CN117098559A - 修饰的尿酸酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了修饰的尿酸酶，以及通过使培养基与修饰的尿酸酶接触来降低尿酸水平的方法。修饰的尿酸酶包含通过至少一个包含聚(亚烷基二醇)部分的双功能连接部分交联的尿酸酶多肽。双功能连接部分的分子量为约1.5kDa至约4kDa，和/或修饰的尿酸酶包含多个具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽。进一步描述了具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽。还描述了制备修饰的尿酸酶的方法，包括使多肽与包含聚(亚烷基二醇)部分和至少两个醛基的交联剂接触，以获得缀合物；以及使所述缀合物与还原剂接触。

Description

修饰的尿酸酶及其用途
相关申请
本申请要求2020年11月3日提交的申请号为63/108,890的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
序列表声明
与本申请同时提交的、创建于2021年10月31日文件名为89419.txt的ASCll文件包括11,072字节，该文件通过引用并入本文。
本发明的技术领域与背景技术
本公开在其一些实施方式中涉及治疗，更具体地，但不排他地，涉及尿酸酶的新形式及其在例如降低尿酸水平中的用途。
尿酸是嘌呤核苷酸代谢分解的产物。高血尿酸浓度(高尿酸血症(hyperuricemia))可导致痛风和/或肾结石，高尿酸水平与其它医学病症相关，包括失血性休克(hemorrhagic shock)[D'Alessandro等人，转化医学杂志(J Transl Med)2015,13:253]；疟疾(malaria)[Gallego-Delgado等人，当代风湿病学报告(Curr Rheumatol Rep)2014,16:401]；变应性哮喘(allergic asthma)[Kool等人，免疫力(Immunity)2011,34:P527-P540]；创伤性脑损伤(traumatic brain injury)[Liu等人，国际医疗科学期刊(IntJ Med Sci)2018,15:1072-1082]；肾功能障碍(renal dysfunction)和急性胃肠炎(acutegastroenteritis)[Matsuo等人，SciRep 2016，6：31003]；多发性硬化(multiplesclerosis)[Piancone等人，免疫学前沿(Front Immunol)2018,9:983]；炎症性肠病(inflammatory bowel disease)[Crane&Mongiardo,免疫学研究(Immunol Invest)2014,43:255-266]；胃肠感染(gastrointestinal infection)[Crane等人，感染与免疫(InfectImmun)2016,84:976-988]；无菌性炎症(sterile inflammation)和妊娠并发症(pregnancycomplications)[Nadeau-Vallee等人，生殖(Reproduction)2016,152:R277-R292]。
通常，痛风的一线治疗(first-line treatment)是治疗症状，例如使用甾体(steroidal)或非甾体(non-steroidal)抗炎药。其他药物包括别嘌呤醇(allopurinol)和非布司他(febuxostat)；黄嘌呤氧化酶(其产生尿酸)的抑制剂；以及丙磺舒、雷西那德(lesinurad)和苯溴马隆(benzbromarone)，它们被认为可以抑制肾脏对尿酸的重吸收。
尿酸酶(uricase)，在本领域中也被称为尿酸氧化酶，是一种催化尿酸氧化(消耗O2并产生H2O2)为5-羟基异脲酸(5-hydroxyisourate)的酶，其在大多数动物、植物和细菌中被水解成尿囊素。然而，人类(以及其他几种类人猿)不存在尿酸酶，因此人类特别容易受到血液中尿酸浓度高的影响。
拉布立酶(rasburicase)(商品名为)是从黄曲霉(Aspergillus flavus)克隆的四聚体尿酸酶；并被批准在美国和欧洲用于在接受癌症化疗的对象中预防和治疗肿瘤溶解综合征(tumor lysis syndrome)。已经报道了拉布立酶治疗痛风的核准标示外使用(off-label label use)[风湿性疾病杂志(J Rheumatol)2007,34:2093-2098]。拉布立酶的半衰期为6至21小时，必须每天经由静脉输注给药。
普瑞凯希(pegloticase)(商品名为)是一种聚乙二醇化的(PEGylated)四聚体猪-狒狒嵌合尿酸酶，已被批准用于治疗难治性痛风。在四种单体的每一种中，30个赖氨酸残基中平均有10个被10kDa的PEG链缀合。
作为一种非天然存在于人体中的蛋白质，尿酸酶具有很高的免疫原性。过敏反应是拉布立酶和普瑞凯希的潜在严重副作用。尽管普瑞凯希的聚乙二醇部分(moieties)可以降低对尿酸酶骨架的免疫应答，但是聚乙二醇(PEG)部分本身可以作为抗体的靶标[Zhang等人，控制释放杂志(JControl Release)2016,244:184-193；Hershfield等人，关节炎研究和治疗(Arthritis Res Ther)2014,16:R63；Ganson等人，关节炎研究和治疗(ArthritisRes Ther)2006,8:R12]。
在普瑞凯希的3期临床试验中，26％的患者出现输注反应，6.5％的患者出现以过敏反应为特征的反应[Baraf等人，关节炎研究和治疗(Arthritis Res Ther)2013,15:R137；Strand等人，风湿性疾病杂志(J Rheumatol)2012,39:1450-1457]。
在长达六个月的2期和3期试验中，超过80％的患者在某个时间点检测(使用不同的方法)到了普瑞凯希抗体；最高效价(titer)与疗效丧失和输液反应有关[Sundy等人，美国医学协会杂志(JAMA)2011,306:711-720；Sundy等人，关节炎和风湿病(ArthritisRheum)2008,58:2882-2891]。
公开号为WO00/07629的国际专利申请描述了与聚乙二醇(PEG)共价结合(coupled)的尿酸酶，每个尿酸酶亚单元(subunit)平均具有2至10个聚乙二醇(PEG)链，平均聚乙二醇(PEG)分子量在约5kDa和100kDa之间。
公开号为WO2011/107992的国际专利申请描述了多聚体蛋白质结构，其包含治疗性蛋白质的单体，例如TNF-α、黄体刺激素(luteinizing hormone)、免疫球蛋白、TNF-α受体、CTLA-4、尿酸氧化酶、VEGF、PDGF、VEGF受体、PDGF受体、白细胞介素-17(interleukin-17)或其片段，所述单体经由连接部分(linking moiety)彼此共价连接。
Koyama等人[生物化学杂志(J Biochem)1996,120:969-973]描述了产朊假丝酵母尿酸酶(Candida utilis uricase)及其突变体(其中半胱氨酸残基被丝氨酸残基替代)，得出的结论是Cys168是4个半胱氨酸残基中唯一参与酶活性的残基之一。
Chua等人[内科学年鉴(ANN Intern Med)1988,109:114-117]描述了用单功能(甲氧基封端的)聚乙二醇(PEG)修饰的球节细菌(Arthrobacter protoformiae)尿酸酶，并报道了其在给药后的三周内不诱导抗体产生。
其他背景技术包括：Hershfield等人(2009)[“聚乙二醇化哺乳动物尿酸氧化酶治疗难治性痛风的研究进展”，载于：Veronese F.M.(编辑)聚乙二醇化蛋白质药物：基础科学和临床应用。药物治疗的里程碑。(PEGylated Protein Drugs:Basic Science andClinical Applications.Milestones in Drug Therapy.)Basel出版社]；Nyborg等人[公共图书馆综合期刊(PLoS ONE)2016,11:e0167935；以及Veronese[生物材料(Biomaterials)2001,22:405-417]；美国专利US4,179,337、US6,913,915、US8,188,224和US9,885,024；公开号为US2007/0274977和US2008/0159976的美国专利申请；以及公开号为WO2011/107990、WO2011/107991、WO2016/187026、WO2018/010369和WO2019/010369的国际专利申请。
发明内容
根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了一种修饰的尿酸酶，包含尿酸酶多肽，所述尿酸酶多肽通过至少一个包含聚(亚烷基二醇)部分的双功能连接部分交联，其中所述双功能连接部分的分子量在约1.5kDa至约4kDa的范围内。
根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了一种包含多个多肽的修饰的尿酸酶，所述多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，其中所述多肽通过至少一个包含聚(亚烷基二醇)部分的双功能连接部分交联。
根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽。
根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了一种制备根据本文描述的涉及修饰的尿酸酶的任一实施方式的修饰的尿酸酶的方法，所述方法包括：
(a)使所述多肽与包含聚(亚烷基二醇)部分的交联剂接触，以获得所述多肽和所述交联剂的缀合物，所述交联剂包含至少两个醛基；和
(b)使所述缀合物与还原剂接触。
根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了一种降低培养基中尿酸水平的方法，所述方法包括使所述培养基与根据本文描述的涉及修饰的尿酸酶的任一相应实施方式的修饰的尿酸酶接触。
根据本公开的一些实施方式，所述多肽是重组多肽。
根据本公开的任何一些实施方式，所述多肽是植物重组多肽。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，双功能连接部分的分子量在约1.5kDa至约4kDa的范围内。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，双功能连接部分的分子量在约2kDa至约3.5kDa的范围内。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，双功能连接部分包含与尿酸酶多肽中的胺基的氮原子共价连接的亚烷基。
根据本公开涉及多肽中的胺基的任何一些实施方式，所述胺基包含在赖氨酸残基侧链中。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述尿酸酶多肽连接到平均至少8个双功能连接部分上。
根据本公开涉及多个多肽的任何一些实施方式，每个多肽连接到平均至少8个双功能连接部分上。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述修饰的尿酸酶中至少30％的赖氨酸残基侧链共价连接于至少一个双功能连接部分。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述双功能连接部分具有式I：
-CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-CH2-
式I
其中：
L1和L2各自独立地是烃部分或不存在L1和L2；
m是2至10范围内的整数；并且
n是在2至1000范围内的整数。
根据本公开涉及式I的任何一些实施方式，n在30至100的范围内。
根据本公开涉及式I的任何一些实施方式，L1和L2中的至少一个或两个是未取代的亚烷基。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述聚(亚烷基二醇)部分是聚乙二醇部分。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述修饰的尿酸酶是四聚体的形式。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述修饰的尿酸酶是交联四聚体的形式。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述修饰的尿酸酶包含至少一种多肽及其同源物(homologs)，所述多肽具有选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所组成的组的氨基酸序列。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述修饰的尿酸酶包含至少一种多肽及其同源物(homologs)，所述多肽具有选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所组成的组的氨基酸序列。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述修饰的尿酸酶的特征是大鼠的血浆半衰期至少为50小时。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述修饰的尿酸酶用于治疗其中尿酸酶活性有益的疾病(disease)或病症(disorder)的用途。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述修饰的尿酸酶用于治疗与过多尿酸水平相关的疾病或病症的用途。
根据本公开涉及修饰的尿酸酶的任何一些实施方式，所述疾病或病症选自由以下所组成的组：痛风、糖尿病、肾结石、肿瘤溶解综合征(tumor lysis syndrome)、出血性休克(hemorrhagic shock)、疟疾(malaria)、变应性炎症(allergic inflammation)、肾功能障碍、病毒感染(viral infection)、急性胃肠炎、胎盘炎症(placental inflammation)、无菌性炎症、妊娠并发症、多发性硬化、炎症性肠病、胃肠感染，以及莱施-奈恩综合症(Lesch-Nyhan syndrome)。
根据本公开涉及治疗的任何一些实施方式，所述治疗包括以至少一周的间隔施用所述修饰的尿酸酶。
根据本公开涉及治疗的任何一些实施方式，所述治疗包括以至少两个月的间隔施用所述修饰的尿酸酶。
根据本公开涉及治疗的任何一些实施方式，所述治疗包括以每月不超过8mg的剂量施用所述修饰的尿酸酶。
根据本公开涉及方法的任何一些实施方式，所述还原剂选自甲基吡啶硼烷络合物和氰基硼氢化物。
根据本公开涉及方法的任何一些实施方式，所述交联剂具有式II：
HC(＝O)-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-C(＝O)H
式II
其中：
L1和L2各自是烃部分；
m是2至10范围内的整数；并且
n是2至1000范围内的整数。
根据本公开涉及方法的任何一些实施方式，所述交联剂的分子量在约1.5kDa至约4kDa的范围内。
根据本公开涉及方法的任何一些实施方式，所述方法包括使四聚形式的多肽与交联剂接触。
根据本公开涉及方法的任何一些实施方式，所述交联剂与所述多肽的摩尔比在100:1至10,000:1的范围内。
根据本公开涉及方法的任何一些实施方式，所述培养基是有需要的对象的组织，所述方法包括向所述对象施用所述修饰的尿酸酶。
根据本公开涉及向对象给药的任何一些实施方式，所述对象患有选自由以下所组成的组的疾病或病症：痛风、糖尿病、肾结石、肿瘤溶解综合征、出血性休克、疟疾、变应性炎症、肾功能障碍、病毒感染、急性胃肠炎、胎盘炎症、无菌性炎症、妊娠并发症、多发性硬化、炎症性肠病、胃肠感染，以及莱施-奈恩综合症。
根据本公开涉及向对象给药的任何一些实施方式，以至少一周的间隔进行给药。
根据本公开涉及向对象给药的任何一些实施方式，以至少两个月的间隔进行给药。
根据本公开涉及向对象给药的任何一些实施方式，施用于对象的尿酸酶的剂量不超过每月8mg。
除非另有限定，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本公开的实施方式的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的方法和材料，但是下面描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书(包括限定)为准。此外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意味着必须是限制性的。
附图简要说明
本文通过示例的方式参考附图描述了本公开的一些实施方式。现在详细地具体参考附图，需要强调的是，所示的细节是示例性的，并且是为了说明性地讨论本公开的实施方式。在这点上，结合附图所作的描述使得本领域技术人员清楚如何实施本公开的实施方式。
在附图中：
图1示出了描述根据本公开的一些实施方式的修饰的尿酸酶的方案；以及通过使尿酸酶与含醛的交联剂和还原剂接触来制备根据本公开的一些实施方式的这种修饰的尿酸酶的方法。
图2示出了在25mM Tris pH 8.4(估计的分子量值在中间示出)中浓度为0.3mg/mL(通过光密度测定)的冷冻/解冻(freeze/thaw，Fr/Th)循环之前(-)和之后(+)，植物重组野生型念珠菌尿酸酶(plant recombinant wild-type Candida uricase，Pru-C)和具有C250K突变的植物重组野生型念珠菌尿酸酶(Pru-C250K)的SDS-PAGE分析(在变性条件下)的凝胶图像；尿酸酶相关的高分子量结构(由多个亚单位如二聚体和四聚体形成)由左边的括号表示。
图3呈现了示出尿酸酶变体(Pru-A、Pru-C、Pru-C250K和Pru-G)的酶活性(归一化至t＝0时的活性)作为在人类血浆(37℃下，2μg/mL尿酸酶)中温育后随时间变化的函数并归一化至t＝0时的活性的图。
图4呈现了示出未修饰的prU-C以及分别与具有1000Da、2000Da、5000Da或10000DaPEG的PEG双醛(Bis PEG ALD)交联的prU-C的SDS-PAGE分析的凝胶图像(分子量标志显示在右侧)。
图5呈现了示出未修饰的prU-A(泳道标记为“-”)以及分别与具有600Da、2000Da、3400Da、5000Da或10000Da PEG的PEG双醛(bis-Ald-PEG)交联的prU-A的SDS-PAGE分析的凝胶图像(分子量标志显示在右侧)。
图6呈现了示出未修饰的prU-G以及分别与200或1000当量的bis-Ald-PEG(2000Da、3400Da或5000Da PEG)交联的prU-G的SDS-PAGE分析的凝胶图像(分子量标志显示在右侧)。
图7呈现了示出未修饰的prU-A以及与1000当量的具有醛(aldehyde，ALD)或N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)功能团的双功能2000Da PEG交联的Pru-A的SDS-PAGE分析的凝胶图像(分子量标志显示在左侧)。
图8A和8B呈现了由2000Da bis-Ald PEG或2000Da bis-NHS PEG交联的prU-A和明矾佐剂免疫大鼠的方案(图8A)(上面的箭头表示免疫的天数，下面的箭头表示血清收集的天数)，并示出了根据图8A中的时间线，用与bis-Ald-PEG(大鼠7-12)或bis-NHS-PEG(大鼠13-18)交联的prU-A免疫的大鼠中针对测试蛋白的抗体效价柱状图，其中每只动物的三个柱表示第30天(左柱)、第50天(中柱)和第72天(右柱)的抗体效价(图8B)。
图9A和9B呈现了使用竞争性ELISA，针对由bis-Ald-PEG(图9A)或bis-NHS-PEG(图9B)交联的prU-A的抗体与交联的prU-A结合的抑制(％)与它们被未修饰的prU-A结合的抑制的比较；将测试项目免疫的大鼠的血清样品与浓度增加的修饰或未修饰的prU-A(x轴的“抑制剂”)预温育；与修饰或未修饰的prU-A预温育抑制后的结合百分比作为预温育中所用蛋白(抑制剂)浓度的函数。
图10呈现了示出用具有2000Da PEG(大鼠1-5)或3400Da PEG(大鼠11-15)的PEG双醛交联的Pru-A，或用具有2000Da PEG(大鼠21-25)或3400Da PEG(大鼠26-30)的PEG双醛交联的Pru-C，以及用明矾佐剂免疫的各个大鼠中抗体(针对测试的修饰prU)的效价的柱状图；在第30天(取血(bleed)1)、第51天(取血2)和第72天(取血3)收集血样，并在第1、21、42和63天进行免疫。
图11呈现了示出使用ELISA在健康人类供体中预先存在的抗体对未修饰的Pru-C250K，用单功能10kDa PEG修饰的Pru-C250K，以及用双功能3400Da PEG修饰的Pru-C250K进行识别的表；数值代表样品和阴性对照的ELISA结果之间的OD值比率，其中仅突出显示OD值比率至少为2的阳性反应的供体(102个供体中的34个，每个由一行表示)的结果。
图12呈现了示出在37℃下在人血浆中用bis-Ald-PEG 3400Da交联的两批(346和347)Pru-C250K的稳定性的图，其通过酶活性(在t＝0时归一化为活性)测定。
