KR20230110281A - 변형된 유리카제(uricase) 및 이의 용도 - Google Patents

변형된 유리카제(uricase) 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230110281A
KR20230110281A KR1020237018900A KR20237018900A KR20230110281A KR 20230110281 A KR20230110281 A KR 20230110281A KR 1020237018900 A KR1020237018900 A KR 1020237018900A KR 20237018900 A KR20237018900 A KR 20237018900A KR 20230110281 A KR20230110281 A KR 20230110281A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
uricase
modified
polypeptide
moiety
group
Prior art date
Application number
KR1020237018900A
Other languages
English (en)
Inventor
일리야 루데르퍼
야키르 나타프
길 아르바츠
우리 하나니아
타마르 아리엘
쉘리 로젠
야엘 아욘
Original Assignee
프로탈릭스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프로탈릭스 리미티드 filed Critical 프로탈릭스 리미티드
Publication of KR20230110281A publication Critical patent/KR20230110281A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0093—Oxidoreductases (1.) acting on CH or CH2 groups (1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13013—Calcidiol 1-monooxygenase (1.14.13.13), i.e. 25-hydroxyvitamin D-1-alpha-hydroxylase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본원에는 변형된 유리카제뿐만 아니라, 변형된 유리카제와 배지를 접촉시켜 요산 수준을 감소시키는 방법이 기재되어 있다. 변형된 유리카제는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 이작용성 연결 모이어티에 의해 가교된 유리카제 폴리펩타이드를 포함한다. 이작용성 연결 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 4 kDa이고/이거나 변형된 유리카제는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 갖는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 갖는 폴리펩타이드가 추가로 설명된다. 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티 및 적어도 2개의 알데하이드기를 포함하는 가교제와 폴리펩타이드를 접촉시켜 접합체를 얻는 단계; 및 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계를 포함하는 변형된 유리카제를 제조하는 방법 또한 기재되어 있다.

Description

변형된 유리카제(uricase) 및 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2020년 11월 3일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/108,890의 우선권 이익을 주장하고, 그 내용은 전체적으로 참조로 본원에 본원에 포함된다.
서열 목록
2021년 10월 31일에 생성되고 11,072바이트로 구성된 89419.txt라는 제목의 ASCII 파일이 본 출원의 제출과 동시에 제출되어 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은, 이의 일부 구현예에서, 요법, 특히 신규한 형태의 유리카제 및 이의 용도(예: 요산 수치 감소)에 관한 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
요산은 퓨린 뉴클레오타이드의 대사 분해 산물이다. 높은 혈중 요산 농도(고뇨산혈증)는 통풍 및/또는 신장 결석을 유발할 수 있으며, 높은 요산 수치는 출혈성 쇼크 [D'Alessandro et al., J Transl Med 2015, 13:253], 말라리아 [Gallego-Delgado et al., Curr Rheumatol Rep 2014, 16:401]; 알레르기성 천식 [Kool et al., Immunity 2011, 34:P527-P540]; 외상성 뇌 손상 [Liu et al., Int J Med Sci 2018, 15:1072-1082]; 신장 기능 장애 및 급성 위장염 [Matsuo et al., Sci Rep 2016, 6:31003]; 다발성 경화증 [Piancone et al., Front Immunol 2018, 9:983]; 염증성 장 질환 [Crane & Mongiardo, Immunol Invest 2014, 43:255-266]; 위장관 감염 [Crane et al., Infect Immun 2016, 84:976-988]; 및 무균 염증과 임신 합병증 [Nadeau-Vallee et al., Reproduction 2016, 152:R277-R292]을 비롯한 다른 의학적 상태와 관련이 있다.
통풍의 일반적인 1차 치료는 예를 들어 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항-염증제를 사용하여 증상을 치료하는 것이다. 추가 약물로는 (요산을 생성하는) 잔틴 산화효소(xanthine oxidase enzyme)의 억제제인 알로퓨리놀(allopurinol)과 페북소스타트(febuxostat), 및 신장에서 요산의 재흡수를 억제하는 것으로 알려진 프로베네시드(probenecid), 레시누라드(lesinurad), 및 벤즈브로마론(benzbromarone) 등이 있다.
당업계에서 요산염 산화효소 (urate oxidase)라고도 하는 유리카제 (uricase, 요산 분해효소)는 요산 (O2를 소비하고 H2O2를 생성)을 대부분의 동물, 식물 및 박테리아에서 알란토인(allantoin)으로 가수분해되는 5-하이드록시이소요산으로 산화시키는 것을 촉매하는 효소이다. 그러나 인간(및 다른 유인원)에는 유리카제가 없기 때문에 인간은 특히 높은 혈중 요산 농도에 취약하다.
라스부리카제 (Rasburicase, Elitek®로 시판됨)는 Aspergillus flavus에서 복제된 사량체 유리카제로, 암에 대한 화학 요법을 받는 대상체에서 종양 용해 증후군의 예방 및 치료를 위해 미국 및 유럽에서 사용하도록 승인되었다. 통풍 치료를 위한 라스부리카제의 오프-라벨 사용도 보고되었다 [J Rheumatol 2007, 34:2093-2098]. 라스부리카제는 반감기가 6-21시간이며, 매일 정맥 주사를 통해 투여해야 한다.
페글로티카제 (Pegloticase, Krystexxa®로 시판됨)는 페길화된 사량체 돼지-개코원숭이 키메라 유리카제이며, 난치성 통풍 치료제로 승인되었다. 4개의 단량체 각각에서, 30개의 라이신 잔기 중 평균 10개가 10kDa PEG 사슬에 의해 접합되어 있다.
유리카제는 인체에 자연적으로 존재하지 않는 단백질로서 면역원성이 매우 높다. 아나필락시스는 라스부리카제와 페글로티카제의 잠재적인 심각한 부작용이다. 페글로티카제의 PEG 모이어티가 유리카제 백본에 대한 면역 반응을 감소시킬 수 있지만, PEG 모이어티 자체는 항체에 대한 표적이 될 수 있다 [Zhang et al., J Control Release 2016, 244:184-193; Hershfield et al., Arthritis Res Ther 2014, 16:R63; Ganson et al., Arthritis Res Ther 2006, 8:R12].
페글로티카제에 대한 임상 3상 시험에서, 환자의 26%가 주입 반응을 경험했고 환자의 6.5%가 아나필락시스로 특징되는 반응을 보였다 [Baraf et al., Arthritis Res Ther 2013, 15:R137; Strand et al., J Rheumatol 2012, 39: 1450-1457].
최대 6개월 동안 진행된 2상 및 3상 시험에서, 페글로티카제에 대한 항체가 어느 시점에서 80% 이상의 환자에서 검출되었으며 (다른 방법 사용); 가장 높은 역가는 효능 손실 및 주입 반응과 관련이 있었다 [Sundy et al., JAMA 2011, 306:711-720; Sundy et al., Arthritis Rheum 2008, 58:2882-2891].
국제 특허 출원 공보 WO 00/07629에는 유리카제 서브유닛당 평균 2 내지 10개의 PEG 가닥 및 평균 약 5 kDa 내지 100 kDa의 PEG 분자량을 갖는 PEG에 공유 결합된 유리카제가 기재되어 있다.
국제 특허 출원 공개 WO 2011/107992에는 TNF-α, 황체형성 호르몬, 면역글로빈, TNF-α 수용체, CTLA-4, 요산염 산화효소, VEGF, PDGF, VEGF 수용체, PDGF 수용체, 인터루킨-17 또는 이들의 단편, 연결 모이어티를 통해 서로 공유 결합된 단량체와 같은 치료용 단백질의 단량체를 포함하는 다량체 단백질 구조가 기재되어 있다.
Koyama et al. [J Biochem 1996, 120:969-973] 에는 Candida utilis 유리카제 뿐만 아니라 시스테인 잔기가 세린 잔기로 대체된 이의 돌연변이가 기재되어 있으며, Cys168이 효소 활성에 관여하는 4개의 시스테인 잔기 중 유일한 하나라는 결론을 내렸다.
Chua et al. [Ann Intern Med 1988, 109:114-117] 에는 단일작용성(메톡시-캡핑) PEG로 변형된 Arthrobacter protoformiae 유리카제가 기재되어 있고, 투여 후 3주 동안 항체 생성을 유도하지 않았다고 보고한다.
추가 배경 기술에는 Hershfield et al. (2009) ["Development of PEGylated mammalian urate oxidase as a therapy for patients with refractory gout" In: Veronese F.M. (Eds) PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications. Milestones in Drug Therapy. Birkhauser Basel]; Nyborg et al. [PLoS ONE 2016, 11:e0167935]; 및 Veronese [Biomaterials 2001, 22:405-417]; 미국 특허 번호. 4,179,337, 6,913,915, 8,188,224, 및 9,885,024; 미국 특허 출원 공개 번호. 2007/0274977 및 2008/0159976; 및 국제 특허 출원 공개 WO 2011/107990, WO 2011/107991, WO 2016/187026, WO 2018/010369 및 WO 2019/010369가 포함된다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 이작용성 연결 모이어티로 가교된 유리카제 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 유리카제가 제공되며, 상기 이작용성 연결 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 4 kDa 범위이다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 갖는 복수의 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 유리카제가 제공되며, 상기 폴리펩타이드는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 이작용성 연결 모이어티에 의해 가교된다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 갖는 폴리펩타이드가 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 변형된 유리카제와 관련하여 본원에 기재된 구현예 중 임의의 것에 따른 변형된 유리카제를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하고, 적어도 2개의 알데하이드기를 포함하는 가교제와 폴리펩타이드를 접촉시켜, 상기 폴리펩타이드와 상기 가교제의 접합체를 얻는 단계; 및
(b) 상기 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 배지 중의 요산 수준을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 배지를 변형된 유리카제와 관련하여 본원에 기재된 구현예 중 임의의 것에 따른 변형된 유리카제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드이다.
본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 폴리펩타이드는 식물 재조합 폴리펩타이드이다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 이작용성 연결 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 4 kDa 범위이다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 이작용성 연결 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 3.5 kDa 범위이다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 이작용성 연결 모이어티는 상기 유리카제 폴리펩타이드 내의 아민기의 질소 원자에 공유 결합된 알킬렌기를 포함한다.
폴리펩타이드 내의 아민기에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 아민기는 라이신 잔기 측쇄에 포함된다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 유리카제 폴리펩타이드는 평균 적어도 8개의 이작용성 연결 모이어티에 부착된다.
복수의 폴리펩타이드에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 각각의 폴리펩타이드는 평균 적어도 8개의 이작용성 연결 모이어티에 부착된다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 변형된 유리카제 내의 라이신 잔기 측쇄의 적어도 30%는 상기 적어도 하나의 이작용성 연결 모이어티에 공유 결합된다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 이작용성 연결 모이어티는 하기 화학식 I을 갖는다:
-CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-CH2-
화학식 I
여기서:
L1 및 L2는 각각 독립적으로 탄화수소 모이어티이거나 부재하고;
m은 2 내지 10 범위의 정수이며; 및
n은 2 내지 1000 범위의 정수이다.
화학식 I에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, n은 30 내지 100 범위이다.
화학식 I에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, L1 및 L2 중 적어도 하나, 또는 둘 다는 비치환된 알킬렌이다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티이다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 변형된 유리카제는 사량체 형태이다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 변형된 유리카제는 가교된 사량체 형태이다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 변형된 유리카제는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩타이드 및 이들의 상동체를 포함한다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 변형된 유리카제는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩타이드 및 이들의 상동체를 포함한다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 변형된 유리카제는 쥐(rat)에서의 혈장 반감기가 적어도 50시간인 것을 특징으로 한다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 변형된 유리카제는 유리카제 활성이 유리한 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.
변형된 유리카제에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 변형된 유리카제는 과도한 요산 수준과 관련된 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.
질병 또는 장애에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 질병 또는 장애는 통풍, 당뇨병, 신장 결석, 종양 용해 증후군, 출혈성 쇼크, 말라리아, 알레르기성 염증, 신장 기능 장애, 바이러스성 감염, 급성 위장염, 태반 염증, 무균 염증, 임신 합병증, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 위장관 감염 및 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
치료에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 치료는 적어도 1주 간격으로 변형된 유리카제를 투여하는 것을 포함한다.
치료에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 치료는 적어도 2개월 간격으로 변형된 유리카제를 투여하는 것을 포함한다.
치료에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 치료는 변형된 유리카제를 월 8 mg 이하의 용량으로 투여하는 것을 포함한다.
방법에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 환원제는 피콜린 보란 착물(picoline borane complex) 및 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
방법에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 가교제는 하기 화학식 II를 갖는다:
HC(=O)-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-C(=O)H
화학식 II
여기서:
L1 및 L2는 각각 탄화수소 모이어티이고;
m은 2 내지 10 범위의 정수이며; 및
n은 2 내지 1000 범위의 정수이다.
방법에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 가교제의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 4 kDa 범위이다.
방법에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 방법은 상기 폴리펩타이드의 사량체 형태를 상기 가교제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
방법에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 가교제 대 상기 폴리펩타이드의 몰비는 100:1 내지 10,000:1 범위이다.
방법에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 배지는 이를 필요로 하는 대상체의 조직이고, 상기 방법은 변형된 유리카제를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
대상체에 투여하는 것에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 대상체는 통풍, 당뇨병, 신장 결석, 종양 용해 증후군, 출혈성 쇼크, 말라리아, 알레르기성 염증, 신장 기능 장애, 바이러스성 감염, 급성 위장염, 태반 염증, 무균 염증, 임신 합병증, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 위장관 감염 및 레쉬-니한 증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질병 또는 장애를 앓고 있다.
대상체에 투여하는 것에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 투여는 적어도 1주 간격으로 수행된다.
대상체에 투여하는 것에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 상기 투여는 적어도 2개월 간격으로 수행된다.
대상체에 투여하는 것에 관한 본 발명의 임의의 구현예 중 일부에 따르면, 대상체에게 투여되는 상기 유리카제의 용량은 월 8 mg 이하이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 기재되는 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 구현예의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료가 하기에 기재된이다. 모순될 경우에는 정의를 포함한 본 특허 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시에 불과하며 반드시 제한하려는 의도는 아니다.
본 발명의 일부 구현예는 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 본 명세서에서 설명된다. 이제 도면을 구체적으로 참조하면, 도시된 특정 사항은 예로서 그리고 본 발명의 실시예의 예시적인 논의를 위한 것임을 강조한다. 이와 관련하여, 도면과 함께 작성된 설명은 본 발명의 실시예가 실시될 수 있는 방법을 당업자에게 명백하게 한다.
도면에서:
도 1은 본 발명의 일부 구현예에 따른 변형된 유리카제; 및 유리카제를 알데하이드-함유 가교제 및 환원제와 접촉시킴으로써 본 발명의 일부 구현예에 따른 이러한 변형된 유리카제를 제조하는 방법을 묘사하는 도식을 제시한다.
도 2는 식물 재조합 야생형 칸디다 유리카제(prU-C)와 C250K 돌연변이(prU-C250K)를 25mM Tris pH 8.4 (추정된 분자량 값은 중앙에 표시됨)에서 0.3 mg/mL (광학 밀도에 의해 결정됨) 농도로 동결/해동(Fr/Th) 사이클 전(-) 및 후(+)의 SDS-PAGE 분석(변성 조건 하) 시 겔 이미지를 나타낸 것이다; 유리카제-관련 고분자량 구조 (이량체 및 사량체와 같은 여러 서브유닛으로 형성됨)는 왼쪽에 괄호로 표시된다.
도 3은 인간 혈장(37℃에서 2μg/mL 유리카제)에서 인큐베이션한 후 시간에 따른 유리카제 변이체(prU-A, prU-C, prU-C250K 및 prU-G)의 효소 활성(t = 0에서의 활성으로 정규화)을 나타내는 그래프이고, t = 0에서의 활성으로 정규화된다.
도 4는 비-변형 prU-C 및 1000 Da, 2000 Da, 5000 Da 또는 10000 Da PEG(분자량 마커는 오른쪽에 표시됨)를 갖는 PEG 비스 알데하이드(Bis PEG ALD)로 가교된 prU-C의 SDS-PAGE 분석 시 젤 이미지를 나타낸다.
도 5는 비-변형 prU-A(레인이 "-"로 표시됨) 및 600 Da, 1000 Da, 2000 Da, 3400 Da, 5000 Da 또는 10000 Da PEG(오른쪽에 표시된 분자량 마커)를 갖는 PEG 비스 알데하이드(Bis-Ald-PEG)로 가교된 prU-A의 SDS-PAGE 분석 시 젤 이미지를 나타낸다.
도 6은 비-변형 prU-G 및 2000 Da, 3400 Da 또는 5000 Da PEG(왼쪽에 표시된 분자량 마커)를 갖는 200 또는 1000 당량의 비스-Ald-PEG로 가교된 prU-G의 SDS-PAGE 분석 시 젤 이미지를 나타낸다.
도 7은 비-변형 prU-A 및 알데하이드(ALD) 또는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 작용기(왼쪽에 표시된 분자량 마커)를 갖는 100 당량의 이작용성 2000 Da PEG로 가교된 prU-A의 SDS-PAGE 분석 시 젤 이미지를 나타낸다.
도 8A 및 8B는 2000 Da 비스-Ald PEG 또는 2000 Da 비스-NHS PEG와 백반 보조제로 가교된 prU-A를 쥐에 면역화시킨 것을 나타내는 도식(도 8A)을 제시하고 (위쪽 화살표는 면역화 일자, 아래쪽 화살표는 혈청 수집 일자를 나타낸다), 막대 그래프(도 8B)는 도 8A의 타임라인에 따라 비스-Ald-PEG(쥐 7-12) 또는 비스-NHS-PEG(쥐 13-18)와 가교된 prU-A로 면역화한 쥐의 테스트 단백질에 대한 항체 역가를 보여준다; 각 동물에 대한 3개의 막대는 30일(왼쪽 막대), 50일(중간 막대), 및 72일(오른쪽 막대)의 항체 역가를 나타낸다.
도 9A 및 9B는 비스-Ald-PEG(도 9A) 또는 비스-NHS-PEG(도 9B)에 의해 가교된 prU-A에 대한 항체의 결합 억제(%)를 비-변형 prU-A에 의한 억제와 비교하여 경쟁 ELISA를 사용하여 나타낸 그래프이다; 테스트 항목에 면역화된 쥐의 혈청 샘플을 변형 또는 비-변형 prU-A(x축의 "억제제(inhibitor)")의 농도를 증가시켜 사전 인큐베이션하였고; 변형 또는 비-변형 prU-A로 사전-인큐베이션하여 억제 후 결합 비율을 사전-인큐베이션에 사용된 단백질(억제제)의 농도의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 10은 2000 Da PEG(쥐 1-5) 또는 3400 Da PEG(쥐 11-15)를 갖는 PEG 비스-알데하이드와 가교된 prU-A,또는 2000 Da PEG(쥐 21-25) 또는 3400 Da PEG(쥐 26-30)를 갖는 PEG 비스-알데하이드 및 백반 보조제로 가교된 prU-C로 면역화된 개별 쥐에서 (테스트된 변형 prU에 대한) 항체의 역가를 보여주는 막대 그래프를 나타낸다; 혈액 샘플을 30일(채혈 1), 51일(채혈 2) 및 72일(채혈 3)에 수집하였고 면역화를 1, 21, 42 및 63일에 수행하였다.
도 11은 건강한 인간 기증자의 기존 항체에 의한 비-변형 prU-C250K, 단일작용성 10 kDa PEG로 변형된 prU-C250K, 및 이작용성 3400 Da PEG로 변형된 prU-C250K를 ELISA를 사용하여 인식하는 것을 보여주는 표를 나타낸 것이다; 값은 샘플의 ELISA 결과와 음성 대조군 사이의 OD 비율을 나타내며, OD 비율이 적어도 2인 양성 반응을 나타내는 기증자(102명의 기증자 중 34명, 각각은 행으로 표시)에 대한 결과만 강조 표시된다.
도 12는 37℃에서 인간 혈장 내 비스-Ald-PEG 3400 Da로 가교된 두 배치(346 및 347)의 prU-C250K의 안정성을 효소 활성(t = 0에서의 활성으로 정규화)으로 측정한 그래프를 보여준다.
도 13A 및 13B는 6회 정맥내(IV) 시도(challenge)(상단 화살표)를 포함하는, 암컷 쥐에서 가교된 prU-C250K-비스-Ald-PEG3400 Da와 비교한 비-변형 prU-C250K의 약동학(PK) 및 면역원성 연구를 도시하는 도식(도 13A)을 제시하고, 이어서 PK 및 항체 역가 평가(하부 화살표는 분석을 위한 혈액 수집 일자를 나타내고, 굵은 화살표는 항체 평가 일자를 나타내며 가는 화살표는 PK 시점을 나타냄)를 제시하며, 막대 그래프(도 13B)는 비-변형 prU-C250K로 면역화된 6마리 쥐에서 0일(Pre1), 14일(채혈 1), 31일(채혈 2), 44일(채혈 3), 59일(채혈 4) 및 73일(채혈 5)에 prU-C250K에 대한 항체 역가를 보여준다.
도 14A, 14B, 14C 및 14D는 나이브 쥐(도 14A 및 14B) 또는 6회 시도된 쥐(도 14C 및 14D)에서 prU-C250K-비스-Ald-PEG3400의 약동학 프로파일을 시간에 따른 혈장 내 단백질 농도의 자연로그(LN) 및 데이터에 대한 선형 적합성(점선 및 방정식 및 R2 값)으로 보여주는 그래프를 나타낸다; 총 prU-C250K-비스-Ald-PEG3400 농도는 상보적 ELISA 분석에 의해 결정되었으며(도 14A 및 14C), 활성 단백질 농도는 유리카제 활성을 측정하여 평가되었다(도 14B 및 14D); 계산된 반감기 및 곡선 아래 면적(AUC)은 54. 0 시간 및 61.07 mg*분/ml (도 14A), 64.8 시간 및 65.95 mg*분/ml (도 14B), 70.5 시간 및 80.4 mg*분/ml (도 14C), 및 68.4 시간 및 58.5 mg*분/ml (도 14D)이다.
도 15는 기질(UA) 농도의 함수로서 예시적인 가교된 유리카제(사각형) 및 페글로티카제(원)에 대한 효소 속도를 나타내는 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 플롯을 제시한다; 효소 속도는 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하고 H2O2 생성과 관련된 산화된 Ampliflu™ 프로브의 선형 형광 증가를 평가하여 결정하였다(데이터 포인트는 3중으로 수행된 실험의 평균을 나타냄).
도 16은 첫 번째 효소 주사 후 시간의 함수로서 쥐에서 예시적인 가교된 유리카제 및 페글로티카제의 혈장 농도를 보여주는 그래프를 제시한다.
도 17은 네 번째 효소 주사 후 시간의 함수로서 쥐에서 예시적인 가교된 유리카제 및 페글로티카제의 혈장 농도를 보여주는 그래프를 제시한다.
도 18은 (도 16 및 17에 제시된 데이터에 기초하여) 첫 번째(나이브) 및 네 번째(반복) 주사 후 쥐에서 예시적인 가교된 유리카제 및 페글로티카제의 혈장 반감기를 보여주는 막대 그래프를 제시한다.
본 발명은, 이의 일부 구현예에서, 요법에 관한 것이고, 배타적이지는 않지만 보다 상세하게는, 신규 형태의 유리카제 및 이의 용도, 예를 들어 요산 수준을 감소시키는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 구현예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 하기 설명에 기재되거나 실시예에 의해 예시된 세부 사항에 대한 적용에 반드시 제한되는 것은 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 구현예가 가능하거나 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다.
상기에서 논의한 바와 같이, 유리카제는 인간에게 외래 단백질이기 때문에 면역원성이 매우 높아 치료적 사용에 심각한 장애가 된다. 또한, 일반적으로 주사 또는 주입으로 투여하기 때문에 매우 불편할 수 있으며, 취급 또는 보관 시 불안정성을 겪을 수 있다.
유리카제의 개선된 형태를 찾기 위해, 본 발명자들은 면역원성이 감소되고 거의 무효화되며 저장 및 생체내 안정성이 우수한 변형된 형태의 유리카제를 설계하고 성공적으로 실시하였다. 본 발명자들은 이러한 가교된 유리카제의 특성이 당업계에 공지된 PEG화 유리카제의 특성과 유리하게 (예를 들어, 낮은 면역원성 및 향상된 생체 내 반감기와 관련하여) 비교된다는 것을 보여주었다.
본 발명을 실시하는 동안, 본 발명자들은 감소된 면역원성 및 감소된 응집을 포함하는 개선된 성능과 관련된 돌연변이 유리카제 폴리펩타이드를 발견하였다.
이제 도면을 참조하면, 도 2는 예시적인 유리카제 돌연변이체(SEQ ID NO: 2)가 감소된 유리카제 응집과 연관되어 있음을 보여준다.
