewnym wykonaniu wynalazku urykazą bezkręgowca jest urykaza Drosophila melanogaster lub Drosophila pseudoobseura.
W pewnym wykonaniu wynalazku urykaza obejmuje urykazę roślinną.
W pewnym wykonaniu wynalazku urykazą roślinną jest urykaza Glycine max z guzów korzeniowych.
Niniejszy wynalazek dostarcza sekwencji kwasu nukleinowego kodującej urykazę.
Niniejszy wynalazek dostarcza wektora zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego.
W konkretnym wykonaniu urykaza jest wyizolowana. W konkretnym wykonaniu urykaza jest oczyszczona. W konkretnych wykonaniach urykaza jest wyizolowana i oczyszczona.
Niniejszy wynalazek dostarcza komórki gospodarza zawierającej wektor.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania sekwencji kwasu nukleinowego, obejmującego modyfikację poprzez techniki PCR (od ang. polymerase chain reaction, reakcja łańcuchowa polimerazy) sekwencji kwasu nukleinowego kodującej nieskróconą urykazę. Specjalista w tej dziedzinie wie, że pożądaną sekwencję kwasu nukleinowego wytwarza się poprzez PCR przy zastosowaniu syntetycznych starterów oligonukleotydowych, które są komplementarne do regionów docelowego DNA (jeden dla każdej nici), który ma podlegać amplifikacji. Startery dodaje się do docelowego DNA (nie muszą być czyste) w obecności nadmiaru deoksynukleotydów i polimerazy Taq, termostabilnej polimerazy DNA. W serii (typowo 30) cykli temperaturowych, docelowy DNA jest wielokrotnie: denaturowany (około 90°C), łączony ze starterami (typowo w 50-60°C) i nić potomna jest wydłużana ze starterów (72°C). Nici potomne same działają jako matryce do kolejnych cykli, fragmenty DNA pasujące do obydwu starterów są powielane wykładniczo, a nie liniowo.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania zmutowanej rekombinowanej urykazy, obejmującego transfekowanie komórki gospodarza wektorem, gdzie komórka gospodarza wyraża urykazę, izolowanie zmutowanej rekombinowanej urykazy z komórki gospodarza, izolowanie oczyszczonej zmutowanej rekombinowanej urykazy, na przykład poprzez zastosowanie technik chromatograficznych i oczyszczanie zmutowanej rekombinowanej urykazy. Przykładowo, urykazę można wywarzać według metod opisanych w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 00/08196, włączonego tu w całości jako odniesienie.
Urykazę można wyizolować i/lub oczyścić przy zastosowaniu dowolnej metody znanej specjalistom w tej dziedzinie. Wyrażane polipeptydy według wynalazku generalnie izoluje się w postaci zasadniczo czystej. Korzystne jest, jeżeli polipeptydy izoluje się do czystości co najmniej 80% wagowo, korzystniej do czystości co najmniej 95% wagowo, a najkorzystniej do czystości co najmniej 99%. Generalnie, takie oczyszczenie można uzyskać na przykład poprzez standardowe techniki frakcjonowania siarczanem amonu, elektroforezy SDS-PAGE i chromatografii powinowactwa. Korzystne jest, jeżeli urykazę izoluje się przy zastosowaniu kationowego czynni ka powierzchniowo czynnego, na przykład chlorku cetylopirydynowego (CPC), zgodnie z metodą opisaną w rozpatrywanym jednocześnie zgłoszeniu patentowym USA, złożonym 11 kwietnia 2005, o numerze zgłoszenia 60/670,520 i numerze odniesienia rzecznika 103864.146644, zatytułowanym „Oczyszczanie białek przy zastosowaniu kationowych czynników powierzchniowo czynnych, włączonym tu w całości jako odniesienie.
W korzystnym wykonaniu komórkę gospodarza traktuje się tak, aby wywołać ekspresję zmutowanej rekombinowanej urykazy. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że transfekcję komórek wektorem zwykle uzyskuje się stosując DNA wytrącony jonami wapniowymi, jakkolwiek można zastosować rozmaite inne metody (np. elektroporację).
W pewnym wykonaniu wynalazku, wektor jest pod kontrolą promotora wrażliwego na ciśnienie osmotyczne. Promotorem jest region DNA, do którego wiąże się polimeraza RNA przed zapoczątkoPL 215 285 B1 waniem transkrypcji DNA do RNA. Promotor wrażliwy na ciśnienie osmotyczne rozpoczyna transkrypcję w rezultacie zwiększonego ciśnienia osmotycznego wyczuwanego przez komórkę.
W pewnym wykonaniu wynalazku promotorem jest zmodyfikowany promotor osmB.
W innych konkretnych wykonaniach urykazą według wynalazku jest urykaza połączona z polimerem.
W pewnym wykonaniu wynalazku, dostarczona jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca urykazę. W jednym z wykonań kompozycją jest roztwór urykazy. W korzystnym wykonaniu wynalazku roztwór jest jałowy i odpowiedni do wstrzyknięcia. W jednym z wykonań taka kompozycja zawiera urykazę jako roztwór w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. W jednym z wykonań kompozycja jest dostarczona w fiolce, ewentualnie mająca gumowe zamknięcie do zastrzyków. W konkretnych wykonaniach, kompozycja zawiera urykazę w roztworze w stężeniu od 2 do 16 miligramów urykazy na mililitr roztworu, od 4 do 12 miligramów na mililitr lub od 6 do 10 miligramów na mililitr. W korzystnym wykonaniu kompozycja zawiera urykazę w stężeniu 8 miligramów na mililitr. Korzystne jest, jeżeli masę urykazy mierzy się w odniesieniu do masy białka.
Tryby skutecznego podawania kompozycji według wynalazku mogą zostać określone przez specjalistę w tej dziedzinie. Przydatne wskaźniki do badania skuteczności danego trybu są znane specjalistom w tej dziedzinie. Przykłady takich wskaźników obejmują normalizację albo obniżenie poziomów kwasu moczowego w osoczu (PUA, od ang. plasma uric acid) i obniżenie lub utrzymywanie się PUA do 6,8 mg/dl lub mniej, korzystnie 6 mg/dl lub mniej. W korzystnym wykonaniu osobnik leczony kompozycją według wynalazku ma PUA wynoszący 6 mg/ml lub mniej przez co najmniej 70%, co najmniej 80% lub co najmniej 90% całego okresu leczenia. Przykładowo, korzystne jest, jeżeli osobnik w trakcie 24 tygodni leczenia ma PUA wynoszący 6 mg/ml lub mniej przez co najmniej 80% 24-tygodniowego okresu leczenia, tj. co najmniej przez czas równy ilości czasu w 134,4 dniach (24 tygodnie x 7 dni/tydzień x 0,8 = 134,4 dni).
W konkretnym wykonaniu, 0,5 do 24 mg urykazy w roztworze podaje się raz na 2 do 4 tygodni. Urykazę można podawać dowolną z dróg znanych specjaliście w tej dziedzinie, na przykład dożylnie, domięśniowo lub podskórnie. Przy podawaniu dożylnym korzystne jest podawanie 0,5 mg do 12 mg urykazy. Przy podawaniu podskórnym korzystne jest podawanie 4 do 24 mg urykazy. W korzystnym wykonaniu urykazę podaje się poprzez wlew dożylny przez okres 30 do 240 minut. W jednym z wykonań, 8 mg urykazy podaje się co dwa tygodnie. W konkretnym wykonaniu, wlew można przeprowadzić przy użyciu 100 do 500 ml roztworu soli fizjologicznej. W korzystnym wykonaniu 8 mg urykazy w roztworze podaje się przez okres 120 minut co dwa tygodnie albo co cztery tygodnie; korzystne jest, jeżeli urykazę rozpuszcza się w 250 ml roztworu soli fizjologicznej do wlewu. W konkretnych wykonaniach, podawanie urykazy następuje w okresie leczenia trwającym 3 miesiące, 6 miesięcy, 8 miesięcy lub 12 miesięcy. W innych wykonaniach okresem leczenia jest 12 tygodni, 24 tygodnie, 36 tygodni lub 48 tygodni. W konkretnym wykonaniu, okres leczenia obejmuje dłuższy okres czasu np. 2 lata lub dłużej, aż do końca życia leczonego osobnika. Dodatkowo, można zastosować wielokrotne okresy leczenia oddzielone od siebie czasem bez leczenia, np. 6 miesięcy leczenia, po którym następują 3 miesiące bez leczenia, a następnie 6 dodatkowycń miesięcy leczenia itd.
W niektórych wykonaniach związki przeciwzapalne można podawać profilaktycznie w celu eliminacji albo zmniejszenia występowania reakcji na wlew na skutek podawania urykazy. W jednym z wykonań wraz kompozycją podaje się również co najmniej jeden kortykosteroid, co najmniej jedną antyhistamine, co najmniej jeden NSAID albo ich kombinację. Przydatne kortykosteroidy obejmują betametazon, budesonid, kortyzon, deksametazon, hydrokortyzon, metyloprednizolon, prednizolon, prednizon i triamcynolon. Przydatne NSAID obejmują ibuprofen, indometacynę, naproksen, aspirynę, acetominofen, celekoksib i waldecoksib. Przydatne antyhistaminy obejmują azatadynę, bromofeniraminę, cetyryzynę, chlorfeniraminę, klemastin, cyproheptadynę, desloratadynę, dekschlorfeniraminę, dimenhydrynat, difenhydraminę, doksylaminę, feksofenadynę, hydroksyzynę, Ioratadynę i fenindaminę.
W korzystnym wykonaniu, antyhistaminą jest feksofenadyna, NSAIDem jest acetaminofen, a kortykosteroidem jest hydrokortyzon i/lub prednizolon. Korzystne jest, jeżeli kombinację wszystkich trzech (niekoniecznie jednocześnie) podaje się przed wlewem roztworu urykazy. W korzystnym wykonaniu NSAID i antyhistaminę podaje się doustnie 1 do 4 godzin przed wlewem urykazy. Odpowiednia dawka feksofenadyny obejmuje około 30 do około 180 mg, około 40 do około 150 mg, około 50 do około 120 mg, około 60 do około 90 mg, około 60 mg, korzystnie, 60 mg. Odpowiednia dawka acetaminofenu obejmuje około 500 do około 1500 mg, około 700 do około 1200 mg, około 800 do około
PL 215 285 B1
1100 mg, około 1000 mg, korzystnie 1000 mg. Odpowiednia dawka hydrokortyzonu obejmuje około 100 do około 500 mg, około 150 do około 300 mg, około 200 mg, korzystnie 200 mg. W jednym z wykonań, antyhistaminą nie jest difenńydramina. W innym wykonaniu NSAIDem nie jest acetaminofen. W korzystnym wykonaniu 60 mg feksofenadyny podaje się doustnie noc przed wlewem urykazy; 60 mg feksofenadyny i 1000 mg acetaminofenu podaje się doustnie następnego dnia rano, a na koniec, 200 mg hydrokortyzonu podaje się tuż przed wlewem roztworu urykazy. W jednym z wykonań, prednizon podaje się w przeddzień, korzystnie wieczorem przed podaniem urykazy. Odpowiednia dawka prednizonu obejmuje 5 do 50 mg, korzystnie 20 mg. W niektórycń wykonaniach te działania profilaktyczne stosuje się wobec osobników otrzymujących albo mających otrzymywać urykazę, włączając w to urykazę PEGylowana i niePEGylowaną. W konkretnych wykonaniach te działania profilaktyczne stosuje się wobec osobników otrzymujących albo mających otrzymywać peptydy terapeutyczne inne niż urykaza, gdzie inne terapeutyczne peptydy są PEGylowane lub niePEGylowane.
W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycja farmaceutyczna zawiera urykazę, która została zmodyfikowana poprzez połączenie z polimerem i zmodyfikowana urykaza zachowuje aktywność rozkładania kwasu moczowego. W konkretnym wykonaniu koniugaty polimer-urykaza są wytwarzane jak opisano w międzynarodowej publikacji patentowej nr WO 01/59078 i zgłoszeniu USA nr 09/501730, włączonych tu w całości jako odniesienie.
W jednym z wykonań wynalazku, polimer jest wybrany z grupy składającej się z glikolu polietylenowego, dekstranu, glikolu polipropylenowego, hydroksypropylometylocelulozy, karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidonu i alkoholu poliwinylowego.
W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycja zawiera 2-12 cząsteczek polimeru na każdą podjednostkę urykazy, korzystnie 3 do 10 cząsteczek polimeru na podjednostkę.
W pewnym wykonaniu wynalazku każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową między około 1 kD i około 100 kD.
W innym wykonaniu wynalazku każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową między około 1 kD i około 50 kD. W korzystnym wykonaniu wynalazku każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową między około 5 kD a około 20 kD, około 8 kD a około 15 kD, około 10 kD a 12 kD, korzystnie, około 10 kD. W korzystnym wykonaniu każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową około 5 kD lub około 20 kD. W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku, każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową 10 kD. Brana jest również pod uwagę mieszanina cząsteczek o różnych masach. W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycja jest odpowiednia do powtarzanego podawania kompozycji.
W konkretnym wykonaniu, przyłączenie urykazy do polimeru obejmuje wiązania wybrane z grupy składającej się z wiązań uretanowych, drugorzędowych wiązań aminowycń i wiązań amidowych.
Niniejszy wynalazek dotyczy także komórki o zdolności wytwarzania urykazy mającej sekwencję aminokwasową zrekombinowanej urykazy, gdzie urykaza została skrócona o 1-20 aminokwasów i ma zmutowane aminokwasy i aktywność metabolizowania kwasu moczowego.
Niniejszy wynalazek ujawnia także sposoby metabolizowania kwasu moczowego przy zastosowaniu urykazy.
Niniejszy wynalazek dostarcza zastosowania kompozycji urykazy do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynie biologicznym.
W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycję urykazy stosuje się do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynie biologicznym obejmującym krew.