图13A和13B呈现了示出与交联的Pru-C250K-bis-Ald-PEG 3400Da相比，未修饰的Pru-C250K在雌性大鼠中的药代动力学(pharmacokinetic，PK)和免疫原性研究的方式，包括6次静脉内(intravenous，IV)攻击(上方箭头)，随后进行PK和抗体效价评价(下方箭头表示用于分析的采血天数，粗箭头表示抗体评估天数，细箭头表示PK时间点)(图13A)；并示出了在第0天(Pre1)、第14天(取血1)、第31天(取血2)、第44天(取血3)、第59天(取血4)和第73天(取血5)，用未修饰的Pru-C250K免疫的6只大鼠中，针对Pru-C250K的抗体效价的柱状图(图13B)。
图14A、14B、14C和14D呈现了示出Pru-C250K-bis-A1d-PEG 3400在初次给药的大鼠(naive rats)(图14A和14B)或被攻击六次的大鼠(图14C和14D)中的药代动力学特征，作为血浆中蛋白质浓度随时间变化的自然对数(natural logarithm，LN)，及其与数据的线性拟合(虚线和方程以及R2值)的图；总Pru-C250K-bis-A1d-PEG 3400浓度通过互补ELISA检测来测定(图14A和14C)；活性蛋白浓度通过测定尿酸酶活性来评价(图14B和14D)；计算的半衰期和曲线下面积(area under curve，AUC)为54.0小时和61.07毫克*分钟/毫升(图14A)、64.8小时和65.95毫克*分钟/毫升(图14B)、70.5小时和80.4毫克*分钟/毫升(图14C)以及68.4小时和58.5毫克*分钟/毫升(图14D)。
图15呈现了示出示例性交联的尿酸酶(正方形)和普瑞凯希(圆形)的酶速率随底物(substrate，UA)浓度变化的米氏曲线(Michaelis-Menten plot)；通过在37℃下温育5分钟并评估与H2O2生成相关的氧化AmplifluTM探针的荧光线性增加来确定酶促速率(数据点代表进行三次实验的平均值)。
图16呈现了示出在第一次注射酶后，大鼠中示例性交联的尿酸酶和普瑞凯希的血浆浓度随时间变化的曲线图。
图17呈现了示出在第四次注射酶后，大鼠中示例性交联尿酸酶和普瑞凯希的血浆浓度随时间变化的曲线图。
图18呈现了示出在第一次(初始)和第四次(重复)注射(基于图16和17中呈现的数据)后大鼠中示例性交联的尿酸酶和普瑞凯希的血浆半衰期的柱状图。
具体实施方式
本公开在其一些实施方式中涉及治疗，更具体地，但不排他地，涉及尿酸酶的新形式及其在例如降低尿酸水平中的用途。
在详细解释本公开的至少一个实施方式之前，应当理解的是，本公开在其应用中不一定局限于在下面的描述中阐述的或者由实施例示出的细节。本公开能够有其他实施方式，或者能够以各种方式实践或执行。
如上所述，因为尿酸酶对人类来说是外源蛋白，所以它具有很高的免疫原性，这严重阻碍了它的治疗用途。此外，一般通过注射或输注的方式给药，可能非常不方便；并且在处理或储存时可能不稳定。
在寻找改进形式的尿酸酶的过程中，本发明人已经设计并成功地实践了修饰形式的尿酸酶，其表现出降低的和几乎无效的免疫原性，以及在储存和体内良好的稳定性。本发明人已经表明，这种交联尿酸酶的性质与本领域已知的PEG化尿酸酶的性质相比具有优势(例如，在低免疫原性和增强的体内半衰期方面)。
在将本公开付诸实践的同时，本发明人发现了一种与改善的性能(包括降低的免疫原性和减少的聚集)相关的突变尿酸酶多肽。
现在参考附图，图2示出了一种示例性尿酸酶突变体(SEQ ID NO:2)与尿酸酶聚集减少相关。
图3示出了在人血浆中表现出稳定性的示例性尿酸酶变体。图12示出了根据示例性实施方式的交联尿酸酶在人血浆中表现出高度的稳定性。图14A-14D示出了根据示例性实施方式的交联尿酸酶在重复给药后在大鼠中也表现出超过50小时的体内半衰期。
图4、5和6示出了当连接部分的分子量大于1000Da且小于5000Da时，聚乙二醇连接部分对各种尿酸酶变体的交联效率最大。
图7示出了bis-NHS和双醛交联剂都有效交联尿酸酶，并且双醛试剂的交联产生比bis-N-羟基琥珀酰亚胺试剂更有效的修饰。
图8A-8B示出与使用bis-N-羟基琥珀酰亚胺交联剂的交联相比，使用双醛试剂的交联使得交联的尿酸酶的体内免疫原性显著降低。
图10示出在不同尿酸酶变体交联后可获得低水平的体内免疫原性。相反，图13A-13B示出未修饰的尿酸酶具有相当大的免疫原性。
图11示出与用10kDa PEG修饰(普瑞凯希中用的修饰)相比，通过示例性(短)PEG连接部分交联后，抗原性(由健康人类供体中预先存在的抗体的量表示)较低。
图15示出了示例性交联尿酸酶在体外表现出比普瑞凯希显著更高的尿酸酶活性。
图16-18示出了示例性交联尿酸酶在体内表现出比普瑞凯希更长的血浆半衰期。
修饰的尿酸酶：
根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了一种修饰的尿酸酶。修饰的尿酸酶包含至少一种尿酸酶多肽(该术语如本文所定义)，该至少一种尿酸酶多肽通过至少一个包含聚(亚烷基二醇)部分的连接部分交联，优选通过至少一个包含聚(亚烷基二醇)部分的双功能连接部分交联。
本文中，术语“修饰的尿酸酶(modified uricase)”是指包含至少一种尿酸酶多肽(该术语如本文所定义)的任何结构，一个或多个其他部分(除尿酸酶之外)共价连接到该尿酸酶多肽上，这并不意味着限制在本文明确描述的范围之外。
本文中，术语“交联(crosslinking)”、“交联的(crosslinked)”及其任何变体是指在另一分子上的两个或更多个不同位点中的每一个处共价连接到另一分子上的单个部分(例如，共价连接到两个或更多个不同原子)。交联可以是分子内的，即，上述单独的部分共价连接到单个分子(例如单个多肽(例如，如在缀合物中，其中部分B在两个不同的位点共价连接到部分A))的两个或更多个不同的位点；或分子间的，即，上述单独的部分共价连接到两个或更多个不同的分子(例如两个或更多个多肽(例如，如在缀合物A-B-A中，其中部分B共价连接于两个不同的A部分))中的每一个；或者可以是分子内和分子间交联的组合(例如，如在缀合物中，其中两个B部分参与分子内交联并且一个参与分子间交联)。
通常，但不一定，上述单独的部分在本文中被描述为“交联(crosslinking)”，一个或多个其它分子被描述为“交联的(crosslinked)”(例如，在缀合物A-B-A中，部分B通常被描述为“交联(crosslinking)”两个A部分，它们被部分B“交联(crosslinked))。
本文中，术语“连接部分(linking moiety)”描述在两个或更多个不同位点共价连接到另一部分和/或分子的任何部分(分子的组分)；即，交联本文定义的一个或多个其它分子(例如一个或多个多肽)的部分。“双功能连接部分(bifunctional linking moiety)”是指共价连接到两个不同位点(没有更多)的连接部分。
应当理解，本文所述的交联和连接部分不同于本领域已知的各种多肽修饰，所述多肽修饰涉及将部分连接到多肽上的单个位点；例如，聚乙二醇化(PEGylation)，其通常涉及将聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)连接到单个位点。如本文的实施例部分所示，用连接部分修饰的尿酸酶可以表现出与用化学上类似的单功能基团修饰的相应尿酸酶显著不同的性质，例如通过典型的聚乙二醇化(如在聚乙二醇化酶中)。
不受任何特定理论的束缚，据信连接部分比单功能基团在空间上受到更大的限制，这可以增加连接到这种部分的位点总数和/或提供多肽与其周围环境更有效的掩蔽(例如，对于给定数量和/或质量的修饰部分)。
本文中，术语“尿酸酶(uricase)”包括被命名为EC1.7.3.3(催化尿酸盐(urate)氧化成5-羟基尿酸盐(5-hydroxyurate,)，伴随O2转化为H2O2)或被命名为EC1.14.13.113(催化尿酸盐氧化成5-羟基尿酸盐，伴随FADH氧化以及O2转化为H2O2)的任何酶；包括两者具有天然存在的酶的氨基酸序列的蛋白质，以及具有同源氨基酸序列的蛋白质(例如，根据本文所述的与同源物相关的任何实施方式，该术语如本文所定义)。
在本文所述的任何一些实施方式中，尿酸酶是EC 1.7.3.3尿酸酶。
本文中，术语“尿酸酶多肽(uricase polypeptide)”是指尿酸酶包含的离散多肽链。例如，四聚体尿酸酶可以包含四种尿酸酶多肽；或者，尿酸酶可以仅包含一种尿酸酶多肽(例如，由尿酸酶多肽组成)。尿酸酶多肽任选地被一个或多个取代基(例如，除了本文所述的连接部分之外)取代；例如，被糖和/或脂质部分，和/或本领域已知的与天然存在的多肽连接的任何其它取代基取代。
在本文所述的任何一些实施方式中，修饰的尿酸酶呈多聚体结构的形式；也就是说，修饰的尿酸酶包含多个尿酸酶多肽链。这种多聚体形式可以是，例如，二聚体、三聚体、四聚体、六聚体、八聚体或更大的多聚体形式。在一些这样的实施方式中，多聚体形式在结构上(例如，在尿酸酶多肽链的数目和/或其方向上)类似于尿酸酶的未修饰形式，例如，许多尿酸酶变体的四聚体。
多聚体结构中的尿酸酶多肽的至少一部分可以任选地彼此共价连接，例如，通过本文所述的连接部分的分子间交联。可选地或附加地，多聚结构中的尿酸酶多肽的至少一部分可任选地仅通过非共价相互作用与多聚结构中的其它多肽结合(例如，其中通过本文所述的连接部分的所有交联都是分子内的)。
对本领域技术人员显而易见的是，本文所述的修饰的尿酸酶具有复杂的聚合性质(例如，由于一种或多种多肽和/或一种或多种聚合连接部分的存在)，因此通常以相似但稍微不同的分子和/或多聚体结构的群体的形式产生。例如，连接部分的数目和/或一个或多个连接部分与尿酸酶多肽连接的位置可以变化。
在任何一些相应实施方式中，所述尿酸酶多肽(例如，本文所述的多聚体结构中的多种尿酸酶多肽中的每一个)连接到平均至少2个连接部分(根据本文所述的任何相应实施方式)，任选地至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个，甚至至少16个连接部分。上述连接部分任选地为双功能连接部分。在一些这样的实施方式中，上述连接部分各自与两个赖氨酸残基连接。
在任何一些相应实施方式中，修饰的尿酸酶中的赖氨酸残基侧链的至少10％连接到连接部分(例如，根据本文所述的涉及连接到赖氨酸残基侧链的连接片段的任何实方式)，任选地至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，甚至至少90％的赖氨酸残基侧链与连接部分连接。上述连接部分任选地为双功能连接部分。在一些实施方式中，基本上所有的赖氨酸残基侧链都与连接部分连接。
在确定连接到每个多肽的连接部分的平均数或连接到连接部分的赖氨酸残基侧链的平均数时，确定了修饰的尿酸酶分子和/或多聚体结构(例如上文讨论的群体)的群体的平均值。例如，连接到两个多肽的单个连接部分对应于每个多肽0.5个连接部分。
除了本文所述的连接部分之外，修饰的尿酸酶可以任选地被一个或多个其他部分进一步修饰，例如，具有与本文所述的连接部分类似的结构的一个或多个部分(例如，包含本文所述的聚(亚烷基二醇)部分和/或以本文所述的用于连接部分的方式与多肽赖氨酸残基连接)，但仅在一个位点与尿酸酶多肽连接。这样的(单功能)基团可以通过例如不完全交联反应产生，例如，其中多肽上的潜在结合位点(例如，赖氨酸残基)连接到其他部分和/或被其他部分空间阻断(sterically blocked)。
另外，在本文涉及双功能连接部分的任何实施方式中，修饰的尿酸酶可以任选地被一个或多个非双功能的连接进一步修饰，例如，连接到3、4或更多个多肽位点的连接部分(任选地支链连接部分(branched linking moiety))。在一些这样的实施方式中，双功能基团可以例如通过包含两个以上能够连接到多肽的官能团的化合物的不完全交联反应产生，例如，其中多肽上的潜在结合位点(例如，赖氨酸残基)连接到部分和/或部分被空间阻断，从而抑制在第三位点的连接。
在本文所述的任何一些实施方式中，修饰的尿酸酶的特征是比相应的未修饰的尿酸酶(即，没有本文所述的连接部分)具有更长的体内半衰期。在本文所述的一些这样的实施方式中，修饰的尿酸酶的半衰期比相应的未修饰的尿酸酶的半衰期长至少20％。在一些实施方式中，修饰的尿酸酶的半衰期比相应的未修饰的尿酸酶的半衰期长至少50％。在一些实施方式中，修饰的尿酸酶的半衰期比相应的未修饰的尿酸酶的半衰期长至少100％(即，至少两倍)。在一些实施方式中，修饰的尿酸酶的半衰期是相应的未修饰的尿酸酶的半衰期的至少三倍。在一些实施方式中，修饰的尿酸酶的半衰期是相应的未修饰的尿酸酶的半衰期的至少五倍。在一些实施方式中，修饰的尿酸酶的半衰期是相应的未修饰的尿酸酶的半衰期的至少10倍。在一些实施方式中，修饰的尿酸酶的半衰期是相应的未修饰的尿酸酶的半衰期的至少20倍。在一些实施方式中，修饰的尿酸酶的半衰期是相应的未修饰的尿酸酶的半衰期的至少50倍。在一些实施方式中，修饰的尿酸酶的半衰期是相应的未修饰的尿酸酶的半衰期的至少100倍。
(修饰的和/或未修饰的)尿酸酶的半衰期可以通过，例如，在将测试尿酸酶注射到对象(例如在人类和/或大鼠中)后，测定血液(例如在血浆中)中测试尿酸酶随时间的量来确定。如本文所举例说明的，尿酸酶的量可以使用针对测试尿酸酶的抗体(例如通过ELISA)和/或通过测定尿酸酶的酶活性特征的量来测定。
在本文所述的任何一些实施方式中，修饰的尿酸酶的特征是大鼠中至少40小时的血浆半衰期(例如，通过抗体识别和/或酶活性测定)。在一些这样的实施方式中，半衰期为至少50小时。在一些实施方式中，半衰期为至少60小时。在一些实施方式中，半衰期为至少70小时。在一些实施方式中，半衰期为至少80小时。在一些实施方式中，半衰期为至少100小时。在一些实施方式中，半衰期为至少一周，或至少两周，或至少三周，或至少四周。
根据本文所述的任何相应实施方式中的经修饰的尿酸酶的较长半衰期可任选地与修饰的尿酸酶的较大分子量(其可降低从血流中去除的速率，例如通过在肾中过滤)和/或修饰的尿酸酶的较低免疫原性(其可降低免疫系统的失活和/或破坏速率)相关。
连接部分：
根据本文所述的任何实施方式的连接部分可以任选地与根据本文所述的任何实施方式(例如，在本文的相应部分)的尿酸酶多肽以本文所述的任何方式组合(例如，根据本文所述的涉及修饰尿酸酶的交联性质和/或总体结构的任何实施方式)。
如本文所讨论的，连接部分包含聚(亚烷基二醇)部分。
如本文所用，短语“聚(亚烷基二醇)(poly(alkylene glycol))”包括聚醚聚合物家族，其共有下式：-[O-(CH2)m]n-O-，其中m表示存在于各个亚烷基二醇单元中的亚甲基的数目，n表示重复单元的数目，因此表示聚合物的大小或长度。例如，当m＝2时，聚合物被称为聚乙二醇，并且当m＝3时，聚合物被称为聚丙二醇。
在一些实施方式中，m是大于1的整数(例如，m＝2、3、4等)。
任选地，m在聚(亚烷基二醇)链的单元之间变化。例如，聚(亚烷基二醇)链可以包含连接在一起的乙二醇(m＝2)和丙二醇(m＝3)单元。
短语“聚(亚烷基二醇)”还包括其类似物，其中氧原子被另一个杂原子例如S、-NH-等替代。该术语还包括上述衍生物，其中构成聚合物的一个或多个亚甲基被取代。亚甲基上的任选取代基的示例包括但不限于烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、氧代、硫醇和硫代烷氧基等。在一些实施方式中，亚甲基上的取代基(如果存在的话)是烷基、任选地C1-4-烷基，以及任选地甲基。
如本文所用，短语“亚烷基二醇单元(alkylene glycol unit)”包括如上文所述的-O-(CH2)m-基团或其类似物，其形成聚(亚烷基二醇)的主链，其中(CH2)m(或其类似物)结合到聚(亚烷基二醇)(如式-[O-(CH2)m]n-O-中所示)或其杂原子类似物的末端的氧原子(或其杂原子类似物)，或属于另一亚烷基二醇单元或属于尿酸酶多肽的杂原子(在末端单元的情况下)；并且O(或前述末端氧原子)或其杂原子类似物结合到另一亚烷基二醇单元的(CH2)m(或其类似物)，或结合到与尿酸酶多肽形成键的官能团(根据本文所述的任一相应实施方式)。
亚烷基二醇单元可以是支化的(branched)，使得其连接到3个或更多个相邻的亚烷基二醇单元，其中3个或更多个相邻的亚烷基二醇单元中的每一个是聚(亚烷基二醇)链的一部分。这种支链亚烷基二醇单元通过其杂原子与一个相邻的亚烷基二醇单元连接，剩余的相邻亚烷基二醇单元的杂原子各自与支链亚烷基二醇单元的碳原子连接。此外，杂原子(例如氮)可以结合其所属的亚烷基二醇单元的一个以上碳原子，从而形成支链亚烷基二醇单元(例如[(-CH2)m]2N-等)。
在示例性实施方式中，至少50％的亚烷基二醇单元是相同的，例如它们包含彼此相同的杂原子和相同的m值。任选地，至少70％，任选地至少90％，以及任选地100％的亚烷基二醇单元是相同的。在示例性实施方式中，与相同的烷基乙二醇单元结合的杂原子是氧原子和/或亚烷基二醇单元是未取代的。在进一步的示例性实施方式中，对于相同的单元，m为2。
在一个实施方式中，聚(亚烷基二醇)是单链、直链(优选为聚乙二醇(PEG))，其中链的两个末端各自独立地直接或间接(例如，经由本文所述的官能团)连接到尿酸酶多肽。
如本文所用，术语“聚乙二醇(polyethylene glycol)”描述了如上文所定义的聚(亚烷基二醇)，其中至少50％、至少70％、至少90％，优选100％的亚烷基二醇单元是-CH2CH2-O-。类似地，短语“乙二醇单元(ethylene glycol units)”在本文中被定义为-CH2CH2-O-的单元。
根据任选的实施方式，连接部分包括聚乙二醇或其类似物，聚乙二醇或其类似物具有下式：
-(Y1-CR1R2-CR3R4)n-Y2-
其中Y1和Y2各自独立地为O、S或NR5(任选地为O)；
n是整数，任选地为2至1000(任选地10至300，以及任选地30至100)，尽管也考虑更高的n值；并且
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、氧代、硫醇和/或硫代烷氧基。
在任何一些实施方式中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为氢或烷基，任选地为氢或C1-4-烷基，以及任选地为氢或甲基。在示例性实施方式中，R1、R2、R3、R4和R5各自是氢。
聚乙二醇或其类似物可任选地包含共聚物，例如，其中上式中的Y1-CR1R2-CR3R4单元并非彼此相同。
在一些实施方式中，至少50％的Y1-CR1R2-CR3R4单元是相同的。任选地，至少70％，任选地至少90％以及任选地100％的Y1-CR1R2-CR3R4单元是相同的。
任选地，连接部分是支化的，例如，使得对于上式中的一个或多个Y1-CR1R2-CR3R4单元，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个是-(Y1-CR1R2-CR3R4)p-Y2-，其中R1至R5和Y1和Y2如上文所定义，并且p是如本文根据任一相应实施方式对n所定义的整数(例如，2至1000)。
连接部分任选地包含至少两个官能团，每个官能团与尿酸酶多肽形成共价键。官能团的示例包括亚烷基和羰基(-C(＝O)-)。亚烷基或羰基可以任选地连接到多肽的氮原子(例如胺基的氮原子)，例如，以分别一起形成胺基或酰胺基。各个官能团可以任选地直接连接到聚(亚烷基二醇)部分(根据本文所述的任一相应实施方式)，或经由连接部分间接连接，任选地其中连接部分是烃基。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，连接部分(任选地双功能连接部分)包含共价连接到多肽中的胺基团的氮原子的亚烷基基团(例如，未取代的亚烷基基团)；例如，赖氨酸残基侧链和/或N-末端的胺基。
如本文所举例说明的，这种共价连接到氮原子上的亚烷基可任选地通过醛基与胺基在还原剂存在下反应获得(例如，根据本文所述的方法)。
不受任何特定理论的束缚，据信通过共价连接到多肽氮原子的亚烷基进行交联比其他交联技术，例如在羰基(-C(＝O)-)基团(任选地通过羧酸酯基团的缩合衍生)和多肽胺基之间形成酰胺键，有利地具有更低的免疫原性。
图1示意性地描述了根据本公开一些实施方式的修饰的尿酸酶(例如，以四聚体的形式)，其中一部分PEG部分连接到多肽的多个胺基(例如，根据本文所述的任一相应实施方式中，通过还原胺化)，一部分PEG部分连接到多肽的单个胺基，具有未反应的剩余的(任选地通过根据本文所述的任一相应实施方式的不完全交联反应产生)官能团(例如，醛)。此外，未连接到任何部分(即，-NH2基团)的胺基可能会保留下来。如其中所述，修饰的尿酸酶可以任选地通过尿酸酶(例如尿酸酶四聚体)与双醛试剂在还原剂存在下反应而产生。
对于包含多个多肽单元的尿酸酶(例如，尿酸酶四聚体)，PEG部分可以任选地(但不是必须地)连接到多肽上，以便使一些或所有多肽(例如，四聚体的所有4个多肽)彼此交联(直接和/或经由一个或多个插多肽间接地交联)。任选地，交联使得多肽在变性条件下不解离。
也考虑了不同于图1所示的修饰尿酸酶，其具有不同的四级结构(quaternarystructure)(例如，除四聚体以外的结构)，其通过不同的反应(例如，除在还原剂存在下与双醛试剂反应以外)形成，包含不同的官能团(例如，除醛以外的官能团)，所述官能团包含用于将多肽连接到连接部分(例如，除-NH-基团之外)的不同基团和/或包含不同的连接部分(例如，包含除PEG之外的聚合物)。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，双功能连接部分具有式I：
-CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-CH2-
式I
其中：
L1和L2各自是连接部分(如本文所定义)或不存在L1和L2(任选地相同或不同的连接部分烃部分)，优选地其中所述连接部分是烃部分；
m是2至10范围内的整数；并且
n是在2至1000范围内的整数。
在本文涉及包含变量m的式的任何一些实施方式中，m是2、3或4。在一些实施方式中，m为2或3。在一些实施方式中，m为2，使得连接部分包含聚乙二醇部分(具有n个乙二醇亚单元)。