도 3은 인간 혈장 내에서 안정성을 나타내는 예시적인 유리카제 변이체를 보여준다. 도 12는 예시적인 구현예에 따른 가교된 유리카제가 인간 혈장 내에서 높은 정도의 안정성을 나타낸다는 것을 보여준다. 도 14A-14D는 예시적인 구현예에 따른 가교된 유리카제가 반복 투여 후에도 쥐에서 50시간 이상의 생체 내 반감기를 나타낸다는 것을 보여준다.
도 4, 5 및 6은 폴리에틸렌 글리콜 연결 모이어티에 의한 다양한 유리카제 변이체의 가교 효율이 연결 모이어티의 분자량이 1000 Da 초과 5000 Da 미만일 때 가장 크다는 것을 보여준다.
도 7은 비스-NHS 및 비스-알데하이드 가교제 모두 유리카제를 효율적으로 가교하며, 비스-알데하이드 제제에 의한 가교가 비스-N-하이드록시숙신이미드 제제보다 더 효율적인 변형을 야기함을 보여준다.
도 8A-8B는 비스-알데하이드 제제를 사용한 가교가 비스-N-하이드록시숙신이미드 제제를 사용한 가교보다 가교된 유리카제의 생체 내 면역원성이 상당히 낮다는 것을 보여준다.
도 10은 낮은 수준의 생체 내 면역원성이 서로 다른 유리카제 변이체의 가교 시 얻어질 수 있음을 보여준다. 대조적으로, 도 13A-13B는 변형되지 않은 유리카제가 상당한 면역원성이 있음을 보여준다.
도 11은 예시적인 (짧은) PEG 연결 모이어티에 의한 가교 시 항원성(건강한 인간 기증자의 기존 항체 양으로 표시됨)이 10kDa PEG(페글로티카제에 사용되는 변형)로 변형한 경우와 비교하여 더 낮다는 것을 보여준다.
도 15는 예시적인 가교된 유리카제가 페글로티카제보다 시험관 내에서 훨씬 더 많은 유리카제 활성을 나타냄을 보여준다.
도 16-18은 예시적인 가교된 유리카제가 생체 내에서 페글로티카제보다 더 긴 혈장 반감기를 나타냄을 보여준다.
변형된 유리카제:
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 변형된 유리카제가 제공된다. 상기 변형된 유리카제는 적어도 하나의 유리카제 폴리펩타이드(이 용어는 본원에서 정의된 바와 같음)를 포함하고, 적어도 하나의 유리카제 폴리펩타이드는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 연결 모이어티, 바람직하게는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 이작용성 연결 모이어티에 의해 가교된다.
본원에서, "변형된 유리카제"라는 용어는 하나 이상의 추가 모이어티(유리카제 제외)가 공유 결합된 적어도 하나의 유리카제 폴리펩타이드(본원에서 정의된 바와 같음)를 포함하는 임의의 구조를 지칭하며, 본원에 명시적으로 설명된 것 이상으로 제한하려는 의도는 아니다.
본원에서, 용어 "가교(crosslinking)", "가교된(crosslinked)" 및 이의 임의의 변이체는 다른 분자 상의 2개 이상의 서로 다른 부위 각각에서 또 다른 분자에 공유 결합된 (예: 2개 이상의 서로 다른 원자에 공유 결합된) 개별 모이어티를 지칭한다. 가교는 분자 내(intramolecular)일 수 있는데, 즉 전술한 개별 모이어티는 단일 분자, 예를 들어 단일 폴리펩타이드 (예: 접합체 에서와 같이, 여기서 모이어티 B는 2개의 다른 부위에서 모이어티 A에 공유 결합됨)의 2개 이상의 서로 다른 부위에 공유 결합된다; 또는 가교는 분자간(intermolecular)일 수 있는데, 즉 전술한 개별 모이어티는 2개 이상의 상이한 분자, 예를 들어 2개 이상의 폴리펩타이드 (예: 접합체 A-B-A에서와 같이, 여기서 모이어티 B는 2개의 상이한 A 모이어티에 공유 결합됨) 각각에 공유 결합된다; 또는 분자 내 및 분자간 가교의 조합일 수 있다 (예: 접합체 에서와 같이, 여기서 2개의 B 모이어티는 분자내 가교에 관여하고 하나는 분자간 가교에 관여함).
필수적이지는 않지만 일반적으로, 전술한 개별 모이어티는 본원에서 "가교"로 기술되고 하나 이상의 다른 분자는 "가교된"으로 기재된이다 (예: 접합체 A-B-A에서, 모이어티 B는 일반적으로 2개의 모이어티 A를 "가교"한다고 기술될 것이며, 2개의 A 모이어티는 모이어티 B에 의해 "가교된"다).
본원에서, 용어 "연결 모이어티(linking moiety)"는 2개 이상의 별개의 부위에서 또 다른 모이어티 및/또는 분자에 공유 결합된 임의의 모이어티(분자의 구성요소)를 기술하고; 즉, 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 다른 분자(예: 하나 이상의 폴리펩타이드)를 가교하는 모이어티이다. "이작용성 연결 모이어티"는 2개의 별개의 부위(그 이상은 아님)에 공유 결합된 연결 모이어티를 지칭한다.
본원에 기재된 가교 및 연결 모이어티는 폴리펩타이드의 단일 부위에 모이어티의 부착을 수반하는 당업계에 공지된 다양한 폴리펩타이드 변형 (예: 일반적으로 단일 부위에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 부착을 수반하는 페길화)과는 다르다는 것을 인식해야 한다. 본원의 실시예 섹션에 나타낸 바와 같이, 연결 모이어티로 변형된 유리카제는, 예를 들어 일반적인 페길화(페글로티카제에서와 같이)에 의해 단일작용성인 화학적으로 유사한 모이어티로 변형된 상응하는 유리카제와는 상당히 다른 특성을 나타낼 수 있다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 연결 모이어티는 단일작용성 모이어티보다 더 입체적으로 제한되어 있으며, 이러한 모이어티에 부착된 부위의 총 수를 증가시킬 수 있고/있거나 그 주변으로부터 폴리펩타이드를 더 효율적으로 차폐할 수 있다고 여겨진다 (예: 변형 모이어티의 주어진 수 및/또는 질량에 대해).
본원에서, 용어 "유리카제"는 EC 1.7.3.3 (요산염의 5-히드록시요산으로의 산화를 촉매하고, O2에서 H2O2로의 전환을 수반함) 또는 EC 1.14.13.113 (요산염의 5-하이드록시요산으로 산화를 촉매하고, FADH의 산화 및 O2의 H2O2로의 전환을 수반함)으로 지정된 임의의 효소를 포함한다; 여기에는 자연 발생 효소의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및 상동 아미노산 서열을 갖는 단백질 (예: 상동체와 관련하여 본원에 기재된 임의의 구현예에 따라, 이 용어가 본원에서 정의된 바와 같이)이 모두 포함된다.
본원에 기재된 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 유리카제는 EC 1.7.3.3 유리카제이다.
본원에서, 용어 "유리카제 폴리펩타이드"는 유리카제에 포함된 분리된 폴리펩타이드 사슬을 의미한다. 예를 들어, 사량체 유리카제는 네 개의 유리카제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다; 또는 대안적으로, 유리카제는 단지 하나의 유리카제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다(예: 유리카제 폴리펩타이드로 구성됨). 유리카제 폴리펩타이드는 하나 이상의 치환기(예: 본원에 기재된 연결 모이어티 이외의 것)에 의해 선택적으로 치환된다 (예: 당류 및/또는 지질 모이어티, 및/또는 자연 발생 폴리펩타이드에 부착되는 것으로 당업계에 공지된 임의의 다른 치환기).
본원에 기재된 임의의 구현예 중 일부에서, 변형된 유리카제는 다량체 구조의 형태이다; 즉, 변형된 유리카제는 복수의 유리카제 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 이러한 다량체 형태는 예를 들어 이량체, 삼량체, 사량체, 육량체, 팔량체 또는 더 큰 다량체 형태일 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 다량체 형태는 구조(예: 유리카제 폴리펩타이드 사슬의 수 및/또는 이의 배향)가 변형되지 않은 유리카제, 예를 들어 많은 유리카제 변이체의 경우 사량체와 유사하다.
다량체 구조에서 유리카제 폴리펩타이드의 적어도 일부는 선택적으로, 예를 들어 본원에 기재된 연결 모이어티에 의한 분자간 가교에 의해 서로 공유 결합될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 다량체 구조에서 유리카제 폴리펩타이드의 적어도 일부는 선택적으로 비공유 상호작용에 의해서만 (예: 여기서 본원에 기재된 연결 모이어티에 의한 모든 가교는 분자내이다) 다량체 구조에서 다른 폴리펩타이드와 연관될 수 있다.
당업자에게 명백할 것이지만, 본원에 기재된 변형된 유리카제는 복잡한 중합체 특성(예: 하나 이상의 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 중합체 연결 모이어티의 존재로 인해)을 가지며, 따라서 일반적으로 유사하지만 다소 다른 분자 및/또는 다량체 구조 집단 형태로 생성될 수 있다. 예를 들어, 연결 모이어티의 수 및/또는 하나 이상의 연결 모이어티가 유리카제 폴리펩타이드에 부착되는 위치는 다양할 수 있다.
각각의 구현예 중 일부에서, 유리카제 폴리펩타이드 (예: 본원에 기재된 다량체 구조의 복수의 유리카제 폴리펩타이드 각각)는 (본원에 기재된 각각의 구현예 중 임의의 것에 따라) 평균 적어도 2개의 연결 모이어티에 부착되며, 선택적으로 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 12개, 적어도 14개 및 심지어 적어도 16개의 연결 모이어티에 부착된다. 전술한 연결 모이어티는 선택적으로 이작용성 연결 모이어티이다. 일부 이러한 구현예에서, 전술한 각각의 연결 모이어티는 2개의 라이신 잔기에 부착된다.
각각의 구현예 중 일부에서, 변형된 유리카제 내의 라이신 잔기 측쇄의 적어도 10%가 연결 모이어티에 부착되고(예: 라이신 잔기 측쇄에 부착되는 연결 모이어티와 관련하여 본원에 기재된 임의의 구현예에 따라), 선택적으로 라이신 잔기 측쇄의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 및 심지어 적어도 90%가 연결 모이어티에 부착되어 있다. 전술한 연결 모이어티는 선택적으로 이작용성 연결 모이어티다. 일부 구현예에서, 실질적으로 모든 라이신 잔기 측쇄가 연결 모이어티에 부착된다.
각각의 폴리펩타이드에 부착된 연결 모이어티의 평균 수 또는 연결 모이어티에 부착된 라이신 잔기 측쇄의 평균 수를 결정함에 있어서, 변형된 유리카제 분자 및/또는 다량체 구조의 집단(예: 전술한 집단)의 평균이 결정된다. 예를 들어, 두 개의 폴리펩타이드에 부착된 개별 연결 모이어티는 폴리펩타이드당 0.5개의 연결 모이어티에 해당한다.
본원에 기재된 연결 모이어티에 더하여, 변형된 유리카제는 선택적으로 하나 이상의 추가 모이어티, 예를 들어, 본원에 기재된 연결 모이어티와 유사한 구조(예: 본원에 기재된 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함 및/또는 연결 모이어티에 대해 본원에 기재된 방식으로 폴리펩타이드 라이신 잔기에 부착되는)를 가지지만 단 하나의 부위에서만 유리카제 폴리펩타이드에 부착되는 하나 이상의 모이어티에 의해 더 변형될 수 있다. 이러한 (단일작용성) 모이어티는 예를 들어, 폴리펩타이드 상의 잠재적 결합 부위(예: 라이신 잔기)가 다른 모이어티에 부착되거나 및/또는 입체적으로 차단되는 불완전한 가교 반응에 의해 생성될 수 있다.
추가적으로, 이작용성 연결 모이어티에 관한 본원의 임의의 구현예에서, 변형된 유리카제는 선택적으로 이작용성이 아닌 하나 이상의 연결 모이어티, 예를 들어 3, 4 또는 그 이상의 폴리펩타이드 부위에 부착된 연결 모이어티(선택적으로 분지형 연결 모이어티)에 의해 더 변형될 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 이작용성 모이어티는 예를 들어, 폴리펩타이드에 부착할 수 있는 2개 이상의 작용기를 포함하는 화합물의 불완전한 가교 반응에 의해 생성될 수 있는데, 예를 들어 여기서 폴리펩타이드 상의 잠재적 결합 부위(예: 라이신 잔기)가 모이어티에 부착 및/또는 입체적으로 차단되어 제3 부위에서의 부착을 억제한다.
본원에 기재된 임의의 구현예 중 일부에서, 변형된 유리카제는 상응하는 비-변형 유리카제(즉, 본원에 기재된 연결 모이어티가 없는 경우)보다 생체 내 반감기가 더 긴 것을 특징으로 한다. 본원에 기재된 이러한 일부 구현예에서, 변형된 유리카제의 반감기는 상응하는 비-변형 유리카제의 반감기보다 적어도 20% 더 길다. 일부 구현예에서, 변형된 유리카제의 반감기는 상응하는 비-변형 유리카제의 반감기보다 적어도 50퍼센트 더 길다. 일부 구현예에서, 변형된 유리카제의 반감기는 상응하는 비-변형 유리카제의 반감기보다 적어도 100 % - 즉, 적어도 두배 - 더 길다. 일부 구현예에서, 변형된 유리카제의 반감기는 상응하는 비-변형 유리카제의 반감기의 적어도 3배이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리카제의 반감기는 상응하는 비-변형 유리카제의 반감기의 적어도 5배이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리카제의 반감기는 상응하는 비-변형 유리카제의 반감기의 적어도 10배이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리카제의 반감기는 상응하는 비-변형 유리카제의 반감기의 적어도 20배이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리카제의 반감기는 상응하는 비-변형 유리카제의 반감기의 적어도 50배이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리카제의 반감기는 상응하는 비-변형 유리카제의 반감기의 적어도 100배이다.
(변형 및/또는 비-변형된) 유리카제의 반감기는, 예를 들어, 대상체 (예: 인간, 및/또는 쥐)에 테스트된 유리카제를 주사한 후, 시간 경과에 따라 혈액 (예: 혈장)에서 테스트된 유리카제의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 본원에 예시된 바와 같이, 유리카제의 양은 테스트된 유리카제에 대한 항체를 사용하여(예: ELISA에 의해) 및/또는 유리카제의 특징적인 효소 활성의 양을 결정함으로써 결정될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 구현예 중 일부에서, 변형된 유리카제는 쥐에서 적어도 40시간의 혈장 반감기(예: 항체 인식 및/또는 효소 활성에 의해 결정됨)를 특징으로 한다. 일부 이러한 구현예에서, 반감기는 적어도 50시간이다. 일부 구현예에서, 반감기는 적어도 60시간이다. 일부 구현예에서, 반감기는 적어도 70시간이다. 일부 구현예에서, 반감기는 적어도 80시간이다. 일부 구현예에서, 반감기는 적어도 100시간이다. 일부 구현예에서, 반감기는 적어도 1주, 또는 적어도 2주, 또는 적어도 3주, 또는 적어도 4주이다.
본원에 기재된 각각의 구현예에 따른 변형된 유리카제의 더 긴 반감기는 선택적으로 변형된 유리카제의 더 큰 분자량(예를 들어, 신장에서의 여과에 의해 혈류로부터 제거되는 속도를 감소시킬 수 있음) 및/또는 변형된 유리카제의 더 낮은 면역원성(면역계에 의한 비활성화 및/또는 파괴율을 감소시킬 수 있음)과 연관될 수 있다.
연결 모이어티:
본원에 기재된 구현예 중 어느 하나에 따른 연결 모이어티는 선택적으로 본원에 기재된 임의의 방식으로 본원에 기재된 임의의 구현예 (예: 본원의 각각의 섹션에서)에 따른 유리카제 폴리펩타이드와 조합될 수 있다 (예: 가교 특성 및/또는 변형된 유리카제의 전체 구조와 관련하여 본원에 기재된 임의의 구현예에 따라).
본원에서 논의된 바와 같이, 상기 연결 모이어티는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함한다.
본원에 사용된, "폴리(알킬렌 글리콜)"이라는 어구는 하기 일반식을 공유하는 폴리에테르 중합체 패밀리를 포함한다: -[O-(CH2)m]n-O-, 여기서 m은 각각의 알킬렌 글리콜 단위에 존재하는 메틸렌기의 수를 나타내고, n은 반복 단위의 수를 나타내며, 따라서 중합체의 크기 또는 길이를 나타낸다. 예를 들어, m = 2일 때, 중합체를 폴리에틸렌 글리콜이라고 지칭하고, m = 3일 때 중합체를 폴리프로필렌 글리콜이라고 지칭한다.
일부 구현예에서, m은 1보다 큰 정수이다(예: m = 2, 3, 4 등).
선택적으로, m은 폴리(알킬렌 글리콜) 사슬의 단위에 따라 다르다. 예를 들어, 폴리(알킬렌 글리콜) 사슬은 함께 연결된 에틸렌 글리콜(m = 2) 및 프로필렌 글리콜(m = 3) 단위를 모두 포함할 수 있다.
"폴리(알킬렌 글리콜)"라는 어구는 또한 산소 원자가, 예를 들어 S, -NH- 등과 같은 또 다른 헤테로원자로 대체된 이의 유사체를 포함한다. 이 용어는 중합체를 구성하는 하나 이상의 메틸렌기가 치환된 상기의 유도체를 추가로 포함한다. 메틸렌기 상의 선택적 치환체의 예는 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 하이드록시, 옥소, 티올 및 티오알콕시 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 메틸렌기(존재하는 경우) 상의 치환체는 알킬, 선택적으로 C1-4-알킬, 및 선택적으로 메틸이다.
본원에 사용된, "알킬렌 글리콜 단위"라는 어구는 폴리(알킬렌 글리콜)의 백본 사슬을 형성하는 전술한 바와같은 -O-(CH2)m- 기 또는 이의 유사체를 포함하며, 여기서 (CH2)m(또는 이의 유사체)은 폴리(알킬렌 글리콜)(화학식 -[O-(CH2)m]n-O-로 표시됨) 또는 이의 헤테로원자 유사체, 또는 또 다른 알킬렌 글리콜 단위 또는 유리카제 폴리펩타이드(말단 단위의 경우)에 속하는 헤테로원자의 말단에 있는 산소 원자(또는 이의 헤테로원자 유사체)에 결합되고; O(또는 전술한 말단 산소 원자) 또는 이의 헤테로원자 유사체는 또 다른 알킬렌 글리콜 단위의 (CH2)m(또는 이의 유사체), 또는 유리카제 폴리펩타이드(본원에 기재된 각각의 구현예 중 어느 하나에 따른)와 결합을 형성하는 작용기에 결합된다.
알킬렌 글리콜 단위는 분지되어 3개 이상의 인접하는 알킬렌 글리콜 단위에 연결될 수 있으며, 여기서 3개 이상의 인접하는 알킬렌 글리콜 단위 각각은 폴리(알킬렌 글리콜) 사슬의 일부이다. 이러한 분지형 알킬렌 글리콜 단위는 이의 헤테로 원자를 통해 하나의 인접하는 알킬렌 글리콜 단위에 연결되고, 나머지 인접하는 알킬렌 글리콜 단위의 헤테로원자는 각각 분지형 알킬렌 글리콜 단위의 탄소 원자에 연결된다. 또한, 헤테로원자(예: 질소)는 그것이 일부인, 알킬렌 글리콜 단위의 하나 이상의 탄소 원자와 결합하여, 분지형 알킬렌 글리콜 단위(예: [(-CH2)m]2N- 등)를 형성할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 알킬렌 글리콜 단위의 적어도 50 %는 동일하며, 예를 들어, 이들은 서로 동일한 헤테로원자 및 동일한 m 값을 포함한다. 선택적으로, 알킬렌 글리콜 단위의 적어도 70 %, 선택적으로 적어도 90 %, 및 선택적으로 100 %는 동일하다. 예시적인 구현예에서, 동일한 알킬렌 글리콜 단위에 결합된 헤테로원자는 산소 원자이고 및/또는 알킬렌 글리콜 단위는 비-치환된다. 추가의 예시적인 구현예에서, 동일한 단위의 경우 m은 2이다.
일 실시예에서, 폴리(알킬렌 글리콜)은 단일의 직선 사슬(바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))이고, 여기서 사슬의 두 말단은 각각 독립적으로 직접 또는 간접적으로(예: 본원에 설명된 작용기를 통해) 유리카제 폴리펩타이드에 부착된다.
본원에서 사용되는, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은, 상기 정의된 바와 같이, 폴리(알킬렌 글리콜)을 설명하며, 여기서 알킬렌 글리콜 단위의 적어도 50 %, 적어도 70 %, 적어도 90 %, 및 바람직하게는 100 %는 -CH2CH2-O-이다. 유사하게, "에틸렌 글리콜 단위"라는 어구는 본원에서 -CH2CH2O-의 단위로 정의된다.
선택적 구현예에 따르면, 연결 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유사체를 포함하며, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유사체는 일반적인 화학식을 갖는다:
-(Y1-CR1R2-CR3R4)n-Y2-
여기서 Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 O, S 또는 NR5(선택적으로 O)이고;
n은 정수이며, 선택적으로 2 내지 1000(선택적으로 10 내지 300, 선택적으로 30 내지 100)이지만, 더 높은 n 값도 고려되고; 및
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 하이드록시, 옥소, 티올 및/또는 티오알콕시이다.
각각의 구현예 중 일부에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 또는 알킬, 선택적으로 수소 또는 C1-4-알킬, 및 선택적으로 수소 또는 메틸이다. 예시적인 구현예에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 수소이다.
폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유사체는, 예를 들어, 상기 화학식에서 Y1-CR1R2-CR3R4 단위가 모두 서로 동일하지 않은 공중합체(copolymer)를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, Y1-CR1R2-CR3R4 단위의 적어도 50 %는 동일하다. 선택적으로, Y1-CR1R2-CR3R4 단위의 적어도 70 %, 선택적으로 적어도 90 %, 선택적으로 100 %는 동일하다.
선택적으로, 연결 모이어티는, 예를 들어, 상기 화학식에서 하나 이상의 Y1-CR1R2-CR3R4 단위에 대해 R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나가 -(Y1-CR1R2-CR3R4)p-Y2-가 되도록 분지되고, 여기서 R1-R5 및 Y1 및 Y2는 상기 정의된 바와 같으며, p는 각각의 구현예 중 어느 하나에 따라 n에 대해 본원에서 정의된 바와 같은 정수(예: 2 내지 1000)이다.
연결 모이어티는 선택적으로 적어도 두 개의 작용기를 포함하며, 각 작용기는 유리카제 폴리펩타이드와 공유 결합을 형성합니다. 작용기의 예는 알킬렌기 및 카르보닐(-C(=O)-)을 포함된다. 알킬렌 또는 카르보닐은 선택적으로 폴리펩타이드의 질소 원자(예: 아민기)에 부착되어 예를 들어 각각 아민기 또는 아미드기를 함께 형성할 수 있다. 작용기는 선택적으로 연결 모이어티의 말단 그룹으로서, 폴리(알킬렌 글리콜)의 전체 길이가 두 작용기 사이에 놓이도록 한다. 각 작용기는 선택적으로 (본원에 기재된 각각의 구현예 중 어느 하나에 따라) 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 직접적으로 부착되거나, 또는 연결기(본원에 정의된 바와 같이)를 통해 간접적으로 부착될 수 있으며, 선택적으로 여기서 연결기는 탄화수소 모이어티이다.
본원에 기재된 각각의 구현예 중 일부에서, 연결 모이어티(선택적으로 이작용성 연결 모이어티)는 폴리펩타이드 내의 아민기의 질소 원자에 공유 결합된 알킬렌기(예: 비-치환 알킬렌기)를 포함한다; 예를 들어, 라이신 잔기 측쇄의 아민기 및/또는 N-말단.
본원에 예시된 바와 같이, 질소 원자에 공유 결합된 이러한 알킬렌기는 선택적으로 환원제의 존재 하에서 알데하이드기를 아민기와 반응시킴으로써(예: 본원에 설명된 공정에 따라) 얻을 수 있다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 폴리펩타이드 질소 원자에 공유 결합된 알킬렌기를 통한 가교는 (선택적으로 카르복실레이트기의 축합에 의해 유도되는) 카르보닐(-C(=O)-)기와 폴리펩타이드 아민기 사이에 아미드 결합을 형성하는 등의 대체 가교 기술보다 유리하게 면역원성이 적은 것으로 여겨지고 있다.
도 1은 본 발명의 일부 구현예에 따른 변형된 유리카제(예: 사량체 형태)를 개략적으로 도시한 것으로, 여기서, PEG 모이어티의 일부는 폴리펩타이드의 복수의 아민기에 부착되고(예: 본원에 기재된 각 구현예에 따라 환원성 아미노화에 의해), 반응하지 않는 작용기(예: 알데하이드)를 남긴 채(본원에 기재된 각 임의의 구현예에 따른 불완전 가교 반응에 의해 선택적으로 생성됨) 폴리펩타이드의 단일 아민기에 부착된다. 또한, 임의의 모이어티에 부착되지 않은 아민기(즉, -NH2기)가 남아있을 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 변형된 유리카제는 선택적으로 환원제의 존재 하에서 비스-알데하이드 시약과 유리카제(예: 유리카제 사량체)의 반응에 의해 생성될 수 있다.