Dostarczane są również nowe cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące polipeptydy urykazy. Manipulacje, które prowadzą do ich wytwarzania są dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie. Przykładowo, sekwencje kwasów nukleinowych urykazy można modyfikować przy zastosowaniu dowolnej z licznych strategii znanych w tej dziedzinie (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Sekwencje mogą być przecinane w odpowiednich miejscach przez endonukleazę(y) restrykcyjną (e), a następnie, jeśli to pożądane, poddane dalszej modyfikacji enzymatycznej, izolowane i poddane ligacji in vitro. Przy wytwarzaniu genu kodującego urykazę, należy zadbać o upewnienie się, że zmodyfikowany gen zachowuje odpowiednią ramkę odczytu dla translacji, nie przerwaną przez sygnały stop dla translacji. Dodatkowo, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą urykazę można zmutować in vitro albo in vivo w celu wytworzenia i/lub zniszczenia sekwencji translacyjnych inicjacyjnych i/lub terminacyjnych albo do wytworzenia wariacji w regionach kodujących i/lub utworzenia nowych miejsc dla enzymów restrykcyjnych albo zniszczenia istniejących wcześniej, w celu ułatwienia dalszej modyfikacji in vitro. Można zastosować
PL 215 285 B1 dowolną technikę mutagenezy znaną w tej dziedzinie, włączając w to między innymi, ukierunkowaną mutagenezę in vitro (Hutchinson, C., i wsp., 1978, J. Biol. Chem 253:6551), zastosowanie łączników
TAB® (Pharmacia), itd.
Sekwencję nukleotydową kodującą białko urykazy można wstawić do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, tj. wektora, który zawiera niezbędne elementy do transkrypcji i translacji wstawionej sekwencji kodującej białko. To obejmuje między innymi ssacze systemy komórkowe zakażane wirusem (np. wirusem krowianki, adenowirusem, itd.); systemy komórek owadów zakażanych wirusem (np. bakulowirusem), mikroorganizmy, takie jak drożdże, zawierające wektory drożdżowe albo bakterie transformowane DNA bakteriofagowym, DNA plazmidowym albo DNA kosmidowym. Elementy ekspresyjne tych wektorów mogą różnić się siłą i specyficznościami. W zależności od zastosowanego systemu gospodarz-wektor, można zastosować dowolny z wielu odpowiednich elementów transkrypcyjnych i translacyjnych.
Dowolną ze znanych metod wstawiania fragmentów DNA do wektora można zastosować w celu skonstruowania wektorów ekspresyjnych zawierających chimerowy gen składający się z odpowiednich sygnałów kontrolnych transkrypcyjnych/translacyjnych i sekwencji kodujących białko. Metody te mogą obejmować techniki rekombinowania DNA in vitro i techniki syntetyczne oraz rekombinację in vivo (rekombinację genetyczną). Ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującego urykazę można regulować przez drugą sekwencję kwasu nukleinowego, tak że białko urykazy jest wyrażane w gospodarzu transformowanym zrekombinowaną cząsteczką DNA. Przykładowo, ekspresja urykazy może być pod kontrolą dowolnego elementu promotora/wzmacniacza znanych w tej dziedzinie. Promotory, które można zastosować do kontrolowania ekspresji urykazy obejmują między innymi region wczesnego promotora SV40 (Bernoist i Chambon, 1981, Nature 290:304-310), promotor zatwary w długich końcowych powtórzeniach 3' wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto, i wsp., 1980, Cell 22:787-797), promotor kinazy tymidynowej opryszczki (Wagner i wsp., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), sekwencje regulacyjne genu metalotioneiny (Brinster i wsp., 1982, Nature 296:39-42); ekspresyjne wektory prokariotyczne, takie jak promotor β-laktamazy (Villa-Kamaroff, i wsp., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), promotor tac (DeBoer, i wsp., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25) oraz promotor osmB. W konkretnych wykonaniach kwasy nukleinowe zawierają sekwencję kwasu nukleinowego kodującą urykazę połączoną funkcjonalnie z promotorem heterologicznym.
Po wytworzeniu i wyizolowaniu konkretnej cząsteczki DNA zawierającej kodującą sekwencję kwasu nukleinowego, można zastosować kilka znanych w tej dziedzinie metod do jej namnażania. Po opracowaniu odpowiedniego systemu gospodarza i warunków wzrostu, zrekombinowabne wektory ekspresyjne można namnażać i uzyskiwać w dużych ilościach. Jak wcześniej wyjaśniono, wektory ekspresyjne, które można zastosować obejmują między innymi następujące wektory albo ich pochodne: ludzkie albo zwierzęce wirusy, takie jak wirus krowianki lub adenowirus, wirusy owadów, takie jak bakulowirus, wektory drożdżowe, wektory bakteriofagowe (np. lambda) oraz wektory DNA plazmidowe i kosmidowe, aby wymienić kilka.
Dodatkowo, można wybrać szczep komórek gospodarza, który moduluje ekspresję wstawionych sekwencji albo modyfikuje i dokonuje obróbki produktu genu w specyficzny, pożądany sposób. Ekspresję z pewnych promotorów można zwiększyć w obecności pewnych induktorów, a zatem ekspresja poddanej zabiegom inżynierii genetycznej urykazy może być kontrolowana. Ponadto, różne szczepy gospodarzy mają właściwości i specyficzne mechanizmy translacyj n ej i potransiacyjnej obróbki i modyfikacji (glikozylacja, cięcie) białek. Można wybrać odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarzy dla zapewnienia pożądanej modyfikacji i obróbki wyrażonego obcego białka. Różne systemy ekspresyjne wektor/gospodarz mogą wpływać w różnym stopniu na reakcje obróbki, takie jak cięcia proteolityczne.
W konkretnych wykonaniach wynalazku ekspresję urykazy w E. coli przeprowadza się korzystnie przy użyciu wektorów, które zawierają promotor osmB.
Przykłady praktycznej realizacji wynalazku
P r z y k ł a d 1. Konstrukcja genu i ekspresja plazmidu dla ekspresji urykazy
Rekombinowana świńska urykaza (oksydaza moczanowa), Pig-KS-ΔΝ (białko urykazy świni ze skróconym końcem aminowym, z zastąpieniem aminokwasów 291 i 301, odpowiednio, lizyną i seryną) wyrażono w szczepie E. coli K-12 W3110 F-. Skonstruowano serię plazmidów, z uzyskaniem na koniec pOUR-P-AN-ks-1, który, po transformacji komórek gospodarza E. coli był zdolny do kierowania wydajną ekspresją urykazy.
Izolacja i subklonowanie cDNA urykazy z wątroby świni i pawiana
PL 215 285 B1 cDNA urykaz wytworzono z wątrób świń i pawianów poprzez izolację i klonowanie odpowiedniego RNA. Całkowity komórkowy RNA ekstrahowano z wątrób świń i pawianów (Erlich, H. A. (1989). PCR Technology; Principles and Application for DNA Amplification; Sambrook, J., i wsp. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2; Ausubel, F. M. i wsp. (1998). Current protocols in molecular Biology), a następnie przepisywano przy zastosowaniu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA Taq (Gibco BRL, Life Technologies).
Syntetyczne startery oligonukleotydowe stosowane do amplifikacji PCR oksydaz moczanowych (urykaz) świni i pawiana są pokazane w Tabeli 1.
T a b e l a 1. Startery do amplifikacji poprzez PCR cDNA dla urykazy
Sekwencjami enzymów restrykcyjnych wprowadzonymi na końcach starterów i zapisanymi małymi literami w Tabeli 1, były sensowne EcoRI i NcoI (Świna i pawian) i antysensowne NcoI, HindIII i XbaI (Świna), XbaI i NcoI (pawian). W starterze sensownym dla pawiana, trzeci kodon GAC (kwas asparaginowy) obecny w urykazie pawiana został zastąpiony CAC (histydyna), kodonem, który jest obecny w tej pozycji w sekwencji kodującej pseudogenu ludzkiej oksydazy moczanowej. Konstrukt dla rekombinowanej urykazy pawiana wytworzony przy użyciu tych starterów jest nazwany D3H Baboon Uricase.
Produkt PCR dla urykazy świni został strawiony EcoRI i HindIII i sklonowany w pUC18 z wytworzeniem pUC18-Pig Uricase. Produkt PCR dla D3H Baboon Uricase sklonowano bezpośrednio w wektorze pCR™II, stosując TA Cloning™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), z wytworzeniem pCR™II-D3H Baboon Uricase.
Poddane ligacji cDNA zastosowano do transformacji szczepu E. coli XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA). Wytworzono plazmidowy DNA zawierający sklonowane cDNA urykazy i klony, które posiadały opublikowaną sekwencję DNA kodującą urykazę (z różnicą polegającą na podstawieniu D3H w urykazie pawiana, pokazanej w Tabeli 1) wybrano i wyizolowano. W wybranym klonie pCR™II-D3H Baboon Uricase, sekwencje pCR™II znajdowały się obok kodonu stop urykazy, co było wynikiem delecji sekwencji wprowadzonej poprzez PCR. W konsekwencji, miejsca restrykcyjne XbaI i NcoI z nie podlegającego translacji regionu 3' zostały wyeliminowane, umożliwiając bezpośrednie klonowanie przy zastosowaniu NcoI na końcu 5' produktu PCR i BamHI, które pochodzi z wektora pCR™II.
Subklonowanie cDNA urykazy do wektorów ekspresyjnych pET
Subklonowanie urykazy pawiana cDNA D3H pawiana zawierający sekwencję kodującą pełnej długości dla urykazy wprowadzono do wektora ekspresyjnego pET-3d (Novagen, Madison, WI). pCR™II-D3H Baboon Uricase strawiono NcoI i BamIII i wyizolowamo fragment 960 bp. Plazmid ekspresyjny pET-3d strawiono NcoI i BamHI i wyizolowano fragment 4600 bp. Dwa fragmenty poddano ligaćji z wytworzeniem pET-3d-D3H Baboon.
Subklobowanie chimerowej urykazy świni-pawiana
Chimerową urykazę świni-pawiana (PBC, od ang. Pig-baboon chimera) skonstruowano w celu osiągnięcia wyższej ekspresji, stabilności i aktywności rekombinowanego genu. PBC skonstruowano poprzez wyizolowanie fragmentu NcoI-ApaI o wielkości 4936 bp z klonu pET-3d-D3H Baboon i poddania ligacji wyizolowanego fragmentu z fragmentem NcoI-ApaI o wielkości 624 bp wyizolowanym z pUC18-Pig Uricase, prowadząc do wytworzenia pET-3d-PBC. cDNA urykazy PBC składa się z kodonów 1-225 urykazy świni połączonych w ramce z kodonami 226-304 urykazy pawiana.
Subklonowanie cDNA urykazy Pig-KS
Urykazę Pig-KS skonstruowano w celu dodania jednej reszty lizyny, która może dostarczać dodatkowego miejsca PEGylacji. KS oznacza wstawienie aminokwasu lizyny do urykazy świni, w pozycji
PL 215 285 B1
291, w miejsce argininy (R291K). Dodatkowo, treoniną w pozycji 301 została zastąpiona przez serynę (T301S). Plazmid z urykazą PigKS skonstruowano poprzez wyizolowanie fragmentu NcoI-NdeI o wielkości 4696 bp z pET-3d-D3H Baboon, a następnie ligację z fragmentem NcoI-NdeI o wielkości 864 bp wyizolowanym z pUC18-Pig Uricase, czego wynikiem było wytworzenie pET-3d-Pig-KS. Otrzymana w rezultacie sekwencja urykazy PigKS składa się z kodonów 1-288 połączonych w ramce z kodonami 289-304 urykazy pawiana.
Subklonowanie sekwencji urykazy regulowanej przez promotor osmB
Gen urykazy subklonowano w wektorze ekspresyjnym zawierającym promotor osmB (zgodnie ze wskazówkami patentu USA nr 5,795,776, włączonego tu w całości jako odniesienie). Wektor ten umożliwia indukcję ekspresji białka w odpowiedzi na wysokie ciśnienie osmotyczne albo starzenie się hodowli. Plazmid ekspresyjny pMFOA-16 zawierał promotor osmB, sekwencję miejsca wiązania rybosomów (rbs, od ang. ribosomal binding site) i sekwencję terminatora transkrypcji (ter). Nadaje on oporność na ampicylinę (AmpR) i wyraża rekombinowaną ludzką esterazę acetylocholiny (AChE, od ang. human acetylcholine esterase).
Subklonowanie D3H Baboon Uricase
Plazmid pMFOA-18 strawiono NcoI i BamHI i wyizolowano duży fragment. Konstrukt pET-3d-D3H Baboon Uricase strawiono NcoI i BamHI I i wyizolowano fragment o wielkości 960 bp, który zawierał gen D3H Baboon Uricase. Te dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pMF0U18.
Plazmid ekspresyjny pMFXT133 zawierał promotor osmB, rbs (operon deo E. coli), ter (TrypA E. coli), rekombinowany polipeptyd inhibitora czynnika Xa (FxaI), i niesie gen oporności na tetracyklinę (TetR). Gen urykazy pawiana wstawiono do tego plazmidu w celu zamiany genów oporności na antybiotyk. Plazmid pMFOU18 strawiono NcoI, wypełniono końce, a następnie strawiono XhoI i wyizolowano fragment o wielkości 1030 bp. Plazmid pMFXT133 strawiono NdeI, wypełniono końce, a następnie strawiono XhoI i wyizolowano duży fragment. Dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem wektora ekspresyjnego dla urykazy pawiana, pURBA16.
Subklonowanie chimerowej urykazy świni-pawiana
Plazmid pURBA16 strawiono ApaI i AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 2320 bp. Plazmid pMFXT133 strawiono NdeI, wypełniono końce, a następnie strawiono AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 620 bp. Konstrukt pET-3d-PBC strawiono XbaI, wypełniono końce, a następnie strawiono ApaI i wyizolowano fragment o wielkości 710 bp. Trzy fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pURPB, plazmidu, który wyrażał urykazę PBC pod kontrolą promotora i rbs osmB, jak również rbs T7, który pochodził z wektora pET-3d.