在本文涉及包含变量n的式的任何一些实施方式中，n至少为10(例如，10至300，或10至100)。在一些这样的实施方式中，n为至少30(例如，30至300、或30至100、或30至80、或30至60)。在一些实施方式中，n至少为40(例如，40至300、或40至100、或40至80、或40至60)。在一些实施方式中，n至少为50(例如，50至300、或50至100、或50至80、或50至60)。在一些实施方式中，n至少为60(例如，60至300、或60至100、或60至80)。在一些实施方式中，n至少为60(例如，60至300、或60至100、或60至80)。在一些实施方式中，n至少为70(例如，70至300、或70至100、或70至80)。
在本文涉及包含变量m和n的式的任何一些实施方式中，n至少为10(例如，10至300、或10至100)；并且m是2、3或4，优选地2或3，更优选地2。在一些这样的实施方式中，n至少为30(例如，30至300、或30至100、或30至80、或30至60)。在一些实施方式中，n至少为40(例如，40至300、或40至100、或40至80、或40至60)。在一些实施方式中，n至少为50(例如，50至300、或50至100、或50至80、或50至60)。在一些实施方式中，n至少为60(例如，60至300、或60至100、或60至80)。在一些实施方式中，n至少为60(例如，60至300、或60至100、或60至80)。在一些实施方式中，n至少为70(例如，70至300、或70至100、或70至80)。
在本文所述的任何一些实施方式中，L1和L2各自独立地为取代或未取代的亚烷基，任选地长度为1至4个碳原子，任选地长度为1至3个碳原子，并且任选地长度为1或2个碳原子。在一些这样的实施方式中，亚烷基是未取代的，例如CH2或CH2CH2。
式I的连接部分(根据任一相应实施方式)可以任选地在多肽的一个或两个末端连接到多肽的氮原子上。在这样的实施方式中，末端-CH2-(任选地与L1和/或L2的至少一部分组合)形成连接到多肽(根据本文描述的任一相应实施方式)的氮原子的亚烷基(任选地未取代的亚烷基)。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，连接部分(任选地双功能连接部分)的分子量为至少约1.5kDa。在一些这样的实施方式中，连接部分的分子量在约1.5kDa至约4kDa的范围内。在一些实施方式中，连接部分的分子量在约1.5kDa至约3.5kDa的范围内。在一些实施方式中，连接部分的分子量在约1.5kDa至约3kDa的范围内。在一些实施方式中，连接部分的分子量在约1.5kDa至约2.5kDa的范围内。在一些示例性实施方式中，连接部分的分子量为约2kDa。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，连接部分(任选地双功能连接部分)的分子量为至少约2kDa。在一些这样的实施方式中，连接部分的分子量在约2kDa至约4kDa的范围内。在一些实施方式中，连接部分的分子量在约2kDa至约3.5kDa的范围内。在一些实施方式中，连接部分的分子量在约2kDa至约3kDa的范围内。在一些实施方式中，连接部分的分子量在约2kDa至约2.5kDa的范围内。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，连接部分(任选地双功能连接部分)的分子量为至少约2.5kDa。在一些这样的实施方式中，连接部分的分子量在约2.5kDa至约4kDa的范围内。在一些实施方式中，连接部分的分子量在约2.5kDa至约3.5kDa的范围内。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，连接部分(任选地双功能连接部分)的分子量为至少约3kDa。在一些这样的实施方式中，连接部分的分子量在约3kDa至约4kDa的范围内。在一些实施方式中，连接部分的分子量在约3kDa至约3.5kDa的范围内。在一些示例性实施方式中，连接部分的分子量为约3.4kDa。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，连接部分(任选地双功能连接部分)的分子量不超过约4kDa。在一些这样的实施方式中，连接部分的分子量不超过约3.5kDa。在一些实施方式中，连接部分的分子量不超过约3kDa。在一些实施方式中，连接部分的分子量不超过约2.5kDa。
如本文所举例说明的，与更小和/或更大的连接部分相比，本文所述大小(例如，至少约1.5kDa和/或不超过约4kDa；和/或本文所述的变量m和/或n的值)的连接部分可能与交联效率和低免疫原性的有利组合相关。
不受任何特定理论的束缚，据信过小的连接部分可能导致多肽的无效掩蔽(ineffective masking)(与较高的免疫原性相关)，例如，由于每个连接部分的质量较小和/或由于连接到每个多肽的连接部分的量较少(例如，其中连接部分的长度不足以有效地连接到两个单独的连接位点。例如赖氨酸残基对)。进一步认为，过大的连接基团可能导致多肽的无效掩蔽，例如，其中大连接部分的连接在空间上抑制了其他连接部分的连接，在多肽的掩蔽中留下间隙(例如，通过抗体可能穿过)。
多肽：
根据本文所述的任何实施方式的尿酸酶多肽部分可以任选地与根据本文所述的任何实施方式(例如，在本文的相应部分)的连接部分以本文所述的任何方式(例如，根据本文所述的与交联性质和/或修饰的尿酸酶的整体结构有关的任何实施方式)组合。
在本文所述的任何实施方式中使用的尿酸酶多肽可以与本领域已知的任何一种或多种尿酸酶(如本文所定义)相关。包含多种交联的尿酸酶多肽(根据本文所述的任一相应实施方式)的修饰的尿酸酶可任选地包含与单一尿酸酶变体或与不同尿酸酶变体相关的尿酸酶多肽。
预期在从本申请开始的专利有效期内，尿酸酶的许多相关变体将被表征(例如，天然存在的尿酸酶变体)和/或被开发(例如，非天然存在的尿酸酶变体)，术语“尿酸酶”和“尿酸酶多肽”的范围旨在包括所有这些先验的新变体和技术。
可用于本文所述的任何实施方式中的尿酸酶多肽的示例包括但不限于：衍生自古人、猪、狒狒、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、马里脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus mali)、Arthrobacter gangotriensis、球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、宇田川曲霉(Aspergillus udagawae)、出芽短梗霉EXF-150(Aureobasidium pullulans EXF-150)、苛求芽胞杆菌(Bacillusfastidiosus)、嗜碱芽孢杆菌C-125(Bacillus halodurans C-125)、枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis str.168)、芽孢杆菌属FJAT-21352(Bacillus sp.FJAT-21352)、芽孢杆菌属TB-90(Bacillus sp.TB-90)、贝弗里奇芽孢杆菌(Bacillus beveridgei)、辣椒实蝇(Bactrocera latifrons(果蝇(fruit fly)))、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、野骆驼(Camelus ferus(野生双峰驼(wild Bactrian camel)))、产朊假丝酵母(Candidautillis)、念珠菌固体杆菌属(Candidatus Solibacter usitatus)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、鹰嘴豆(Cicer arietinum(chickpea))、耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)、中度嗜热菌(Deinococcus geothermalis)、圆锥掘氏梅里霉(Drechmeria coniospora)、刺猬(Erinaceus europaeus(普通刺猬))、大肠杆菌ISC56(Escherichia coli ISC56)、嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria)、大豆(Glycine max(soybean))、苔藓颗粒菌属(Granulicella tundricola)、桫椤科DSM 2912(Kyrpidiatusciae DSM 2912)、早熟禾夏季斑枯病菌(Magnaporthiopsis poae)、微杆菌属zzj4-1(Microbacterium sp.zzj4-1)、新丛赤壳属(Neonectria ditissima)、烟草(Nicotianatabacum(tobacco))、达尔文帕尼芽孢杆菌(Paenibacillus darwinianus)、香拟杆菌(Paenibacillus odorifer)、菜豆(Phaseolus vulgaris(普通菜豆(common bean)))、鞘翅目菌根真菌(Phialocephala scopiformis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、阿德利企鹅(Pygoscelis adeliae(Adelie penguin))、埃及果蝠(Rousettus aegyptiacus(Egyptian fruit bat))、厩螫蝇(Stomoxys calcitrans(barn fly))、桑特氏三角菌(Terriglobus saanensis)、大团囊虫草(Tolypocladium ophioglossoides)和大团囊弯颈霉CBS100239(Tolypocladium ophioglossoides CBS100239)；两种或多种尿酸酶多肽的嵌合体(例如，由聚脲酶构成的猪-狒狒嵌合多肽)；及其任何同源物(如本文所定义)。示例性的尿酸酶多肽氨基酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
在本文所述的任何一些实施方式中，修饰的尿酸酶包含至少一种具有如下氨基酸序列的多肽，和/或其同源物(如本文所定义)：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，和/或SEQ IDNO:3。如本文所举例说明的，这样的序列可以任选地与相对低的多肽免疫原性相关。
在本文所述的任何一些实施方式中，修饰的尿酸酶包含至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的多肽，和/或其同源物(如本文所定义)。如本文所举例说明的，这样的序列可任选地与相对低的免疫原性、相对高的交联能力(例如，由于其中大量的赖氨酸残基)和/或在生理条件下相对高的稳定性(例如，在约37℃的温度下的热稳定性)相关。
在本文中，给定多肽(例如本文所述的尿酸酶多肽)的“同源物(homolog)”是指与给定多肽表现出至少80％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，更优选至少98％同源性的多肽。在一些实施方式中，给定多肽的同源物进一步与给定多肽共有酶和/或治疗活性(例如，尿酸氧化)。同源性百分比是指第一多肽序列中与第一多肽所比较的第二多肽序列的相应残基相匹配的氨基酸残基的百分比。通常，多肽排列以获得最大的同源性。本领域已知多种策略用于进行氨基酸或核苷酸序列的比较，以评估同一性程度，包括例如手动比对(manual alignment)、计算机辅助序列比对(computer assisted sequencealignment)及其组合。用于执行序列比对的许多算法(通常是计算机实现的)是广泛可用的，或者可以由本领域技术人员产生。代表性的算法包括，例如，史密斯-沃特曼局部同源性算法(local homology algorithm of Smith and Waterman)(应用数学进展(Adv ApplMath),1981,2:482)；尼德勒曼-翁施同源性比对算法(homology alignment algorithm ofNeedleman and Wunsch)(分子生物学杂志(J Mol Biol)1970,48:443)；Pearson和Lipman的搜索相似性算法(美国科学院院报(PNAS)988,85:2444)；和/或通过这些算法的计算机化实现(例如，威斯康星遗传学软件包版本7.0(Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机集团(Genetics ComputerGroup)，575科学(Science)麦迪逊博士(Dr.,Madison,Wis.))。包含这种算法的容易获得的计算机程序包括，例如，BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST、PILEUP、CLUSTALW等。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序的默认参数。或者，从业者(practitioner)可以根据他或她的实验和/或其它要求来使用非默认参数(例如，参见网址为URLwww.ncbi.nlm.nih.gov的网站)。
在涉及给定多肽的同源物的任何一些实施方式中，所述同源物与给定多肽显示出至少80％的序列同一性，任选地至少90％的序列同一性，任选地至少95％的序列同一性，任选地至少98％的序列同一性，以及任选地至少99％的序列同一性。
在本文所述的任何一些实施方式中，尿酸酶多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一些这样的实施方式中，修饰的尿酸酶包含多个具有SEQ ID NO:2的多肽，任选地包含4个具有SEQ ID NO:2的多肽。
如以下实施例部分所述，SEQ ID NO:2对应于天然存在的尿酸酶多肽，该多肽来源于具有点突变C250K(即Cys250被赖氨酸取代)的产朊假丝酵母(SEQ ID NO:1)。SEQ ID NO:2的多肽，如SEQ ID NO:1的多肽，容易形成四聚体。
或者，尿酸酶多肽可以任选地是SEQ ID NO:2的同源物，其中该同源物在与SEQ IDNO:2中的Lys250(或SEQ ID NO:1中的Cys250)同源的位置含有除Cys以外的任何残基。任选地，同源物在与SEQ ID NO:2中Lys250同源的位置含有Lys。
不受任何特定理论的束缚，据信Cys250通过形成分子间二硫键在多肽聚集中起重要作用，因此它的消除大大减少了不想要的聚集。进一步认为其他赖氨酸残基(来自C250K突变)促进交联，例如，与适于连接到胺基的交联部分交联。
根据本公开一些实施方式的一个方面，提供了具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽。
本公开的任何实施方式的尿酸酶多肽可以任选地通过重组DNA技术纯化(例如，从植物或动物组织)或产生。在任何一些相应实施方式中，尿酸酶多肽是植物重组多肽；也就是说，通过重组技术在植物中产生。烟草(Nicotiana tabacum)(烟草(tobacco))是一种用于重组产生多肽的示例性植物。
在各种细胞和/或生物体(包括植物和植物细胞)中重组产生多肽的多种技术是本领域已知的。
重组蛋白可以任选地以产生重组蛋白的细胞和/或生物体(例如植物)类型的翻译后修饰(例如糖基化)为特征；相反，例如，天然表达多肽(或其最接近的天然同源物)的细胞和/或生物体的类型。
本文所用的术语“植物(plant)”包括植物的完整的植物；嫁接的植物；植物的祖先和后代；以及植物部分，包括种子、芽、茎、根(包括块茎)、根茎(rootstock)、接穗，以及植物细胞、组织和器官。植物可以是任何形式，包括悬浮培养物、胚胎、分生组织区域、愈伤组织、叶、配子体、孢子、花粉和小孢子。在本公开的方法中特别有用的植物包括属于绿色植物(Viridiplantae)总科的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或饲料豆科植物、观赏植物、食物作物、树木或灌木例如：金合欢属(Acacia spp.)、槭属(Acer spp.)、猕猴桃属(Actinidia spp.)、七叶树属(Aesculus spp.)、南方贝壳杉(Agathis australis)、苦合欢(Albizia amara)、三色桫椤属(Alsophila tricolor)、须芒草属(Andropogonspp.)、落花生属(Arachis spp)、槟榔(Areca catechu)、香桂(Astelia fragrans)、鹰嘴紫云英(Astragalus cicer)、罗得西亚柚木(Baikiaea plurijuga)、桦木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、伯克苏木(Burkea africana)、甄叔迦树(Butea frondosa)、卡达巴木(Cadaba farinosa)、朱缨花属(Calliandra spp)、茶属(Camellia sinensis)、大麻科(Cannabaceae)、印度大麻(Cannabis indica)、大麻属(Cannabis)、大麻(Cannabis sativa)、大麻(Hemp)、工业大麻(industrial Hemp)、辣椒属(Capsicum spp.)、决明属(Cassia spp.)、巨瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜属(Chacoomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、阿拉比卡咖啡(Coffea arabica)、可乐豆(Colophospermum mopane)、多变小冠花(Coronillia varia)、木栒子属(Cotoneasterserotina)、山楂属(Crataegus spp.)、黄瓜属(Cucumis spp.)、柏木属(Cupressus spp.)、粉背番桫椤(Cyathea dealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅草(Cymbopogon spp.)、银蕨(Cynthea dealbata)、榅桲(Cydoniaoblonga)、货贝黄檀(Dalbergia monetaria)、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山蚂蟥属(Desmodium spp.)、粗糙蚌壳蕨(Dicksonia squarosa)、拢双黄茅(Dibeteropogonamplectens)、迪奥豆属(Dioclea spp)、扁豆属(Dolichos spp.)、豆科矛豆属(Dorycniumrectum)、金字塔稗(Echinochloa pyramidalis)、Ehraffia spp.、龙爪稷(Eleusinecoracana)、Eragrestis spp.、刺桐属(Erythrina spp.)、桉树属(Eucalypfus spp.)、假乌木(Euclea schimperi)、绒毛状金茅(Eulalia villosa)、荞麦属(Pagopyrum spp.)、菲油果(Feijoa sellowlana)、草莓属(Fragaria spp.)、千斤拔属(Flemingia spp)、藤露兜属(Freycinetia banksli)、童氏老鹳草(Geranium thunbergii)、银杏(Ginkgo biloba)、威地大豆(Glycine javanica)、南洋樱属(Gliricidia spp)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属(Grevillea spp.)、小巴花(Guibourtia coleosperma)、岩黄芪属(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemaffhia altissima)、黄茅(Heteropogon contoffus)、青稞(Hordeumvulgare)、泰国苞茅(Hyparrhenia rufa)、小连翘(Hypericum erectum)、Hypeffheliadissolute、异花木蓝(Indigo incamata)、鸢尾属(Iris spp.)、常绿虎耳草(Leptarrhenapyrolifolia)、古月枝子属(Lespediza spp.)、生菜属(Lettuca spp.)、银合欢属(Leucaena leucocephala)、单罗得草(Loudetia simplex)、Lotonus bainesli、莲花属(Lotus spp.)、大结豆(Macrotyloma axillare)、苹果属(Malus spp.)、木薯(Manihotesculenta)、苜蓿(Medicago saliva)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musasapientum)、尼古丁属(Nicotianum spp.)、红豆草属(Onobrychis spp.)、鸟爪豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)、非洲盾柱木(Peltophorum africanum)、狼尾草属(Pennisetum spp.)