다수의 폴리펩타이드 단위를 포함하는 유리카제(예: 유리카제 사량체)의 경우, 폴리펩타이드의 일부 또는 전체(예: 사량체의 폴리펩타이드 4개 모두)를 서로 가교하기 위해 선택적으로(반드시 필요한 것은 아님) 폴리펩타이드에 PEG 모이어티를 부착할 수 있다(하나 이상의 간섭 폴리펩타이드를 통해 직접 및/또는 간접적으로). 선택적으로, 가교는 변성(denaturating) 조건 하에서 폴리펩타이드가 해리되지 않도록 하는 것이다.
도 1의 도시와 다른 4차 구조(예: 사량체 이외의 구조)를 갖는 변형된 유리카제는, 다른 반응(예: 환원제의 존재 하에서 비스-알데하이드 제제와의 반응 이외의 반응)에 의해 형성되고, 다른 작용기(예: 알데하이드 이외의 작용기)를 포함하며, 폴리펩타이드를 연결 모이어티에 부착하기 위한 다른 기(예: -NH- 기 이외의 것) 및/또는 다른 연결 모이어티를 포함하는(예: PEG 이외의 중합체를 포함하는) 것도 고려된다.
본원에 기재된 각 구현예 중 일부에서, 이작용성 연결 모이어티는 화학식 I을 갖는다:
-CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-CH2-
화학식 I
여기서:
L1 및 L2는 각각 (본원에 정의된 바와 같이) 연결 모이어티거나 부재(선택적으로 동일하거나 다른 연결 모이어티 탄화수소 모이어티)하고, 바람직하게는 여기서 연결 모이어티는 탄화수소 모이어티이고;
m은 2 내지 10 범위의 정수이며; 및
n은 2 내지 1000 범위의 정수이다.
변수 m을 포함하는 화학식과 관련된 본원의 임의의 구현예 중 일부에서, m은 2, 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, m은 2 또는 3이다. 일부 구현예에서, m은 2이고, 연결 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(n개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 포함)를 포함한다.
변수 n을 포함하는 화학식과 관련된 본원의 임의의 구현예 중 일부에서, n은 적어도 10(예: 10에서 300, 또는 10에서 100)이다. 일부 구현예에서, n은 적어도 30(예: 30 내지 300, 또는 30 내지 100, 또는 30 내지 80, 또는 30 내지 60)이다. 일부 예에서, n은 적어도 40이다(예: 40 내지 300, 또는 40 내지 100, 또는 40 내지 80, 또는 40 내지 60). 일부 구현예에서, n은 적어도 50이다(예: 50 내지 300, 또는 50 내지 100, 또는 50 내지 80, 또는 50 내지 60). 일부 구현예에서, n은 적어도 60이다(예: 60 내지 300, 또는 60 내지 100, 또는 60 내지 80). 일부 구현예에서, n은 적어도 60이다(예: 60 내지 300, 또는 60 내지 100, 또는 60 내지 80). 일부 구현예에서, n은 적어도 70(예: 70 내지 300, 또는 70 내지 100, 또는 70 내지 80)이다.
변수 m 및 n을 포함하는 화학식과 관련된 본원의 임의의 구현예 중 일부에서, n은 적어도 10(예: 10 내지 300 또는 10 내지 100)이고, m은 2, 3 또는 4, 바람직하게는 2 또는 3, 더 바람직하게는 2이다. 이러한 일부 구현예에서, n은 적어도 30(예: 30 내지 300, 또는 30 내지 100, 또는 30 내지 80, 또는 30 내지 60)이다. 일부 구현예에서, n은 적어도 40이다(예: 40 내지 300, 또는 40 내지 100, 또는 40 내지 80, 또는 40 내지 60). 일부 구현예에서, n은 적어도 50이다(예: 50 내지 300, 또는 50 내지 100, 또는 50 내지 80, 또는 50 내지 60). 일부 구현예에서, n은 적어도 60이다(예: 60 내지 300, 또는 60 내지 100, 또는 60 내지 80). 일부 구현예에서, n은 적어도 60이다(예: 60 내지 300, 또는 60 내지 100, 또는 60 내지 80). 일부 구현예에서, n은 적어도 70(예: 70 내지 300, 또는 70 내지 100, 또는 70 내지 80)이다.
본원에 기재된 임의의 구현예 중 일부에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 치환 또는 비-치환 알킬렌으로서, 선택적으로 1 내지 4 탄소 원자, 선택적으로 1 내지 3 탄소 원자, 및 선택적으로 1 또는 2 탄소 원자를 갖는다. 일부 이러한 구현예에서, 알킬렌은 비-치환된 알킬렌, 예를 들어, CH2 또는 CH2CH2이다.
(각각의 임의의 구현예에 따른) 화학식 I의 연결 모이어티는 선택적으로 폴리펩타이드의 하나 또는 양쪽 말단에서 질소 원자에 부착될 수 있다. 이러한 구현예에서, 말단 -CH2-(선택적으로 L1 및/또는 L2의 적어도 일부와 조합하여)는 폴리펩타이드의 질소 원자에 부착된 알킬렌(선택적으로 비-치환 알킬렌)을 형성한다(본원에 기재된 각 구현예 중 임의의 것에 따라).
본원에 기재된 각각의 구현예 중 일부에서, 연결 모이어티(선택적으로 이작용성 연결 모이어티)의 분자량은 적어도 약 1.5 kDa이다. 이러한 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 4 kDa 범위이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 3.5 kDa 범위이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 3 kDa 범위이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 2.5 kDa 범위이다. 일부 예시적인 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 2kDa이다.
본원에 기재된 각각의 구현예 중 일부에서, 연결 모이어티(선택적으로 이작용성 연결 모이어티)의 분자량은 적어도 약 2kDa이다. 이러한 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 4 kDa 범위이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 3.5 kDa 범위이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 3 kDa 범위이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 2kDa 내지 약 2.5kDa 범위이다.
본원에 기재된 각각의 구현예 중 일부에서, 연결 모이어티의(선택적으로 이작용성 연결 모이어티)의 분자량은 적어도 약 2.5 kDa이다. 이러한 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 2.5 kDa 내지 약 4kDa 범위이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 2.5 kDa 내지 약 3.5 kDa 범위이다.
본원에 기재된 각각의 구현예 중 일부에서, 연결 모이어티의(선택적으로 이작용성 연결 모이어티)의 분자량은 적어도 약 3 kDa이다. 이러한 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 3 kDa 내지 약 4 kDa 범위이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 3 kDa 내지 약 3.5 kDa 범위이다. 일부 예시적인 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 3.4 kDa이다.
본원에 기재된 각각의 구현예 중 일부에서, 연결 모이어티(선택적으로 이작용성 연결 부분)의 분자량은 약 4 kDa 이하이다. 이러한 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 3.5 kDa 이하이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 3 kDa 이하이다. 일부 구현예에서, 연결 모이어티의 분자량은 약 2.5 kDa 이하이다.
본원에 예시된 바와 같이, 본원에 기재된 크기(예: 적어도 약 1.5 kDa 및/또는 약 4 kDa 이하, 및/또는 본원에 기재된 변수 m 및/또는 n의 값)의 연결 모이어티는 더 작고/작거나 더 큰 연결 모이어티에 비해 가교 효율 및 낮은 면역원성의 유리한 조합과 연관될 수 있다.
임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 지나치게 작은 연결 모이어티는 예를 들어, 연결 모이어티당 질량이 더 작거나 및/또는 각 폴리펩타이드에 부착되는 연결 모이어티의 양이 더 적기 때문에(예: 연결 모이어티가 라이신 잔기 쌍과 같은 2개의 개별 부착 부위에 효율적으로 부착하기에 충분히 길지 않은 경우) 폴리펩타이드의 비효과적인 마스킹(높은 면역원성과 관련됨)을 초래할 수 있다고 여겨진다. 또한, 지나치게 큰 연결 모이어티는 폴리펩타이드의 비효율적인 마스킹을 초래할 수 있는데, 예를 들어, 큰 연결 모이어티의 부착은 추가적인 연결 모이어티의 부착을 입체적으로 억제하여 폴리펩타이드의 마스킹에 틈을 남긴다(예: 항체를 통해 침투할 수 있음).
폴리펩타이드:
본원에 기재된 임의의 구현예에 따른 유리카제 폴리펩타이드 모이어티는 선택적으로 본원에 기재된 임의의 구현예에 따른(예: 본원의 각 세션에서) 연결 모이어티와 본원에 기재된 임의의 방식으로(예: 가교의 특성 및/또는 변형된 유리카제의 전체 구조와 관련하여 본원에 기재된 임의의 구현예에 따라) 조합될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 구현예에서 사용되는 유리카제 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 하나 이상의 유리카제(본원에 정의된 바와 같이)와 연관될 수 있다. 복수의 가교된 유리카제 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 유리카제는(본원에 기재된 각 구현예 중 임의의 것에 따라) 선택적으로 단일 유리카제 변이체 또는 상이한 유리카제 변이체와 연관된 유리카제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 출원으로부터 특허가 만료되는 기간 동안 많은 관련 유리카제 변이체들이 특성화(예: 자연적으로 발생하는 유리카제 변이체) 및/또는 개발(예: 자연적으로 발생하지 않는 유리카제 변이체)될 것으로 예상되며, "유리카제" 및 "유리카제 폴리펩타이드"라는 용어의 범위는 이러한 새로운 변이체 및 기술을 모두 선험적으로 포함하도록 의도된다.
본원에 기재된 임의의 구현예에서 사용될 수 있는 유리카제 폴리펩타이드의 예로는, 고대 인간, 돼지, 개코원숭이, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 알리사이클로바실러스 말리(Alicyclobacillus mali), 아트로박터 강고트리엔시스(Arthrobacter gangotriensis), 아트로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 우다가와(Aspergillus udagawae), 아우레오바시디움 풀룰란스 EXF-150(Aureobasidium pullulans EXF-150), 바실러스 파스티디오서스(Bacillus fastidiosus), 바실러스 할로두란스 C-125(Bacillus halodurans C-125), 바실러스 서브틸리스 str. 168(Bacillus subtilis str. 168), 바실러스 sp. FJAT-21352(Bacillus sp. FJAT-21352), 바실러스 sp. TB-90(Bacillus sp. TB-90), 바실러스 베베리데이(Bacillus beveridgei), 박트로세라 라티프론스(초파리)(Bactrocera latifrons), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 카멜루스 페루스(Camelus ferus )(야생 박트리아 낙타), 칸디다 유틸리스 (Candida utillis), 칸디다투스 솔리박터 우시타투스(Candidatus Solibacter usitatus), 클라미도모나스 라인하르트티(Chlamydomonas reinhardtii), 시서 아리에티눔(Cicer arietinum)(병아리콩), 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans), 데이노코커스 지오써멀리스(Deinococcus geothermalis), 드레크메리아 코니오스포라 (Drechmeria coniospora), 에리나세우스 유로파에우스(고슴도치)(Erinaceus europaeus), 에슐리키아 콜라이 ISC56(Escherichia coli ISC56), 갈디에리아 설푸라리아(Galdieria sulphuraria), 글리신 맥스(대두)(Glycine max), 그라뉼리셀라 툰드리콜라(Granulicella tundricola), 키르피디아 투시아에 DSM 2912(Kyrpidia tusciae DSM 2912), 마그네포르티옵시스 포에(Magnaporthiopsis poae), 마이크로박테리움 sp. zzj4-1(Microbacterium sp. zzj4-1), 네오넥트리아 디티시마(Neonectria ditissima), 니코티아나 타바쿰(담배)(Nicotiana tabacum), 페니바실러스 다위니아누스(Paenibacillus darwinianus), 페니바실러스 오도리퍼(Paenibacillus odorifer), 페이폴루스 벌가리스(일반 콩)(Phaseolus vulgaris), 피알로세팔라 스코피미시스(Phialocephala scopiformis), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 피고셀리스 아델리아에(아델리 펭귄)(Pygoscelis adeliae), 루세투스 애깁티쿠스(이집트 과일 박쥐)(Rousettus aegyptiacus), 스토목시스 칼시트란스(헛간 파리)(Stomoxys calcitrans), 테라글로부스 사넨시스(Terriglobus saanensis), 톨리포클라디움 오피오글로소이데스(Tolypocladium ophioglossoides), 및 톨리포클라디움 오피오글로소이데스 CBS 100239(Tolypocladium ophioglossoides CBS 100239)에서 유래한 유리카제 폴리펩타이드; 두 개 이상의 유리카제 폴리펩타이드의 키메라(예. g., 페글로티카제에 의해 구성된 돼지-개코원숭이 키메라 폴리펩타이드); 및 이의 임의의 상동체 (본원에 정의된 바와 같음)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 유리카제 폴리펩타이드 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4를 포함한다.
본원에 기재된 구현예들 중 일부에서, 변형된 유리카제 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3 을 갖는 적어도 하나의 폴리펩타이드, 및/또는 이들의 상동체(본원에 정의된 바와 같이)를 포함한다. 본원에 예시된 바와 같이, 이러한 서열은 선택적으로 상대적으로 낮은 폴리펩타이드 면역원성과 연관될 수 있다.
본원에 기재된 구현예들 중 일부에서, 변형된 유리카제는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 및/또는 SEQ ID NO: 2를 갖는 적어도 하나의 폴리펩타이드, 및/또는 이들의 상동체(본원에 정의된 바와 같이)를 포함한다. 본원에 예시된 바와 같이, 이러한 서열은 선택적으로 상대적으로 낮은 면역원성, 상대적으로 높은 가교 능력(예: 다수의 라이신 잔기로 인해) 및/또는 생리학적 조건 하에서 상대적으로 높은 안정성(예: 약 37℃의 온도에서의 열 안정성)과 연관될 수 있다.
본원 전체에서, 주어진 폴리펩타이드(예: 본원에 기재된 유리카제 폴리펩타이드)의 "상동체"는 주어진 폴리펩타이드와 적어도 80 % 상동성, 바람직하게는 적어도 90 % 상동성, 더 바람직하게는 적어도 95 % 상동성, 더 바람직하게는 적어도 98 % 상동성을 나타내는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 주어진 폴리펩타이드의 상동체는 주어진 폴리펩타이드와 효소 및/또는 치료적 활성(therapeutic activity) (예: 요산 산화)을 추가로 공유한다. 상동성 백분율은 제1 폴리펩타이드가 비교되는 제2 폴리펩타이드 서열의 상응하는 잔기와 일치하는 제1 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 일반적으로 폴리펩타이드는 최대 상동성을 제공하도록 정렬된다. 예를 들어, 수동 정렬, 컴퓨터 보조 서열 정렬 및 이들의 조합을 포함하는, 동일성의 정도를 평가하기 위해 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 비교를 수행하기 위한 다양한 전략이 당업계에 공지되어 있다. 서열 정렬을 수행하기 위한 다수의 알고리즘(일반적으로 컴퓨터로 구현됨)이 널리 이용 가능하거나 당업자에 의해 생성될 수 있다. 대표적인 알고리즘은, 예를 들어, Smith 및 Waterman의 로컬 상동성 알고리즘(Adv Appl Math, 1981, 2:482); Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘(J Mol Biol 1970, 48:443); Pearson 및 Lipman의 유사성 검색 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1988, 85: 2444); 및/또는 이들 알고리즘의 전산화된 구현을 포함한다(예: Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA). 이러한 알고리즘을 포함하는 즉시 사용 가능한 컴퓨터 프로그램은, 예를 들어, BLASTN, BLASTP, Gapped BLAST, PILEUP, CLUSTALW 등을 포함한다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램의 기본 매개변수(parameter)가 사용될 수 있다. 또는, 실무자는 자신의 실험 및/또는 기타 요구 사항에 따라 기본값이 아닌 매개 변수를 사용할 수 있다(예를 들어, URL이 www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov인 웹 사이트 참조).
주어진 폴리펩타이드의 상동체에 관한 임의의 구현예들 중 일부에서, 상동체는 주어진 폴리펩타이드에 대해 적어도 80%의 서열 동일성, 선택적으로 적어도 90%의 서열 동일성, 선택적으로 적어도 95%의 서열 동일성, 선택적으로 적어도 98%의 서열 동일성, 및 선택적으로 적어도 99%의 서열 동일성을 나타낸다.
본원에 기재된 구현예들 중 일부에서, 유리카제 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 갖는다. 이러한 일부 구현예에서, 변형된 유리카제는 SEQ ID NO: 2를 갖는 복수의 폴리펩타이드, 선택적으로 SEQ ID NO: 2를 갖는 4개의 폴리펩타이드를 포함한다.
아래 실시예 섹션에서 설명한 바와 같이, SEQ ID NO: 2는 점 돌연변이 C250K(즉, Cys250이 라이신으로 대체됨)가 있는 칸디다 유틸리스(Candida utilis)(SEQ ID NO: 1)에서 유래한 자연 발생 유리카제 폴리펩타이드에 해당한다. SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드와 마찬가지로 쉽게 사량체를 형성한다.
대안적으로, 유리카제 폴리펩타이드는 선택적으로 SEQ ID NO: 2의 상동체일 수 있으며, 여기서 상동체는 SEQ ID NO: 2의 Lys250(또는 SEQ ID NO: 1의 Cys250)과 상동인 위치에서 Cys 이외의 임의의 잔기를 포함한다. 선택적으로, 상동체는 SEQ ID NO: 2에서 Lys250과 상동인 위치에 Lys를 포함한다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, Cys250은 분자간 이황화 결합을 형성하여 폴리펩타이드 응집에 중요한 역할을 하여, 이를 제거하면 원치 않는 응집을 상당히 감소시키는 것으로 여겨진다. 또한 추가 라이신 잔기(C250K 돌연변이로 인한)는 예를 들어 아민기에 부착하기에 적합한 가교 모이어티와의 가교를 촉진하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 갖는 폴리펩타이드가 제공된다.
본 발명의 임의의 구현예의 유리카제 폴리펩타이드는 선택적으로 (예: 식물 또는 동물 조직으로부터) 정제되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 각 구현예 중 일부에서, 유리카제 폴리펩타이드는 식물 재조합 폴리펩타이드, 즉 식물에서 재조합 기술에 의해 생성된 것이다. 니코티아나 타바쿰(담배)(Nicotiana tabacum)은 폴리펩타이드의 재조합 생성을 위한 예시적인 식물이다.
다양한 세포 및/또는 유기체(식물 및 식물 세포 포함)에서 폴리펩타이드의 재조합 생성을 위한 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다.
재조합 단백질은 선택적으로 재조합 단백질이 생성되는 세포 및/또는 유기체 유형(예: 식물)에 특징적인 번역 후 변형(예: 글리코실화)을 특징으로 할 수 있다 (반대로, 예를 들어 폴리펩타이드(또는 이의 가장 가까운 자연 발생 상동체)를 자연적으로 발현하는 세포 및/또는 유기체의 유형).
본원에서 사용되는 용오 "식물"은 전체 식물, 접목된 식물, 식물의 조상 및 자손, 및 씨앗, 새싹, 줄기, 뿌리(덩이줄기 포함), 대목, 접순, 식물 세포, 조직 및 기관을 포함한 식물 부분을 포함한다. 식물은 현탁 배양물, 배아, 분열부, 캘러스 조직, 잎, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 미세 포자를 포함하는 임의의 형태일 수 있다. 본 발명의 방법에 특히 유용한 식물은 녹색식물 (Viridiplantae) 계통에 속하는 모든 식물, 특히 사료 또는 마초 콩과 식물, 관상용 식물, 식량 작물, 교목 또는 관목을 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다 (예: 아카시아 (Acacia spp.), 에이서 (Acer spp.),　악티니디아 (Actinidia spp.), 에스큘러스 (Aesculus spp.), 아가시스 아우스트랄리스 (Agathis australis), 알비지아 아마라 (Albizia amara), 알소필라 트리컬러 (Alsophila tricolor), 안드로포곤 (Andropogon spp.), 아라키스 (Arachis spp.), 아레카 카태추 (Areca catechu), 아스텔리아 프라그란스 (Astelia fragrans), 아스트라갈루스 시세르 (Astragalus cicer), 바이키에아 플러리주가 (Baikiaea plurijuga), 베툴라 (Betula spp.), 브라시카 (Brassica spp.), 브루귀에라 김노리자 (Bruguiera gymnorrhiza), 버케아 아프리카나 (Burkea africana), 부테아 프론도사 (Butea frondosa), 카다바 파리노사 (Cadaba farinose), 칼리안드라 (Calliandra spp.), 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis), 칸나바케아이 (Cannabaceae), 칸나 인디카 (Canna indica), 칸나비스 (Cannabis), 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa), 대마 (Hemp), 산업용 대마 (industrial Hemp), 캡시쿰 (Capsicum spp.), 카시아 (Cassia spp.), 센트로에마 퍼베센스 (Centroema pubescens), 차코멜레스 (Chacoomeles spp.), 신나모멈 카시아 (Cinnamomum cassia), 코페아 아라비카 (Coffea Arabica), 콜로포스페르멈 모판 (Colophospermum mopane), 코로닐리아 바리아 (Coronillia varia), 코토네아스테르 세로티나 (Cotoneaster serotina), 크라테구스 (Crataegus spp.), 커쿠미스 (Cucumis spp.), 커프레수스 (Cupressus spp.), 시아테아 딜바타 (Cyathea dealbata), 키도니아 오브롱가 (Cydonia oblonga), 크립토메리아 자포니카 (Cryptomeria japonica), 심보포곤 (Cymbopogon spp.), 신테아 딜바타 (Cynthea dealbata), 키도니아 오브롱가 (Cydonia oblonga), 달베르기아 모네타리아 (Dalbergia monetaria), 다발리아 디바리카타 (Davallia divaricata), 데스모디움 (Desmodium spp.), 딕소니아 스쿠아로사 (Dicksonia squarosa), 디베테로포곤 암플렉텐스 (Dibheteropogon amplectens), 디오크레아 (Dioclea spp.), 돌리코스 (Dolichos spp.), 도리크니움 렉툼 (Dorycnium rectum), 에키노클로아 피라미달리스 (Echinochloa pyramidalis), 에라피아 (Ehraffia spp.), 엘레우신 코라카나 (Eleusine coracana), 엘라그레스티스 (Eragrestis spp.), 에리트리나 (Erythrina spp.), 유카립투스 (Eucalyptus spp.), 유크레아 심페리 (Euclea schimperi), 유랄리아 빌로사 (Eulalia villosa), 파고피룸 (Pagopyrum spp.), 페이요아 셀로위아나 (Feijoa sellowiana), 프라가리아 (Fragaria spp.), 프레밍기아 (Flemingia spp.), 프레이시네티아 방크시 (Freycinetia banksii), 제라니움 툰베르기 (Geranium thunbergii), 징코 빌로바 (Ginkgo biloba), 글라이신 자바니카 (Glycine javanica), 글리리시디아 (Gliricidia spp.), 고시피움 히르수툼 (Gossypium hirsutum), 그레빌레아 (Grevillea spp.), 귀볼티아 콜레오스페르마 (Guibourtia coleosperma), 헤디사룸 (Hedysarum spp.), 헤마르트리아 알티시마 (Hemarthria altissima), 헤테로포곤 콘토르투스 (Heteropogon contortus), 홀데움 불가레 (Hordeum vulgare), 하이파레니아 루파 (Hyparrhenia rufa), 하이페리쿰 이렉툼 (Hypericum erectum), 하이퍼텔리아 디솔루타 (Hyperthelia dissoluta), 인디고 인카르나타 (Indigo incarnata), 아이리스 (Iris spp.), 렙타레나 피폴리폴리아 (Leptarrhena pyrolifolia), 레스페데자 (Lespedeza spp.), 레투카 (Lettuca spp.), 레우카에나 레우코케팔라 (Leucaena leucocephala), 로우데티아 심플렉스 (Loudetia simplex), 로토누스 베네시 (Lotonus bainesii), 로투스 (Lotus spp.), 마크로틸로마 액실레르 (Macrotyloma axillare), 말루스 (Malus spp.), 마니호트 에스쿨렌타 (Manihot esculenta), 메디카고 사티바 (Medicago saliva), 메타세콰이아 글립토스트로보이데스 (Metasequoia glyptostroboides), 무사 사피엔툼 (Musa sapientum), 니코티아눔 (Nicotianum spp.), 오노브리키스 (Onobrychis spp.), 오르니토푸스 (Ornithopus spp.), 오리자 (Oryza spp.), 펠토포룸 아프리카눔 (Peltophorum africanum), 페니세툼 (Pennisetum spp.), 페르세아 그라티시마 (Persea gratissima), 페튜니아 (Petunia spp.), 파세올루스 (Phaseolus spp.), 피닉스 카나리엔시스 (Phoenix canariensis), 포르미움 쿠키아눔 (Phormium cookianum), 포티니아 (Photinia spp.), 피케아 글라우카 (Picea glauca), 피누스 (Pinus spp.), 피숨 사티붐 (Pisum sativam), 포도칼푸스 토타라 (Podocarpus totara), 포고나트리아 프렉키 (Pogonarthria fleckii), 포고나트리아 스쿠아로사 (Pogonarthria squarrosa), 포푸러스 (Populus spp.), 프로소피스 시네라리아 (Prosopis cineraria), 슈도수가 멘지에시 (Pseudotsuga menziesii), 프테롤로비움 스텔라툼 (Pterolobium stellatum), 피루스 코무니스 (Pyrus communis), 케르쿠스 (Quercus spp.), 라피오렙시스 움벨라타 (Rhaphiolepsis umbellata), 로파로스틸리스 사피다 (Rhopalostylis sapida), 루스 나타렌시스 (Rhus natalensis), 리베스 그로술라리아 (Ribes grossularia), 리베스 (Ribes spp.), 로비니아 슈도아카시아 (Robinia pseudoacacia), 로사 (Rosa spp.), 루부스 (Rubus spp.), 살릭스 (Salix spp.), 스키자키리움 상귀네움 (Schyzachyrium sanguineum), 스키아도피티스 버티실라타 (Sciadopitys verticillata), 세콰이아 셈페르비렌스 (Sequoia sempervirens), 세콰이아덴드론 기간테움 (Sequoiadendron giganteum), 소르굼 바이칼라 (Sorghum bicolor), 스피나시아 (Spinacia spp.), 스포로볼루스 핌브리아투스 (Sporobolus fimbriatus), 스티불루스 알로페투로이데스 (Stiburus alopecuroides), 스틸로산토스 후밀리스 (Stylosanthos humilis), 타데하기 (Tadehagi spp.), 탁소디움 디스티쿰 (Taxodium distichum), 테메다 트리안드라 (Themeda triandra), 트리폴리움 (Trifolium spp.), 트리티쿰 (Triticum spp.), 투가 헤테로필라 (Tsuga heterophylla), 박시니움 (Vaccinium spp.), 비시아 (Vicia spp.), 비티스 비니페라 (Vitis vinifera), 와트소니아 피라미다타 (Watsonia pyramidata), 잔테데스키아 애티오피카 (Zantedeschia aethiopica), 지아 메이스 (Zea mays), 아마란스 (amaranth), 아티초크 (artichoke), 아스파라거스, 브로콜리, 싹양배추 (Brussels sprouts), 양배추, 캐놀라, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 콜라드 그린 (collard greens), 아마 (flax), 케일, 렌즈콩, 유채, 오크라, 양파, 감자, 벼, 대두, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 토마토, 호박, 차, 및/또는 나무). 대안적으로, 조류 (algae) 및 기타 비-녹색식물이 본 발명의 일부 구현예의 방법에 사용될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 일부 구현예의 폴리펩타이드는 펩타이드 합성 분야의 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 고체상 펩타이드 합성의 경우, 많은 기술에 대한 요약은 J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 및 J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1973에서 찾을 수 있다. 고전적인 용액 합성에 대해서는 G. Schroder and K. Lupke, The Peptides, vol. 1, Academic Press (New York), 1965를 참고할 수 있다.