Rbs T7 został wycięty w dodatkowym etapie. pUR-PB strawiono NcoI, wypełniono końce, a następnie strawiono AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 3000 bp. Plazmid pMFXT133 strawiono NdeI, wypełniono końce, a następnie strawiono AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 620 bp. Te dwa fragmenty poddano ligacji z pDUR-PB, który wyraża PBC pod kontrolą promotora osmB.
Konstrukcja pOUR-PB-ANC
Wprowadzono kilka zmian w cDNA urykazy, które prowadzą do zasadniczego zwiększenia stabilności rekombinowanego enzymu. Skonstruowano plazmid pOUR-PBC-ANC, w którym N-końcowy peptyd dojrzewania złożony z sześciu reszt i tripeptyd na końcu C, który działa in vivo jako sygnał kierujący do peroksysomów, obydwa zostały usunięte. Przeprowadzono to z użyciem sekwencji PBC w plazmidzie pDUR-PB i specyficznych starterów oligonukleotydowych zamieszczonych w Tabeli 2, przy zastosowaniu amplifikacji w reakcji PCR.
T a b e l a 2. Startery do amplifikacji urykazy PBC-ANC w reakcji PCR
Urykaza PBC-ANC:.................................................. i
Sensowny
5' gcgcatATGACTTACAAAAAGAATGATGAGGTAGAG 3’ (SEK NR ID: 5)
Antysensowny
5' ccgtctagaTT AAG ACAACTTCCTCTTGACTGTACCAGTAATTTTTCCGT ATGG 3f (SEK NR ID: S)
Sekwencje enzymów restrykcyjnych wprowadzone na końcach starterów pokazane jako wytłuszczenie i regiony niekodujące są pokazane w Tabeli 2 małymi literami. NdeI jest sensowny, a XbaI jest antysensowny. Starter sensowny zastosowano również w celu wyeliminowania wewnętrznego miejsca restrykcyjnego NdeI poprzez wprowadzenie mutacji punktowej (podkreślona), która nie wpływa na sekwencję aminokwasową, a zatem ułatwiała subklonowanie przy zastosowaniu NaeI.
Fragment o wielkości 900 par zasad wytworzony poprzez amplifikację w reakcji PCR pDUR-PB przecięto NdeI i XbaI i wyizolowano. Otrzymany fragment wprowadzono następnie do plazmidu eks16
PL 215 285 B1 presyjnego deo, pDBAST-RAT-N, który niesie promotor deo-P1P2 i rbs pochodzący z E. coli i wyraża konstytutywnie prekursor ludzkiej rekombinowanej insuliny. Plazmid strawiono NdeI i XbaI i wyizolowano fragment o wielkości 4035 bp i poddano go ligacji z produktem PCR dla urykazy PBC. Otrzymany w rezultacie konstrukt, pDUR-PB-ANC, użyto do transformacji E. coli K-12 Sφ733 (F-cytR strA), która wyrażała wysokie poziomy aktywnej skróconej urykazy.
Podwójne skrócona sekwencja PBC-ANC została również wyrażona pod kontrolą promotora osmB. Plazmid pDUR-PB-ANC strawiono AlwNI - NdeI i wyizolowano fragment o wielkości 3459 bp. Plazmid pMFXT133, opisany powyżej, strawiono NdeI - AlwNI, i wyizolowano fragment o wielkości 660 bp. Fragmenty poddano następnie ligacji z wytworzeniem pOUR-PB-ANC, który został wprowadzony do szczepu E. coli K-12 W3110 F- i wyrażał wysokie poziomy aktywnej skróconej urykazy.
Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego dla urykazy pOUR-P^^ks-1
Plazmid ten skonstruowano w celu polepszenia stabilności rekombinowanego enzymu. Urykazę Pig-KS-ΔΝ skrócono jedynie na końcu N (ΔΝ), gdzie usunięty został N-końcowy peptyd dojrzewania złożony z sześciu reszt i zawierała ona mutatcje S46T, R291K i T301S. W pozycji 46 występowała reszta treoniny zamiast seryny na skutek mutacji konserwatywnej, która nastąpiła w czasie amplifikacji PCR i klonowania. W pozycji 291 lizyna zastąpiła argininę, a w pozycji 301 seryna została wstawiona zamiast treoniny. Obydwie reszty pochodziły z sekwencji urykazy pawiana Modyfikacje R291K i T301S są oznaczone jako KS i były dyskutowane powyżej. Dodatkowa reszta lizyny dostarczała dodatkowego potencjalnego miejsca PEGylacji.
W celu skonstruowania pOUR-P-AN-ks-1 (Fig. 1), plazmid pOUR-PB-ANC strawiono ApaI XbaI i wyizolowano fragment o wielkości 3873 bp. Plazmid pET-3d-PKS (konstrukcj a pokazana na Fig. 4) strawiono ApaI - SpeI i wyizolowano fragment o wielkości 270 bp. Cięcie SpeI pozostawia wystający w stronę 5' koniec CTAG, który był wydajnie łączony poprzez ligację z fragmentami DNA wytworzonymi przez XbaI. Te dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pOUR-P-AN-ks-1. Po ligacji miejsca rozpoznawane przez enzymy SpeI i XbaI zostały utracone (ich miejsce jest pokazane w nawiasach na Fig. 9). Konstrukt pOUR-P-AN-ks-1 został wprowadzony do szczepu E. coli K-12 W3110 F-, prototroficznego, ATCC#27325. Otrzymana w rezultacie urykaza Pig-KS-ΔΝ, wyrażana pod kontrolą promotora osmB, dawała wysokie poziomy rekombinowanego enzymu mającego lepszą aktywność i stabilność.
Na Figurze 1 przeastawiono strukturę plazmidu pOUR-Ρ-ΔΝ-ks-1. Numery obok miejsc restrykcyjnych wskazują pozycję nukleotydową w odniesieniu do miejsca HaeII, oznaczonego jako I.'Miejsca restrykcyjne, które zostały utracone w czasie klonowania są zaznaczone nawiasami. Plazmid pOUR-P-AN-ks-1, kodujący urykazę Pig-KS-ΔΝ ma długość 4143 par zasad (bp) i zawiera następujące elementy:
1. Fragment DNA o długości 113 bp, rozciągający się od nukleotydu numer 1 do miejsca NdeI (w pozycji 113), który zawiera promotor osmB i miejsce wiązania rybosomów (rbs).
2. Fragment DNA o długości 932 bp, rozciągający się od NdeI (w pozycji 113) do styku Spel/Xbal (w pozycji 1045), który zawiera: 900 bp region kodujący Pig-KS-ΔΝ (sekwencja kwasu nukleinowego dla końca aminowego białka skróconej urykazy świni, w którym aminokwasy 291 i 301 są zastąpione, odpowiednio, lizyną, seryną) i sekwencję flankującą o długości 32 bp pochodzącą z pCR™II, z miejsca klonowania TA przed miejscem restrykcyjnym Spel/Xbal.
3. Sekwencję z wieloma miejscami do klonowania (MCS, od ang. multiple cloning sites) o wielkości 25 bp od styku Spel/Xbal (w pozycji 1045) do HindIII (w pozycj i 1070).
4. Syntetyczny oligonukleotyd o wielkości 40 bp, zawierający terminator transktypcji TrpA (ter) z końcami HindIII (w pozycji 1070) i AatII (w pozycji 1110).
5. Fragment DNA o długości 1519 bp, rozciągający sie od miejsca AatII (w pozycji 1110) do MscI/Scal (w pozycji 2629) na pBR322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę (TetR).
6. Fragment DNA o długości 1514 bp, rozciągający się od miejsca Scal (w pozycji 2629) do HaeII (w pozycji 4143) na pBR322, który zawiera początek replikacji.
Na Figurze 2 pokazano DNA i wydedukowane sekwencje aminokwasowe urykazy Pig-KS-ΔΝ. Na tym rysunku numeracja aminokwasów jest według kompletnej sekwencji urykazy świni. Po reszcie inicjacyjnej metioniny wstawiona została treonina w miejsce kwasu asparaginowego w sekwencji urykazy świni. Ta reszta treoninowa umożliwiała usuwanie metioniny przez bakteryjną aminopeptydazę. Przerwa w sekwencji aminokwasowej przedstawia usunięty N-końcowy peptyd dojrzewania. Wskazane są miejsca restrykcyjne, które zostały wykorzystane na różnych etapach subklonowania różnych
PL 215 285 B1 sekwencji urykazy (Apal, NdeI, BamHI, EcoRI i SpeI). Nie podlegająca translacji sekwencja 3', zapisana małymi literami, pochodziła z sekwencji pCRTMII. Kodon stop dla translacji jest zaznaczony gwiazdką.
Na Figurze 3 pokazuje dopasowanie sekwencji aminokwasowych różnych sekwencji rekombinowanych urykaz. Górna linia przedstawia urykazę świni, która obejmuje pełną sekwencję aminokwasową. Druga linia to sekwencja podwójnie skróconej chimerowej urykazy świni-pawiana (PBC-ANC). Trzecia linia pokazuje sekwencję urykazy Pig-KS-ΔΝ, która jest skrócona jedynie na końcu N i zawiera mutacje S46T i zmiany aminokwasowe R291K i T301S, obydwie odzwierciedlające pochodzenie z pawiana końca karboksylowego sekwencji kodującej urykazę. Gwiazdka wskazuje pozycję, w której występują różnice aminokwasów w urykazie Pig-KS-ΔΝ w porównaniu z opublikowaną sekwencją urykazy świni; kółka wskazują na pozycje, w których występują różnice aminokwasów w Pig-KS-ΔΝ w porównaniu z PBC-ΔΝ, chimerze ze świni-pawiana; a linie przerywane wskazują delecje aminokwasów.
cDNA z natywnej urykazy pawiana, świni i królika, z mutacją Y97K oraz chimery ze świni/pawiana (PBC) skonstruowano do klonowania w E. coli. Klony wyrażające wysokie poziomy wariantów urykazy skonstruowano i wyselekcjonowano tak, że wszystkie były w E. coli W3110 F-, a ekspresja była regulowana przez osmB. Plazmidowe DNA izolowano, sprawdzano poprzez sekwencjonowanie DNA i analizę enzymami restrykcyjnymi i komórki hodowano.
Konstrukcji skróconych urykaz, włączając w to pig-ΔΝ i Pig-KS-ΔΝ dokonano poprzez ligację krzyżową pomiędzy PBC-ANC i Pig-KS, a następnie cięcie endonukleazami restrykcyjnymi, odpowiednio, ApaI i XbaI oraz ApaI plus SpeI. Można było sądzić, że te skrócone mutanty zachowają aktywność, ponieważ sześć N-końcowych reszt, peptyd „dojrzewania (1-2), i C-końcowy tri-peptyd, „sygnał kierowania do peroksysomów (3-5), nie ma funkcji, która znacząco wpływa na aktywność enzymatyczną, a jest możliwe że te sekwencje mogą być immunogenne. Wybrano klony wyrażające bardzo wysokie poziomy urykazy.
P r z y k ł a d 2. Transformacja plazmidu ekspresyjnego do bakteryjnej komórki gospodarza
Plazmid ekspresyjny, pOUR-P-AN-ks-1, został wprowadzony do was szczepu E. coli K-12 W3110 F-. Przygotowano komórki bakteryjne do transformacji, co obejmowało hodowanie do środka fazy logarytmicznej w buforze Luria (LB), następnie komórki zbierano poprzez wirowanie, przemywano zimną wodą i zawieszano w 10% glicerolu w wodzie w stężeniu około 3x1010 komórek na ml. Komórki przechowywano w porcjach w -70°C. Plazmidowy DNA wytrącano następnie etanolem i rozpuszczano w wodzie.
Komórki bakteryjne i plazmidowy DNA mieszano i przeprowadzano transformację przy zastosowaniu metody wysokonapięciowej elektroporacji z użyciem Gene Pulser II z BIO-RAD (Trevors i wsp. (1992). Electrotransformation of bacteria by plasmid DNA, w Guide to Electroporation and Electrofusion (D.C. Chang, B. M. Chassy, J. A. Saunders and A. E. Sowers, wyd.), str. 265-290, Academic Press Inc., San Diego, Hanahan i wsp. (1991) Meth. Enzymol., 204, 63-113). Transformowane komórki zawieszano w pożywce SOC (2% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukoza), inkubowano w 37°C przez 1 godzinę i poddawano selekcji pod kątem oporności na tetracyklinę. Wybrano klony o wysokiej ekspresji.
P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie rekombinowanej urykazy
Bakterie, takie jak te transformowane (patrz wyżej), hodowano w pożywce zawierającej glukozę; pH utrzymywano na poziomie 7,2±0.2, w około 37°C.
W trakcie ostatnich 5-6 godzin hodowli, pożywka była uzupełniona KCl do końcowego stężenia 0,3 M. Hodowlę kontynuowano dla umożliwienia akumulacji urykazy.
Rekombinowana urykaza akumulowała się w komórkach bakteryjnych jako nierozpuszczalny precypitat podobny do ciał inkluzyjnych (IB, od ang. inclusion bodies). Zawiesinę komórek przemywano poprzez wirowanie i zawieszano 50 mM buforze Tris, pH 8,0 i 10 mM EDTA i doprowadzano do ostatecznej objętości około 40 razy sucha masa komórek.
IB zawierające rekombinowana urykazę izolowano poprzez wirowanie po rozbiciu komórek bakteryjnych przy użyciu Iizozymu i wysokiego ciśnienia. Traktowanie lizozymem (2000-3000 jednostek/ml) przeprowadzano przez 16-20 godzin przy pH 8,0 i 7±3°C, z mieszaniem. Osad przemywano wodą i przechowywano w -20°C do chwili użycia.
Wzbogacone IB puddawano dalszej obróbce po zawieszaniu w 50 mM buforze NaHCO3, pH 10,3±0,1. Zawiesinę inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej w celu umożliwienia upłynnienia urykazy pochodzącej z IB, a następnie klarowano poprzez wirowanie.