、鳄梨(Persea gratissima)、矮牵牛属(Petunia spp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、加那利海枣(Phoenix canariensis)、新西兰麻(Phormiumcookianum)、石楠属(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativam)、桃柘罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonaffhria squarrosa、杨树属(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、非洲老虎刺(Pterolobium stellatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、栎属(Quercus spp.)、厚叶石斑木(Rhaphiolepsis umbellata)、香棕(Rhopalostylis sapida)、纳塔尔盐肤木(Rhus natalensis)、欧洲醋栗(Ribesgrossularia)、醋栗属(Ribes spp.)、刺槐属(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属(Rosaspp.)、黑莓属(Rubus spp.)、柳树属(Salix spp.)、红裂稃草(Schyzachyriumsanguineum)、金松(Sciadopitys vefficillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高粱(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、流苏状鼠尾粟(Sporobolus fimbriatus)、苦豆草(Stiburus alopecuroides)、矮柱花草(Stylosanthos humilis)、葫芦茶属(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、黄背草(Themeda triandra)、三叶草属(Trifolium spp.)、小麦属(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越橘属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、葡萄属(Vitisvinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、苋菜(amaranth)、朝鲜蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、花椰菜(broccoli)、抱子甘蓝(Brussels sprouts)、甘蓝(cabbage)、芥花籽油(canola)、胡萝卜(carrot)、菜花(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘蓝(collard greens)、亚麻(flax)、羽衣甘蓝(kale)、兵豆(lentil)、油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、土豆(potato)、水稻(rice)、大豆(soybean)、稻草(straw)、甜菜(sugar beet)、甘蔗(sugarcane)、向日葵(sunflower)、蕃茄(tomato)、南瓜茶(squash tea)和/或树。或者，藻类和其它非绿色植物可用于本公开一些实施方式的方法。
或者，公开一些实施方式的多肽可以通过肽合成领域技术人员已知的任何技术化学合成。对于固相肽合成，许多技术可以总结在以下文献中：J.M.Stewart和J.D.Young,固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis),W.H.Freeman公司(旧金山),1963，以及J.Meienhofer，荷尔蒙蛋白质和肽(Hormonal Proteins and Peptides)，第2卷，第46页，学术出版社(Academic Press)(纽约)，1973。对于经典的溶液合成，参见G.Schroder和K.Lupke,肽(The Peptides),第1卷，学术出版社(Academic Press)(纽约)，1965。
通常，这些方法包括将一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸顺序加入到生长的肽链中。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基被合适的保护基保护。然后，在适于形成酰胺键的条件下，被保护或衍生的氨基酸可以连接到惰性固体支持物上，或者通过添加序列中具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的下一个氨基酸而在溶液中使用。然后从这个新加入的氨基酸残基中除去保护基团，然后加入下一个氨基酸(适当保护的)，等等。在所有所需氨基酸以适当的顺序连接后，依次或同时除去任何剩余的保护基团(和任何固体支持物)，以提供最终的多肽化合物。通过对该通用方法的简单修改，有可能在生长的链上一次加入一个以上的氨基酸，例如，通过将保护的三肽与适当保护的二肽偶联(在不使手性中心外消旋的条件下)，在去保护后形成五肽等。肽合成的进一步描述公开于美国专利US6472505。
Andersson等人[生物聚合物(Biopolymers)2000,55(3):227-50]描述了大规模肽合成。
在本文中，术语“多肽(polypeptide)”是指包含由肽键或其类似物(如下文所述)连接的至少10个氨基酸残基(优选至少50个氨基酸残基)的聚合物，并且任选地仅由肽键本身连接。术语“多肽”包括天然多肽(例如降解产物、合成的多肽和/或重组多肽)，包括但不限于天然蛋白质、天然蛋白质的片段和天然蛋白质和/或其片段的同源物；以及肽模拟物(peptidomimetics)(通常是化学合成的多肽)和类肽(peptoids)和半类肽(semipeptoids)，它们是多肽类似物，它们可以具有，例如修饰(例如，不同于本文明确描述的交联修饰)，使多肽在体内更稳定或更能渗入细胞。这种修饰包括但不限于N-末端修饰、C-末端修饰、肽键修饰、主链修饰和残基修饰。制备肽模拟物化合物的方法是本领域熟知的，并且例如在定量药物设计(Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.，17.2章，F.Choplin Pergamon Press(1992))中有详细说明，该文献通过引用整体并入本文中，如同在本文中完全阐述一样。下文提供了这方面的进一步细节。
肽内的肽键(-CO-NH-)可以被例如N-甲基化酰胺键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(＝O)-O-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、亚磺酰亚甲基键(-S(＝O)-CH2-)、-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基(例如，甲基)、胺键(-CH2-NH-)、硫键(-CH2-S-)、乙烯键(-CH2-CH2-)、羟基乙烯键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH＝CH-)、氟化烯烃双键(-CF＝CH-)、反酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是天然存在于碳原子上的“正”侧链。
这些修饰可以发生在沿着多肽链的任何键上，甚至同时发生在几个(例如，2至3个)键上。
天然芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以被非天然芳香族氨基酸如1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid，Tic)、萘基丙氨酸、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或O-甲基-Tyr取代。
本公开一些实施方式的多肽还可以包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、络合碳水化合物等)。
术语“氨基酸(amino acid或amino acids)”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；那些通常在体内翻译后修饰的氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素(isodesmosine)、正缬氨酸(nor-valine)、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸(aminoacid)”包括D-氨基酸和L-氨基酸。
下表1和2列出了天然存在的氨基酸(表1)和非常规或修饰的氨基酸(non-conventional or modified amino acids)(例如，合成的，表2)，其可以用于本公开的一些实施方式。
表1
表2
修饰的尿酸酶的制备：
根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了制备根据本文描述的涉及修饰的尿酸酶和/或其组分(例如，尿酸酶多肽和/或连接部分)任一实施方式的修饰的尿酸酶的方法。该方法包括：
(a)使尿酸酶多肽(根据本文所述的任一实施方式)与包含聚(亚烷基二醇)部分(根据本文所述的任一实施方式)的交联剂接触，以获得多肽和交联剂的缀合物，其中所述交联剂包含至少两个醛基(-C(＝O)H)；和
(b)使所述缀合物与还原剂接触。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，交联剂包含不超过两个醛基(-C(＝O)H)。
在本文所述的任何一些实施方式，交联剂具有式II：
HC(＝O)-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-C(＝O)H
式II
其中，L1各自是烃部分；m是2至10的范围内的整数；并且n是2至1000范围内的整数(例如，其中L1、R1、m和/或n如根据本文所述的涉及式I的任何相应实施方式中所定义)。式II的试剂可以任选地用于获得根据式I的连接部分(根据本文所述的任一相应实施方式)；例如，在每个醛基与胺基反应(例如，形成亚胺或半缩醛胺中间体)后，并还原形成胺基。
或者，交联剂可任选地包含两个以上(例如3、4或更多个)醛基。这种交联剂可任选地通过仅两个醛基与多肽反应而产生双功能连接部分(根据本文所述的任一相应实施方式)，例如，其中在前述两个醛基反应时，在第三醛基附近不存在未反应的胺基。
图1示意性地描绘了根据本文所述的任何一些相应实施方式中的方法。
合适的还原剂的示例包括但不限于硼烷及其络合物(complexes)(例如，甲基吡啶硼烷络合物)、硼氢化物(包括硼氢化物盐，例如，硼氢化钠)、三乙酰氧基硼氢化物(包括三乙酰氧基硼氢化物盐，例如，三乙酰氧基硼氢化钠)、氰基硼氢化物(包括氰基硼氢化物盐，例如，氰基硼氢化钠)，以及本领域已知的适用于还原胺化方法的任何其它还原剂。示例性的还原剂包括但不限于2-甲基吡啶硼烷络合物和氰基硼氢化钠。
尿酸酶多肽、交联剂和还原剂可以任选地以任何顺序组合。例如，可以任选地将交联剂添加到包含多肽和还原剂的混合物中，或者可以任选地将多肽添加到包含交联剂和还原剂的混合物中(例如，使得多肽和交联剂的缀合物在形成缀合物时已经与还原剂接触)。在一些实施方式中，尿酸酶多肽、交联剂和还原剂基本上同时结合(例如，作为“一锅反应”)。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，当与交联剂接触时，尿酸酶多肽呈多聚体形式(包含一个以上尿酸酶多肽链的形式)。这种多聚体形式可以是，例如，二聚体、三聚体、四聚体、六聚体、八聚体或更大的多聚体形式。在一些这样的实施方式中，多聚体形式是是尿酸酶多肽的天然存在形式，例如，许多尿酸酶多肽的四聚体。在任一相应实施方式中，使多聚形式的尿酸酶多肽与交联剂接触可用作产生分子间交联的有效技术，其中产生一个或多个连接到不同多肽链的交联部分(例如，根据本文所述的任一相应实施方式)。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，交联剂(根据本文所述的任一相应实施方式)和与交联剂接触的尿酸酶多肽(根据本文所述的任一相应实施方式)的摩尔比为至少100:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为100:1至10,000:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为100:1至5,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为100:1至2,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为100:1至1,000:1。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，交联剂(根据本文所述的任一相应实施方式)和与交联剂接触的尿酸酶多肽(根据本文所述的任一相应实施方式)的摩尔比为至少200:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为200:1至10,000:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为200:1至5,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为200:1至2,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为200:1至1,000:1。示例性比率包括200:1和1,000:1。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，交联剂(根据本文所述的任一相应实施方式)和与交联剂接触的尿酸酶多肽(根据本文所述的任一相应实施方式)的摩尔比为至少500:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为500:1至10,000:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为500:1至5,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为500:1至2,000:1。
在本文所述的任何一些相应实施方式中，交联剂(根据本文所述的任一相应实施方式)和与交联剂接触的尿酸酶多肽(根据本文所述的任一相应实施方式)的摩尔比为至少1,000:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为1,000:1至10,000:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为1,000:1至5,000:1。
可以任选地选择交联剂的分子量，以产生具有根据本文任一实施方式所述与交联部分分子量相关的分子量的交联剂。在本文所述的方法中，给定交联剂的分子量和由该试剂产生的交联部分之间的关系对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如，式II的试剂通常比式I的部分(其中，变量L1、R1、m和n以相同的方式定义)分子量大30Da(例如，对于1kDa或更大的分子量，基本上是舍入误差(rounding error))。
根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了可根据本文所述的方法在任何相应实施方式中获得的修饰的尿酸酶。
制剂和适应症：
根据本文所述的任一相应实施方式中的修饰的尿酸酶可以任选地用于治疗其中尿酸酶活性有益的疾病或病症的用途和/或用于治疗与过多尿酸水平相关的疾病或病症的用途。
根据本文所述的一些实施方式的一个方面，提供了根据本文所述的任一相应实施方式的修饰的尿酸酶在制备用于治疗其中尿酸酶活性有益的疾病或病症的药物中的用途。
根据本文所述的一些实施方式的一个方面，提供了根据本文所述的任一相应实施方式的修饰的尿酸酶在制备用于治疗与过多尿酸水平相关的疾病或病症的药物中的用途。
根据本文所述的一些实施方式的一个方面，提供了治疗其中尿酸酶活性有益于治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的根据本文所述的任一相应实施方式中的修饰的尿酸酶。
根据本文所述的一些实施方式的一个方面，提供了治疗与过多尿酸水平相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的根据本文所述的任一相应实施方式中的修饰的尿酸酶。
根据一些实施方式(根据本文所述的任何方面)可治疗的病症的示例包括但不限于痛风、糖尿病、肾结石、肿瘤溶解综合征、出血性休克、疟疾、变应性炎症、肾功能障碍、病毒感染(例如流感和COVID-19)(例如其中过多的尿酸水平与抗病毒药(例如法匹拉韦(favipiravir))相关)、急性胃肠炎、胎盘炎症、无菌性炎症以及其它与尿酸有关的妊娠并发症(例如，流产、先兆子痫和早产)、多发性硬化、炎症性肠病、胃肠感染，以及莱施-奈恩综合症。
在本文所述的任何一些实施实施方式中，所述治疗增强了体内固体(例如，结晶)尿酸的溶解，例如，在治疗痛风、肾结石、胎盘炎症、无菌性炎症、妊娠并发症、莱施-奈恩综合症和/或肿瘤溶解综合征中。
在本文所述的任何一些实施实施方式中，所述治疗降低了尿酸的炎性作用，其可任选地有益于治疗炎性病状，例如痛风、疟疾、变应性炎症、病毒感染(例如，COVID-19)、急性胃肠炎、胎盘炎症、无菌性炎症、妊娠并发症、多发性硬化和炎症性肠病。
根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了一种降低培养基中尿酸水平的方法，该方法包括使所述培养基与根据本文所述的任一相应实施方式的修饰的尿酸酶接触。培养基可以任选地是体内或离体的生理培养基(例如组织)，或非生理培养基。
在一些实施方式中，培养基是有需要的(人类或非人类)对象的组织，所述方法包括向所述对象施用所述修饰的尿酸酶。对象可以任选地患有根据本文所述的任一相应实施方式中的疾病或病症，或有患这些疾病或病症的风险。
根据本文所述的任一相应实施方式中的修饰的尿酸酶本身可以任选地本身使用，或者作为进一步包含药学上可接受的载体的药物组合物的一部分使用。
如本文所用，“药物组合物(pharmaceutical composition)”是指本文所述的一种或多种修饰的尿酸酶与其它化学成分如药学上可接受的和合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
下文中，术语“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。载体的非限制性示例是丙二醇、盐水、乳液和有机溶剂与水的混合物，以及固体(例如粉末)和气态载体。
本文中，术语“赋形剂(excipient)”是指加入到药物组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性物质。赋形剂的示例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚合物如聚乙二醇。
可以在以下文献中找到药物的配制和给药技术：“雷明登氏药学全书(Remington's Pharmaceutical Sciences)”，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，Easton,PA，最新版，其通过引用并入本文。
本公开的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封(encapsulating)、包埋(entrapping)或冻干方法。
因此，根据本公开使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包含赋形剂和助剂，其有助于将修饰的尿酸酶加工成可药用的制剂。合适的剂型(formulation)取决于所选的给药途径。
本文所述的修饰的尿酸酶可以配制用于肠胃外给药，例如通过弹丸注射(bolusinjection)或连续输注(continuous infusion)。用于注射的制剂可以以单位剂型(unitdosage)形式存在，例如在安瓿中或多剂量容器中，任选地添加防腐剂。组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂(formulatory agents)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的修饰的尿酸酶制剂的水溶液。对于注射或输注，修饰的尿酸酶可以任选地配制在水溶液中，优选配制在生理相容的缓冲液中，例如汉克氏液(Hank’s solution)、林格氏液(Ringer’s solution)或生理盐缓冲液(含有或不含有机溶剂，例如丙二醇、聚乙二醇)。
此外，可以将修饰的尿酸酶的悬浮液制备成合适的油基注射悬浮液和乳液(例如：油包水、水包油或油包水油(water-in-oil in oil)乳液)。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)，或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯)，甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液(Aqueous injection suspensions)可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加修饰的尿酸酶的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