일반적으로, 이러한 방법은 하나 이상의 아미노산 또는 적절하게 보호된 아미노산을 성장하는 폴리펩타이드 사슬에 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다. 보통, 첫 번째 아미노산의 아미노 또는 카복실기는 적절한 보호기로 보호된다. 그런 다음 보호되거나 유도체화된 아미노산은 불활성 고체 지지체에 부착되거나 아미드 연결을 형성하기에 적합한 조건 하에서, 적합하게 보호된 상보적(아미노 또는 카복실) 기를 가지는 서열의 다음 아미노산을 첨가함으로써 용액에서 이용될 수 있다. 이어서 새로 추가된 아미노산 잔기에서 보호기를 제거하고 다음 아미노산(적절하게 보호됨)을 추가하는 등의 작업을 수행한다. 원하는 모든 아미노산이 적절한 순서로 연결된 후, 나머지 보호기(및 모든 고체 지지체)는 순차적으로 또는 동시에 제거하여, 최종 폴리펩타이드 화합물을 얻는다. 이 일반 절차를 간단하게 변형하면, 예를 들어, 보호된 트리펩타이드를 적절히 보호된 디펩타이드와 결합시키고 (키랄 중심을 라세미화하지 않는 조건에서) 탈보호 후 펜타펩타이드 등을 형성함으로써 성장하는 사슬에 한 번에 하나 이상의 아미노산을 첨가할 수 있다. 펩타이드 합성에 대한 추가 설명은 미국 특허 제6,472,505호에 개시되어 있다.
대규모 폴리펩타이드 합성은 Andersson et al. [Biopolymers 2000; 55:227-250]에 기술되어 있다.
본원에서, 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합 또는 이의 유사체(본원에서 하기 기재된 바와 같이)에 의해 연결된 적어도 10개의 아미노산 잔기(바람직하게는 적어도 50개의 아미노산 잔기)를 포함하는 중합체를 의미하며, 선택적으로 펩타이드 결합 자체에 의해서만 연결되는 중합체를 의미한다. 용어 "폴리펩타이드"는 천연 단백질, 천연 단백질의 단편 및 천연 단백질의 상동체(homologs) 및/또는 이의 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 천연 폴리펩타이드(예, 분해 산물, 화학적으로 합성된 펩타이드 및/또는 재조합 폴리펩타이드)를 포함하며; 뿐만 아니라 펩티도미메틱(peptidomimetic)(일반적으로, 화학적으로 합성된 폴리펩타이드) 및 폴리펩타이드 유사체인 펩토이드(peptoid) 및 세미펩토이드(semipeptoid)를 포함하며, 이는 예를 들어, 체내에서 더 안정적으로 만들거나 세포 내로 더 잘 침투할 수 있는 폴리펩타이드를 만드는 변형 (예: 본원에 명시적으로 설명된 가교에 의한 변형 이외의 변형)을 가질 수 있다. 이러한 변형은 N-말단 변형, C-말단 변형, 펩타이드 결합 변형, 백본 변형 및 잔기 변형을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 펩티도미메틱 화합물을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press(1992)에 명시되어 있으며, 본원에서 완전히 설명된 것처럼 참조로 포함된다. 이와 관련하여 더 자세한 내용은 하기에 제공된다.
펩타이드 내의 펩타이드 결합(-CO-NH-)은, 예를 들어, N-메틸화 아미드 결합(-N(CH3)-CO-), 에스테르 결합(-C(=O)-O-), 케토메틸렌 결합(-CO-CH2-), 설피닐메틸렌 결합(-S(=O)-CH2-), α-아자 결합(-NH-N(R)-CO-) (여기서 R은 임의의 알킬(예: 메틸)이다), 아민 결합(-CH2-NH-), 설파이드 결합(-CH2-S-), 에틸렌 결합(-CH2-CH2-), 하이드록시에틸렌 결합(-CH(OH)-CH2-), 티오아미드 결합(-CS-NH-), 올레핀 이중 결합(-CH=CH-), 플루오르화 올레핀 이중 결합(-CF=CH-), 레트로 아미드 결합(-NH-CO-), 펩타이드 유도체(-N(R)-CH2-CO-) (여기서 R은 탄소 원자에 자연적으로 존재하는 "정상" 측쇄이다) 에 의해 치환될 수 있다.
이러한 변형은 폴리펩타이드 사슬을 따라 있는 모든 결합에서 발생할 수 있으며 심지어 동시에 여러(예: 2-3) 결합에서도 발생할 수 있다.
천연 방향족 아미노산인 Trp, Tyr 및 Phe는 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid, Tic), 나프틸알라닌(naphthylalanine), Phe의 고리-메틸화 유도체, Phe 또는 O-메틸-Tyr의 할로겐화 유도체와 같은 비-천연 방향족 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 펩타이드는 또한 하나 이상의 변형된 아미노산 또는 하나 이상의 비-아미노산 단량체(예: 지방산, 복합 탄수화물 등)를 포함할 수 있다.
용어 "아미노산" 또는 "아미노산들"은 20개의 자연 발생 아미노산을 포함하고; 예를 들어, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 포스포티로신(phosphotyrosine), 포스포세린(phosphoserine) 및 포스포트레오닌(phosphothreonine)을 포함하는 이들 아미노산은 종종 생체 내 번역 후 변형에 의해 형성되며; 및 2-아미노아디프산(2-aminoadipic acid), 하이드록시라이신(hydroxylysine), 이소데스모신(isodesmosine), 노르-발린(nor-valine), 노르-류신(nor-leucine) 및 오르니틴(ornithine)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 기타 특이 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 용어 "아미노산"은 D- 및 L-아미노산을 모두 포함한다.
하기 표 1 및 2는 본 발명의 일부 구현예와 함께 사용될 수 있는 천연 아미노산 (표 1), 및 비-관습적 또는 변형된 아미노산(예: 합성, 표 2)을 나열한다.
아미노산 세 글자 약어 한 글자 기호
알라닌(Alanine) Ala A
아르기닌(Arginine) Arg R
아스파라긴(Asparagine) Asn N
아스파라긴산(Aspartic acid) Asp D
시스테인(Cysteine) Cys C
글루타민(Glutamine) Gln Q
글루탐산(Glutamic Acid) Glu E
슬리신(Glycine) Gly G
히스티딘(Histidine) His H
이소류신(Isoleucine) Ile I
류신(Leucine) Leu L
라이신(Lysine) Lys K
메티오닌(Methionine) Met M
페닐알라닌(Phenylalanine) Phe F
프롤린(Proline) Pro P
세린(Serine) Ser S
트레오닌(Threonine) Thr T
트립토판(Tryptophan) Trp W
티로신(Tyrosine) Tyr Y
발린(Valine) Val V
상기와 같은 임의의 아미노산 Xaa X
비-통상적 아미노산 코드 비-통상적 아미노산 코드
오르니틴(ornithine) Orn 히드록시프롤린(hydroxyproline) Hyp
α-아미노부티르산(α-aminobutyric acid) Abu 아미노노보닐-카르복실레이트(aminonorbornyl-carboxylate) Norb
D-알라닌(D-alanine) Dala 아미노시클로프로판-카르복실레이트(aminocyclopropane-carboxylate) Cpro
D-아르기닌(D-arginine) Darg N-(3-구아니디노프로필)글리신(N-(3-guanidinopropyl)glycine) Narg
D-아스파라긴(D-asparagine) Dasn N-(카르바밀메틸)글리신(N-(carbamylmethyl)glycine) Nasn
D-아스파르트산(D-aspartic acid) Dasp N-(카르복시메틸)글리신(N-(carboxymethyl)glycine) Nasp
D-시스테인(D-cysteine) Dcys N-(티오메틸)글리신N-(thiomethyl)glycine) Ncys
D-글루타민(D-glutamine) Dgln N-(2-카르바밀에틸)글리신(N-(2-carbamylethyl)glycine) Ngln
D-글루탐산(D-glutamic acid) Dglu N-(2-카르복시에틸)글리신(N-(2-carboxyethyl)glycine) Nglu
D-히스티딘(D-histidine) Dhis N-(이미다졸릴에틸)글리신(N-(imidazolylethyl)glycine) Nhis
D-이소류신(D-isoleucine) Dile N-(1-메틸프로필)글리신(N-(1-methylpropyl)glycine) Nile
D-류신(D-leucine) Dleu N-(2-메틸프로필)글리신(N-(2-methylpropyl)glycine) Nleu
D-라이신(D-lysine) Dlys N-(4-아미노부틸)글리신(N-(4-aminobutyl)glycine) Nlys
D-메티오닌(D-methionine) Dmet N-(2-메틸티오에틸)글리신(N-(2-methylthioethyl)glycine) Nmet
D-오르니틴(D-ornithine) Dorn N-(3-아미노프로필)글리신(N-(3-aminopropyl)glycine) Norn
D-페닐알라닌(D-phenylalanine) Dphe N-벤질글리신(N-benzylglycine) Nphe
D-프롤린(D-proline) Dpro N-(히드록시메틸)글리신(N-(hydroxymethyl)glycine) Nser
D-세린(D-serine) Dser N-(1-히드록시에틸)글리신(N-(1-hydroxyethyl)glycine) Nthr
D-트레오닌(D-threonine) Dthr N-(3-인돌릴에틸)글리신(N-(3-indolylethyl) glycine) Nhtrp
D-트립토판(D-tryptophan) Dtrp N-(p-히드록시페닐)글리신(N-(p-hydroxyphenyl)glycine) Ntyr
D-티로신(D-tyrosine) Dtyr N-(1-메틸에틸)글리신(N-(1-methylethyl)glycine) Nval
D-발린(D-valine) Dval N-메틸글리신(N-methylglycine) Nmgly
D-N-메틸알라닌(D-N-methylalanine) Dnmala L-N-메틸알라닌(L-N-methylalanine) Nmala
D-N-메틸아르기닌(D-N-methylarginine) Dnmarg L-N-메틸아르기닌(L-N-methylarginine) Nmarg
D-N-메틸아스파라긴(D-N-methylasparagine) Dnmasn L-N-메틸아스파라긴(L-N-methylasparagine) Nmasn
D-N-메틸아스파라테이트(D-N-methylasparatate) Dnmasp L-N-메틸아스파르트산(L-N-methylaspartic acid) Nmasp
D-N-메틸시스테인(D-N-methylcysteine) Dnmcys L-N-메틸시스테인(L-N-methylcysteine) Nmcys
D-N-메틸글루타민(D-N-methylglutamine) Dnmgln L-N-메틸글루타민(L-N-methylglutamine) Nmgln
D-N-메틸글루타메이트(D-N-methylglutamate) Dnmglu L-N-메틸글루탐산(L-N-methylglutamic acid) Nmglu
D-N-메틸히스티딘(D-N-methylhistidine) Dnmhis L-N-메틸히스티딘(L-N-methylhistidine) Nmhis
D-N-메틸이소류신(D-N-methylisoleucine) Dnmile L-N-메틸이소류신(L-N-methylisolleucine) Nmile
D-N-메틸류신(D-N-methylleucine) Dnmleu L-N-메틸류신(L-N-methylleucine) Nmleu
D-N-메틸라이신(D-N-methyllysine) Dnmlys L-N-메틸라이신(L-N-methyllysine) Nmlys
D-N-메틸메티오닌(D-N-methylmethionine) Dnmmet L-N-메틸메티오닌(L-N-methylmethionine) Nmmet
D-N-메틸오르니틴(D-N-methylornithine) Dnmorn L-N-메틸오르니틴(L-N-methylornithine) Nmorn
D-N-메틸페닐알라닌(D-N-methylphenylalanine) Dnmphe L-N-메틸페닐알라닌(L-N-methylphenylalanine) Nmphe
D-N-메틸프롤린(D-N-methylproline) Dnmpro L-N-메틸프롤린(L-N-methylproline) Nmpro
D-N-메틸세린(D-N-methylserine) Dnmser L-N-메틸세린(L-N-methylserine) Nmser
D-N-메틸트레오닌(D-N-methylthreonine) Dnmthr L-N-메틸트레오닌(L-N-methylthreonine) Nmthr
D-N-메틸트립토판(D-N-methyltryptophan) Dnmtrp L-N-메틸트립토판(L-N-methyltryptophan) Nmtrp
D-N-메틸티로신(D-N-methyltyrosine) Dnmtyr L-N-메틸티로신(L-N-methyltyrosine) Nmtyr
D-N-메틸발린(D-N-methylvaline) Dnmval L-N-메틸발린(L-N-methylvaline) Nmval
L-노르류신(L-norleucine) Nle L-N-메틸노르류신(L-N-methylnorleucine) Nmnle
L-노르발린(L-norvaline) Nva L-N-메틸노르발린(L-N-methylnorvaline) Nmnva
L-에틸글리신(L-ethylglycine) Etg L-N-메틸-에틸글리신(L-N-methyl-ethylglycine) Nmetg
L-t-부틸글리신(L-t-butylglycine) Tbug L-N-메틸-t-부틸글리신(L-N-methyl-t-butylglycine) Nmtbug
L-호모페닐알라닌(L-homophenylalanine) Hphe L-N-메틸-호모페닐알라닌(L-N-methyl-homophenylalanine) Nmhphe
α-나프틸알라닌(α-naphthylalanine) Anap N-메틸-α-나프틸알라닌(N-methyL-α-naphthylalanine) Nmanap
페니실라민(penicillamine) Pen N-메틸페니실라민(N-methylpenicillamine) Nmpen
γ-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) Gabu N-메틸-γ-아미노부티레이트(N-methyl-γ-aminobutyrate) Nmgabu
사이클로헥실알라닌(cyclohexylalanine) Chexa N-메틸-시클로헥실알라닌(N-methyl-cyclohexylalanine) Nmchexa
사이클로펜틸알라닌(cyclopentylalanine) Cpen N-메틸-시클로펜틸알라닌(N-methyl-cyclopentylalanine) Nmcpen
α-아미노-α-메틸부티레이트(α-amino-α-methylbutyrate) Aabu N-메틸-α-아미노-α-메틸부티레이트(N-methyL-α-amino-α-methylbutyrate) Nmaabu
α-아미노이소부티르산(α-aminoisobutyric acid) Aib N-메틸-a-아미노이소부티레이트(N-methyL-α-aminoisobutyrate) Nmaib
D-α-메틸아르기닌(D-α-methylarginine) Dmarg L-α-메틸아르기닌(L-α-methylarginine) Marg
D-α-메틸아스파라긴(D-α-methylasparagine) Dmasn L-α-메틸아스파라긴(L-α-methylasparagine) Masn
D-α-메틸아스파르테이트(D-α-methylaspartate) Dmasp L-α-메틸아스파르테이트(L-α-methylaspartate) Masp
D-α-메틸시스테인(D-α-methylcysteine) Dmcys L-α-메틸시스테인(L-α-methylcysteine) Mcys
D-α-메틸글루타민(D-α-methylglutamine) Dmgln L-α-메틸글루타민(L-α-methylglutamine) Mgln
D-α-메틸글루탐산(D-α-methyl glutamic acid) Dmglu L-α-메틸글루타메이트(L-α-methylglutamate) Mglu
D-α-메틸히스티딘(D-α-methylhistidine) Dmhis L-α-메틸히스티딘(L-α-methylhistidine) Mhis
D-α-메틸이소류신(D-α-methylisoleucine) Dmile L-α-메틸이소류신(L-α-methylisoleucine) Mile
D-α-메틸류신(D-α-methylleucine) Dmleu L-α-메틸류신(L-α-methylleucine) Mleu
D-α-메틸라이신(D-α-methyllysine) Dmlys L-α-메틸라이신(L-α-methyllysine) Mlys
D-α-메틸메티오닌(D-α-methylmethionine) Dmmet L-α-메틸메티오닌(L-α-methylmethionine) Mmet
D-α-메틸오르니틴(D-α-methylornithine) Dmorn L-α-메틸오르니틴(L-α-methylornithine) Morn
D-α-메틸페닐알라닌(D-α-methylphenylalanine) Dmphe L-α-메틸페닐알라닌(L-α-methylphenylalanine) Mphe
D-α-메틸프롤린(D-α-methylproline) Dmpro L-α-메틸프롤린(L-α-methylproline) Mpro
D-α-메틸세린(D-α-methylserine) Dmser L-α-메틸세린(L-α-methylserine) Mser
D-α-메틸트레오닌(D-α-methylthreonine) Dmthr L-α-메틸트레오닌(L-α-methylthreonine) Mthr
D-α-메틸트립토판(D-α-methyltryptophan) Dmtrp L-α-메틸트립토판(L-α-methyltryptophan) Mtrp
D-α-메틸티로신(D-α-methyltyrosine) Dmtyr L-α-메틸티로신(L-α-methyltyrosine) Mtyr
D-α-메틸발린(D-α-methylvaline) Dmval L-α-메틸발린(L-α-methylvaline) Mval
N-시클로부틸글리신(N-cyclobutylglycine) Ncbut L-α-메틸노르발린(L-α-methylnorvaline) Mnva
N-시클로헵틸글리신(N-cycloheptylglycine) Nchep L-α-메틸에틸글리신(L-α-methylethylglycine) Metg
N-시클로헥실글리신(N-cyclohexylglycine) Nchex L-α-메틸-t-부틸글리신(L-α-methyl-t-butylglycine) Mtbug
N-시클로데실글리신(N-cyclodecylglycine) Ncdec L-α-메틸-호모페닐알라닌(L-α-methyl-homophenylalanine) Mhphe
N-시클로도데실글리신(N-cyclododecylglycine) Ncdod α-메틸-α-나프틸알라닌(α-methyl-α-naphthylalanine) Manap
N-시클로옥틸글리신(N-cyclooctylglycine) Ncoct α-메틸페니실라민(α-methylpenicillamine) Mpen
N-시클로프로필글리신(N-cyclopropylglycine) Ncpro α-메틸-γ-아미노부티레이트(α-methyl-γ-aminobutyrate) Mgabu
N-시클로운데실글리신(N-cycloundecylglycine) Ncund α-메틸-시클로헥실알라닌(α-methyl-cyclohexylalanine) Mchexa
N-(2-아미노에틸)글리신(N-(2-aminoethyl)glycine) Naeg α-메틸-시클로펜틸알라닌(α-methyl-cyclopentylalanine) Mcpen
N-(2,2-디페닐에틸)글리신(N-(2,2-diphenylethyl)glycine) Nbhm N-(N-(2,2-디페닐에틸)카르바밀메틸-글리신(N-(N-(2,2-diphenylethyl)carbamylmethyl-glycine) Nnbhm
N-(3,3-디페닐프로필)글리신(N-(3,3-diphenylpropyl)glycine) Nbhe N-(N-(3,3-디페닐프로필)카르바밀메틸-글리신(N-(N-(3,3-diphenylpropyl)carbamylmethyl-glycine) Nnbhe
1-카르복시-1-(2,2-디페닐에틸아미노)시클로프로판(1-carboxy-1-(2,2-diphenyl ethylamino)cyclopropane) Nmbc 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid) Tic
포스포세린(phosphoserine) pSer 포스포트레오닌(phosphothreonine) pThr
포스포티로신(phosphotyrosine) pTyr O-메틸-티로신(O-methyl-tyrosine)
2-아미노아디프산(2-aminoadipic acid) 하이드록시라이신(hydroxylysine)
변형된 유리카제의 제조:
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 변형된 유리카제 및/또는 이의 성분(예: 유리카제 폴리펩타이드 및/또는 연결 모이어티)과 관련하여 본원에 기재된 구현예 중 임의의 것에 따라 변형된 유리카제를 제조하는 방법이 제공된다. 공정은 다음을 포함한다:
(a) 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 가교제와 (본원에 기재된 임의의 구현예에 따른) 유리카제 폴리펩타이드를 접촉시키고, 상기 가교제는 적어도 2개의 알데하이드(-C(=O)H) 기를 포함하여, 폴리펩타이드와 가교제의 접합체를 얻는 단계; 및
(b) 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계.
본원에 기재된 각 구현예 중 일부에서, 가교제는 2개 이하의 알데하이드(-C(=O)H) 기를 포함한다.
본원에 기재된 각 구현예 중 일부에서, 가교제는 하기 화학식 II를 갖는다:
HC(=O)-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-C(=O)H
화학식 II
여기서 L1 및 L2는 탄화수소 모이어티이고; m은 2 내지 10 범위의 정수이며, n은 2 내지 1000 범위의 정수이다(예: 여기서 L1, L2, m 및/또는 n은 화학식 I과 관련하여 본원에 기재된 각각의 구현예 중 어느 하나에 따라 정의된 바와 같다). 화학식 II의 작용제는, 예를 들어, 알데하이드기와 아민기의 반응(예: 이민(imine) 또는 헤미아미날(hemiaminal) 중간체를 형성하기 위해), 및 아민기를 형성하기 위한 환원 시, 선택적으로 화학식 I에 따른 연결 모이어티를 얻기 위해 사용될 수 있다(본원에 기재된 각각의 구현예 중 어느 하나에 따름).
대안적으로, 가교제는 선택적으로 둘 이상의(예: 3, 4 또는 그 이상) 알데하이드기를 포함할 수 있다. 이러한 가교제는 선택적으로, 예를 들어, 전술한 두 알데하이드기의 반응시 세번째 알데하이드기의 부근에 미반응 아민기가 남아 있지 않은, 단지 두 개의 알데하이드기와 폴리펩타이드의 반응에 의해 (본원에 기재된 각 구현예 중 임의의 것에 따라) 이작용성 연결 모이어티를 얻을 수 있다.
도 1은 본원에 기재된 각 구현예 중 어느 하나에 따른 방법을 개략적으로 도시한다.