PL 215 285 B1
Urykazę oczyszczano następnie poprzez kilka etapów chromatografii. Na początek chromatografię przeprowadzono na kolumnie Q-Sepharose FF. Załadowaną kolumnę przemywano buforem wodorowęglanowym zawierającym 150 mM NaCl i urykazę wymywano buforem wodorowęglanowym zawierającym 250 mM NaCl. Następnie zastosowano złoże ksantyna-agaroza, Xanthine Agarose (Sigma) w celu usunięcia z preparatu urykazy niewielkich zanieczyszczeń. Wyciek z Q-Sepharose FF rozcieńczano 50 mM buforem glicynowym, pH 10,3±0,1, do stężenia białka około 0,25 mg/ml i nakładano na kolumnę. Kolumnę przemywano buforem wodorowęglanowym, pH 10,3±0,1, zawierającym 100 mM NaCl, i urykazę wymywano tym samym buforem uzupełnionym 60 μΜ ksantyną. Na tym etapie urykaza była ponownie czyszczona poprzez chromatografię na Q-Sepharose w celu usunięcia form zagregowanych.
Czystość każdego preparatu urukazy jest większa niż 95%, co oceniano poprzez sączenie molekularne. W każdym preparacie wykrywano przy zastosowaniu kolumny Superdex 200 mniej niż 0,5% zagregowanych form.
Tabela 3 podsumowuje oczyszczenie urykazy Pig-KSAN z IB pochodzących z 25 I buforu fermentacyjnego.
T a b e l a 3. Oczyszczanie urykazy Pig-KSAN
Etap oczyszczania Białko(mg) Aktywność (jedn.) Aktywność specyficzna (jedn./mg)
Nierozpuszczalne IB 12748 47226 3,7
Klarowny roztwór 11045 44858 4,1
Q-Sepharose I - główna pula 7590 32316 4,3
Xanthine Agarose - główna pula 4860 26361 5,4
Q-Sepharose II - główna pula 4438 22982 5,2
Frakcja UF 30 kD 4262 27556 6,5
P r z y k ł a d 4. Charakterystyka rekombinowanych urykaz SDS-PAGE
Analiza SDS-PAGE wysoce oczyszczonych wariantów urykazy (Fig. 4) wykazała dość wyróżnialny wzór. Próbki przechowywano w 4°C, w buforze węglanowym, pH 10,3, do kilku miesięcy. Warianty pełnej długości, Pig, Pig-KS i PBC, wykazywały akumulację dwóch głównych produktów degradacji mających ciężar cząsteczkowy około 20 i 15 kD. Ta obserwacja sugeruje, że co najmniej pojedyncze cięcie dzieli cząsteczkę podjednostki urykazy. Inny wzór degradacji jest wykrywany dla klonów skróconych na końcu aminowym, a także dla urykazy królika, ale w mniejszej proporcji. Koniec aminowy królika przypomina ten dla skróconych klonów. Określono aminokońcowe sekwencje fragme n tów urykazy wytworzone w czasie oczyszczania i przechowywania.
Sekwencjonowanie peptydów
N-końcowe sekwencjonowanie dużych preparatów urykazy przeprowadzono przy zastosowaniu metody degradacji Edmana. Przeprowadzono dziesięć cykli. Rekombinowana urykaza Pig (klon pełnej długości) dawała więcej fragmentów degradacji w porównaniu z urykazą Pig-KS-ΔΝ. Wydedukowane miejsca cięcia prowadzące do fragmentów degradacji są jak następuje:
1) Główne miejsce w pozycji 168 mające sekwencję:
--QSG i FEGFI-2) Drugorzędne miejsce w pozycji 142 mające sekwencję:
--IRN i GPPVI-Powyższe sekwencje nie sugerują żadnego znanego miejsca proteolitycznego. Pomimo tego, cięcie może nastąpić bądź na skutek proteolizy bądź jakiejś reakcji chemicznej. Urykazy skrócone na końcu aminowym są zaskakująco bardziej stabilne niż urykazy nie skrócone na końcu aminowym. PBC-ANC miała również stabilność podobną do innych cząsteczek ΔΝ i mniejszą niż PBC bez skrócenia aminowego.
Aktywność
Aktywność urykazy mierzono metodą UV. Szybkość reakcji enzymatycznej określano poprzez pomiar zmniejszenia absorbancji przy 292 nm będącej wynikiem utleniania kwasu moczowego do alantoiny. Jedna jednostka aktywności jest zdefiniowana jako ilość urykazy wymagana do utlenienia
PL 215 285 B1 jednego μmola kwasu moczowego na minutę w 25°C, w podanych warunkach. Moc urykazy jest wyrażana w aktywnościach na mg białka (jedn./mg).
-1 -1
Współczynnik ekstynkcji 1 mM kwasu moczowego przy 292 nm wynosi 12,2 mM-1 cm-1. A zatem utlenienie 1 μmola kwasu moczowego na ml mieszaniny reakcyjnej prowadziło do zmniejszenia absorbancji wynoszącego 12,2 mA292. Zmiana absorbancji w czasie (ΔΑ292 na minutę) pochodziła z liniowej części krzywej.
Stężenie białka określano przy zastosowaniu zmodyfikowanej metody Bradford (Macart i Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122:93-101). Aktywność specyficzną (moc) urykazy obliczano dzieląc aktywność w jedn./ml przez stężenie w mg/ml. Wyniki aktywności enzymatycznej dla różnych rekombinowanych urykaz są zestawione w Tabeli 4. Wyniki preparatów handlowych są włączone do tej tabeli jako wartości odnośnikowe. Widać z tych wyników, że skrócenie białek urykazy nie ma znaczącego wpływu na ich aktywność enzymatyczną.
T a b e l a 4. Podsumowanie parametrów kinetycznych natywnych urykaz
Urykazy Stężenie(1) roztworu podstawowego (mg/ml) Aktywność specyficzna (jedn./mg)(2) Km(4) ^M kwasu moczowego) Kcat (5) (1/min.)
Rekombinowana
Świni 0,49 7,41 4,39 905
Pig-AN 0,54 7,68 4,04 822
Pig-KS 0,33 7,16 5,27 1085
Pig-KS-AN 1,14 6,20 3,98 972
PBC 0,76 3,86 4,87 662
PBC-ANC 0,55 3,85 4,3 580
Królika 0,44 3,07 4,14 522
Natywna
Świni (Sigma) 2,70 3,26(3) 5,85 901
A.flavus 9merck) 1,95 0,97(3) 23,54 671
Przypisy do Tabeli 4:
(1) Stężenie białka określano poprzez absorbancję mierzoną przy 278 nm, stosując współczynnik ekstynkcji 11,3 dla roztworu urykazy 10 mg/ml (Mahler, 1963).
(2) 1 jednostka aktywności urykazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która utlenia 1 μmol kwasu moczowego do alantoiny na minutę, w 25°C.
(3) Wartości aktywności specyficznej pochodziły z wykresów Lineweaver-Burk przy stężeniu substratu równym 60 μΜ.
(4) Mieszaniny reakcyjne składały się z różnych kombinacji następujących roztworów podstawowych
100 mM buforu-boranu sodowego, pH 9,2
300 μΜ kwasu moczowego w 50 mM buforze-boranie sodowym, pH 9,2 mg/ml BSA w 50 mM buforze-boranie sodowym, pH 9,2 (5) Kcat obliczono poprzez podzielenie Vmax (obliczonej z odpowiednich wykresów Lineweaver-Burk) przez stężenie urykazy w mieszaninie reakcyjnej (wyrażone w równoważnikach molowych, w oparciu o masę cząsteczkową tetramerycznych urykaz).
P r z y k ł a d 5. Sprzęganie urykazy z m-PEG (PEGylacja)
Urykaza Pig-KS-ΔΝ była sprzęgana przy zastosowaniu m-PEG-NPC (węglan monometoksypoli(etylenoglikolo)-nitrofenylu). Ustalono warunki dajace 2 - 12 nici 5, 10 lub 20 kD PEG na podjednostkę urykazy. m-PEG-NPC dodawano stopniowo do roztworu białka. Po zakończeniu dodawania PEG, mieszaninę reakcyjną urykaza/m-PEG-NPC inkubowano w 2-8°C przez 16-18 godzin, aż maksymalna liczba niezwiązanych nici m-PEG przyłączyła się do urykazy.
PL 215 285 B1
Liczbę nici PEG na monomer PEG-urykaza określono poprzez sączenie molekularne (SEC, od ang. size exclusion chromatography), na Superose 6, stosując jako standardy PEG i urykazę. Liczbę związanych nici PEG na podjednostkę określano przy zastosowaniu następującego równania:
Nici PEG 3,42 x Ilość PEG we wstrzykiwanej próbce ^g) /podjednostkę = Ilość białka we wstrzykiwanej próbce ^g)
Stężenie PEG i reszt białkowych w próbce PEG-urykaza ustalano poprzez sączenie molekularne (SEC) przy zastosowaniu detektorów nadfioletu (UV) i współczynnika załamania (RI) ustawionych szeregowo (opracowane przez Kunitani i wsp., 1991). Wytworzono trzy krzywe kalibracyjne: krzywą białkową (absorpcja mierzona przy 220 nm); krzywą białkową (mierzona przez RI) i krzywą PEG (mierzoną poprzez RI). Następnie próbki PEG-urykaza analizowano przy zastosowaniu tego samego systemu. Otrzymane w rezultacie wartości powierzchni pod pikami UV i RI próbek eksperymentalnych zastosowano do obliczenia stężeń PEG i białka w stosunku do krzywych kalibracyjnych. Współczynnik 3,42 to stosunek masy cząsteczkowej monomeru urykazy (34192 Daltonów) do masy 10 kD PEG.
Przyłączenie PEG poprawiało rozpuszczalność urykazy w roztworach mających fizjologiczne wartości pH. Tabela 5 wskazuje na zróżnicowanie pomiędzy partiami produktu - PEGylowanej urykazy Pig-KS-ΔΝ. Generalnie, istnieje odwrotna proporcja pomiędzy liczbą przyłączonych nici PEG i zachowaniem specyficznej aktywności (SA) enzymu.
T a b e l a 5
Aktywność enzymatyczna koniugatów PEGylowanej urykazy Pig-KS- ΔΝ
Partie koniugatu PEG MW (kD) Nici PEG na pod- jednostkę urykazy SA urykazy (U/mg) SA-procent kontroli
Pig-KS-AN - - 8,2 100
1-17 # 5 9,7 5,8 70,4
LP-17 10 2,3 7,8 94,6
1-15 # 10 5,1 6,4 77,9
13 # 10 6,4 6,3 76,9
14 # 10 6,5 6,4 77,5
5-15 # 10 8,8 5,4 65,3
5-17 # 10 11,3 4,5 55,3
4-17 # 10 11,8 4,4 53,9
1-18 # 20 11,5 4,5 54,4
P r z y k ł a d 6. PEGylacja urykazy przez PEG 1000 D i 100000 D
Urykaza Pig-KS-ΔΝ została połączona z m-PEG-NPC 1000 D i 100000 D, jak opisano w przykładzie 5. Zastosowano warunki, w których uzyskiwano 2-11 nici PEG na podjednostkę urykazy. Po zakończeniu dodawania PEG, mieszanina reakcyjna urykaza/m-PEG-NPC była inkubowana w 2-8°C przez 16-18 godzin, aż maksymalna liczba niezwiązanych nici m-PEG przyłączyła się do urykazy.
Liczbę nici PEG na monomer PEG-urykaza określono jak opisano powyżej.
Przyłączenie PEG poprawiało rozpuszczalność urykazy w roztworach mających fizjologiczne wartości pH.
P r z y k ł a d 7. Farmakokinetyka urykazy Pig-KS-AN połączonej z PEG
Przeprowadzono doświadczenia biologiczne w celu określenia optymalnego zakresu i wielkości PEGylacji niezbędnej dla dostarczenia korzyści terapeutycznej.
Badania farmakokinetyczne na szczurach, przy zastosowaniu zastrzyków dożylnych (i.v.) z 0,4 mg (2 jedn.) na kg wagi ciała niezmodyfikowanej urykazy, podawanej w dniu 1 i dniu 8, dawało okres półtrwania w obiegu około 10 minut. Jednakże badania szybkości klirensu u szczurów dla 2-11x10 kD urykazy PEG-Pig-KS-ΔΝ, po aż 9 cotygodniowych zastrzykach, wskazywały, że klirens nie zależy od liczby nici PEG (w tym zakresie) i pozostawał stosunkowo stały w trakcie okresu badania (patrz Tabela 6; z okresem półtrwania około 30 godzin). Różnice od tygodnia do tygodnia są w zakresie błędu eksperymentalnego. Ten sam wzór jest widoczny po dziewięciu wstrzyknięciach koniugatów 10x5kD PEG- i 10x20kD PEG-urykaza. Wyniki wskazują, że w modelu szczurzym niezależnie od stopnia PEGylacji urykazy, w tym zakresie, obserwowane były podobne efekty biologiczne.
PL 215 285 B1
T a b e l a 6. Okresy półtrwania preparatów PEGylowanej urykazy Pig-KS-ΔΝ u szczurów
Stopień modyfikacji (nici PEG na podjednostkę urykazy)
5kD PEG 10kD PEG 20kD PEG
Tydzień 10x 2x 5x 7x 9x 11x 10x
1 25,7±1,7 29,4±3,4 37,7±3,1 37,6±3,9 36,9±4,3 31,4±4,3 21,6±1,5
(5) (5) (5) (5) (5) (5) (5)
2 26,7±3,0 28,4±1,6
(5) (5)
3 27,5±3,8 29,0±2,6 29,9±11,7 32,7±11,1 26,3±4,7 11,8±3,3 14,5±2,7
(5) (5) (5) (5) (5) (5) (5)
4 27,1±5,3 18,4±2,2 19,7±5,6
(5) (4) (4)
5 28,6±1,7 22,5±2,7 34,4±3,9 37,3±3,0 30,4±3,6 30,5±1,3 19,3±2,5
(5) (5) (4) (5) (5) (5) (5)
6 35,4±3,1 27,1±3,6 30,7±2,9
(14) (13) (13)
7 16,5±4,9 32,5±4,3 16,12±2,7 25,8±2,5
(5) (5) (5) (5)
8 - - - - - - -
9 36,8±4,0 28,7±2,7 34,0±2,4 24,2±3,4 31,0±2,6 29,3±1,4 26,7±0,5
(15) (15) (13) (13) (13) (15) (15)
Przypisy do Tabeli 4:
Wyniki są wskazane w godzinach ± błędy standardowe średniej. Numery w nawiasach wskazują na liczbę testowanych zwierząt.