直接注射和/或输注到血流中(例如，静脉内给药)可特别适合于治疗高尿酸血症(包括与其相关的任何病症)，其中升高的尿酸水平存在于血液中。向血流中的施用还可以任选地用于将修饰的尿酸酶递送至特定组织。
任选地或附加地，可以将修饰的尿酸酶局部注射到例如受过多尿酸水平折磨的组织中。该组织任选地是与尿酸沉淀相关的组织，例如关节(例如，在痛风的情况下)或肾脏(例如，在肾结石的情况下)。
对于经粘膜给药，在制剂中使用渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。
对于口服给药，可以通过将修饰的尿酸酶与本领域公知的药学上可接受的载体结合来配制本公开的修饰的尿酸酶。这种载体能够将本文所述的修饰的尿酸酶配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供患者口服摄入(oralingestion)。用于口服使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，任选地研磨所得混合物，如果需要，在加入合适的助剂后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。
糖衣丸芯具有合适的包被(coatings)。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素添加到片剂或糖衣丸包被中，以用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊(push-fitcapsules)以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊。推入配合式胶囊可含有与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，修饰的尿酸酶可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。用于口服给药的所有制剂的剂量都应适合所选的给药途径。
还可以使用例如常规栓剂基质(例如可可脂)或其它甘油酯，将本公开实施方式的修饰的尿酸酶配制成直肠组合物，例如，栓剂或保留灌肠剂。
口服和/或直肠给药可特别适于治疗胃肠道疾病或病症，例如与胃肠道炎症相关的病症(例如，炎症性肠病和/或胃肠炎)。
对于颊给药(buccal administration)，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过吸入给药，修饰的尿酸酶可以方便地以气溶胶喷雾形式(通常包括粉状、液化和/或气态载体)从加压包装或喷雾器中递送，并使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以输送计量的量来确定。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有修饰的尿酸酶和合适的粉末基质(例如但不限于乳糖或淀粉)的粉末混合物。
或者，修饰的尿酸酶可以是粉末形式，用于在使用前与合适的载体，例如无菌、无热原的水一起构成。
适用于本公开上下文的药物组合物包括多个组合物，其中包含多个活性成分于一有效量，以达到预期目的。更具体地，治疗有效量是指有效预防、缓解或改善疾病的症状或延长正在接受治疗的对象的生存的活性的修饰的尿酸酶的量。
对于根据本公开的实施方式使用的任何修饰的尿酸酶，所述治疗有效量或剂量最初可以从动物的活性测定估计。例如可以在动物模型中配制剂量，以实现循环浓度范围，所述循环浓度范围包括通过活性测定确定的IC50(例如，测试蛋白结构的浓度，其实现修饰的尿酸酶的生物活性的半数最大增加(half-maximal increase))。这种信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。
如以下实施例部分所证明的，本公开实施方式的修饰的尿酸酶的治疗有效量可以在约0.1μg/kg体重和约500mg/kg体重之间的范围内。在本文所述的任何一些实施方式中，修饰的尿酸酶的治疗有效量为约10μg/kg体重至约2000μg/kg体重，任选地为约25μg/kg体重至约800μg/kg体重。
本文所述的修饰的尿酸酶的毒性和治疗功效可以通过实验动物中的标准药物程序来确定，例如通过测定对象蛋白结构的EC50、IC50和LD50(导致50％受试动物死亡的致死剂量)来确定。从这些活性测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。
剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。鉴于患者状况，各个医师可以选择确切的配方、给药途径和剂量。(例如参见Fingl等人所著，1975，“治疗药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”，Ch.1p.1)。
剂量的量和间隔可以单独调整，以提供足以维持所需效果的活性尿酸酶的血浆水平，成为最低有效浓度(minimal effective concentration，MEC)。MEC将因每种制剂而有差异，但可以从体外(in vitro)数据估算；例如，在体外达到所需活性水平所必需的浓度。实现MEC所需的剂量取决于个体特征和给药途径。HPLC测定或生物测定可用于测定血浆浓度。
还可以使用MEC值来确定剂量间隔。制剂应使用在10-90％，优选30-90％和最优选50-90％的时间内维持血浆水平高于MEC的方式施用。
如本文所讨论的，本文所述的修饰的尿酸酶可以在体内表现出长的半衰期。这种特性可以允许使用相对不频繁的给药(当通过不方便的途径(如注射)给药时，这可能是特别有利的)和/或相对低剂量的给药(这对于降低毒性和/或对修饰的尿酸酶的潜在免疫应答可能是特别有利的)。
可通过尿酸酶活性治疗的一些疾病可能不需要持续、长期的最低有效浓度的修饰尿酸酶。因此，修饰的尿酸酶可以以不足以连续提供最小有效浓度的频率施用。例如，以尿酸沉淀为特征的疾病可以任选地通过施用足以促进沉淀的尿酸在体内部分或完全溶解的剂量的修饰尿酸酶来治疗，随后不需要尿酸酶活性的间隔，例如，直到经过足够的时间使得临床上显著水平的尿酸再次沉淀。
在本文所述的任何一些实施方式中，以至少一周的间隔给药(例如，通过注射)(即，治疗包括以至少一周的间隔单独地多次给药)，任选地以最多6个月或12月(一年)的间隔给药。在一些这样的实施方式中，所述间隔为至少两周。在一些实施方式中，所述间隔为至少一个月(例如，在1至12个月的范围内，或1至6个月，或1至2个月，任选地1或2个月的范围内)。在一些实施方式中，所述间隔为至少两个月(例如，在2至12个月的范围内，或2至6个月的范围内)。在一些实施方式中，所述间隔为至少三个月(例如，在3至12个月的范围内，或3至6个月的范围内)。
在本文所述的任何一些实施方式中，选择每次给药的给药频率和剂量，使得修饰的尿酸酶的给药剂量(例如，通过注射至成人对象)不超过每月60mg修饰的尿酸酶(例如，以3个月的间隔给药120mg将被认为是40mg/月的剂量)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过40mg/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过80mg)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过24mg/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过48mg)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过16mg/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过32mg)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过12mg/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过24mg)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过10mg/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过20mg)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过8mg/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过16mg)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过6mg/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过12mg)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过4mg/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过8mg)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过2mg/月。在一些这样的实施方式中，剂量不超过1mg/月。
在本文所述的任何一些实施方式中，选择每次给药的给药频率和剂量，使得经修饰的尿酸酶的给药剂量不超过每月每千克体重2mg修饰的尿酸酶。在一些这样的实施方式中，剂量不超过0.8mg/kg体重/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过1.6mg/kg体重/月)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过0.4mg/kg体重/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过0.8mg/kg体重/月)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过0.2mg/kg体重/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过0.4mg/kg体重/月)。在一些实施方式中，剂量不超过0.1mg/kg体重/月(例如，以约两个月的间隔给药不超过0.2mg/kg体重/月)。在一些实施方式中，剂量不超过0.5mg/kg体重/月。在一些实施方式中，剂量不超过0.25mg/kg体重/月。
取决于要治疗的病症的严重性和反应性，给药可以是单次给药，任选地施用上文所述的缓释组合物，治疗过程持续数天至数周，或直到治愈，或达到疾病状态的减轻。
当然，要施用的组合物的量将取决于被治疗对象的痛苦严重性、给药方式、处方医师的判断等。
如果需要，本公开的组合物可以存在于包装(pack)或分配器(dispenser)装置，例如美国FDA(美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration))批准的试剂盒，其可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如但不限于泡罩包装(blister pack)或加压容器(用于吸入)。包装或分配装置可附有给药说明书。所述包装或分配器也可以伴随着与容器相关的通知，所述容器的形式是依照监管药品生产、使用或销售的政府机构所规定，所述通知反映所述组成物的用于人体或兽医的形式授所述机构批准。举例而言，这样的通知，可能是经过美国食品和药物管理局批准的处方药标签，或批准的产品插入物。组成物包括配制在药学相容的载体中的本公开任何实施方式的修饰的尿酸酶的化合物，所述组合物可以被制备，置于合适的容器中，并标记，以用于治疗本文中所述的病症，如本文中详细说明。
因此，根据本公开的一个实施方式，将本文所述的药物组合物包装在包装材料中，并在包装材料中或包装材料上印刷标识，用于治疗其中修饰的尿酸酶的活性有益于治疗的病症，如上文所述。
其他定义：
在本文中，术语“烃(hydrocarbon)”和“烃部分(hydrocarbon moiety)”描述了一种有机基团，包括多个碳原子所构成的炭链，作为其基本骨架，并由氢原子取代。烃可以是饱和或不饱和的，由脂族(aliphatic)、脂环族(alicyclic)或芳族(aromatic)部分所组成，并且可以任选被一个或多个取代基(除氢以外)取代。取代的烃可以具有一个或多个取代基，其中每个取代基可以独立地是例如环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环、胺、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯(sulfonate)、硫酸酯(sulfate)、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基(phosphinyl)、氧代(oxo)、羰基、硫代羰基、脲基(urea group)、硫脲基(thiourea group)、O-氨基甲酰基(O-carbamyl)、N-氨基甲酰基(N-carbamyl)、O-硫代氨基甲酰基(O-thiocarbamyl)、N-硫代氨基甲酰基(N-thiocarbamyl)、S-硫代氨基甲酰基(S-thiocarbamyl)、C-酰氨基(C-amido)、N-酰氨基(N-amido)、C-羧基(C-carboxy)、O-羧基(O-carboxy)、磺酰氨基(sulfonamido)、脒基(guanyl)、胍基(guanidinyl)、肼(hydrazine)、酰肼(hydrazide)、硫酰肼(thiohydrazide)和氨基。烃可以是端基(end group)或连接基团，如这些术语在本文中所定义的。优选地，烃部分具有1至20个碳原子。每当一个数值范围；例如，“1至20”在本文中被陈述时，这意味着该基团(在这种情况下是烃)，可以含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，至多并且包括20个碳原子。任选地，烃是具有1至10个碳原子的中等大小的烃。任选地，烃具有1至4个碳原子。
本文中，短语“连接基团(linking group)”了连接到化合物中两个或多个部分的基团(例如，取代基)；而短语“端基(end group)”描述了经由其一个原子连接到化合物中单个部分的基团(例如，取代基)。
如本文通篇所用，术语“烷基(alkyl)”是指包括直链和支链基团的饱和脂族烃(aliphatic hydrocarbon)。优选地，烷基具有1至20个碳原子。更优选地，烷基是具有1至10个碳原子的中等大小的烷基。最优选地，除非另有说明，烷基是具有1至4个碳原子的低级烷基(lower alkyl)。烷基可以是取代或未取代的。
当被取代时，可以是例如环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯(sulfonate)、硫酸酯(sulfate)、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、S-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文所定义。
本文中，术语“烯基(alkenyl)”描述了包含至少一个碳-碳双键的不饱和脂族烃，包括直链和支链基团。优选地，烯基具有2至20个碳原子。更优选地，烯基是具有2至10个碳原子的中等大小的烯基。最优选地，除非另有说明，烯基是具有2至4个碳原子的低级烯基。烯基可以是取代的或未取代的。
取代的烯基可以具有一个或多个取代基，其中每个取代基可以独立地是例如炔基(alkynyl)、环烷基、炔基(alkynyl)、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、S-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基。
本文中，术语“炔基(alkynyl)”描述了包含至少一个碳-碳三键的不饱和脂族烃，包括直链和支链基团。优选地，炔基具有2至20个碳原子。更优选地，炔基是具有2至10个碳原子的中等大小的炔基。最优选地，除非另有说明，炔基是具有2至4个碳原子的低级炔基。炔基可以是取代的或未取代的。
取代的炔基可以具有一个或多个取代基，其中每个取代基可以独立地是例如环烷基、烯基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、S-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基。
术语“亚烷基(alkylene)”描述了饱和或不饱和脂族烃连接基团，该术语如本文中所定义，其与如本文所定义的烷基(当饱和时)或烯基或炔基(当不饱和时)的不同，仅在于亚烷基是连接基团而不是端基。
“环烷基(cycloalkyl)”基团是指饱和的或不饱和的全碳单环或稠环(fusedring)(即共有一对相邻的碳原子的环)，其中多个环中的一者或多者不具有完全共轭的π电子系统。环烷基的非限制性示例是环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、环庚烷、环庚三烯和金刚烷(adamantane)。环烷基可以是取代或未取代的。当被取代时，取代基可以是例如：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、S-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文中定义。当环烷基是不饱和的时，它可以包含至少一碳-碳双键和/或至少一碳-碳三键。环烷基可以是如本文所定义的端基，其中它连接到单个相邻原子上，或者是如本文所定义的连接基团，连接两个或多个部分。
“芳基(aryl)”基团是指具有完全共轭的π电子体系的全碳单环或稠环多环(即共有相邻的碳原子对的环)端基。芳基的非限制性示例是苯基、萘基和蒽基。芳基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基可以是例如：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、S-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文中定义。
“杂芳基(heteroaryl)”基团是指在环中具有一个或多个原子，例如氮、氧和硫，此外还具有完全共轭的π电子体系的单环或稠环(即共有一对相邻的碳原子的环)端基。杂芳基的非限制性示例包括吡咯(pyrrole)、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。杂芳基可以是取代或未取代的。当被取代时，取代基可以是例如：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、S-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文中定义。
术语“亚芳基(arylene)”描述了如本文所定义的单环或稠环多环连接基团，并且包括连接基团，该连接基团与本文定义的芳基或杂芳基不同仅在于亚芳基是连接基团而不是端基。
“杂脂族(heteroalicyclic)”基团是指在环中具有一个或多个原子，例如氮、氧和硫的单环或稠环。所述环也可以具有一个或多个双键。然而所述环不具有完全共轭的π电子体系。杂脂环可以是被取代的或未取代的。当被取代时，取代基可以是例如：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、S-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文中定义。代表性示例为哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉等。杂脂族基团可以是如本文所定义的端基，其中它连接到单个相邻原子上，或者是如本文所定义的连接基团，连接两个或多个部分。
本文中，术语“胺(amine)”和“氨基(amino)”分别指-NR’R”基团或-N+R’R”R”’基团，其中R’、R”和R”’各自是氢或是取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环(通过其环碳与胺氮连接)、芳基，或杂芳基(通过其环碳与胺氮连接)，如本文所定义。任选地，R’、R”和R”’是氢和包含1至4个碳原子的烷基。任选地，R’和R”(以及R”’，如果存在的话)是氢。当被取代时，与胺的氮原子键合的R’、R”或R”’烃部分的碳原子不被氧代取代(除非另有明确说明)，使得R’、R”和R”’不是(例如)羰基、C-羧基或酰胺，如这些基团在本文中所定义。
“叠氮化物(azide)”基团是指-N＝N+＝N-基团。
“烷氧基(alkoxy)”基团是指-O-烷基(-O-alkyl)和-O-环烷基(-O-cycloalkyl)，如本文所定义。
“芳氧基(aryloxy)”基团是指-O-芳基(-O-aryl)和-O-杂芳基(-O-heteroaryl)，如本文所定义。
“羟基(hydroxy)”基团是指-OH基团。
“硫代羟基(thiohydroxy)”或“硫醇(thiol)”基团是指-SH基团。
“硫代烷氧基(thioalkoxy)”基团是指-S-烷基(-S-alkyl)和-S-环烷基(-S-cycloalkyl)，如本文所定义。