적절한 환원제의 예시는 보란(borane) 및 이의 착물(예: 피콜린 보란 착물(picoline borane complex)), 보로하이드라이드(borohydride)(예를 들어, 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride)를 포함하는 보로하이드라이드 염), 트리아세톡시보로하이드라이드(triacetoxyborohydride)(예를 들어, 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride)를 포함하는 트리아세톡시보로하이드라이드 염), 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)(예를 들어, 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride) 를 포함하는 시아노보로하이드라이드 염), 및 환원성 아민화 공정에 적합하다고 당업계에 공지된 임의의 다른 환원제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 환원제는 2-피콜린 보란 착물 및 소듐 시아노보로하이드라이드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
유리카제 폴리펩타이드, 가교제 및 환원제는 선택적으로 임의의 순서로 조합될 수 있다. 예를 들어, 가교제는 선택적으로 폴리펩타이드 및 환원제를 포함하는 혼합물에 첨가되거나, 폴리펩타이드는 선택적으로 가교제 및 환원제를 포함하는 혼합물에 선택적으로 첨가될 수 있다(예: 폴리펩타이드 및 가교제의 접합체가 접합체 형성 시 이미 환원제와 접촉하고 있음). 일부 구현예에서, 유리카제 폴리펩타이드, 가교제, 및 환원제는 본질적으로 동시에(예: "원-포트 반응(one-pot reaction)"으로서) 조합된다.
본원에 기재된 각 구현예 중 일부에서, 가교제와 접촉할 때, 유리카제 폴리펩타이드는 다량체 형태(하나 이상의 유리카제 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 형태)로 존재한다. 이러한 다량체 형태는 예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 육량체, 팔량체, 또는 더 큰 다량체 형태일 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 다량체 형태는 자연적으로 발생하는 형태의 유리카제 폴리펩타이드, 예를 들어, 많은 유리카제 폴리펩타이드의 사량체이다. 임의의 각각의 구현예에서, 가교제와 다량체 형태의 유리카제 폴리펩타이드를 접촉시키는 것은 분자간 가교를 생성하는 효율적인 기술로서 작용할 수 있으며, 여기서 상이한 폴리펩타이드 사슬에 부착된 하나 이상의 가교 모이어티가 생성된다(예: 본원에 기재된 각각의 구현예 중 임의의 것에 따라).
본원에 기재된 각 구현예 중 일부에서, 가교제와 접촉된 유리카제 폴리펩타이드(본원에 기재된 각 실시예 중 어느 하나에 따른)에 대한 가교제(본원에 기재된 각 실시예 중 어느 하나에 따른)의 몰비는 적어도 100:1이다. 이러한 일부 구현예에서, 몰비는 100:1 내지 10,000:1이다. 이러한 일부 구현예에서, 몰비는 100:1 내지 5,000:1이다. 일부 구현예에서, 몰비는 100:1 내지 2,000:1이다. 일부 구현예에서, 몰 비는 100:1 내지 1,000:1이다.
본원에 기재된 각 구현예 중 일부에서, 가교제와 접촉된 유리카제 폴리펩타이드(본원에 기재된 각 실시예 중 어느 하나에 따른)에 대한 가교제(본원에 기재된 각 실시예 중 어느 하나에 따른)의 몰비는 적어도 200:1이다. 이러한 일부 구현예에서, 몰비는 200:1 내지 10,000:1이다. 이러한 일부 구현예에서, 몰비는 200:1 내지 5,000:1이다. 일부 구현예에서, 몰비는 200:1 내지 2,000:1이다. 일부 구현예에서, 몰 비는 200:1 내지 1,000:1이다. 예시적인 비율은 200:1 및 1,000:1을 포함한다.
본원에 기재된 각 구현예 중 일부에서, 가교제와 접촉된 유리카제 폴리펩타이드(본원에 기재된 각 실시예 중 어느 하나에 따른)에 대한 가교제(본원에 기재된 각 실시예 중 어느 하나에 따른)의 몰비는 적어도 500:1이다. 이러한 일부 구현예에서, 몰비는 500:1 내지 10,000:1이다. 이러한 일부 구현예에서, 몰비는 500:1 내지 5,000:1이다. 일부 구현예에서, 몰비는 500:1 내지 2,000:1이다.
본원에 기재된 각 구현예 중 일부에서, 가교제와 접촉된 유리카제 폴리펩타이드(본원에 기재된 각 실시예 중 어느 하나에 따른)에 대한 가교제(본원에 기재된 각 실시예 중 어느 하나에 따른)의 몰비는 적어도 1000:1이다. 이러한 일부 구현예에서, 몰비는 1000:1 내지 10,000:1이다. 이러한 일부 구현예에서, 몰비는 1000:1 내지 5,000:1이다.
가교제의 분자량은 가교 모이오티 분자량과 관련하여 본 명세서에 기술된 실시예 중 임의의 실시예에 따른 분자량을 갖는 가교 모이오티를 초래하도록 선택적으로 선택될 수 있다. 주어진 가교제의 분자량과 본 명세서에 기술된 공정에서 상기 가교제로부터 생성된 가교 모이오티어 사이의 관계는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 화학식 II의 작용제는 일반적으로 화학식 I의 모이오티에 비해 30 Da 더 큰 분자량(예를 들어, 본질적으로 1 kDa 이상의 분자량에 대한 반올림 오차)을 가질 것이다(여기서 변수 L, L2, m 및 n은 동일한 방식으로 정의된다).
본 발명의 일부 실시예의 양상에 따르면, 본원에 기재된 공정에 따라 얻을 수 있는 개량된 유리카제가 제공되며, 각 실시예 중 임의의 실시예가 제공된다.
가교제의 분자량은 임의로 선택되어 가교 모이어티 분자량과 관련하여 본원에 기재된 구현예 중 어느 하나에 따른 분자량을 갖는 가교 모이어티를 생성할 수 있다. 주어진 가교제의 분자량과 본원에 기재된 방법에서 작용제로부터 생성된 가교 모이어티 사이의 관계는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 화학식 II의 작용제는 전형적으로 화학식 I의 모이어티보다 30 Da 더 큰(예: 본질적으로 1 kDa 이상의 분자량에 대한 반올림 오차) 분자량을 가질 것이다(여기서 변수 L, L2, m 및 n은 동일한 방식으로 정의된다).
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 각각의 구현예 중 어느 하나에서, 본원에 기재된 방법에 따라 얻을 수 있는 변형된 유리카제가 제공된다.
제형 및 적응증:
본원에 기재된 임의의 각각의 구현예에 따른 변형된 유리카제는 선택적으로 유리카제 활성이 유리한 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것 및/또는 과도한 요산 수준과 관련된 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다 .
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 유리카제 활성이 유익한 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 각각의 구현예 중 임의의 것에 따른 변형된 유리카제의 용도가 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 과도한 요산 수준과 관련된 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 있어서 본원에 기재된 각각의 구현예 중 임의의 것에 따른 변형된 유리카제의 용도가 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 유리카제 활성이 유리한 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 기재된 각 임의의 구현예에 따른 변형된 유리카제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 과도한 요산 수준과 관련된 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 기재된 각 임의의 구현예에 따른 변형된 유리카제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에 따라(본원에 기재된 임의의 측면에 따라) 치료 가능한 상태의 예는 통풍, 당뇨병, 신장 결석, 종양 용해 증후군, 출혈성 쇼크, 말라리아, 알레르기성 염증, 신장 기능 장애, 인플루엔자 및 COVID-19와 같은 바이러스성 감염(예: 과도한 요산 수준이 파비피라비르(favipiravir)와 같은 항바이러스 약물과 연관된 경우), 급성 위장염, 태반 염증, 무균 염증 및 요산과 관련된 기타 임신 합병증(예: 유산, 자간전증(pre-eclampsia) 및 조산), 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 위장관 감염 및 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기재된 구현예 중 일부에서, 상기 치료는 통풍, 신장 결석, 태반 염증, 무균 염증, 임신 합병증, 레쉬-니한 증후군 및/또는 종양 용해 증후군을 치료하는데 있어서 체내 고체(예: 결정질) 요산의 용해를 향상시킨다.
본원서 기재된 구현예 중 일부에서, 상기 치료는 요산의 염증 효과를 감소시키며, 이는 선택적으로 예를 들어 통풍, 말라리아, 알레르기성 염증, 바이러스성 감염(예: COVID-19), 급성 위장염, 태반 염증, 무균 염증, 임신 합병증, 다발성 경화증 및 염증성 장 질환과 같은 염증 상태의 치료에 유리할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 배지 중의 요산 수준을 감소시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 배지와 본원에 기재된 각 구현예 중 어느 하나에 따른 변형된 유리카제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 배지는 선택적으로 생체 내 또는 생체 외의 생리학적 배지(예: 조직) 또는 비-생리학적 배지일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 배지는 이를 필요로 하는 대상체(인간 또는 비인간)의 조직이며, 상기 방법은 대상체에게 변형된 유리카제를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 대상체는 선택적으로 본원에 기재된 각 구현예 중 어느 하나에 따른 질병 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 앓을 위험에 처해 있을 수 있다.
본원에 기재된 각각의 구현예 중 어느 하나에 따른 변형된 유리카제는 선택적으로 그 자체로, 또는 대안적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물의 일부로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "약학적 조성물"은 약학적으로 허용가능하고 적절한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분과 함께, 본원에 기재된 변형된 유리카제의 하나 이상의 종의 제조를 의미한다. 약학적 조성물의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.
이하에서, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 유기체에 현저한 자극을 일으키지 않고, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 식염수, 에멀젼 및 유기 용매와 물의 혼합물뿐만 아니라 고체(예: 분말) 및 기체 담체이며, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 용어 "부형제"는 화합물의 투여를 추가로 용이하게 하기 위해 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘(calcium carbonate), 인산칼슘(calcium phosphate), 다양한 당 및 전분 유형, 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives), 젤라틴(gelatin), 식물성 오일(vegetable oils) 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 찾아볼 수 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은, 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 통상적인 혼합(mixing), 용해(dissolving), 과립화(granulating), 당의정 제조(dragee-making), 분말화(levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화(encapsulating), 포획(entrapping) 또는 동결건조(lyophilizing) 방법에 의해 제조될 수 있다.
따라서 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 변형된 유리카제를 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제(auxiliary)를 포함하는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택한 투여 경로에 따라 다르다.
본원에 기재된 변형된 유리카제는, 예를 들어, 볼루스 주사(bolus injection) 또는 연속 주입(continuous infusion)에 의해 비경구(parenteral) 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사 또는 주입을 위한 제형은, 예를 들어, 앰플 또는 선택적으로 방부제(preservative)가 첨가된 다중 용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형 제제(formulatory agents)를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 약학적 조성물은 수용성 형태의 변형된 유리카제 제제의 수용액을 포함한다. 주사 또는 주입을 위해 변형된 유리카제는 선택적으로 수용액, 바람직하게는 행크 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution), 또는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유기 용매가 있거나 없는 생리 식염수 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액으로 제형화될 수 있다.
추가로, 변형된 유리카제의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액 및 에멀젼(예: 유중수형(water-in-oil), 수중유형(oil-in-water) 또는 유중유중수형(water-in-oil in oil) 에멀젼)으로 제조될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레이트, 트리글리세리드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 소르비톨(sorbitol) 또는 덱스트란(dextran)과 같이, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 변형된 유리카제의 용해도를 증가시켜, 고농축 용액의 제조를 가능하게 하는 적절한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.
혈류로의 직접 주사 및/또는 주입(예: 정맥내 투여)은 혈중 요산 수준이 상승된 고뇨산혈증(이와 관련된 임의의 병태를 포함)을 치료하는 데 특히 적합할 수 있다. 혈류로의 투여는 변형된 유리카제를 특정 조직으로 전달하기 위해 선택적으로 사용될 수도 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 변형된 유리카제는, 예를 들어, 과도한 요산 수준에 의해 영향을 받는 조직에 국부적으로 주사될 수 있다. 조직은 선택적으로 관절(예: 통풍의 경우) 또는 신장(예: 신장 결석의 경우)과 같이 요산 침전과 관련된 조직일 수 있다.
경점막(transmucosal) 투여의 경우, 제형에 침투제가 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
경구 투여를 위해, 본 발명의 변형된 유리카제는 변형된 유리카제를 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 본원에 기재된 변형된 유리카제를 환자가 경구 섭취할 수 있도록 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화할 수 있게 한다. 고형 부형제를 사용하여 경구 사용을 위한 약리학적 제제를 만들 수 있고, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적절한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물을 가공하여, 정제 또는 당의정 코어를 얻을 수 있다. 적합한 부형제는, 특히, 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는, 당과 같은 충전제; 셀룰로오스 제제, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검(gum tragacanth), 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP)과 같은 생리학적으로 허용가능한 중합체와 같은 충전제이다. 원하는 경우, 가교된 폴리비닐 피롤리돈(cross-linked polyvinyl pyrrolidone), 한천, 또는 알긴산 또는 알긴산나트륨과 같은 이의 염과 같은 붕해제(disintegrating agent)가 첨가될 수 있다.
당의정 코어에는 적절한 코팅이 제공된다. 이러한 목적을 위해, 선택적으로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티타늄(titanium dioxide), 래커 용액(lacquer solution) 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 변형 유리카제 용량의 다양한 조합을 식별 또는 특성화하기 위해 염료(dyestuffs) 또는 안료(pigments)를 정제 또는 당의정 코팅에 첨가할 수 있다.
경구로 사용할 수 있는 약학적 조성물은 젤라틴으로 만든 푸시-핏 캡슐(push-fit capsule)뿐만 아니라 젤라틴 및 가소제(plasticizer)(예: 글리세롤 또는 소르비톨)로 만든 연질, 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 선택적으로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 변형된 유리카제는 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택된 투여 경로에 적절한 투여량이어야 한다.
본 발명의 구현예의 변형된 유리카제는 또한, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 기제(suppository base)를 사용하여 좌약 또는 정체 관장(retention enema)과 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
경구 및/또는 직장 투여는 위장관의 질병 또는 장애, 예를 들어, 위장관의 염증과 관련된 병태(예: 염증성 장 질환 및/또는 위장염)를 치료하는 데 특히 적절할 수 있다.
협측 투여(buccal administration)를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 변형된 유리카제는 적절한 추진제(propellant)(예: 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로메탄 또는 이산화탄소)를 사용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태(전형적으로 분말, 액화 및/또는 기체 담체 포함)로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 흡입기(inhaler) 또는 취입기(insufflator)에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 변형된 유리카제의 분말 혼합물 및, 이에 제한되지는 않지만, 락토스 또는 전분과 같은 적절한 분말 기제를 함유하여 제형화될 수 있다.
대안적으로, 변형된 유리카제는 사용 전에, 적절한 비히클 (예: 멸균 주사용 증류수(sterile, pyrogen-free water))로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용하기에 적합한 약학적 조성물은 활성 성분이 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 치료적 유효량은 질병의 증상을 예방, 완화 또는 개선하거나 치료받는 대상체의 생존을 연장시키는데 효과적인 변형된 유리카제의 양을 의미한다.
본 발명의 방법에 사용되는 임의의 변형된 유리카제에 대해, 치료적 유효량 또는 용량은 초기에 동물에서의 활성 분석으로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 활성 분석에 의해 결정된 바와 같이 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다(예: 변형된 유리카제의 생물학적 활성의 반-최고치 증가(half-maximal increase)를 달성하는, 테스트 단백질 구조의 농도). 이러한 정보는 인간의 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다.
다음의 실시예 섹션에서 설명하는 바와 같이, 본 발명의 구현예의 변형된 유리카제의 치료적으로 효과적인 양은 약 1 ㎍/㎏ 체중 내지 약 500 ㎎/㎏ 체중 범위일 수 있다. 본원에 기재된 구현예들 중 일부에서, 변형된 유리카제의 치료적으로 효과적인 양은 약 10 μg/kg 체중 내지 약 2000 μg/kg 체중 이며, 선택적으로 약 25 μg/kg 체중 내지 약 800 μg/kg 체중 이다.
본원에 기재된 변형된 유리카제의 독성 및 치료 효능은 실험 동물에서의 표준 약학적 절차(예: 대상체 단백질 구조에 대한 EC50, IC50 및 LD50(테스트된 동물의 50 %에서 사망을 유발하는 치사량)을 측정)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 활동 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에게 사용할 투여량 범위를 제형화하는 데 사용할 수 있다.
투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사가 선택할 수 있다 (예를 들어, Fingl, et al., 1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1 참조).
최소 유효 농도(minimal effective concentration, MEC)라고 하는, 원하는 효과를 유지하기에 충분한 활성 유리카제의 혈장 수준을 제공하기 위한 투여량 및 간격은 개별적으로 조정할 수 있다. MEC는 각 제제에 따라 다르지만, 시험관 내 데이터, 예를 들어, 시험관 내에서 원하는 수준의 활성을 달성하는 데 필요한 농도로부터 추정할 수 있다. MEC 달성에 필요한 투여량은 개인의 특성과 투여 경로에 따라 다르다. HPLC 분석 또는 생물학적 분석을 사용하여 혈장 농도를 결정할 수 있다.
투여 간격도 MEC 값을 사용하여 결정될 수 있다. 제제는 시간의 10-90 %, 바람직하게는 30-90 %, 가장 바람직하게는 50-90 % 동안 MEC 이상의 혈장 수준을 유지하는 요법을 사용하여 투여해야 한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본원에서 기재된 변형된 유리카제는 체내에서 긴 반감기를 나타낼 수 있다. 이러한 특성은 상대적으로 드문 투여의 사용(투여가 주사와 같은 불편한 경로에 의한 경우 특히 유리할 수 있음) 및/또는 상대적으로 낮은 투여량의 투여(이는 변형된 유리카제에 대한 독성 및/또는 잠재적인 면역 반응을 감소시키는 데 특히 유리할 수 있음)를 허용할 수 있다.
유리카제 활성으로 치료할 수 있는 일부 상태는 변형된 유리카제의 지속적이고 장기적인 최소 유효 농도를 필요로 하지 않을 수 있다. 따라서, 변형된 유리카제는 최소 유효 농도를 지속적으로 제공하기에 충분하지 않은 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 요산 침전을 특징으로 하는 상태는 체내에서 침전된 요산의 부분적 또는 완전한 용해를 촉진하기에 충분한 용량으로 변형된 유리카제를 투여한 후 유리카제 활성의 간격이 필요하지 않을 경우, 예를 들어 임상적으로 유의한 수준의 요산이 다시 침전될 수 있는 충분한 시간이 경과할 때까지 투여함으로써 선택적으로 치료할 수 있습니다.
본원에 기재된 구현예 중 일부에서, 투여(예: 주사에 의한)는 적어도 1주 간격(즉, 치료는 적어도 1주 간격으로 분리된 복수의 투여를 포함함)으로 이루어지며, 선택적으로 최대 6개월 또는 12개월(1년)의 간격으로 수행된다. 이러한 일부 구현예에서, 간격은 적어도 2주이다. 일부 구현예에서, 간격은 적어도 1개월이다(예: 1개월 내지 12개월, 또는 1개월 내지 6개월, 또는 1개월 내지 2개월, 선택적으로 1개월 또는 2개월의 범위). 일부 구현예에서, 간격은 적어도 2개월이다(예: 2개월 내지 12개월, 또는 2개월 내지 6개월의 범위). 일부 구현예에서, 간격은 적어도 3개월이다(예: 3개월 내지 12개월, 또는 3개월 내지 6개월의 범위).
본원에 기재된 구현예들 중 일부에서, 투여 빈도 및 투여 당 용량은 (예를 들어, 성인 인간 대상체에게 주사를 통해) 투여되는 변형된 유리카제의 투여량이 1개월당 변형된 유리카제 60mg 이하가 되도록 선택된다(예를 들어, 3개월 간격으로 120mg을 투여하는 것은 월 40mg의 투여량으로 간주될 수 있다). 일부 이러한 구현예에서, 투여량은 월 40mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 80mg 이하 투여). 일부 이러한 구현예에서, 투여량은 월 24 mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 48mg 이하 투여). 일부 이러한 구현예에서, 투여량은 월 16 mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 32mg 이하 투여). 일부 이러한 구현예에서, 투여량은 월 12 mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 24mg 이하 투여). 일부 이러한 구현예에서, 투여량은 월 10 mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 20mg 이하 투여). 일부 구현예에서, 투여량은 월 8 mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 16mg 이하 투여). 일부 구현예에서, 투여량은 월 6mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 12mg 이하 투여). 일부 구현예에서, 투여량은 월 4mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 8mg 이하 투여). 일부 구현예에서, 투여량은 월 2mg 이하이다. 일부 구현예에서, 투여량은 월 1 mg 이하이다.
본원에 기재된 구현예들 중 일부에서, 투여 빈도 및 투여 당 용량은 투여되는 변형된 유리카제의 투여량이 월 체중 kg당 변형된 유리카제 2 mg 이하가 되도록 선택된다. 일부 이러한 구현예에서, 투여량은 한 달에 체중 kg당 0.8 mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 체중 kg당 1.6 mg 이하 투여). 일부 이러한 구현예에서, 투여량은 한 달에 체중 kg당 0.4 mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 체중 kg당 0.8 mg 이하 투여). 일부 이러한 구현예에서, 투여량은 한 달에 체중 kg당 0.2 mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 체중 kg당 0.4 mg 이하 투여). 일부 구현예에서, 투여량은 한 달에 체중 kg당 0.1 mg 이하이다(예: 약 2개월 간격으로 체중 kg당 0.2 mg 이하 투여). 일부 구현예에서, 투여량은 한 달에 체중 kg당 0.5 mg 이하이다. 일부 구현예에서, 투여량은 한 달에 체중 kg당 0.25 mg 이하이다.
치료할 상태의 중증도 및 반응성에 따라, 투여량은 또한 단일 투여일 수 있고, 선택적으로 상기 기재된 서방형 조성물을 수일에서 수주까지 지속되는 치료 과정과 함께 또는 치유가 이루어지거나 질병이 감소될 때까지 투여할 수 있다.
투여되는 조성물의 양은 물론 치료받는 대상체, 고통의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 조성물은 원하는 경우, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는, FDA(미국 식품의약국) 승인 키트와 같은, 팩 또는 디스펜서(dispenser) 장치로 제공될 수 있다. 팩은, 예를 들어, 블리스터 팩 또는 가압 용기(흡입용)와 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여 지침이 수반될 수 있다. 팩 또는 디스펜서에는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 형식으로 용기와 관련된 통지가 수반될 수 있으며, 이 통지는 인간 또는 동물(veterinary) 투여를 위한 조성물의 형식에 대한 기관의 승인을 반영한다. 예를 들어, 이러한 통지는 처방약에 대해 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 라벨링 또는 승인된 제품 삽입물일 수 있다. 적절한 약학적 담체에 제형화된 본 발명의 구현예 중 어느 하나의 변형된 유리카제를 포함하는 조성물은 또한 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 제조되고, 적절한 용기에 배치되며, 지시된 상태의 치료 또는 진단을 위해 라벨링될 수 있다.
따라서, 본 발명의 구현예에 따르면, 본원에 기재된 약학적 조성물은 포장재로 포장되고, 상기에서 기재된 바와 같이, 변형된 유리카제의 활성이 유리한 상태의 치료에 사용하기 위해 포장재 내 또는 포장재 상에 인쇄물로 식별된다.
추가 정의:
여기서, "탄화수소" 및 "탄화수소 모이어티"라는 용어는, 기본 골격으로서, 주로 수소 원자로 치환된 탄소 원자 사슬을 포함하는 유기 모이어티를 설명한다. 탄화수소는 포화되거나 비-포화될 수 있고, 지방족(aliphatic), 지환족(alicyclic) 또는 방향족(aromatic) 모이어티로 구성될 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 치환기(수소 제외)로 치환될 수 있다. 치환된 탄화수소는 하나 이상의 치환기를 가질 수 있으며, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로, 예를 들어, 사이클로알킬(cycloalkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아릴(aryl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로알리시클릭(heteroalicyclic), 아민(amine), 할로(halo), 하이드록시(hydroxy), 알콕시(alkoxy), 아릴옥시(aryloxy), 티오하이드록시(thiohydroxy), 티오알콕시(thioalkoxy), 티오아릴옥시(thioaryloxy), 설피닐(sulfinyl), 설포닐(sulfonyl), 설포네이트(sulfonate), 설페이트(sulfate), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아지드(azide), 포스포닐(phosphonyl), 포스피닐(phosphinyl), 옥소(oxo), 카르보닐(carbonyl), 티오카르보닐(thiocarbonyl), 우레아기(urea group), 티오우레아기(thiourea group), O-카르바밀(O-carbamyl), N-카르바밀(N-carbamyl), O-티오카르바밀(O-thiocarbamyl), N-티오카르바밀(N-thiocarbamyl), S-티오카르바밀(S-thiocarbamyl), C-아미도(C-amido), N-아미도(N-amido), C-카르복시(C-carboxy), O-카르복시(O-carboxy), 술폰아미도(sulfonamido), 구아닐(guanyl), 구아니디닐(guanidinyl), 히드라진(hydrazine), 히드라지드(hydrazide), 티오히드라지드(thiohydrazide), 및 아미노(amino)일 수 있다. 탄화수소는 이들 용어가 본원에서 정의된 바와 같이, 말단기 또는 연결기일 수 있다. 바람직하게는, 탄화수소 모이어티는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 예를 들어, "1 내지 20"과 같은 수치 범위가 본원에서 언급될 때마다, 이는 해당 그룹이(이 경우 탄화수소가), 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등, 최대 20개의 탄소 원자를 포함할 수 있음을 의미한다. 선택적으로, 탄화수소는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 탄화수소이다. 임의로, 탄화수소는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다.