Szczury otrzymywały co tydzień i.v. zastrzyki z 0,4 mg na kg wagi ciała urykazy Pig-KS-ΔΝ zmodyfikowanej jak wskazano w tabeli. Każda grupa wyjściowo obejmowała 15 szczurów, które były na kolejno skrwawiane w podgrupach po 5. Kilka szczurów zdechło w czasie tego badania na skutek znieczulenia. Okres półtrwania określano poprzez pomiar aktywności urykazy (test kolorymetryczny) w próbkach osocza zbieranych w 5 minucie, 6, 24 i 48 godzinie po zastrzyku.
Tabela 5 opisuje partie PEGylowanej urykazy użytej w tych badaniach.
Badania biodostępności dla urykazy 6x5 kD PEG-Pig-KS^N u królików wskazuje, że po pierwszym zastrzyku okres półtrwania w obiegu wynosi 98,2±1,8 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu domięśniowym (i.m.) i podskórnym (s.c.) wynosiła, odpowiednio, 71% i 52%. Jednakże, wykrywano znaczące miana przeciwciała anty-urykaza po drugim zastrzyku i.m. i s.c. u wszystkich królików i klirens był przyspieszony po następnych zastrzykach. Wstrzyknięcie szczurom tych samych koniugatów prowadziło do czasu półtrwania 26±1,6 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 33% i 22%.
Badania na szczurach z urykazą 9x10 KD PEG-Pig-KS-ΔΝ wskazują, że okres półtrwania w obiegu po pierwszym zastrzyku w wynosi 42,4 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 28,9% i 14,5% patrz Fig. 5 i Tabela 7). Po czwartym zastrzyku okres półtrwania w obiegu wynosił 32,1±2,4 godziny, a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 26,1% i 14,9%.
Podobne badania farmakokinetyczne, u królików dla urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ wskazują, że nie obserwuje się przyspieszonego klirensu po wstrzyknięciu tego koniugatu (podawano 4 zastrzyki co dwa tygodnie). U tych zwierząt okres półtrwania w obiegu po pierwszym zastrzyku wynosił 88,5 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 98,3% i 84,4%. (patrz Fig. 6 i Tabela 7). Po czwartym zastrzyku okres półtrwania w obiegu wynosił 141,1±15,4 godziny, a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 85% i 83%.
Podobne badania farmakokinetyczne dla urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ przeprowadzono w celu zbadania biodostępności u psów rasy beagle (2 samce i 2 samice w każdej grupie). Okres
PL 215 285 B1 półtrwania w obiegu zanotowano jako 70±11,7 godzin po pierwszym zastrzyku i.v., a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 69,5% i 50,4% (patrz Fig. 7 i Tabela 7).
Badanie z preparatami urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ przeprowadzono z użyciem świń. Trzy zwierzęta na grupę użyto do podawania drogami i.v., s.c. i i.m. Okres półtrwania w obiegu zanotowano jako 178±24 godzin po pierwszym zastrzyku i.v., a biodostepność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 71,6% i 76,8% (patrz Fig. 8 i Tabela 7).
T a b e l a 7. Badania farmakokinetyczne z urykazą 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ
Zastrzyk # Okres półtrwania (godziny) Biodostępność
i.v. i.m. s.c.
Szczury
1 42,4±4,3 28,9% 14,5%
2 24,115,0 28,9% 14,5%
4 32,1 ±2,4 26,1% 14,9%
Króliki
1 88,5±8,9 98,3% 84,4%
2 45,7±40,6 100% 100%
4 141,1±15,4 85% 83%
Psy
1 70,0±11,7 69,5% 50,4%
Świnie
1 178±24 71,6% 76,8%
Badania abspopcji, dystrybucji, metabolizmu i wydalania (ADME, od ang. Absorption, distribution, metabolism, and excretion) wykonano po jodowaniu urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ stosując
125 metodę Bolton & Hunter przy użyciu 125I. Wyznakowany koniugat wstrzyknięto 7 grupom, każda po 4 szczury (2 samce i 2 samice). Dystrybucję radioaktywności analizowano po I godzinie i co 24 godziny przez 7 dni (z wyjątkiem dnia 5). Każda grupę kolejno uśmiercano i różne narządy wycinano i analizowano. Siódmą grupę trzymano w klatce metabolicznej, z której zbierano mocz i kał. Dystrybucję materiału w ciele zwierzęcia oceniano poprzez pomiar całkowitej radioaktywności w każdym narządzie i frakcję zliczeń (nerka, wątroba, płuco i śledziona), która była dostępna do wtrącania TCA (tj.) związane białko, normalizowane w stosunku do rozmiaru narządu). Spośród narządów, które zostały wycięta, żaden nie miał wyższej radioaktywności specyficznej niż inne, a zatem nie obserwowano znaczącej akumulacji, na przykład w wątrobie albo nerce. 70% radioaktywności była wydalana przed upływem 7 dnia.
P r z y k ł a d 8. Wyniki testów klinicznych
Przeprowadzono randomizowane, otwarte, wieloośrodkowe, równoległe badania grupowe w celu zbadania odpowiedzi na moczan i profile bezpieczeństwa PEG-urykazy (Puricase®, Savient Pharmaceuticals) u pacjentów-ludzi z hiperurykemią i ostrą dną moczanową, którzy nie odpowiadali albo nie tolerowali konwencjonalnej terapii. Średni czas choroby wynosił 14 lat i 70 procent badanej populacji miało jeden albo więcej guzków dnawych.
W tym badaniu 41 pacjentów (średnia wieku 58,1 lat) randomizowano do 12 tygodni leczenia dożylną PEG-urykazą w jednym z czterech trybów dawkowania: 4 mg co dwa tygodnie (7 pacjentów); 8 mg co dwa tygodnie (8 pacjentów); 8 mg co dwa tygodnie (13 pacjentów); lub 12 mg co cztery tygodnie (13 pacjentów). Aktywność urykazy w osoczu i poziomy moczanu mierzono w określonych odstępach czasu. Parametry farmakokinetyczne, średnie stężenie moczanu w osoczu i procent czasu, kiedy poziom moczanu w osoczu był mniejszy niż lub równy 6 mg/dl pochodziły z analiz aktywności urykazy i poziomów moczanu.
PL 215 285 B1
Pacjenci, którzy otrzymywali 8 mg PEG-urykazy co dwa tygodnie mieli większe zmniejszenie
PUA, z poziomami poniżej 6 mg/dl przez 92 procent czasu leczenia (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 9,1 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 1,4 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni).
Zasadnicze i utrzymujące się niższe poziomy moczanu w osoczu obserwowano również w innych grupach dawek przy traktowaniu PEG-urykaza: PUA poniżej 6 mg/ml przez 86 procent czasu leczenia w grupie 8 mg co cztery tygodnie (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 9,1 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 1,4 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni); PUA poniżej 6 mg/ml przez 84 procent czasu leczenia w grupie 12 mg co cztery tygodnie (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 8,5 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 2,6 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni) i PUA poniżej 6 mg/ml przez 73 procent czasu leczenia w grupie 4 mg co cztery tygodnie (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 7,6 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 4,2 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni).
Maksymalny procent zmniejszenia poziomu kwasu moczowego w osoczu w stosunku do poziomu podstawowego w czasie pierwszych 24 godzin podawania dawki PEG-urykazy wynosił 72% dla osobników otrzymujących 4 mg/2 tygodnie (p wynosi 0,0002); 94% dla osobników otrzymujących 8 mg/2 tygodnie (p mniej niż 0,0001); 87% dla osobników otrzymujących 8 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0,0001); i 93% dla osobników otrzymujących 12 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0,0001).
Procent zmniejszenia poziomu kwasu moczowego w osoczu w stosunku do poziomu podstawowego w okresie 12-tygodni leczenia wynosił 38% dla osobników otrzymujących 4 mg/2 tygodnie (p wynosi 0,0002); 86% dla osobników otrzymujących 8 mg/2 tygodnie (p mniej niż 0,0001); 58% dla osobników otrzymujących 8 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0, 0001); i 67% dla osobników otrzymujących 12 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0, 0001).
Ku zaskoczeniu, niektóre osoby otrzymujące PEG-urykazę doświadczały związanych z wlewem efektów ubocznych, tj. reakcji na wlew. Te reakcje następowały w 14% wszystkich wlewów.
Wszystkie zacytowane tu odnośniki są tu włączone w całości jako odniesienie i dla wszystkich celów w takim samym zakresie jak gdyby każda indywidualna publikacja albo zgłoszenie patentowe były konkretnie i indywidualnie wskazane aby zostać włączone jako odniesienie w całości dla wszystkich celów.
Można dokonać wielu modyfikacji i odmian niniejszego wynalazku bez odchodzenia od jego ducha i zakresu, co będzie oczywiste dla specjalistów w dziedzinie. Konkretne opisane tu wykonania są przedstawione jedynie jako przykład i wynalazek ma być ograniczony jedynie przez załączone zastrzeżenia, łącznie z pełnym zakresem równoważników, których te zastrzeżenia dotyczą.
PL 215 285 B1
Lista sekwencji <110> Savient Pharmaceuticals, Inc.
Hartman, 3acob Mendelovitz, Simona <120> Warianty oksydazy moczanowej i ich zastosowanie <130> 103864-146638 <150> US 60/670,573 <151> 2005-04-11 <160> 16 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> urykaza z wątroby świni (sensowna) <400> 1 gcgcgaattc catggctcat taccgtaatg actaca 36 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Urykaza z wątroby świni (antysensowna) <400> 2 gcgctctaga agcttccatg gtcacagcct tgaagtcagc 40 <210> 3 <211> 35 <2ł2> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> urykaza z wątroby pawiana (D3n) (sensowna) <400> 3 gcgcgaattc catggcccac taccataaca actat 35 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> urykaza z wątroby pawiana (D3H) (antysensowna) <400> 4 gcgcccatgg tctagatcac agtcttgaag acaacttcct 40 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 215 285 B1 <220>
<223> Urykaza PBC-DeltaNC (sensowna) <400> 5 gcgcatatga cttacaaaaa gaatgatgag gtagag 36 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> urykaza PBC-DeltaNC (antysensowna) <400> 6 ccgtctagat taagacaact tcctcttgac tgtaccagta atttttccgt atgg 54 <21O> 7 <211> 299 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> Pig-KS-DeltaN <400> 7
Met Thr 1 Tyr Lys Lys 5 Asn Asp Glu Val Glu Phe Val 10 Arg Thr Gly 15 Tyr
Gly Lys Asp Met 20 Ile Lys Val Leu Hi 5 25 ile Gin Arg Asp Gly 30 Lys Tyr
HIS Ser ile Lys Glu Val Ala Thr Thr val Gin Leu Thr Leu Ser Ser
35 40 45
Lys Lys Asp Tyr Leu Hi s Gly Asp Asn Ser Asp val ile pro Thr ASP
50 55 60
Thr ile Lys Asn Thr val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly ile Lys
65 70 75 80
Ser Ile Glu Thr Phe Ala val Thr ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser
85 90 95
phe Lys His Val ile Arg Ala Gin val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp
100 105 110
Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His val HIS Ala Phe Ile Tyr
115 120 125
Thr pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gin Ile Arg Asn Gly
130 135 140
Pro Pro val Ile Hi S Ser Gly ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr
145 150 155 160
PL 215 285 B1
Thr Gln Ser Gly Phe 165 Glu Gly Phe ile Lys 170 Asp Gln Phe Thr Thr 175 Leu
Pro Glu val Lys ASP Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Cys Lys Trp
180 185 190
Arg Tyr Hi s Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr
195 200 205
Val Arg Ser ile val Leu Gln Lys Phe Al a Gly Pro Tyr Asp Lys Gly
210 215 220
Glu Tyr ser pro ser Va1 Gln Lys Thr Leu Tyr ASP He Gln val Leu
225 230 235 240
Thr Leu Gly Gln val Pro Glu Ile Glu Asp wet Glu ile Ser Leu Pro
245 2 50 255
Asn ile His Tyr Leu Asn ll e Asp Met Ser Lys Met Gly Leu ile Asn
260 265 270
Lys Glu Glu val teu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly tys Ile Thr
275 280 285
Gly Thr val Lys Arg Lys Leu Ser ser Arg Leu
290 295 <210> 8 <211> 298 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <22O>
<223> Pig-KS-DeltaN bez startowej Met <400> 8
Thr Tyr Lys 1 Lys Asn 5 Asp Glu val Glu Phe Val Arg Thr 10 Gly Tyr 15 Gly
Lys ASP Met Ile Lys val Leu HIS ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr Hi s
20 25 30
Ser ile Lys Glu val Ala Thr Thr val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys
35 40 45
Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn ser Asp val Ile Pro Thr Asp Thr
50 55 60
Ile Lys Asn Thr Val Α5Π val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser
65 70 75 80
Ile Glu Thr Phe Ala val Thr ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe
85 90 95
PL 215 285 B1
Lys HIS val ile Arg Ala Gin val Tyr Val Glu Glu val Pro Trp Lys
100 105
Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His val His Ala Phe ile Tyr Thr
115 120 125
Pro Thr Gly Thr Hi s phe cys Glu val Glu Gin ile Arg Asn Gly pro
130 135 140
Pro Val ile His Ser Gly ile Lys Asp Leu Lys val Leu Lys Thr Thr
145 150 155 160
Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin val Tyr cys Lys Trp Arg
180 185 190
Tyr His Gin 195 Gly Arg Asp val Asp 200 Phe Gl u Ala Thr Trp 205 ASp Thr Val
Arg ser Ile val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu
210 215 220
Tyr Ser pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Ty r Asp ile Gin Val Leu Thr
225 230 235 240
Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
ile His Tyr Leu Asn ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys
260 265 270
Glu Glu val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly
275 280 285
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295
<210> 9 <213> 897 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> Pig-KS-DeltaNA <400> 9 atgacttaca aaaagaatga tgaggtagag tttgtccgaa ctggctatgg gaaggatatg 60 ataaaagttc tccatattca gcgagatgga aaatatcaca gcattaaaga ggtggcaact 120 acagtgcaac tgactttgag ctccaaaaaa gattacctgc atggagacaa ttcagatgtc 180