“硫代芳氧基(thioaryloxy)”基是指-S-芳基(-S-aryl)和-S-杂芳基(-S-heteroaryl)，如本文所定义。
“羰基(carbonyl)”基团是指-C(＝O)-R’基团，其中R’如上文所定义，或指-C(＝O)-连接基团。
“醛基(aldehyde)”基团是指-C(＝O)H基团。
“硫代羰基(thiocarbonyl)”基团是指-C(＝S)-R’基团，其中R’如本文所定义。
“羧基(carboxyl、carboxylic)”或“羧酸酯(carboxylate)”是指“C-羧基”和“O-羧基”基团，如本文所定义。
“C-羧基(C-carboxy)”基团是指-C(＝O)-O-R’基团，其中R’如本文所定义。
“O-羧基(O-carboxy)”基团是指R’C(＝O)-O-基团，其中R’如本文所定义。
“氧代(oxo)”基团是指＝O基团。
“卤代(halo)”基团是指氟、氯、溴或碘。
“亚磺酰基(sulfinyl)”基团是指-S(＝O)-R’基团，其中R’如本文所定义。
“磺酰基(sulfonyl)”基团是指-S(＝O)2-R’基团，其中R’如本文所定义。
“磺酸酯(sulfonate)”基团是指-S(＝O)2-O-R’基团，其中R’如本文所定义。
“硫酸酯(sulfate)”基团是指-O-S(＝O)2-O-R’基团，其中R’如本文所定义。
“磺酰胺(sulfonamide)”或“磺酰氨基(sulfonamido)”基团包括S-磺酰氨基(S-sulfonamido)和N-磺酰氨基(N-sulfonamido)基团，如本文所定义。
“S-磺酰氨基(S-sulfonamido)”基团是指-S(＝O)2-NR’R”基团，其中R’和R”各自如本文所定义。
“N-磺酰氨基(N-sulfonamido)”基团是指R’S(＝O)2-NR”-基团，其中R’和R”各自如本文所定义。
“O-氨基甲酰基(O-carbamyl)”基团是指-OC(＝O)-NR’R”基团，其中R’和R”各自如本文所定义。
“N-氨甲酰基”基团是指R’OC(＝O)-NR”-基团，其中R’和R”各自如本文所定义。
“O-硫代氨基甲酰基(O-thiocarbamyl)”基团是指-OC(＝S)-NR’R”基团，其中R’和R”各自如本文所定义。
“N-硫代氨基甲酰基(N-thiocarbamyl)”基团是指R’OC(＝S)NR”-基团，其中R’和R”各自如本文所定义。
“S-硫代氨基甲酰基(S-thiocarbamyl)”基团是指-SC(＝O)-NR’R”基团，其中R’和R”各自如本文所定义。
“酰胺(amide)”或“酰氨基(amido)”基团包括C-酰氨基和N-酰氨基，如本文所定义。
“C-酰氨基(C-amido)”基团是指-C(＝O)-NR’R”基团，其中R’和R”各自如本文所定义。
“N-酰胺基(N-amido)”基团是指R’C(＝O)-NR”-基团，其中R’和R”各自如本文所定义。
“脲基团(urea group)”是指-N(R’)-C(＝O)-NR”R”’基团，其中R’、R”和R”’各自如本文所定义。
“硫脲基(thiourea group)”是指-N(R’)-C(＝S)-NR”R”’基团，其中R’、R”和R”’各自如本文所定义。
“硝基(nitro)”基团是指-NO2基团。
“氰基(cyano)”基团是指-CN基团。
术语“膦酰基(phosphonyl)”或“膦酸酯(phosphonate)”描述了-P(＝O)(OR’)(OR”)基团，其中R’和R”如上文所定义。
术语“磷酸酯(phosphate)”描述了-O-P(＝O)(OR’)(OR”)基团，其中R’和R”各自如上文所定义。
术语“氧膦基(phosphinyl)”描述了-PR’R”基团，其中R’和R”各自如上文所定义。
术语“肼(hydrazine)”描述了-NR’-NR”R”’基团，其中R’、R”和R”’，如本文所定义。
如本文所用，术语“酰肼(hydrazide)”描述-C(＝O)-NR’-NR”R”’基团，其中R’、R”和R”’如本文所定义。
如本文所用，术语“硫代酰肼(thiohydrazide)”描述了-C(＝S)-NR’NR”R”’基团，其中R’、R”和R”’如本文所定义。
“胍基(guanidinyl)”基团是指-RaNC(＝NRd)-NRbRc基团，其中Ra、Rb、Rc和Rd中的每一个可以如本文对于R’和R”所定义。
“脒基(guanyl)”或“鸟嘌呤(guanine)”基团是指RaRbNC(＝NRd)-基团，其中Ra、Rb和Rd如本文所定义。
“亚胺(imine)”是指-C(＝NR”)-R’基团，其中R’和R”如上文所定义。
“半缩醛胺(hemiaminal)”是指-C(R’)(OH)-NR”R”’基团，R’、R”和R”’如本文所定义。
如本文所用，术语“约(about)”是指±10％或±5％。
术语“包括(comprises、comprising、includes、including)”、“具有(having)”及其同源词(conjugates)意为“包括但不限于”。
术语“由……组成(consisting of)”是为“包括并限于”。
术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”意为组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特性。
如本文所使用的，单数形式“一个(a、an)”和“所述(the)”包括复数，除非上下文另有明确的指示。例如，术语“化合物(a compound)”或“至少一种化合物(at least onecompound)”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个申请中，本公开的各个实施方式可以以范围的形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本公开的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，都适用。
每当本文指出数值范围时，意为包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。表述“第一指示数和第二指示数之间的范围(ranging/ranges between a firstindicate number and a second indicate number)”和“从第一指示数到第二指示数的范围(ranging/ranges from a first,indicate number“to”a second indicate number)”在本文中可互换使用，意为包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有数和整数。
如本文所用，术语“方法(method)”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的或者容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施方式中组合地提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本公开的各个特征也可以单独提供，或者以任何合适的子组合提供，或者以本公开的任何其它描述的实施方式中的合适的方式提供。在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有这些元件的情况下不起作用。
如上文所述以及如以下权利要求部分所要求的本公开的各个实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例，这些实施例与上面的描述一起以非限制性的方式说明了本公开的一些实施方式。
材料和方法
材料：
嵌合cHu 3.3人类抗PEG IgG1抗体，获自台湾地区“中央研究院”。
2-甲基吡啶硼烷和氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，获自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)。
单功能聚乙二醇硝基苯基碳酸酯(mPEG(10K)-NPC)，获自Creative PEGWorks公司。
聚乙二醇双-醛(bis-Ald-PEG)试剂，获自Creative PEGWorks公司。
聚乙二醇双-N-羟基琥珀酰亚胺(2kDa)(bis-NHS-PEG 2000)，获自Iris BiotechGmbh公司。
构建用于在BY2细胞中表达尿酸酶变体的载体：
为了在BY2细胞中转化和表达不同的尿酸酶序列，使用了基于双生病毒菜豆黄矮病毒(Bean yellow dwarf virus，BeYDV)复制子的表达系统[Chen等人，人类疫苗(HumVaccin)2011,7:331-338；Mor等人，生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)2003,81:430-437]。
BY2细胞转化、尿酸酶的表达和选定细胞系的分离：
用上述分子构建体对BY2细胞的遗传转化是用农杆菌介导的转化方法进行的，如An等人[欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)1985,4:277-284]所述。使用卡那霉素(kanamycin)作为选择剂来选择转化的细胞。一旦建立了存活的卡那霉素抗性细胞悬浮液，就将其用于分离和筛选单个细胞系(克隆)。通过使用高度稀释的转基因细胞悬浮液的等分试样并将其铺展在固体培养基上来建立单独的细胞系。使细胞生长直至形成小的愈伤组织(植物细胞团(plant cell masses))。然后将代表单个克隆的每个愈伤组织重新悬浮在液体培养基中，并取样。分离个个转化的细胞系，并筛选尿酸酶表达水平。选择显示最高表达水平的系用于进一步的工艺开发。
植物细胞悬浮液：
烟草BY2(N.tabacum cv.BY2)细胞在25℃下，在液体MS-BY-2培养基(Nagata和Kumagai,Methods Cell Sci 1999,21:123-127)中以悬浮培养物的形式培养，在回旋振荡器(orbital shaker)上持续搅拌(85rpm)。悬浮液在250毫升锥形瓶中以50毫升的体积生长，并以每周2.5％(v/v)的浓度传代培养。
制备“类普瑞凯希(pegloticase-like)”聚乙二醇化的尿酸酶：
为了用作“类普瑞凯希”对照，通过在100mM磷酸盐缓冲液(pH8)中将Pru-C250K尿酸酶(SEQ ID NO:2)稀释至1mg/mL，并加入1000摩尔当量的单功能聚乙二醇硝基苯基碳酸酯来制备单功能PEG修饰的尿酸酶。反应在室温下进行2小时。使用具有100K截止值(在14,000G下4分钟)的AmiconTM系统，通过透析进入100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)的3个循环来实现纯化。
通过ELISA评价抗体水平：
将MaxiSorpTM 96孔微量滴定板用5μg/ml尿酸酶样品在磷酸盐缓冲盐水缓冲液中的溶液包被，在4℃温育过夜，洗涤，并在室温下用2％牛血清白蛋白封闭2小时。然后洗涤板以除去任何未结合的蛋白质，并加入100μl血清。在室温下，以600rpm摇动，再温育2小时后，洗去未结合的化合物，将小鼠抗人类lgG-碱性磷酸酶以1∶5000稀释度加入每个孔中，并在室温下以600rpm摇动温育1.5小时。在最后的洗涤步骤之后，加入磷酸酶底物，并使用碱性磷酸酶终止溶液终止反应。使用酶标仪(Tecan)在630nm处测量最终吸光度。
MALDI-TOF质谱：
样品制备-通过混合375μL 20mg/mL的2,5-DHAP(2,5-二羟基苯乙酮(2,5-dihydroxyacetophenone))在乙醇溶液和125μL 18mg/mL DAC(柠檬酸氢二铵(diammoniumhydrogen citrate))水溶液来制备基质溶液。将2μL样品溶液与2μL 2％的三氟乙酸溶液混合，然后与2μL基质溶液混合。然后向上和向下吸取该三元混合物，直到结晶开始，由此先前透明的混合物变得不透明。将0.5μL体积的该混合物施用于MALDI钢靶板上。蒸发溶剂后，将靶插入质谱仪中。
质谱-使用MALDI-TOF/TOF AutoflexTM速度质谱仪(Bruker Daltonilk GmbH公司)获得MALDI-TOF质谱。质谱仪配备有SmartbeamTM-II固态激光器(改进的Nd:YAG激光器；λ＝355nm)，并在20000至200000m/z或60000至200000m/z的质量范围内以正离子线性模式操作。每个样品的激光流畅性都进行了优化。激光器以2千赫的频率工作，光谱以1000次激光发射的倍数累积，总共2000次发射。
尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)：
使用DionexTM UltiMateTM 3000HPLC系统进行尺寸排阻色谱法。
使用12 10/300GL柱，在含有100mM NaCl的50mM硼酸盐缓冲液(pH8)中，以0.4mL/分钟的流速分析修饰前的尿酸酶，并在214nm处测量吸光度。
使用在含有100mM NaCl的50mM Tris缓冲液(pH 8.0)中以0.3mL/分钟流速，柱温50℃串联连接的两个TSK凝胶G5000PWXL,7.8×300mm色谱柱在214nm处的吸光度测量来分析交联的尿酸酶。
尿酸酶活性测定：
尿酸酶比活性通过间接荧光测定法测定，检测尿酸酶氧化尿酸后释放的H2O2副产物。具体而言，将400uM尿酸溶解并加入到含有0.1％ BSA的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)中具有未知尿酸酶浓度的样品中。在37℃的辣根过氧化物酶的存在下，荧光探针(AmplifluTM)与H2O2以1:1的化学计量比反应，得到具有530-560nm的激发波长和590nm的发射波长的高荧光产物。使用酶标仪记录荧光增益10分钟，并根据尿酸酶标准曲线对样品进行定量。
为了进行米海利斯-曼恬(Michaelis-Menten)分析，如上文所述确定了60ng/ml酶和增加的尿酸浓度的催化速率，其中尿酸浓度范围为1.56μM至200μM。使用GraFit软件(Erithacus Software Limited,2010)从底物(UA)浓度对反应速率(V)曲线计算动力学参数。尿酸酶活性的单位(U)被定义为在37℃，pH8.0下，每分钟将1μmol的尿酸转化成尿囊素所需的酶的量。
光密度
使用NanoDropTM 2000分光光度计(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific Inc))，从其在280nm的吸光度(消光系数为1.43cm-1(gr/l)-1)获得纯化蛋白质的定量。
实施例1
尿酸酶氨基酸序列免疫原性的计算机比较
为了开发低免疫原性尿酸酶，通过计算机评估了46个尿酸酶序列中每一个的免疫原性。
根据[Singh&Raghava,生物信息学(Bioinformatics)2010,17:1236-1237]描述的方法，使用定量基质，使用ProPred MHC II类结合肽预测服务器预测序列中的MHC II类结合区域。确定了覆盖超过90％人群的九个最丰富的人类等位基因(DRB1*0101、0103、0401、0701、0801、1101、1301、1015)的MHC II类九聚体肽表位。基于其在5％阈值处与共有结合序列的偏差，对各种9聚体肽进行鉴定和评分。
显示与共有序列有15％以上相似性并预测结合3个以上MHC II类等位基因的肽被认为是免疫原性的。
所分析的尿酸酶序列为古人、根癌农杆菌、马里脂环酸芽孢杆菌、坏疽节杆菌、球形节杆菌、黄曲霉、宇田川曲霉(Aspergillus udagawae)、出芽短梗霉EXF-150、苛求芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌C-125、枯草芽孢杆菌168、芽孢杆菌属FJAT-21352、芽孢杆菌属TB-90、贝弗里奇芽孢杆菌、辣椒实蝇(果蝇)、皮炎芽生菌、野骆驼(野生双峰驼)、产朊假丝酵母、念珠菌固体杆菌属(Candidatus Solibacter usitatus)、莱茵衣藻、鹰嘴豆(chickpea)、耐辐射奇球菌、中度嗜热菌、圆锥掘氏梅里霉、普通刺猬、大肠杆菌ISC56、嗜硫原始红藻、大豆、苔藓颗粒菌属、桫椤科DSM 2912、早熟禾夏季斑枯病菌、微杆菌属zzj4-1、新丛赤壳属、烟草、达尔文帕尼芽孢杆菌、香拟杆菌、菜豆(普通菜豆)、鞘翅目菌根真菌、绿脓杆菌、阿德利企鹅、埃及果蝠、厩螫蝇、桑特氏三角菌、大团囊虫草，以及大团囊弯颈霉CBS100239。
基于以下条件选择最终候选物：(i)赖氨酸残基的数量；(ii)预测的免疫原性表位的数量；和(iii)预测的免疫原性表位的得分。选择以下尿酸酶作为植物重组尿酸酶(plantrecombinant uricase，Pru)在烟草BY2细胞中表达：
产朊假丝酵母尿酸酶(Candida utilis uricase，Pru-C)(SEQ ID NO:1，登记号：P78609)：预测的8个T细胞表位与共有结合序列具有54％的最大相似度得分；氨基酸序列包括可用于蛋白质修饰的32个赖氨酸残基；和
神经节节杆菌尿酸酶(Arthrobacter gangotriensis uricase，Pru-G)(SEQ IDNO:3，登记号。EMR00187.1)：预测5个T-细胞表位与共有结合序列具有42％的最大相似度得分；氨基酸序列包括可用于蛋白质修饰的12个Lys残基。
尿酸酶Pru-G和Pru-C被计算为具有比两种临床批准的重组尿酸酶，拉布立酶和普瑞凯希的序列显著更低的免疫原性潜力。特别地，拉布立酶中使用的黄曲霉尿酸酶(Pru-A)(SEQ ID NO:4，登记号DB00049)预计具有11个T-细胞表位，与共有结合序列(以及25个赖氨酸残基可用于蛋白质修饰)具有最高68％的最大相似度得分；然而，在普瑞凯希中使用的猪-狒狒狒嵌合尿酸酶预计具有19个T细胞表位，与共有结合序列(以及30个赖氨酸残基可用于蛋白质修饰)具有最高68％的最大相似度得分。
黄曲霉尿酸酶(Pru-A)(SEQ ID NO:4)也在烟草BY2细胞中表达，作为参照。
Pru-C(SEQ ID NO:1)包括作为三肽(tripeptide，TKL)的C末端过氧化物酶体靶向信号1(peroxisomal targeting signal 1，PTS1)[Brocard&Hartig,生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)2006,1763:1565-1573]，并在过氧化物酶体中表达。Pru-A也在过氧化物酶体中表达，而Pru-G在细胞质中表达。
实施例2
C250K突变对尿酸酶影响
观察到在如上文材料和方法部分所制备的植物重组产朊假丝酵母尿酸酶(prU-C；SEQ ID NO:1)在常规条件下进行聚合。进一步观察到二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)抑制Pru-C的聚合，表明聚合与不同尿酸酶分子中半胱氨酸残基之间的二硫键的形成有关。
Pru-C的Cys250是Pru-C中4个Cys残基之一，据报道其对Pru-C活性是非必需的。此外，与其他尿酸酶(未示出)的公开结构的比较表明，Pru-C的Cys250面向外-这种取向可促进分子间二硫键的形成。
鉴于上述情况，Pru-如上所述，分析了C250K突变体(prU-C250K；SEQ ID NO:2)的免疫原性，并在烟草BY2细胞中表达。预测10个T-细胞表位，与共有结合序列具有52％的最大相似度得分。对于Pru-C(SEQ ID NO:1)，Pru-C250K(SEQ ID NO:2)包括作为三肽(TKL)的C-末端过氧化物酶体靶向信号1(PTS1)[Brocard&Hartig,生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)2006,1763:1565-1573]，并在过氧化物酶体中表达。
然后通过在-20℃下以0.3mg/mL的浓度(通过测量光密度测定)在25mM Tris，pH8.4中过夜储存，在使蛋白质经受冷冻/解冻循环之前或之后，评估C250K点突变对prU-C储存稳定性的影响。
在冷冻之前和之后通过测定比活性(通过荧光活性测定定量)来分析Pru-C250K；高分子量(high molecular weight，HMW)的物种形成(在天然条件下通过尺寸排阻色谱法测定)在变性条件下通过SDS-PAGE测定。
如下表3所示，在天然条件下，Pru-C250K突变样品在冷冻前后只存在四聚体；而WTPru-C在冷冻前包含8.4％的八聚体，冷冻后包含20.2％的八聚体和48.4％的高分子量(HMW)异构体(通过SEC测定)。如本文进一步示出的，C250K突变对比活性没有显著影响。
类似地，如图2所示，在前或冷冻后(在没有DTT的情况下)，在变性条件下仅观察到Pru-C250K的单体形式；而一些WT Pru-C显示出具有多个亚单元的物种(species)的可变性，例如二聚体和四聚体(通过SDS-PAGE测定)。
表3：通过尺寸排阻色谱法测定的具有或不具有冷冻/解冻循环的示例性尿酸酶变体的四聚体、八聚体和HMW(分子量高于八聚体)的酶活性和比例(--表示低于检测极限的水平)。
这些结果表明，相对于WT序列，C250K突变增强了尿酸酶的结构特性，使得活性和四聚体结构(例如，而不是HMW物种)被保留下来。
此外，不受任何特定理论的束缚，据信C250K突变体的额外(di 33个)赖氨酸残基可进一步促进蛋白质修饰。
实施例3
尿酸酶序列对稳定性影响
比较了各种尿酸酶变体(Pru-A、Pru-C、Pru-C250K和Pru-G)在生理相关条件下的稳定性。