본원에서, "연결기"라는 어구는 화합물 내 2개 이상의 모이어티에 부착된 그룹(예: 치환체)을 설명하는 반면, "말단기"이라는 어구는 하나의 원자를 통해 화합물 내 하나의 모이어티에 부착된 그룹(예: 치환체)을 설명한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된, 용어 "알킬"은 직쇄(straight chain) 및 분지쇄(branched chain) 기를 포함하는 임의의 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 바람직하게는, 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 보다 바람직하게는, 알킬은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알킬이다. 가장 바람직하게는, 달리 나타내지 않는 한, 알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬이다. 알킬기는 치환되거나 비-치환될 수 있다.
치환된 경우, 치환기는, 예를 들어 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드, 및 아미노일 수 있으며, 이들 용어는 본원에서 정의된 바와 같다.
본원에서, 용어 "알케닐"은 직쇄 및 분지쇄 기를 포함하고, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 불포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 바람직하게는, 알케닐기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 보다 바람직하게는, 알케닐은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알케닐이다. 가장 바람직하게는, 달리 나타내지 않는 한, 알케닐은 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 저급 알케닐이다. 알케닐기는 치환되거나 비-치환될 수 있다.
치환된 알케닐은 하나 이상의 치환기를 가질 수 있으며, 여기서 각 치환기는 독립적으로, 예를 들어, 알키닐, 사이클로알킬, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있다.
본원에서, 용어 "알키닐"은 직쇄 및 분지쇄 기를 포함하고, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 불포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 바람직하게는, 알키닐기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 보다 바람직하게는, 알키닐은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알키닐이다. 가장 바람직하게는, 달리 나타내지 않는 한, 알키닐은 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 저급 알키닐이다. 알키닐기는 치환되거나 비-치환될 수 있다.
치환된 알키닐은 하나 이상의 치환기를 가질 수 있으며, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로, 예를 들어, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S- 티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있다.
용어 "알킬렌"은, 본원에서 정의된 바와 같은 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소 연결기를 설명하며, 알킬렌이 말단기가 아닌 연결기라는 점에서만 본원에 정의된 바와 같이 알킬기(포화 시) 또는 알케닐 또는 알키닐기(불포화 시)와 다르다.
"사이클로알킬" 기는 불포화된 전-탄소(all-carbon) 모노사이클릭 또는 융합 고리(즉, 인접한 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리)에 포화된 그룹을 말하며, 여기서 하나 이상의 고리는 완전히 공액된 파이-전자계(conjugated pi-electron system)를 갖지 않는다. 사이클로알킬기의 예는, 제한 없이, 사이클로프로판(cyclopropane), 사이클로부탄(cyclobutene), 사이클로펜탄(cyclopentane), 사이클로펜텐(cyclopentene), 사이클로헥산(cyclohexane), 사이클로헥사디엔(cyclohexadiene), 사이클로헵탄(cycloheptane), 사이클로헵타트리엔(cycloheptatriene), 및 아다만탄(adamantane)이다. 사이클로알킬기는 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 경우, 치환기는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C- 아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있고, 이들 용어는 본원에 정의된 바와 같다. 사이클로알킬기가 불포화된 경우, 이는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 및/또는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함할 수 있다. 사이클로알킬기는 이 어구가 본원에 정의된 바와 같이 단일 인접 원자에 부착된 말단기일 수 있고, 본원에 정의된 바와 같이 두 개 이상의 모이어티를 연결하는 연결기일 수도 있다.
"아릴" 기는 완전히 공액된 파이-전자계를 가지는 전-탄소 모노사이클릭 또는 융합-고리 폴리사이클릭(즉, 인접한 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리) 말단기를 의미한다. 아릴기의 예는, 제한 없이, 페닐, 나프탈레닐 및 안트라세닐이다. 아릴기는 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 경우, 치환기는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C- 아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있고, 이들 용어는 본원에 정의된 바와 같다.
"헤테로아릴" 기는, 예를 들어, 질소, 산소 및 황과 같은, 하나 이상의 원자를 고리(들)에 가지고, 추가로, 완전히 공액된 파이-전자계를 갖는 모노사이클릭 또는 융합 고리(즉, 인접한 원자 쌍을 공유하는 고리) 말단기를 의미한다. 헤테로아릴기의 예는, 제한 없이, 피롤(pyrrole), 푸란(furan), 티오펜(thiophene), 이미다졸(imidazole), 옥사졸(oxazole), 티아졸(thiazole), 피라졸(pyrazole), 피리딘(pyridine), 피리미딘(pyrimidine), 퀴놀린(quinoline), 이소퀴놀린(isoquinoline) 및 퓨린(purine)을 포함한다. 헤테로아릴기는 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 경우, 치환기는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C- 아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있고, 이들 용어는 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "아릴렌"은 이 용어가 본원에 정의된 바와 같이 모노사이클릭 또는 융합 고리 폴리사이클릭 연결기를 나타내며, 아릴렌이 말단기가 아닌 연결기라는 점에서만 본원에 정의된 바와 같은 아릴 또는 헤테로아릴기와 다른 연결기를 포괄한다.
"헤테로알리사이클릭" 기는 고리(들)에 질소, 산소 및 황과 같은 하나 이상의 원자를 갖는 모노사이클릭 또는 융합 고리 그룹을 의미한다. 고리는 또한 하나 이상의 이중 결합을 가질 수 있다. 그러나, 고리에는 완전히 공액된 파이-전자계가 없다. 헤테로알리시클릭은 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 경우, 치환기는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C- 아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있고, 이들 용어는 본원에 정의된 바와 같다. 대표적인 예는 피페리딘(piperidine), 피페라진(piperazine), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 테트라히드로피란(tetrahydropyran), 모르폴린(morpholine) 등이다. 헤테로알리사이클릭기는 이 어구가 본원에 정의된 바와 같이 단일 인접 원자에 부착된 말단기일 수도 있고, 본원에 정의된 바와 같이 두 개 이상의 모이어티를 연결하는 연결기일 수도 있다.
본원에서, 용어 "아민" 및 "아미노"는 각각 -NR'R'' 기 또는 -N+R'R''R''' 기를 의미하며, 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 수소, 또는 본원에 정의된 바와 같이, 치환 또는 비-치환 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로알리시클릭(이의 고리 탄소를 통해 아민 질소에 연결됨), 아릴, 또는 헤테로아릴(이의 고리 탄소를 통해 아민 질소에 연결됨)이다. 선택적으로, R', R'' 및 R'''은 수소 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는 알킬이다. 선택적으로, R' 및 R''(및 R''', 존재하는 경우)은 수소이다. 치환될 때, 아민의 질소 원자에 결합된 R', R'' 또는 R''' 탄화수소 모이어티의 탄소 원자는 옥소에 의해 치환되지 않으므로(명시적으로 달리 나타내지 않는 한), R', R'' 및 R'''는 (예를 들어) 카르보닐, C-카르복시 또는 아미드가 아니며, 이들 그룹은 본원에 정의된 바와 같다.
"아지드" 기는 -N=N+=N- 기를 의미한다.
"알콕시" 기는 본원에 정의된 바와 같은, -O-알킬 및 -O-사이클로알킬 기 모두를 의미한다.
"아릴옥시" 기는 본원에 정의된 바와 같은, -O-아릴 및 -O-헤테로아릴 기 모두를 의미한다.
"하이드록시" 기는 -OH 기를 의미한다.
"티오하이드록시" 또는 "티올" 기는 -SH 기를 의미한다.
"티오알콕시" 기는 본원에 정의된 바와 같은, -S-알킬 및 -S-사이클로알킬 기 모두를 의미한다.
"티오아릴옥시" 기는 본원에 정의된 바와 같은, -S-아릴 및 -S-헤테로아릴 기 모두를 의미한다.
"카르보닐" 기는 -C(=O)-R' 말단기 또는 -C(=O)- 연결기를 의미하며, 여기서 R'은 상기 정의된 바와 같다.
"알데하이드" 기는 -C(=O)H 기를 의미한다.
"티오카르보닐" 기는 -C(=S)-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본원에서 정의된 바와 같다.
"카르복실", "카르복실릭" 또는 "카르복실레이트"는 본원에 정의된 바와 같이 "C-카르복시" 및 "O-카르복시" 기 모두를 지칭한다.
"C-카르복시" 기는 -C(=O)-O-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본원에서 정의된 바와 같다.
"O-카르복시" 기는 R'C(=O)-O- 기를 의미하며, 여기서 R'은 본원에서 정의된 바와 같다.
"옥소" 기는 =O 기를 의미한다.
"할로" 기는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
"설피닐" 기는 -S(=O)-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본원에서 정의된 바와 같다.
"설포닐" 기는 -S(=O)2-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본원에서 정의된 바와 같다.
"설포네이트" 기는 -S(=O)2-O-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본원에서 정의된 바와 같다.
"설페이트" 기는 -O-S(=O)2-O-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본원에서 정의된 바와 같다.
"설폰아미드" 또는 "설폰아미도" 기는 본원에서 정의된 바와 같이, S-설폰아미도 및 N-설폰아미도 기를 모두 포함한다.
"S-설폰아미도" 기는 -S(=O)2-NR'R'' 기를 의미하며, 각각의 R' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"N-설폰아미도" 기는 R'S(=O)2-NR''- 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"O-카르바밀" 기는 -OC(=O)-NR'R'' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"N-카르바밀" 기는 R'OC(=O)-NR''- 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"O-티오카르바밀" 기는 -OC(=S)-NR'R'' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"N-티오카르바밀" 기는 R'OC(=S)NR''- 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"S-티오카르바밀" 기는 -SC(=O)-NR'R'' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"아미드" 또는 "아미도" 기는 본원에서 정의된 바와 같이, C-아미도 및 N-아미도 기를 포함한다.
"C-아미도" 기는 -C(=O)-NR'R'' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"N-아미도" 기는 R'C(=O)-NR''- 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"우레아 기"는 -N(R')-C(=O)-NR''R''' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R', R'' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"티오우레아 기"는 -N(R')-C(=S)-NR''R''' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R', R'' 및 R''는 본원에서 정의된 바와 같다.
"니트로" 기는 -NO2 기를 의미한다.
"시아노" 기는 -C≡N 기를 의미한다.
용어 "포스포닐" 또는 "포스포네이트"는 -P(=O)(OR')(OR'') 기를 의미하며, 여기서 R' 및 R''는 상기 정의된 바와 같다.
용어 "포스페이트"는 -O-P(=O)(OR')(OR'') 기를 의미하며, 각각의 R' 및 R''는 상기 정의된 바와 같다.
용어 "포스피닐"은 -PR'R'' 기를 의미하며, 각각의 R' 및 R''는 상기 정의된 바와 같다
용어 "하이드라진"은 -NR'-NR"R''' 기를 의미하며, R', R" 및 R"'는 본원에 정의된 바와 같다.
본원에서 사용되는, 용어 "히드라지드"는 -C(=O)-NR'-NR"R"' 기를 의미하며, 여기서 R', R" 및 R'"는 본원에서 정의된 바와 같다.
본원에서 사용되는, 용어 "티오히드라지드"는 -C(=S)-NR'-NR"R"' 기를 의미하며, 여기서 R', R" 및 R'"는 본원에서 정의된 바와 같다.
"구아니디닐" 기는 -RaNC(=NRd)-NRbRc 기를 의미하며, 여기서 Ra, Rb, Rc 및 Rd는 각각 R' 및 R''에 대해 본원에서 정의된 바와 같을 수 있다.
"구아닐" 또는 "구아닌" 기는 RaRbNC(=NRd)- 기를 의미하며, 여기서 Ra, Rb 및 Rd는 본원에서 정의된 바와 같다.
"이민"은 -C(=NR")-R' 기를 의미하며, 여기서 R' 및 R"는 상기 정의된 바와 같다.
"헤미아미날"은 -C(R')(OH)-NR"R"' 기를 의미하며, R', R" 및 R'"는 본원에 정의된 바와 같다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 ± 10%를 지칭한다.
용어 "포함하다", "포함하는", "함유하다", "함유하는", "가지는" 및 이들의 접합체는 "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미한다.
"~로 구성된"이라는 용어는 "포함하고 제한되는"을 의미한다.
"~로 본질적으로 이루어진"이라는 용어는 조성물, 방법 또는 구조가 추가 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있지만, 추가 성분, 단계 및/또는 부분이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본 및 신규 특성을 실질적으로 변경하지 않는 경우에만 해당됨을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구현예는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것으로 이해되어야 하며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 따라서, 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위 범위와 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위에 대한 설명은 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 뿐만 아니라 구체적으로 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6까지와 같은 하위 범위를 개시한 것으로 간주되어야 한다.
수치 범위가 본 명세서에 표시될 때마다, 이는 표시된 범위 내의 임의의 인용된 숫자(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 제1 표시된 수 및 제2 표시된 수의 "범위/~사이 범위"라는 문구 및 제1 표시된 수 "내지" 제2 표시된 수 "~의 범위/~까지의 범위"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 제1 및 제2 표시된 수와 그 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "방법"은 주어진 작업을 수행하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 의미하며, 여기에는 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 실무자에게 알려져 있거나 알려진 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 쉽게 개발된 방식, 수단, 기술 및 절차가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
명료함을 위해 개별 구현예의 맥락에서 설명된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 구현예에서 조합되어 제공될 수도 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 설명된 구현예에서 적절하게 제공될 수 있다. 다양한 구현예의 맥락에서 설명된 특정 특징은 해당 구현예가 해당 요소 없이 작동하지 않는 경우를 제외하고는 해당 구현예의 필수 특징으로 간주되어서는 안 된다.
위에서 기술되고 하기 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 구현예 및 양태는 하기 실시예에서 실험적 뒷받침된다.
실시예
이제 상기 설명과 함께 본 발명의 일부 구현예를 비-제한적인 방식으로 예시하는 하기 실시예를 참조한다.
재료 및 방법
재료:
키메라 cHu 3.3 인간 항-PEG IgG1 항체는 Academia Sinica (Taiwan)에서 얻었다.
2-피콜린 보란과 시아노보로하이드라이드 나트륨(NaBH3CN)은 Sigma Aldrich에서 얻었다.
단일작용성 폴리에틸렌 글리콜 니트로페닐 카보네이트 (mPEG(10K)-NPC)는 Creative PEGWorks에서 얻었다.
폴리에틸렌 글리콜 비스-알데하이드(bis-Ald-PEG) 시약은 Creative PEGWorks에서 얻었다.
폴리에틸렌 글리콜 비스-N-하이드록시숙신이미드 (2kDa) (bis-NHS-PEG 2000)는 Iris Biotech Gmbh에서 얻었다.
BY2 세포에서 유리카제 변이체를 발현하기 위한 벡터의 구축:
BY2 세포에서 상이한 유리카제 서열의 형질 전환 및 발현을 위해 제미니바이러스 콩 황화 위축 바이러스(BeYDV) 레플리콘을 기반으로 한 발현 시스템 [Chen et al., Hum Vaccin 2011, 7:331-338; Mor et al., Biotechnol Bioeng 2003, 81:430-437]을 사용하였다.
BY2 세포 형질 전환, 유리카제 발현 및 선택된 라인의 분리:
상기 설명한 분자 구조물을 이용한 BY2 세포의 유전적 형질전환은 An et al. [EMBO J 1985, 4:277-284]에 기재된 바와 같은 아그로박테리아-매개 형질전환 절차를 사용하여 수행되었다. 형질전환된 세포는 선별제로 카나마이신(kanamycin)을 사용하여 선별하였다. 생존 가능한 카나마이신 내성 세포 현탁액이 확립되면, 개별 세포주(클론)를 분리하고 스크리닝하는 데 사용하였다. 형질전환 세포 현탁액의 고도로 희석된 분취량을 사용하고 이를 고체 배지에 펴서 개별 세포주를 확립하였다. 작은 캘러스(식물 세포 덩어리)가 발달할 때까지 세포를 성장시켰다. 단일 클론을 나타내는 각 캘러스를 액체 배지에 재-현탁하고 샘플링했다. 개개의 형질전환된 세포주를 분리하고 유리카제 발현 수준에 대해 스크리닝하였다. 추가 공정 개발을 위해 가장 높은 발현 수준을 나타내는 라인을 선택하였다.
식물 세포 현탁액:
N. tabacum cv. BY2 세포는 액체 MS-BY2 배지[Nagata & Kumagai, Methods Cell Sci 1999, 21:123-127]에서 오비탈 진탕기(85rpm)에서 일정하게 교반하면서 25℃에서 현탁 배양물로서 배양되었다. 현탁액을 250ml 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 50ml 부피로 성장시키고 매주 2.5%(v/v)의 농도로 계대배양하였다.
"페글로티카제-유사" 페길화된 유리카제의 제조:
"페글로티카제-유사" 대조군으로 작용하기 위해, prU-C250K 유리카제(SEQ ID NO: 2)를 100 mM 인산 완충액(pH 8)에서 1 mg/mL로 희석하고, 1000 몰 당량의 단일작용성 폴리에틸렌 글리콜 니트로페닐 카보네이트를 첨가하여 단일작용성 PEG에 의해 변형된 유리카제를 제조하였다. 실온에서 2시간 동안 반응을 진행하였다. 100K 컷오프(14,000G에서 4분 동안)를 갖는 Amicon® 시스템을 사용하여 100mM 인산염 완충액(pH 8)으로 3주기 투석하여 정제를 수행하였다.
ELISA를 통한 항체 수준 평가:
MaxiSorp™ 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 인산염 완충 식염수 완충액에서 5μg/ml의 유리카제 샘플로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였으며, 세척하고 실온에서 2시간 동안 2% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 그런 다음 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 모든 단백질을 제거하고 100μl의 혈청을 첨가하였다. 600rpm으로 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 추가 인큐베이션한 후, 결합되지 않은 화합물을 세척하고 마우스 항-인간 IgG-알칼리성 포스파타제를 각 웰에 1:5000 희석으로 첨가하였으며 600rpm에서 진탕시키면서 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 단계 후 BluePhos® 포스파타제 기질을 첨가하고 알칼리성 포스파타제 정지 용액을 사용하여 반응을 중단하였다. 마이크로플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 630 nm에서 최종 흡광도를 측정하였다.
MALDI-TOF 질량 분석법:
샘플 제조 - 매트릭스 용액은 에탄올에 녹인 20mg/mL 2,5-DHAP(2,5-dihydroxyacetophenone) 용액 375μL와 18mg/mL DAC(구연산수소이암모늄(diammonium hydrogen citrate)) 수용액 125μL를 혼합하여 제조하였다. 2 μL의 샘플 용액을 2 μL의 2 % 트리플루오로아세트산 용액과 혼합한 다음 2 μL의 매트릭스 용액을 혼합하였다다. 얻어진 삼원 혼합물(ternary mixture)을 결정화가 시작될 때까지 위아래로 피펫팅하여, 이전에 투명했던 혼합물이 불투명해졌다. 이 혼합물 0.5μL의 부피를 MALDI 강철 타겟 플레이트에 도포하였다. 용매를 증발시킨 후, 타겟을 질량분석기에 삽입하였다.
질량 분석법 - MALDI-TOF/TOF Autoflex™ 속도 질량 분석기(Bruker Daltonik GmbH)를 사용하여 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 획득하였다. 질량 분석기에는 SmartBeam™-II 고체 레이저(변형된 Nd:YAG 레이저; λ = 355 nm)가 장착되어 있고, 20000 내지 200000 m/z 또는 60000 내지 200000 m/z의 범위 내에서 양이온 선형 모드로 작동되었다. 레이저 유창성(Laser fluency)은 각 샘플에 대해 최적화되었다. 레이저는 2 킬로헤르츠의 주파수에서 작동되었고 스펙트럼은 총 2000개의 샷으로, 1000개의 레이저 샷의 배수로 축적되었다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC):
크기 배제 크로마토그래피는 Dionex™ UltiMate™ 3000 HPLC 시스템을 사용하여 수행되었다.
변형 전 유리카제는 100mM NaCl을 포함하는 50mM 붕산염 완충액(pH 8)에서 Superose® 12 10/300 GL 컬럼을 사용하여 0.4mL/분의 유속으로 분석하고, 214nm에서 흡광도를 측정하였다.
가교된 유리카제는 100mM NaCl을 포함하는 50mM Tris 완충액(pH 8.0)에서 직렬로 연결된 2개의 TSK 겔 G5000PWXL, 7.8x300mm 컬럼을 사용하여 0.3mL/분의 유속, 컬럼 온도 50℃에서 분석하고, 214nm에서 흡광도를 측정하였다.
유리카제 활성 분석:
유리카제 특이적 활성은 유리카제에 의한 요산 산화 후 방출되는 H2O2 부산물을 검출하는 간접 형광 분석법으로 측정하였다. 구체적으로, 400μM의 요산을 용해하여 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에 0.1% BSA를 사용하여 유리카제 농도가 알려지지 않은 샘플에 첨가하였다. 37℃에서 홀스래디쉬 과산화효소가 있는 상태에서, 형광 프로브(Ampliflu™)를 1:1 화학양론으로 H2O2와 반응시켜 여기 파장 530-560nm 및 방출 파장 590nm의 고형광 생성물을 생성하였다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 형광 증가를 10분 동안 기록하고, 샘플을 유리카제 표준 곡선에 따라 정량화하였다.
미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 분석을 수행하기 위해, 60 ng/ml 효소 및 증가하는 요산 농도(1.56 μM 내지 200 μM 범위의 요산 농도)에 대해 전술한 바와 같이 촉매 속도를 측정하였다. 운동 매개변수(Kinetic parameter)는 GraFit 소프트웨어(Erithacus Software Limited, 2010)를 사용하여 기질(UA) 농도 대 반응 속도(V) 플롯으로부터 계산되었다. 유리카제 활성의 한 단위(U)는 37℃, pH 8.0에서 분당 1μmol의 요산을 알란토인(allantoin)으로 전환하는 데 필요한 효소의 양으로 정의되었다.
광학 밀도(OD):
정제된 단백질의 정량화는 NanoDrop™ 2000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific Inc)를 사용하여 280 nm에서의 흡광도 및 이들 각각의 흡광 계수(extinction coefficient)(cm-1(그램/리터)-1)를 기반으로 수행되었다.
실시예 1
유리카제 아미노산 서열의 면역원성의 인 실리코(in silico) 비교
면역원성이 낮은 유리카제를 개발하기 위해, 46개의 유리카제 서열 각각에 대한 면역원성을 인실리코 분석으로 추정하였다.
ProPred MHC 클래스 II 결합 펩타이드 예측 서버는 [Singh & Raghava, Bioinformatics 2010, 17:1236-1237]에 설명된 것과 같은 절차에 따라 정량적 매트릭스를 사용하여 서열의 MHC 클래스-II 결합 영역을 예측하는 데 사용되었다. 모집단(population)의 90% 이상을 차지하는 9개의 가장 풍부한 인간 대립유전자(DRB1*0101, 0103, 0401, 0701, 0801, 1101, 1301, 1015)에 대해 MHC 클래스 II 9-mer 펩타이드 에피토프를 결정하였다. 다양한 9-mer 펩타이드를 식별하고 5% 임계값에서 컨센서스 결합 서열로부터의 편차를 기준으로 점수를 매겼다.
컨센서스 서열과 15% 이상의 유사성을 보이고 3개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 펩타이드는 면역원성으로 간주되었다.