PL 215 285 B1
atccctacag acaccatcaa gaacacagtt aatgtcctgg cgaagttcaa aggcatcaaa 240
agcatagaaa cttttgctgt gactatctgt gagcatttcc tttcttcctt caagcatgtc 300
atcagagctc aagtctatgt ggaagaagtt ccttggaagc gttttgaaaa gaatggagtt 360
aagcatgtcc atgcatttat ttatactcct actggaacgc acttctgtga ggttgaacag 420
ataaggaatg gacctccagt cattcattct ggaatcaaag acctaaaagt cttgaaaaca 480
acccagtctg gctttgaagg attcatcaag gaccagttca ccaccctccc tgaggtgaag 540
gaccggtgct ttgccaccca agtgtactgc aaatggcgct accaccaggg cagagatgtg 600
gactttgagg ccacctggga cactgttagg agcattgtcc tgcagaaatt tgctgggccc 660
tatgacaaag gcgagtactc gccctctgtc cagaagacac tctatgacat ccaggtgctc 720
accctgggcc aggttcctga gatagaagat atggaaatca gcctgccaaa tattcactac 780
ttaaacatag acatgtccaa aatgggactg atcaacaagg aagaggtctt gctaccttta 840
gacaatccat atggaaaaat tactggtaca gtcaagagga agttgtcttc aagactg 897
<210» 10 <211» 894 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220> <223» Pig-KS-DeltaN bez startowej ATG <400» 10 acttacaaaa agaatgatga ggtagagttt gtccgaactg gctatgggaa ggatatgata 60
aaagttctcc atattcagcg agatggaaaa tatcacagca ttaaagaggt ggcaactaca 120
gtgcaactga ctttgagctc caaaaaagat tacctgcatg gagacaattc agatgtcatc 180
cctacagaca ccatcaagaa cacagttaat gtcctggcga agttcaaagg catcaaaagc 240
atagaaactt ttgctgtgac tatctgtgag catttccttt cttccttcaa gcatgtcatc 300
agagctcaag tctatgtgga agaagttcct tggaagcgtt ttgaaaagaa tggagttaag 360
catgtccatg catttattta tactcctact ggaacgcact tctgtgaggt tgaacagata 420
aggaatggac ctccagtcat tcattctgga atcaaagacc taaaagtctt gaaaacaacc 480
cagtctggct ttgaaggatt catcaaggac cagttcacca ccctccctga ggtgaaggac 540
cggtgctttg ccacccaagt gtactgcaaa tggcgctacc accagggcag agatgtggac 600
tttgaggcca cctgggacac tgttaggagc attgtcctgc agaaatttgc tgggccctat 660
gacaaaggcg agtactcgcc ctctgtccag aagacactct atgacatcca ggtgctcacc 720
ctgggccagg ttcctgagat agaagatatg gaaatcagcc tgccaaatat tcactactta 780
aacatagaca tgtccaaaat gggactgatc aacaaggaag aggtcttgct acctttagac 840
aatccatatg gaaaaattac tggtacagtc aagaggaagt tgtcttcaag actg 894
<210» 11 <211> 304 <212» PRT <213» Sus scrofa
PL 215 285 B1 <400> 11
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
ł 5 10 15
val Arg Thr Gly 20 Tyr Gly Lys ASP Met 25 ile Lys val Leu His 30 ile Gl n
Arg Asp Gly 35 Lys Yy p His Ser ile 40 Lys Glu Val Ala Thr 45 ser val Gln
Leu Thr Leu Ser Ser tys Lys Asp Yy f· Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
val Ile Pro Thr Asp Thr ile Lys Asn Thr Val Asn val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys ser Ile Glu Thr Phe Ala val Thr ile Cys Glu
85 90 95
Hi s Phe Leu Ser Ser Phe Lys His val li e Arg Ala Gln val Tyr val
100 105 110
Glu Glu val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Ile Arg Asn Gly Pro pro val ile His Ser Gly ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln
180 185 190
Val Tyr cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp ile Gln val Leu Thr Leu Gly Gln va1 Pro Glu ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
PL 215 285 B1
Met Gly Leu Asn Lys Gl U Glu val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg ile Thr Gly Thr val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 12 <211> 296 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna
<22O> <223> PBC-DeltaNC
<400> 12
Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu val Glu Phe val Arg Thr Gly Tyr
15 10 15
Gly tys Asp Met ile Lys val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr 20 25 30
His Ser ile Lys Glu Va1 Ala Thr Thr Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser
35 40 45
Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp
50 55 60
Thr ile Lys Asn Thr val Asn val Leu Ala Lys Phe tys Gly ile Lys
65 70 75 80
Ser ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser
85 90 95
Phe Lys His Va1 ile Arg Ala Gin Val Tyr val Glu Glu val Pro Trp
100 105 110
Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr
115 120 125
Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu val Glu Gin ile Arg Asn Gly
130 135 140
Pro Pro val ile His Ser Gly ile Lys Asp Leu Lys val Leu Lys Thr
145 150 155 160
Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu
165 170 175
Pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin val Tyr cys Lys Trp
180 185 190
Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr
PL 215 285 B1
195 200 205
Val Arg Ser Ile Val 210 Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly
215 220
Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp ile Gln val Leu
225 230 235 240
ser Leu Ser Arg val Pro Glu ile Glu ASp Met Glu ile ser Leu pro
245 250 255
Asn Ile His Tyr Phe Asn ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn
260 265 270
Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr
275 280 285
Gly Thr val Lys Arg Lys Leu Ser
290 295
<210> 13 <211> 295 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> PBC-DeltaNC bez startowej Met <400> 13
Thr Tyr Lys Lys 1 Asn Asp 5 Glu va! Glu Phe val Arg Thr Gly Tyr Gly
10 15
Lys Asp Met Ile 20 Lys val Leu His ile 25 Gln Arg Asp Gly Lys 30 Tyr Hi s
Ser il e Lys Glu val Ala Thr Thr va1 Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys
35 40 45
Lys ASp 50 py p Leu His Gly Asp 55 Asn ser Asp val Ile 60 Pro Thr Asp Thr
Ile Lys Asn Thr val Asn val Leu Ala Lys Phe Lys Gly ile Lys Ser
65 70 75 80
Ile Glu Thr phe Ala Va1 Thr ile cys Glu His phe Leu Ser Ser phe
85 90 95
Lys His Val ile Arg Ala Gln val Tyr val Glu Gl u val pro Trp Lys
100 105 110
Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His Val His Ala Phe il e Tyr Thr
115 120 125
PL 215 285 B1
pro Thr 130 Gly Thr His phe Cys Glu 135 val Glu Gin ile 140 Arg Asn Gly pro
pro val ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr
145 150 155 160
Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Glu val Lys Asp Arg cys Phe Ala Thr Gl n val Tyr Cys Lys Trp Arg
180 185 190
Tyr Hi s Gin 195 Gly Arg Asp Val Asp 200 Phe Glu Ala Thr Trp 205 Asp Thr Val
Arg Ser ile val Leu Gin Lys Phe Al a Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu
210 215 220
Tyr Ser Pro Ser val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin Va1 Leu Ser
225 230 235 240
Leu Ser Arg Val Pro Glu ile Gl u Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr phe 260 Asn ile Asp Met ser 265 Lys Met Gly Leu ile 270 Asn Lys
Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly
275 280 285
Thr Yal Lys Arg Lys Leu Ser
290 295
<210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> PBC-DeltaNC (Fragment 44-56 z PBC-DeltaNC) <400> 14
Ala Thr Thr Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 936 <212> DNA <213> Papio hamadryas (pawian hamadryas) <400> 15 ccagaagaaa atggccgact accataacaa ctataaaaag aatgatgaat tggagtttgt 60 ccgaactggc tatgggaagg atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata 120 tcacagcatt aaagaggtgg caacttcagt gcaacttact ctgagttcca aaaaagatta 180
PL 215 285 B1
cctgcatgga gataattcag atatcatccc tacagacacc atcaagaaca cagttcatgt 240
cttggcaaag tttaagggaa tcaaaagcat agaagccttt ggtgtgaata tttgtgagta 300
ttttctttct tcttttaaec atgtaatccg agctcaagtc tacgtggaag aaatcccttg 360
gaagcgtctt gaaaagaatg gagttaagca tgtccatgca tttattcaca ctcccactgg 420
aacacacttc tgtgaagttg aacaactgag aagtggaccc cccgtcatta cttctggaat 480
caaagacctc aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca 540
gttcaccacc ctccctgagg tgaaggaccg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg 600
gcgctaccac cagtgcaggg atgtggactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct 660
tgtcctggag aaatttgctg ggccctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa 720
gaccctctat gatatccagg tgctctccct gagccgagtt cctgagatag aagatatgga 780
aatcagcctg ccaaacattc actacttcaa tatagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa 840
caaggaagag gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa 900
gaggaagttg tcttcaagac tgtgacattg tggcca 936
<210> 16 <211> 304 <212> PRT <213> Paplo hamadryas (pawian hamadryas) <400> 16
Met 1 Ala Asp Tyr HIS 5 Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe
10 15
Val Arg Thr Gly 20 Tyr Gly Lys Asp Met 25 val Lys val Leu His 30 ile Gin
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser tys Lys Asp Tyr Leu Hi s Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser ll e Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr phe Leu Ser Ser Phe Asn His val ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly val Lys Hi s val
115 120 125
His Ala Phe ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
PL 215 285 B1
Gin 145 Leu Arg Ser Gly Pro 150 Pro Val Ile Thr Ser Gly Ile 155 Lys Asp Leu 160
Lys val Leu Lys Thr r* Gin ser Gly phe Glu Gly phe il e Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
va1 Tyr Cys 195 Lys Trp Arg Tyr His 200 Gin Cys Arg Asp val 205 ASP Phe Glu
Ala Thr Trp Gly Thr il e Arg Asp Leu val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr ASP Lys Gl y Gl u Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
ASP ile Gin val Leu Ser Leu Ser Arg val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu il e Ser Leu Pro Asn ile His Tyr Phe Asn ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu val Leu Leu pro Leu ASP Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
Zastrzeżenia patentowe

Claims (34)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza, znamienna tym, że jest skrócona na końcu aminowym lub na końcu karboksylowym lub na obydwu końcach, aminowym i karboksylowym, o 1-6 aminokwasów i dodatkowo obejmuje podstawienie aminokwasowe treoniną w pozycji 7 (D7T), podstawienie aminokwasowe treoniną w pozycji 46 (S46T), podstawienie aminokwasowe lizyną w pozycji 291 (R291K) oraz podstawienie aminokwasowe seryną w pozycji 301 (T301S), a skrócenie i podstawienie aminokwasowe są określone w stosunku do urykazy świni o sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID. 11.
  2. 2. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje aminokońcowy aminokwas, którym jest alanina, glicyna, prolina, seryna lub treoniną.
  3. 3. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według zastrz. 2, znamienna tym, że aminokońcowym aminokwasem jest treoniną.
  4. 4. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według zastrz. 3, znamienna tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 8.
  5. 5. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według jednego z zastrz. 1-4, znamienna tym, że jest połączona z polimerem.
  6. 6. Koniugat glikol polietylenowy-urykaza obejmujący wyizolowaną, skróconą ssaczą urykazę określoną w dowolnym z zastrz. od 1 do 4.
  7. 7. Koniugat według zastrz. 6, znamienny tym, że obejmuje od 2 do 12 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy.
    PL 215 285 B1
  8. 8. Koniugat według zastrz. 7, znamienny tym, że obejmuje od 3 do 10 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy.
  9. 9. Koniugat według zastrz. 6, znamienny tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1*103 do 100*103 u.
  10. 10. Koniugat według zastrz. 9, znamienny tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1*103 do 50*103 u.
  11. 11. Koniugat według zastrz. 10, znamienny tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 5*103 do 20*103 u.
  12. 12. Koniugat według zastrz. 11, znamienny tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego 3 ma ciężar cząsteczkowy wynoszący 10*103 u.
  13. 13. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera urykazę określoną w dowolnym z zastrz. od 1 do 3.
  14. 14. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera koniugat glikol polietylenowy-urykaza określony w zastrz. 6.
  15. 15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 13, znamienna tym, że jest odpowiednia do powtarzalnego podawania.
  16. 16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 14, znamienna tym, że jest odpowiednia do powtarzalnego podawania.
  17. 17. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 13 do wytwarzania leku użytecznego do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych u wymagającego tego osobnika.
  18. 18. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 14 do wytwarzania leku użytecznego do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych u wymagającego tego osobnika.
  19. 19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że płynem biologicznym jest krew.
  20. 20. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że płynem biologicznym jest krew.
  21. 21. Wyizolowana skrócona ssacza urykaza jak określona) w zastrz. 1, w której N-końcowym aminokwasem jest metionina.
  22. 22. Wyizolowana skrócona ssacza urykaza według zastrz. 21, znamienna tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 7.
  23. 23. Wyizolowany kwas nukleinowy, którego sekwencja koduje białko określone w zastrz. 1, zastrz. 3, zastrz. 4, zastrz. 21 lub zastrz. 22.
  24. 24. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 23, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem.
  25. 25. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 24, znamienny tym, że promotorem jest promotor osmB.
  26. 26. Wektor kwasu nukleinowego, który obejmuje kwas nukleinowy określony w zastrz. 24.
  27. 27. Komórka gospodarza obejmująca wektor określony w zastrz. 26.