为了评估其热稳定性，采用纳米差示扫描荧光法对尿酸酶进行了分析。具体地，将纯化的蛋白质样品在PBS中稀释至0.5mg/mL的最终浓度，每种样品10μL加载到毛细管中。在置于毛细管阵列中之后，将板置于纳米差示扫描荧光仪中，并以每分钟1℃的速率(以28％的激发功率)从15℃逐渐加热至95℃。通过软件测定Tm(熔点)起点(蛋白质开始变性的温度)和Tm(50％蛋白质变性的温度)，这是由蛋白质构象变化引起的荧光变化的结果。
如表4所示，Pru-C和Pru-C250K显示出相似的熔点参数，而Pru-A在明显更低的温度下熔化。
这些结果表明Pru-C和Pru-C250K在生理温度下比Pru-A更稳定，并且C250K突变对热稳定性影响很小或没有影响。
表4：示例性尿酸酶变体的熔点(Tm)和熔点起点(Tm onset)
尿酸酶变体 熔点起点(℃) Tm(℃)
prU-A 34.9 45.2
prU-C 61.0 74.5
prU-C250K 62.4 73.2
为了评估在人血浆条件下的稳定性，尿酸酶在人血浆(离体)中稀释至最终浓度为2μg/ml，并在37℃下温育4周。在指定的时间点，通过比活性测定来定量蛋白质的稳定性。
如图3所示，未修饰的Pru-A、Pru-C、Pru-C250K和Pru-G蛋白在人血浆中温育4周后各自显示活性逐渐降低，其中Pru-A在人血浆中显示出最大的稳定性，Pru-G显示出最低的稳定性。Pru-C和Pru-C250K在生理基质中表现出相似的显著稳定性，表明C250K突变对血浆稳定性影响很小或没有影响。
实施例4
聚乙二醇交联对尿酸酶的影响
为了使用聚乙二醇双-醛(bis-Ald-PEG)交联尿酸酶，对于每摩尔尿酸酶，将至多1000摩尔的不同大小(1kDa至10kDa)的双-醛PEG加入到尿酸酶的磷酸盐缓冲液(pH8)的溶液中。将还原剂以25mM至100mM的最终浓度加入到所得的溶液中。使偶联反应在室温(～23℃)下进行过夜，例如至少10小时。然后通过色谱法和/或超滤从反应混合物中除去游离PEG。通过SDS-PAGE测定交联效果，并根据未修饰的尿酸酶的标准曲线测定酶活性。活性蛋白与总蛋白的比率(通过280nm处的光密度(OD)测定)表示为反应后保留活性的百分比。
使用上述一般方法，使用通过不同大小的bis-Ald-PEG交联的不同尿酸酶变体进行以下具体实验。
在25mM 2-甲基吡啶硼烷作为还原剂存在的条件下，Pru-C与1000摩尔当量(相对于总蛋白四聚体)PEG分子量为1000、2000、5000和10,000Da的bis-Ald-PEG交联。
如下表5所示，交联的Pru-C保留了天然Pru-C的大部分酶活性。
表5：相对于未修饰的Pru-C活性，与不同大小的PEG交联的Pru-C的酶活性。
PEG大小(Da) 酶活性
1000 47％
2000 73％
5000 47％
10,000 35％
如图4所示，天然Pru-C在SDS-PAGE中显示约34kDa的分子量，对应于蛋白质单体(即，亚单元或约136kDa四聚体)的分子量，较小的条带对应于二聚体；而与2kDa PEG交联的Pru-C与对应于约315kDa的主条带相关，没有对应于明显更低分子量的任何条带。
在约315kDa处的主条带与用约45分子的2kDa PEG修饰的完全交联的Pru-C四聚体(约136kDa)一致，因为PEG分子以相当于两倍于其重量的蛋白质的速率迁移，因此额外的90kDa PEG表现为180kDa蛋白质。此外，与四聚体相比，不存在比四聚体分子量更低的条带表明有效的共价交联，这不会导致任何剩余的非交联单体。
进一步如图4所示，与1kDa PEG交联的Pru-C与对应于约42kDa的强条带相关，表明是聚乙二醇化的单体；以及约80kDa、约120kDa和约160kDa的条带，它们分别表示聚乙二醇化的二聚体、三聚体和四聚体。
如本文进一步示出的，用5kDa PEG交联的Pru-C与对应于10kDa增量的几个条带相关，这与1分子(5kDa)的PEG的增量一致(因为PEG分子以对应于两倍于其重量的蛋白质的速率迁移当PEG分子以对应于蛋白质的两倍其重量的速率迁移时)；包括对应于略小于55kDa的褪色条带，这与用单一PEG分子修饰的单一Pru-C单体一致。
这些结果表明用1kDa PEG和5kDa(或更多)PEG交联四聚体内的Pru-C单体比用2kDa PEG交联效率低得多。
在另一个实验中，使用100mM NaBH3CN作为还原剂，用500摩尔当量的PEG分子量为600、1000、2000、3400、5000和10,000Da的bis-Ald-PEG交联市售的尿酸酶-A(拉布立酶)。
如图5所示，拉布立酶在SDS-PAGE中显示约34kDa的分子量，对应于蛋白质单体的分子量；与600Da PEG反应的拉布立酶显示出对应于单体和二聚体(分别在约40和72kDa处)的主要条带(main bands)，以及对应于三聚体和四聚体(分别在约130和160kDa处)的较弱条带；与1000Da PEG交联的拉布立酶显示出对应于四聚体的主要条带，以及对应于单体、二聚体和三聚体的较弱条带；以及与5000Da或10,000PEG交联的拉布立酶表现出与单体和各种数量的PEG分子一致的模糊条带(如上文关于图4所讨论的)。如其中进一步显示的，与2000Da或3400Da PEG交联的rasburicase显示出对应于聚乙二醇化四聚体的条带，而没有对应于较小物种的条带。
这些结果表明，四聚体中拉布立酶单体与2kDa和3.4kDa PEG的交联是有效的，而与1kDa(或更少)或5kDa(或更多)PEG的交联是无效的。这些结果类似于用Pru-C获得的结果。
在另一个实验中，使用NaBH3CN作为还原剂，将Pru-G与200或1000摩尔当量的PEG分子量为2000、3400和5000Da的bis-Ald-PEG交联。
如下表6所示，与2000Da PEG交联的Pru-G比与5000Da或10,000Da交联的Pru-G保留了明显更多的活性；活性的降低与交联剂的用量相关。
如图6所示，对于所有测试的bis-Ald-PEG，在Pru-G交联时，相对高水平的单体物种(在SDS-PAGE中对应于小于70kDa的条带)。此外，与1000当量PEG的反应产生比与200当量PEG的反应更高的分子量。所有测试条件都伴随着Pru-G酶活性的显著丧失。
这些结果表明Pru-G的部分交联取决于PEG浓度，并且不如Pru-A和Pru-C的交联有效。
如其中所示，Pru-G与5000Da PEG的交联不如与2000或3400Da PEG的交联有效。该结果与用Pru-C和Pru-A获得的结果一致。
表6：相对于未修饰的Pru-G活性，与不同大小的PEG交联的Pru-G的酶活性(使用200或1000当量的bis-Ald-PEG)
总之，上述结果表明尿酸酶交联对于大于1kDa且小于5kDa的PEG最有效，并且在这种条件下一些尿酸酶变体(例如，除了Pru-G之外)的交联可以产生具有未修饰尿酸酶的至少约50％酶活性的交联尿酸酶。
实施例5
交联剂类型对修饰尿酸酶的影响
比较了尿酸酶与不同交联剂的交联情况。
通过在室温下在100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中与1000当量的bis-NHS-PEG(2000Da)反应2小时，然后透析至100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，使Pru-A交联。此外，如上所述，通过与1000当量的bis-Ald-PEG(2000Da)反应，并使用100mM NaBH3CN作为还原剂，使prU-A交联。根据上文所述的方法测定蛋白质浓度和酶活性，并根据上文所述的方法使用SDS-PAGE评估交联效率和修饰程度。
如图7所示，bis-NHS-PEG(2000Da)和bis-Ald-PEG(2000Da)都导致Pru-A的有效交联，如通过SDS-PAGE所测定的。交联的Pru-A主要是四聚体形式，没有观察到对应于非交联物种(小于140kDa)的条带。如本文进一步示出的，与使用bis-Ald-PEG的修饰相比，使用bis-NHS-PEG的修饰产生适度较低的分子量，这表明bis-NHS-PEG产生较少数量的PEG分子连接到prU-A上。
使用bis-NHS-PEG(2000Da)和bis-Ald-PEG(2000Da)获得的修饰的Pru-A分别保留59％和78％的初始酶活性，这通过蛋白质活性与总蛋白质含量的比率(通过280nm处的OD测量)来确定。
这些结果表明，就引入的PEG部分的数量而言，醛官能团和还原剂的使用对于尿酸酶的交联特别有效。
实施例6
尿酸酶修饰对免疫原性的影响
根据实施例5中所述的方法，在动物研究中测试了由bis-NHS-PEG和bis-Ald-PEG交联的Pru-A的相对免疫原性。如图8A所示，将修饰的Pru-A的样品与ImjectTM明矾佐剂以1:1的比例混合，并以1mg/kg(通过OD测定)的剂量，以三周间隔，皮下注射给6至8周龄雌性Sprague Dawley大鼠(每组6只动物)。在指定的时间点，从每只动物收集血清，并通过ELISA(分别对每只动物)测定针对测试项目的效价。
如图8B所示，用由bis-Ald-PEG(2000Da)交联的Pru-A免疫产生的抗体效价比由bis-NHS-PEG(2000Da)交联的Pru-A低得多。如本文进一步所示，重复注射通常使得抗体效价增加。
使用竞争性ELISA研究了针对交联尿酸酶形成的抗体的性质。用未修饰的尿酸酶或用bis-NHS-PEG或bis-Ald-PEG(2000Da)交联的尿酸酶预温育样品，并通过ELISA评价竞争剂抑制所产生抗体结合的能力。
如图9A和9B所示，用与bis-NHS-PEG交联的Pru-A免疫时形成的抗体不受尿酸酶抑制，表明它们识别PEG部分(图9B)；而用bis-Ald-PEG交联的Pru-A免疫时形成的抗体倾向于识别核心蛋白(图9A)。
总之，上述结果表明，使用醛基的交联比使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团的交联更有效地降低了交联尿酸酶的免疫原性，并且使用NHS基团使得针对连接部分的抗体的形成量更高。
为了进一步评估PEG分子量和尿酸酶变体对免疫原性的影响，使用1000当量的2000Da或3400Da bis-Ald-PEG(2000Da)分别交联prU-A和prU-C，然后透析至100mM磷酸盐缓冲液(pH8)和尺寸排阻色谱法(根据上文材料和方法部分所述的方法)，以分离高分子量形式。通过MALDI质谱法(根据上文材料和方法部分所述的方法)评估附着的PEG部分的量。
如表7所示，与交联的Pru-A相比，更多的PEG部分被掺入交联的Pru-C中。
与prU-A相比，这些结果与prU-C序列中的大量赖氨酸残基一致。
表7：尿酸酶(prU-A或prU-C)四聚体中与bis-Ald-PEG(2000Da或3400Da)交联的PEG部分的量
bis-Ald-PEG(2000) bis-Ald-PEG(3400)
prU-A 38 34
prU-C 45 40
将交联的Pru-A和Pru-C与ImjectTM明矾佐剂以1:1的比例混合，并以1mg/kg(通过OD测定)的剂量，以3-4周间隔(使用与图8A中所示相同的时间线)，皮下注射给6至8周龄雌性Sprague Dawley大鼠(每组5只动物)。在指定的时间点，从每只动物收集血清，并通过ELISA测定效价。
如图10所示，与用2000Da PEG交联的交联Pru-A或Pru-C相比，用bis-Ald-PEG(3400Da)交联的Pru-C在免疫时产生最低的抗体效价。
这些结果表明，Pru-C的免疫原性比Pru-A稍低，本文所述的降低免疫原性的方法可用于不同类型的尿酸酶，用约3400Da的PEG交联在降低免疫原性方面特别有效。
修饰的尿酸酶的抗原性通过其被预先存在于人血浆中的抗体识别的水平来评估。
使用ELISA(如上文材料和方法部分所述的方法)测试来自各种首次接受治疗的个体患者(n＝102)的人血清样品中抗PEG抗体的存在。使用Pru-C250K的两种聚乙二醇化变体(根据上文所述的方法制备)：与bis-Ald-PEG(3400Da)交联的Pru-C250K和用单功能10kDaPEG(类似于普瑞凯希)聚乙二醇化的Pru-C250K进行测定，未修饰的Pru-C250K用于比较。嵌合cHu 3.3人类抗PEG IgG1抗体用于产生标准曲线，并作为阳性对照。阳性抗体应答定义为，相对于空白，OD比率至少为2，显示阳性应答的患者的结果示于图11中。
如图11所示，对未经处理的人类血液样本进行的筛选表明，102个(15％)测试供体中有15个具有识别用单功能10kDa PEG修饰的尿酸酶的预先存在的抗体；然而，102个供体中的仅3个(3％)-每个都包括在上述15个供体的组中-具有识别与3400Da PEG交联的Pru-C250K的抗体，并且这种抗体的效价明显较低。如本文进一步示出的，102个供体中的20个(20％)具有识别未修饰的Pru-C250K的抗体，但是这些供体都没有一个具有与3400Da PEG交联的针对Pru-C250K的抗体。
这些结果表明，PEG交联剂有效地掩蔽了尿酸酶蛋白，并且PEG部分(聚乙二醇化尿酸酶中免疫原性的重要来源)在由bis-Ald-PEG(约3400Da)交联时比由10kDa单功能PEG(类似于普瑞凯希)修饰时的免疫原性低得多。
为了评估血浆稳定性，将用3400Da PEG交联的Pru-C250K在人血浆中在37℃下离体温育4周，浓度为2μg/mL。在指定的时间点，根据上述方法测定尿酸酶活性。
如图12所示，用3400Da PEG交联的两批测试的Pru-C250K在28天的过程中在人血浆中保持完全活性。
这些结果表明示例性交联Pru-C250K在人血浆中是高度稳定的。
使用截止值为30kDa的系统(15mL)将示例性尿酸酶(Pru-C250K)浓缩至4.4mg/mL。
将40mg Pru-C250K(10ml)在9.86ml的100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中稀释，并加入到由50μl 200mM DTT水、1006mg(1000摩尔当量)bis-Ald-PEG(3400Da)和1ml 500mM 2-甲基吡啶硼烷络合物在乙醇中形成的反应混合物中，最终浓度为2mg/mL蛋白质和25mM 2-甲基吡啶硼烷络合物。通过在室温下轻轻摇动17小时来混合反应。反应后，将样品装载到尺寸排阻色谱柱上，以除去高分子量(HMW)物种。合并含有少于5％ HMW物种的级分，透析至100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)并浓缩至1.5mg/mL(通过OD测定)。
交联的Pru-C250K和未修饰的Pru-C250K均使用0.22μm过滤器灭菌，在-20℃下等分并储存。如上所述测定浓度和活性。通过MALDI质谱测定，每个尿酸酶四聚体的PEG部分的数量为约37。通过分析尺寸排阻色谱法测定，高分子量物种(修饰的八聚体)的比例为约2％。
通过标准方法确认不存在内毒素(<5EU/ml)，并通过竞争性ELISA确定蛋白质免疫原性的掩蔽程度。
将测试的尿酸酶以10U/kg(交联prU-C250K为每千克1.35毫克(由OD测定)，未修饰的prU-C250K为每千克1.09毫克(由OD测定))的剂量，以两周的间隔，静脉注射给12只6至8周龄雌性Sprague Dawley大鼠(注射#1-5)；接着是以四周的间隔，然后将交联的Pru-C250K注射到两组中(注射#6)，如图13A所示。在每组中，在指定的时间点收集血清并测定效价。
如图13B所示，在5次注射未修饰的Pru-C250K后，在6只受试动物中的4只中观察到抗Pru-C250K效价增加。
相比之下，在用3400Da PEG交联的Pru-C250K的6次IV注射后，所有受试动物中的抗-Pru-C250K-3400效价低于1:50(数据未示出)。
这些结果进一步证实了与示例性PEG部分的交联会明显降低尿酸酶的免疫原性。
实施例7
尿酸酶对重复给药对药代动力学的影响
为了评估重复注射对交联的尿酸酶的药代动力学的影响，根据上文实施例6中所述的相同方法，给大鼠静脉内注射与bis-Ald-PEG(3400Da)交联的Pru-C250K。在第一次注射和第六次注射后，通过ELISA或活性测定法测定交联的Pru-C250K的半衰期(T1/2)和曲线下面积(AUC)。
如图14A-14D所示，第一次注射后，交联的Pru-C250K的T1/2是54小时(如通过ELISA测定)和64.8小时(如通过活性测定法测定)；而第六次注射后，通过ELISA测定的T1/2为70.5小时，通过活性测定法测定的T1/2为68.4小时。
如本文进一步所示，第一次注射后，交联的Pru-C250K的AUC是61.07mg*分钟/ml(如通过ELISA测定)和65.95mg*分钟/ml(通过活性测定法测定)；而第六次注射后，通过ELISA测定的AUC为70.5mg*分钟/ml，通过活性测定法测定的AUC为58.5mg*分钟/ml。
相比之下，未修饰的Pru-C250K的T1/2小于1小时(数据未示出)。
这些结果表明，交联尿酸酶显著增加了尿酸酶在血浆中的半衰期，这可以允许持续的治疗效果并以相对不频繁的间隔给药。
这些结果进一步表明，反复暴露于交联的Pru-C250K并未缩短修饰蛋白在体内相对长的半衰期，这表明修饰蛋白的低免疫原性和持续治疗效果甚至在长期治疗后仍可保持。
实施例8
示例性交联尿酸酶与普瑞凯希的比较
如上文材料和方法部分所述，使用尿酸酶测定和米海利斯-曼恬分析，比较了示例性交联的尿酸酶(与bis-Ald-PEG(3400Da)交联的Pru-C250K)和普瑞凯希的酶活性。
如图15和表8所示，交联的尿酸酶显示出比普瑞凯希高得多的比活性，kcat和Vmax。
表8：普瑞凯希和示例性交联的尿酸酶的酶活性参数
KM(μM) Vmax(μmol/分钟) kcat(μmol/分钟) 比活性(U/mg)
普瑞凯希 30±4 7·10-6±1.6·10-6 37.4 1.1
交联的尿酸酶 86±9 33·10-6±1.6·10-6 187.0 5.5
这些结果表明，在高尿酸浓度(例如，200至400μM，这预计是是尿酸的临床相关浓度范围)下，当酶促反应速率大致与kcat(和Vmax)成正比时，交联的尿酸酶的效率比普瑞凯希高约5倍；在接近30μM的较低浓度(普瑞凯希的KM)下，交联的尿酸酶的效率比普瑞凯希高两倍以上；即使在非常低的尿酸浓度下，当酶促反应速率大致与kcat/KM成比时，交联的尿酸酶也比普瑞凯希更有效。
通过以1mg/kg的剂量，静脉注射给雌性Sprague Dawley大鼠，也比较了交联的尿酸酶和普瑞凯希的体内效率。在第一次注射(初始药代动力学(naive pharmacokinetics))后，以3周间隔重复4次注射(重复药代动力学)后收集血浆样品；通过测定每个时间点测定活性酶浓度来计算血浆半衰期。
如图16-18所示，在单次给药(图16和18)和重复(4)给药(图17和18)后，示例性交联的尿酸酶显示出比普瑞凯希更长的血浆半衰期。
总之，上述结果表明，本文所述的交联的尿酸酶的酶活性在体外和体内均优于普瑞凯希。
尽管已经结合本公开的具体实施方式描述了本公开，但是显然，对于本领域技术人员来说，许多替代、修改和变化将是显而易见的。因此，旨在包含落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替换、修改和变化。
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序列表
<110> 波塔力克斯有限公司（Protalix Ltd.）
宜尔雅·卢朵弗尔（RUDERFER, Ilya）
亚基尔·纳塔夫（NATAF, Yakir）
吉尔·阿尔瓦兹（ARVATZ, Gil）
尤里·哈纳尼亚（HANANIA, Uri）
塔玛·阿里尔（ARIEL, Tamar）
谢利·罗森（ROZEN, Shelly）
雅艾尔·海因（HAYON, Yael）
<120> 修饰的尿酸酶及其用途（MODIFIED URICASE AND USES THEREOF）
<130> 89419
<150> US 63/108,890
<151> 2020-11-03
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 303
<212> PRT
<213> Candida utilis
<400> 1
Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys
1 5 10 15
Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val
20 25 30
Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser
35 40 45
Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys
50 55 60
Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu
65 70 75 80
Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His
85 90 95
Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr
100 105 110
Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly
115 120 125
Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys
130 135 140
Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser
145 150 155 160
Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr
165 170 175
Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp
180 185 190
Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys
195 200 205
Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr
210 215 220
Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn
225 230 235 240
Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser
245 250 255
Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys
260 265 270
Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn
275 280 285
Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu
290 295 300
<210> 2
<211> 303
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> C250K point mutation of SEQ ID NO: 1
<400> 2
Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys
1 5 10 15
Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val
20 25 30
Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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260 265 270
Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn
275 280 285
Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu
290 295 300
<210> 3
<211> 308
<212> PRT
<213> Arthrobacter gangotriensis
<400> 3
Met Thr Thr Phe Ala Thr Lys Thr Thr Thr Asp Thr Lys Ile Val Leu
1 5 10 15
Gly Ser Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Ile Thr
20 25 30
Arg Asp Thr Asp Arg His Gln Ile Glu Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln
35 40 45
Leu His Gly Asp Phe Leu Ala Ala His Ile Asp Gly Asp Asn Ala His
50 55 60
Val Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Gly Leu Ala Lys
65 70 75 80
Asp Gly Val Gly Ser Pro Glu Glu Phe Leu Ala Arg Leu Gly Gln His
85 90 95
Phe Thr Gly Glu Phe Asp Trp Val Ser Gly Gly Arg Trp Ala Ala Glu
100 105 110
Gln Tyr Phe Trp Asp Arg Ile Gln Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg
115 120 125
Asn Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Arg Asn Gly Glu
130 135 140
Thr Ser Val Leu Ala Gly Ile Gln Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr
145 150 155 160
Ala Ser Glu Phe Arg Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln
165 170 175
Glu Thr Asp Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Thr Ala Arg Trp Arg
180 185 190
Tyr Asn Ser Glu Thr Ile Glu Ala Ser Gly Leu Asp Phe Asn Ala Val
195 200 205
Tyr Ala Ser Val Arg Glu Leu Leu Leu Ala Gly Phe Ser Ala Thr His
210 215 220
Ser Tyr Ala Leu Gln Gln Thr Met Phe Glu Met Gly Lys Ala Val Leu
225 230 235 240
Glu Ala His Pro Glu Ile Glu Glu Ile Lys Phe Ser Leu Pro Asn Lys
245 250 255
His His Phe Leu Val Asp Leu Thr Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn
260 265 270
Glu Val Phe Phe Ala Ala Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr
275 280 285
Ile Thr Arg Glu Gly Val Pro Ala Asn His Pro Ile Trp Glu Asn Thr
290 295 300
Pro Gly Phe Cys
305
<210> 4
<211> 302
<212> PRT
<213> Aspergillus flavus
<400> 4
Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val
1 5 10 15
Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu
20 25 30
Met Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr
35 40 45
Lys Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr
50 55 60
Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His
85 90 95
Ala Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile
100 105 110
Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys
115 120 125
Arg Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe
145 150 155 160
Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp
165 170 175
Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe
180 185 190
Ser Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr
195 200 205
Trp Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn
210 215 220
Ser Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu
225 230 235 240
Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys
245 250 255
His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr
260 265 270
Gly Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu
275 280 285
Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu
290 295 300

Claims (49)

1.一种修饰的尿酸酶，包含尿酸酶多肽，所述尿酸酶多肽通过至少一个包含聚(亚烷基二醇)部分的双功能连接部分交联，其中，所述双功能连接部分的分子量在约1.5kDa至约4kDa的范围内。
2.根据权利要求1所述的修饰的尿酸酶，其中，所述双功能连接部分的所述分子量在约2kDa至约3.5kDa的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的修饰的尿酸酶，其中，所述双功能连接部分包含与所述尿酸酶多肽中的胺基的氮原子共价连接的亚烷基。
4.根据权利要求3所述的修饰的尿酸酶，其中，所述胺基由赖氨酸残基侧链构成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述尿酸酶多肽连接到平均至少8个所述双功能连接部分。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述修饰的尿酸酶中至少30％的赖氨酸残基侧链与所述至少一个双功能连接部分共价连接。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述双功能连接部分具有式I：
-CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-CH2-
式I
其中：
L1和L2各自独立地是烃部分，或不存在L1和L2；
m是2至10范围内的整数；并且
n是2至1000范围内的整数。
8.根据权利要求7所述的修饰的尿酸酶，其中，n在30至100的范围内。
9.根据权利要求7或8所述的修饰的尿酸酶，其中，L1和L2中的至少一个是未取代的亚烷基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述聚(亚烷基二醇)部分是聚乙二醇部分。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的修饰的尿酸酶，为交联的四聚体的形式。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的修饰的尿酸酶，包含至少一种具有选自由SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所组成的组的氨基酸序列的多肽及其同源物。
13.根据权利要求12所述的修饰的尿酸酶，包含至少一种具有选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所组成的组的氨基酸序列的多肽及其同源物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述尿酸酶多肽是重组多肽。
15.根据权利要求14所述的修饰的尿酸酶，其中，所述尿酸酶多肽是植物重组多肽。
16.一种修饰的尿酸酶，包含多个具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽，其中，所述多肽通过至少一个包含聚(亚烷基二醇)部分的双功能连接部分交联。
17.根据权利要求16所述的修饰的尿酸酶，其中，所述双功能连接部分包含与所述多肽中的胺基的氮原子共价连接的亚烷基。
18.根据权利要求17所述的修饰的尿酸酶，其中，所述胺基由赖氨酸残基侧链构成。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述多肽中的每一个连接到平均至少8个所述双功能连接部分。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述修饰的尿酸酶中至少30％的赖氨酸残基侧链与所述至少一个双功能连接部分共价连接。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述双功能连接部分具有式I：
-CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-CH2-
式I
其中：
L1和L2各自独立地是烃部分，或不存在L1和L2；
m是2至10范围内的整数；并且
n是2至1000范围内的整数。
22.根据权利要求21所述的修饰的尿酸酶，其中，n在30至100的范围内。
23.根据权利要求21或22所述的修饰的尿酸酶，其中，L1和L2中的至少一个或两个都是未取代的亚烷基。
24.根据权利要求16至23中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述聚(亚烷基二醇)部分是聚乙二醇部分。
25.根据权利要求16至24中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述双功能连接部分的分子量在约1.5kDa至约4kDa的范围内。
26.根据权利要求25所述的修饰的尿酸酶，其中，所述双功能连接部分的所述分子量在约2kDa至约3.5kDa的范围内。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的修饰的尿酸酶，为四聚体的形式。
28.根据权利要求16至27中任一项所述的修饰的尿酸酶，其中，所述多肽是重组多肽。
29.根据权利要求28所述的修饰的尿酸酶，其中，所述多肽是植物重组多肽。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的修饰的尿酸酶，其特征在于在大鼠中的血浆半衰期为至少50小时。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的修饰的尿酸酶，用于治疗其中尿酸酶活性有益的疾病或病症的用途。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的修饰的尿酸酶，用于治疗与过多尿酸水平相关的疾病或病症的用途。
33.根据权利要求31或32所述的用于用途的修饰的尿酸酶，其中，所述疾病或病症选自由以下所组成的组：痛风、糖尿病、肾结石、肿瘤溶解综合征、出血性休克、疟疾、变应性炎症、肾功能障碍、病毒感染、急性胃肠炎、胎盘炎症、无菌性炎症、妊娠并发症、多发性硬化、炎症性肠病、胃肠感染和莱施-奈恩综合症。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的用于用途的修饰的尿酸酶，其中，所述治疗包括以至少一周的间隔施用所述修饰的尿酸酶。
35.根据权利要求34所述的用于用途的修饰的尿酸酶，其中，所述治疗包括以至少两个月的间隔施用所述修饰的尿酸酶。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的用于用途的修饰的尿酸酶，其中，所述治疗包括以每月不超过8mg的剂量施用所述修饰的尿酸酶。
37.一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽。
38.一种制备权利要求1至30中任一项所述的修饰的尿酸酶的方法，所述方法包括：
(a)使所述多肽与包含聚(亚烷基二醇)部分的交联剂接触，以获得所述多肽和所述交联剂的缀合物，所述交联剂包含至少两个醛基；和
(b)使所述缀合物与还原剂接触。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述还原剂选自由甲基吡啶硼烷络合物和氰基硼氢化物所组成的组。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中，所述交联剂具有式II：
HC(＝O)-L1-[O-(CH2)m]n-O-L2-C(＝O)H
式II
其中：
L1和L2各自是烃部分；
m是2至10范围内的整数；并且
n是2至1000范围内的整数。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其中，所述交联剂的分子量在约1.5kDa至约4kDa的范围内。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，包括使所述多肽的四聚体形式与所述交联剂接触。
43.根据权利要求38至42中任一项所述的方法，其中，所述交联剂与所述多肽的摩尔比在100:1至10,000:1的范围内。
44.一种降低培养基中尿酸水平的方法，所述方法包括使所述培养基与根据权利要求1至30中任一项所述的修饰的尿酸酶接触。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述培养基是有需要的对象的组织，所述方法包括向所述对象施用所述修饰的尿酸酶。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述对象患有选自由以下所组成的组的疾病或病症：痛风、糖尿病、肾结石、肿瘤溶解综合征、出血性休克、疟疾、变应性炎症、肾功能障碍、病毒感染、急性胃肠炎、胎盘炎症、无菌性炎症、妊娠并发症、多发性硬化、炎症性肠病、胃肠感染，以及莱施-奈恩综合症。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中，所述施用以至少一周的间隔进行。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述施用以至少两个月的间隔进行。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中，施用于所述对象的所述尿酸酶的剂量不超过每月8mg。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
AU746461B2 (en) 1997-05-14 2002-05-02 Aventis Pharmaceuticals Inc. Peptide parathyroid hormone analogs
CA2338665C (en) 1998-08-06 2011-01-18 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
BRPI9917760B8 (pt) 1998-08-06 2021-05-25 Univ Duke método para isolar uma forma tetramérica de uricase a partir de uma solução de uricase purificada
US6913915B2 (en) 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20080159976A1 (en) 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
HU229068B1 (hu) 2005-04-11 2013-07-29 Savient Pharmaceuticals Urát oxidáz változatok és alkalmazásuk
EP3088514B1 (en) 2010-03-02 2018-11-28 Protalix Ltd. Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
US20130017169A1 (en) 2010-03-02 2013-01-17 Protalix Ltd. Multimeric forms of therapeutic proteins and uses thereof
CN102634492B (zh) * 2011-02-14 2015-06-10 重庆富进生物医药有限公司 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用
CA2984926A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Medimmune, Llc Improved uricase sequences and methods of treatment
CN106226651B (zh) 2016-07-12 2019-08-23 国电南瑞科技股份有限公司 一种架空型故障指示定位终端及对地电压测量方法
JP2020530282A (ja) 2017-07-07 2020-10-22 アレナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 組換えウリカーゼ酵素
WO2019183292A1 (en) * 2018-03-20 2019-09-26 Rubius Therapeutics, Inc. Therapeutic cell systems and methods for treating hyperuricemia and gout

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