분석된 유리카제 서열은 고대 인간, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 알리사이클로바실러스 말리(Alicyclobacillus mali), 아트로박터 강고트리엔시스(Arthrobacter gangotriensis), 아트로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 우다가와(Aspergillus udagawae), 아우레오바시디움 풀룰란스 EXF-150(Aureobasidium pullulans EXF-150), 바실러스 파스티디오서스(Bacillus fastidiosus), 바실러스 할로두란스 C-125(Bacillus halodurans C-125), 바실러스 서브틸리스 str. 168(Bacillus subtilis str. 168), 바실러스 sp. FJAT-21352(Bacillus sp. FJAT-21352), 바실러스 sp. TB-90(Bacillus sp. TB-90), 바실러스 베베리데이(Bacillus beveridgei), 박트로세라 라티프론스(초파리)(Bactrocera latifrons), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 카멜루스 페루스(Camelus ferus )(야생 박트리아 낙타), 칸디다 유틸리스 (Candida utillis), 칸디다투스 솔리박터 우시타투스(Candidatus Solibacter usitatus), 클라미도모나스 라인하르트티(Chlamydomonas reinhardtii), 시서 아리에티눔(Cicer arietinum)(병아리콩), 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans), 데이노코커스 지오써멀리스(Deinococcus geothermalis), 드레크메리아 코니오스포라 (Drechmeria coniospora), 에리나세우스 유로파에우스(고슴도치)(Erinaceus europaeus), 에슐리키아 콜라이 ISC56(Escherichia coli ISC56), 갈디에리아 설푸라리아(Galdieria sulphuraria), 글리신 맥스(대두)(Glycine max), 그라뉼리셀라 툰드리콜라(Granulicella tundricola), 키르피디아 투시아에 DSM 2912(Kyrpidia tusciae DSM 2912), 마그네포르티옵시스 포에(Magnaporthiopsis poae), 마이크로박테리움 sp. zzj4-1(Microbacterium sp. zzj4-1), 네오넥트리아 디티시마(Neonectria ditissima), 니코티아나 타바쿰(담배)(Nicotiana tabacum), 페니바실러스 다위니아누스(Paenibacillus darwinianus), 페니바실러스 오도리퍼(Paenibacillus odorifer), 페이폴루스 벌가리스(일반 콩)(Phaseolus vulgaris), 피알로세팔라 스코피미시스(Phialocephala scopiformis), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 피고셀리스 아델리아에(아델리 펭귄)(Pygoscelis adeliae), 루세투스 애깁티쿠스(이집트 과일 박쥐)(Rousettus aegyptiacus), 스토목시스 칼시트란스(헛간 파리)(Stomoxys calcitrans), 테라글로부스 사넨시스(Terriglobus saanensis), 톨리포클라디움 오피오글로소이데스(Tolypocladium ophioglossoides), 및 톨리포클라디움 오피오글로소이데스 CBS 100239(Tolypocladium ophioglossoides CBS 100239)의 서열이다.
최종 후보군(candidate)은 (i) 라이신 잔기의 수, (ii) 예측된 면역원성 에피토프의 수, (iii) 예측된 면역원성 에피토프의 점수를 기준으로 선정되었다. 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) BY2 세포에서 식물 재조합 유리카제(prU)로 발현하기 위해 다음과 같은 유리카제가 선택되었다:
칸디다 유틸리스(Candida utilis) 유리카제 (prU-C) (SEQ ID NO: 1, Accession No. P78609): 컨센서스 결합 서열과 54% 유사성의 최고 점수로 예측된 8개의 T-세포 에피토프; 아미노산 서열은 단백질 변형에 이용가능한 32개의 Lys 잔기를 포함함; 및
아트로박터 강고트리엔시스(Arthrobacter gangotriensis) 유리카제 (prU-C) (SEQ ID NO: 3, Accession No. EMR00187.1): 컨센서스 결합 서열과 42% 유사성의 최고 점수로 예측된 5개의 T-세포 에피토프; 아미노산 서열은 단백질 변형에 이용가능한 12개의 Lys 잔기를 포함함.
유리카제 prU-G와 prU-C는 임상적으로 승인된 두 가지 재조합 유리카제인 라스부리카제와 페글로티카제의 서열보다 면역원성 잠재력이 현저히 낮은 것으로 계산되었다. 특히, 라스부리카제에 사용되는 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 유리카제(prU-A)(SEQ ID NO: 4, Accession No. DB00049)는 컨센서스 결합 서열과 68% 유사성의 최고 점수를 갖는 11개의 T-세포 에피토프(및 단백질 변형에 이용가능한 25개의 Lys 잔기)를 가질 것으로 예측되었다; 반면에 페글로티카제에 사용된 돼지-개코원숭이 키메라 유리카제는 컨센서스 결합 서열과 68% 유사성의 최고 점수를 갖는 19개의 T-세포 에피토프(및 단백질 변형에 이용가능한 30개의 Lys 잔기)를 가질 것으로 예측되었다.
아스퍼질러스 플라부스 유리카제(prU-A)(SEQ ID NO: 4)도 참조로 사용하기 위해 니코티아나 타바쿰 BY2 세포에서 발현되었다.
prU-C(SEQ ID NO: 1)는 트리펩타이드(TKL)로서 C-말단 과산화소체(peroxisomal) 타겟 신호 1(PTS1)을 포함하고[Brocard & Hartig, Biochim Biophys Acta 2006, 1763:1565-1573], 퍼옥시좀에서 발현되었다. prU-A도 퍼옥시좀에서 발현되는 반면, prU-G는 세포질에서 발현된다.
실시예 2
C250K 돌연변이의 유리카제에 대한 영향
상기 재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 제조된 식물 재조합 칸디다 유틸리스 유리카제(prU-C; SEQ ID NO: 1)는 통상적인 조건 하에서 중합되는 것으로 관찰되었다. 또한 디티오트레이톨(DTT)이 prU-C의 중합을 억제하는 것으로 관찰되었으며, 이는 중합이 다른 유리카제 분자의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합 형성과 관련이 있음을 시사한다.
prU-C의 Cys250은 prU-C 활성에 필수적이지 않은 것으로 보고된 prU-C의 4개의 Cys 잔기 중 하나이다. 또한, 공개된 다른 유리카제의 구조와 비교한 결과(표시되지 않음) prU-C의 Cys250이 바깥쪽을 향하고 있음을 알 수 있다 - 이러한 방향은 분자간 이황화 결합 형성을 촉진할 수 있다.
상기의 관점에서, prU-C C250K 돌연변이체(prU-C250K; SEQ ID NO: 2)를 면역원성에 대해 분석하였고, 상기 기재된 바와 같이 니코티아나 타바쿰 BY2 세포에서 발현시켰다. 10개의 T-세포 에피토프는 컨센서스 결합 서열과 52% 유사성의 가장 높은 점수로 예측되었다. prU-C(SEQ ID NO: 1)의 경우, prU-C250K(SEQ ID NO: 2)는 트리펩타이드(TKL)로서 C-말단 과산화소체 타겟 신호 1(PTS1)을 포함하고[Brocard & Hartig, Biochim Biophys Acta 2006 , 1763:1565-1573], 퍼옥시좀에서 발현되었다.
그런 다음 prU-C의 저장 안정성에 대한 C250K 점 돌연변이의 효과는 25mM Tris, pH 8.4, 0.3 mg/mL 농도(광학 밀도 측정으로 결정됨)로 -20℃에서 하룻밤 동안 보관하여 동결/해동 사이클을 거치기 전 또는 후에 평가되었다.
동결 전후에 특이 활성(형광 활성 분석으로 정량화)을 결정하고; 고분자량(HMW) 종(species) 형성(자연 조건 하에서 크기 배제 크로마토그래피로 측정) 및 변성 조건 하에서 SDS-PAGE를 통해 prU-C250K를 분석하였다.
하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 자연 조건 하에서 동결 전 또는 후에 prU-C250K 돌연변이 샘플에는 사량체만이 존재하였다; 반면 WT prU-C는 동결 전 8.4% 팔량체, 동결 후 20.2% 팔량체 및 48.4% 고분자량(HMW) 이소형을 포함하였다(SEC에 의해 결정됨). 여기에 추가로 나타낸 바와 같이, C250K 돌연변이는 특이 활성에 유의한 영향을 미치지 않았다.
유사하게, 도 2에 도시된 바와 같이, prU-C250K의 단량체 형태만이 동결 전후의 변성 조건 하에서 관찰되었다(DTT가 없는 경우); 반면 일부 WT prU-C는 이량체 및 사량체(SDS-PAGE에 의해 결정됨)와 같은 다중 서브유닛을 갖는 종의 다양성을 입증하였다.
동결/해동 사이클이 있거나 없는 예시적인 유리카제 변이체에 대한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 사량체, 팔량체 및 HMW(팔량체보다 더 높은 분자량)의 효소 활성 및 비율(---는 검출 한계 미만의 수준을 나타냄).
종 동결/해동 없음 동결/해동 있음
prU-C prU-C250K prU-C prU-C250K
사량체 91.62 % 100 % 31.38 % 100 %
팔량체 8.38 % --- 20.20 % ---
HMW --- --- 48.42 % ---
활성 (mg/mL) 0.22 0.19 0.21 0.17
이러한 결과는 C250K 돌연변이가 WT 서열에 비해 유리카제의 구조적 특성을 향상시켜 활성과 사량체 구조(예: HMW 종 대신)를 모두 유지한다는 것을 나타낸다.
추가로, 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, C250K 돌연변이의 추가 (33번째) Lys 잔기가 단백질 변형을 더욱 촉진할 수 있다고 여겨진다.
실시예 3
유리카제 서열이 안정성에 미치는 영향
생리학적으로 관련된 조건에서 다양한 유리카제 변이체(prU-A, prU-C, prU-C250K 및 prU-G)의 안정성을 비교하였다.
열안정성을 평가하기 위해, 나노 시차 주사 형광 분석법(nano-differential scanning fluorimetry)으로 유리카제를 분석하였다. 구체적으로, 정제된 단백질 샘플을 PBS에 최종 농도 0.5mg/mL로 희석하고 각 샘플의 10μl를 모세관(capillary)에 넣었다. 모세관 어레이에 넣은 후, 플레이트를 나노 시차 주사 형광 분석 기기에 넣고 분당 1℃의 속도(28% 여기광 출력(excitation power)에서)로 15℃에서 95℃까지 서서히 가열하였다. 단백질 형태 변화에 따른 형광 변화의 결과로 소프트웨어에 의해 Tm(녹는점) 개시점(단백질이 변성되기 시작하는 온도)과 Tm(단백질의 50%가 변성되는 온도)이 결정되었다.
표 4에서 나타낸 바와 같이, prU-C와 prU-C250K는 유사한 녹는점 매개변수를 나타낸 반면, prU-A는 현저히 낮은 온도에서 녹았다.
이러한 결과는 prU-C와 prU-C250K가 생리적 온도에서 prU-A보다 더 안정적이며 C250K 돌연변이가 열안정성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
예시적인 유리카제 변이체의 녹는점(Tm) 및 녹는점 개시점(Tm onset)
유리카제 변이체 Tm 개시점 (℃) Tm (℃)
prU-A 34.9 45.2
prU-C 61.0 74.5
prU-C250K 62.4 73.2
인간 혈장 조건에서 안정성을 평가하기 위해, 유리카제를 인간 혈장(체외)에서 최종 농도 2μg/ml로 희석하고 37℃에서 4주 동안 인큐베이션하였다. 지정된 시점에서, 단백질 안정성을 특이 활성 분석으로 정량화하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 비-변형 prU-A, prU-C, prU-C250K 및 prU-G 단백질은 각각 인간 혈장에서 4주 배양 시 점진적인 활성 감소를 나타냈으며, prU-A는 가장 큰 안정성을 나타냈고 prU-G는 인간 혈장에서 가장 낮은 안정성을 나타냈다. prU-C 및 prU-C250K는 생리학적 기질에서 유사하게 유의미한 안정성을 나타냈으며, 이는 C250K 돌연변이가 혈장 안정성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
실시예 4
유리카제에 대한 PEG 가교의 효과
폴리에틸렌 글리콜 비스 알데하이드 (bis-Ald-PEG)를 사용하여 유리카제를 가교하기 위해, 다양한 크기 (1 kDa 내지 10 kDa)의 최대 1000 몰의 비스-알데하이드 PEG를 유리카제 각 1몰당 인산 완충액 (pH 8)의 유리카제 용액에 첨가하였다. 얻어진 용액에 환원제를 최종 농도 25-100 mM로 첨가하였다. 커플링 반응은 실온(~23℃)에서 하룻밤(예: 최소 10시간) 동안 진행하도록 하였다. 그런 다음 크로마토그래피 및/또는 한외여과(ultrafiltration)를 통해 반응 혼합물에서 유리 PEG를 제거하였다. 가교 효능은 SDS-PAGE로 결정하였고, 효소 활성은 비-변성 유리카제의 표준 곡선에 따라 측정하였다. 총 단백질에 대한 활성 단백질의 비율(280nm에서 광학 밀도(OD)로 결정)은 반응 후 유지된 활성의 %로 표시되었다.
상기 일반적인 절차를 사용하여, 상이한 크기의 비스-Ald-PEG에 의해 가교된 상이한 유리카제 변이체를 사용하여 다음과 같은 특정 실험을 수행하였다.
prU-C는 환원제로서 25mM 2-피콜린 보란의 존재 하에, 1000, 2000, 5000 및 10,000D Da의 PEG 분자량을 갖는 비스-Ald-PEG의 1000몰 당량(vs. 총 단백질 사량체)과 가교되었다.
하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 가교된 prU-C는 천연 prU-C의 효소 활성의 대부분을 유지하였다.
변형되지 않은 prU-C 활성과 비교한 다양한 크기의 PEG와 가교된 prU-C의 효소 활성.
PEG 크기 (Da) 효소 활성
1000 47 %
2000 73 %
5000 47 %
10,000 35 %
도 4에 나타낸 바와 같이, 천연 prU-C는 SDS-PAGE에서 이량체에 해당하는 더 작은 밴드와 함께 ~34kDa의 분자량을 나타냈으며, 이는 단백질 단량체(즉, 서브유닛 또는 ~136kDa 사량체)의 분자량에 해당한다; 반면 2kDa PEG와 가교된 prU-C는 약 315kDa에 해당하는 메인 밴드와 관련이 있었고, 상당히 낮은 분자량에 해당하는 밴드는 없었다.
약 315kDa의 메인 밴드는 2kDa PEG 약 45개 분자로 변형된 완전히 가교된 prU-C 사량체(~136kDa)와 일치하며, PEG 분자는 무게가 두 배인 단백질에 해당하는 속도로 이동하므로 PEG의 추가적인 90kDa는 180kDa 단백질로 나타난다. 또한, 사량체보다 낮은 분자량에 해당하는 밴드가 없다는 것은 효율적인 공유 가교를 나타내므로 가교되지 않은 단량체가 남아 있지 않게 된다.
도 4에 추가로 나타낸 바와 같이, 1 kDa PEG와 가교된 prU-C는 약 42 kDa에 해당하는 강한 밴드와 연관되었으며, 이는 PEG화된 단량체를 나타낸다; 뿐만 아니라 약 80kDa, 약 120kDa 및 약 160kDa의 밴드는 각각 PEG화된 이량체, 삼량체 및 사량체를 나타낸다.
추가로 나타낸 바와 같이, 5kDa PEG와 가교된 prU-C는 10kDa에 해당하는 증분을 갖는 여러 밴드와 연관되었으며, 이는 PEG 1분자(5kDa)의 증분과 일치하며(PEG 분자는 무게가 두 배인 단백질에 해당하는 속도로 이동하므로); 단일 PEG 분자로 변형된 단일 prU-C 단량체와 일치하는 55kDa보다 약간 적은 것에 해당하는 희미한 밴드(faded band)를 포함한다.
이러한 결과는 1kDa PEG 및 5kDa(또는 그 이상) PEG에 의한 사량체 내의 prU-C 단량체의 가교가 2kDa PEG와의 가교보다 상당히 덜 효율적임을 나타낸다.
또 다른 실험에서, 시중에서 입수할 수 있는 유리카제-A(라스부리카제)를 PEG 분자량이 600, 1000, 2000, 3400, 5000 및 10,000 Da인 500 몰 당량의 비스-Ald-PEG와 가교시켰고, 환원제로 100 mM NaBH3CN을 사용하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 라스부리카제는 SDS-PAGE에서 단백질 단량체의 분자량에 해당하는 ~34 kDa의 분자량을 나타내었고; 600 Da PEG와 반응한 라스부리카제는 단량체 및 이량체(각각 약 40 및 72 kDa)에 해당하는 메인 밴드와 삼량체 및 사량체(각각 약 130 및 160 kDa)에 해당하는 약한 밴드를 나타내었으며; 1000 Da PEG로 가교된 라스부리카제는 사량체에 해당하는 메인 밴드와 단량체, 이량체 및 삼량체에 해당하는 약한 밴드를 나타내었고; 5000 Da 또는 10,000 PEG로 가교된 라스부리카제는 단량체 및 다양한 수의 PEG 분자와 일치하는 번짐 밴드(smeared band)를 나타내었다(도 4와 관련하여 상기 논의된 바와 같이). 거기에 추가로 나타낸 바와 같이, 2000 Da 또는 3400 Da PEG로 가교된 라스부리카제는 더 작은 종에 해당하는 밴드 없이, PEG화된 사량체에 해당하는 밴드를 나타내었다.
이러한 결과는 2kDa 및 3.4kDa PEG를 사용한 사량체 내의 라스부리카제 단량체의 가교가 효율적인 반면, 1kDa(또는 그 미만) 또는 5kDa(또는 그 이상) PEG를 사용한 가교는 그렇지 않았음을 나타낸다. 이러한 결과는 prU-C로 얻은 결과와 유사하다.
또 다른 실험에서, prU-G를 PEG 분자량이 2000, 3400 및 5000 Da인 200 또는 1000 몰 당량의 비스-Ald-PEG와 가교시켰고, 환원제로 NaBH3CN을 사용하였다.
하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 2000 Da PEG로 가교된 prU-G는 5000 Da 또는 10,000 Da으로 가교된 prU-G보다 상당히 더 많은 활성을 유지하였고; 활성의 감소는 사용된 가교제의 양과 관련이 있었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 테스트된 비스-Ald-PEG에 대해, prU-G의 가교 시 비교적 높은 수준의 단량체 종(SDS-PAGE에서 70kDa 미만에 해당하는 밴드)이 나타났다. 또한, 1000 당량의 PEG와의 반응은 200 당량의 PEG와의 반응보다 더 높은 분자량을 나타내었다. 모든 테스트 조건은 prU-G 효소 활성의 상당한 손실을 동반하였다.
이러한 결과는 prU-G의 부분적 가교는 PEG 농도에 따라 달라지며, prU-A 및 prU-C의 가교보다 덜 효율적이라는 것을 나타낸다.
거기에 나타낸 바와 같이, prU-G와 5000 Da PEG의 가교는 2000 또는 3400 Da PEG와의 가교보다 덜 효율적이었다. 이 결과는 prU-C 및 prU-A로 얻은 결과와 일치한다.
변형되지 않은 prU-G 활성과 비교한 다양한 크기의 PEG(200 또는 1000 당량의 비스-Ald-PEG 사용)와 가교된 prU-G의 효소 활성.
PEG 크기 (Da) 비스-Ald-PEG의 당량 효소 활성
2000 200 21 %
1000 14 %
5000 200 12 %
1000 8 %
10000 200 6 %
1000 5 %
종합하면, 상기 결과는 유리카제 가교가 1kDa 초과 5kDa 미만의 PEG에서 가장 효율적이며, 이러한 조건 하에서 일부 유리카제 변이체(예: prU-G 제외)의 가교로 비-변형 유리카제의 효소 활성의 적어도 약 50%를 갖는 가교된 유리카제를 생성될 수 있음을 나타낸다.
실시예 5
변형된 유리카제에 대한 가교제 유형의 영향
상이한 가교제를 사용한 유리카제의 가교를 비교하였다.
prU-A를 100mM 인산 완충액(pH 8)에서 실온에서 2시간 동안 1000 당량의 비스-NHS-PEG(2000Da)와 반응시켜 가교한 후, 100mM 인산 완충액(pH 7.4)으로 투석하였다. 또한, prU-A는 1000 당량의 비스-Ald-PEG(2000Da)와 반응시키고, 환원제로 상기 기재된 바와 같이 100mM NaBH3CN을 사용하여 가교시켰다. 상기 기재된 절차에 따라 단백질 농도 및 효소 활성을 결정하고, 상기 기재된 절차에 따라 SDS-PAGE를 사용하여 가교 효율 및 변형 정도를 평가하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 비스-NHS-PEG(2000 Da) 및 비스-Ald-PEG(2000 Da)는 모두 SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이 prU-A의 효율적인 가교를 초래하였다. 가교된 prU-A는 주로 사량체 형태였으며, 가교되지 않은 종(140 kDa 미만)에 해당하는 밴드는 관찰되지 않았다. 여기에 추가로 나타낸 바와 같이, 비스-NHS-PEG를 사용한 변형은 비스-Ald-PEG를 사용한 변형보다 분자량이 적당히 낮았으며, 이는 비스-NHS-PEG가 prU-A에 부착되는 PEG 분자의 수가 더 적다는 것을 나타낸다.
비스-NHS-PEG(2000 Da) 및 비스-Ald-PEG(2000 Da) 모두를 사용하여 얻은 변형된 prU-A는 총 단백질 함량에 대한 단백질 활성의 비율로 결정된 초기 효소 활성의 각각 59%와 78%를 유지하였다(280 nm에서 OD로 측정).
이러한 결과는 알데하이드 작용기와 환원제를 사용하는 것이 도입되는 PEG 모이어티의 수 측면에서 유리카제의 가교에 특히 효과적이라는 것을 나타낸다.
실시예 6
면역원성에 대한 유리카제 변형의 영향
실시예 5에 기술된 절차에 따라 비스-NHS-PEG 및 비스-Ald-PEG에 의해 가교된 prU-A의 상대적인 면역원성을 동물 연구에서 테스트하였다. 변형된 prU-A의 샘플을 Imject™ 백반 보조제(alum adjuvant)와 1:1 비율로 혼합하고 6-8주령의 암컷 Sprague Dawley 쥐(그룹당 6마리)에 kg 당 1 mg(OD에 의해 결정됨)의 용량, 3주 간격으로 도 8A에 도시된 바와 같이 피하 주사하였다. 표시된 시점에서, 각 동물로부터 혈청을 수집하고 테스트 항목에 대한 역가(titer)를 ELISA로 측정하였다(각 동물에 대해 별도로).
도 8B에 나타낸 바와 같이, 비스-Ald-PEG(2000Da)에 의해 가교된 prU-A로의 면역화는 비스-NHS-PEG(2000Da)에 의해 가교된 prU-A보다 항체 역가가 상당히 더 낮았다. 거기에 추가로 나타낸 바와 같이, 반복 주사는 일반적으로 항체 역가를 증가시키는 결과를 가져왔다.
가교된 유리카제에 대해 형성된 항체의 성질은 경쟁 ELISA를 사용하여 조사하였다. 샘플을 비-변형 유리카제 또는 비스-NHS-PEG 또는 비스-Ald-PEG(2000 Da)에 의해 가교된 유리카제와 함께 사전-인큐베이션하고, 생성된 항체의 결합을 억제하는 경쟁자의 능력을 ELISA로 평가하였다.
도 9A 및 9B에 나타낸 바와 같이, 비스-NHS-PEG로 가교된 prU-A를 면역화하여 형성된 항체는 비변형 유리카제에 의해 억제되지 않았으며, 이는 이들이 PEG 모이어티를 인식한다는 것을 나타낸다 (도 9B); 반면, 비스-Ald-PEG로 가교된 prU-A를 면역화하여 형성된 항체는 핵심 단백질을 인식하는 경향을 보였다(도 9A).
종합하면, 상기 결과는 알데하이드기를 사용한 가교는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 기를 사용한 가교보다 가교된 유리카제의 면역원성을 더 효과적으로 감소시키며, NHS 기를 사용하면 연결 모이어티에 대한 더 많은 양의 항체가 형성된다는 것을 나타낸다.
면역원성에 대한 PEG 분자량과 유리카제 변이체의 영향을 추가로 평가하기 위해, prU-A 및 prU-C를 각각 2000 Da 또는 3400 Da 비스-Ald-PEG의 1000 당량을 사용하여 가교한 다음, 100mM 인산염 완충액(pH 8)으로 투석하고 고분자량 형태를 분리하기 위해 크기 배제 크로마토그래피(상기 재료 및 방법 섹션에 설명된 절차에 따라)를 수행하였다. 부착된 PEG 모이어티의 양은 MALDI 질량 분석법(상기 재료 및 방법 섹션에 설명된 절차에 따라)으로 평가하였다.
표 7에 나타낸 바와 같이, 가교된 prU-A보다 가교된 prU-C에 다소 더 많은 PEG 모이어티가 통합되었다.
이러한 결과는 prU-A에 비해 prU-C의 서열에 더 많은 양의 라이신 잔기가 있는 것과 일치한다.
비스-Ald-PEG(2000 Da 또는 3400 Da)와 가교된 유리카제(prU-A 또는 prU-C) 사량체 내 PEG 모이어티의 양
비스-Ald-PEG(2000) 비스-Ald-PEG(3400)
prU-A 38 34
prU-C 45 40
가교된 prU-A 및 prU-C를 Imject™ 백반 보조제와 1:1 비율로 혼합하고 3-4주 간격으로 kg당 1mg(OD에 따라 결정)의 용량으로 6-8주령 암컷 Sprague Dawley 쥐(그룹당 5마리)에 피하 주사하였다(도 8A에 도시된 것과 동일한 타임라인 사용). 표시된 시점에서, 혈청을 수집하고 각 동물의 역가를 ELISA로 측정하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 비스-Ald-PEG(3400 Da)와 가교된 prU-C는 가교된 prU-A 또는 2000 Da PEG와 가교된 prU-C와 비교하여 면역화 시 가장 낮은 항체 역가를 나타냈다.