  28. 28. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego kodującą urykazę obejmującą sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 7 lub SEK NR ID: 8.
  29. 29. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 28, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję przedstawioną na SEK NR ID: 9 lub SEK NR ID: 10.
  30. 30. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 28, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem.
  31. 31. Kwas nukleinowy według zastrz. 30, znamienny tym, że promotorem jest promotor osmB.
  32. 32. Wektor kwasu nukleinowego, obejmujący kwas nukleinowy określony w zastrz. 30.
  33. 33. Komórka gospodarza obejmująca wektor określony w zastrz. 32.
  34. 34. Sposób wytwarzania urykazy, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowania komórki gospodarza określonej w zastrz. 27 lub 33 w takich warunkach, że sekwencja kwasu nukleinowego ulega ekspresji w komórce gospodarza, oraz izolowania wyrażonej urykazy.
PL387691A 2005-04-11 2006-04-11 Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza, obejmujacy ja koniugat glikol polietylenowy-urykaza, sposób jej wytwarzania, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna i jej zastosowanie oraz kodujacy urykaze wyizolowany kwas nukleinowy, jego wektor i obejmujaca go komórka gospodarza PL215285B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67057305P 2005-04-11 2005-04-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL387691A1 PL387691A1 (pl) 2009-09-14
PL215285B1 true PL215285B1 (pl) 2013-11-29

Family

ID=37075495

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL17192971T PL3321359T3 (pl) 2005-04-11 2006-04-11 Wariantowe postacie oksydazy moczanowej i ich zastosowanie
PL387691A PL215285B1 (pl) 2005-04-11 2006-04-11 Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza, obejmujacy ja koniugat glikol polietylenowy-urykaza, sposób jej wytwarzania, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna i jej zastosowanie oraz kodujacy urykaze wyizolowany kwas nukleinowy, jego wektor i obejmujaca go komórka gospodarza

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL17192971T PL3321359T3 (pl) 2005-04-11 2006-04-11 Wariantowe postacie oksydazy moczanowej i ich zastosowanie

Country Status (27)

Country Link
US (12) US8188224B2 (pl)
EP (3) EP3321359B1 (pl)
JP (6) JP2008535500A (pl)
KR (1) KR20080009111A (pl)
CN (1) CN101198693B (pl)
AU (1) AU2006235495B2 (pl)
BR (1) BRPI0612941A2 (pl)
CA (1) CA2604399A1 (pl)
CY (1) CY1124138T1 (pl)
CZ (1) CZ2007695A3 (pl)
DK (1) DK3321359T3 (pl)
ES (2) ES2538357T3 (pl)
FR (1) FR15C0067I2 (pl)
HK (1) HK1112021A1 (pl)
HU (2) HU229068B1 (pl)
IL (1) IL186510A (pl)
LT (1) LT3321359T (pl)
MX (1) MX2007012547A (pl)
NZ (1) NZ562292A (pl)
PL (2) PL3321359T3 (pl)
PT (1) PT3321359T (pl)
RU (4) RU2451074C2 (pl)
SG (1) SG161247A1 (pl)
SI (1) SI3321359T1 (pl)
TW (1) TWI366467B (pl)
WO (1) WO2006110819A2 (pl)
ZA (1) ZA200708650B (pl)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2158923B1 (en) 1998-08-06 2013-02-27 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
PL3321359T3 (pl) 2005-04-11 2021-06-28 Horizon Pharma Rheumatology Llc Wariantowe postacie oksydazy moczanowej i ich zastosowanie
US8148123B2 (en) * 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
RU2435847C2 (ru) 2005-04-11 2011-12-10 Савиент Фармасьютикалз, Инк. Вариантная форма урат-оксидазы и ее использование
US20080159976A1 (en) * 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
ES2532804T3 (es) * 2006-04-12 2015-03-31 Crealta Pharmaceuticals Llc Purificación de proteínas con tensioactivo catiónico
KR101861547B1 (ko) 2009-06-25 2018-07-02 크레알타 파마슈티칼스 엘엘씨 페길화된 유리카아제 치료 중에 혈청 요산을 모니터링하여 주입 반응의 위험성 및 반응의 항체­매개 상실을 예측하는 방법 및 키트
CN102051348B (zh) * 2009-10-27 2012-10-03 重庆富进生物医药有限公司 人源化重组尿酸酶及其突变体
US8940861B2 (en) 2010-04-08 2015-01-27 Georgia Tech Research Corporation Variants of ancestral uricases and uses thereof
CN102634492B (zh) 2011-02-14 2015-06-10 重庆富进生物医药有限公司 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用
CN102260653B (zh) * 2011-06-30 2013-04-03 荣俊 一种peg化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法
CN103834623B (zh) * 2014-02-11 2017-11-07 中国药科大学 具有催化活性的人源尿酸氧化酶
US11098289B2 (en) 2015-05-15 2021-08-24 Medimmune, Llc Uricase sequences and methods of treatment
JP2019535819A (ja) * 2016-11-11 2019-12-12 ホライゾン ファーマ リューマトロジー リミテッド ライアビリティ カンパニーＨｏｒｉｚｏｎ Ｐｈａｒｍａ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｌｌｃ プレドニゾンおよびウリカーゼ分子の併用療法ならびにその使用
CN111909906B (zh) * 2019-05-10 2024-04-19 重庆派金生物科技有限公司 聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶
WO2021042055A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 Horizon Pharma Rheumatology Llc Pegloticase for treatment of gout in renal transplant recipients
CN112646790A (zh) * 2019-10-11 2021-04-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法
CN112980808A (zh) * 2019-12-12 2021-06-18 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 尿酸酶、及其制备方法和用途
CN113144174B (zh) * 2020-01-22 2023-07-04 杭州远大生物制药有限公司 治疗高尿酸相关性疾病的药物
KR20230110281A (ko) 2020-11-03 2023-07-21 프로탈릭스 리미티드 변형된 유리카제(uricase) 및 이의 용도
CN114438048A (zh) * 2020-11-05 2022-05-06 重庆派金生物科技有限公司 尿酸氧化酶制剂及其应用
CN114438047A (zh) * 2020-11-05 2022-05-06 重庆派金生物科技有限公司 制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法
CN115197923A (zh) * 2021-04-09 2022-10-18 上海君实生物医药科技股份有限公司 尿酸酶、其药物组合物及其用途
CN117230034A (zh) * 2023-10-16 2023-12-15 临沂大学 一种高稳定性哺乳动物尿酸氧化酶突变体

Family Cites Families (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279489C (pl)
DE279486C (pl)
US1141973A (en) 1911-05-22 1915-06-08 Jesse W Nichols Can-cap with vent-shield.
DE837379C (de) 1950-04-20 1955-08-16 Nordwind G M B H Windkraftanlage, insbesondere zum Antrieb einer Kolbenpumpe
US3451996A (en) 1968-02-12 1969-06-24 Thompson Farms Co Method for the preparation of heparin
US3616231A (en) 1968-11-14 1971-10-26 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the production of uricase
US3613231A (en) 1969-07-25 1971-10-19 Paul F Pugh Method for manufacturing high voltage cable systems
US3931399A (en) 1970-12-22 1976-01-06 Behringwerke Aktiengesellschaft Process for isolating a fibrin-stabilizing factor
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4027676A (en) 1975-01-07 1977-06-07 Ethicon, Inc. Coated sutures
US4169764A (en) 1975-08-13 1979-10-02 Ajinomoto Co., Inc. Process for production of urokinase
US4141973A (en) 1975-10-17 1979-02-27 Biotrics, Inc. Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof
US4064010A (en) 1976-07-21 1977-12-20 Eastman Kodak Company Purification of uricase
US4301153A (en) 1977-03-21 1981-11-17 Riker Laboratories, Inc. Heparin preparation
US4425431A (en) 1978-04-20 1984-01-10 Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. Production of an allose-containing polysaccharide
US4312979A (en) 1978-04-20 1982-01-26 Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. Polysaccharides containing allose
JPS6031472B2 (ja) 1978-12-14 1985-07-22 協和醗酵工業株式会社 酸性ウリカ−ゼ
US4251431A (en) 1979-01-16 1981-02-17 Shell Oil Company Lubricating greases
JPS5599189A (en) 1979-01-22 1980-07-28 Mihama Hisaharu Modified uricase free from antigenicity and its preparation
JPS55135590A (en) 1979-04-05 1980-10-22 Mihama Hisaharu Modified asparaginase and uricase and their preparation
DE2916711A1 (de) 1979-04-25 1980-11-06 Behringwerke Ag Blutgerinnungsfaktoren und verfahren zu ihrer herstellung
DE2943016C2 (de) 1979-10-24 1984-09-06 Dr. Rentschler Arzneimittel Gmbh & Co, 7958 Laupheim Verfahren zur Reinigung von Interferon
JPS5651995A (en) 1979-10-05 1981-05-09 Green Cross Corp:The Preparation of interferon
AU538665B2 (en) 1979-10-30 1984-08-23 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon dna
DE3005897A1 (de) 1980-02-16 1981-09-03 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus
FR2475900A1 (fr) 1980-02-20 1981-08-21 Fabre Sa Pierre Complexe vaccinal contenant un antigene specifique et vaccin le contenant
CH651308A5 (de) 1980-07-01 1985-09-13 Hoffmann La Roche Interferone und deren herstellung.
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
JPS5740503A (en) 1980-08-22 1982-03-06 Seikagaku Kogyo Co Ltd Separation of saccharides
US4315852A (en) 1980-11-26 1982-02-16 Schering Corporation Extraction of interferon from bacteria
FR2497006A1 (fr) 1980-12-24 1982-06-25 Ind Electro Ste Gle Contacts electriques pour cables coaxiaux et cables bifilaires
JPS57192435A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Toyobo Co Ltd Modified polypeptide
DE3126759A1 (de) 1981-07-07 1983-01-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Loesliche leber-uricase, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
US4450103A (en) 1982-03-01 1984-05-22 Cetus Corporation Process for recovering human IFN-β from a transformed microorganism
US4485176A (en) 1982-06-28 1984-11-27 E. I. Du Pont De Nemours & Company Turbidimetric method for measuring protein in urine and cerebrospinal fluid
EP0109688A3 (en) 1982-11-23 1986-12-03 The Wellcome Foundation Limited Improved complexes, processes for obtaining them and formulations containing such complexes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
USD279486S (en) 1983-04-25 1985-07-02 International Jensen Incorporated Controller for a video game or the like
US4719179A (en) 1984-11-30 1988-01-12 Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. Six base oligonucleotide linkers and methods for their use
US4732863A (en) 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
JPH0671425B2 (ja) 1985-06-05 1994-09-14 サッポロビール株式会社 ウリカ−ゼおよびその製造法
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
EP0229108B1 (en) 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4847079A (en) 1985-07-29 1989-07-11 Schering Corporation Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal
AU597924B2 (en) 1985-12-11 1990-06-14 Natinco Nv Solubilization of protein aggregates
DD279486A1 (de) 1986-03-10 1990-06-06 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur aktivierung von hydroxylgruppenhaltigen polymeren verbindungen
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
JPS6255079A (ja) 1986-04-23 1987-03-10 Mihama Hisaharu 修飾ウリカ−ゼ
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DD279489A1 (de) 1986-12-11 1990-06-06 Leuna Werke Veb Verfahren zur herstellung optisch transparenter epoxidharzformmassen
JPS63203548A (ja) 1987-02-12 1988-08-23 四国化工機株式会社 飲料用密封容器の製造装置
AU612133B2 (en) 1987-02-20 1991-07-04 Natinco Nv Production of proteins in active forms
CA1305285C (en) 1987-04-21 1992-07-14 Malcolm Roy Brandon Production of proteins in active forms
AU609824B2 (en) 1987-06-15 1991-05-09 Southern Cross Biotech Pty Ltd. Production of proteins in active forms
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
CA1286591C (en) 1987-12-18 1991-07-23 Douglas B. Taylor Apparatus for opening and closing roll-up door
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
JPH01216939A (ja) 1988-02-24 1989-08-30 Hoechst Japan Kk 末熟児頭蓋内出血阻止剤
US4945086A (en) 1988-05-03 1990-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Smooth muscle cell growth inhibitor
US5955336A (en) 1988-08-17 1999-09-21 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha DNA sequence for uricase and manufacturing process of uricase
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
JP3148208B2 (ja) 1988-10-31 2001-03-19 富士ゼロックス株式会社 マルチ出力トレイ付プリントサーバおよびプリントシステム
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5010183A (en) 1989-07-07 1991-04-23 Macfarlane Donald E Process for purifying DNA and RNA using cationic detergents
NZ234453A (en) 1989-07-13 1993-01-27 Sanofi Sa Recombinant dna encoding urate oxidase, and vector, host, protein and pharmaceutical compositions associated therewith
KR0159107B1 (ko) 1989-07-13 1998-11-16 쟝 르쌍드뢰 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포
JPH0354581A (ja) 1989-07-24 1991-03-08 Nec Corp 電子写真系プリンタの現像カートリッジ
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
KR927003090A (ko) 1989-08-23 1992-12-17 하다사 메디칼 오르가니제이션 헤파린효소를 포함하는 상처 치유 약제
JPH03148298A (ja) 1989-11-01 1991-06-25 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 修飾ペプチドおよびその製造方法
JPH03148208A (ja) 1989-11-02 1991-06-25 Mikimoto Seiyaku Kk 皮膚外用剤
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5653974A (en) 1990-10-18 1997-08-05 Board Of Regents,The University Of Texas System Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor
EP0575545B1 (en) 1991-03-15 2003-05-21 Amgen Inc. Pegylation of polypeptides
ES2141108T3 (es) 1991-07-02 2000-03-16 Inhale Inc Metodo y dispositivo para proporcionar medicamentos en aerosol.
YU66892A (sh) 1991-08-20 1995-10-24 Hoechst Ag. Fosfoinositolglikan - peptid sa delovanjem kao insulin
JP3148298B2 (ja) 1991-09-02 2001-03-19 帝人株式会社 軽量複合成形物の製造法
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
AU6240494A (en) 1993-02-16 1994-09-14 Enzon, Inc. Ribosome inactivating protein compositions having reduced antigenicity
US6385312B1 (en) 1993-02-22 2002-05-07 Murex Securities, Ltd. Automatic routing and information system for telephonic services
JP3875730B2 (ja) 1993-02-22 2007-01-31 サノフィ・アベンティス株式会社 自己免疫疾患の予防治療剤
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
JPH06255079A (ja) 1993-03-08 1994-09-13 Akira Totsuka 被服地のスクリーン印刷装置及び被服地のスクリーン印刷方法
KR960701649A (ko) 1993-04-09 1996-03-28 심파쓰 Xa인자 억제활성을 가진 신규 폴리펩티드
US5783421A (en) 1993-04-09 1998-07-21 Bio-Technology General Corp. DNA encoding novel polypeptide having Factor Xa inhibitory activity
WO1994023740A1 (en) 1993-04-22 1994-10-27 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of growth factor and bone resorption inhibitor
WO1995000162A1 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
AU685187B2 (en) 1993-10-29 1998-01-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins including protease nexin-1 variants
DK0730470T3 (da) 1993-11-10 2002-06-03 Enzon Inc Forbedrede interferonpolymerkonjugater
US5795776A (en) 1994-03-22 1998-08-18 Bio-Technology General Corp. Expression plasmids regulated by an OSMB promoter
FI96317C (fi) 1994-05-31 1996-06-10 Exavena Oy Menetelmä hienojakoisten ja muunnettujen tärkkelyksien valmistamiseksi
DE4423131A1 (de) 1994-07-01 1996-01-04 Bayer Ag Neue hIL-4-Mutantenproteine als Antagonisten oder partielle Agonisten des humanen Interleukin 4
US5633227A (en) 1994-09-12 1997-05-27 Miles, Inc. Secretory leukocyte protease inhibitor as an inhibitor of tryptase
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5856451A (en) 1994-12-07 1999-01-05 Novo Nordisk A/S Method for reducing respiratory allergenicity
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL116696A (en) 1995-01-25 1999-08-17 Bio Technology General Corp Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b
TW426523B (en) 1995-04-06 2001-03-21 Hoffmann La Roche Interferon solution
FR2733914B1 (fr) 1995-05-11 1997-08-01 Sanofi Sa Composition de liquide stable contenant de l'urate oxydase et composition lyophilisee pour sa preparation
JPH09154581A (ja) 1995-12-05 1997-06-17 Asahi Chem Ind Co Ltd ウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物
US6006753A (en) 1996-08-30 1999-12-28 Eli Lilly And Company Use of GLP-1 or analogs to abolish catabolic changes after surgery
ES2275300T3 (es) 1997-01-15 2007-06-01 Phoenix Pharmacologics, Inc. Factor de necrosis tumoral modificado.
US5816397A (en) 1997-01-21 1998-10-06 Ogio International, Inc. Golf club carrying apparatus
EP1017794A1 (en) 1997-02-06 2000-07-12 Novo Nordisk A/S Polypeptide-polymer conjugates having added and/or removed attachment groups
KR100369838B1 (ko) 1997-02-26 2003-09-29 주식회사 엘지생명과학 한국형c형간염바이러스의비구조단백질3에서유래한단백질분해효소단백질및그의제조방법
US6821763B2 (en) 1997-07-04 2004-11-23 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing microbial transglutaminase
JPH1175876A (ja) * 1997-07-04 1999-03-23 Ajinomoto Co Inc 新規な微生物トランスグルタミナーゼの製造法
JP2002517406A (ja) 1998-06-01 2002-06-18 ジェネンテック・インコーポレーテッド イオン交換クロマトグラフィーの使用による、凝集体からのタンパク質モノマーの分離
PT1100880E (pt) * 1998-08-06 2011-01-13 Univ Duke Urato-oxidase
JP5183836B2 (ja) 1998-08-06 2013-04-17 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
US20060188971A1 (en) 1998-08-06 2006-08-24 Duke University Urate oxidase
EP2158923B1 (en) 1998-08-06 2013-02-27 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
KR19980069019U (ko) 1998-09-29 1998-12-05 양영석 신축성 핸드폰 케이스
US6425448B1 (en) 2001-01-30 2002-07-30 Cdx Gas, L.L.P. Method and system for accessing subterranean zones from a limited surface area
US6429860B1 (en) 1999-06-15 2002-08-06 Visicomp, Inc. Method and system for run-time visualization of the function and operation of a computer program
RU2286711C2 (ru) 2000-02-14 2006-11-10 Фёрст Опинион Корпорэйшн Система и способ автоматической диагностики
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
US20050084478A1 (en) 2000-10-17 2005-04-21 Chih-Ping Liu Combination therapy using interferon-tau
NZ528076A (en) 2001-03-02 2005-09-30 Medimmune Inc Methods of preventing or treating inflammatory or autoimmune disorders by administering integrin alphav beta3 antagonists with an immunomodulatory agents, anti-inflammatory agents, TNF-alpha antagonists or CD2 binding molecules
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US20040105839A1 (en) 2001-11-28 2004-06-03 Myung-Ok Park Biologically active non-antigenic copolymer and conjugates thereof and methods for producing the same
ZA200504990B (en) 2003-01-09 2006-08-30 Genentech Inc Purification of polypeptides
JP4273998B2 (ja) 2004-02-26 2009-06-03 学校法人東海大学 プロテオーム解析用試料の調製方法
WO2005110386A2 (en) 2004-04-13 2005-11-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of decreasing inflammation in kidney transplantation using angiotensin receptor blockers
CN103088038B (zh) 2004-07-12 2015-06-24 美国天甲生物医药有限公司 黄病毒疫苗
GB0420888D0 (en) 2004-09-20 2004-10-20 Photopharmica Ltd Compounds and uses
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
PL3321359T3 (pl) 2005-04-11 2021-06-28 Horizon Pharma Rheumatology Llc Wariantowe postacie oksydazy moczanowej i ich zastosowanie
US20080159976A1 (en) 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
RU2435847C2 (ru) 2005-04-11 2011-12-10 Савиент Фармасьютикалз, Инк. Вариантная форма урат-оксидазы и ее использование
CA2642656A1 (en) 2006-02-22 2007-09-07 Novartis Pharma Ag System for delivering nebulized cyclosporine and methods of treatment
ES2532804T3 (es) 2006-04-12 2015-03-31 Crealta Pharmaceuticals Llc Purificación de proteínas con tensioactivo catiónico
NL1031926C2 (nl) 2006-05-31 2007-12-03 X Flow Bv Inrichting met een bioreactor en membraanfiltratiemodule voor het behandelen van een inkomend fluïdum.
US20080145876A1 (en) 2006-11-21 2008-06-19 University Of Southern California Poly(ethylene glycol) anti-body detection assays and kits for performing thereof
JP5813919B2 (ja) 2007-10-10 2015-11-17 協和発酵バイオ株式会社 シトルリンおよびアルギニンを含有する即効性血中アルギニン濃度上昇型経口剤
CN101168052A (zh) 2007-10-26 2008-04-30 西安交通大学 一种防治高尿酸血症及痛风的肠溶制剂
ES2521674T3 (es) 2008-09-15 2014-11-13 Transition Therapeutics Ireland Limited Métodos de tratamiento de hiperuricemia y estados patológicos asociados
WO2010071865A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Nuon Therapeutics, Inc. Pharmaceutical compositions and methods for treating hyperuricemia and related disorders
KR101861547B1 (ko) 2009-06-25 2018-07-02 크레알타 파마슈티칼스 엘엘씨 페길화된 유리카아제 치료 중에 혈청 요산을 모니터링하여 주입 반응의 위험성 및 반응의 항체­매개 상실을 예측하는 방법 및 키트
WO2011032175A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 Nuon Therapeutics, Inc. Combination formulations of tranilast and allopurinol and methods related thereto
JP5451464B2 (ja) 2010-03-09 2014-03-26 キヤノン株式会社 帯電装置
EP2560642A4 (en) 2010-03-30 2013-12-18 Ardea Biosciences Inc TREATMENT OF GICHT
CN104066324A (zh) 2011-11-04 2014-09-24 西玛贝医药公司 治疗痛风急性发作的方法
JP5746101B2 (ja) 2012-06-18 2015-07-08 コスメディ製薬株式会社 マイクロニードルの迅速溶解法
GB2512876A (en) 2013-04-09 2014-10-15 Image Analysis Ltd Methods and apparatus for quantifying inflammation
LT3536685T (lt) 2014-04-04 2022-04-25 Pfizer Inc. Biciklinio sulieto heteroarilo arba arilo junginiai ir jų naudojimas kaip irak4 inhibitorių
MX2018011012A (es) 2016-03-11 2019-03-28 Selecta Biosciences Inc Formulaciones y dosis de uricasa pegilada.
WO2018007878A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 CanTrust LifeScience Corp. Methods of treating and preventing gout and lead nephropathy
US20220409620A1 (en) 2016-11-11 2022-12-29 Horizon Pharma Rheumatology Llc Reducing immunogenicity to pegloticase
JP2019535819A (ja) 2016-11-11 2019-12-12 ホライゾン ファーマ リューマトロジー リミテッド ライアビリティ カンパニーＨｏｒｉｚｏｎ Ｐｈａｒｍａ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｌｌｃ プレドニゾンおよびウリカーゼ分子の併用療法ならびにその使用
BR112019018748A2 (pt) 2017-03-11 2020-04-07 Selecta Biosciences Inc métodos e composições relacionados ao tratamento combinado com anti-inflamatórios e nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor
US20200237879A1 (en) 2019-01-30 2020-07-30 Horizon Pharma Rheumatology Llc Tolerization reduces intolerance to pegloticase and prolongs the urate lowering effect (triple)
WO2020160325A1 (en) 2019-01-30 2020-08-06 Horizon Pharma Rheumatology Llc Reducing immunogenicity to pegloticase
WO2020160324A1 (en) 2019-01-30 2020-08-06 Horizon Pharma Rheumatology Llc Reducing immunogenicity to pegloticase
WO2021042055A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Horizon Pharma Rheumatology Llc Pegloticase for treatment of gout in renal transplant recipients
KR20230086660A (ko) 2020-08-10 2023-06-15 호라이즌 테라퓨틱스 유에스에이, 인크. 통풍의 치료 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US8541205B2 (en) 2013-09-24
RU2012106148A (ru) 2013-08-27
LT3321359T (lt) 2021-05-10
JP2018015005A (ja) 2018-02-01
PT3321359T (pt) 2021-03-11
WO2006110819A3 (en) 2007-03-08
RU2012106150A (ru) 2013-08-27
EP1871874B1 (en) 2015-04-08
RU2610680C2 (ru) 2017-02-14
US9017980B2 (en) 2015-04-28
US9670467B2 (en) 2017-06-06
WO2006110819A2 (en) 2006-10-19
JP2013135676A (ja) 2013-07-11
HUE052976T2 (hu) 2021-06-28
SI3321359T1 (sl) 2021-07-30
AU2006235495B2 (en) 2012-04-12
RU2012106116A (ru) 2013-08-27
HUP0700730A2 (en) 2008-03-28
US9926537B2 (en) 2018-03-27
PL387691A1 (pl) 2009-09-14
US20150197732A1 (en) 2015-07-16
IL186510A (en) 2013-03-24
US20130330803A1 (en) 2013-12-12
HUP0700730A3 (en) 2012-09-28
KR20080009111A (ko) 2008-01-24
US9926538B2 (en) 2018-03-27
HK1112021A1 (en) 2008-08-22
US10731139B2 (en) 2020-08-04
DK3321359T3 (da) 2021-03-08
US20120309085A1 (en) 2012-12-06
HU229068B1 (en) 2013-07-29
EP2947145A1 (en) 2015-11-25
US20170313995A1 (en) 2017-11-02
NZ562292A (en) 2009-11-27
JP2015107122A (ja) 2015-06-11
RU2007141625A (ru) 2009-05-20
RU2451074C2 (ru) 2012-05-20
US20190316097A1 (en) 2019-10-17
AU2006235495A1 (en) 2006-10-19
BRPI0612941A2 (pt) 2012-10-02
PL3321359T3 (pl) 2021-06-28
US10160958B2 (en) 2018-12-25
EP3321359B1 (en) 2020-12-02
US20170313993A1 (en) 2017-11-02
US20210079362A1 (en) 2021-03-18
CZ2007695A3 (cs) 2008-02-27
ZA200708650B (en) 2009-07-29
JP2019070006A (ja) 2019-05-09
JP2016171819A (ja) 2016-09-29
US11345899B2 (en) 2022-05-31
FR15C0067I2 (fr) 2016-02-12
US11781119B2 (en) 2023-10-10
US20170321193A1 (en) 2017-11-09
US20230034252A1 (en) 2023-02-02
CN101198693B (zh) 2013-03-27
FR15C0067I1 (pl) 2015-11-13
CA2604399A1 (en) 2006-10-19
US20170313994A1 (en) 2017-11-02
IL186510A0 (en) 2008-01-20
ES2856881T3 (es) 2021-09-28
TWI366467B (en) 2012-06-21
EP1871874A2 (en) 2008-01-02
JP2008535500A (ja) 2008-09-04
TW200640482A (en) 2006-12-01
CY1124138T1 (el) 2022-05-27
CN101198693A (zh) 2008-06-11
ES2538357T3 (es) 2015-06-19
SG161247A1 (en) 2010-05-27
US20170298326A1 (en) 2017-10-19
MX2007012547A (es) 2008-03-11
EP3321359A1 (en) 2018-05-16
US20090169534A1 (en) 2009-07-02
US8188224B2 (en) 2012-05-29
RU2610680C9 (ru) 2018-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11345899B2 (en) Variant forms of urate oxidase and use thereof
PL215157B1 (pl) Wyizolowana urykaza, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna, kodujacy ja wyizolowany kwas nukleinowy, zawierajacy go wektor i obejmujaca ten wektor komórka gospodarza oraz sposoby wytwarzania urykazy oraz zawierajacej urykaze kompozycji farmaceutycznej