이러한 결과는 prU-C가 prU-A보다 다소 덜 면역원성이고, 본원에 기술된 면역원성을 감소시키는 방법론이 상이한 유형의 유리카제에 사용될 수 있으며, 약 3400 Da의 PEG와의 가교가 면역원성을 감소시키는데 특히 효과적이라는 것을 나타낸다.
변형된 유리카제의 항원성은 인간 혈장에 이미 존재하는 항체에 의한 이의 인식 수준으로 평가되었다.
다양한 나이브(naive) 개인 환자(n = 102)의 인간 혈청 샘플을 ELISA(상기 재료 및 방법 섹션에서 설명된 바와 같이)를 사용하여 항-PEG 항체의 존재에 대해 테스트하였다. 분석은 prU-C250K의 2개의 PEG화 변이체(상기 기술된 절차에 따라 제조됨)를 사용하여 수행하였다: 비스-Ald-PEG(3400 Da)와 가교된 prU-C250K 및 단일작용성 10 kDa PEG로 PEG화된 prU-C250K(페글로티카제와 유사), 그리고 비교를 위해 비-변형 prU-C250K를 사용하였다. 키메라 cHu 3.3 인간 항-PEG IgG1 항체를 사용하여 표준 곡선을 생성하고 양성 대조군으로 사용하였다. 양성 항체 반응은 블랭크(blank) 대비 적어도 2의 OD 비율로 정의되었고, 양성 반응을 나타내는 환자에 대한 결과는 도 11에 제시되어 있다.
도 11 에 나타낸 바와 같이, 나이브 인간 혈액 샘플의 스크리닝은 테스트된 기증자의 102 명 중 15 명(15%)이 단일작용성 10 kDa PEG 로 변형된 유리카제를 인식하는 기존 항체를 보유하고 있는 반면, 102 명의 기증자 중 3명(3%)만이(이들 각각은 앞서 언급한 15 명의 기증자 그룹에 포함됨) 3400 Da PEG로 가교된 prU-C250K 를 인식하는 항체를 보유하고 있었고 이러한 항체의 역가는 상당히 낮았다는 것을 입증한다. 여기에 추가로 나타낸 바와 같이, 102명의 기증자 중 20명(20%)은 비-변형 prU-C250K를 인식하는 항체를 보유하고 있었지만, 이들 기증자 중 3400 Da PEG로 가교된 prU-C250K에 대한 항체를 보유한 기증자는 없었다.
이러한 결과는 PEG 가교제가 유리카제 단백질을 효율적으로 차폐하고, (페길화 유리카제에서 면역원성의 중요한 원천인) PEG 모이어티가 (약 3400 Da의) 비스-Ald-PEG로 가교될 때 10 kDa 단일작용성 PEG로 변형될 때(페글로티카제와 유사)보다 면역원성이 상당히 낮다는 것을 나타낸다.
혈장 안정성을 평가하기 위해, 3400 Da PEG로 가교된 prU-C250K를 2 μg/mL의 농도로 생체 외 37 ℃의 인간 혈장에서 4주 동안 인큐베이션하였다. 표시된 시점에서, 유리카제 활성을 상기 기재된 절차에 따라 분석하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 3400 Da PEG로 가교된 prU-C250K의 두 테스트된 배치(batch)는 28일 동안 인간 혈장 내에서 완전한 활성을 유지했다.
이러한 결과는 예시적으로 가교된 prU-C250K가 인간 혈장에서 매우 안정적임을 나타낸다.
컷오프가 30kDa인 Amicon® 시스템(15mL)을 사용하여 예시적인 유리카제(prU-C250K)를 4.4mg/mL로 농축하였다.
prU-C250K 40mg(10ml)을 100mM 인산염 완충액(pH 8) 9.86ml에 희석하고, 200mM DTT 물 50μl, 비스-Ald-PEG 1006mg(1000 몰 당량)(3400 Da), 및 에탄올 중 500mM 2-피콜린 보란 복합체 1ml로 형성된 반응 혼합물에 첨가하여 최종 농도가 2mg/mL 단백질 및 25mM 2-피콜린 보란 복합체가 되도록 하였다. 반응은 실온에서 17시간 동안 부드럽게 진탕하여 혼합하였다. 반응 후, 고분자량(HMW) 종을 제거하기 위해 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 5% 미만의 HMW 종을 함유한 분획을 결합하고, 100mM 인산염 완충액(pH 8)으로 투석한 후 1.5mg/mL(OD에 따라 결정됨)로 농축하였다.
가교된 prU-C250K와 비-변형 prU-C250K를 각각 0.22μm 필터를 사용하여 멸균하고, 분주하여 -20℃에서 보관하였다. 농도 및 활성은 상기 설명된 대로 측정하였다. MALDI 질량 분석법에 의해 결정된 바와 같이, 유리카제 사량체당 PEG 모이어티 수는 약 37개였다. 고분자량 종(변형된 팔량체)의 비율은 분석적 크기 배제 크로마토그래피로 측정한 결과 약 2%였다.
표준 절차에 따라 내독소(<5 EU/ml)가 없음을 확인했으며, 단백질 면역원성의 차폐 정도를 경쟁 ELISA로 측정하였다.
테스트된 유리카제를 12마리의 6-8주령 암컷 Sprague Dawley 쥐에 10 U/kg(가교된 prU-C250K의 경우 kg당 1.35 mg(OD에 의해 결정됨) 및 비-변형 prU-C250K의 경우 kg당 1.09 mg(OD에 의해 결정됨))의 투여량을 2주 간격으로(주사 #1-5) 정맥 주사하였다; 그 후 4주 간격으로, 가교된 prU-C250K가 도 13A에 도시된 바와 같이 두 그룹 모두에 주사되었다(주사 #6). 각 그룹에서, 혈청을 수집하고 표시된 시점에서 역가를 측정하였다.
도 13B에 나타낸 바와 같이, 비-변형 prU-C250K의 5회 주사 후, 6마리의 테스트 동물 중 4마리에서 항- prU-C250K 역가의 증가가 관찰되었다.
대조적으로, 3400 Da PEG로 가교된 prU-C250K의 6회 IV 주사 후, 모든 테스트 동물에서 항-prU-C250K-3400 역가는 1:50 미만이었다(데이터는 표시되지 않음).
이러한 결과는 예시적인 PEG 모이어티와의 가교가 유리카제 면역원성을 상당히 감소시킨다는 추가적 확인을 제공한다.
실시예 7
반복 투여 시 약동학에 대한 유리카제 가교의 영향
가교된 유리카제의 약동학에 대한 반복 주사의 효과를 평가하기 위해, 비스-Ald-PEG(3400 Da)로 가교된 prU-C250K를 상기 실시예 6에 기재된 것과 동일한 절차에 따라 쥐에 정맥 주사하였다. 가교된 prU-C250K의 반감기(T1/2) 및 곡선 아래 면적(AUC)은 첫 번째 주사 후와 여섯 번째 주사 후 ELISA 또는 활성 분석으로 결정되었다.
도 14A-14D에 나타낸 바와 같이, 첫 번째 주사 후 가교된 prU-C250K의 T1/2는 ELISA에 의해 측정한 결과 54시간, 활성 분석에 의해 측정한 결과 64.8시간이었다; 반면, 6회 주사 후 T1/2는 ELISA로 측정한 결과 70.5시간, 활성 분석으로 측정한 결과 68.4시간이었다.
여기에 추가로 나타낸 바와 같이, 첫 번째 주사 후 가교된 prU-C250K의 AUC는 ELISA로 측정한 결과 61.07 mg*분/ml, 활성 분석으로 측정한 결과 65.95 mg*분/ml인 반면, 6회 주사 후 AUC는 ELISA로 측정한 결과 70.5 mg*분/ml, 활성 분석으로 측정한 결과 58.5 mg*분/ml이었다.
반면, 비-변형 prU-C250K의 T1/2는 1시간 미만이었다(데이터는 표시되지 않음).
이러한 결과는 유리카제를 가교하면 혈장 내 유리카제 반감기가 상당히 증가하여 지속적인 치료 효과와 비교적 드문 간격으로 투여할 수 있음을 나타낸다.
또한 이러한 결과는 가교된 prU-C250K에 대한 반복적 노출이 생체 내에서 변형된 단백질의 상대적으로 긴 반감기가 단축되지 않았으며, 이는 장기간 치료 후에도 변형된 단백질의 낮은 면역원성과 지속적인 치료 효과가 유지될 수 있음을 나타낸다.
실시예 8
예시적인 가교된 유리카제 대 페글로티카제의 비교
예시적인 가교된 유리카제(bis-Ald-PEG(3400 Da)로 가교된 prU-C250K) 및 페글로티카제의 효소 활성을 상기 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 유리카제 검정 및 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 분석을 사용하여 비교하였다.
도 15와 표 8에 표시된 바와 같이, 가교된 유리카제는 페글로티카제보다 상당히 높은 특이 활성(specific activity), kcat 및 Vmax를 나타내었다.
페글로티카제 및 예시적인 가교된 유리카제에 대한 효소 활성 매개변수
KM
(μM)		 Vmax
(μmol/분)		 kcat
(μmol/분)		 특이 활성
(U/mg)
페글로티카제 30 ± 4 7·10-6 ± 1.6·10-6 37.4 1.1
가교된 유리카제 86 ± 9 33·10-6 ± 1.6·10-6 187.0 5.5
이러한 결과는 높은 요산 농도(예: 임상적으로 요산과 관련된 농도 범위로 예상되는 200-400 μM)에서 효소 반응 속도가 kcat(및 Vmax)에 대략적으로 비례할 때 가교된 유리카제는 페글로티카제보다 약 5배 더 효과적이라는 것을 의미한다; 30 μM(페글로티카제의 KM)에 가까운 낮은 농도에서는, 가교된 유리카제가 페글로티카제보다 2배 이상 효과적이며; 매우 낮은 요산 농도에서도 효소 반응 속도가 대략적으로 kcat/KM에 비례할 때 가교된 유리카제는 페글로티카제보다 약간 더 효과적이다.
가교된 유리카제와 페글로티카제의 생체 내 효능은 1 mg/kg 용량으로 암컷 Sprague Dawley 쥐에게 정맥 주사하여 비교하였다. 혈장 샘플은 첫 번째 주사 후(나이브 약동학) 및 3주 간격으로 반복된 4회 주사 후(반복 약동학) 수집되었고; 혈장 반감기는 각 시점에서 활성 효소 농도를 결정하여 계산되었다.
도 16-18에 나타낸 바와 같이, 예시적인 가교된 유리카제는 단일 투여(도 16 및 18) 및 반복(4회) 투여(도 17 및 18) 후 모두 페글로티카제보다 더 긴 혈장 반감기를 나타냈다.
종합하면, 상기 결과는 본원에 기재된 가교된 유리카제의 효소 활성이 시험관 내 및 생체 내 모두에서 페글로티카제의 효소 활성과 유리하게 비교된다는 것을 나타낸다.
본 발명이 이의 특정 구현예와 관련하여 설명되었지만, 많은 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것임이 분명하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 정신 및 넓은 범위에 속하는 이러한 모든 대안, 수정 및 변형을 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다는 것을 참조할 때 구체적이고 개별적으로 언급된 것처럼, 명세서 전체에 참조로 통합되어야 한다는 것이 출원인의 의도이다. 또한, 본 출원에서의 참조의 인용 또는 식별은 그러한 참조가 본 발명의 선행 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 섹션 제목이 사용된 범위 내에서, 이것이 반드시 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 이 출원의 임의의 우선권 문서(들)는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Protalix Ltd. RUDERFER, Ilya NATAF, Yakir ARVATZ, Gil HANANIA, Uri ARIEL, Tamar ROZEN, Shelly HAYON, Yael <120> MODIFIED URICASE AND USES THEREOF <130> 89419 <150> US 63/108,890 <151> 2020-11-03 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 303 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 1 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C250K point mutation of SEQ ID NO: 1 <400> 2 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Lys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 3 <211> 308 <212> PRT <213> Arthrobacter gangotriensis <400> 3 Met Thr Thr Phe Ala Thr Lys Thr Thr Thr Asp Thr Lys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Ile Thr 20 25 30 Arg Asp Thr Asp Arg His Gln Ile Glu Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln 35 40 45 Leu His Gly Asp Phe Leu Ala Ala His Ile Asp Gly Asp Asn Ala His 50 55 60 Val Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Gly Leu Ala Lys 65 70 75 80 Asp Gly Val Gly Ser Pro Glu Glu Phe Leu Ala Arg Leu Gly Gln His 85 90 95 Phe Thr Gly Glu Phe Asp Trp Val Ser Gly Gly Arg Trp Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Tyr Phe Trp Asp Arg Ile Gln Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg 115 120 125 Asn Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Arg Asn Gly Glu 130 135 140 Thr Ser Val Leu Ala Gly Ile Gln Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ser Glu Phe Arg Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln 165 170 175 Glu Thr Asp Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Thr Ala Arg Trp Arg 180 185 190 Tyr Asn Ser Glu Thr Ile Glu Ala Ser Gly Leu Asp Phe Asn Ala Val 195 200 205 Tyr Ala Ser Val Arg Glu Leu Leu Leu Ala Gly Phe Ser Ala Thr His 210 215 220 Ser Tyr Ala Leu Gln Gln Thr Met Phe Glu Met Gly Lys Ala Val Leu 225 230 235 240 Glu Ala His Pro Glu Ile Glu Glu Ile Lys Phe Ser Leu Pro Asn Lys 245 250 255 His His Phe Leu Val Asp Leu Thr Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn 260 265 270 Glu Val Phe Phe Ala Ala Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr 275 280 285 Ile Thr Arg Glu Gly Val Pro Ala Asn His Pro Ile Trp Glu Asn Thr 290 295 300 Pro Gly Phe Cys 305 <210> 4 <211> 302 <212> PRT <213> Aspergillus flavus <400> 4 Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val 1 5 10 15 Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu 20 25 30 Met Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr 35 40 45 Lys Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr 50 55 60 Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe 65 70 75 80 Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His 85 90 95 Ala Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile 100 105 110 Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys 115 120 125 Arg Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe 145 150 155 160 Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp 165 170 175 Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe 180 185 190 Ser Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr 195 200 205 Trp Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn 210 215 220 Ser Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu 225 230 235 240 Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys 245 250 255 His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr 260 265 270 Gly Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu 275 280 285 Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300

Claims (49)

  1. 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 이작용성 연결 모이어티로 가교된 유리카제 (uricase) 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 유리카제로서, 상기 이작용성 연결 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 4 kDa 범위인 변형된 유리카제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 이작용성 연결 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 3.5 kDa 범위인 변형된 유리카제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 이작용성 연결 모이어티는 상기 유리카제 폴리펩타이드 내의 아민기의 질소 원자에 공유 결합된 알킬렌기를 포함하는 변형된 유리카제.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 아민기는 라이신 잔기 측쇄에 포함되는 변형된 유리카제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유리카제 폴리펩타이드는 상기 이작용성 연결 모이어티의 평균 적어도 8개에 부착되는 변형된 유리카제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 유리카제 내의 라이신 잔기 측쇄의 적어도 30%는 상기 적어도 하나의 이작용성 연결 모이어티에 공유 결합되는 변형된 유리카제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이작용성 연결 모이어티는 하기 화학식 I을 갖는 변형된 유리카제:
    -CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-CH2-
    화학식 I
    여기서:
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 탄화수소 모이어티이거나 부재하고;
    m은 2 내지 10 범위의 정수이며; 및
    n은 2 내지 1000 범위의 정수이다.
  8. 제7항에 있어서,
    n은 30 내지 100 범위인 변형된 유리카제.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    L1 및 L2 중 적어도 하나는 비치환된 알킬렌인 변형된 유리카제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티인 변형된 유리카제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    가교된 사량체 형태인 변형된 유리카제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩타이드 및 이들의 상동체를 포함하는 변형된 유리카제.
  13. 제12항에 있어서,
    SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩타이드 및 이들의 상동체를 포함하는 변형된 유리카제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유리카제 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드인 변형된 유리카제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 유리카제 폴리펩타이드는 식물 재조합 폴리펩타이드인 변형된 유리카제.
  16. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 갖는 복수의 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 유리카제로서, 상기 폴리펩타이드는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 이작용성 연결 모이어티에 의해 가교된 것인 변형된 유리카제.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 이작용성 연결 모이어티는 상기 폴리펩타이드 내의 아민기의 질소 원자에 공유 결합된 알킬렌기를 포함하는 변형된 유리카제.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 아민기는 라이신 잔기 측쇄에 포함되는 변형된 유리카제.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 상기 폴리펩타이드는 상기 이작용성 연결 모이어티의 평균 적어도 8개에 부착되는 변형된 유리카제.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 유리카제 내의 라이신 잔기 측쇄의 적어도 30%는 상기 적어도 하나의 이작용성 연결 모이어티에 공유 결합되는 변형된 유리카제.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이작용성 연결 모이어티는 하기 화학식 I을 갖는 변형된 유리카제:
    -CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-CH2-
    화학식 I
    여기서:
    L1 및 L2는 각각 탄화수소 모이어티이거나 부재하고;
    m은 2 내지 10 범위의 정수이며; 및
    n은 2 내지 1000 범위의 정수이다.
  22. 제21항에 있어서,
    n은 30 내지 100의 범위인 변형된 유리카제.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    L1 및 L2 중 적어도 하나, 또는 둘 다는 비치환된 알킬렌인 변형된 유리카제.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티인 변형된 유리카제.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이작용성 연결 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 4 kDa 범위인 변형된 유리카제.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 이작용성 연결 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 3.5 kDa 범위인 변형된 유리카제.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    사량체 형태인 변형된 유리카제.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드인 변형된 유리카제.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 식물 재조합 폴리펩타이드인 변형된 유리카제.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    쥐(rat)에서의 혈장 반감기가 적어도 50시간인 것을 특징으로 하는 변형된 유리카제.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    유리카제 활성이 유리한 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 변형된 유리카제.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    과도한 요산(uric acid) 수준과 관련된 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 변형된 유리카제.
  33. 제31항 또는 제32항에 따른 사용을 위한 변형된 유리카제로서,
    상기 질병 또는 장애는 통풍, 당뇨병, 신장 결석, 종양 용해 증후군, 출혈성 쇼크, 말라리아, 알레르기성 염증, 신장 기능 장애, 바이러스성 감염, 급성 위장염, 태반 염증, 무균 염증, 임신 합병증, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 위장관 감염 및 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 변형된 유리카제.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 변형된 유리카제로서,
    상기 치료는 적어도 1주 간격으로 변형된 유리카제를 투여하는 것을 포함하는 변형된 유리카제.
  35. 제34항에 따른 사용을 위한 변형된 유리카제로서,
    상기 치료는 적어도 2개월의 간격으로 변형된 유리카제를 투여하는 것을 포함하는 변형된 유리카제.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 변형된 유리카제로서,
    상기 치료는 변형된 유리카제를 월 8 mg 이하의 용량으로 투여하는 것을 포함하는 변형된 유리카제.
  37. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 갖는 폴리펩타이드.
  38. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변형된 유리카제를 제조하는 방법으로서,
    (a) 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 포함하고, 적어도 2개의 알데하이드기를 포함하는 가교제와 상기 폴리펩타이드를 접촉시켜, 상기 폴리펩타이드와 상기 가교제의 접합체를 얻는 단계; 및
    (b) 상기 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 환원제는 피콜린 보란 착물(picoline borane complex) 및 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    상기 가교제는 하기 화학식 II를 갖는, 방법:
    HC(=O)-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-C(=O)H
    화학식 II
    여기서:
    L1 및 L2는 각각 탄화수소 모이어티이고;
    m은 2 내지 10 범위의 정수이며; 및
    n은 2 내지 1000 범위의 정수이다.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가교제의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 4 kDa 범위인 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드의 사량체 형태를 상기 가교제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가교제 대 상기 폴리펩타이드의 몰비는 100:1 내지 10,000:1 범위인 방법.
  44. 배지 중의 요산 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 배지를 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변형된 유리카제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 배지는 이를 필요로 하는 대상체의 조직이고, 상기 변형된 유리카제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 대상체는 통풍, 당뇨병, 신장 결석, 종양 용해 증후군, 출혈성 쇼크, 말라리아, 알레르기성 염증, 신장 기능 장애, 바이러스성 감염, 급성 위장염, 태반 염증, 무균 염증, 임신 합병증, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 위장관 감염 및 레쉬-니한 증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질병 또는 장애를 앓고 있는 것인, 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서,
    상기 투여는 적어도 1주 간격으로 수행되는 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 투여는 적어도 2개월의 간격으로 수행되는 방법.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 투여되는 상기 유리카제의 용량은 월 8 mg 이하인 방법.
KR1020237018900A 2020-11-03 2021-11-03 변형된 유리카제(uricase) 및 이의 용도 KR20230110281A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063108890P 2020-11-03 2020-11-03
US63/108,890 2020-11-03
PCT/IL2021/051305 WO2022097141A1 (en) 2020-11-03 2021-11-03 Modified uricase and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230110281A true KR20230110281A (ko) 2023-07-21

Family

ID=78829449

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237018900A KR20230110281A (ko) 2020-11-03 2021-11-03 변형된 유리카제(uricase) 및 이의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240002814A1 (ko)
EP (1) EP4240423A1 (ko)
JP (1) JP2023548496A (ko)
KR (1) KR20230110281A (ko)
CN (1) CN117098559A (ko)
CA (1) CA3197108A1 (ko)
IL (1) IL302628A (ko)
WO (1) WO2022097141A1 (ko)

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
AU746461B2 (en) 1997-05-14 2002-05-02 Aventis Pharmaceuticals Inc. Peptide parathyroid hormone analogs
JP5183836B2 (ja) 1998-08-06 2013-04-17 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用
EP2158923B1 (en) * 1998-08-06 2013-02-27 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
US6913915B2 (en) 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
PL3321359T3 (pl) 2005-04-11 2021-06-28 Horizon Pharma Rheumatology Llc Wariantowe postacie oksydazy moczanowej i ich zastosowanie
US20080159976A1 (en) 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
WO2011107992A2 (en) 2010-03-02 2011-09-09 Protalix Ltd. Multimeric forms of therapeutic proteins and uses thereof
CN102933707B (zh) 2010-03-02 2015-09-30 普罗塔里克斯有限公司 稳定的α-半乳糖苷酶及其用途
CN102634492B (zh) * 2011-02-14 2015-06-10 重庆富进生物医药有限公司 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用
US11098289B2 (en) 2015-05-15 2021-08-24 Medimmune, Llc Uricase sequences and methods of treatment
CN106226651B (zh) 2016-07-12 2019-08-23 国电南瑞科技股份有限公司 一种架空型故障指示定位终端及对地电压测量方法
US20200308534A1 (en) 2017-07-07 2020-10-01 Allena Pharmaceuticals, Inc. Recombinant uricase enzyme
US20190309269A1 (en) * 2018-03-20 2019-10-10 Rubius Therapeutics, Inc. Therapeutic cell systems and methods for treating hyperuricemia and gout

Also Published As

Publication number Publication date
IL302628A (en) 2023-07-01
WO2022097141A1 (en) 2022-05-12
JP2023548496A (ja) 2023-11-17
EP4240423A1 (en) 2023-09-13
US20240002814A1 (en) 2024-01-04
CN117098559A (zh) 2023-11-21
CA3197108A1 (en) 2022-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2005254736B2 (en) Oligomeric peptides and their use for the treatment of HIV infections
US9409961B2 (en) Cell penetrating peptides to target EIF4E
US20180002376A1 (en) Anti-microbial peptides and uses of same
CN108395471B (zh) 抑制MERS-CoV感染的多肽
US20210162025A1 (en) Variants of tace pro-domain as tnf-a inhibitor and their medical use
Nicoll et al. Nucleophilic and general acid catalysis at physiological pH by a designed miniature esterase
KR100614714B1 (ko) ｇｐ41 단편의 아세틸화
US20240002814A1 (en) Modified uricase and uses thereof
US20060008464A1 (en) Histone conjugates and uses thereof
US20200362018A1 (en) Inhibitors of the 20s proteasome
EP3197913B1 (en) Alpha-1 anti-trypsin for treating liver diseases
WO2013134249A1 (en) Adipose tissue targeted peptides
US10487115B2 (en) Proteinaceous compounds and uses therefor
US20230416707A1 (en) Long-acting dnase
WO2013114363A2 (en) Antimicrobial agents
NZ540582A (en) Chimaeric protein containing cysteine protease of liver fluke fused to hepatitis B core protein or ubiquitin, plants expressing said protein, and uses thereof as vaccine
JP2011177135A (ja) 酵母によるｎ３６結合ペプチドの製造方法